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BIORREATORESPesquisa

Biorreatores para clulas, tecidos e rgos vegetais - Produo de mudas em larga escalaFotos cedidas pelo autor

Joo Batista Teixeira,Ph.D., Biologia Celularbatista@cenargen.embrapa.brEmbrapa Recursos Genticos eBiotecnologia

Introduo

A micropropagao uma formavegetativa de propagao de diferentesespcies de plantas por meio da tcnicadenominada cultura de tecidos. Essatcnica requer laboratrios bem estru-turados e pessoal treinado.

Em resumo, o procedimento envol-ve os seguintes passos: inicialmente, feita a escolha da planta matriz e do tipode material a ser utilizado, tais como

gemas, segmentos nodais, folhas, flo-res, etc. Em seguida, o material desin-festado j em condies de laboratrioem ambiente estril, e introduzido emfrascos igualmente estreis, contendomeio de cultura esterilizado. Esse meiocontm, todos os nutrientes necessriosao crescimento e desenvolvimento domaterial em cultivo, alm de substnciasreguladoras de crescimento. Os frascoscom o material so mantidos em salas

de crescimento, sob condies de tem-peratura, luminosidade e fotoperodoadequados.

Milhes de plantas so produzidasanualmente, em todo o mundo, pormeio da micropropagao. Entretanto,esse mtodo de multiplicao alta-mente demandante de mo-de-obra es em condies especiais tal procedi-mento deve ser utilizado. Basicamente,a escolha da micropropagao frente aoutras formas de propagao baseia-seno valor venal da muda ou do produtoa ser obtido pela muda micropropaga-da.

A metodologia tradicional de micro-propagao baseia-se em cultivos empequenos frascos, com nmero reduzi-do de plntulas por frasco, e uso demeio nutritivo gelificado, o que acarretaintensa manipulao das culturas, e en-volve, com isso um grande contingentede mo-de-obra especializada.

Biorreatores podem ser conceitua-dos como equipamentos para cultivosob imerso temporria ou permanentede clulas, gemas, embries ou qual-quer tipo de propgulo que possa serutilizado na micropropagao.

Os biorreatores utilizam meio decultura lquido, permitem a renovaodo ar durante o cultivo, bem como omonitoramento de alguns parmetrosessenciais ao crescimento do propgu-lo, tais como pH, oxignio dissolvido,temperatura, concentrao de ons, etc.

Os primeiros biorreatores derivaramdos equipamentos denominados fer-mentadores, os quais foram, h muitasdcadas, desenvolvidos para cultivo defungos e bactrias para fins industriais.Assim, os primeiros biorreatores testa-dos para plantas continuaram sendochamados de fermentadores, por seremutilizados basicamente para o cultivo declulas vegetais isoladas, de forma mui-

Figura 1. Sistema de biorreatorde imerso temporria,desenvolvido pela EmbrapaRecursos Genticos eBiotecnologia, utilizandotanque de ar comprimido

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to parecida com o que era feito com osfungos e bactrias.

Inicialmente, os fermentadores fo-ram empregados com pouca ou nenhu-ma modificao para o cultivo de clu-las vegetais. Para isso, pequenos ajustesforam feitos na taxa de renovao do are nas formas de agitao das clulas.Biorreatores para cultivo de clulas ve-getais foram bastante estudados, princi-palmente na dcada de 80, e uma sriede modelos especficos para plantasforam desenvolvidos.

Recentemente, os biorreatores co-mearam a ser utilizados para cultivo declulas, tecidos, gemas e plntulas, ten-do como objetivo final a produo demudas em larga escala.

O primeiro relato sobre o uso debiorreatores para propagao vegetalfoi primeiramente feito por Takayama eMisawa (1981) para micropropagaode begnia. Nesse caso, os autoresutilizaram segmentos nodais de plntu-las estabelecidas in vitro, seguindo pro-tocolos de cultivos convencionais emmeio gelificado. Procedimentos simila-res foram adaptados para uma srie deoutras espcies vegetais (Noriega &Sndahl, 1993; Akita & Takayama, 1994).

Os biorreatores so aplicados igual-mente produo de embries somti-cos (Tautorus et al., 1992; Denchev etal., 1992 e sementes sintticas (Attree etal., 1994; Onishi et al., 1994). Essa meto-dologia exige completo domnio sobreo processo de induo e seleo decalos embriognicos, bem como da di-ferenciao e encapslulamento dos

embries somticos, alm da germina-o das sementes sintticas.

Constituio bsicados biorreatores

A constituio dos biorreatores usa-dos para cultura de embrio, gemas ehastes caulinares para fins de micropro-pagao fundamentalmente a mesmados equipamentos utilizados para culti-vo de fungos, bactrias e clulas vege-tais (Takayama & Akita, 1994).

Basicamente, os biorreatores tradici-onais apresentam os seguintes compo-nentes: frasco de cultivo, motor eltricoconectado a um eixo que se estende ato interior do frasco, bomba compresso-ra de ar, sensores de temperatura, pH eoxignio (Takayama & Akita, 1994).

O frasco de cultura desenhado detal forma a permitir uma tima aeraodo meio de cultura, bem como umahomogeneizao satisfatria com ummnimo de dano mecnico do materialem cultivo. Os frascos podem ser feitosde vidro, ao inoxidvel, policarbonato,polipropileno ou qualquer outro materi-al que suporte a autoclavagem a umatemperatura de 121 C durante 15 a 30minutos. Freqentemente, o frasco decultivo apresenta um envoltrio metli-co em forma de jaqueta, por ondecircula gua com temperatura pre-de-terminada, para controle da temperatu-ra de cultivo (Takayama & Akita, 1994).

A homogeneizao do meio de cul-tura e a aerao do material em cultivoso feitos de diversas formas, sendo a

mais comum a injeo de um fluxo de ara uma determinada presso, combinadacom o movimento de uma hlice nointerior do frasco de cultivo (Takayama& Akita, 1994). O ar que entra nosistema esterilizado ao ser forado apassar atravs de uma membrana comporos de 0,22 a 0,44 micras de dimetro.

O tamanho do frasco de cultivonormalmente varia entre 1 e 20 litros,embora volumes menores como 250 e500 ml, ou maiores, 20 ou at mesmo 300litros j tenham sido utilizados. Entre-tanto, a maioria dos frascos utilizadosest na faixa de 1 a 4 litros (Takayama& Akita, 1994).

Principais tipos de biorreatoresutilizados para cultivo de hastes

caulinares e embrio

Vrios tipos de biorreatores tm sidodesenvolvidos e utilizados ou tm po-tencial de uso em cultivo de gemas,embries e plantas. Esses biorreatoresso classificados pelo tipo de agitao econstruo do frasco (Takayama & Aki-ta, 1994).

Biorreatores tipoaerador agitador

(aeration agitationbioreactor)

Esse tipo de biorreator o maisparecido com os fermentadores con-vencionais. A agitao basicamentefeita por meio de hlices conectadas aum eixo giratrio. basicamente utiliza-do para clulas e embries somticos(Kessel & Carr ,1972; Preil et al., 1988). Agrande desvantagem desse modelo debiorreator que, para haver uma boahomogeneizao do meio, necessrioque a hlice gire em velocidades sufici-entemente elevadas, o que, regra geral,causa dano mecnico acentuado aomaterial em cultivo, principalmente emhastes e gemas.

Biorreator tipo tambor rotat-rio (roller drum bioreactor)

Nesse tipo de biorreator, o frasco decultivo gira suavemente em movimen-tos rotacionais sobre dois eixos, queservem no apenas de apoio, mas quetambm so responsveis por imprimirao frasco de cultivo o movimento rota-trio. Nesse tipo de biorreator, o danomecnico mnimo e adequado ao

Figura 2. Sistema de biorreator, modelo compacto de 4 pares defrascos, utilizando bomba compressora de ar

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cultivo de embries e plantas. Entretan-to, o nvel de oxigenao s adequadoquando se utilizam meios de culturacom alta viscosidade (Tanaka et al.,1983).

Biorreator tipo filtro rotatrio(spin filter biorreactor)

Biorreator de filtro rotatrio apre-senta um filtro conectado a um eixocentral, por onde o meio de cultura descarregado (Styer, 1985). Esse ele-mento responsvel igualmente pelahomogeneizao, bem como pela aera-o do material em cultivo. Esse tipo debiorreator funciona satisfatoriamentebem para propagao via embriognesesomtica (Wheat et al., 1986).

Biorreator tipo borbulhamento(air driven bioreactor)

O biorreator tipo borbulhamentoapresenta uma constituio muito sim-ples. A homogeneizao do meio, bemcomo a aerao so feitos via borbulha-mento de ar no fundo do frasco. Podeser de dois tipos: aerao simples oucoluna de bolha.

Biorreator de aeraosimples e coluna de bolha

(bubble column bioreactor)

A relao altura/dimetro de 1 a 2define o biorreator de aerao simples ese a relao 3 ou acima, o biorreator do tipo coluna de bolha. Esses modelos

de biorreatores apresentam bons resul-tados no cultivo de hastes caulinares,bulbos, cormos e tubrculos (Takayama& Misawa, 1981; Takayama et al, 1991).Esse modelo de biorreator foi desenvol-vido e utilizado primeiramente na mi-cropropagaco, por Takayama & Misa-wa (1981).

Biorreator do tipolevantamento de ar

(air lift bioreactor)

O meio de cultura nesse tipo debiorreator movido de baixo para cimadentro de um tubo situado verticalmen-te no interior do frasco pelas bolhas dear produzidas no fundo do frasco decultivo. Esse modelo apresenta bonsresultados, uma vez que h uma boaaerao e homogeneizao do meio decultura e pouco dano mecnico aomaterial em cultivo (Park et al, 1989). Anica diferena desse biorreator para omodelo anterior que o borbulhamentode ar feito dentro de um tubo centra-lizado no frasco de cultivo.

Biorreator do tipo fase gasosa(gaseous phase bioreactor)

Esse modelo equipado com umsuporte perfurado sobre o qual o mate-rial em cultivo posicionado. O meio decultura, pulverizado sobre o material emcultivo , em seguida, drenado pela basede suporte e novamente bombeado epulverizado a intervalos preestabeleci-dos (Ushiyama, 1984). Esse tipo de

biorreator apresenta excelentes resulta-dos no cultivo de clulas, tecidos ergos porque no h dano mecniconem agitao via borbulhamento. Oinconveniente desse modelo a norenovao do ar interno do frasco decultivo, o que pode ser contornado coma incluso de um sistema de aerao viainjeo de ar estril.

Biorretor de aerao pormembrana porosa ao oxignio

(oxygen permeablemembrane aerator

bioreactor)

O frasco de cultura desse tipo debiorreator contm uma canalizao finaem forma de espiral feita de materialporoso ao oxignio, que pode ser deteflon, silicone, policarbonato ou poli-propileno, atravs do qual o oxigniopassa para o meio de cultura. Essemodelo de biorreator no apresentaproblemas relacionados com o danomecnico, uma vez que no h nenhumtipo de agitao, entretanto, a homoge-neizao do meio de cultura fica preju-dicada (Luttman et al, 1994).

Biorreator do tiposobre-aerao

(overlay aeration bioreactor)

Nesse modelo, a aerao feita porsopramento do ar estril sobre o meio decultura. Eventualmente, esse tipo deaerao pode ser combinado com agita-o suave do meio (Ishibashi et al.,1987). Esse modelo apresenta deficin-cia na aerao, o que pode comprome-ter o crescimento, sobretudo, de clulase tecidos.

Biorreator deimerso temporria

Em todos os modelos descritos ante-riormente, com exceo daquele queutiliza um sistema de pulverizao domeio, o material em cultivo permaneceimerso continuamente no meio de cul-tura. Essa imerso contnua causa pro-blemas de hiperhidratao dos tecidos,rgos e plntulas. Dependendo da es-pcie e do tipo de meio utilizado, ahiperhidratao dos tecidos pode cau-sar distrbios fisiolgicos srios, queiro afetar o crescimento e desenvolvi-mento do material em cultivo.

Visando a eliminar ou a minimizar

Figura 3. Detalhe dos frascos do biorreator, com clulas embriognicasde caf em cultivo

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esse problema, foi desenvolvido ummodelo de biorreator chamado de imer-so temporria (Alvard et al., 1993).Nesse tipo de biorreator, o meio decultura permanece em contato com oexplante por um perodo predetermina-do. Em seguida, o meio drenado e oexplante deixa de ficar em contatodireto com o meio de cultura.

O modelo desenvolvido por Alvardet al. (1993) constitudo de um frascode dois compartimentos, um superior eum inferior, conectados entre si por umtubo. O meio de cultura colocado nocompartimento inferior e o material a sercultivado, no superior. O meio de cultu-ra passa do compartimento inferior parao superior pela injeo de ar no compar-timento inferior. Quando todo o meiopassa para o compartimento superior,ocorre borbulhamento e aerao do

meio em contato com o material emcultivo. O ar expelido atravs de umorifcio na tampa do compartimentosuperior. Aps um perodo preestabele-cido, a presso do ar no compartimentoinferior aliviada, o que, por gravidade,faz com que o meio retorne ao compar-timento inferior, permanecendo a atque o ciclo recomece.

O modelo desenvolvido por Alvardet al. (1993) foi modificado no que serefere construo, mas mantendo asmesmas caractersticas de funcionamen-to, dando origem ao sistema de biorre-ator denominado RITAfi (Teisson et al.,1995).

O sistema RITAfi vem sendo utiliza-do para uma srie de espcies vegetais,com diferentes tipos de explantes, apre-sentando resultados muito bons (Alvardet al., 1993; Teisson et al., 1995; Etienne

et al., 1997; Cabasson et al.,1997; Etienne et al., 1999).

Na realidade, o princ-pio da imerso temporriapara cultivo de fragmentosvegetais relativamente gran-des foi primeiramente des-crito por Steward et al.(1952) e relatado por Harris& Mason (1983). SegundoHarris & Mason (1983),Steward et al. (1952) de-monstraram que razes decenoura imersos em meiolquido no apresentavamcrescimento satisfatrio econcluram que o motivo setratava de deficincia deoxigenao do meio decultura. Visando a contor-

nar esse problema, delinearam e cons-truram um equipamento que foi deno-minado auxophyton, o qual movi-mentava os frascos de cultura de formarotacional sobre uma roda, de tal formaque, em determinado momento, os seg-mentos de raiz eram expostos ao ar e, nomomento seguinte, submersos no meiolquido, conseguindo, com isso, umaumento da matria fresca de 38,1 mgem meio gelificado para 98,6 mg emmeio lquido, no auxophyton.

Posteriormente, um equipamentodesenvolvido por Harris & Mason (1983),para cultivo de explantes de uva emmeio lquido em frascos tipo Erlen-meyer, apresentava o mesmo princpiorelatado por Steward et al. (1952). Nesseequipamento, o frasco tipo Erlenmeyerera mudado automaticamente de posi-o a intervalos predeterminados, de talforma que, em certa posio, o explantese encontrava submerso e, em outraposio, no submerso. O estoque inici-al de explantes era obtido atravs docultivo, por 28 dias, em meio gelificadocom agar. Aps 90 dias de cultivo nomeio de imerso temporria, a produode brotos foi sete vezes superior aorendimento obtido pelo mesmo perodoem meio com agar.

Em 1985, Tisserat & Vandercookdesenvolveram um sistema de cultivoem imerso temporria, que consistia deuma grande cmara de cultura, a qualera periodicamente cheia de meio decultura. Embora o controle da trocagasosa fosse insatisfatrio, esse mtodode cultivo por imerso temporria mos-trou ser muito superior aos cultivos emmeios gelificados.

Atken-Christie & Jones (1987) utili-zaram igualmente um sistema de cultivoem imerso temporria na propagaode Pinus. Nesse sistema, o meio nutriti-vo lquido era colocado sobre o meioslido sobre o qual estavam os explan-tes. O meio permanecia em contato como explante por 4 a 6 horas. Aps esseperodo, o meio era retirado atravs deuma bomba de vcuo. Esse procedi-mento era repetido a cada semana.

Pouco tempo depois, Aitken-Chistie& Davies (1988) desenvolveram um sis-tema semi-automtico de cultivo sobimerso temporria, no qual plntulaseram cultivadas em um grande recipien-te com meio gelificado, com adio eremoo automtica e peridica do meiolquido.

Simonton et al. (1991) desenvolve-

Figura 4. Hastes de abacaxi, em cultivo, em biorreator de imersotemporria, em meio de multiplicao

Figura 5. Mudas alongadas de abacaxi, aps amultiplicao e alongamento em biorreator deimerso temporria, prontas para seremaclimatadas

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ram um equipamento automtico demicropropagao, no qual o meio lqui-do era injetado sobre as plntulas emcultivo, de acordo com um esquema detempo preestabelecido. Embora esse sis-tema tenha apresentado uma excelenteperformance quanto ao preciso contro-le da exposio do explante ao meio decultura, alguns problemas foram identi-ficados, como o uso de um frasco rela-tivamente grande, de difcil manuseio,alm de alguns problemas de contami-nao especialmente do tipo bacteria-na.

Uma modificao mais recente domodelo de biorreator de imerso tem-porria foi feito por Lorenzo et al. (1998)para micropropagao de gemas decana-de-acar e Escalona et al. (1999)para gemas de abacaxi. Esse sistemautiliza dois frascos, sendo um para culti-vo do material vegetal e outro paraestocagem do meio de cultura. O meiode cultura transferido de um frascopara o outro por meio de um vcuo de250 mm de Hg. Entretanto, no foramapresentados detalhes adicionais daconstruo e funcionamento desse tipode biorreator.

Os modelos de biorreatores de imer-so contnua encontrados na literaturacientfica, em termos gerais, so equipa-mentos:a) complexos, do ponto de vista demontagem e funcionamento;b) destinam-se apenas ao cultivo sobcondies de imerso contnua, nopermitindo versatilidade no seu uso, por

ex., transformao de um modelo deimerso contnua para imerso tempo-rria e vice-versa;c) de difcil manipulao durante asfases de esterilizao, carga, descarga etroca do meio de cultura.Por sua vez, os modelos de imersotemporria so mais simples na suaconcepo, montagem e funcionamen-to.

Sistema de Biorreatordesenvolvido pela Embrapa

A Embrapa-Recursos Genticos eBiotecnologia desenvolveu e subme-teu ao INPI, para fins de patenteamen-to um sistema de biorreator tomandocomo base o modelo desenvolvido porAlvard et al., (1993) e Lorenzo et al.(1998), que permite uma grande versa-tilidade de uso. O equipamento apre-senta as seguintes caractersticas noencontradas em outros modelos debiorreatores:a) o equipamento pode utilizar dife-

rentes tipos de frascos, os quaispodem variar em tamanho, forma-to, constituio, tipo de tampa,transparncia, etc.;

b) a montagem simples e os com-ponentes (vlvulas solenides, tem-porizadores, fonte de ar comprimi-do, filtros de ar, fluxmetro, cone-xes metlicas, mangueiras de sili-cone, etc.) podem ser de fcil aqui-sio ou feitura;

c) o sistema foi desenhado para com-portar diferentes nmeros de fras-cos de cultivo, o que determina-do pela extenso das tubulaes,bem como pela potncia do com-pressor ou da fonte de ar compri-mido;

d) o equipamento pode ser montadoem diferentes ambientes de inten-sidade de luz, fotoperodo e tem-peratura;

e) o equipamento pode ser utilizadopara cultivo em regime de imersotemporria ou contnua.

f) no regime de imerso contnua, oequipamento pode funcionar sobregime de borbulhamento cont-nuo com diferentes fluxos de ar ousob borbulhamento temporrio,cujo perodo pode ser definidopelo temporizador. Para isso, sonecessrios pequenos ajustes noequipamento;

g) o equipamento permite fazer, ain-da, uso de uma fonte de ar artificialcom dosagens especficas de oxi-gnio, nitrognio e gs carbnico;

h) o equipamento pode ser utilizadotanto para cultivo de clulas eembries, quanto para gemas esegmentos nodais e raiz.

Nos primeiros ensaios, o sistema foitestado para cultivo de microestacas debatata para microtuberizao e hastesde abacaxi visando multibrotao eao alongamento das mudas, sob regi-me de imerso temporria. Em ambosos casos, os resultados preliminaresforam excelentes. No momento, estoem andamento testes definitivos comhastes de abacaxi, em experimentos demultiplicao para fins de comparaocom o cultivo em meio lquido estaci-onrio e em meio gelificado. Estoigualmente em andamento os primei-ros testes de cultivo de clulas embrio-gnicas de caf.

Por ser um equipamento recm-desenvolvido, vrias modificaes es-to sendo introduzidas no sistema,como novos e mais adequados tipos defrascos e tampas e novos sistemas deiluminao com vistas a ajust-lo paracultivo de explantes especficos, comoclulas e gemas, alm de propiciar uma

Figura 6. Plantas aclimatadas de abacaxi, multiplicadas embiorreator de imerso temporria

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melhora no funcionamento, bemcomo no uso e economia da fonteluminosa.

Alguns exemplos de uso podemser enumerados para esse sistema decultivo em meio lquido, de formasemi-automtica: cultivo de clulasembriognicas e no embriognicas,embries somticos de diferentes es-pcies, gemas axilares e apicais parafins de multibrotao, microestacasde vrias espcies para fins de cresci-mento e multiplicao das hastescaulinares, cultivo de raiz para expe-rimentos diversos, incluindo a produ-o de metablitos secundrios, almde outras aplicaes, como a germi-nao de embrio zigtico in vitro,em alta quantidade e em condiestotalmente asspticas.

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