BIOTRANSFORMAÇÃO DE CHÁ VERDE POR TANASE PRODUZIDA … · empregado para sínteses do...

Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.20, n.1, p.19-31, 2018 19 ISSN: 1517-8595

BIOTRANSFORMAÇÃO DE CHÁ VERDE POR TANASE PRODUZIDA POR

Colletotrichum gloeosporioides URM 7130

Lucas Carlos de Souza Santos1, Tonny Cley Campos Leite2, Marcelo Rodrigues Figueira de

Mello3, Amanda Reges de Sena4

RESUMO

Tanino acil hidrolase (TAH), é uma enzima que hidrolisa ligações ésteres e depsídica de taninos

hidrolisáveis, conhecida como tanase. Elas são extensamente utilizadas nas indústrias de alimentos e bebidas,

farmacêutica e química. O objetivo neste trabalho foi avaliar a produção de tanase e ácido gálico a partir de

Colletotrichum gloeosporioides URM 7130, utilizando fermentação em estado submerso. Esta enzima foi

aplicada ao chá verde e o seu efeito avaliado. As análises seguiram desenhos estatísticos de Plackett-Burman

e Doehlert. A quantidade total de proteína foi determinada pelo método de Bradford, a atividade antioxidante

foi avaliada pelo método de DPPH, os teores totais de taninos foram obtidos pela precipitação proteica, e a

quantidade de ácidos fenólicos pelo método de Folin Ciocalteau. Os resultados da curva de biomassa, pH e

atividade enzimática indicaram que a melhor atividade foi encontrada depois de 168 h de fermentação,

quando foi obtido valores de 79,39 ± 0,33 U/mL da atividade volumétrica e 552,73 U/mg da atividade

específica. A produção de ácido gálico em 168 horas de fermentação foi de 0,17 ± 0,00069 mg/mL. Foi

verificada uma redução de 12,75% do teor de taninos e foi possível aumentar em 24,87% os compostos

fenólicos e 4,45 % a atividade antioxidante. A superfície de resposta mostra que a melhor resposta pode ser

obtida quando o extrato enzimático for aplicado numa concentração de 6,93% durante 141,30 minutos,

quando poderá ser obtida 83,04% de atividade antioxidante total. Os resultados sugerem que o chá verde

pode ser utilizado como alternativa a alimentos funcionais, pois aumentou sua atividade antioxidante.

Palavras-chave: ácido gálico; chá verde; atividade antioxidante; biotransformação; tanase.

BIOTRANSFORMATION OF GREEN TEA BY TANNASE PRODUCED BY


ABSTRACT

Tannin acyl hydrolase (TAH), is an enzyme that hydrolyzes esters and depsidic bonds of hydrolysable

tannins, known as tannase. They are widely used in the food and beverage, pharmaceutical and chemical

industries. The objective of this work was to evaluate the production of tannase and gallic acid from

Colletotrichum gloeosporioides URM 7130, using submerged fermentation. This enzyme was applied to

green tea and its effect evaluated. The statistical analyzes followed designs of Plackett-Burman and Doehlert

were used. The total amount of protein was determined by the Bradford method, the antioxidant activity was

evaluated by the DPPH method, total tannin contents were obtained by protein precipitation and the amount

of phenolic acids by the Folin Ciocalteau method. The results of the biomass, pH and enzymatic activity

curve indicated that the best activity was found after 168 h of fermentation, when the values of the

volumetric activity were 79.39 ± 0.33 U/mL and the specific activity was 552,73 U/mg. The production of

gallic acid in 168 hours of fermentation was 0.17 ± 0.00069 mg/mL. A reduction of 12.75% in the tannin

content was observed and it was possible to increase phenolic compounds by 24.87% and antioxidant activity

by 4.45%. The response surface shows that the best response can be obtained when the enzyme extract is

applied at a concentration of 6.93% for 141.30 minutes, when 83.04% of total antioxidant activity can be

obtained. The results suggest that green tea can be used as alternative to functional foods as it increased its

antioxidant activity.

Keywords: gallic acid; green tea; antioxidant activity; biotransformation; tannase.

Protocolo 19-2017-24 de 20/12/2017 1 Discente do Curso de Licenciatura em Química. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Pernambuco, Campus Barreiros.

Fazenda Sapé, S/N, Zona Rural. Barreiros. Cep: 55560-000. E-mail: [email protected]. Tel.: 81 – 982527300. 2 Técnico em Química. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Pernambuco, Campus Barreiros. Fazenda Sapé, S/N, Zona Rural.

Barreiros. Cep: 55560-000. E-mail: [email protected]. Tel.: 81 – 998207698. 3 Docente do Curso Tecnólogo em Agroecologia. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Pernambuco, Campus Barreiros.

Fazenda Sapé, S/N, Zona Rural. Barreiros. Cep: 55560-000. E-mail: [email protected]. Tel.: 81 – 992098087. 4 Docente do Curso Técnico em Alimentos. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Pernambuco, Campus Barreiros. Fazenda

Sapé, S/N, Zona Rural. Barreiros. Cep: 55560-000. E-mail: [email protected]. Tel.: 81 – 996275043.

mailto:[email protected]




20 Biotransformação de chá verde por tanase produzida por Colletotrichum gloeosporioides URM 7130 Santos et al.

Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.20, n.1, p.31, 2018

INTRODUÇÃO

A enzima Tanino acil hidrolase (TAH)

conhecida como tanase (E.C: 3.1.1.20) são

enzimas que hidrolisam ésteres e ligações

laterais de taninos hidrolisáveis como o ácido

tânico, em glicose e ácido gálico (Belur &

Mugeraya, 2011).

A tanase apresenta uma vasta aplicação

na indústria de alimentos, sucos, cervejas,

cosméticos, farmacêutica e indústria química.

Ela é utilizada na estabilização da cor do vinho,

refrigerantes a base de café, para tratamento de

efluentes na indústria de couros e na produção

de ácido gálico (Battestin et al, 2004; Belur &

Mugeraya, 2011).

O ácido gálico tem uma vasta aplicação

nas indústrias químicas e farmacêuticas. É

extraído através da hidrólise de ácido tânico e

empregado para sínteses do trimetropim,

pirogalol e propil-galato. O trimetropim é uma

droga muito utilizada na indústria farmacêutica

como agente antibacteriano, o pirogalol é

utilizado como agente conservante na indústria

de alimentos e o propil-galato tem função de

agente antioxidante em produtos que

contenham ácidos graxos e óleos, e (Beena et

al., 2011; Aithal & Belur, 2013). Outra grande

aplicação é no preparo dos chás instantâneos,

pois a adição de tanase em diferentes etapas do

processo industrial diminui a turbidez e leva ao

aumento da capacidade antioxidante presente

no mesmo (Pinto et, al., 2005).

Nos organismos vivos, a função dos

antioxidantes é impedir que radicais danifiquem

tecidos e auxilie a saúde celular, inibindo a

instalação de patogenias ligadas ao stress

oxidativo (Santos et al., 2011).

Certos organismos têm a capacidade de

efetuar modificações químicas em compostos,

denominando-se este processo de

biotransformação. No caso dos fungos

filamentosos, pode ocorrer utilizando a

totalidade do organismo (várias transformações

sintéticas sequenciais) ou através de biocatálise

(reduzido número de passos sintéticos) (Hüttel

& Hoffmeister, 2011).

Atualmente a maior utilização das

biotransformações verifica-se no sector

farmacêutico, pois promove a descoberta e a

investigação de novos fármacos (Pollard &

Woodley, 2007; Severiano et al., 2013).

A partir do exposto, o objetivo do

presente plano de trabalho foi produzir tanase e

ácido gálico a partir de Colletotrichum

gloeosporioides URM 7130, utilizando

fermentação em estado submerso. Ao mesmo

tempo, foi feita a aplicação enzimática no chá

verde e avaliou seu efeito.

METODOLOGIA

O projeto foi realizado no Instituto

Federal de Educação, Ciência e

Tecnologia/Campus Barreiros. O fungo


encontra-se incorporado à Coleção de Culturas

Micoteca URM, Departamento de Micologia do

Centro de Ciências Biológicas, Universidade

Federal de Pernambuco e no Campus Barreiros,

preservado em água destilada esterilizada em

frascos de penicilina (Castellani, 1939).

Preparação do inóculo

Inicialmente foi realizado um teste com o

micro-organismo no intuito de identificar

melhores meios de cultura para o crescimento e

esporulação do mesmo, os meios de cultura

utilizados na análise foram: Aveia (Aveia-

Ágar); Czapek (Ágar sais); BDA (Batata-

Dextrose-Ágar); seguido por 12 horas luz e 12

horas de escuridão.

Para ativá-los foram feitos repique nos

meios, com o pH 6,8 e foram incubado em

B.O.D (Solab, SL-200/364,Piracicaba, Brasil )

a 28 ºC durante 10 dias.

Curva de Biomassa e pH

Com a finalidade de avaliar o comporta-

mento microbiano antes da sua utilização no

processo fermentativo foi construído uma curva

de biomassa, no qual, foi utilizado discos de 1,3

cm de diâmetro de micélios em frascos

Erlenmeyers e a fermentação ocorreu por 7

dias, sendo paralisada a cada 24 horas. O

material residual contido no papel filtro, após

filtragem, foi levado à estufa por 24 horas a 90

ºC e a matéria seca avaliada ao final do

experimento por pesagem. O estudo da variação

do pH no processo fermentativo foi

desenvolvido através do método

potenciométrico (MS Tecnopon, mPA210,

Piracicaba, Brasil).

Produção enzimática e do ácido gálico

A produção enzimática ocorreu em

frascos Erlenmeyers de 125 mL contendo 25

mL de meio de fermentação (0,3 % NaNO3; 0,1

% K2HPO4; 0,05 % MgSO4; 0,05 % KCl;

0,0001 % FeSO4; 1 % ácido tânico; 0,1 %

extrato de levedura; pH 4,0). Devido à uma

Biotransformação de chá verde por tanase produzida por Colletotrichum gloeosporioides URM 7130 Santos et al. 21

Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.20, n.1, p.19-31, 2018

quantidade inadequada de esporos, a

fermentação acorreu após inoculação de discos

de 1,3 cm de diâmetro de micélios do micro-

organismo, removidos das placas de petri

previamente esterilizadas. O ácido tânico foi

acrescentado ao meio após ser passado em

membrana de 0,45 μm. Após a inoculação os

meios foram incubados a 40 °C em shaker

(Solab, Refrigerada SL-221, Piracicaba, Brasil)

por 168 h/100 rpm.

Após fermentação, as soluções foram

filtradas e centrifugadas (Thermo Electron Led

GMBH, Multifuge X1R, Kalkberg, Alemanha),

a 10000 rpm por 15 minutos a 4ºC e o

sobrenadante, considerado extrato enzimático,

congelado para posterior atividade enzimática e

quantificação de ácido gálico. Todos os testes

foram realizados em duplicata.

Determinação da atividade enzimática

A atividade da tanase foi estimada pelo

método de Sharma et al. (2000) modificado por

Pinto el al. (2006).

Quantificação de ácido gálico

A estimação da produção de ácido gálico

foi realizada por meio da reação entre 0,5 mL

do caldo de fermentação e 0,3 mL de rodanina

etanólica (0,667%, m/v). Após 5 minutos foi

adicionado 0,2 mL de hidróxido de potássio a

0,5 N e feita a leitura em espectrofotômetro a

520 nm. Uma curva-padrão de ácido gálico (10

a 100 mg/L) foi utilizada.

2.6 Dosagem do conteúdo de proteína

A proteína total foi determinada pelo

método de Bradford (1976) utilizando-se soro

albumina bovina como padrão. A atividade

específica da tanase foi então calculada pela

razão: AE=UA/mg proteína.

Aplicação enzimática

Preparo do chá verde

Incialmente foi adicionado 25g de folhas

completamente oxidadas (chá verde) em 200

mL de água destilada em ebulição e

posteriormente foi deixado em repouso durante

20 minutos e filtrado através de papel Whatman

Nº 1 (Selwal, et al., 2011).

Tratamento do chá verde com tanase

Para verificar uma melhor condição para

a diminuição do teor de taninos, aumento do

teor de compostos fenólicos e capacidade

antioxidante, foi proposto um planejamento

estatístico de Doehlert utilizando duas

variáveis: concentração de extrato enzimático

(%, v/v) e tempo de aplicação enzimática

(minutos). A concentração de extrato

enzimático foi avaliada em três níveis (2,0, 4,0

e 6,0 %) e o tempo de aplicação em cinco níveis

(140, 150, 160, 170 e 180 minutos), os quais

são apresentados em seus valores reais e

codificados na Tabela 1. Para cada porcentagem

de extrato enzimático utilizado foi feito um

controle, trocando-o por água destilada.

O comportamento do sistema foi

explicado pela seguinte equação quadrática (Eq.

(1)) cuja forma geral é:

Y = β0 + β1A + β2B + β11A2 + β22B2 +

β12AB + ε (Eq. 1)

Onde Y é a resposta predita, β0 é o

intercepto, β1e β2 são os coeficientes lineares,

β11, β22 os coeficientes quadráticos, β12 o

coeficiente de interação e A, B, A2, B2, AB são

as variáveis independentes e ε o erro

experimental.

Para cada 10 mL de chá em frascos

Erlenmeyers foi aplicada tanase com atividade

enzimática em torno de 79,39 U/mL nas

proporções citadas na Tabela 1, incubados em

shaker a 120 ± 1 rpm, 40 ºC. Logo após a

aplicação enzimática, segundo tempo pré-

estabelecido, a enzima foi desnaturada a 70 ºC

por 10 minutos.

Após a obtenção das condições preditas,

as mesmas foram submetidas a avaliações de

taninos totais, compostos fenólicos e atividade

antioxidante.



Tabela 1 – Matriz de planejamento estatístico de Doehlert para o tratamento enzimático do chá verde

Ensaios Extrato enzimático (%, v/v) Tempo de aplicação enzimática (minutos)

1 6,0 (0,866) 150 (-0,5)

2 6,0 (0,866) 170 (0,5)

3 4,0 (0) 140 (-1,0)

4 C 4,0 (0) 160 (0)

5 C 4,0 (0) 160 (0)

6 C 4,0 (0) 160 (0)

7 4,0 (0) 180 (1,0)

8 2,0 (- 0,866) 150 (-0,5)

9 2,0 (- 0,866) 170 (0,5)

C: Ponto central.

Determinação do teor de taninos totais

A estimativa do teor de taninos totais foi

feita pelo método de precipitação proteica

(Haggerman & Butler, 1978) utilizando o ácido

tânico como padrão. Para a análise um mL do

chá (antes e após tratamento com a enzima)

obtido foi posto em contato com 3 mL de

solução de BSA e mantida durante 15 minutos a

temperatura ambiente. Os tubos foram

centrifugados a 5500 rpm por 15 minutos, o

sobrenadante descartado e o precipitado

dissolvido em 3 mL da solução de SDS-

Trietanolamina. Um mL de solução de FeCl3

foi adicionada e mantido durante 15 minutos à

temperatura ambiente para a estabilização da

cor. Após este período procedeu-se a leitura em

espectrofotômetro a 510 nm contra um branco.

Foi feita uma curva de calibração com ácido

tânico (0,2 a 1,0 mg/mL). Todos os testes foram

realizados em duplicata. Os resultados são

apresentados em porcentagem de hidrólise.

Fenólicos Totais

Para determinar o teor de compostos

fenólicos totais no chá verde foram pipetados

para tubos de ensaio 50 µL da amostra, e em

seguida foram adicionados 125 µL do reagente

Folin Ciocalteau, diluído na proporção de 1:10.

Os tubos foram agitados e mantidos em repouso

por 3 minutos para reagir. Após, foi adicionado

1 mL de carbonato de sódio (7,5 %, m/v) e 1,35

mL de água destilada. Os tubos foram mantidos

por 2 horas ao abrigo da luz. Após o período de

reação, o espectrofotômetro foi zerado com o

controle (branco) e em seguida realizadas as

leituras à 765 nm (Singleton et al., 1999). Os

valores obtidos foram comparados com a curva

padrão de ácido gálico (10 a 500 mg/L). O

conteúdo total de fenólicos foi expresso em mg

equivalente de ácido gálico por litro de chá.

Todos os testes foram realizados em duplicata.

Atividade Antioxidante (DPPH)

Para análise de atividade antioxidante

(Brand-Williams et al., 1995) foram pipetados

em tubos 100 µL de chá e estes foram

misturados a 3,9 mL de DPPH a 60 μM

(diluídos em metanol). Os tubos foram agitados

e deixados para reagir por 20 minutos ao abrigo

da luz. Um controle negativo foi utilizado,

trocando-se a amostra por metanol. Decorrido o

tempo foram medidas as absorbâncias das

amostras a 517 nm. A capacidade de sequestro

de radical DPPH foi calculada de acordo com a

equação (Eq. (2)) abaixo:

DPPH (%) = [(A0-A1)/A0]* 100 (Eq. 2)

Onde A0 foi a absorbância do controle

negativo e A1 a absorbância na presença do

composto (amostra).

Análises estatísticas

Após obtenção dos resultados, os

mesmos foram analisados através do programa

SISVAR – Sistema de Análise de Variância

(Ferreira, 2011), realizando-se a comparação de

médias pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5

% de probabilidade. Ademais, uma Análise de

Variância (ANOVA) através do programa

Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, USA), foi

feita para indicar as variáveis com efeitos

estatisticamente significativos (p<0,1) e o ajuste

do modelo aos dados experimentais. Todos os

ensaios foram realizados aleatoriamente.



RESULTADOS E DISCUSSÃO

Crescimento e esporulação do micro-

organismo

Colletotrichum gloeosporioides é uma

espécie de fungo, pertencente à ordem

Melanconiales da classe Coelomycetes, cujo

gênero é o Glomerella sp., são considerados os

maiores patógenos de plantas em todo o mundo

(Menezes, 2006).

A avaliação do crescimento micelial foi

realizada diariamente, mantendo um ciclo de

luz e escuridão durante alguns dias

consecutivos ou até que o micélio já tivesse

tomado por completo a superfície do meio de

cultura. Santos et al. (2005) observou que a

exposição de C. gloeosporioides a ciclo

alternado de 12 horas de luz e 12 horas de

escuridão resultou em crescimento máximo e

que a temperatura afeta quase todas as funções

do fungo, incluindo crescimento, germinação de

esporos e reprodução.

Constatou-se que os meios apresentaram

grande crescimento micelial, mas, já para

esporulação não ocorreu o mesmo, pois,

segundo Nozaki et al. (2004) nem sempre as

condições que favorecem o crescimento

micelial são as mesmas para a esporulação.

3.2 Curva de Biomassa, pH e Produção

enzimática

A curva de crescimento tem papel

significativo no intuito de avaliar o

comportamento microbiano antes da utilização

no processo fermentativo, na variação do pH

presente no meio e também a biomassa que é o

crescimento do fungo. Os resultados obtidos de

massa micelial e pH são apresentados na Tabela

2 e as atividades volumétricas e específicas na

Tabela 3.

Tabela 2 - Curva de biomassa e pH e atividade enzimática

Tempo (h) pH Biomassa (mg)

24 4,02 ± 0,014 22,60 ± 0,00

48 3,98 ± 0,028 23,15 ± 0,001

72 3,81 ± 0,099 27,70 ± 0,00

96 3,73 ± 0,049 36,40 ± 0,0017

120 3,46 ± 0,0071 23,90 ± 0,0025

144 3,43 ± 0,0071 25,75 ± 0,00

168 3,45 ± 0,0071 45,60 ± 0,0021

Tabela 3 - Atividades volumétricas e específicas

Tempo (h) Atividade

volumétrica

(U/mL)

Atividade

específica

(U/mg)

24 2,20 ± 0,45 g 9,95 ± 1,99

48 21,89 ± 0,13 f 94,66 ± 0,77

72 38,99 ± 0,32 e 160,68 ± 0,34

96 49,92 ± 0,00 d 189,018 ± 1,08

120 64,22 ± 0,52 c 296,44 ± 0,36

144 70,45 ± 1,89 b 410,78 ± 3,37

168 79,39 ± 0,33 a 552,78 ± 6,99

Pode-se observar na Tabela 3 que a

atividade volumétrica está relacionada ao pH,

pois se tem mais atividade o pH será menor

devido á formação do ácido gálico, já a

biomassa neste caso vários fatores estão

envolvidos e consequentemente pode não ter

uma relação direta com a atividade, pois se

tradando de fermentação por micélios não há

um controle da quantidade de meio de cultura

que esta sendo depositado no meio de

fermentação e até mesmo a quantidade de

esporos.

Com a obtenção dos resultados, mostra

que todos os ensaios foram estatisticamente

diferentes entre si e que a melhor atividade foi

encontrada após o tempo de 168 h de

fermentação, no qual foi obtido valores de

79,39 ± 0,33 U/mL da atividade volumétrica e

552,73 U/mg da atividade especifica que é o

número de unidade da enzima tanase por

miligrama de proteína.

https://pt.wikipedia.org/wiki/Fungo

https://pt.wikipedia.org/wiki/Plantas



A produção da enzima esta relacionada

com a concentração de ácido tânico que é

adicionada ao meio de fermentação. Esta fonte

de carbono favorece a produção rápida de

tanase que, por sua vez, cliva os taninos

fornecendo suprimento contínuo de fonte de

carbono. De acordo com BajpaI & Patil (1997),

Lekha & Lonsane (1997) e Pinto (2003), o

ácido tânico desempenha o papel de fonte de

carbono para o micro-organismo, bem como de

indutor da síntese. Dessa maneira, a presença de

ácido tânico é imprescindível para a síntese de

tanase.

Em estudo realizado por Naidu et al.

(2008) quando se utilizou Aspergillus foetidus

(MTCC 3557) para a produção da tanase em

meio de fermentação submersa, após a

otimização da produção e o acido tânico como

fonte de carbono, obteve-se valores para a

atividade enzimática de 15 para 30 U/mL.

Através de pesquisa desenvolvida por Riul

(2011) na produção de tanases em meio de

fermentação submerso foram testados 12

fungos. Dentre os micro-organismos testados,

os que apresentaram maiores produções

enzimáticas foram Aspergillus phoenicis (0,42

U/mL), Aspergillus ochraceus (0,39 U/mL) e

Aspergillus caespitosus (0,31 U/mL),

respectivamente. Em comparação com o C.

gloeosporioides URM 7130 para a produção de

tanase, utilizando também fermentação

submersa, a atividade enzimática foi superior.

A Tabela 4 apresenta os resultados da

produção de ácido gálico com o consumo dos

taninos hidrolisáveis presente no chá verde. A

produção de ácido gálico em 168 horas de

fermentação foi de 0,17 ± 0,00069 mg/mL, o

que demonstra que o ajuste do tempo

influenciou em maiores conversões de ácido

gálico.

Tabela 4 - Produção de ácido gálico a partir de

Colletotrichum gloeosporioides URM 7130.

Tempo (h) Ácido gálico (mg/mL)

24 0,0054 ± 0,0017

48 0,047 ± 0,00028

72 0,083 ± 0,00069

96 0,11 ± 0,00

120 0,14 ± 0,0011

144 0,15 ± 0,0040

168 0,17 ± 0,00069

Esses resultados para a produção de

ácido gálico foram inferiores quando

comparados aos trabalhos desenvolvidos por

Aguila-Zárate et al. (2015) e Serra et al. (2014),

os quais encontraram valores de 52,03 mg/mL e

24,16 mg/mL, respectivamente.

Aplicação enzimática

Taninos totais

A Tabela 5 indica o efeito de tanase, após

aplicação, nos taninos hidrolisáveis presentes

no chá verde. Foi verificada uma redução no

teor desses compostos. No campo experimental

avaliado as maiores reduções de taninos totais

foram obtidas nos ensaios 2 e 8, sendo estes

estatisticamente superiores aos demais ensaios

ao nível considerado.

Tabela 5 - Resultados obtidos da matrix de Doehlert para a aplicação de extrato enzimático, contendo

tanase de Colletotrichum gloeosporioides URM 7130, na redução de taninos do chá verde.

Ensaios Redução de taninos experimental

(%)

Redução de taninos preditos (%)

1 7,77 ± 2,14 c 6,41

2 11,40 ± 5,16 a 12,75

3 2,50 ± 1,72 e 3,85

4 C 5,30 ± 0,66 d 5,56

5 C 5,60 ± 0,59 d 5,56

6 C 5,80 ± 2,45 d 5,56

7 9,89 ± 1,14 b 8,54

8 11,08 ± 2,63 a 9,72

9 6,72 ± 0,27 c 8,07

C: Ponto central. Médias seguidas por letras distintas na vertical diferem entre si ao nível de 5 % de

probabilidade pelo Teste de Scott-Knott. C: Ponto central



A utilização de tanase na redução de

taninos vem sendo explorada e pode minimizar

custos de produção pela indústria. No entanto,

são mais utilizadas no processamento de sucos.

A utilização em chás não foi verificada na

literatura sobre a redução destes compostos. Em

estudo realizado por Couri et al. (2002) diz que

o investimento inicial para obtenção do suco de

caju clarificado com enzima é menor que para o

suco clarificado com gelatina. Esse fato ocorre

devido à necessidade da etapa adicional de

filtração. No tratamento com enzimas há

somente uma etapa de centrifugação com

geração de resíduo sólido rico em taninos,

porém devido à ação da TAH, significativa

fração do teor de taninos totais (44,5%) foi

solubilizada. No tratamento convencional

existem duas etapas, a primeira para remoção

de material particulado já presente e a segunda

para a retirada do precipitado resultante da

complexação da gelatina com os taninos. Dessa

forma, o processo convencional apresenta

maior nível de geração de um resíduo

recalcitrante e maior custo financeiro.

Fenólicos totais

Vários estudos mostram que o chá verde

possui diversas propriedades medicinais, como

potencial anticariogênico, contra os radicais

livres, alergias, inflamações, úlceras, viroses,

tumores, para a prevenção e tratamento da

obesidade e suas co-morbidades. As ações

inibitórias podem prevenir também a agregação

plaquetária, reduzindo as doenças

cardiovasculares e trombose (German &

Dillard, 2000), Segundo Westerterp-Plantenga

et al. (2005), o chá verde também contém os

efeitos da cafeína e o possível mecanismo de

atuação na termogênese. Todas as ações

benéficas podem estar relacionadas aos

fitoquímicos presentes em todas as partes do

vegetal. Entre esses compostos podem ser

citados o ácido elágico, ácido gálico, a

quercetina, miricetina, isoquercitina, ácido

acetil oleanólico, os quais são compostos

fenólicos em diferentes concentrações e podem

estar relacionados à atividade antioxidante e

diminuição de radicais livres (Nair et al., 2013).

A Tabela 6 indica os resultados de

fenólicos totais equivalente em ácido gálico,

antes e após aplicação enzimática.


tanase do fungo Colletotrichum gloeosporioides URM 7130, no teor de fenólicos totais do chá verde.

Ensaios Fenólicos totais experimentais

(mg de EAG/L)/Aumento de ácido

gálico (%)

Fenólicos totais preditos

(mg de EAG/L)/Aumento de

ácido gálico (%)

1 633 ± 5,77/12,43 b 648

2 703 ± 17,32/24,87 a 688

3 623 ± 23,09/11,65 c 608

4 613 ± 5,77/9,86 c 623

5 623 ± 33,05/11,65 b 623

6 633 ± 11,55/13,44 b 623

7 643 ± 0,00/15,23 d 658

8 593 ± 17,33/5,06 b 608

9 633 ± 17,33/12,43 b 618

Antes da

aplicação

C2,0 % 563 ± 17,33 e -

C4,0 % 558 ± 21,21 e -

C6,0 % 563 ± 11,55 e -

C: Controle. Médias seguidas por letras distintas na vertical diferem entre si ao nível de 5 % de

probabilidade pelo Teste de Scott-Knott.

Pode-se verificar que todos os ensaios

apresentaram diferença estatisticamente

significativa (p<0,05) em relação aos seus

respectivos controles. No entanto, o ensaio 2 foi

o que apresentou maior conteúdo em compostos

fenólicos totais. Esses resultados estão em

acordo com aqueles apresentados na Tabela 3,

uma vez que a enzima degradou tanino



hidrolisável presente no chá verde. Após

aplicação enzimática foi possível aumentar em

24,87 % os compostos fenólicos no ensaio 2.

Bastos et. al. (2007) ao avaliarem o ter de

fenólicos totais de extratos aquosos de erva-

mate e chá verde obtiveram respectivamente

valores 7,73% e 7,15% em equivalência de

acido gálico e as análises foram feitas de acordo

com o método de Folin-Ciocalteu. A partir

destes resultados bibliográficos, pode-se

afirmar que a aplicação enzimática

proporcionou aumento significativo dos

compostos fenólicos totais presentes no chá

verde, tornando vantajosa sua utilização

industrial.

Atividade antioxidante

O chá verde tem sido extensivamente

estudado devido às suas propriedades, ligadas

principalmente à presença de seus princípios

constituintes, sendo flavonóides amplamente

reconhecidos por suas propriedades

antioxidantes (Wiseman, 1997; Croft, 1998;

Dreosti, 2000). De modo geral, a atividade

antioxidante no chá em questão está relacionada

à prevenção de várias doenças, incluindo

aterosclerose, doenças do fígado, obesidade e

vários tipos de câncer (Nanjo et al., 1996;

Langley-Evans, 2000).

Um antioxidante pode ser definido como

uma substância que, em baixas concentrações,

retarda ou previne a oxidação do substrato

(Halliwel et a., 1995). A capacidade

antioxidante pode ser expressa por meio de

vários parâmetros, incluindo a remoção de um

radical peroxil (ORAC – Oxygen radical

absorbance capacity, TRAP – Total reactive

antioxidant potential), a capacidade de redução

de metal (FRAP – ferric reducing antioxidant

power, CUPRAC – cupric íon reducing

antioxidant capacity), a capacidade de remoção

de radical orgânico (ABTS – 2,20-azino-bis

(ácido 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfônico),

DPPH – peroxidação do 2,2-difenil-1-

picrylhydrazil) e a quantificação de produtos

formados durante a peroxidação de lipídios

(TBARS, a oxidação do LDL, co-oxidação do

β-caroteno. O ensaio com maior atividade

antioxidante total foi o de número 1, com 82,89

% (Tabela 7).


tanase do fungo Colletotrichum gloeosporioides URM 7130, na atividade antioxidante total do chá

verde.

Ensaios Atividade antioxidante

experimental – DPPH (%)

Atividade antioxidante

predita

1 82,89 ± 0,71 a 82,83

2 81,45 ± 0,36 b 81,52

3 81,88 ± 0,24 b 81,94

4 C 81,80 ± 0,12 b 81,59

5 C 81,38 ± 0,24 b 81,59

6 79,78 ± 0,12 d 79,73

7 80,12 ± 0,83 c 80,06

8 79,11 ± 1,07 d 79,17

Antes da

aplicação

C2,0 % 80,79 ± 0,12 c -

C4,0 % 80,87 ± 0,00 c -

C6,0 % 79,36 ± 0,00 d -

Médias seguidas por letras distintas na vertical diferem entre si ao nível de 5 % de probabilidade

pelo Teste de Scott-Knott. C: Ponto central.

Os resultados obtidos experimentalmente

para a atividade antioxidante total foram

avaliados pelo Teste F e ANOVA (Tabela 8). A

regressão foi estatisticamente significativa e a

falta de ajuste indicou uma boa concordância

entre o modelo ajustado e os dados

experimentais. O coeficiente de determinação

foi de 0,99.



Tabela 8 - Análise de variância para os dados obtidos na Tabela 7.

Fonte de

variação

Soma dos

quadrados

Graus de

liberdade

Média

quadrática

Fcal Ftab

Regressão 11,02 5 2,20 40,00 5,31

Resíduo 0,11 2 0,055

Falta de

ajuste

0,019 1 0,019 0,22 8,53

Puro erro 0,088 1 0,088

Total 11,13

Fcal – F calculado; Ftab – F tabelado (Nível de confiança: 90 %). R2 = 0,99.

A partir da Figura 2 verifica-se que o

tempo e a concentração do extrato enzimático

em seus termos lineares foram estatisticamente

significativos para a atividade antioxidante

total, sendo seus efeitos negativo e positivo,

respectivamente.

Figura 2 - Gráfico de Pareto para os efeitos das variáveis na atividade antioxidante total do chá verde

de acordo com planejamento estatístico de Doehlert.

A Figura 3 ilustra a superfície de resposta

e curvas de contorno referente à relação entre

tempo de aplicação enzimática e concentração

de extrato enzimático. A figura indica que ao

diminuir os níveis do tempo de aplicação

enzimática e aumentar a concentração de

extrato enzimático, a atividade antioxidante

total aumenta. A superfície de resposta mostra

que o melhor resultado pode ser obtido quando

o extrato enzimático for aplicado numa

concentração de 6,93 % durante 141,30 minutos

obtendo 83,04% de atividade antioxidante total.

A atividade antioxidante do chá e de seus

polifenólicos tem sido avaliada por diversos

métodos (Cao et al., 1996; Langley-Evans,

2000; Miller et al., 1971). Utilizando o método

ORAC (capacidade de absorção de radicais de

oxigênio), Cao et al. (1996) constataram que o

chá verde e o chá preto possuem maior

atividade antioxidante contra radicais peróxidos

do que alguns vegetais, como alho, espinafre e

couve de Bruxelas. Utilizando o método FRAP

(poder antioxidante pela redução do íon

férrico), Langley-Evans (2000) encontrou uma

maior capacidade antioxidante total no chá

verde 92,1% quando comparado ao preto

28,8%. Giada (2006) utilizando o método

DPPH (peroxidação do 2,2-difenil-1-

picrylhydrazil) demonstraram que o chá preto

apresenta maior atividade antioxidante ex-vivo,

quando comparado ao chá verde de 91,26% e

89,91%, respectivamente. Hong et al. (2013)

observaram aumento na concentração de ácido

gálico, (-)-epilocatequina e (-)-epicatequina

após utilização de tanase em extrato de chá

verde. Em pesquisa desenvolvida por Lu &



Chen (2008), os autores verificaram um

aumento de atividade antioxidante e quelante,

quando comparado ao chá não tratado, após

utilizar tanase em chá verde.

A partir dos resultados obtidos ressalta o

tão quanto é imprescindível a aplicação da

enzima tanase no melhoramento nutricional do

chá verde.

Figura 3 - Superfície de resposta e curvas de contorno para atividade antioxidante total considerando

a interação entre o tempo de aplicação enzimática e concentração de extrato enzimático.

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos no presente

trabalho mostram o potencial promissor da

tanase obtida a partir do fungo endofítico C.

gloeosporioides URM 7130. Verificou-se que

com a utilização da fermentação submersa por

micélios houve uma produção enzimática

adequada e que vários fatores foram

importantes durante o processo. Dentre eles, se

destaca o tempo que afetou diretamente a

produção da enzima. No caso da biomassa foi

observada grande variação à medida que o

tempo passava. No entanto, não houve uma

influência direta na produção enzimática.

A tanase produzida apresentou

características desejáveis para o emprego

industrial como, por exemplo, na produção de

ácido gálico. No entanto, novas formas de

produção devem ser estudadas. Neste trabalho

foi feita aplicação da tanase na

biotransformação do chá verde. Foi verificada

uma redução de 12,75% no teor de taninos

totais, um aumento de 24,87 % em fenólicos

totais e um aumento de 4,45 % na atividade

antioxidante total.

Verificou-se que a tanase produzida por

C. gloeosporioides URM 7130 pode ser

utilizada em aplicações biotecnológicas. O chá

verde obtido após aplicação enzimática pode

ser empregado como alternativa de consumo

como alimento funcional uma vez que teve sua

atividade antioxidante total incrementada.

AGRADECIMENTOS

Ao Instituto Federal de Educação,

Ciência e Tecnologia de Pernambuco (IFPE),

Campus Barreiros, pela bolsa concedida e ao

Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio

financeiro (469406/2014-3).

REFERÊNCIAS

Aguilar-Zárate P, Cruz-Hernández M,

Montañez J, Belmares-Cerda R, Aguilar C.

Bacterial tannases: production, properties

and applications. Revista Mexicana de



Ingeniería Química. v. 13, n. 1, p. 63–74,

2015.

Aithal, M.; Belur, P.D. Production of propyl

gallate in non aqueous medium using cell-

associated tannase of Bacillus massiliensis:

effect of various parameters and statistical

optimization. Biotechnology and Applied

Biochemistry. v. 60, n. 2, p. 210-218, 2013.

Bajpai, B.; Patil, S. Induction of tannin acyl

hydrolase (EC 3.1.1.20) activity in some

members of fungi imperfecti. Enzyme and

Microbial Technology. v. 20, n. 8, p. 612-

614, 1997.

Bastos, D.H.M.; Saldanha, L.A.; Catharino,

R.R.; Sawaya, A.C.H.F.; Cunha, I.B.S.;

Carvalho, P.O.; Eberlin, M.N. Phenolic

Antioxidants Identified by ESI-MS from

Yerba Maté (Ilex paraguariensis) and Green

Tea (Camelia sinensis) Extracts. Molecules.

v. 12, p. 423-432, 2007.

Battestin, V.; Matsuda, L.K.; Macedo, G.A.

Fontes e aplicações de taninos e tanases em

alimentos. Alimentos e Nutrição.

Araraquara. v. 15, n. 1, p. 63-72, 2004.

Beena, P.S.; Basheer, S.M.; Bhat, S.C.; Bakali,

A.H.; Chandrasekaran, M. Propyl gallate

synthesis using acidophilic tannase and

simultaneous production of tannase and

gallic acid by marine Aspergillus awamori

BTMFW032. Applied Biochemistry and

Biotechnology. v. 164, n. 5, p. 612-628,

2011.

Belur, P.D.; Mugeraya, G. Microbial

Production of Tannase: State of the Art.

Research Journal of Microbiology. v. 6, n.

1, p. 25-40, 2011.

Brand-Wiliams, W.; Cuvelier, M. E.; Berset, C.

Use of a free radical method to evaluate

antioxidant activity. Food Science and

Technology. v. 28, n. 1, p. 25-30, 1995.

Cao, G; Sofice, P.R. Antioxidant capacity of tea

and common vegetables. Journal of

Agricultural and Food Chemistry. v. 44,

n. 11, p. 3426-3431, 1996.

Castellani, A. Viability of some pathogenic

fungi in distilled water. Journal of Tropical

Medicine & Hygiene, v. 42, n. 15, p. 225-

226, 1939.

Couri, S.; Menezes, L.F.; Pinto, G.A.S.; Souza,

M.L.M.; Freitas, S.P. Comparação entre os

tratamentos com tanase e com gelatina para

clarificação do suco de caju (Anacardium

occidentale L.). B. Ceppa. v. 20, n. 1, p. 41-

54, 2002.

Croft, K.D. The chemistry and biological

effects of flavonoids and phenolic acids.

Annals of the New York Academy of

Science, v. 20, n. 854, p. 435-442, 1998.

Dreosti, J. E. Antioxidant polyphenols in tea,

cocoa, and wine. Nutrition. v. 16, n. 7-8, p.

692-694, 2000.

Ferreira, D.F. Sisvar: a computer statistical

analysis system. Ciência e Agrotecnologia.

Lavras. v. 35, n. 6, p. 1039-1042, 2011.

German, B.; Dillard, C.J. Phytochemicals:

nutraceuticals and human health. Journal of

the Science of Food and Agriculture. v.

80, n. 12, p. 1744-1756, 2000.

Giada, M.L.R. Avaliação da capacidade

antioxidante dos compostos fenólicos do

cotilédone da semente de girassol

(Helianthus annuus L.) rajada. São Paulo:

USP/Faculdade de Ciências Farmacêuticas,

2006. 206p. (Tese de Doutorado).

Hagerman, A.E.; Butler, L.G. Protein

precipitation method for the quantitative

determination of tannins. Journal of

Agriculture and Food Chemistry. v. 26, n.

4, p. 809-812, 1978.

Hong, Y.H.; Jung, E.Y.; Shin, K.S.; Yu, K.W.;

Chang, U.J.; Suh, H.J. Tannase-converted

green tea catechins and their anti-wrinkle

activity in humans. Journal of Cosmetic

Dermatology, v. 12, n. 2, p. 137-143, 2013.

Hüttel, W.; Hoffmeister, D. Fungal

Biotransformations in Pharmaceutical

Sciences. In: Hofrichter, M. (ed.).

Industrial Applications. Germany:

Springer Berlin Heidelberg, 2011. cap. 14,

p. 293-317.

Langley-Evans, S. Antioxidant potential of

green and black tea determined using the

ferric reducing power (FRAP) assay.

International Journal Food Science and

Nutrition. v. 51, n. 3, p. 181-188, 2000.

Lekha, P.K, Lonsane, B. K. Production and

application of tannin acyl hydrolase: state of

the art. Advances in Applied

Microbiology. v. 44, p. 215-260, 1997.

Menezes, M. Aspectos biológicos e

taxonômicos de espécies do gênero

Colletotrichum. Anais da Academia



Pernambucana de Ciência Agronômica.

Recife. n. 3, p. 170-179, 2006.

Miller, H.E. A simplifies melhod for the

evaluation of. Antioxidants. Journal of the

American Oil Chemists Society. v. 48, n.

2, p. 91, 1971.

Naidu, M.M.; Sulochanamma, G.; Sampathu, S.

R.; Srinivas, P. Studies on extraction and

antioxidant potential of green coffee. Food

Chemistry. v. 107, n. 1, p. 377-384, 2008.

Nair, L.K.; Begum, M.; Geetha, S. Invitro-

Antioxidant activity of the seed and leaf

extracts of Syzygium cumini. Journal of

Environmental Science, Toxicology and

Food Technology. v. 7, n. 1, p. 54-62, 2013.

Nanjo, F.; Goto, K.; Seto R.; Suzuki, M.; Sakai,

M.; Hara, Y. Scavenging effects of tea

catechins and their derivatives on 1,1-

Dipheny1-2-Picrylheydrazy1 radical. Free

Radical Biology and Medicine. v. 21, n. 6,

895-902, 1996.

Nozaki, M.H.; Camargo, M.E.; Barreto, M.

Caracterização de Diaporthe citri em

diferentes meios de cultura, condições de

temperatura e luminosidade. Fitopatologia

Brasileira. Brasília. v. 29, n. 4, p. 429-432,

2004.

Pinto, G.A.S. Produção de tanase por

Aspergillus niger. Rio de Janeiro:

UFRJ/Escola de Química, 2003. 207p. (Tese

de Doutorado).

Pinto, G.A.S.; Brito, E.S.; Andrade, A.M.R.;

Fraga, S.L.P.; Teixeira, R.B. Fermentação

em Estado Sólido: Uma Alternativa para o

Aproveitamento e Valorização de Resíduos

Agroindustriais Tropicais. Comunicado

Técnico. Fortaleza. v. 102, p. 1-5, 2005.

Pinto, G.A.S.; Couri, S.; Gonçalves, E.B. 2006.

Replacement of methanol by ethanol on

gallic acid determination by rhodanine and

its impacts on the tannase assay. Electronic

Journal Environmental, Agricultural and

Food Chemistry. v. 5, n. 5, p. 1560-1568,

2006.

Pollard, D.J.; Woodley, J.M. Biocatalysis for

pharmaceutical intermediates: the future is

now. Trends in Biotechnology. v. 25, n. 2,

p. 66-73, 2007.

Riul, A.J. Purificação e Caracterização

Bioquímica de Tanases Produzidas pelo

Fungo Filamentoso Aspergillus phoenicis.

Araraquara: Universidade Estadual

Paulista/Instituto de Química, 2011. 127p.

(Dissertação de Mestrado).

Santos, A.B.; Silva, D.H.S.; Bolzani, V.S.;

Santos, L.A.; Schimdt, T. M.; Baffa, O.

Antioxidant properties of plant extracts: an

EPR and DFT comparative study of the

reaction with DPPH, TEMPOL and spin trap

DMPO. Journal of the Brazilian Chemical

Society. v. 20, n. 8, p. 1483-1492, 2011.

Santos, J.; Rey, M.S.; Rosseto, E.A.; Pierobom,

C.R. Crescimento e esporulação de três

raças de Colletotrichum lindemuthianum

(Sacc. & Magn.) sob quatro condições de

luminosidade. Revista Brasileira de

Agrociência. Pelotas. v. 11, n. 4, p. 493-

495, 2005.

Selwal, M.K; Yadav, A.; Selwal, K.K.;

Aggarwal, N.K.; Gupta, R.; Gautam, S.K.

Tannase production by Penicillium

atramentosum KM under SSF and its

applications in wine clarification and tea

cream solubilization. Brazilian Journal of

Microbiology. v. 42, n. 1, p. 374-387, 2011.

Serra, R.L.; Faheina Jr., G.S.; Pinto, G.A.S.;

Freitas, A.C. Produção de ácido gálico por

fermentação submersa utilizando

fermentador instrumentado. In: Congresso

Brasileiro de Engenharia Química, 20, 2014,

Florianóplois, Anais... Florianópolis:

Associação Brasileira de Engenharia

Química, 2014. v. 1, p. 2065-2072.

Severiano, M.E.; Simão, M.R.; Ramos, H.P.;

Parreira, R.L.T.; Arakawa, N.S.; Said, S.;

Ambrósio, S.R. Biotransformation of ent-

pimaradienoic acid by cell cultures of

Aspergillus niger. Bioorganic and

Medicinal Chemistry. v. 21, n. 18, p. 5870-

5875, 2013.

Sharma, S.; Bhat, T.K.; Dawra, R.K. A

spectrophotometric method for assay of

tannase using rhodanine. Analytical

Biochemistry. v. 279, n. 1, p. 85-89, 2000.

Singleton, V.L.; Orthofer, R.; Lamuela-

Raventos; R.M. Analysis of total phenols

and other oxidation substrates and

antioxidants by means of Folin-Ciocalteu

reagent. Methods in Enzymology. v. 299,

p. 152-178, 1999.

Westerterp-Plantenga, M.S.; Lejeune, M.P.;

Kovacs, E.M. Body weight loss and weight

maintenance in relation to habitual caffeine

intake and green tea supplementation.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/08915849

http://www.sciencedirect.com/science/journal/08915849



Obesity Research. v. 13, n. 7, p. 1195-

1204, 2005.

Wiseman, B.D.A.; Frei B. Antioxidants in tea.

Critical Reviews in Food Science and

Nutrition. v. 37, n. 7, p. 705-718, 1997.

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