Boletim de Pesquisae Desenvolvimento

Ministério da Agricultura,Pecuária e Abastecimento 44

ISSN 1677-2229Junho, 2008

Tigueras: uma Fonte de Inóculo Inicial da Mancha Bacteriana em Tomate para Processamento Industrial

República Federativa do Brasil Luiz Inácio Lula da Silva Presidente Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Reinhold Stephanes Ministro Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Conselho de Administração Luiz Gomes de Souza Presidente Silvio Crestana Vice-Presidente Alexandre Kalil Pires Hélio Tollini Ernesto Partemiani Cláudia Assunção dos Santos Viegas Membros Diretoria-Executiva da Embrapa Silvio Crestana Diretor-Presidente José Geraldo Eugênio de Franca Kepler Euclides Filho Tatiana Deane de Abreu Sá Diretores-Executivos Embrapa Hortaliças José Amauri Buso Chefe-Geral Carlos Alberto Lopes Chefe Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento Gilmar Paulo Henz Chefe Adjunto de Comunicação, Negócios e Apoio André Nepomuceno Dusi Chefe Adjunto de Administração

ISSN 1677-2299Junho,2008

Empresa Brasileira de Pesquisa agropecuáriaEmbrapa HortaliçasMinistério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 44

Tigueras: uma Fonte de Inóculo Inicial da Mancha Bacteriana em Tomate para Processamento Industrial Alice Maria Quezado-DuvalCarielli Milagre Neto GuimarãesClodoaldo Santos Silva

Basília-DF2008

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Pollyanna T. B. de Morais Editor Técnico: Flávia A. de Alcântara Membros: Alice Maria Quezado Duval Edson Guiducci Filho Milza M. Lana Raquel Freitas Waldir A. Marouelli Normalização bibliográfica: Rosane Mendes Parmagnani Editoração eletrônica: Rafael Miranda Lobo 1ª edição 1ª impressão (2008): 50 exemplares

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Embrapa Hortaliças

Quezado-Duval, Alice Maria Tigueras : uma fonte de inóculo inicial da mancha bacteriana em tomate para processamento

industrial / Alice Maria Quezado-Duval, Carielli Milagre Neto Guimarães e Clodoaldo Santos Silva -- Brasília : Embrapa Hortaliças, 2008. 13 p. - (Boletim de pesquisa e desenvolvimento / Embrapa Hortaliças , ISSN 1677-2229 ; 44)

1. Tomate industrial – Doença - Bactéria. 2. Tomate industrial – Planta invasora. I. Guimarães, Carielli Milagre Neto. II. Silva, Clodoaldo Santos. III. Título. IV. Série.

CDD 635.642 (21. ed.)

© Embrapa 2008

Sumário

Resumo ......................................................................................................... 01

Abstract ........................................................................................................ 02

Introdução ..................................................................................................... 03

Material e Métodos ......................................................................................... 04

Resultados e Discussão ....................................................................................05

Conclusões .....................................................................................................07

Referências .....................................................................................................08

Tigueras: uma Fonte de Inóculo Inicial da Mancha Bacteriana em Tomate para Processamento Industrial Alice Maria Quezado-Duval1Carielli Milagre Neto Guimarães2

Clodoaldo Santos Silva3

Resumo

A mancha bacteriana causada por Xanthomonas spp. é uma importante doença do tomate

para processamento industrial no Estado de Goiás. Existem relatos em outros países da

sobrevivência de Xanthomonas em sementes, plantas daninhas e plantas voluntárias. Neste

trabalho, plantas voluntárias (tigueras) de tomate com sintomas da doença foram coletadas em

Itaberaí, GO, em lavoura comercial do híbrido U2006, com 36 dias do transplante e

aparentemente sadias. Após isolamento em meio nutriente-ágar, obtiveram-se 23 isolados de

Xanthomonas. Vinte e um dias após a primeira coleta, coletaram-se folhas e frutos de plantas

do híbrido U2006 apresentando sintomas, obtendo-se três isolados. Todos os isolados foram

identificados por comparação de seus perfis genômicos, obtidos por BOX-PCR, com os de

isolados de referência das quatro espécies associadas à doença. Dos isolados das tigueras, 22

foram X. perforans e apenas um X. vesicatoria. Os três isolados de ‘U2006’ foram de X.

perforans, com perfis idênticos a 91% dos isolados de X. perforans das tigueras. A ocorrência

de uma espécie comum entre tigueras e posteriormente em plantas da cultivar, evidencia a

importância do papel das primeiras como fonte de inóculo inicial da doença. Este fato revela a

necessidade de se implementar no sistema de produção de tomate para processamento em

voga na região, uma rotação de culturas e/ou eliminação de tigueras mais eficiente.

1 Eng. Agr., DSc., Embrapa Hortaliças. E-mail: alice@cnph.embrapa.br2 Estudante de Biologia, Universidade Católica de Brasília, Brasilia-DF 3 Estudante de Biologia, Universidade Católica de Brasília, Brasilia-DF

Tigueras: a Source of Inoculum of Bacterial Spot in Processing Tomato in Goiás State, Brazil Alice Maria Quezado-DuvalCarielli Milagre Neto GuimarãesClodoaldo Santos Silva

Abstract

Bacterial spot is an important disease for processing tomatoes in Goiás. Survival of the associated Xanthomonas

on seeds, weeds, tomato crop residues and volunteer tomato plants are reported outside Brazil. In this work,

volunteer tomato plants with bacterial spot symptoms were collected in Itaberaí, state of Goiás, at a commercial

field of hybrid U2006. The plants were at 36 days stage from the transplant and apparentely healthy. Twenty-

three isolates of Xanthomonas were obtained at nutrient-agar medium. Twenty-one days after the first sampling,

leaves and fruits of the cultivar, with bacterial spot symptoms, were also collected. Three isolates were

obtained. All isolates were identified by comparing their genomic BOX-PCR profiles, with those of the four

Xanthomonas species associated with bacterial spot reference species. From the isolates originated from the

volunteer plants, 22 were X. perforans and only one X. vesicatoria. The isolates from ‘U2006’ were X.

perforans, with identical genomic profiles to 91% of the isolates from the volunteer plants. The occurrence of

one common specie between the volunteer plants and later on the plants of the hybrid, give some support of the

important rule of volunteer plants as initial inoculum source for bacterial spot. This fact also highlights the

necessity of an eficient crop rotation and/or elimination of volunteer plants in the region.

Index terms: X. perforans L., X. vesicatoria, Solanum lycopersicum.

Tigueras: uma Fonte de Inóculo Inicial da Mancha Bacteriana em Tomate para Processamento Industrial 3

Introdução

A mancha bacteriana do tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma das doenças mais importantes do tomate para processamento industrial no Brasil, tendo inclusive sido apontada por produtores do Estado de Goiás como um dos maiores problemas para a produção da cultura (VILLAS BÔAS et al., 2007). Nesse estado, que é o maior produtor nacional, maiores incidência e severidade da doença têm sido observadas em lavouras irrigadas por pivô central e nos plantios iniciais (fevereiro-março) e finais (maio-junho) da safra, quando as temperaturas são mais elevadas e há maior ocorrência de chuvas. A doença se manifesta na parte aérea da planta, iniciando-se como pequenas pontuações acizentadas de aspecto encharcado. Os sintomas típicos são manchas arredondadas de coloração marrom escura, ligeiramente deprimidas e nas folhas manchas de bordos irregulares que coalescem dando um aspecto de queima. No tomate para processamento industrial, a queima precoce da folhagem provocada pela doença deixa os frutos expostos à escaldadura pelo sol, o que reduz a qualidade fabril dos mesmos. Plantas doentes têm crescimento e produção reduzida, dependendo da severidade do ataque e do estádio de desenvolvimento das plantas (STALL, 1993). A mancha bacteriana em tomateiro pode ser causada por até três espécies de Xanthomonas: X. vesicatoria, X. gardneri e X. perforans, que foram recentemente descritas (JONES et al., 2004). A proposição dessas espécies advém de resultados de pesquisas relacionadas à variabilidade genética de X. campestris pv. vesicatoria, por muito tempo reconhecido como o agente etiológico da mancha bacteriana. Estudos de sobrevivência de um ciclo a outro de cultivo, epidemiologia e controle remontam do período anterior à distinção das espécies. De acordo com Jones et al. (1985), em observações feitas na Flórida, EUA, além de sobreviver em resíduos de colheita, plantas daninhas e sementes, plantas voluntárias teriam importante papel na perpetuação de Xanthomonas da mancha bacteriana em determinada área. Em geral, os cultivos de tomateiro para processamento industrial na região de Goiás ocorrem em uma mesma área uma vez por ano, em alternância com apenas um ciclo de lavoura de gramínea, geralmente milho (Zea mays L.). Este fato tem propiciado a ocorrência de plantas voluntárias de tomate (tigueras) no início do estabelecimento da lavoura comercial, que requer a prática da capina. O objetivo da capina seria o de reduzir, não só a competitividade por nutrientes com a lavoura principal, mas também os problemas advindos de mistura varietal por ocasião da colheita. A quantidade de tigueras de um ciclo para o outro, por sua vez, pode depender do manejo da cultura. Por exemplo, foi observado por Madeira (dados não publicados), em um ensaio de adubação realizado em 2007, em diferentes sistemas de cultivos de tomate para processamento industrial, um número superior de tigueras na área de plantio direto, comparado à área de sistema convencional. Neste trabalho é relatado a observação da mancha bacteriana em plantas voluntárias de tomate em uma lavoura comercial em Goiás, evidenciando-se por meio da identificação da(s)

4 Tigueras: uma Fonte de Inóculo Inicial da Mancha Bacteriana em Tomate para Processamento Industrial

espécie(s) de Xanthomonas envolvida(s), de acordo com a proposição de Jones et al. (2004), a importância das mesmas como fonte de inóculo inicial da doença.

Material e Métodos A lavoura do híbrido U2006 (Unilever BestFoods) foi instalada em 28 de fevereiro de 2007, em sistema de plantiio direto, na Fazenda Córrego Branco, município de Itaberaí, Estado de Goiás. O híbrido plantado na área no ano anterior foi o Heinz 9553 (Heinz). Foram realizadas três visitas à lavoura ao longo do ciclo da cultura, aos 36 dias após o transplante (dat; 04/04/2007), aos 57 dat (25/04/2007) e aos 97 dat (05/06/2007). Foram coletadas amostras de plantas com sintomas de mancha bacteriana durante as duas primeiras visitas. As amostras de folhas e posteriormente também de frutos com sintomas foram acondicionadas em sacos de pape. O isolamento e a identificação dos isolados obtidos foram realizados no Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Hortaliças, em Brasília, DF. O isolamento foi feito em meio nutriente-ágar (NA), após assepsia dos fragmentos de folha ou fruto com lesão. Após 4 dias de incubação a 28oC, foram selecionadas colônias puras (uma colônia/amostra) para novo crescimento por 2 dias e preservação dos isolados em tampão fosfato pH 7,0. Para a identificação dos isolados foi inicialmente feita a extração do DNA pelo método CTAB, descrito em Quezado-Duval, 2003. Para tanto, os isolados preservados foram recuperados em meio NA, selecionando-se após 4 dias de crescimento a 28oC, colônias puras para transferência para novo meio NA. Após 2 dias, uma alíquota de massa bacteriana formada pelo volume de uma alça bacteriológica foi então transferida para 5 mL de meio nutriente-ágar (NB), à temperatura ambiente para cultivo sob agitação contínua por cerca de 15 h. Após etapas de centrifugação, obteve-se uma massa bacteriana que foi submetida às etapas subsequentes da extração. Os isolados obtidos foram comparados a isolados de referência de cada espécie (Tabela 1) quanto aos perfis genômicos obtidos por BOX-PCR e presença / ausência de fragmento dos genes avrRxv (presenta na raça T1) e avrXv3 (raça T3), ambos evidenciados por meio de PCR com iniciador específico (BOUZAR et al., 1994 e ASTUA-MONGE et al., 2000, respectivamente). Tabela 1. Procedência e ano dos isolados de referência utilizados para identificação das espécies de Xanthomonas dos isolados coletados em lavoura de tomate para processamento industrial em Itaberaí, GO, 2007. Isolado Espécie Procedência Ano

CNPH 213-T X. euvesicatoria Petrolina-PE 1996

CNPH 411-T X. euvesicatoria Morrinhos-GO 1998

CNPH 468-T X. euvesicatoria Morrinhos-GO 1998

CNPH 89-T X. vesicatoria Itapaci-GO 1995

EH 2005-54 X. perforans Goiânia-GO 2005

EH 2006-17 X. gardneri Goiânia-GO 2006

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Resultados e Discussão Por ocasião da primeira visita à lavoura, verificou-se a ocorrência de plantas voluntárias de tomate (tigueras) com sintomas de mancha bacteriana (Fig. 1). Essas plantas provavelmente originaram-se do banco de sementes remanescentes da colheita de frutos do ano anterior. Plantas do híbrido ‘U2006’, no entanto, apresentavam-se aparentemente sadias. Vinte e um dias após, sintomas da doença já podiam ser vistos na parte aérea do híbrido comercial (Fig. 2). Na última visita, a doença já estava bastante disseminada na área, com alta incidência de frutos com sintomas e seca generalizada da folhagem (Fig. 2). Foram obtidos 23 isolados na primeira visita e três na segunda (Tabela 2).

A B

C

Figura 1. A. Campo de ‘U2006’com em Itaberaí-GO aos 36 diasdo transplante. B. Plantas de‘U2006’ (folhas verde maisescuro, acima) e de tigüera de‘Heinz 9553’ (folhas verde maisclaro). C. Sintomas de manchabacteriana em tigüera de ‘Heinz9553’.

Tabela 2. Coletas de amostras de plantas com sintomas de mancha bacteriana realizadas na Fazenda Córrego Branco em Itaberaí, GO. Data da coleta Dia após transplantio Tipo de amostra Número de isolados obtidos

04/04/2007 36 Tiguera 23

25/04/2007 57 ‘U2006’ 3

Analisando os perfis obtidos por BOX-PCR, verificou-se que 22 isolados originados das tigueras, representando 96% do total, foram mais semelhantes ao isolado de referência de X. perforans (EH 2005-54). Apenas um isolado (Tig-41) foi considerado mais semelhante ao isolado de referência de X. vesicatoria (CNPH 89-T) (Fig. 2). Os três isolados de ‘U2006’, por sua vez, foram identificados como X. perforans, como a maioria dos isolados das tigueras.

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A

C

Figura 2. A. Campo de‘U2006’ em Itaberaí-GO, aos57 dias após o transplante. B.Sintoma inicial de manchabacteriana em fruto de ‘U2006’nesta ocasião. C. Sintomas demancha bacteriana em frutosde ‘U2006’ e seca defolhagem, aos 97 dias após otransplante.

B

Para corroborar na identificação inicial, foram realizadas reações de PCR com os iniciadores específicos RST27/RST28 e RST88/RST89, de fragmentos dos genes avrRxv e avrXv3, respectivamente. O primeiro identificaria a raça T1, uma característica de X. euvesicatoria, e o segundo, a raça T3 de X. perforans. Nenhum isolado amplificou o produto de 680 pares de base (pb) esperado para o conjunto RST27/RST28, indicando que nenhum isolado pertence a X. euvesicatoria (Fig. 3A). Por outro lado, todos os isolados previamente atribuídos a X. perforans amplificaram o produto de 654-bp esperado para o iniciador RST88/RST89 (Fig. 3B). M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

500 pb

1.000 pb

Figura 3A. Perfis genômicos de Xanthomonas spp. gerados por BOX-PCR. Poço M, marcador 1 kb-DNA Plus; poços 1

a 4, isolados-referência (X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X. gardneri e X. perforans, respectivamente); poços 5 a 11,

isolados das tigueras; poços 12 e 13, isolados de ‘U2006’ e poço 14; isolado Tig-41 (tiguera).

Tigueras: uma Fonte de Inóculo Inicial da Mancha Bacteriana em Tomate para Processamento Industrial 7

M 1 2 3 4 5

500 pb

1.000 pb

M 1 2 3 4 5 6 7

A B

Figura 3B. Fragmentos de DNA genômico de Xanthomonas spp. contendo os genes avrRxv (A) e avrXv3 (B). A. Poço

M, marcador 100 pb; poço 1, isolado-referência de X. vesicatoria; poço 2, Tig-41 (tiguera); poços 3 a 5, isolados-

referência de X. euvesicatoria (CNPH 213-T, CNPH 411-T e CNPH 468-T). B. Poço M, marcador 100 pb; poço 1,

isolado-referência de X. perforans; poços 2 e 3, Tig-2 e Tig-3 (tigueras); poços 4, 5 e 6, isolados U2006-1, U2006-2

e U2006-3; poço 7, Tig-41.

A ocorrência dessas espécies já foi relatada em lavouras de tomate para processamento industrial no Brasil e, particularmente no Estado de Goiás (QUEZADO-DUVAL et al., 2005). No município de Itaberaí, nas lavouras de início da safra, é senso comum a ocorrência de epidemias severas da mancha-bacteriana, tanto que o híbrido U2006, por ser considerado uma das mais resistentes por técnicos da indústria, é preferida para esse período do ano. A ocorrência de X. perforans em amostras de outra fazenda deste mesmo município já foi registrada em 2002 e 2005 pelo Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Hortaliças. Esta espécie tem sido considerada mais agressiva em relação a X. euvesicatoria e X. vesicatoria (JONES et al., 1998). A ocorrência de uma espécie comum entre tigueras e posteriormente plantas da lavoura comercial, evidencia o papel das primeiras como fonte de inóculo inicial e fator de perpetuação da doença na área. Este fato revela, ainda, a necessidade de se implementar no sistema de produção de tomate para processamento industrial em voga na região, um esquema de rotação de culturas (e não apenas alternância de cultivos) e/ou de eliminação mais eficiente das tigueras.

Conclusões

• A identificação de espécies de Xanthomonas, bem como a análise de seus perfis genômicos por BOX-PCR auxilia na elucidação da origem da mancha bacteriana em uma lavoura.

• As plantas voluntárias de tomate podem ser fonte de inóculo inicial para a ocorrência da mancha bacteriana em lavouras de tomate para processamento no Estado de Goiás.

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Referências ASTUA-MONGE, G.; MINSAVAGE, G. V.; STALL, R. E.; VALLEJOS, C. E. ; DAVIS, M. J.; JONES, J. B. Xv4-vrxv4 : a new gene-for-gene interaction identified between Xanthomonas campestris pv. vesicatoria race T3 and the wild tomato relative Lycopersicon pennellii. Molecular Plant-Microbe Interactions, Saint Paul, v. 13, p. 1346-1355, 2000. BOUZAR, H.; JONES, J. B.; STAL, R. E.; HODGE, N. C.; MINSAVAGE, G. V.; BENEDICT, A. A.; ALVAREZ, A. M. Physiological, chemical, serological, and pathogenic analyses of a worldwide collection of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria strains. Phytopathology, Saint Paul, v. 84, p. 663-671, 1994. JONES J. B ; BOUZAR, H.; SOMOD, G. C.; STALL, R. E.; PERNEZNY, K. ; EL-MORSY, G. ; SCOTT, J. W. Evidence of the preemptive nature of tomato race 3 of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in Florida. Phytopathology, Saint Paul, v. 88, p. 33-38, 1998. JONES, J. B.; POHRONEZNY , K. L.; STALL, R. E.; JONES, J. P. Survival of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in Florida on tomato crop residue, weeds, seeds, and volunteer tomato plants. Phytopathology, Saint Paul, v. 76, p. 430-434, 1985. JONES, J. B.; LACY, G. H. ; BOUZAR, H.; STALL, R. E. ; SCHAAD, N. W. Reclassification of the xanthomonads associated with bacterial spot disease of tomato and pepper. Systematic Applied Microbiology, Stuttgart, v. 27, p.755-762, 2004. QUEZADO-DUVAL, A.M.; LEITE JÚNIOR, R. P.; LOPES, C. A.; LIMA, M. F.; CAMARGO, L. E. A. Diversity of Xanthomonas spp. associated with bacterial spot of processing tomatoes in Brazil. Acta Horticulturae, The Hague, v. 695, p. 101-108, 2005. STALL, R. E. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria: cause of bacterial spot of tomato and pepper. In: SWINGS, J.G.; CIVEROLO, E.L. Xanthomonas. London: Chapman & Hall, 1993. p. 57-60. VILLAS BÔAS, G. L.; MELO, P. E. de; CASTELO BRANCO, M.; GIORDANO, L. de B.; MELO, W. F. de. Desenvolvimento de modelo de produção integrada de tomate indústria-PITI In: ZAMBOLIN, L.; LOPES, C. A.; PICANÇO, M. C.; COSTA, H. (Ed.). Manejo integrado de doenças e pragas, hortaliças.Viçosa, MG: Universidade Federal de Viçosa, 2007. p. 349-362.