book sc v5n4 - iicweb.org · industrial, bem como estudantes de graduação e pós-graduação. O...

Scientia ChromatographicaRevista Trimestral do Instituto Internacional de Cromatografi a

2013 | Volume 5 | Número 4

Scientia Chromatographica 2013; 5(4) 245

SUMÁRIO

Editorial ................................................................................................................... 247

Microextração em fase líquida suportada com fi bra oca (HF-LPME): Fundamentos e aplicações recentes ............................................ 249Josias Merib, Eduardo Carasek

Acoplamiento de plataformas mesofl uídicas a sistemas cromatográfi cos para la automatización y miniaturización del tratamiento de muestra previa a separaciones analíticas .......................................................263Manuel Miró

Microextração adsortiva em barra (BAµE): Um conceito analítico inovador para microextração estática ......................................... 275J. M. F. Nogueira

Microextração em fase sólida e cromatografi a de gás: Uma combinação de elevado potencial ................................................................. 284Sílvia M. Rocha, Ângelo C. Salvador, Cátia Martins, Corália Barbosa, Magda Santos, Sílvia Petronilho

Desenvolvimento de um novo sistema de microextração em fase sólida com fi bra resfriada .................................................................... 301Helvécio C. Menezes, Zenilda L. Cardeal

SIMCRO 2014 - VI Simpósio Brasileiro de Cromatografi a e Técnicas Afi m ................... 310

Bookstore ................................................................................................................. 318

Informação Para Autores ........................................................................................... 319


EDITORIAL

O 15th International Symposium on Advances in Extraction Technologies (ExTech-2013)

reuniu em João Pessoa-PB, entre os dias 05 e 07 de agosto de 2013, especialistas da

área de preparo de amostras de diferentes setores de atuação, tais como acadêmico e

industrial, bem como estudantes de graduação e pós-graduação. O evento reuniu mais de

200 participantes de diversas regiões do Brasil e do exterior, levando a interação, troca de

experiências e discussão de trabalhos de ponta na área de preparo de amostras. Além disso,

minicursos sobre diversos assuntos na área de preparo de amostras – desde fundamentos

até a automação do preparo – foram oferecidos. O evento contou com diversas palestras de

especialistas nacionais e do exterior da academia, sessões orais apresentadas por estudantes

de graduação e pós-graduação, e seminários técnicos apresentados por especialistas de

empresas. Diversas atividades sociais e a concentração dos participantes no Hotel Tambaú

permitiram um maior contato entre especialistas e entre especialistas e estudantes, tornando o

evento mais produtivo para todos e possibilitando a formação de novas redes de cooperação

entre grupos nacionais e internacionais.

Maria Eugênia Queiroz Nassur

Eduardo Carasek da Rocha

Editores Convidados

Scientia Chromatographica 2013; 5(4):247

Instituto Internacional de Cromatografia

http://dx.doi.org/10.4322/sc.2014.007

ISSN 1984-4433

PREPARO DE AMOSTRAS

Scientia Chromatographica 2013; 5(4):249-262


DOI: http://dx.doi.org/10.4322/sc.2014.008

ISSN 1984-4433

Microextração em fase líquida suportada com fibra oca (HF-LPME): Fundamentos e aplicações recentes

Josias Merib, Eduardo Carasek*Departamento de Química, Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, Cep 88040-900, Florianópolis, SC, Brazil

e-mail: [email protected]

Resumo

A etapa de preparo de amostras constitui parte de um procedimento analítico, pois a maioria das amostras não são analisadas na sua forma bruta, mas após serem submetidas a um tratamento adequado prévio. Tendo em vista principalmente a efi ciência nas análises, bem como a redução da quantidade de solventes orgânicos empregados nos procedimentos, foram desenvolvidas as chamadas técnicas miniaturizadas de preparo de amostras, merecendo destaque a microextração em fase líquida suportada com membrana oca (HF-LPME). Essa técnica baseia-se na utilização de quantidades muito pequenas de solvente orgânico imobilizado nos poros de uma membrana, sendo utilizada em duas ou três fases; o mecanismo de extração dos analitos é baseado no equilíbrio de partição entre a fase extratora (aquosa ou orgânica) e a amostra. Essa técnica apresenta ampla aplicabilidade, principalmente para amostras extremamente complexas, nomeadamente urina, sangue e matrizes que apresentam material particulado. Nesta contribuição são apresentados alguns aspectos teóricos básicos referentes à HF-LPME, bem como algumas aplicações recentes e variantes dessa técnica.

Palavras-chaveHF-LPME; preparo de amostras; amostras complexas; microextrações.

Supported liquid phase microextraction with hollow fiber (HF-LPME): Fundamentals and recent applications

Abstract

Th e sample preparation step is a key part of an analytical procedure, due to majority of the samples are not analyzed in their raw form, but aft er being subjected to a previous suitable treatment. Especially regarding to the effi ciency for the analysis as well as reducing the amount of organic solvents used in these procedures, miniaturized techniques of sample preparation was developed, with emphasis in hollow-fi ber liquid phase microextraction (HF- LPME). Th is technique is based on the use of very small amounts of organic solvent immobilized in the pores of a membrane, it can be used in two or three phases; the extraction mechanism is based on the partition equilibrium of the analytes between the extraction phase (aqueous or organic) and the sample. Th is technique has wide applicability, especially for highly complex samples, such as urine, blood and matrices containing particulate material. Th is paper presents some basic theoretical aspects related to HF-LPME, as well as some recent applications and variants of this technique.

KeywordsHF-LPME; sample preparation; complex samples; microextractions.

Merib J, Carasek E Microextração em fase líquida suportada com fibra oca

250 Scientia Chromatographica 2013; 5(4):249-262

1 Introdução

Em praticamente todos os tipos de análises realizadas na área da química é necessário uma etapa de preparo de amostra anteriormente à análise propriamente dita. É comum não se ana-lisarem quimicamente matrizes na forma bruta, pois elas costumam gerar e apresentar interfe-rências e incompatibilidades com equipamentos analíticos. Para contornar tais problemas, são empregados procedimentos de preparo de amos-tra, com os quais procura-se isolar e concentrar os analitos a níveis adequados e obter-se uma condição de limpeza da amostra que não com-prometa a sua análise química[1].

Essa etapa de preparo de amostras constitui--se de fundamental importância e é essencial para o sucesso de qualquer método analítico. Geralmente, essa etapa é dependente das caracte-rísticas do analito e da matriz, exigindo uma oti-mização adequada de seus diferentes parâmetros de infl uência. Embora no passado não se tenha dado muita atenção, especialmente devido aos avanços na instrumentação analítica, atualmente os esforços direcionam-se ao desenvolvimento e melhoria de diversos métodos de preparo de amostras. Nesse sentido, a tendência é a sua simplifi cação, miniaturização e automatização, envolvendo a redução na utilização de solventes e o desenvolvimento de processos menos agres-sivos ao meio ambiente, mantendo-se ao mesmo tempo a boa efi ciência de extração[2].

Tendo em vista esse foco na busca de téc-nicas de preparo de amostras efi cientes e com menos impacto ambiental, a última década do século XX teve extrema importância, sendo que várias das técnicas desenvolvidas nesse período são utilizadas e aperfeiçoadas inclusive nos dias de hoje, sendo aplicadas para análise de diver-sos analitos nas mais variadas matrizes. Dentre as técnicas desenvolvidas, ganharam destaque

as chamadas técnicas miniaturizadas de preparo de amostras, as quais tiveram grande impulso com o desenvolvimento da microextração em fase sólida (SPME, do inglês solid phase microex-traction) proposta por Pawliszyn e colaborado-res no ano de 1990[3]. Em 1996 foram apresen-tados os primeiros trabalhos sobre a utilização da microextração em fase líquida (LPME, do inglês liquid phase microextraction) introduzi-dos por Dasgupta et al.[4] e Cantwell et al.[5]; mais tarde, Lee et al.[6] e Andrews et al.[7] também se envolveram no desenvolvimento da técnica. A partir desses primeiros trabalhos realizados com microextração em fase líquida foram desenvolvi-das diferentes variantes para a LPME, cada uma delas apresentando características específi cas.

2 Diferentes formas de microextração em fase líquida

Podem-se distinguir diversos métodos inte-grantes do grupo da LPME, por exemplo, dentre os mais difundidos estão a microextração com gota única (SDME, do inglês single drop microex-traction)[4], a qual foi o primeiro modelo desen-volvido para a LPME; a microextração líquido--líquido dispersiva (DLLME, do inglês dispersive liquid-liquid microextraction)[8] e a microextra-ção em fase líquida suportada com membrana oca (HF-LPME, do inglês hollow-fi ber liquid phase microextraction[9]).

Os primeiros sistemas para LPME base-aram-se na extração de analitos em amostras aquosas por meio de uma pequena gota de um solvente orgânico – em virtude dessa confi gura-ção, essa técnica fi cou conhecida como micro-extração com gota única, SDME. Tipicamente, a pequena gota de solvente orgânico era suspensa a partir da ponta de uma seringa para cromato-grafi a gasosa (GC, do inglês gas chromatography) e colocada na solução aquosa para a realização da

Microextração em fase líquida suportada com fibra oca Merib J, Carasek E

Scientia Chromatographica 2013; 5(4):249-262 251

extração. Dessa forma, os analitos eram extraí-dos da amostra aquosa pela gota em suspensão, baseada na difusão passiva, e as recuperações das extrações eram essencialmente determinadas pelo coefi ciente de partição entre o solvente orgânico e a água. Quando terminada a extração, a gota de solvente orgânico era recolhida para o interior da seringa e subsequentemente injetada no croma-tógrafo a gás. Apesar de essa confi guração para a LPME ser muito simples e efi ciente e reduzir o consumo de solventes orgânicos por amostra para apenas alguns μL, ela é utilizada apenas em um número limitado de laboratórios de pesquisa. Uma razão para isso pode ser a baixa estabilidade da gota suspensa, a qual pode ser facilmente per-dida na amostra durante a extração[10].

A DLLME foi introduzida por Rezaee et al. em 2006[8], consistindo basicamente da mis-tura de um solvente dispersor, miscível no sol-vente extrator (fase orgânica) e na amostra (fase aquosa), bem como de um solvente extrator, imiscível na fase aquosa, sendo baseada em um sistema ternário de solventes. A mistura de poucos μL dos solventes extrator e dispersor é introduzida rapidamente na amostra, propor-cionando a formação de uma quantidade muito grande de microgotículas, as quais permitem a formação de uma grande área de contato entre o solvente extrator e a amostra, facilitando dessa forma a passagem dos analitos da fase aquosa para a fase extratora. Após um tempo determi-nado, a fase extratora decanta para o fundo do frasco, de onde é retirada com auxílio de uma microsseringa e encaminhada para um sistema analítico de leitura; caso não ocorra a decantação pode ser necessária a utilização do processo de centrifugação[11].

Outro método extremamente importante do rol das técnicas de microextração em fase líquida é a chamada microextração em fase líquida suportada com membrana oca (HF-LPME),

a qual foi introduzida em 1999 por Pedersen-Bjegaard et al.[9]. Nesse estudo foram analisadas amostras de urina e plasma humano e utilizado como analito a metanfetamina, utilizando-se um solvente orgânico, nesse caso 1-octanol, o qual foi imobilizado nos poros de uma membrana de polipropileno (fi bra oca), formando uma mem-brana líquida suportada (SLM, do inglês suppor-ted liquid membrane). O interior da fi bra oca foi preenchido com 25 μL de uma solução receptora ácida e uma pequena quantidade de NaOH foi adicionada à amostra, para ajuste de pH. O ana-lito foi extraído da fase doadora (amostra) para o solvente orgânico e em seguida conduzido para a fase receptora. Após a extração, a fase recep-tora foi analisada por eletroforese capilar, sendo encontrados limites de detecção da metanfe-tamina da ordem de 5 ng mL–1 para ambas as matrizes, com desvio padrão relativo de 5,2% e coefi ciente de correlação de 0,9983.

Existem ainda outros métodos envolvendo a microextração em fase líquida, tais como a microextração com gota diretamente suspensa, DSDME (do inglês direct-suspended droplet microextraction)[12], e a microextração por solidi-fi cação de gota fl utuante, SFDME (do inglês, soli-difi cation of fl oating drop microextraction)[13]. No decorrer deste trabalho serão abordados maiores detalhes sobre a técnica de microextração em fase líquida utilizando-se membrana oca (HF-LPME) e algumas considerações teóricas sobre a técnica serão discutidas, bem como serão apresenta-dos avanços e aplicações recentes desse tipo de microextração, pesquisados em revisão biblio-gráfi ca de revistas científi cas especializadas.

3 Princípios básicos da HF-LPME

Como mencionado, essa variante da LPME foi introduzida no fi nal da década de 1990, con-sistindo basicamente na utilização de um sol-



vente orgânico imiscível em água imobilizado em uma fi na membrana líquida suportada na parede de uma membrana oca porosa, mem-brana essa cujo tamanho varia, geralmente, de 1,5 a 10 cm, dependendo da aplicação. A imobi-lização do solvente é facilmente conseguida pela imersão da membrana oca, por poucos segundos, no solvente orgânico, o qual imediatamente fl ui para os poros por força capilar, sendo o excesso de solvente retirado da superfície da membrana. A membrana mais utilizada para HF-LPME é a composta por polipropileno, geralmente apre-sentando porosidade de aproximadamente 70%, tamanho de poros de 0,2 μm, expessura de parede de aproximadamente 200 μm e diâme-tro interno de 600 μm. O interior da membrana oca é subsequentemente preenchido com alguns μL de uma solução receptora e todo o conjunto é colocado na solução da amostra para a extra-ção dos compostos de interesse. Os analitos são extraídos a partir da amostra (aquosa) por meio da SLM (orgânica) e migram para a solu-ção receptora (aquosa ou orgânica) localizada no interior da membrana oca.

Após extração, a solução receptora é retirada com auxílio de uma microsseringa e submetida à análise fi nal, quer por cromatografi a em fase gasosa (GC), quer por cromatografi a líquida de alta efi ciência (HPLC), eletroforese capilar (CE) ou mesmo hifenadas a espectrometria de massa (MS)[10]. Também são encontrados trabalhos na literatura envolvendo a utilização da HF-LPME juntamente com a espectrometria de absorção atômica na determinação de algumas espécies de metais[14,15] .

4 Configurações para HF-LPME

A microextração em fase líquida utilizando membrana oca apresenta duas formas básicas: utilização de duas ou três fases. No sistema uti-

lizando duas fases, o analito é extraído de uma amostra aquosa (fase doadora) através de um solvente imiscível com a água, o qual é imobi-lizado nos poros da membrana oca para for-mar a membrana líquida suportada – utiliza-se também esse mesmo solvente orgânico no inte-rior dessa membrana (fase extratora). O extrato fi nal obtido no sistema com duas fases é uma fase orgânica compatível com técnicas analíti-cas tais como HPLC ou GC. A Equação 1 rela-ciona a concentração de analito (A) no equilíbrio entre a amostra (A amostra) e a fase extratora orgâ-nica receptora (A fase orgânica) para um sistema de HF-LPME com duas fases.

amostra fase organicaA A (1)

No sistema de HF-LPME com duas fases, os analitos são extraídos por difusão passiva da amostra aquosa (solução doadora) direta-mente para a solução orgânica receptora, como mostrado na Equação 1. O processo de extra-ção depende do coefi ciente de partição entre a solução orgânica receptora e a solução doadora (Kr/d), conforme a Equação 2:

eqa d

r

eq d

CK

C,

/,

= (2)

onde Ceq,r corresponde à concentração do ana-lito no equilíbrio na solução receptora e Ceq,d é a concentração do analito no equilíbrio na solução doadora[16].

No sistema utilizando três fases, o analito é extraído de uma solução aquosa (fase doadora) através de um solvente orgânico imobilizado nos poros de uma membrana oca (fase orgânica) para uma nova fase aquosa (fase receptora) presente no interior da fi bra oca. A fase orgânica, nesse caso, funciona como uma barreira entre a solu-ção receptora e a solução doador –, essa barreira não permite a mistura dessas duas fases aquosas. Nesse caso, a fase receptora é aquosa, sendo esse



sistema também largamente utilizado em HPLC ou eletroforese capilar[17]. Essa metodologia de análise utilizando três fases foi originalmente denominada por Pederseen-Bjergaard et al. LLLME (do inglês, liquid-liquid-liquid microex-traction)[9]. A Equação 3 relaciona a concentra-ção de analito no equilíbrio entre a amostra (A

amostra), a fase extratora orgânica (A fase orgânica) e a fase aquosa receptora (A fase receptora) para um sis-tema de HF-LPME com três fases.

amostra fase organica fase receptoraA A A (3)

O pH é um parâmetro muito importante que afeta a efi ciência de extração quando se tra-balha com um sistema de HF-LPME utilizando três fases. O pH da fase doadora deve ser ajus-tado para manter os analitos na forma não ioni-zada, enquanto que o pH para a fase receptora deve ser ajustado a um valor em que os analitos permaneçam na forma ionizada. A diferença de pH entre a fase doadora e a receptora é um dos principais parâmetros que podem promover a transferência dos analitos da fase doadora para o solvente orgânico imobilizado e, posterior-mente, para a fase receptora. Dessa forma, os valores de pH para a fase doadora e receptora são selecionados como sendo ligeiramente menores e maiores do que o valor do pKa do analito[18]. No sistema de HF-LPME utilizando três fases, os analitos são extraídos mediante difusão pas-siva da amostra aquosa (fase doadora), através do solvente orgânico imobilizado nos poros da membrana oca (fase orgânica) e, posteriormente, pela fase receptora aquosa presente no interior dessa membrana. O processo geral de extração é afetado por ambos os coefi cientes de partição, entre a fase orgânica e a solução doadora (Korg/d) e entre a fase receptora e a fase orgânica (Kr/org), conforme defi nido pelas Equações 4 e 5:

eqo

org

qd

erg

dK

CC

,/

,= (4)

eqr

r

eq gg

oo

rrK

CC

,

,/ = (5)

onde Ceq,org corresponde à concentração do ana-lito no equilíbrio na fase orgânica, Ceq,d é a con-centração do analito no equilíbrio na solução doadora e Ceq,r corresponde à concentração do analito no equilíbrio na solução receptora. O coefi ciente de partição entre a fase receptora e a fase doadora (Kr/d), que deve ser considerado como a força motriz global para a extração, é cal-culado como o produto de Korg/d e Kr/org, represen-tado pela Equação 6[16]:

eq rr d org d r org

eq d

CK K K

C,

/ /,

= = ⋅ (6)

Na Figura 1 estão representados esque-mas dos constituintes de um dos sistemas de HF-LPME utilizados, um com três fases (A) e outro com duas (B).

Como pode ser observado, a principal dife-rença entre as duas formas de extração é a solução do interior da membrana oca: utilizando-se o sis-tema de três fases tem-se uma solução receptora aquosa e, no caso da confi guração em duas fases, utiliza-se como fase receptora uma fase orgânica. São utilizados frascos devidamente vedados e, no caso do esquema da Figura 1, pequenos tubos cônicos como guias – geralmente utilizam-se

Figura 1 Esquema dos modos de extração utilizados em HF-LPME. Fonte: adaptado de Lee et al.[19]



ponteiras de micropipetas com as extremidades cortadas, as quais facilitam a colocação e retirada da solução presente no interior da membrana oca com o auxílio de uma microsseringa.

Existem outras confi gurações empre-gando-se HF-LPME, tal como a adaptação da membrana oca em forma de U, na qual são utili-zadas duas microsseringas para a injeção e a reti-rada da solução receptora do interior da mem-brana; outra confi guração possível é a utilização da membrana em forma de haste, com a parte inferior da membrana selada mediante aplicação de pressão, valendo-se nesse caso também do auxílio de uma microsseringa para a colocação e retirada da solução receptora, como mostrado na Figura 2a, b.

5 Principais parâmetros a serem otimizados em HF-LPME

Há alguns parâmetros que devem ser otimi-zados quando se utiliza a microextração em fase líquida com fi bra oca, os principais são: a escolha do tipo de membrana a ser empregada, o tempo de extração, o solvente orgânico, o ajuste do pH e

da força iônica na solução da amostra, a agitação da amostra e os volumes das soluções doadora e receptora.

5.1 Escolha da membrana

Em relação à escolha da membrana devem-se priorizar membranas que possuem certa hidro-fobicidade, para compatibilizar a interação com solvente orgânico, bem como alta porosidade, para a imobilização desse solvente. Geralmente são escolhidas membranas compostas de poli-propileno – cujas especifi cações já foram men-cionadas anteriormente[17].

5.2 Tempo de extração

Um fator extremamente importante é a otimização do tempo de extração, tendo em vista que o processo de transferência de massa é dependente do tempo. O tempo de extração é defi nido teoricamente como o tempo em que o sistema alcança o equilíbrio. Tipicamente, o tempo de extração depende de algumas caracte-rísticas do analito, tais como a massa molecular e suas volatilidades[17,21].

5.3 Solvente orgânico

Essa também é uma variável que possui extrema importância quando se trabalha com microextração em fase líquida. O solvente utili-zado deve possuir algumas características, como ter boa seletividade e alta efi ciência de extração para os compostos de interesse, também deve ser imiscível com a água, possuir compatibilidade com a técnica de determinação analítica (por exemplo, com a fase móvel utilizada no HPLC), bem como apresentar alta pureza e não ter con-taminantes ou interferentes que possam prejudi-car a análise. Os principais solventes emprega-dos em HF-LPME são: 1-octanol, ciclohexano e tolueno[21].

Figura 2 Diferentes confi gurações para HF-LPME, confi guração em forma de U (a); confi guração em forma de haste (b). Fonte: adaptado de Oliveira et al.[20].



5.4 Ajuste do pH

O ajuste do pH pode aumentar a efi ciência de extração, bem como o equilíbrio pode ser afe-tado, juntamente com a solubilidade dos anali-tos ácidos ou básicos. Genericamente, em qual-quer sistema de microextração com solventes utilizando duas fases, o pH da amostra deve ser modifi cado para prevenir a ionização de qual-quer analito ácido ou básico. Para isso, o pH deve ser ajustado à menor em pelo menos 1,5 unidade em relação ao pKa para as espécies ácidas e, em caso contrário, em pelo menos 1,5 unidade acima do pKa para qualquer soluto básico. Geralmente, para analitos ácidos o pH da amostra é ajustado entre 0,1 e 3,5, enquanto que para analitos bási-cos o ajuste varia entre 10 e 14.

Num sistema de HF-LPME utilizando três fases, para assegurar a extração dos analitos para a fase receptora e prevenir o seu retorno para a fase orgânica localizada nos poros da membrana, o pH da solução receptora deve ser ajustado a valores que garantam a ionização dos analitos, dessa forma soluções receptoras básicas devem ser usadas para analitos ácidos e soluções recep-toras ácidas devem se utilizadas para analitos básicos[21].

5.5 Ajuste da força iônica

Dependendo dos analitos, a adição de sal e a consequente mudança da força iônica da solu-ção da amostra podem afetar signifi cativamente os resultados obtidos com a microextração em fase líquida. A adição de sal pode diminuir a solubilidade dos analitos e, dessa forma, aumen-tar a efi ciência de extração em virtude do efeito salting-out. Com isso, deve-se verifi car a infl uên-cia dessa variável nos sistemas em estudo, sendo que, em determinadas situações[17], essa também pode não ser signifi cativa para a efi ciência do procedimento de microextração.

5.6 Agitação da amostra

A agitação da amostra é comumente aplicada para acelerar a cinética de extração. Aumentando a taxa de agitação da solução doadora acelera-se a extração, bem como a difusão dos analitos atra-vés da camada interfacial da fi bra oca (membrana de polipropileno) é facilitada[22]. Na HF-LPME, como o solvente orgânico é protegido, podem ser utilizadas taxas de agitação mais vigorosas, tais como 2.000 rpm (HF-LPME em duas fases) e 1.500 rpm (HF-LPME em três fases)[21].

5.7 Volumes de solução doadora e receptora

De uma forma geral, nos sistemas envol-vendo LPME em duas ou três fases, a sensi-bilidade do método pode ser aumentada pelo decréscimo na razão entre os volumes da fase receptora e doadora[17]. Com isso, altos fatores de enriquecimento podem ser alcançados em virtude da utilização de poucos L como fase receptora, tornando a HF-LPME muito atra-tiva, principalmente quando se tem volumes relativamente pequenos de amostra deve-se considerar que esses fatores de enriquecimento não são conseguidos quando se utiliza a extra-ção líquido-líquido tradicional, em que volumes relativamente altos de solventes extratores[16] são utilizados.

6 Aplicações recentes da HF-LPME

As técnicas de microextração em fase líquida estão ganhando cada vez mais espaço na comunidade científi ca, principalmente em vir-tude da utilização de uma quantidade reduzida de solventes. Essas técnicas miniaturizadas têm ampla aplicabilidade, podendo ser utilizadas na quantifi cação de compostos ao nível de tra-ços, tais como diversos contaminantes ambien-



Tabela 1 Aplicações recentes da HF-LPME.

Confi guração Analito MatrizTécnica de

determinaçãoLOD (μg L–1) Ref.

HF-LPME (2 fases) ostol plasma de ratos HPLC-fl uorescência 2 [23]

HF-LPME (3 fases) tramadolurina e plasma

humanoGC-MS 0,08 [24]

HF-LPME (2 fases)presticidas

organofosforadostecidos de peixes GC-MS 2,1-4,5 [25]

HF-LPME (3 fases) ácido valerênicoplantas da espécie Valeriana offi cinalis

HPLC-UV 2,5 [26]

HF-LPME (3 fases) fl uoroquinolonasurina bovina e

amostras aquosasHPLC-DAD 0,0003-0,016 [27]

HF-LPME (3 fases) sulfonamidas amostras aquosasHPLC-DAD

HPLC-fl uorescência0,0003-0,033 [28]

HF-LPME (3 fases) mercúrio amostras aquosas ETAAS 0,06 [14]

HF-LPME (3 fases) mitiglinida fl uídos biológicos HPLC-UV 1,38 [18]

HF-LPME (3 fases) varfarina plasma humano HPLC-UV 5 [29]

HF-LPME (3 fases) ácidos carboxílicos aerosóis orgânicos GC-MS 0,5-1,0 [30]

HF-LPME (3 fases) fenóis amostras aquosasHPLC-DAD

HPLC-fl uorescência0,14-0,29 [31]

HF-LPME (2 fases) equinacosídeo plasma de ratos HPLC-UV 2,0 [32]

HF-LPME (3 fases)disruptores endócrinos

amostras aquosas HPLC-fl uorescência 0,52-0,54 [33]

HF-LPME (2 fases)fármacos anti-

infl amatórios (não esteroidais)

amostras aquosas, sucos, energéticos

UPLC-MS/MS 0,5-1,25 [34]

HF-LPME 3 fases fl avonóidesamostras de

vegetaisHPLC-UV 0.5-7.0 [35]

HF-LPME (2 fases) mercúrio e selênio amostras biológicas HPLC-ICP-MS 0,11-0,23 [15]

HF-LPME (3 fases) estrogêniosamostras biológicas

e ambientaisHPLC-UV 0,055-1,46 [36]

HF-LPME (3 fases)fármacos anti-

infl amatórios (não esteroidais)

lodo de esgoto LC-ESI-MS 0,4-3,7 [37]

HF-LPME (3 fases) salicilatos amostras aquosas HPLC-UV 0,6-1,2 [38]

HF-LPME (3 fases) propiltiouracil amostras biológicas HPLC-UV 0,1-0,4 [39]

HF-LPME (3 fases)compostos

organometálicosamostras aquosas,

alimentíciasCE-UV 0,68-6,90 [40]

HF-LPME (2 fases)pesticidas piretróides

amostras aquosas GC-MS 0,002-0,012 [41]

CE-UV: Capillary Electrophoresis; ETAAS: Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry; GC-MS: Gas Chromatography - Mass Spectrometry; HPLC-DAD: High Performance Liquid Chromatography - Diode Array Detector; HPLC-ICP-MS: High Performance Liquid Chromatography - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry; HPLC-UV: High Performance Liquid Chromatography - Ultraviolet; LC-ESI-MS: Liquid Chromatography - Electrospray Ionization - Mass Spectrometry; UPLC-MS/MS: Ultra Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry/Mass Spectrometry.



tais que possuem limites de concentração espe-cífi cos para cada matriz nos quais podem ser encontrados.

Nesse sentido, a HF-LPME apresenta algu-mas vantagens em relação às outras técnicas de microextração em fase líquida, tais como a possi-bilidade de utilizar amostras mais complexas, as quais também possam conter certa quantidade de material particulado, possibilitando a análise de amostras aquosas em geral, solos, urina, sangue, e outras que apresentem elevada complexidade.

Têm sido publicados diversos trabalhos científi cos que aplicam com sucesso a HF-LPME em diversos tipos de matrizes e analitos, alguns dos trabalhos publicados nos últimos três anos são mostrados na Tabela 1, onde há uma breve descrição dos analitos e técnicas utilizadas para as determinações.

Algumas variações das confi gurações origi-nais da HF-LPME têm sido propostas e aplicadas para alguns tipos de analitos, uma delas é a cha-mada microextração com fi bra oca em membrana líquida renovável (HFRLM, do inglês hollow fi ber renewal liquid membrane)[47-50], a qual é base-ada em uma modifi cação da membrana líquida suportada (SLM); nesse caso, um solvente extra-tor extra é introduzido na amostra, resultando em

uma solução com alta razão entre a fase aquosa e o solvente orgânico, o qual é colocado em agita-ção do lado de fora da membrana oca. Devido à afi nidade pela água da fase orgânica e ao fato de a membrana ser hidrofóbica, uma película fi na de solvente orgânico é formada na interface entre a fase doadora e a membrana. A força de cisalha-mento, devido à agitação da amostra, provoca a formação de microgotas orgânicas sobre a super-fície da membrana líquida, as quais se separam a partir da superfície da membrana. Ao mesmo tempo, as microgotas orgânicas presentes na amostra aumentam muito a área de contato entre o solvente extrator e a amostra. Simultaneamente, essas microgotas são reintroduzidas no fi lme de solvente, renovando a membrana líquida, o que pode acelerar a velocidade de transferência de massa na camada limite hidrodinâmica, na inter-face da membrana com a fase doadora. Na fase doadora, uma fase orgânica adicional é necessá-ria apenas para a renovação, repondo-se continu-amente a perda de líquido devidas à solubilidade e à emulsifi cação, evitando-se assim a degrada-ção da membrana líquida[51].

A metodologia utilizando-se a HFRLM foi aplicada para a análise de sulfonamidas em amos-tras de mel com separação/detecção por LC-MS/MS: utilizou-se como solvente extrator uma mis-

Confi guração Analito MatrizTécnica de

determinaçãoLOD (μg L–1) Ref.

HF-LPME (3 fases) anfetaminas cabelo humano GC-MS 0,01-0,04 [42]

HF-LPME (2 fases) estrogênios fígado de peixe GC-MS 0,017-0,033 [43]

HF-LPME (3 fases) apigenina urina humana HPLC-UV 0,1 [44]

HF-LPME (3 fases) bisfenol A amostras aquosas HPLC-DAD 0,2 [45]

HF-LPME (3 fases)fármacos

antidepressivosurina e plasma

humanoHPLC-DAD

GC-MS0,08-0,2 [46]

CE-UV: Capillary Electrophoresis; ETAAS: Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry; GC-MS: Gas Chromatography - Mass Spectrometry; HPLC-DAD: High Performance Liquid Chromatography - Diode Array Detector; HPLC-ICP-MS: High Performance Liquid Chromatography - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry; HPLC-UV: High Performance Liquid Chromatography - Ultraviolet; LC-ESI-MS: Liquid Chromatography - Electrospray Ionization - Mass Spectrometry; UPLC-MS/MS: Ultra Performance Liquid Chromatography - Mass Spectrometry/Mass Spectrometry.

Tabela 1 Continuação...



tura de 1-octanol:1-pentanol (55:45 v/v), sendo essa colocada diretamente na amostra; também construiu-se um sistema três fases, tendo como fase receptora uma solução tampão contendo carbonato a pH 10. Utilizou-se otimização mul-tivariada para a determinação das melhores con-dições de extração, sendo otimizadas variáveis como: tempo de extração, pH (solução doadora e receptora), volumes de solução, tipo de solvente extrator e também a força iônica da solução. Foram obtidos bons resultados em relação aos parâmetros analíticos de mérito, sendo encon-trados limites de detecção para os compostos de interesse variando entre 5,1–27,4 g kg−1 e coe-fi cientes de correlação superiores a 0,987; tam-bém foram avaliadas a repetibilidade e a precisão intermediária, as quais foram de 15% e 13%, res-pectivamente, bem como foram obtidos tempo de extração relativamente curtos[52].

7 Conclusões e perspectivas

A HF-LPME é uma técnica de microextra-ção que vem tornando-se bastante difundida em laboratórios de pesquisa, sendo aplicada para análise de diversas classes de compostos nas mais variadas matrizes, com excelentes resultados. Ela é considerada uma técnica de preparo de amostras efetiva e pouco onerosa que proporciona altos fatores de enriqueci-mento e seletividade. A natureza descartável da fi bra oca elimina a possibilidade de efeito de memória e assegura alta reprodutibilidade nas análises. Além disso, os pequenos poros da membrana previnem que partículas indeseja-das, as quais podem estar presentes na solução doadora, entrem na solução receptora, sendo obtido dessa forma um extrato muito limpo, o qual pode ser conduzido ao instrumento analí-tico sem maiores problemas[17]. A técnica é com-patível com um ampla variedade de matrizes,

incluindo-se plasma, urina, saliva, leite, água de torneira, água de superfície, água do mar e suspensões de solos[16]. Como as outras técnicas de microextração, a HF-LPME apresenta baixo consumo de solventes tóxicos, o que é um fator de extrema importância nos dias atuais, como contribuição à tendência de redução na utiliza-ção de solventes que possam causar problemas.

Um dos maiores desafi os encontrados atu-almente, não só na HF-LPME mas em todas as técnicas de microextração em fase líquida, é a automatização do processo de microextra-ção. Nessa perspectiva, muitos esforços dire-cionam-se e muito se tem estudado para que se disponha, num futuro próximo, de equipamen-tos comerciais robustos para LPME que permi-tam amostragem automática, segura e confi ável, diminuindo o trabalho operacional delicado que muitas vezes essas técnicas de preparo de amos-tras exigem.

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Recebido: 09/10/2013

Aceito: 21/11/2013

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PREPARO DE AMOSTRAS




ISSN 1984-4433

Acoplamiento de plataformas mesofluídicas a sistemas cromatográficos para la automatización y miniaturización del

tratamiento de muestra previa a separaciones analíticas

Manuel MiróFI-TRACE group, Department of Chemistry, University of the Balearic Islands, Carretera de Valldemossa,

km 7.5, E-07122, Palma de Mallorca, Illes Balearse-mail: [email protected]

Resumen

En este artículo se presenta el potencial de sistemas mesofl uídicos denominados Lab-on-a-Valve (LOV) como la nueva generación de sistemas de fl ujo derivados de la combinación de plataformas micro-Flow Injection Analysis y Lab-on-a-Chip para la manipulación automática de muestras y su pretratamiento en línea previa a separaciones cromatográfi cas y electroforéticas. Se presta especial atención a la miniaturización de sistemas de extracción en fase sólida y su integración en la plataforma LOV permitiendo de forma completamente automatizada la renovación de dicha fase sólida para cada análisis. Mediante ejemplos representativos en el campo de análisis ambiental y biológico se detallarán las diferentes interfaces diseñadas en la bibliografía para el acoplamiento de la plataforma LOV a métodos separativos incluyendo tanto cromatografía líquida como cromatografía de gases y electroforesis capilar.

Palabras claveSistemas meso/microfluídicos; cromatografía; preparación de muestra en chip; microextracción en fase solida; automatización.

Automatic on-chip sample processing prior to chromatographic separations

Abstract

In this review, mesofl uidic Lab-on-a-Valve (LOV) platforms as the new generation of fl ow systems resulting from the combination of micro-fl ow Injection analysis and Lab-on-a-Chip are presented for automatic handling of samples and their pretreatment prior to chromatographic and electrophoretic separations. Miniaturization and integration of on-chip solid-phase extraction procedures within LOV using disposable (single-use) sorbent is explained in detail. Interfaces designed in the literature for coupling LOV with liquid and gas chromatography and capillary electrophoresis are overviewed and exemplifi ed via representative applications in the environmental and bioanalytical fi elds.

KeywordsMeso/microfluidics; chromatography; on-chip sample pretreatment; microsolid-phase extraction; automation.

Miró M Acoplamiento de plataformas mesofluídicas a sistemas cromatográficos


1 Introducción

La etapa más crítica en el proceso analítico es la preparación de la muestra, siendo la respon-sable de más del 70% del tiempo invertido en el análisis y la principal fuente de errores determi-nados [1]. Dentro del contexto de la química verde, existe una tendencia actual para la miniaturiza-ción y simplifi cación de métodos preparativos de muestra previos a separaciones cromatográfi cas. El objetivo primordial es realizar un “clean-up” de la muestra, eliminando posibles interferen-cias espectrales y no espectrales de matriz y en la medida de lo posible preconcentrar los analitos de interés en aquellos procedimentos analíticos dedicados al análisis de trazas[2].

Los métodos clásicos de extracción líquido--líquido y sólido-líquido han sido reemplazados en la última década por técnicas de microextrac-ción en fase líquida, dentro de la cual podemos destacar los métodos de microextracción usando una única gota orgánica[3-6], membranas líqui-das usando fi bras huecas[4,7-9], microextracción líquido-líquido dispersiva[4-6,10-12], microextrac-ción líquido-líquido asistida por un campo eléc-trico[13,14], y la solidifi cación de una gota orgánica fl otante[3-6,15], normalmente acoplados a sepa-raciones cromatográfi cas[16]. Más atención sin embargo se ha prestado a las técnicas de extrac-ción en fase sólida miniaturizada (SPE)[17-19] y microextracción en fase sólida (SPME)[20] como consecuencia de su mayor versatilidad, superio-res factores de enriquecimiento, mayor robustez y simplicidad operacional. Además existe una gran variedad de formatos para μSPE y SPME incluyendo cartuchos, fi ltros, fi bras, puntas de pipeta, y capilares para contener o inmovilizar la fase sólida adsorbente o absorbente según el volumen de muestra, tipo de matriz y objeto de los análisis. Otra de las ventajas inherentes de los sistemas de extracción con fase sólida es su mayor predisposición a la automatización usando sis-

temas robotizados o muestreadores específi cos, como por ejemplo, el autosampler CombiPal para SPME y 96 well-plates o sistemas robóti-cos Prospekt para SPE, operando todos ellos de forma discreta. Otra de las tendencias actuales es la automatización del tratamiento de muestra usando las diferentes generaciones de análisis por inyección en fl ujo, operando de forma con-tinua o discontinua y que permiten procesar la muestra bruta para una correcta separación y efi -ciencia cromatográfi ca y/o detección fi able. Para obtener una visión de las posibilidades ofrecidas por la primera generación de análisis en fl ujo (Flow Injection Analysis, FIA) y la segunda gene-ración de análisis en fl ujo (Sequential Injection Analysis, SIA) caracterizada por el mayor nivel de automatización y control hidrodinámico usando microjeringas bidireccionales controla-bles por soft ware para la automatización del tra-tamiento de muestra previo a separaciones por cromatográfi cas y electroforéticas remitimos a los lectores a la lectura de las siguientes mono-grafías y artículos de revisión[21-23].

El objetivo de este artículo es destacar las posibilidades analíticas ofrecidas por platafor-mas (chips) mesofl uídicas denominadas siste-mas Lab-on-a-Valve (LOV), acrónimo de labo-ratorio sobre una válvula, que son el desarrollo lógico de la combinación de sistemas SIA y Lab-on-a-Chip (LOC, acrónimo de laboratorio sobre un chip) para la implementación de operaciones unitarias previas a separaciones cromatográfi cas incluyendo la manipulación de muestra y reacti-vos, derivatización, separación de interferencias de matriz y preconcentración del analito.

El artículo se estructurará en varias seccio-nes dónde se describirán brevemente los princi-pios operacionales de plataformas LOV mesofl u-ídicas y los diferentes diseños de interfaces para el acoplamiento a cromatografía líquida (LC),

Acoplamiento de plataformas mesofluídicas a sistemas cromatográficos Miró M


cromatografía de gases (GC) y electroforesis capilar (CE), con ejemplos representativos en el campo medioambiental y bioanalítico.

2 Principios de plataformas mesofluídicas

En el año 2000 y como resultado de los avances en sistemas integrados microFIA y LOC apareció la nueva técnica de LOV (Figura 1), que incluye un gran número de méritos de los siste-mas SIA en cuanto a automatización y versatili-dad, pero con un mayor grado de miniaturiza-ción. La diferencia básica reside en el uso de un módulo monolítico en LOV (diámetro de unos 5 cm y grosor de 1 cm aproximadamente) con-teniendo canales integrados de unos 500-1800 m de diámetro (ver imagen en la Figura 1). De ahí el nombre de plataforma mesofl uídica frente a sistemas microfl uídicos con diámetros de canales inferiores a 100 m. Inicialmente la plataforma LOV fue construida de polimetilme-tacrilato pero más recientemente de cloruro de polivinilo o polieteretercetona (PEEK), Kel-F o polieterimida para aumentar la resistencia quí-mica a disolventes orgánicos. Dicha plataforma LOV se monta sobre una válvula rotatoria de 6, 8 o 10 posiciones (denominada válvula de selec-ción).

Análogamente a sistemas SIA, la plataforma LOV dispone de un puerto central conectado mediante el denominado bucle de espera a una microjeringa de pistón bidireccional y de ele-vada precisión fl uídica. Mediante dicho bucle y el canal interno de la válvula de selección la microjeringa es capaz de comunicarse automá-ticamente con cada uno de los puertos del sis-tema LOV (ver Figura 1) para la aspiración de microvolúmenes de muestra o reactivos hacia el bucle de espera para posteriormente ser impul-sados hacia el detector o bien a algún sistema

de pretratamiento integrado en la plataforma (on-LOV) o conectado a uno de sus puertos (off -LOV). Además de ser completamente con-trolado por soft ware, siendo una de las princi-pales diferencias en comparación con sistemas LOC, la plataforma LOV se diseñó para incor-porar todas las operaciones unitarias necesarias en ensayos (bio)analíticos adaptados a sistemas en fl ujo, incluyendo confl uencias, dilución en línea, mezcla de reactivos con muestra, incuba-ción, pretratamiento de muestra y una celda de fl ujo integrada para la monitorización óptica de los productos de reacción. El sistema mesofl uí-dico por tanto permite la detección on-LOV (ver Figura 1), mediante espectrofotómetros CCDs, fl uorímetros, fotomultiplicadores, o simple-mente LEDs y fotodiodos, usando fi bras ópticas para la conexión con la fuente de radiación y el detector. Las dimensiones de la celda de fl ujo son fácilmente ajustables mediante las propias fi bras ópticas fi jando la longitud de paso óptico y el volumen de la celda. Indicar que además de

Figura 1 Dibujo esquemático de la plataforma Lab-on-a-Valve (LOV) e imagen de la misma para ilustrar los canales integrados, la válvula rotatoria de selección a la cual se acopla y la celda de fl ujo para medidas ópticas usando fi bras ópticas acopladas a la fuente de radiación y fotodetector (Reproducida de referencia Miró y Hansen[27] con permiso de Elsevier).



detección on-LOV, la plataforma puede conec-tarse, cuando se precise a detectores y sistemas de separación externos, como es el caso que nos incumbe en este trabajo, destacando cromató-grafos líquidos, de gases o sistemas de electro-foresis capilar acoplados a sistemas de detección óptica o espectrómetros de masas. Por tanto, un importante rol de los sistemas LOV es de servir de interface entre la muestra bruta y el sistema de separación cromatográfi co integrando el tra-tamiento de muestra, como se comentará en las próximas secciones. De hecho, una de las carac-terísticas inherentes de la plataforma mesofl uí-dica es la posibilidad de manipular no solamente volúmenes de líquidos sino también de suspen-siones de sólidos para la ejecución de reacciones químicas heterogéneas. Permite la manipulación de fases sólidas, usadas en separaciones croma-tográfi cas o sistemas de extracción en fase sólida, generando columnas empaquetadas on-LOV para extracciones en fase sólida miniaturizadas (SPE) o cromatografía de afi nidad ya sea usadas de forma permanente o renovable, dando lugar en este último caso a la denominada técnica de Bead-injection que se detalla en el siguiente apar-tado.

3 Sistemas automáticos de tratamiento de muestra

3.1 Tratamiento de muestra previo a LC

La plataforma LOV se ha convertido en los últimos años en un sistema miniaturizado ideal para la automatización del tratamiento de muestra en el análisis de trazas de contaminan-tes ambientales. El objetivo es integrar la extrac-ción en fase sólida para la preconcentración de contaminantes orgánicos a niveles inferiores a los exigidos por las legislaciones vigentes con el consiguiente clean-up de la matriz de la mues-

tra. La problemática inherente al uso repetitivo de columnas empaquetadas en sistemas de pre-concentración on-line derivada del aumento de la sobrepresión al fl ujo con el paso del tiempo, la contaminación cruzada, la adsorción/absorción irreversible de interferentes y la desactivación o pérdida de grupos funcionales ha sido solucio-nada con la técnica denominada bead-injection que permite usar nuevas columnas extractivas para cada análisis, todo ello de forma comple-tamente automatizada. Las columnas extrac-tivas se generan in-situ en la LOV mediante la aspiración controlada de una suspensión de fase sólida (mantenida en uno de los puertos exter-nos de la válvula de selección), que es tratada análogamente a fl uidos. Las partículas sólidas son fácilmente transportadas entre los diferentes canales de la LOV, siendo su retención facilitada mediante el uso de fritas poliméricas porosas o restrictores que retienen la fase sólida (empa-quetada a baja presión) pero permiten el fl ujo libre de los fl uidos. Después de la impulsión de la muestra, de los protocolos de limpieza, y la elución de los compuestos para su posterior inyección en los equipos cromatográfi cos (ver apartado siguiente), la fase sólida se elimina mediante su aspiración en el bucle de espera y su impulsión hacia uno de los puertos de la LOV funcionando como descarte y una nueva frac-ción de fase sólida es aspirada para ser empaque-tada en la LOV antes de iniciar un nuevo ciclo de análisis o réplica del ensayo[24-27].

Los sistemas LOV-Bead injection han sido también usados recientemente en sistemas miniaturizados de cromatografía de afi nidad[28-30] para evaluar interacciones y constantes termo-dinámicas de enlace entre proteínas o ADN y biomoléculas siguiendo el perfi l de elución cro-matográfi co. También se han evaluado activida-des enzimáticas mediante la inyección del eluato conteniendo el substrato y moléculas producto



en ESI-MS[28,29]. Sin embargo, la cromatografía de afi nidad en LOV tiene como principal obje-tivo la purifi cación selectiva de una biomolécula o grupo específi co de moléculas funcionando por tanto la columna como immunosorbente on-LOV. El aspecto más distintivo de sistemas mesofl uídicos LOV es que permiten la incorpo-ración de protocolos analíticos que no pueden ser desarrollados con los equipos convenciona-les de cromatografía de afi nidad. Normalmente, las interacciones entre las biomoléculas y la fase estacionaria se evalúan mediante el estudio de tiempos de retención y perfi l de los compues-tos eluídos. Sin embargo, los grupos de investi-gación de Ruzicka y Turecek de la Universidad de Washington[28] propusieron la posibilidad de monitorizar las interacciones de la biomolécula con el inmunosorbente in-situ y a tiempo real mediante el empaquetamiento de la columna de afi nidad en la propia celda de fl ujo de la LOV para poder así seguir mediante cambios en las propiedades ópticas de la columna (denomina-das técnicas optosensoras en fase sólida) la ciné-tica de retención de la biomolécula sin necesidad de elución. Esta técnica combinada con bead--injection (renovación de la columna de afi ni-dad para cada ensayo) permite la detección de biomoléculas fuertemente retenidas y de forma irreversible en la fase sólida, como es el caso del ADN biotinilado con fase solida funcionalizada con estreptavidina[31]. Sin embargo, no todo son ventajas con la monitorización de interacciones en la fase sólida debido a las elevadas señales del blanco causadas por la dispersión de la radiación por las propias partículas sólidas, lo que provoca relaciones S/N bastante bajas; la limitada capa-cidad de la minicolumna integrada en los cana-les LOV (inferior a 10 mg) y la imposibilidad de aumentar el paso óptico por encima de 10 mm, lo que se traduce en una menor sensibilidad en comparación con la detección de biomoléculas

purifi cadas en la fase eluato[30]. Otra importante fuente de error es la causada por la distribución longitudinal heterogénea de la(s) biomolécula(s) en la columna empaquetada (en función de la matriz de la muestra) con lo que es muy difícil conocer a priori exactamente las dimensiones de la zona óptima de monitorización óptica para detectar la máxima concentración de analito[32,33].

3.2 Tratamiento de muestra previo a electroforesis capilar

Trabajos recientes han demostrado que la plataforma LOV, análogamente a sistemas SIA[22,34,35], permite la manipulación de la mues-tra y su inyección automática de forma presuri-zada en equipos electroforéticos convencionales. Para ello se adaptó la celda de fl ujo típica de la LOV para insertar tanto el cátodo del sistema electroforético como un extremo del capilar de sílice[36]. A la salida de la celda de fl ujo se incor-poró una válvula solenoide de apertura/cierre para permitir la inyección hidrodinámica pul-sada en el capilar usando la microjeringa del sis-tema LOV. De esta manera se evitan los errores de volumen causados por la inyección electroci-nética al analizar estándares y muestras de dife-rente fuerza iónica. La inyección hidrodinámica de una muestra de baja conductividad antes de la aplicación del voltaje permite la preconcentra-ción automática electroforética mediante técni-cas de amplifi cación y apilamiento (stacking) sin necesidad de manipular el extremo del capilar dónde tiene lugar la inyección[36]. Mediante sof-tware es posible controlar la activación, lavado y regeneración del capilar del sistema electrofo-rético. Además, es posible renovar o cambiar el electrolito (tampón) de fondo sin modifi car el hardware, solamente mediante la programación del método analítico por soft ware. Se ha demos-trado también mediante ejemplos en la biblio-grafía que es posible conseguir separaciones



ultra-rápidas mediante la activación sincroni-zada de la válvula solenoide y la jeringa de pistón para inyectar hidrodinámicamente segmentos de electrolito a alta velocidad para reducir los tiem-pos de migración o limpiar rápidamente el capi-lar una vez separados los analitos de interés[36,37]. Mediante detección dual óptica consistiendo en el acoplamiento de un espectrofotómetro CCD a la propia celda de fl ujo de la LOV (además de la detección en-línea a la salida del capilar de los compuestos separados) el grupo de Ruzicka demostró la posibilidad de monitorizar la efi ca-cia de la reacción de la muestra con una sonda (turn-on) fl uorescente realizada en-línea dentro de los canales de la LOV para la derivatización de analitos ópticamente inactivos (derivatización de proteinas o aminoácidos) seguida del control de la inyección hidrodinámica de un volumen resultante de producto derivatizado en el capilar del equipo electroforético[37].

4 Acoplamiento de plataformas LOV a sistemas cromatográficos y aplicaciones analíticas

4.1 Acoplamiento LOV a LC

El acoplamiento de LOV con LC se lleva a cabo normalmente en un formato de fl ujo con-tinuo usando una válvula rotatoria que actúa de interface de forma que la muestra procesada en la plataforma mesofl uídica LOV (por ejemplo mediante extracción en fase sólida on-LOV) se introduce en el bucle de la válvula rotatoria con posterior inyección en la columna cromatográ-fi ca por la propia fase móvil mediante la rotación de la válvula desde la posición de “carga” a “inyec-ción”[38-41]. A este tipo de interface se la denomina acoplamiento on-line[42] en el que no existe una conexión directa entre la plataforma LOV y el cromatógrafo. Esta interface permite además la

sincronización del tratamiento on-LOV de una muestra con la separación cromatográfi ca de la procesada anteriormente.

Una diferencia básica entre los sistemas convencionales on-line SPE basados en column switching[42] (ver Figura 2) y Bead-injection LOV acoplados a LC de fase reversa reside en que mientras en los primeros los analitos reteni-dos son eluídos con la propia fase móvil de baja fuerza eluyente, en el segundo caso, es posible eluir con un pequeño volumen de 100% meta-nol o etanol (debido a las menores dimensiones de la columna de SPE), consiguiendo así mejo-rar la fuerza eluyente del disolvente asegurando la introducción cuantitativa de todo el volumen de eluato en el bucle de la válvula rotatoria, lo que permite mantener elevados factores de enri-quecimiento y bajos límites de detección. Para compuestos polares esta estrategia puede provo-car sin embargo problemas de ensanchamiento de banda cromatográfi ca que han sido solucio-nados en sistemas LOV mediante la dilución en--linea controlada del eluato[38,39,41,43]. La Figura 3 ilustra un sistema LOV acoplado on-line a LC para la determinación de fármacos antiinfl a-matorios no esteroides (ibuprofeno, naproxeno, ketoprofeno, bezafi brato y diclofenac) en aguas residuales (sin tratamiento previo) procesadas mediante la técnica de bead-injection usando un co-polímero de balance hidrofílico/hidrofóbico (poliestireno-N-vinilpirrolidona, Oasis HLB) e inyección del eluato en el cromatógrafo después de dilución en-línea con agua destilada[38] (ver componentes en el pie de la Figura 3). Debido a efectos de matriz e interferentes irreversible-mente adsorbidos fue necesario renovar la fase sólida para cada muestra. Un sistema instrumen-tal muy similar usando extracción en fase sólida multimodal (bidimensional) formada por Oasis HLB y polímeros de impresión molecular (MIP)



fue aplicado a la determinación selectiva de her-bicidas de la familia de las triazinas en extractos de suelos[43].

En aquellos casos en los que se pretenda simplemente conseguir un clean-up de la mues-tra sin necesidad de lograr elevados factores de enriquecimiento, se puede adoptar la estrategia de heart-cut (ver Figura 2) para la introducción del eluato del sistema LOV-bead injection al LC. En este caso no se inyecta la totalidad del volu-men de eluato sino que una vez conocido el perfi l de elución y el gradiente de concentración de los analitos eluídos se selecciona aquel volumen que sin provocar ensanchamiento de banda contenga el máximo del gradiente de concentración[39,40]. En este caso, las dimensiones del bucle de la vál-vula son inferiores al de la inyección completa de eluato descrito anteriormente y no se precisa ninguna dilución adicional del eluato. Este aco-plamiento fue usado para la determinación de vitamina B2 en muestras de leche sin ningún tratamiento previo (incluso sin la precipitación de proteínas) usando MIPs para clean-up en un sistema LOV[41]. Se comprobó además la impo-sibilidad de reusar la columna empaquetada en LOV debido a la pérdida de efi cacia de los MIPs por interacciones no-específi cas con proteínas.

4.2 Acoplamiento LOV a GC

Debido a las difi cultades inherentes del aco-plamiento de las plataformas mesofl uidicas a GC solo existe un trabajo publicado por nuestro grupo[44]. Se utilizó una válvula de inyección rota-toria como interface para el acoplamiento on-line e introducción de un volumen de eluato en el GC mediante segmentos de aire pulsados. Para com-patibilizar la SPE en la LOV y los requerimien-tos del inyector del GC se usó un inyector de ele-vado volumen con temperatura de vaporización programable y con un liner conteniendo lana de vidrio. Así se consiguieron inyectar volúme-

Figura 2 Representación esquemática del acoplamiento de sistemas de preconcentración en línea usando SPE a cromatógrafos líquidos usando las estrategias de column switching y heart cut.

Figura 3 Diagrama de un sistema LOV con SPE (bead-injection) acoplado a LC para la separación y determinación de trazas de fármacos antiinfl amatorios no esteroides en aguas residuales. Acrónimos: LOV: Lab-on-a-Valve, MP: Bomba impulsión; S: Jeringa de impulsión; SV: Válvula solenoide; HC: Bucle de espera; CC: Canal de comunicación; C1 and C2: canales para la fase sólida; P: bomba HPLC; IV: Válvula de inyección; AC: Columna analítica; D: Detector; W: Residuo; Ca1: Portador (Agua Milli-Q) Ca2: Portador (Agua Milli-Q, pH 2); LC-Eluyente A: 20/80 (v/v) MeOH/H2O + 0.1% (v/v) ácido fórmico; LC-Eluyente B: 95/5 (v/v) MeOH/H2O+ 0.1% (v/v) ácido fórmico (Adaptada de Quintana et al.[38]).



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nes de acetato de etilo (como eluyente) de hasta 80 L, lo que permitió la automatización de un método LOV-GC para el tratamiento y detección de trazas de bifenilos policlorados (a niveles de partes por trillón) en lixiviados de residuos sóli-dos[44].

Comentar también que en el reciente con-greso 18th Internacional Conference on Flow Injection Analysis celebrado en Oporto del 15-20 de septiembre de 2013 (http://icfi a.eventos.che-mistry.pt/) se presentó una comunicación en forma de cartel sobre un sistema LOV integrando microextracción en fase líquida dispersiva de contaminantes ambientales (compuestos policí-ciclos aromáticos en agua y lixiviados) como pre-tratamiento de muestra previo al análisis por GC usando una interface on-line.

4.3 Acoplamiento LOV a CE

En este caso la opción más comúnmente adoptada consiste en un acoplamiento at-line conectando el sistema LOV a un vial de un muestreador comercial desde dónde se inyecta automáticamente la muestra procesada. Es el acoplamiento más sencillo posible puesto que no se precisa de ninguna interfase operando en fl ujo contínuo y además no es necesario sincronizar el tratamiento LOV con la separación electrofo-rética puesto que ambos equipos operan inde-pendientemente. A diferencia del acoplamiento at-line, en los métodos on-line LOV-CE en los cuales la propia celda de fl ujo de la LOV actúa de interfase y la introducción de la muestra en el capilar tiene lugar de forma hidrodinámica mediante la presurización del sistema mesofl u-ídico (ver apartado anterior) es posible realizar varias inyecciones en el capilar a pesar que la muestra anterior siga analizándose, con lo cual no es necesario esperar a detectar los analitos con mayores tiempos de migración para inyectar la siguiente muestra[36,37].

En la Figura 4 se representa de forma esque-mática las diferentes opciones de acoplamiento at-line y on-line de sistemas LOV integrando SPE a sistemas cromatográfi cos y electrofo-réticos. En la Tabla 1 se resumen las propieda-des analíticas de recientes artículos publicados dónde se demuestra el potencial de sistemas LOV para el tratamiento automático y miniaturizado de muestras ambientales y biológicas complejas previo a separaciones cromatográfi cas.

5 Conclusiones

El objetivo de este artículo es destacar las posibilidades que ofrecen los sistemas mesofl uí-dicos LOV como la nueva generación de sistemas de análisis en fl ujo frente a plataformas microfl u-ídicas para integrar y simplifi car el procesado de muestra y su acoplamiento a separaciones cro-matográfi cas (LC, GC y CE). La mayoría de los esfuerzos se han centrado en la técnica de bead--injection o SPE para preconcentración de com-puestos orgánicos y/o clean-up pero también es posible incorporar otras operaciones unitarias en línea basadas en microextracción en fase líquida y separaciones basadas en membranas porosas o

Figura 4 Esquema de una plataforma mesofl uídica LOV incorporando SPE (bead-injection) y su acoplamiento on-line/at-line a sistemas cromatográfi cos y electroforéticos. SP: Microjeringa de pistón, IV: Válvula de inyección, HC: Bucle de espera, D: Detector, µSPE: Extracción en fase sólida miniaturizada (Adaptada de Miró[26]).



extractivas. Desde el punto de vista del autor, en un futuro próximo muy probablemente se inte-grarán columnas monolíticas separativas en los canales de la LOV con la fi nalidad de miniaturi-zar la totalidad del equipo; aumentar la efi cacia separativa de las microcolumnas empaquetadas actualmente en LOV y obtener información in--situ y a tiempo real de la composición de la muestra ya sea con fi nes de screening o confi r-mativos.

Agradecimientos

El autor agradece al Ministerio de Ciencia y Competitividad de España la ayuda económica proporcionada a través del proyecto de investi-gación fi nanciado del Plan Nacional CTM2010-17214.

Referencias

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Recibido: 30/10/2013

Aceptado: 09/12/2013

PREPARO DE AMOSTRAS




ISSN 1984-4433

Microextração adsortiva em barra (BAE): Um conceito analítico inovador para microextração estática

J. M. F. NogueiraDepartamento de Química e Bioquímica, Centro de Química e Bioquímica, Faculdade de Ciências,

Universidade de Lisboa, Campo Grande, Ed. C8, 1749-016, Lisboa, Portugalemail: [email protected]

Resumo

Recentemente, foram introduzidas técnicas inovadoras de microextração estática, com particular ênfase para a microextração adsortiva em barra, BAE, que tem demonstrado grande capacidade analítica e excepcional desempenho para operar ao nível residual dos subtraços. Este novo conceito tem igualmente provado grande efetividade na análise de compostos orgânicos com características polares, particularmente em sistemas complexos, tendo-se já tornado numa ferramenta analítica bem estabelecida no preparo de amostras e proposta na literatura para diversas aplicações em áreas científi cas relevantes. A presente contribuição tem por objetivo abordar os princípios fundamentais e propor o potencial analítico da BAE como conceito alternativo e complementar a diversas técnicas baseadas em sorção, no domínio da microextração estática.

Palavras-chavePreparo de amostras; métodos baseados em sorção; microextração estática; BAE; tecnologia de amostragem por flutuação; materiais nanoestruturados; análise de traços; matrizes reais.

Bar adsorptive microextraction (BAE): An innovative concept for static analytical microextraction

Abstract

Recently were introduced novel static microextraction techniques, with particular emphasis on bar adsorptive microextraction, BAE, which has demonstrated high analytical capacity and remarkable performance to operate at the ultra-trace level. Th is new concept has also proved great eff ectiveness in the analysis of organic compounds with polar characteristics particularly in complex systems, becoming a well-established analytical tool for sample preparation, and been proposed in literature several applications in relevant scientifi c areas. Th e present contribution aims to discuss the fundamental principles and proposes all the analytical potential of BAE, as an alternative and complementary analytical concept to several sorption-based techniques, in the static microextraction domain.

KeywordsSample preparation; sorption-based methods; static microextraction; BAE; floating sampling technology; nanostruturated materials; trace analysis; real matrices.

Nogueira JMF Microextração Adsortiva em Barra (BAµE)


1 Introdução

Nas últimas duas décadas, as técnicas de microextração baseadas em sorção têm eviden-ciado enorme desenvolvimento e demonstrado serem a opção mais efetiva, fundamentalmente na análise de traços em diversos tipos de matri-zes, como etapa de enriquecimento prévio para aplicação de técnicas cromatográfi cas e hifena-das[1] . Nesse contexto, os modos de amostragem passivos ou estáticos têm ganhado preponderân-cia em diversas áreas científi cas, por serem pouco dispendiosos e de fácil manipulação, reduzindo o tempo global requerido para o preparo da amos-tra, tornando-se ideais para serem combinados com a grande detectabilidade da instrumenta-ção analítica atual. Nesse cenário tem-se desta-cado a microextração em fase sólida (Solid Phase Microextraction, SPME)[2] e a extração sortiva em barra de agitação (Stir Bar Sorptive Extraction, SBSE)[3]. Embora a SPME apresente diversas vantagens analíticas comparada às outras abor-dagens para microextração, a SBSE detém maior capacidade, detectabilidade compatível com análise residual ao nível dos subtraços e grande robustez, como descrito em inúmeras publica-ções científi cas especializadas[4]. Apesar das van-tagens analíticas já amplamente demonstradas, a técnica de SBSE opera com sorventes baseados em silicone, uma vez que usa exclusivamente o poli(dimetilsiloxano)(PDMS) como fase poli-mérica, o qual apresenta propriedades muito interessantes de difusão e termoestabilidade e é indicado para microextrair, fundamentalmente, compostos orgânicos com características apola-res. Entretanto, se focarmos a atenção no alar-gado grupo de compostos orgânicos com carac-terísticas polares, a técnica de SBSE(PDMS) tem demonstrado inefi cácia devido às fracas inte-rações hidrofóbicas que se estabelecem entre a fase polimérica e esse tipo de analitos[5]. Por essa razão, diversas estratégias e conceitos ino-

vadores baseados em sorção têm sido propos-tos para sobrepor essa limitação. As técnicas de microextração adsortiva (AE) foram inicial-mente concebidas para solucionar a limitação da SBSE(PDMS) na análise de compostos orgânicos com características mais polares, destacando-se a microextração adsortiva em barra (BAE), que tem demonstrado grande potencial e comple-mentaridade analítica relativamente à primeira[6]. Essa nova abordagem recorre ao uso de disposi-tivos analíticos contendo fases alternativas com grande capacidade sortiva e que operam com o recurso da tecnologia inovadora de amostragem por fl utuação. A presente contribuição tem assim por objetivo abordar os princípios fundamentais e mostrar o potencial analítico da BAE como conceito inovador e alternativo à microextração estática, em particular para análise de traços do vasto grupo de compostos orgânicos com carac-terísticas polares.

2 Técnicas de microextração adsortiva (AE)

2.1 Fundamentos e configurações

Uma vez que os materiais sólidos apresen-tam propriedades físico-químicas e de textura muito interessantes, nomeadamente áreas super-fi ciais elevadas e nanoestruturas porosas, são ideais para adsorverem facilmente moléculas orgânicas com características mais polares. São bons exemplos desse tipo de materiais os carvões ativados (ACs) e os polímeros (Ps) que detenham propriedades de sorção fortes, sempre que os pri-meiros não apresentarem seletividade ou capaci-dade adequada para reterem os analitos alvo[5,6]. Apesar desse tipo de materiais sorventes apre-sentarem características extraordinárias para reterem compostos orgânicos, desde os polares a apolares, são constituídos por partículas fi na-mente divididas que se tornam difíceis de mani-

Microextração Adsortiva em Barra (BAµE) Nogueira JMF


pular do ponto de vista prático. No entanto, se esses materiais puderem ser suportados a subs-tratos adequados, com o recurso de tecnologias apropriadas para fi xação, os novos dispositivos analíticos representarão uma alternativa viável para microextração residual de compostos mais polares. Essa abordagem analítica permite pre-parar e/ou desenvolver microcoletores revesti-dos com o(s) sorvente(s) mais adequado(s) para cada tipo particular de aplicação, sem grandes custos e perdas de tempo associadas, tendo sido designadas técnicas de microextração adsortiva (AE). Inicialmente foram propostas duas confi -gurações geométricas[6], nomeadamente em for-mato de multiesferas e barras cilíndricas, tendo a última demonstrado maior versatilidade do ponto de vista prático. Na geometria cilíndrica, técnica designada por microextração adsortiva em barra (BAE), os sorventes constituídos por pó fi namente dividido (até 5 mg) são fi xados com adesivos convenientes aos suportes (18 mm em comprimento e 3 mm em largura) à base de poli-propileno (PP) com formato de barra cilíndrica, como é reproduzido no esquema e imagem da Figura 1, sendo nesse exemplo em particular revestida com AC. Por análise da micrografi a reproduzida na Figura 1b e obtida por microsco-pia eletrônica de varredura (SEM), observa-se de forma qualitativa as características da superfície da fase sorvente, mostrando-se que as partículas fi xas ao substrato apresentam grande homoge-neidade. Uma vez que o suporte apresenta baixa densidade, o processo de microextração torna--se igualmente inovador, já que opera através da tecnologia de amostragem por fl utuação, como é representado esquematicamente e por imagem na Figura 2a. Essa nova abordagem apresenta a grande vantagem do dispositivo analítico fl u-tuar imediatamente abaixo do vortex formado pela agitação gerada por uma barra de agitação convencional em tefl on, evitando assim o seu

contato direto quer com as paredes quer com o fundo do frasco de amostragem. Evita-se dessa forma a desagregação mecânica das partícu-las de sorvente do microcoletor, aumentando--se o correspondente tempo médio de vida. Por outro lado, durante o processo estático, os ana-litos migram por difusão desde o seio da matriz da amostra até à fase sorvente, promovida pela agitação magnética. Essa tecnologia inovadora de amostragem por fl utuação tem demonstrado excelente estabilidade e reprodutibilidade ana-lítica para ser adotada como técnica alternativa para enriquecimento residual em análise de rotina. Estudos de avaliação da estabilidade dos dispositivos analíticos, nomeadamente de resis-tência a solventes orgânicos e aquosos, pH, tem-

Figura 1 Representação esquemática (a), imagem e micrografi a por SEM (b) do dispositivo analítico usado na técnica BAE [5,6].

Figura 2 Representação esquemática e imagem exemplifi cando os modos de operação da microextração por fl utuação (a) e retroextração por LD (b) usados na técnica BAE[5,6]. 1 - Frasco de amostragem; 2 - Vortex; 3 - Amostra; 4 - Barra de agitação magnética em Tefl on; 5 - Dispositivo de BAE; 6 - Vial; 7 - Solvente para LD.



peratura e mecânica, mostraram que a fi xação e o comportamento das fases sorventes envolvidas são efetivas e robustas[6]. A reutilização desses dispositivos é igualmente possível dependendo apenas da complexidade da matriz envolvida, do tipo de solutos alvo, das condições experimentais impostas, assim como das fases sorventes sele-cionadas.

2.2 Características das fases sorventes

Para análise residual em particular, os AC são sorventes ideais para microextração, uma vez que na forma de pó apresentam partícu-las (tamanho < 30 m) nanoestruturadas, com áreas superfi ciais que podem ir até 1.500 m2 g–1 e natureza desde microporosa (largura de poro < 2 nm) a mesoporosa (2 nm < largura de poro < 50 nm), com volumes estimados até 60% do total, que facilitam a difusidade das moléculas alvo na porosidade interna sem sofrerem res-trições estéreas. Além disso, apresentam grande capacidade para enriquecimento (≈100-500 g mg–1), não sendo aplicáveis as considerações teóricas de Langmuir e Freundlich, por estarem abaixo dos correspondentes patamares isotérmi-cos[5,6]. Os ACs são sólidos amorfos, contendo centros ativos nos quais podem ocorrer inte-rações eletrostáticas e/ou dispersivas (proprie-dades de “adsorção-dessorção”), sendo a rede sólida essencialmente composta por carbono com elevada capacidade adsortiva, podendo ser adquiridos comercialmente ou preparados laboratorialmente a partir de matérias-primas ricas em carbono. Dependendo da metodologia de preparação e do percursor usado, é possível adaptar a distribuição do tamanho de poro e a química da superfície no sentido de se encontra-rem os requerimentos ideais para uma aplicação analítica em particular. Além disso, o pHpzc (pH do ponto de carga zero) tem grande infl uência nos tipos de mecanismos de interação, sendo que

as características básicas ou ácidas condicionam o fenômeno eletrostático e/ou dispersivo, dado serem dependentes da existência de heteroáto-mos, geralmente em pequena percentagem, na rede sólida dos ACs. No entanto, esses heteroá-tomos formam espécies superfi ciais que infl uen-ciam as propriedades adsortivas do material em fase líquida, situação ideal para reter compostos orgânicos com características polares em meio aquoso. Alternativamente, pode-se recorrer a outros sorventes, como as fases baseadas em materiais poliméricos, nomeadamente à base de poliestireno-divinilbenzeno (PS-DVB), pirroli-dona modifi cada, materiais de troca iônica etc. Muitos desses materiais poliméricos são de tipo fase reversa, retendo os solutos através de inte-racções -, dipolo-dipolo, ligações de hidrogê-nio e iônicas, mas também com recurso a meca-nismos múltiplos. Genericamente, o tamanho da partícula, a área superfi cial, a microporosidade e o pH são propriedades igualmente importan-tes que evidenciam grande infl uência nos meca-nismos de interação entre as moléculas alvo e os materiais poliméricos. Em suma, as característi-cas físico-químicas das fases sorventes referidas são determinantes, para poderem ser usadas na microextração efetiva de compostos orgânicos polares e, nesse sentido, solucionarem as limita-ções demonstradas por outras técnicas sortivas, como é o caso da SBSE(PDMS).

3 Desenvolvimento analítico da BAE

O método de desenvolvimento experimental para BAE utiliza um dispositivo cilíndrico idên-tico à SPME ou SBSE[2-5] e consiste em dois pas-sos fundamentais de operação, nomeadamente, a extração ou enriquecimento dos analitos do seio da amostra para a fase sorvente e, posteriormente, a retroextração ou dessorção dos solutos da fase



sorvente para o sistema instrumental. Durante o processo de extração, os dispositivos BAE são colocados em contato com os solutos, recor-rendo ao modo de amostragem por fl utuação, conforme referido anteriormente (Figura 2a). O passo de extração é geralmente levado a cabo sob condições de equilíbrio, no sentido de se obter máxima efi ciência, sendo sempre obrigatório o controle de diversos parâmetros experimentais. Genericamente, são efetuados ensaios sistemati-zados para otimizar as mais importantes variá-veis que infl uenciam e condicionam a cinética de extração, nomeadamente o tempo de equilíbrio e a velocidade de agitação, assim como a termo-dinâmica associada à interação entre os analitos alvo e a fase extratora, i.e., pH, polaridade e força iônica da amostra. Por outro lado, a escolha do sorvente é igualmente crítica, assim como o fator de diluição, na perspectiva de se alcançarem sele-tividades e detectabilidades compatíveis com os limites analíticos desejáveis. O desenvolvimento de qualquer método que envolva BAμE, deve ini-ciar o processo de otimização efetuando ensaios em matrizes de água ultrapura fortifi cada com os compostos alvos ou modelo que se pretende estudar, no sentido de se avaliar a efi ciência e o comportamento analítico. Numa primeira abor-dagem e após a seleção da fase sorvente mais seletiva, avalia-se o tempo de equilíbrio, que depende da velocidade das interações entre os analitos e as fases sorventes, garantindo máxima exatidão e precisão conveniente. Por outro lado, a velocidade de agitação costuma ser igualmente controlada, a fi m de tanto acelerar o processo de difusão dos analitos como de garantir a estabili-dade necessária para a fl utuação do dispositivo de microextração. Assim, velocidades de agita-ção muito elevadas para terem muito pouco ou quase nenhum efeito no processo de microextra-ção podem causar desagregação da fase sorvente, devido a eventuais contatos mecânicos com as

paredes do frasco de amostragem. Em geral, o pH da matriz é uma variável muito importante durante a operação por BAE, principalmente para analitos contendo características de disso-ciação, ou seja, propriedades ácidas ou básicas, uma vez que infl uenciam a interação com as fases sorventes. A modifi cação da força iônica e/ou da polaridade da matriz da amostra, geral-mente feita com o uso de eletrólitos fortes (p. ex., cloreto de sódio) e/ou álcoois (p. ex., meta-nol), é um imperativo no sentido de se avaliar o comportamento dos compostos orgânicos com menor polaridade aos fenômenos do salting-out e do wall-eff ect, respectivamente[5]. Embora a temperatura seja um parâmetro sempre impor-tante em qualquer processo analítico, na BAE pode ser considerada negligenciável dentro de certos limites, uma vez que esta técnica é indi-cada para operar à temperatura ambiente. Após o passo de extração, as barras de agitação são removidas com pinças adequadas e submetidas ao processo de retroextração com recurso ao modo de dessorção líquida (LD), indicada para solutos desde semivoláteis a não voláteis, como reproduzido na Figura 2b. Tanto o tipo de sol-vente (ex. metanol, acetonitrila, misturas etc.), como o tempo de imersão e o número de dessor-ções são variáveis importantes de serem avaliadas durante o passo de LD. Esse procedimento exige imersão completa da fase sorvente que reveste a barra de agitação dentro de vials ou inserts em vidro e sob tratamento ultrassônico, no sen-tido de melhorar a efi ciência de retroextração. A abordagem por LD apresenta a vantagem de poder ser combinada com qualquer tipo de sis-tema de separação, incluíndo a cromatografi a em fase gasosa (GC), a cromatografi a líquida de alta efi ciência (HPLC), a eletroforese capilar (CE) ou mesmo técnicas hifenadas (GC-MS, LC-MS etc.), recorrendo-se a condições instrumentais convenientes[5]. Durante o desenvolvimento do



método por BAE, ensaios sistematizados cos-tumam ser implementados, podendo ser usadas estratégias de otimização univariada ou multiva-riada no sentido de encontrar os melhores parâ-metros experimentais que afetam os sistemas em estudo. Após o processo de otimização tem lugar a validação, na qual parâmetros analíticos como os limites de detecção e quantifi cação, inter-valo linear dinâmico, exatidão e precisão, entre outros, deverão ser estimados no sentido de se provar a confi abilidade do método desenvolvido. Para análise residual em particular, a validação deve ainda demonstrar repetibilidade em con-formidade com os requerimentos da Diretiva 98/83/EC para a determinação de compostos orgânicos[7]. Em resumo, qualquer esquema ana-lítico que envolva BAμE requer que a ordem do método de desenvolvimento comece pela otimi-zação do sistema instrumental, i.e., as condições de detecção e separação, seguida do passo de retroextração e, fi nalmente, dos parâmetros crí-ticos da microextração. Após validação, a aplica-ção a matrizes reais deve igualmente ter lugar, no sentido de demonstrarem-se todas as vantagens analíticas como técnica alternativa e confi ável relativamente a outras metodologias conven-cionais, sobretudo se estão envolvidas matrizes complexas. Uma das características interessan-tes da BAE reside em os dispositivos analíticos poderem ser usados tanto uma única vez como diversas vezes, sem mostrar degradação física da fase sorvente, apesar do custo associado ser baixo. A única condição prática a ser implemen-tada é que antes de serem reutilizados os dis-positivos devem ser regenerados com solventes adequados (p. ex., acetonitrila). Outra vantagem, comparativamente com diversas abordagens de enriquecimento, nomeadamente com técnicas de amostragem dinâmicas, reside no fato de a BAE permitir que a operação de microextração possa ter lugar à noite, em particular se forem

necessários tempos muito superiores (> 4 h) para se alcançar as condições de equilíbrio adequadas, sem nenhum requisito especial.

4 Aplicações recentes da BAE

Na generalidade, a grande maioria das apli-cações de BAE tem por propósito substituir outras técnicas de enriquecimento dedicadas, uma vez que apresenta maior facilidade de mani-pulação como técnica de amostragem passiva e grande facilidade na monitorização residual de compostos orgânicos, nas quais outras técnicas baseadas em sorção demonstram limitações e, ainda, como metodologia multirresíduo para monitorar simultaneamente diferentes classes de solutos em diversos tipos de amostras reais. Mesmo assim, a efi ciência de qualquer técnica de microextração, como é o caso da BAE, pode ser substancialmente afetada pela complexidade das matrizes envolvidas, uma vez que potenciais interferentes podem infl uenciar o rendimento de recuperação. Nesse contexto, a aplicação de qualquer metodologia por BAE, otimizada e validada, a amostras reais é uma obrigação, no sentido de se verifi car o comportamento analí-tico, assim como a ocorrência de interferentes que causem objetivamente efeitos matriz. Uma forma de minimizar eventuais efeitos de matriz reside no recurso à padronização por adição de padrão, uma vez que fornece o nível de exa-tidão requerido para a análise residual numa grande variedade de sistemas. Nessa perspec-tiva, a BAE tem sido aplicada com sucesso para determinação residual de compostos orgânicos emergentes e prioritários em áreas fundamen-tais como ambiental, farmacêutica, alimentar, forense, biomédica etc., em particular como técnica para análise vestigial alternativa às con-vencionais ou bem estabelecidas. Exemplos da aplicação da BAE incluem a determinação de



Figura 3 Exemplo de cromatogramas obtidos por BAE na aplicação a matrizes reais: A) Análise de subprodutos formados da desinfecção de águas para consumo humano por BAE(PS-DVB)-LD/HPLC-DAD, após derivatização in situ com pentafl uorofenil hidrazina (PFPH); a) Água ultrapura fortifi cada, b) Água clorada, c) Água ozonada, d) Água pré-ozonada seguida de cloração; 1 - formaldeído-PFPH; 2 - acetaldeído-PFPH; 3 - acetona-PFPH; 4 - propanal-PFPH; 5 - butanona-PFPH; 6 - 2-hexenal-PFPH. Fonte: adaptado de Neng[8]. B) Determinação de morfi na (MOR) e codeína (COD) em amostras de água (a) e urina (b) por BAE(AC)-LD/HPLC-DAD. Fonte: adaptado de Gonçalves[12]. C) Monitoramento de fungicidas numa amostra de água fortifi cada por BAµE(P3)-LD/LVI-GC-MS; 1 - metalaxil, 2 - ciprodinilo, 3- penconazol, 4 - procimidona, 5 - fl usilazol, 6 - miclobutanilo, 7 - benalaxil, 8 - tebuconazol, 9 - difenoconazol, 10 – azoxistrobina. Fonte: adaptado de Almeida[13]. D) Análise de fi ltros UV numa amostra de loção de barbear (a) e de protetor solar (b) por BAE(P2 ou AC4)-LD/HPLC-DAD; 1 - 4-hidroxi-benzofenona, 2 - 2,4-hidroxi-benzofenona. Fonte: adaptado de Almeida[14].



resíduos de herbicidas (p. ex., triazínicos), fun-gicidas (p. ex., triazoles, anilidas etc.), inseticidas repelentes (p. ex., piretróides), subprodutos da desinfecção (p. ex., carbonilos de cadeia curta), parabenos, produtos de higiene e cuidado pes-soal, fi ltros UV (p. ex., benzofenonas), hormô-nios esteróides, antibióticos, ibuprofeno, ácido clofi brico, acetaminofeno, cafeína, drogas de abuso (morfi na e codeína), polifenóis etc., em amostras de água para consumo humano, água superfi cial, águas residuais, águas estuarinas, fl uídos biológicos (p. ex., urina), bebidas (p. ex., vinho e sumos) e muitas outras matrizes comple-xas[8-15]. A Figura 3 exemplifi ca diversas aplica-ções a matrizes reais, nomeadamente, na análise de subprodutos formados após a desinfecção de águas para consumo humano por BAE(PS-DVB)-LD/HPLC-DAD (Figura 3A); na deter-minação de morfi na e codeína numa amostra de água e urina por BAE(AC)-LD/HPLC-DAD (Figura 3B); no monitoramento de fungicidas em amostras de água por BAE(P3)-LD/LVI-GC-MS (Figura 3C); e na análise de fi ltros UV em amostras de loção de barbear e protetor solar por BAE(P2 ou AC4)-LD/HPLC-DAD (Figura 3D). Refi ra-se que, além do excelente desempenho observado na BAE para compos-tos orgânicos polares, apresenta-se como técnica alternativa muito promissora e complemen-tar relativamente à SBSE. Em resumo, a técnica BAE é um novo conceito de microextração estática que recorre a materiais nanoestrutura-dos e à tecnologia de amostragem por fl utuação, sendo de fácil operação analítica, possibilitando a escolha do sorvente mais adequado para cada aplicação em particular.

5 Conclusões

Entre as técnicas baseadas em sorção, a BAE é, na atualidade, uma ferramenta analí-tica alternativa e bem estabelecida, que possui grande capacidade para microextração estática, notável desempenho e robustez compatível com a elevada detectabilidade e seletividade exigidas na análise de traços em matrizes complexas. Essa técnica apresenta-se ainda como uma aborda-gem pouco dispendiosa, comparativamente a outras técnicas baseadas em sorção, e de muito fácil implementação, exigindo volume reduzido de amostra e sendo muito promissora no moni-toramento de compostos orgânicos emergentes em diversas áreas científi cas.

Agradecimentos

O autor agradece o suporte da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (PEst-OE/QUI/UI0612/2013), Portugal.

Referências

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Aceito: 05/01/2014

PREPARO DE AMOSTRAS




ISSN 1984-4433

Microextração em fase sólida e cromatografia de gás: Uma combinação de elevado potencial

Sílvia M. Rocha*, Ângelo C. Salvador, Cátia Martins, Corália Barbosa, Magda Santos, Sílvia Petronilho

Departamento de Química & QOPNA, Universidade de Aveiro – UA, Campus Universitário de Santiago, 3810-193, Aveiro, Portugal

e-mail: [email protected]

Resumo

A microextracção em fase sólida (SPME) combinada com a cromatografi a de gás (GC) apresenta um elevado potencial de aplicação, quer no estabelecimento de perfi s voláteis globais de uma dada amostra, quer na quantifi cação de analitos alvo. Essa combinação tem sido utilizada em inúmeras áreas, nomeadamente na caracterização de produtos naturais, alimentos e biofl uidos, na pesquisa de contaminantes, na avaliação de processos industriais, em estudos nas áreas ambiental e clínica, entre outros. Esses estudos envolvem normalmente a análise de amostras complexas, constituídas por inúmeras moléculas com características físico-químicas distintas, algumas das quais presentes em concentrações de ordens de grandeza muito diferentes. Assim, os parâmetros experimentais relativos às condições de preparação da amostra, extração de analitos e posterior análise cromatográfi ca têm de ser defi nidos caso a caso em função das características físico-químicas da amostra e do(s) analito(s) a estudar. Neste artigo serão apresentados vários exemplos ilustrativos de estudos com especial enfoque nos produtos naturais, alimentos e metabolômica, os quais mostram claramente o elevado potencial das técnicas de microextração e cromatografi a de gás.

Palavras-chaveSPME; GC; GC×GC; compostos voláteis; alimentos; produtos naturais; metabolômica.

Solid phase microextraction and gas chromatography: A combination of high potential

Abstract

Solid phase microextraction (SPME) combined with gas chromatography (GC) represents a powerful tool regarding several fi elds of application, which may be used to establish global volatile sample profi ling or to quantify target analytes. Th is combination has been used in many fi elds, such as in the characterization of natural products, foods, and biofl uids, screening of contaminants, evaluation of industrial processes, and in the environmental or clinical studies, among others. Th ese studies typically involve the analysis of complex samples, containing numerous molecules, with diff erent physicochemical characteristics, in

SPME e GC: uma combinação de elevado potencial Rocha, SM, Salvador ÂC, Martins C, Barbosa C, Santos M, Petronilho S


1 Introdução

O desenvolvimento de métodos de análise expeditos, rápidos, com elevada sensibilidade e baixo custo continua a ser um desafi o atual. Nas últimas décadas têm ocorrido muitos desenvol-vimentos a nível instrumental, os quais têm per-mitido atingir limites de deteção e de quantifi -cação cada vez menores. Esses desenvolvimentos têm contribuído para o aumento exponencial do conhecimento sobre tudo o que nos rodeia. Paralelamente com os avanços observados ao nível do desenvolvimento de equipamentos de análise, tem-se observado também um grande investimento na área da preparação de amostra. Procuram-se procedimentos rápidos, que envol-vam uma reduzida manipulação da amostra e que, idealmente, não incluam o uso de solven-tes, tendo como objetivo evitar a formação de artefatos e minimizar a quantidade de resíduos resultantes da etapa de extração. A preocupação com a preservação da qualidade do ambiente de trabalho num laboratório e do meio ambiente em geral também deve estar presente na fase de decisão relativa a uma dada abordagem metodo-lógica. A microextração em fase sólida (SPME) e a cromatografi a de gás (GC) surgem como duas abordagens com amplo leque de aplicações e que estão em linha com essas preocupações atuais. Essa combinação tem sido utilizada em inúme-ras áreas, nomeadamente na caracterização de produtos naturais, alimentos e biofl uidos, na

pesquisa de contaminantes, na avaliação de pro-cessos industriais, em estudos nas áreas ambien-tal e clínica, quer na defi nição de perfi s globais ou na análise de compostos alvo. Na Figura 1 são apresentados alguns exemplos de estudos que têm sido desenvolvidos no nosso grupo de inves-tigação, sendo dado especial destaque ao estudo de produtos naturais e alimentos de origem vegetal e aos estudos na área da metabolômica, envolvendo um vasto leque de matrizes (micror-ganismos, urina, ar exalado, líquido amniótico, plasma e excrementos de animais). Por outro lado, a análise de compostos voláteis por recurso a técnicas baseadas em SPME/GC também tem sido usada como uma ferramenta auxiliar e muito promissora em estudos mecanísticos.

2 Combinação de SPME com a cromatografia de gás

2.1 Microextração em fase sólida

A microextração em fase sólida foi desen-volvida nos anos 90 do século passado por Janusz Pawliszyn e seus colaboradores na Universidade de Waterloo, Canadá, sendo inicialmente apli-cada na análise de poluentes em água. Trata-se de uma técnica de extração e de pré-concentra-ção de compostos voláteis e semivoláteis. Nesse tipo de metodologia não ocorre uma extração exaustiva dos analitos, apenas uma pequena fra-ção é extraída, a qual é representativa da com-

a wide range of concentrations. Th us, the experimental parameters, including the sample preparation and extraction, and subsequent chromatographic analysis, should be optimized for each specifi c case, according to the physicochemical characteristics of the sample(s) and analyte(s). Th is paper covers a set of examples selected to highlight the challenges related to method implementation, and particular attention was devoted to applications in the fi elds of natural products, food and metabolomics, which really demonstrate the high potential of microextraction and gas chromatography techniques.

KeywordsSPME; GC; GC×GC; volatile compounds; food products; natural products; metabolomics.

Rocha, SM, Salvador ÂC, Martins C, Barbosa C, Santos M, Petronilho S SPME e GC: uma combinação de elevado potencial


posição global dos compostos na forma livre se as condições experimentais forem devidamente otimizadas e posteriormente controladas. Apesar de existirem sistemas de SPME com diferen-tes geometrias, a mais comum consiste numa seringa em que a agulha tem uma base de sílica fundida revestida com uma fi na camada de uma fase estacionária que pode ser imersa na amostra (caso das amostras líquidas) ou introduzida na fase de vapor emitida pela amostra (HS-SPME).

Existem disponíveis no mercado vários tipos de fases estacionárias para SPME, apresen-tando diferentes polaridades, espessuras de fi lme e tipos de interação com o analito (absorção e adsorção) (Figura 2). A escolha da fase estacio-nária mais adequada depende das propriedades físico-químicas do(s) analito(s) e da amostra, e as condições experimentais devem ser otimiza-das para cada tipo de analito e de fase estacio-

nária. A efi ciência extrativa e a reprodutibilidade são dependentes de parâmetros experimentais como temperatura e tempo de extração, quanti-dade de amostra, composição química da amos-tra, agitação, adição de sais (efeito salting out), entre outros.

A microextração em fase sólida é uma meto-dologia de extração que apresenta inúmeras van-tagens relativamente às técnicas convencionais, das quais se destacam algumas:

• Fácil manipulação;• Elevada sensibilidade e reprodutibilidade;• Extração não seletiva ou altamente seletiva,

dependendo do tipo de fase estacionária;• Elevada versatilidade, pois existem disponí-

veis vários tipos de fases estacionárias com diferentes geometrias;

• Tempo de extração relativamente curto, normalmente da ordem de minutos;

Figura 1 Exemplos de aplicações de SPME combinada com cromatografi a de gás desenvolvidos no Laboratório de Bioquímica e Química Alimentar da Universidade de Aveiro.



• Possibilidade de realização de estudos in vivo, pois a sua introdução é pouco invasiva e já existem fases estacionárias biocompatíveis;

• Possibilidade de, numa única etapa, serem extraídos compostos hidrofóbicos e hidro-fílicos;

• Não requerer etapas prévias de limpeza da amostra (sample clean-up) como, por exemplo, a eliminação de açúcares ou a precipitação de proteínas;

• Possibilidade de ser aplicada na análise da composição volátil de matrizes sólidas, líquidas ou gasosas;

• Permite a análise direta de amostras sólidas;

• Permite que a análise seja facilmente auto-matizada em combinação com vários tipos de equipamentos como, por exemplo, GC, HPLC, LC-MS etc.

2.2 Cromatografia de gás

Os compostos sorvidos na fase estacionária são normalmente desorvidos no injetor de um GC com deteção por espectrometria de massa (GC-MS). Por vezes são utilizados detectores específi cos como, por exemplo, o ECD (Electron Capture Detector), o NPD (Nitrogen/Phophorus Detector), entre outros, com vista a incrementar a sensibilidade e a especifi cidade da metodologia relativamente a um dado analito. A deteção por

Figura 2 Fluxograma global de análise: Preparação de amostras/extração, métodos cromatográfi cos e processamento de dados.



espectrometria de massa é amplamente utilizada, especialmente quando o objetivo não é pesquisar um analito específi co, mas sim o estudo global da fração volátil. Atualmente, esse tipo de equi-pamento está sufi cientemente desenvolvido, apresentando detectores robustos e soft wares com algoritmos que facilitam o processamento de dados[1]. Além disso, incluem bases de dados de espectros de massa que constituem uma fer-ramenta chave na identifi cação de analitos, espe-cialmente daqueles para os quais não há padrões disponíveis comercialmente ou no caso de amos-tras muito complexas, em que não é exequível adquirir dezenas ou mesmo centenas de padrões para confi rmação da identifi cação de todos os compostos detectados. Os GCs com detector por ionização de chama (GC-FID) são bastante mais baratos que as opções referidas anteriormente e são muito utilizados nos laboratórios quando se pretende analisar um analito ou um conjunto de analitos para os quais há padrões disponíveis e os limites de detecção e quantifi cação exigidos não são muito baixos (por exemplo, concentrações da ordem de mg/L). Por exemplo, num estudo recente pretendeu-se avaliar a libertação de far-nesol retido em cápsulas de sílica amorfa por recurso a GC-FID[2]. O farnesol tem sido alvo de vários estudos devido às suas propriedades de aroma e efeitos benéfi cos para a saúde, tendo sido exploradas várias aplicações na fi tofarma-cêutica e cosmética. A sua utilização fi ca por vezes condicionada pela sua volatilidade, assim têm sido desenvolvidas várias estratégias com vistas a promover a retenção e libertação contro-lada do farnesol como, por exemplo, a encapsu-lação em cápsulas de sílica. Para controlar a sua libertação a partir de diferentes tipos de cápsulas foi realizado um estudo, por cromatografi a de gás unidimensional com um detector FID. O uso deste tipo de detetor é devido à baixa complexi-

dade da matriz e ao fato de ser um estudo diri-gido a um único composto presente em concen-tração acima do limite de detecção do método. Essa metodologia de análise simples e rápida permitiu verifi car que as cápsulas produzidas são efi cientes na libertação controlada do farnesol e que o seu perfi l de libertação depende do tipo de cápsula utilizada.

Apesar de a cromatografi a unidimensional (1D-GC) ser amplamente utilizada na análise qualitativa e quantitativa de uma grande varie-dade de amostras, fornecendo dados analíticos perfeitamente validados, por vezes a complexi-dade das amostras excede a capacidade separativa de um único processo cromatográfi co. Nesses casos, os cromatogramas apresentam coeluições, o que difi culta bastante as tarefas de identifi ca-ção e quantifi cação dos analitos. Assim, nos últi-mos anos têm sido desenvolvidas várias soluções instrumentais com o objetivo de incrementar a resolução cromatográfi ca. A cromatografi a de gás bidimensional abrangente (GC×GC) apre-senta-se como uma alternativa, a qual inclui dois mecanismos ortogonais para separação dos vários componentes de uma amostra numa única análise. Essa técnica baseia-se na combinação de duas colunas com diferentes fases estacionárias como, por exemplo, uma apolar e outra polar, ligadas em série através de uma interface espe-cífi ca, um modulador (Figura 2). Essa interface fi xa por criofocagem pequenas frações (corres-pondendo a alguns segundos) eluídas a partir da primeira coluna e as reinjeta na segunda coluna. Cada pico da primeira dimensão (1D) é modu-lado várias vezes, o que permite a preservação da separação nessa dimensão. A segunda coluna (2D) é muito curta e fi na e, consequentemente, cada fração modulada é separada muito rapida-mente, antes que a próxima modulação se inicie. Usando esse tipo de equipamento, os compostos



coeluídos na primeira coluna serão adicional-mente separados na segunda coluna[3]. Assim, a capacidade separativa é altamente incrementada quando comparada com 1D-GC. Além da sepa-ração cromatográfi ca, a sensibilidade e os limites de detecção também são incrementados devido à focagem do pico no modulador e à separação dos analitos do background. A GC×GC também oferece novas oportunidades no estabelecimento de cromatogramas estruturados (estrutura orde-nada do cromatograma de contornos GC×GC baseada na presença de compostos estrutural-mente relacionados), o que permite defi nir espa-ços cromatográfi cos associados a determinadas estruturas moleculares[4]. Na Figura 3 apresenta--se um exemplo em que se combinou uma coluna apolar (1D) com outra polar (2D) na análise de um vinho licoroso. Assim, os compostos não separa-dos na primeira coluna, porque apresentam vola-tilidades similares, foram separados na segunda coluna pelo fato de apresentarem diferenças ao nível da polaridade. A obtenção de cromato-gramas estruturados também contribui para a redução do tempo de tratamento dos dados. Por exemplo, através da Figura 3 é possível observar as zonas em que aparecem os produtos de fer-mentação, tais como os ésteres e os álcoois. Se se pretende estudar só essas famílias químicas, o analista irá focar o seu esforço apenas na análise de uma zona limitada do cromatograma.

Devido à elevada sensibilidade e resolu-ção cromatográfi ca, o GC×GC-ToFMS tem sido muito utilizado, principalmente na última década. A seguir serão realçados alguns exem-plos da sua aplicação na área dos produtos natu-rais e alimentos e da metabolômica. É, ainda, interessante destacar a ampla gama de aplicação dessa metodologia e a possibilidade de desenvol-vimento em domínios de aplicação transversais, nomeadamente como ferramenta de suporte no

estudo de misturas reaccionais complexas, em complementaridade com outras técnicas analí-ticas. Por exemplo, o furfural tem sido alvo de vários estudos devido ao seu potencial como substituto de uma variedade de materiais deriva-dos de petróleo, carvão, gás e de produtos quí-micos. Esse composto pode ser produzido por desidratação da D-xilose, a qual, por sua vez, é obtida a partir de biomassa lignocelulósica. A conversão de xilose em furfural é acompanhada por várias reações secundárias, formando mis-turas reacionais complexas. O GC×GC-ToFMS foi utilizado na caracterização química dessa mistura reaccional, sendo possível estabele-cer um modelo de cinética pseudo-homogênea que se ajusta muito bem aos dados experimen-tais[5,6]. Com base nessa experiência de sucesso, o GC×GC-ToFMS foi posteriormente utilizado como uma poderosa ferramenta na compreensão de várias reações químicas[7,8].

Figura 3 Cromatograma de GC×GC-ToFMS gerado em duas dimensões, resultante da combinação de uma coluna apolar na primeira dimensão com uma coluna polar na segunda dimensão; estão assinalados os espaços cromatográfi cos associados aos ésteres e aos álcoois; *os três compostos que aparecem ao longo dessa linha apresentam características de volatilidade similares e foram separados ao longo da segunda dimensão de acordo com as suas diferentes características de polaridade.



3 Análise de produtos naturais e/ou alimentos

Os produtos naturais e os alimentos são amostras constituídas por inúmeras biomolécu-las com características físico-químicas distintas, algumas das quais estão presentes em concen-trações de ordens de grandeza muito diferentes. Assim, a análise desse tipo de amostras apresenta alguns desafi os, quer no estabelecimento do per-fi l volátil global, quer na quantifi cação de ana-litos específi cos. Esse tipo de estudos têm sido levados a cabo com propósitos muito diversos e a defi nição da metodologia de análise tem de ser defi nida caso a caso em função das característi-cas físico-químicas da amostra e do(s) analito(s) a estudar. A seguir serão apresentados vários exemplos ilustrativos.

A determinação do perfi l volátil, bem como do teor em compostos voláteis, tem sido usada para avaliar a composição de espécies vegetais ou alimentos, quer em termos de avaliação da infl u-ência da origem geográfi ca ou das práticas agrí-colas[9,10], da distinção entre espécies endógenas e espécies exóticas[11], quer na valorização de espé-cies através da identifi cação de compostos com potenciais efeitos benéfi cos para a saúde[12-15], nomeadamente os compostos terpênicos (com-postos mono e sesquiterpênicos). Esses compos-tos são provenientes do metabolismo secundário das plantas e também têm sido estudados com o intuito de avaliar seus processos fi siológicos, como, por exemplo, o amadurecimento da uva (Vitis vinifera L.), que tem grande impacto nas características organolépticas do vinho[16-18]. Os estudos anteriormente referidos[9,11-16] envolve-ram a análise de amostras muito distintas, como plantas, bivalves e uvas. No que diz respeito à preparação das amostras, é de realçar que houve sempre o propósito de minimizar ou mesmo evi-

tar qualquer tipo de manipulação da amostra. Assim, as plantas foram colocadas num frasco de vidro e extraídas diretamente por SPME, após defi nição das condições de extração, os bival-ves foram homogeneizados e diluídos em água para incrementar a efi ciência extrativa e as uvas foram esmagadas antes da análise por SPME, com vista a simular o processo de esmagamento que ocorre durante a vinifi cação, antes da etapa da fermentação. O fato de se analisar a amostra diretamente, sem qualquer tipo de manipulação ou com uma manipulação mínima, permite tem-pos de análise muito curtos (alguns minutos), prevenindo a formação de artefatos ou perda de analitos, especialmente da fracção mais volátil. Para o estudo desse tipo de amostras que apre-sentam elevada complexidade em termos de número de analitos detectados e de diversidade de estruturas químicas, opta-se por fases estacio-nários de SPME, que incorporam dois ou mais tipos de materiais, como a PDMS/DVB (65 μm, polydimethylsiloxane/divinylbenzene) ou DVB/CAR/PDMS (50/30μm, divinylbenzene/carbo-xen/poly(dimethylsiloxane)). O efeito sinérgico devido a fases estacionárias do tipo absorvente e adsorvente conferem uma maior capacidade de retenção de analitos e, consequentemente, uma maior efi ciência extrativa comparativamente com as fi bras contendo apenas um tipo de fase estacionária. Relativamente às técnicas croma-tográfi cas, as amostras foram analisadas por 1D-GC e por GC×GC, dependendo do nível de informação pretendido.

A partir de um estudo exploratório com vista à futura valorização de várias espécies vegetais portuguesas, foi obtido um perfi l global de com-postos mono e sesquiterpênicos de 25 espécies de plantas e respectivas infusões, por HS-SPME/GC-qMS[15]. Por outro lado, o estudo de produ-tos naturais, com enfoque na bioprospecção de



compostos específi cos com eventual interesse para a saúde, normalmente implica o uso de téc-nicas cromatográfi cas de elevada sensibilidade e resolução cromatográfi ca, de modo a resol-ver a complexidade das amostras. Em amostras como calistemo (Callistemon citrinus), camomila (Matricaria recutita L.), sabugueiro (Sambucus nigra L.) ou algas vermelhas (Gracilaria vermi-culophylla) são detectadas várias centenas de compostos voláteis, inclusive os compostos ter-pênicos, descritos como apresentando poten-ciais efeitos benéfi cos para a saúde humana[19]. Assim, o estudo detalhado da fracção mono e sesquiterpênica dessas amostras foi realizado por GC×GC-ToFMS, tendo sido possível reportar dezenas de compostos nunca antes descritos na literatura, por exemplo, para o Callistemon citri-nus[13] e a Ferula gummosa[12,14].

Uma das tendências atuais do mercado passa pela valorização dos produtos regionais e artesa-nais. O sal marinho obtido de forma artesanal nas salinas de Aveiro (Portugal) corresponde a uma tipologia de produto que é muito valorizada atualmente. A pesquisa de biomarcadores do sal marinho tem sido objeto de vários estudos, dado que há uma preocupação crescente a nível euro-peu para a proteção e a revalorização da iden-tidade das salinas. Essa valorização está intrin-secamente associada à qualidade do sal marinho produzido, que pode ser avaliada pelas suas caraterísticas físico-químicas. A análise do sal marinho, por HS-SPME/GC-MS e mais recente-mente por HS-SPME/GC×GC-ToFMS, revelou a presença de uma grande diversidade de compos-tos orgânicos voláteis, aos quais foram atribuídas várias origens: comunidade bacteriana das sali-nas, algas, poluição e atividade humana nas zonas envolventes das salinas[20,21]. Foi, ainda, desenvol-

vida uma metodologia baseada em HS-SPME/GC-qMS[22] para quantifi cação da β-ionona no sal marinho, a qual explica o seu odor a violeta.

Os perfi s de compostos voláteis de alimentos têm sido usados para avaliar aromas característi-cos dos produtos, detectar defeitos sensoriais ou avaliar o impacto de diversos processos indus-triais como, por exemplo, a secagem de frutas, torra do café[23], os efeitos do processamento[24,25] e do armazenamento em vinhos de mesa e lico-rosos[26,27], entre outros. Esse tipo de controle pode ser um apoio na tomada rápida de decisão nas indústrias, contribuindo para a melhoria das características organolépticas dos produtos e, consequentemente, para a redução de custos e para uma maior aceitação do produto por parte do consumidor[28].

Na área da segurança alimentar, o estudo dos compostos voláteis tem-se revelado uma ferramenta de grande utilidade. A segurança ali-mentar está entre as grandes preocupações das organizações reguladoras dos vários países e das organizações internacionais, dado que todos os anos são reportados diversos problemas de saúde pública advindos do consumo de alimentos que, em alguma fase do processo (colheita, processa-mento, transporte e/ou armazenamento), foram tratados de forma imprópria, o que pode com-prometer a segurança do consumidor. A seguir serão apresentados dois exemplos de aplicações em que a análise de compostos voláteis pode ser uma mais-valia no controle e adoção de estra-tégias que minimizam potenciais riscos para a saúde.

O carbamato de etilo, que tem sido detectado em diversos alimentos fermentados e bebidas alcoólicas, nomeadamente em vinhos Madeira, é um composto químico considerado como pro-vavelmente carcinogênico para humanos (grupo 2A) pela Agência Internacional de Pesquisa sobre



o Cancro (IARC). Essa realidade impõe que sejam desenvolvidas metodologias expeditas que possam ser incorporadas no controle de quali-dade do vinho Madeira. A combinação da SPME com GC×GC-ToFMS permitiu a quantifi cação do carbamato de etilo por análise direta do vinho. Os dados relativos ao carbamato de etilo foram obtidos em modo de extração de íons (usando o m/z 62 como íon diagnóstico do carbamato de etilo), o que permitiu aumentar a sensibilidade e a seletividade do método. Para os vinhos secos foram obtidos limites de detecção (LOD) e de quantifi cação (LOQ) de 4,31 μg/L e 14,38 μg/L, respectivamente, e para os vinhos doces, de 2,75 μg/L e 9,16 μg/L, respectivamente[29]. O teor mais elevado de glucose nos vinhos doces, comparati-vamente aos vinhos secos, explica os parâmetros analíticos obtidos, uma vez que um teor superior de glucose irá contribuir para a redução da solu-bilidade do carbamato de etilo no vinho (solução etanol/água), consequentemente aumentando a sua transferência para a fase de vapor onde se encontra a fi bra de SPME. Essa metodologia foi posteriormente aplicada para defi nir estratégias para a redução de carbamato de etilo em vinhos Madeira[30].

O 2-hidróxi-6-metilbenzaldeído é uma feromona produzida por ácaros e o seu monito-ramento permite avaliar de forma expedita a pre-sença de ácaros em alimentos. Atualmente, sabe--se que há uma percentagem muito elevada da população mundial que apresenta reações alér-gicas aos ácaros. Assim, o consumo de alimen-tos com ácaros por pessoas sensibilizadas pode desencadear uma resposta alérgica de maior ou menor gravidade, podendo mesmo desencadear um choque anafi lático. Foi desenvolvido um método que permite a detecção do 2-hidróxi-6--metilbenzaldeído por análise direta de cere-ais com recurso a HS-SPME/GC×GC-ToFMS,

tendo-se verifi cado que o teor dessa feromona está diretamente relacionado com a quantidade de ácaros existente na amostra[31]. Para o desen-volvimento com sucesso dessa abordagem foi fundamental o uso de GC×GC-ToFMS. Como é ilustrado na Figura 4, apesar de na 1D, no tempo de retenção de 525 s, existirem vários compos-tos, o 2-hidróxi-6-metilbenzaldeído foi devida-mente separado por adição de uma 2D indepen-dente, revestida com uma fase estacionária polar. Assim, obteve-se a resolução cromatográfi ca adequada para a obtenção de um pico bem defi -nido para o 2-hidróxi-6-metilbenzaldeído.

4 Metabolômica

A metabolômica representa uma abordagem analítica emergente que tem sido utilizada como uma ferramenta de grande utilidade para extrair informação global e integrada sobre metabólitos endógenos de sistemas biológicos e suas varia-ções em situações concretas como, por exem-plo, em doenças, exposição a agentes tóxicos, situações de stress, entre outras[32]. Esse conceito tem sido aplicado em inúmeras áreas como, por

Figura 4 Seção de um cromatograma de GC×GC-ToFMS de grãos de aveia. Apesar de na 1D, no tempo de retenção de 525 s, existirem vários compostos, o 2-hidróxi-6-metilbenzaldeído foi devidamente separado por polaridade através da 2D.



exemplo, no desenvolvimento de fármacos e no diagnóstico clínico, biotecnologia e agricultura e toxicologia ambiental[33].

Os metabólitos voláteis produzidos por microrganismos podem ser utilizados como biomarcadores da sua presença ou ainda para estudar a comunicação entre eles, ou a sua patogenicidade. A segurança microbiológica de um alimento está muito associada ao seu nível de contaminação microbiológica, o qual pode ser avaliado a partir do perfi l metabólico dos microrganismos presentes. A análise direta de trigo, aveia, arroz e grãos de café por HS-SPME/GC×GC-ToFMS mostrou que amostras com teores superiores de metilbenzeno, 3-octanona, 2-nonanona, 2-metil-3-pentanol, 1-octen-3-ol e 2-hexanona apresentavam os níveis de contami-nação microbiológica mais elevados, expressos em UFCs (unidades formadoras de colônias)[31]. Essa análise demora apenas 70 min, o que repre-senta um tempo de análise muito menor compa-rativamente aos ensaios dependentes de cultura em placa, que demoram pelo menos 24 h.

Muitos estudos da área da microbiologia incluem o crescimento de microrganismos em meio de cultura e a sua posterior análise. Nesses casos, o passo inicial passa por escolher o meio de cultura mais adequado para o crescimento do microrganismo em estudo, mas que não apre-sente uma composição volátil muito complexa, evitando futuras coeluições com os metabólitos do microrganismo em estudo. Por vezes, esse é o grande desafi o que um analista tem em mãos quando pretende fazer estudos de metabólitos na área da microbiologia. É, ainda, importante defi nir se se pretende apenas estudar o exometa-boloma (conjunto de metabólitos expressos para o exterior da célula) ou se se pretende também estudar o endometaboloma (conjunto de meta-bólitos produzidos pela célula e que se mantêm

no seu interior). Nesse último caso, após lavagem das células para eliminação do exometaboloma, deve-se rebentar a célula por congelação, ultras-som ou tratamentos químicos, físicos ou mecâ-nicos.

Os metabólitos voláteis produzidos por microrganismos apresentam várias funções, como na comunicação célula-célula, no cresci-mento, como reguladores da patogenicidade[34,35], entre outros. Assim, com recurso a HS-SPME/GC-MS foi avaliada a produção de álcoois extra-celulares por culturas de Candidas spp. e o seu efeito sobre a formação de biofi lmes: álcool iso-amilo, 2-feniletanol, 1-dodecanol, E-nerolidol e E, E-farnesol. Os resultados obtidos indi-cam que esses álcoois induzem efeitos distintos na atividade e formação do biofi lme[34]. Essas moléculas sinalizadoras também têm um papel muito importante no controle da morfogênese de Candida albicans e Candida dubliniensis[35], a qual está associada à sua patogenicidade.

Biofl uidos como, por exemplo, urina e ar exalado obtidos de forma não invasiva têm rece-bido grande destaque no estudo da patogênese de diversas doenças, com o objetivo de desenvol-ver metodologias que permitam um diagnóstico precoce e o monitoramento do estado de saúde dos pacientes. A metabolômica oferece métodos cada vez mais específi cos e sensíveis, permitindo traçar perfi s metabolômicos individuais, o que vai ao encontro do desenvolvimento emergente da medicina personalizada. A análise de bio-fl uidos requer o estabelecimento de protocolos standard de coleta para que seja possível a sua aplicação em estudos transversais envolvendo um número expressivo de indivíduos. O ar exa-lado condensado e a urina, após coleta, podem ser congelados a -80 °C para evitar degradações e podem ser analisados posteriormente. O ar exa-lado na fase de vapor deve ser analisado até ca.



6 h após a sua coleta, posteriormente verifi ca-se que ocorre sorção dos metabólitos na superfície do saco de coleta[36]. Os metabólitos do ar exa-lado podem ser extraídos por SPME diretamente a partir do saco de coleta. Relativamente à aná-lise da urina, deve-se ter em atenção o seu pH, pois esse é fundamental para a defi nição do perfi l metabólico urinário. Para abordagens mais glo-bais, recomenda-se o pH ácido (2,0), pois per-mite a detecção de um maior número de com-postos. No entanto, para a análise de compostos alvo, podem ser escolhidos o pH alcalino (12,0) ou não se fazer o ajuste de pH, trabalhando no pH fi siológico da urina[37].

O estudo desses biofl uidos por metodologias baseadas em SPME/GC requer a otimização de parâmetros experimentais e de processamento de dados. Por exemplo, o perfi l metabólico da urina obtido por HS-SPME/GC×GC-ToFMS é extremamente complexo, tendo sido detectados cerca de 700 compostos por amostra, distribuí-dos por diversas famílias químicas: hidrocarbo-netos, aminas, amidas, ésteres, cetonas, aldeídos, álcoois, ácidos carboxílicos, éteres, nitrilos, halo-genetos, sulfuretos, tióis, terpenos e compostos heterocíclicos[37]. Apesar da complexidade da amostra, foi possível defi nir estratégias para se obter informação estruturada sobre as várias famílias químicas detectadas. Globalmente verifi cou-se que ao longo da 2D obtêm-se alca-nos alifáticos < alcenos ~ alcanos aromáticos < cetonas ~ aldeídos < álcoois < ácidos. O acesso rápido a informação específi ca de determinada família química pode ser obtido através do uso de íons diagnóstico específi cos. Por exemplo, para estudar os aldeídos e alcanos alifáticos, reportados como marcadores de stress oxidativo, foram seleccionados os íons m/z 43, 56, 57, 71, e 85 – íons diagnóstico. Assim, estabeleceu-se um espaço cromatográfi co específi co para essas

duas famílias: os alcanos alifáticos encontram--se entre 0,35-0,43 s para a 2D e os aldeídos alifáticos encontram-se entre 0,48-0,63 s. Um estudo exploratório realizado em fumadores e não fumadores recorrendo à metodologia desen-volvida mostrou que essa abordagem pode ser muito promissora, nomeadamente na avaliação de marcadores do stress oxidativo, tais como os aldeídos e alcanos alifáticos[37].

A asma representa um problema de saúde pública muito relevante que tem apresentado um crescimento signifi cativo nos últimos anos. A asma afeta indivíduos de todas as idades, da infância aos sêniores. Tem sido dada particular atenção à população infantil, pois a asma repre-senta a principal causa de doença nas crianças nos países desenvolvidos, alterando as rotinas diárias dos pacientes e das famílias, com con-sequente diminuição da qualidade de vida. A asma está igualmente associada a elevados cus-tos, especialmente relacionados com diagnóstico e tratamento. Essa realidade tem desencadeado o aparecimento de vários estudos com o obje-tivo de estabelecer metodologias que possam ser utilizadas no diagnóstico precoce e no monito-ramento da doença. Recentemente, urina e ar exalado foram usados como matrizes preferen-ciais em estudos relacionados com a avaliação de alterações metabólicas associadas à asma[36,37], permitindo a distinção entre a população asmá-tica e a população saudável e a avaliação do impacto da terapia de controle da doença. A população asmática foi caracterizada principal-mente por metabólitos associados ao stress oxi-dativo, tais como alcanos e aldeídos alifáticos, característicos da infl amação das vias aéreas[38]. Considerando o papel das metodologias basea-das em análise molecular e inerentes aplicações clínicas, foi estabelecido um conjunto de biomar-cadores que caracterizam a população asmática:



nonano, 2,2,4,6,6-pentametilheptano, decano, dodecano e tetradecano. A análise focada nesses metabólitos reduz consideravelmente o tempo de processamento de dados e, portanto, torna a metodologia mais expedita para aplicações clíni-cas. Comparativamente com a urina, o ar exalado é uma matriz que apresenta um menor teor de metabólitos, assim a análise por GC×GC-ToFMS torna-se particularmente útil no estabelecimento detalhado da sua composição, inclusive na detec-ção de compostos vestigiais. Como observado na Figura 5, a seção de cromatograma de GC×GC de ar exalado de uma criança com asma indica que o pico da 3-hexanona apresenta cerca de 180

milissegundos de largura (metabólito vestigial), no entanto está bem defi nido e tem uma quali-dade espectral que permite a sua fácil identifi ca-ção por comparação com espectros de massa de bases de dados comerciais.

A metabolômica pode também ser uma fer-ramenta de elevada utilidade na área da biotec-nologia microbiana, na qual se destaca o exem-plo da Saccharomyces cerevisiae, uma levedura amplamente utilizada na indústria alimentar e afi ns. As fermentações vínicas são constituídas por consórcios microbianos, com diferentes espécies e estirpes de leveduras, onde a S. cere-visiae tem um papel fundamental. Assim, consi-

Figura 5 Seção de um cromatograma de GC×GC-ToFMS de ar exalado de uma criança com asma. O pico da 3-hexanona apresenta cerca de 180 milissegundos de largura (metabólito vestigial), no entanto esse está bem defi nido e o espectro de massa correspondente tem uma qualidade espectral que permite a sua fácil identifi cação por comparação com espectros de massa de bases de dados comerciais.



dera-se crucial avaliar a biodiversidade intrínseca de estirpes de S. cerevisiae, de forma a explorar o seu potencial biotecnológico, nomeadamente o potencial enológico. A análise de várias estirpes de S. cerevisiae por HS-SPME/GC×GC-ToFMS permitiu a identifi cação de várias dezenas de metabólitos, os quais são diferencialmente pro-duzidos pelas estirpes analisadas. Os compostos terpênicos parecem ser os fatores diferenciado-res interestirpe[39]. Considerando o potencial impacto desses compostos para o aroma, a sele-ção de determinada estirpe de S. cerevisiae pode ser um fator determinante na defi nição do aroma do vinho.

Para fi nalizar é importante realçar que, devido à complexidade dos dados gerados, os estudos na área da metabolômica devem ser sempre acompanhados da aplicação de méto-dos de análise multivariada não supervisionada ou supervisionada, tais como PCA (Análise de Componentes Principais), PLS (regressão por Mínimos Quadrados Parciais), PLS-DA (regres-são por Mínimos Quadrados Parciais – Análise Discriminante), entre outros. A aplicação desse tipo de análise tem como objetivo extrair as principais fontes de variabilidade e, consequen-temente, ajudar na caracterização do conjunto de dados. Por outro lado, ela pode ser usada para fi ns de classifi cação de amostras, defi nindo asso-ciações de amostra para grupos predefi nidos e permitindo a extração de informações relevan-tes/variabilidade que possam explicar os padrões observados (grupos). Os resultados obtidos devem ser objeto de validação, recorrendo, por exemplo, a métodos de validação cruzada de Monte Carlo (MMCV), que permitirão obter informação relevante sobre o poder preditivo dos modelos estatísticos e respectiva especifi ci-dade e sensibilidade.

5 Notas finais

Este artigo demonstra claramente o elevado potencial da combinação da microextração em fase sólida com a cromatografi a de gás na aná-lise de compostos voláteis e semivoláteis numa grande gama de matrizes. No entanto, não será demais realçar que a qualidade analítica dos resultados dependerá sempre do correto estabe-lecimento do método a aplicar em cada caso de estudo.

A microextração de fase sólida é uma téc-nica de extração e de pré-concentração muito versátil que pode ser aplicada diretamente a amostras sólidas, líquidas e gasosas. No entanto, a otimização das condições experimentais de SPME é crucial. Considerando-se que o modo de extração a partir da fase de vapor envolvente da amostra é o mais utilizado e que podem ocor-rer efeitos de competição nessa fase de vapor, é particularmente determinante a seleção da fase estacionária e do tempo de extração. Apesar dessa técnica ser muito utilizada, inclusive em contexto industrial, há ainda vários desafi os a considerar, nomeadamente o desenvolvimento de fases estacionárias e confi gurações com carac-terísticas muito específi cas, com vistas a dar res-posta a problemas concretos de laboratórios de investigação, indústrias e, ainda, da área clínica, concretamente para análises in vivo de biofl uidos ou tecidos.

Sob o ponto de vista instrumental é claro que a oferta de equipamentos é muito ampla, tendo todos eles espaço de atuação. Inclusive, há empresas que desenvolvem soluções instrumen-tais e soft ware à medida da solicitação do cliente. Os cromatógrafos do tipo 1D-GC continuam a ser os mais utilizados, sendo mais baratos e tendo menores custos com consumíveis, e têm capacidade de resposta para a maior parte dos problemas analíticos. Mas o estudo de amostras complexas ou a pesquisa de compostos vestigiais justifi cam perfeitamente a existência de croma-



trógrafos do tipo GC×GC. Apesar de todas as vantagens que esse tipo de equipamento apre-senta, as quais já foram anteriormente reporta-das, e embora estejam equipados com soft wares muito desenvolvidos, com algoritmos que facili-tam o processamento de dados, há ainda alguns desafi os nessa área. Ainda que o tempo de uma corrida cromatográfi ca seja menor num GC×GC comparativamente a um 1D-GC, devido à com-plexidade dos dados gerados, o tempo de proces-samento de dados é maior. Já existem diversos programas para alinhamento de dados, mas eles nem sempre respondem cabalmente a todos os casos em estudo. Esse é um aspecto crítico, prin-cipalmente para aplicações na área da metabo-lômica, devido à elevada dimensão da matriz de dados gerados por uma única análise cromato-gráfi ca. Há, ainda, grande espaço de progressão nessa área.

Agradecimentos

Os autores agradecem à União Europeia, QREN, FEDER, COMPETE, pelo fi nancia-mento da unidade de investigação de Química Orgânica, Produtos Naturais e Agroalimentares (QOPNA – Unidade de Investigação 62/94), no âmbito de projectos PEst-C/QUI/UI0062/2013 e FCOMP-01-0124-FEDER-037296. Agradece-se, ainda ao projecto PTDC/QUI-QUI/117803/2010.

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Aceito: 08/01/2014

PREPARO DE AMOSTRAS




ISSN 1984-4433

Desenvolvimento de um novo sistema de microextração em fase sólida com fibra resfriada

Helvécio C. Menezes, Zenilda L. Cardeal*Departamento de Química – ICEx, Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG,

Cep 31270-901, Belo Horizonte, MG, Brasile-mail: [email protected]

Resumo

Este artigo apresenta a descrição e aplicação de um sistema de resfriamento da fi bra de microextração em fase sólida. O sistema usa nitrogênio líquido transferido por tubulações de cobre para a parte externa da fi bra de SPME. O sistema é simples, barato e possibilita portabilidade. São descritas aplicações para análises ambientais e de alimentos.

Palavras-chaveCF-SPME; cromatografia a gás com detector de espectrometria de massas; compostos orgânicos voláteis.

Development of a new system of cold fiber solid phase microextraction

Abstract

Th is paper presents a description and application of a system of cold fi ber solid phase microextraction. Th e system uses liquid nitrogen transferred by copper tubes to the outside of the SPME fi ber. Th e system is simple, cheap and allows portability. Applications are described for environmental and food analysis.

KeywordsCF-SPME; gas chromatography mass spectrometry; Volatile Organic Compounds.

1 Introdução

Os compostos orgânicos voláteis (Volatile Organic Compounds – VOC) geralmente estão em concentrações muito baixas com valores típi-cos em nível de parte por bilhão, o que requer, muitas vezes, uma etapa de pré-concentração para sua determinação. As estratégias de amos-tragem e extração de VOC variam de acordo com

os objetivos do estudo, tipo de amostra, faixa de concentração, sensibilidade, exatidão, precisão, interferentes, portabilidade e custo.

Os VOC podem ser amostrados por sorção, membrana ou solvente. Extração em fase sólida (Solid Phase Extraction – SPE) é uma das princi-pais técnicas que utilizam o princípio de sorção.

Menezes HC, Cardeal ZL Microextração em fase sólida com fibra resfriada


Na extração em fase sólida, os VOC são retidos em tubos preenchidos com sorventes adequados. Carvão ativado, carbono grafi tizado, peneiras moleculares e polímeros porosos são materiais comumente utilizados para esse propósito[1]. Os sorventes podem ser sólidos (processo de adsorção) ou líquidos (processo de absorção). A seleção do sorvente apropriado depende princi-palmente das propriedades físico-químicas dos VOC de interesse e das características do próprio sorvente. Combinações de sorventes podem ser utilizadas para aumentar a efi ciência do processo e diminuir perdas de analitos. Perdas também ocorrem devido a reações com o ozônio e a umi-dade[2].

A extração dos VOC coletados no sorvente ocorre por dessorção térmica ou com solvente. A principal desvantagem do uso de fases sólidas adsorventes é a necessidade da posterior extra-ção do analito com a utilização de solventes, o que pode provocar uma diminuição da sensibili-dade analítica, além de aumentar o risco de con-taminação ambiental e ocupacional.

Na tentativa de contornar algumas defi ci-ências das técnicas de extração por sorventes, têm sido propostas várias alternativas como a extração por fl uídos supercríticos, extração líquido-líquido e extração por membranas[3]. Essas membranas geralmente são compostas por uma estrutura de silicone que retém os analitos de forma seletiva. A análise posterior é realizada por espectrometria de massas com introdução via membrana (Membrane Introduction Mass Spectrometry – MIMS). Com essa técnica é pos-sível monitorar VOC em tempo real devido à rapidez de resposta, além da grande capacidade de miniaturização pelo uso de analisadores de massas com dimensões submilimétricas[4]. Há também a possibilidade de se combinar várias membranas em um mesmo dispositivo multi-membrana ou combinar uma membrana com

um sorvente (Membrane Extraction with a Sorbent Interface – MESI)[5]. Essa técnica apre-senta grande capacidade de enriquecimento, ele-vado potencial de automação e diversas aplica-ções ambientais e ocupacionais[6].

Na pré-concentração com solventes, os VOC são absorvidos irreversivelmente em uma fase líquida através do processo de quimiosor-ção. Bulbos e tubos são preenchidos com o sol-vente e substâncias adequadas para reação com os VOC de interesse. Com essa técnica é possível amostrar grandes volumes de ar, compostos com altos pontos de ebulição e espécies reativas[7]. A principal limitação está no fato de que o solvente pode ser facilmente contaminado pelos VOC presentes no ambiente, além da grande produção de resíduos de solventes.

2 Microextração em fase sólida

O princípio da técnica de microextração em fase sólida (Solid Phase Microextraction – SPME) é o equilíbrio do analito entre a matriz e a fase polimérica que recobre a haste de sílica. Se a fase polimérica for líquida há absorção do ana-lito e se estabelece um equilíbrio de partição que é afetado pela espessura do fi lme polimérico e pelo tamanho do analito. Em fases poliméricas sólidas, a retenção do analito ocorre nos sítios ativos da fi bra e o equilíbrio de adsorção que ocorre depende, principalmente, do tamanho dos poros. Após a fase de extração, o analito é dessorvido termicamente no injetor do croma-tógrafo. Atualmente são comercializadas fi bras com espessuras de fases, polaridades e composi-ções variadas. A adsorção é um processo compe-titivo no qual espécies com baixa afi nidade pela fi bra podem ser substituídas por aquelas de alta afi nidade.

Microextração em fase sólida com fibra resfriada Menezes HC, Cardeal ZL


A extração por SPME pode ser feita pela imersão direta da fi bra na matriz ou por hea-dspace[8]. Na extração por imersão, o analito é transportado diretamente da matriz para a fi bra. A fi bra pode ser usada com proteção, isto é, ser recoberta por uma membrana que evita a sorção de outros compostos da matriz e torna a análise mais seletiva. Para matrizes aquosas deve-se pro-ceder a uma agitação para facilitar o processo de difusão do analito para a fi bra. Quando a matriz é muito complexa ou suja, usa-se uma mem-brana. Na técnica de headspace, a amostra sólida ou líquida é colocada em um frasco de vidro que é então lacrado. A fi bra é exposta no topo do frasco, sem contato direto com a amostra, assim os analitos voláteis entram em equilíbrio com a fi bra (Figura 1a). Alternativamente pode-se utili-zar o frasco de headspace para expor a fi bra dire-tamente na amostra líquida (Figura 1b).

Muitos compostos polares presentes em matrizes complexas são de difícil extração, nes-sas situações, a técnica da derivatização pode ser conjugada com a SPME para facilitar o processo[9].

Uma das maneiras mais simples de derivatização é a adição do agente derivatizante diretamente no frasco contendo a matriz. Após completar a reação, a fi bra de SPME é exposta para extração do analito derivatizado. Alternativamente, faz--se uma derivatização da fi bra de SPME com um reagente derivatizante adequado e logo em seguida expõe-se a fi bra derivatizada à matriz para que o analito possa ser extraído[10].

Várias modifi cações já foram introduzidas nessa técnica para melhorar o desempenho da extração. O uso de bombas tem sido proposto para aumentar a pressão e acelerar a extração em amostras sólidas. A passagem de um fl uxo con-tínuo de gás de arraste inerte no frasco de hea-dspace facilita a remoção de compostos menos voláteis. O aquecimento da água diminui sua constante dielétrica e facilita a remoção dos com-postos mais apolares da amostra. Aquecimento da água e resfriamento interno da fi bra aumenta o coefi ciente de distribuição e melhora a extra-ção de compostos voláteis.

Figura 1 Representação da extração por SPME no modo headspace (a) e por imersão direta (b).



3 Microextração em fase sólida com fibra resfriada

O resfriamento interno da fi bra de SPME tem sido feito com a utilização de gás carbônico líquido (Figura 2), que percorre internamente um tubo capilar revestido externamente com a fi bra[11]. Como a partição entre o analito e a fi bra é um processo exotérmico, o resfriamento favo-rece a recuperação dos analitos, principalmente dos mais voláteis. Entretanto, essa modifi cação apresenta limitações tais como baixa capacidade de resfriamento do gás carbônico, uso de bomba e comprometimento da portabilidade.

O modo headspace permite modifi cações na matriz sem danifi car a fi bra. Fatores como tem-peratura, agitação, tempo de exposição e força iônica exercem infl uência na efi ciência de extra-ção. Após extração, a fi bra é recolhida e levada diretamente ao injetor do cromatógrafo para

dessorção. Para armazenar a fi bra até o momento da análise, deve-se resfriá-la para minimizar per-das por volatilização.

Para a obtenção de um sistema mais sim-ples que permitisse portabilidade, desenvolve-mos um novo sistema para resfriamento das fi bras de SPME. A Figura 3 mostra o esquema do dispositivo construído para resfriamento da fi bra de SPME no modo imersão direta (Direct Imersion – Cold Fiber – Solid Phase Microextraction – DI-CF-SPME). Com um tubo de cobre de 70 cm e diâmetro interno de 1,6 mm foi feita uma espiral com comprimento de 3 cm para envolver a agulha do suporte manual de SPME em uma extremidade, sendo a outra inse-rida no frasco Dewar.

Uma rolha de borracha (diâmetro médio de 3,5 cm) foi utilizada para tampar o frasco Dewar contendo 500 mL de nitrogênio líquido. Com outro tubo de cobre (comprimento de 10 cm, diâmetro interno de 4,7 mm) foi feita a ligação com a válvula para controle da pressão do nitro-gênio no frasco Dewar.

Ao se fechar a válvula, o nitrogênio líquido evapora lentamente e passa pela espiral, em fl uxo constante, enquanto absorve energia térmica da agulha e, consequentemente, da fi bra. Com a vál-vula aberta, o nitrogênio evaporado sai preferen-cialmente pelo tubo de maior diâmetro interno, com isso encerra o resfriamento na espiral. Com 500 mL de nitrogênio líquido é possível uma autonomia de 3 h de resfriamento.

4 Aplicações do sistema DI-CF-SPME

O sistema DI-CF-SPME desenvolvido foi aplicado com sucesso em diferentes determi-nações. Para as determinações foi utilizado um cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas com analisador de massas do tipo ion

Figura 2 Representação da extração por SPME no modo headspace com fi bra resfriada internamente. Fonte: adaptado de Zhang e Pawliszyn[11].



trap (Finnigan Trace GC/PolarisQ – Th ermo). A análise cromatográfi ca foi feita no modo sem divisão de fl uxo (splitless), utilizando uma coluna HP-5MS Agilent (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm) e ionização por elétrons (EI) com energia de 70 eV.

4.1 Determinações de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos em material particulado atmosférico

Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) coletados no ar ambiente e em material particulado (MP) foram analisados por cro-matografi a a gás com detector de espectrome-tria de massas (GC/MS) usando-se o método DI-CF-SPME[12] com fi bra de PDMS (polidime-tilsiloxana) com 100 μm de espessura de fi lme. O método foi otimizado através de estudo com um planejamento fatorial completo 23 e plane-jamento Doehlert das duas variáveis mais signi-

fi cativas. A Figura 4 apresenta uma visão geral do método em condições otimizadas de extração com a fi bra resfriada.

Um estudo comparativo foi realizado com o novo dispositivo CF-DI-SPME para avaliar o efeito do resfriamento da fi bra na resposta instru-mental. Os resultados dos experimentos realiza-dos em triplicata com discos de fi ltro de quartzo fortifi cados com solução de HAP são apresen-tados na Figura 5. As áreas obtidas para todos os HAP foram maiores no modo CF-DI-SPME, se comparadas ao modo DI-SPME nas mesmas condições, mas sem refrigeração. O processo de sorção que ocorre entre os analitos e a fi bra é exotérmico, portanto a remoção do excesso de energia térmica com o dispositivo CF-DI-SPME favorece a transferência de massa para a fi bra, como demonstrado por Ghiasvand et al.[13].

Figura 3 Representação esquemática do dispositivo construído para extração DI-CF-SPME.



O método DI-CF-SPME GC/MS, validado e testado com poeira urbana NIST SRM1649b, demonstrou alta precisão (%CV < 17,3) e recu-peração (> 88%), baixo LOD (0,02 – 1,16 ng) e LOQ (0,05 – 3,86 ng) para quantifi cação de HAP em amostras de aerossóis atmosféricos coletadas em fi ltros de fi bra de quartzo com amostradores de alto volume.

4.2 Determinação de naftaleno no ar ambiente

O sistema CF-SPME foi utilizado como método de amostragem para análise ambiental de naft aleno[14]. Foi utilizado um sistema de gera-ção de padrões gasosos[15], mostrado na Figura 6, para a padronização do método. O ar ambiente, após compressão a 345 kPa, é conduzido para um purifi cador UHP-10ZA da marca Domnick Hunter, em seguida passa por um tubo de cobre (diâmetro = 0,3 cm) espiralado para preaqueci-

Figura 4 Representação da visão geral do método DI-CF-SPME para determinação de HAP em material particulado atmosférico

Figura 5 Áreas obtidas para extração em fi ltros de quartzo fortifi cados com os 16 HAP no modo DI-SPME e DI-CF-SPME: Naftaleno (1), Acenaftileno (2), Acenafteno (3), Fluoreno (4), Fenantreno (5), Antraceno (6), Fluoranteno (7), Pireno (8), Benzo[a]antraceno (9), Criseno (10), Benzo[b]fl uoranteno (11), Benzo[k]fl uoranteno (12), Benzo[a]pireno (13), Indeno[1,2,3-cd]pireno (14), Dibenzo[a,h]antraceno (15) e Benzo[ghi]perileno (16).



mento. Após a válvula de controle de diluição, o ar entra na câmara de permeação e passa por um tubo de 3,5 cm de material polimérico con-tendo naft aleno líquido, fabricado pela VICI Metronics, Inc., certifi cado com rastreabilidade até os padrões NIST, com taxa de permeação 19,8 ± 2,0 ng min-1 à 40,0 °C. O tubo foi subme-tido a um fl uxo constante com temperatura con-trolada por um termostato a 40,0 ± 0,1 °C. O sis-tema de controle de temperatura está conectado a uma resistência e a um pequeno ventilador

para distribuição uniforme do calor em todos os componentes inseridos no espaço delimitado pelo isolante térmico.

A mistura de ar com naft aleno é homoge-nizada em um tubo de vidro espiralado antes de alcançar o bulbo de amostragem, onde a fi bra de SPME é então exposta. O fl uxo é medido com digital Flowmeter Optifl ow 650, da Supelco. A pressão do sistema é mantida em 99 ± 1 kPa em todos os experimentos através da válvula de con-trole de fl uxo. As determinações foram feitas por GC/MS.

Para se avaliar a efi ciência da extração SPME com resfriamento (CF-SPME) em relação a sem resfriamento foram realizadas extrações, em tri-plicata, com duração de 15 minutos, no sistema de geração de padrões gasosos. As áreas obtidas para o naft aleno em três níveis de concentração (P1 = 14,30; P2 = 78,50; P3 = 120,90 μg m-3) estão representadas na Figura 7. Em todos esses níveis avaliados observou-se que a extração CF-SPME é mais efi ciente que aquela realizada sem resfria-mento da fi bra.

Figura 6 Sistema de padronização com câmara de permeação e amostragem por CF-SPME.

Figura 7 Análise de naftaleno por GC/MS em três níveis de concentração (P1 = 14,30; P2 = 78,50; P3 = 120,90 µg m-3) em extração (n = 3) no sistema de geração de padrões gasosos com fi bra SPME resfriada (CF-SPME) e sem resfriamento (SPME).



4.3 Análise da migração de ftalatos para simulantes de alimentos em recipientes plásticos aquecidos em micro-ondas

Este estudo teve por objetivo a determina-ção da migração de dibutilft alato (DBP) e ben-zilbutilft alato (BBP) presentes em embalagens para alimentos quando submetidos a diferentes condições de aquecimento em micro-ondas[16].

Para extração dos compostos foi utilizada fi bra de poliacrilato (PA) resfriada; 20,0 mL de amostra continuamente agitada com uma barra magnética colocada no interior do frasco; aque-cimento a 65 °C por 30 min e dessorção a 250 °C por 2 min. As condições ótimas de trabalho foram escolhidas através de estudo com um pla-nejamento fatorial completo 23 e planejamento Doehlert das duas variáveis mais signifi cativas.

A utilização da fi bra resfriada possibilitou maior rendimento de extração quando com-parada à utilização da fi bra sem resfriamento (Figura 8).

A metodologia desenvolvida para determi-nação do DBP e BBP foi validada de acordo com as diretrizes da EURACHEM[17]. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

Foi feita a avaliação da migração utilizando--se cinco recipientes novos e cinco recipientes com um longo tempo de uso. BBP não foi encon-trado nas amostras que foram analisadas. DBP foi encontrado na concentração de até 7,5 μ g L–1. A análise realizada mostrou que em recipientes com um tempo prolongado de utilização existe uma maior migração de ft alatos. Recipientes

com uma utilização prolongada possuem peque-nas deformações e são menos resistentes ao calor, permitindo que os ft alatos sejam mais facilmente liberados. Os valores de DBP estão em confor-midade com a legislação vigente para a migração desse composto.

5 Conclusão

A utilização de CF-SPME possibilitou a quantifi cação de compostos orgânicos voláteis em baixas concentrações em diferentes tipos amostras por causa de um aumento da efi ciência na etapa de extração. CF-SPME pode ser poten-cialmente aplicável para o estudo de vários tipos de compostos presentes ao nível de traços em matrizes ambientais, alimentos e fl uidos biológi-cos. O sistema de resfriamento da fi bra proposto neste estudo é simples, de baixo custo e permite portabilidade para amostragens de campo.

Tabela 1 Parâmetros de mérito da análise de ftalatos por CF-SPME-GC/MS.

Composto% CV – Intra-ensaio1,0 g L–1 5,0 g L–1

% CV – Inter-ensaio1,0 g L–1 5,0 g L–1

LD g L–1 LQ g L–1 Faixa linear g/L

R2

DBP 11,7 11,7 0,005 0,2 0,2 a 6,0 0,2 0,2 a 6,0 0,9905

BBP 16,2 16,2 0,3 0,5 0,5 a 6,0 0,5 0,5 a 6,0 0,9854

Figura 8 Estudo do rendimento de extração em função do resfriamento da fi bra de PA; 4-tert-butilfenol (4-t-BP), 4-octilfenol (OP), dibutilftalato (DBP), bisfenol A (BPA), benzilbutilftalato (BBP) e bis(etilhexil)ftlatao (BEHP).



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9 Stashenko EE, Martinez JR. Derivatization and solid-phase microextraction. TrAC Trends in Analytical Chemistry 2004; 23(8):553-561. http://dx.doi.org/10.1016/j.trac.2004.06.002

10 Pan L, Pawliszyn J. Derivatization/solid-phase microextraction: new approach to polar analytes. Analytical Chemistry 1997; 69(2):196-205. http://dx.doi.org/10.1021/ac9606362

11 Zhang ZY, Pawliszyn J. Quantitative extraction using an internally cooled solid phase microextraction device. Analytical Chemistry 1995; 67(1):34-43. http://dx.doi.org/10.1021/ac00097a007

12 Menezes HC, Cardeal ZL. Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons from ambient air particulate matter using a cold fi ber solid phase microextraction gas chromatography–mass spectrometry method. Journal of Chromatography A 2011; 1218(21):3300-3305. PMid:21093868. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2010.10.105

13 Ghiasvand AR, Hosseinzadeh S, Pawliszyn J. New cold-fi ber headspace solid-phase microextraction device for quantitative extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediment. Journal of Chromatography A 2006; 1124(1-2):35-42. PMid:16714028. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2006.04.088

14 Menezes HC, Paulo BP, Costa NT, Cardeal ZL. New method to determination of naphthalene in ambient air using cold fi ber-solid phase microextraction and gas chromatography–mass spectrometry. Microchemical Journal 2013; 109:93-97. http://dx.doi.org/10.1016/j.microc.2012.03.031

15 Amorim LCA, Carneiro JP, Cardeal ZL. An optimized method for determination of benzene in exhaled air by gas chromatography–mass spectrometry using solid phase microextraction as a sampling technique. Journal of Chromatography B 2008; 865(1-2):141-146. PMid:18346945. http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2008.02.023

16 Moreira MA, Amorim LCA, Cardeal ZL. Analysis of migration to the dibutylphthalate for food simulants in plastic containers using fi ber cooled and gas chromatography mass spectrometry. In: 36th International Symposium on Capillary Chromatography; 2012; Riva del Garda.

17 Cooperation on International Traceability in Analytical Chemistry - CITAC, Eurachem. Guide to Quality in Analytical Chemistry: An Aid to Accreditation. CITAC, Eurachem; 2002 [cited 2013 June 20]. Available from: http://www.eurachem.org/images/stories/Guides/pdf/CITAC_EURACHEM_GUIDE.pdf.


Aceito: 22/04/2014

DIVULGAÇÃO



ISSN 1984-4433

VI Simpósio Brasileiro de Cromatografia e Técnicas Afins

*****SIMCRO 2014*****

VI Simpósio Brasileiro de Cromatografia e Técnicas Afim SIMCRO 2014


ORGANIZAÇÃO

Comitê Científi co

Fernando M. Lanças (coordenador) USP-IQSC

Luigi Mondello University of Messina, Italy

Maria E. Queiroz USP-FFCLRP

Elena Stashenko University of Santander, Colômbia

Comitê Organizador

Adélia Araujo ITEP - PE

Álvaro dos Santos Neto IQSC - USP

Carol Collins IQ - UNICAMP

Cláudia Zini IQ - UFRGS

Eduardo Carasek DQ - UFSC

Elina Bastos Caramão IQ - UFRGS

Fábio Augusto IQ - UNICAMP

Fátima Dutra CENPES - PETROBRÁS

Fernando M. Lanças IQSC - USP

Isabel C.S.F. Jardim IQ - UNICAMP

Marcos Eberlin IQ - UNICAMP

Maria Eugenia Queiroz FFCLRP - USP

Quézia Cass DQ - UFSCAR

Renato Zanella DQ - UFSM

SIMCRO 2014 VI Simpósio Brasileiro de Cromatografia e Técnicas Afim


APRESENTAÇÃO

Bem vindos a Campos do Jordão e ao 6º. Simpósio Brasileiro de Cromatografi a e Técnicas Afi ns (SIMCRO 2014) e ao III Workshop de Residuos e Contaminantes

em Alimentos e Fluidos Biológicos (ReCAFluB)!

A excelente acolhida a nosso convite para o evento demonstra, claramente, a importância das téc-nicas de separação para a sociedade brasileira. Campos de Jordão possui a atmosfera apropriada para servir como um fórum para a discussão das recentes inovações nas áreas de cromatografi a e técnicas relacionadas.

Antecedendo a abertura do evento, no dia 3 de setembro, serão oferecidos 4 cursos em paralelo. Os cursos contarão com a participação de uma equipe de instrutores altamente qualifi cados, dentre os quais especialistas de outros países.

O programa científi co incluirá mais de 80 apresentações orais na forma de Conferências Plenárias, Tutoriais, Simpósios Satélite e Workshops, discutindo o estado-da-arte das principais técnicas de separação e suas aplicações em diferentes áreas. Os Tutoriais, uma inovação do SIMCRO 2014, serão apresentados por lideres na área abordando os mais recentes avanços nas técnicas cromatográfi cos e relacionadas. Uma movimentada Sessão de Pôsteres (cerca de 400 trabalhos são esperados) será a grande responsável pela discussão da maioria dos avanços científi cos na área, e suas aplicações em múltiplos problemas relevantes para a sociedade atual. Com uma importante contribuição das empre-sas de instrumentação, acessórios, insumos, soft ware e literatura na área, os recentes avanços tec-nológicos serão apresentados em uma ampla Exposição e, por elas e seus convidados, na forma de Seminários Técnicos (24 seminários programados) cobrindo uma ampla gama de assuntos.

Adicionalmente, e continuando uma tradição de eventos anteriores, a programação social permi-tirá uma maior aproximação entre os congressistas de forma a ampliar as discussões em um ambiente mais descontraído.

Desejamos a todos os participantes um evento com ótimo retorno técnico, assim como uma semana agradável e inesquecível em Campos do Jordão.

Comissão OrganizadoraSIMCRO 2014 e III ReCAFlub



PATROCINADORESO generoso patrocínio de várias empresas e entidades de fomento permitiram o equilíbrio fi nan-

ceiro do evento. Sem eles, certamente seria inviável a realização do mesmo. Agradecemos a colabora-ção das seguintes entidades Patrocinadoras (até a data do fechamento do artigo) do SIMCRO 2014:

Master

Th ermo Scientifi c

Ouro

Nova AnalíticaSINC do Brasil

Prata

AB SciexAgilentAllcromBio RadCromatecJasco BrasilPerkinElmerPermutionSigma-AldrichWaters Brasil

APOIO:

AIC CNPq CAPES FAPESP USP



INFORMAÇÕES GERAIS:

LOCAL DE REALIZAÇÃO DO SIMCRO 2014:

Campos do Jordão Convention Center

Av. Macedo Soares, 499 - Capivari

CEP: 12.460-000 - Campos do Jordão - SP

Fone: (12) 366-5144/3663-5143

DATAS IMPORTANTES:

31. abril Inscrição com desconto máximo

04. agosto Fim das inscrições on-line (website)

20.agosto Fim da aceitação de resumos

03.setembro Cursos pré-congresso

04.setembro Inicia o SIMCRO 2014

EVENTOS PARALELOS:• Cursos Pré-Congresso (03 de setembro/2014)• III Workshop de Residuos e Contaminantes em Alimentos e Fluidos Biológicos (ReCAFluB); • IV Workshop Em Avanços Recentes no Preparo de Amostras (WAPA)

Os workshops não requerem inscrição adicional; todos os inscritos no SIMCRO poderão partici-par dos mesmos. Os cursos pré-congresso requerem inscrição e podem ser atendidos sem a necessi-dade de participação no Simpósio.

CONTACTO:

[email protected]

www.simcro.com.br

HOTÉIS:

Para uma lista completa de hotéis e pousadas fornecida à organização do SIMCRO utilize o link http://simcro.com.br/hospedagem.php .

São diversos tipos de hospedagem com variação de preço, distância do evento e tipo de acomodação.



PROGRAMAÇÃO RESUMIDA:

***** Short-courses*****

Antecedendo o SIMCRO 2014 no dia 03 de setembro (quarta-feira) serão oferecidos quatro cur-sos de curta duração (“short-courses”) por especialistas nacionais e internacionais nos assuntos dos cursos. Não é necessário participar do SIMCRO 2014 para registrar em um curso (as inscrições são independentes). Os seguintes cursos estão programados:

***** Conferências Plenárias*****

Serão apresentadas várias Conferências Plenárias por especialistas internacionais em suas áreas de atuação. Vários temas serão abordados, incluindo Cromatografi a Líquida Capilar acoplada a Espectrometria de Massas em Tandem (u-LC-MS/MS), Micro técnicas de preparo de amostras, Cromatografi a Gasosa Multidimensional (GCxGC), dentre muitas outras.

***** Simpósios Satélite*****

Dando continuidade aos Simpósios que tanto sucesso alcançaram nas edições anteriores, estão programadas tentativamente 9 Simpósios sobre os seguintes temas:

Estima-se que mais de 40 seminários serão apresentados nos diferentes temas abordados nos Simpósios Satélite.

Não é necessário inscrição adicional para esta atividade.

***** Tutoriais*****

Mais uma vez inovando, o SIMCRO introduzirá em 2014 uma série de Tutoriais abordando temas como U-HPLC; LC-MS/MS, micro e nano-LC; GC-MS/MS; GCxGC; LC multidimensional e outros assuntos e técnicas relevantes.

Não é necessário inscrição adicional para esta atividade.

***** Pôsteres (Painéis) *****

Uma das atividades mais importantes e concorridas do SIMCRO é a Sessão de Pôsteres (Painéis). Consiste na apresentação de trabalhos, na forma de Pôsteres, cujo resumo foi previamente enviado para análise e aprovação da Comissão Científi ca. Os painéis fi cam expostos a partir das 10:00 horas e durante todo o dia de sua apresentação (um dia apenas). Os interessados tem o dia todo para consultar



os painéis e, no fi nal daquele dia, comparecerem à sessão para discutir com os autores dos mesmos. No horário da discussão dos Pôsteres (17:00 as 18:00 do dia da apresentação do Pôster) pelo menos um dos autores deverá fi car em frente a seu Pôster para discutir os resultados com os interessados.

Importante: A data máxima para envio dos resumos é 20 de agosto de 2014.

***** Exposição *****

Em conjunto com o SIMCRO 2014 haverá uma ampla Exposição de equipamentos, acessórios, literatura e consumíveis para a área de cromatografi a e técnicas relacionadas. Trata-se de uma opor-tunidade única para os participantes do evento entrarem em contato com as principais empresas da área e seus representantes, conhecendo as novidades da área e resolvendo suas dúvidas a respeito dos diferentes materiais em exposição.

***** Coffee-break *****

Nos horários relacionados na programação do evento, haverá uma parada para café o qual será servido na área da Exposição (Grande Salão), sendo uma ótima oportunidade para visita a Exposição.

***** Seminários Técnicos *****

Também uma atividade bastante concorrida no SIMCRO os Seminários Técnicos são organi-zados pelas empresas da área que patrocinam o evento. É uma atividade gratuita, e que não requer inscrição prévia.

***** Atividades Sociais *****

As atividades científi cas do SIMCRO são sempre complementadas com atividades sociais as quais permitem a continuação dos contatos recém formados em um ambiente mais descontraído. A progra-mação social do SIMCRO 2014 será informada em breve.

***** Certificados*****

Todos os participantes inscritos no evento e/ou nos cursos receberão um certifi cado de participa-ção. Os participantes que apresentarem trabalhos receberão também certifi cado de apresentação dos mesmos.



***** Premiações *****

Haverá premiações para os melhores Pôsteres (Painéis), selecionados por uma Comissão de Avaliação indicada pela Comissão Científi ca do SIMCRO 2014. Os prêmios serão entregues na Sessão de Encerramento do evento, sendo necessária a presença de pelo menos um dos autores dos pôsteres premiados (caso isto não ocorra um próximo pôster será indicado pela Comissão de Avaliação para recebimento do premio).

Será também entregue a Medalha CIOLA, criada em 2010 com o objetivo de manter presente a memória de um dos precursores da cromatografi a instrumental no Brasil, Professor Dr. Remolo Ciola. Objetiva também reconhecer e homenagear a contribuição relevante de um “pesquisador sênior” para o desenvolvimento da área em nosso país, ou um “jovem pesquisador” (menos de 35 anos de idade na data da indicação) de expressiva e comprovada criatividade e produtividade na área. O júri será formado por pesquisadores indicados pelo Comitê Científi co do SIMCRO, sendo a medalha entregue durante o evento.

A Medalha CIOLA é patrocinada, desde sua criação, pela empresa Nova Analítica.

***** Publicação dos trabalhos *****

Os trabalhos apresentados no SIMCRO 2014 poderão ser publicados no periódico Scientia Chromatographica, após a avaliação padrão pelos assessores. Os autores dos resumos aceitos para apresentação na Sessão de Pôsteres receberão mais informações a respeito da publicação do trabalho completo no Scientia.

318 Scientia Chromatographica 2013; 5(4)

BOOKSTORE

O Bookstore divulgará o material de informação e formação produzido pelo IIC, incluindo Livros, fi l-mes, slides, material didático de cursos e outras formas de divulgação dos materiais por ele produzido. Esses

materiais podem ser adquiridos do IIC através do website www.iicweb.org/biblioteca.php

Cromatografi a Líquida Moderna - Fernando M. Lanças

Livro publicado pela Editora Átomo em maio de 2009, aborda de forma simples e didática os principais assuntos relacionados à Cromatografi a Líquida Moderna (HPLC ou CLAE), desde a Teoria, Instrumentação, Colunas, Detectores, até aspectos da Validação, Preparo da Amostra e Análise Quantitativa.

O IIC recomenda este livro para todos os interessados em iniciar-se ou atualizar-se nesta técnica.

Cromatografi a em Fase Gasosa - Fernando M. Lanças

Livro de autoria do Prof. Lanças, abordando todos os princípios básicos: instrumentação, análise qualitativa e quantitativa, detectores e muitos outros aspectos da Cromatografi a Gasosa.

Altamente recomendado para os iniciantes na técnica, os quais encontrarão explicações detalhadas e simples a respeito da maior parte dos fundamentos básicos da técnica.

Validação de Métodos Cromatográfi cos - Fernando M. Lanças

Livro de autoria do Prof. Lanças, descreve os princípios da validação de métodos cromatográfi cos com detalhes. Enfoque também a validação de instrumentação e a adequação dos sistemas (“system suitability”) frente aos requisitos dos órgãos regulamentadores de resultados analíticos. O livro é acompanhado de um software, denominado Validate – versão demonstração – desenvolvido em colaboração com o Dr. Vitor Hugo P. Pacces, o qual auxilia no processo de validação.

Extração em Fase Sólida - Fernando M. Lanças

De autoria do Prof. Lanças, este livro apresenta e discute as várias formas de extração em fase sólida (SPE), desde a mais clássica empregando cartuchos até as mais atuais como discos, placas, ponteiras, e outras. Também discute os princípios da micro extração em fase sólida (SPME) e da extração por sorção em barras de agitação (SBSE).

INFORMAÇÃO PARA AUTORES


Normas para publicação de artigos no Scientia Chromatographica (as normas mais detalha-

das podem ser obtidas no website do periódico http://www.scientiachromatographica.com).

Escopo

Scientia Chromatographica publica trabalhos em todas as áreas da Cromatografi a, incluindo

GC (colunas capilares, empacotadas, preparativas), LC (convencional, HPLC, U-HPLC, Prep-LC,

micro-LC, nano-LC, TLC, PC), SFC (colunas empacotadas ou capilares), Técnicas Acopladas

(GC-MS, LC-MS, SFC-MS, LC-GC, SFE-CE, GCxGC, LCxLC) e Técnicas de Preparo de Amostras (SPME, SBSE, MEPS, QuEChERS, LLE, MAE,SPE, LLE, etc.). A partir de 2012 o Scientia

publica os seguintes formatos de artigos:

• Artigos Originais de Pesquisa

• Comunicação (“Short Communication”)

• Artigos de Revisão Crítica

Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos

co-editores mais relacionados ao assunto em questão. Devem conter uma contribuição nova a

respeito de um assunto de grande interesse atual, incluindo uma discussão a respeito das van-

tagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na

literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

Os artigos Originiais de Pesquisa deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que

signifi quem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela concei-

tual, na instrumentação, ou na aplicação.

Os artigos do tipo Comunicação deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais,

porém devido a seu caráter de comunicação preliminar usualmente são de menor extensão.

Envio do Artigo

Os artigos deverão ser encaminhados para [email protected]. Os

artigos do tipo Revisão deverão antes de seu envio pelo website ter o aval de um dos co-Editores do

periódico, caso contrário não serão avaliados. Todos os artigos, independentemente do formato,

deverão ser submetidos exclusivamente ao Scientia, com o entendimento de que eles não foram

anteriormente submetidos, não estão sendo e não serão posteriormente publicados em outro veí-

culo. Autores que utilizarem tabelas, ilustrações, fi guras, ou textos contendo mais de 25 palavras,

anteriormente publicados em outro periódico – sendo ou não autores do artigo – deverão obter

a devida permissão por escrito do portador dos direitos de cópia (“Copyright”). Esse documento

deverá permanecer de posse dos autores, sendo encaminhado ao Scientia, quando solicitado.

IdiomaOs artigos, com exeção dos de Revisão, podem ser escritos preferencialmente em inglês,

porém em Português e Espanhol também serão aceitos. Os autores cujo idioma nativo não for o

empregado na redação do artigo são orientados a solicitar a colaboração de colegas fl uentes no

idioma, antes de enviar o artigo para o periódico.

INFORMAÇÃO PARA AUTORES

320 Scientia Chromatographica 2013; 5(4)

Tipos de contribuições aceitas para publicação no Scientia

O Scientia Chromatographica considera para publicação quatro tipos de contribuição:

• Artigos Originais de pesquisa: descrevem resultados de estudos completos. Deverão conter resultados de laboratório e/ou teóricos, que signifi quem uma contribuição expressiva para a área de técnicas de separação, seja ela conceitual, na instrumentação, ou na aplicação. Este tipo de contribuição é limitado a 6.000 palavras, incluindo as legendas das fi guras e as refe-rências, e no máximo 5 tabelas e/ou fi guras somados. No momento do envio da prova de impressão, caso isto ocorra o autor será consultado se prefere revisar o artigo para enquadrá--lo em até 7 páginas, ou se prefere pagar as páginas excedentes. O número de páginas de um artigo depende muito das fi guras e tabelas do mesmo. Este critério não é aplicado aos artigos convidados, cujo número de páginas será informado ao autor no momento do convite.

• Comunicações (“Short Communication”): são artigos completos, porém que relatam resultados mais curtos, oportunos, e/ou cuja relevância requer sua rápida publicação. Deverão ter a mesma qualidade dos artigos Originais porém, devido a seu caráter de comunicação preliminar, usualmente são de menor extensão. Este tipo de publicação deve ter no máximo quatro páginas impressas, incluindo todo o artigo, ou seja, tabelas, fi guras e referências. O autor deve indicar claramente que se trata de uma comunicação no topo da primeira página do artigo.

• Artigos de Revisão crítica: revisões críticas sobre uma area específi ca das técnicas cromatográ-fi cas e relacionadas são também consideradas para publicação. Esses artigos devem se limitar a no máximo 10.000 palavras, incluindo as legendas, e até 10 tabelas e fi guras somadas. Os artigos de Revisão Crítica deverão antes de sua submissão serem discutidos com um dos co-Editores mais relacionados ao assunto em questão. Artigos não encaminhados desta forma serão antes enviados a um co-Editor da área em que se enquadre para parecer e, somente então, serão enviados aos revisores, podendo atrasar signifi cativamente sua publicação. Devem conter uma contribuição nova a respeito de um assunto de grande interesse atual, discutindo as vantagens e desvantagens do mesmo. O Scientia não publica apenas relato de artigos descritos na literatura, sem uma discussão crítica sobre os mesmos.

• Artigos de Alta Prioridade: são publicados no primeiro número disponível do periódico, rece-bendo prioridade máxima de todo o sistema Editorial do periódico. Para justifi car sua publicação como alta prioridade, os manuscritos deverão apresentar, de forma resumida, resultados importantes de recentes desenvolvimentos na área de cromatografi a e técnicas relacionadas (espectrometria de massas, preparo de amostras, eletroforese capilar e outros). Não precisam conter resultados experimentais detalhados, sendo limitados a 2.500 palavras e três fi guras e/ou tabelas combinadas.

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