C ––– iii aa a ,,, aaa o t AAA eee · 142 A maioria dos métodos analíticos requer que as...

CCCAAAPPPÍÍÍTTTUUULLLOOO VVV ––– AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo dddaaa cccooonnntttaaammmiiinnnaaaçççãããooo cccooommm aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaasss,,,

ooocccrrraaatttoooxxxiiinnnaaa AAA eee ccciiitttrrriiinnniiinnnaaa eeemmm dddrrrooogggaaasss vvveeegggeeetttaaaiiisss

555...111 ––– IIINNNTTTRRROOODDDUUUÇÇÇÃÃÃOOO

O desenvolvimento de métodos analíticos exatos, precisos e reprodutíveis

para determinar a extensão da contaminação natural de micotoxinas, em geral na

ordem de partes por bilhão, tornou-se um desafio (LIN et al, 1998; PITT, 1996;

SHEPHARD, 2000; STROKA e ANKLAM, 2002; STROKA et al, 2000) e a necessidade

de métodos mais sensíveis, específicos, rápidos e de fácil execução promoveu um

avanço das técnicas instrumentais e de separação (PITT, 1996; SHEPHARD, 2000;

SMEDSGAARD, 1997; STROKA e ANKLAM, 2002; STROKA et al, 2000).

Apesar dos avanços tecnológicos, a análise de micotoxinas apresenta vários

fatores que influenciam os resultados obtidos, tais como a distribuição não uniforme

da contaminação, freqüentemente em baixas concentrações, torna de extrema

importância os planos de amostragem aplicados, além de influências relacionadas

com a natureza da amostra e a presença de substâncias interferentes, como

pigmentos e lipídios (PITT, 1996; SHEPHARD, 2000; TRUCKSESS, 2000; VENTURA et

al, 2004).

Os métodos para análise de micotoxinas envolvem três procedimentos

básicos: extração, purificação/separação e detecção (TRUCKSESS, 2000).

142

A maioria dos métodos analíticos requer que as micotoxinas sejam extraídas

para uma fase líquida composta por solventes orgânicos – como clorofórmio,

metanol, acetronitrila, acetona, diclormetano – ou misturas destes solventes e água

(SHEPHARD, 2000; STROKA et al, 2000; TRUCKSESS, 2000).

As técnicas utilizadas na homogeneização da amostra com o líquido extrator

podem influenciar a eficiência do procedimento de extração. Devem permitir contato

suficiente entre as duas fases e normalmente são empregados homogeneizadores e

shakers ou misturadores (RESNIK et al, 1995).

Técnicas de filtração e de centrifugação são utilizadas para separar as fases

líquida e sólida. Após a extração da matriz sólida, o extrato é purificado para

remover impurezas e isolar as toxinas antes dos procedimentos de detecção e

quantificação, sendo etapa necessária para alguns, mas não a todos os métodos

analíticos. A purificação do extrato, em geral, utiliza colunas de extração em fase

sólida, com afinidade por micotoxinas ou pelas impurezas (RESNIK et al, 1995;

TRUCKSESS, 2000; VENTURA et al, 2004).

A etapa final do protocolo analítico envolve a determinação qualitativa e

quantitativa da micotoxina. Muitos métodos analíticos têm sido desenvolvidos para a

determinação de micotoxinas, geralmente envolvendo técnicas cromatográficas. A

maioria dos métodos emprega a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), que

exige alto investimento inicial e técnicos capacitados a operar e manter tais

equipamentos. Outras técnicas analíticas envolvem a cromatografia em camada

delgada (CCD), a cromatografia gasosa (CG) e imunoensaios (GILBERT e ANKLAM,

2002; LIN et al, 1998; REIF E METZGER, 1995; RODRIGUEZ-AMAYA e SABINO,

143

2002; STROKA e ANKLAM, 2002; STROKA et al, 2000; TRUCKSESS, 2000; VENTURA

et al, 2004, 2005; YANG et al, 2005).

A cromatografia em camada delgada é uma técnica robusta e simples, mais

econômica que cromatografia líquida de alta eficiência e bastante utilizada na análise

de micotoxinas, permitindo a avaliação qualitativa e quantitativa em uma variedade

de matrizes (GILBERT e ANKLAM, 2002; LIN et al, 1998; RODRIGUEZ-AMAYA e

SABINO, 2002; SOARES e RODRIGUEZ-AMAYA, 1989; STROKA e ANKLAM, 2002;

STROKA et al, 2000; TRUCKSESS, 2000; YANG et al, 2005). No entanto, entre as

desvantagens deste método analítico podem ser citados o baixo poder de separação

e de discriminação de possíveis co-interferentes (GILBERT e ANKLAM, 2002; YANG et

al, 2005).

Os imunoensaios, como os ELISAs (Enzyme-linked immunosorbent assay),

encontram aplicação na detecção de micotoxinas, sendo disponíveis kits para

detecção de aflatoxinas, ocratoxinas, fumonisinas, zearalenonas e desoxinivalenol

(DON) (OLIVEIRA et al, 2000; STROKA et al, 2002; TRUCKSESS, 2000; YONG e

COUSIN, 2001). Em geral, a toxina presente na amostra compete com um marcador

por um número limitado de anticorpos; quanto maior a quantidade de toxina na

amostra, menor a ligação do marcador e menor é o sinal gerado pelo ensaio, sendo

nestes casos, a presença da micotoxina medida pela ausência de resposta (LIN et al,

1998; OLIVEIRA et al, 2000; TRUCKSESS, 2000). Substâncias presentes na matriz

podem se constituir em fatores de interferência estrutural com o anticorpo,

impedindo a conjugação ou absorvendo anticorpos e conjugados, ou de

desnaturação dos anticorpos, podendo acarretar falsos resultados (LIN et al, 1998;

YANG et al, 2005).

144

Apesar dos avanços obtidos no desenvolvimento de técnicas para avaliação

qualitativa e quantitativa de micotoxinas em matrizes alimentares, apenas em 2002,

houve a publicação de um método oficial para a pesquisa de aflatoxinas em produtos

naturais na 25a edição da Farmacopéia Americana (2002), que utiliza a técnica de

cromatografia em camada delgada para a avaliação de aflatoxinas extraídas destes

materiais.

145

555...222 ––– PPPAAARRRTTTEEE AAA::: AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo d ddeee dddeeessseeemmmpppeeennnhhhooo dddooo mmmééétttooodddooo fffaaarrrmmmaaacccooopppêêêiiicccooo pppaaarrraaa

dddeeettteeecccçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaasss eeemmm dddrrrooogggaaasss vvveeegggeeetttaaaiiisss

É fundamental demonstrar que os métodos de ensaios executados permitem

conduzir a resultados confiáveis e adequados, além da capacidade em operar de

maneira adequada os métodos normalizados (ABNT, 2001; ANVISA, 2004; GILBERT

e ANKLAM, 2002; US Pharmacopeia, 2005).

A avaliação do desempenho do método oficial para detecção de aflatoxinas

em amostras de drogas vegetais (USP, 2005) foi realizada por comparação com

método desenvolvido por Soares e Rodriguez-Amaya (1989) para detecção destas

micotoxinas em alimentos, avaliando-se a recuperação de aflatoxina B1 adicionada à

amostra e considerando como valores aceitáveis, a recuperação entre 70% e 110%

(GILBERT e ANKLAM, 2002; PEARSON et al, 1999).

555...222...111 ––– MMMAAATTTEEERRRIIIAAAIIISSS EEE MMMÉÉÉTTTOOODDDOOOSSS

555...222...111...111 ––– AAAmmmooossstttrrraaa

Neste estudo, foi utilizada a droga vegetal alcachofra, pulverizada em moinho.

146

555...222...111...222 ––– MMMaaattteeerrriiiaaaiiisss

Padrão de aflatoxina B1 PPaaddrrããoo ddee aaffllaattooxxiinnaa BB11

Solução padrão-estoque de Aflatoxina B1, Sigma.

Concentração: 1,28 μg/mL, confirmada por método

espectrofotométrico (SCOTT, 1995).

Reagentes RReeaaggeenntteess

EEExxxtttrrraaaçççãããooo ––– UUUSSSPPP,,, 222000000555

Água deionizada

Diclorometano PA, Merck

Metanol PA, Merck

Reagente acetato de zinco – cloreto de alumínio

Composição: Acetato de zinco (200 g/L) e Cloreto de alumínio (50 g/L)

Solução de cloreto de sódio a 10%

Hexano PA, Merck

EEExxxtttrrraaaçççãããooo ––– SSSoooaaarrreeesss eee RRRooodddrrriiiggguuueeezzz---AAAmmmaaayyyaaa,,, 111999888999

Água deionizada

Clorofórmio PA, Merck

Metanol PA, Merck

Solução de cloreto de potássio a 4%

Solução de sulfato de cobre a 30%

147

DDDeeettteeecccçççãããooo

Acetato de etila PA, Merck

Ácido fórmico PA, Merck


Tolueno PA, Merck

CCCooonnnfff iiirrrmmmaaaçççãããooo

Acetona PA, Merck




Tolueno PA, Merck

Insumos IInnssuummooss

Cromatoplaca de vidro para HPTLC, Merck

(10 x 20) cm, coberta com camada de 0,25 mm de espessura de

silicagel G60 sem indicador de fluorescência

Espátulas

Frascos de vidro, boca larga

Microsseringas, de 1 µL e de 10 µL, Hamilton

Papel de filtro, Whatman

Ponteiras descartáveis, com capacidade para 1000 µL

Terra diatomácea, Merck

148

Tubos de ensaio, 25 x 150 mm, bequeres, funis de separação, funis de

vidro

Equipamentos EEqquuiippaammeennttooss

Agitador mecânico tipo Shaker, Innova 4230, New Brunswick Scientific

Balança semi-analítica, Micronal

Banho-maria a 80ºC, alocado em capela de segurança química

Câmara para visualização com lâmpada UV (365 nm), Camag

Cuba cromatográfica, Camag

Freezer, Brastemp

Pipetador monocanal, volume variável, 100 a1000 µL, Boeco

555...222...111...333 ––– MMMééétttooodddooosss

555...222...111...333...111 ––– AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo dddaaa cccooonnntttaaammmiiinnnaaaçççãããooo nnnaaatttuuurrraaalll cccooommm aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111

Para verificar se a droga vegetal alcachofra, utilizada neste estudo,

apresentava contaminação natural com aflatoxina B1, foram pesadas duas alíquotas

de 50 g de amostra pulverizada de alcachofra, em frasco de vidro com boca larga.

Em seguida, cada alíquota foi submetida às técnicas de extração, conforme descrito

em compêndio farmacopêico (USP, 2005) e por Soares e Rodriguez-Amaya (1989).

149

555...222...111...333...222 ––– AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo dddeee dddeeessseeemmmpppeeennnhhhooo dddooosss mmmééétttooodddooosss aaannnaaalllííítttiiicccooosss eeemmmppprrreeegggaaadddooosss

nnnaaa eeexxxtttrrraaaçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm dddrrrooogggaaa vvveeegggeeetttaaalll

AAA))) PPPrrreeepppaaarrraaaçççãããooo dddaaasss aaammmooossstttrrraaasss aaarrrtttiiifffiiiccciiiaaalllmmmeeennnttteee cccooonnntttaaammmiiinnnaaadddaaasss

Alíquotas de 50 g de amostra pulverizada de alcachofra foram pesadas, em

frasco de vidro com boca larga.

Em seguida, duas a duas, foram contaminadas pela adição de solução padrão

de aflatoxina B1 em quantidade suficiente para obter concentração final de 0,5 μg/kg

de amostra, 1,0 μg/kg de amostra, 2,0 μg/kg de amostra e 5,0 μg/kg de amostra.

Após a evaporação do solvente da solução padrão, cada par de amostras foi

submetida às técnicas de extração conforme descritas pela Farmacopéia Americana

(USP, 2005) e por Soares e Rodriguez-Amaya (1989).

BBB))) EEExxxtttrrraaaçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm dddrrrooogggaaa vvveeegggeeetttaaalll cccooonnnfffooorrrmmmeee UUUSSSPPP,,, 222000000555

Sobre alíquota de 50 g da amostra pulverizada, foram adicionados 170 mL de

metanol e 30 mL de água deionizada, sendo a mistura mantida sob agitação em

agitador horizontal do tipo shaker, por 40 minutos, e em seguida filtrada.

Aos 100 mL do filtrado, coletados a partir do início da filtração, foram

adicionados 20 mL de reagente acetato de zinco-cloreto de alumínio e 80 mL de

água deionizada, que foram submetidos à agitação e mantidos em repouso por 5

150

minutos. Em seguida, foram misturados 5 g de terra diatomácea e realizada nova

filtração, sendo que os primeiros 50 mL do filtrado foram descartados.

80 mL do filtrado foram transferidos a funil de separação e adicionados 40 mL

de solução de cloreto de sódio a 10% e 25 mL de hexano. Após um minuto de

agitação e a separação das fases, a fase aquosa foi transferida para outro funil de

separação.

Sobre a fase aquosa foram adicionados 25 mL de diclorometano, e após um

minuto de agitação e a separação das fases, a fase orgânica foi coletada em frasco

de vidro, de boca larga. O procedimento foi repetido, sendo a segunda fase orgânica

recolhida no mesmo frasco anteriormente utilizado. Após a execução das duas

extrações, foi realizada a evaporação do solvente, em banho-maria a 80ºC e o

resíduo foi congelado até o momento do uso.

CCC))) EEExxxtttrrraaaçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm dddrrrooogggaaa vvveeegggeeetttaaalll cccooonnnfffooorrrmmmeee SSSoooaaarrreeesss eee

RRRooodddrrriiiggguuueeezzz---AAAmmmaaayyyaaa,,, 111999888999

Sobre alíquota de 50 g da amostra pulverizada de alcachofra, foram

adicionados 270 mL de metanol e 30 mL de solução aquosa de cloreto de potássio a

4%, sendo a mistura mantida sob agitação, em agitador horizontal do tipo shaker

por 40 minutos, e em seguida filtrada.


adicionados 150 mL de solução de CuSO4 a 30%, que foram submetidos à agitação e

151

mantidos em repouso por 5 minutos. Em seguida, foram misturados 50 g de terra

diatomácea e realizada nova filtração.

150 mL do filtrado foram transferidos a funil de separação e adicionados 150

mL de água deionizada e 20 mL de clorofórmio. Após um minuto de agitação e a

separação das fases, a fase orgânica foi coletada em frasco de vidro, de boca larga.

O procedimento foi repetido, sendo a segunda fase orgânica recolhida no mesmo

frasco anteriormente utilizado. Após a execução das duas extrações, foi realizada a

evaporação do solvente, em banho-maria a 80ºC e o resíduo foi congelado até o

momento do uso.

A Figura 5.1 apresenta esquema dos procedimentos de extração utilizados.

152

Soares e

USP, 2005 Rodriguez-Amaya, 1989

Droga vegetal 50 gramas

FIGURA 5.1 – Esquema dos procedimentos para extração utilizados na detecção de

aflatoxinas em drogas vegetais

Metanol: 170 mL Água deionizada: 30 mL

Metanol: 270 mL Cloreto de potássio 4%: 30 mL

Shaker: 40 min Filtração

Filtrado

Filtrado 80 mL

Cloreto de sódio 10%: 40 mL Hexano: 25 mL

Extrato aquoso

Diclorometano: 25 mL (2x)

Extrato orgânico

Resíduo

Extração

Evaporação (banho-maria a 80ºC)

Resíduo

Extrato orgânico

100 mLFiltrado 150 mL

Reagente acetato de zinco-cloreto de alumínio: 20 mL Água deionizada: 80 mL

Solução de sulfato de cobre 30%: 150 mL

Filtrado 150 mL

Água deionizada: 150 mL Clorofórmio: 20 mL (2x)

153

DDD))) DDDeeettteeecccçççãããooo

As micotoxinas foram quantitativamente detectadas por cromatografia em

camada delgada.

Foram marcados spots na cromatoplaca, localizados a 2,0 cm da base inferior

da placa e com distância mínima de 1,0 cm entre eles.

O resíduo obtido foi ressuspendido em 100 μL de clorofórmio e alíquota de 10

μL do extrato foi aplicada, com auxílio de microsseringa. Em seguida, foram

aplicadas alíquotas de 6,0 μL, 5,5 μL, 5,0 μL, 4,8 μL, 2,5 μL, 2,0 μL, 1,8 μL, 1,5 μL,

1,0 μL, 0,9 μL, 0,5 μL, 0,4 μL e 0,3 μL da solução padrão de aflatoxina B1

(concentração 1,28 μg/mL).

O cromatograma foi desenvolvido a temperatura ambiente, em cuba não

saturada, utilizando sistema de solventes composto por tolueno, acetato de etila e

ácido fórmico (50:40:10). Embora a Farmacopéia Americana (2005) indique a

utilização de sistema de solventes composto por clorofórmio, acetona e álcool

isopropílico (85:10:5), foi utilizado o sistema de solventes proposto por Soares e

Rodriguez-Amaya (1989) para avaliação simultânea de micotoxinas em alimentos.

A visualização foi realizada sob luz ultravioleta (365 nm), para verificar a

presença de fluorescência característica, bem como a comparação da intensidade da

fluorescência e entre as distâncias Rf de padrões e amostra.

154

EEE))) CCCooonnnfffiiirrrmmmaaaçççãããooo dddaaa iiidddeeennntttiiidddaaadddeee

A alta incidência de substâncias interferentes, como pigmentos e lipídios,

presentes nos extratos de drogas vegetais podem dificultar a visualização da

fluorescência da micotoxina, conforme pode ser verificado na Figura 5.2.

Extrato +

Padrão AFB1 Padrão AFB1

FIGURA 5.2 – Placa cromatográfica obtida na avaliação de método farmacopêico para

detecção de aflatoxina B1 em drogas vegetais

155

Nestes casos, foram realizados testes confirmatórios da presença da

micotoxina, por cromatografia bi-dimensional (SCOTT, 1995). A Figura 5.3 apresenta

exemplo de placas de cromatografia bi-dimensional obtidas, sendo que:

(A) representa o cromatograma obtido utilizando sistema de solventes composto por

tolueno, acetato de etila e ácido fórmico (50:40:10 v/v/v) e

(B), o cromatograma desenvolvido em segundo sistema de solventes, composto por

clorofórmio e acetona (90:10 v/v).

(A) (B)

FIGURA 5.3 – Placa obtida com a técnica de cromatografia bi-dimensional, sendo (A)

cromatograma obtido após o primeiro sistema de solventes, composto por tolueno,

acetato de etila e ácido fórmico (50:40:10 v/v/v) e (B) cromatograma obtido após o

segundo sistema de solventes, composto por clorofórmio e acetona (90:10 v/v).

156

555...222...111...333...333 ––– TTTaaaxxxaaa dddeee rrreeecccuuupppeeerrraaaçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm dddrrrooogggaaasss vvveeegggeeetttaaaiiisss

ooobbbtttiiidddaaa cccooommm ooosss mmmééétttooodddooosss aaannnaaalllííítttiiicccooosss

Para avaliar a recuperação obtida em cada método, calculou-se a

concentração de AFB1 (μg/kg) em cada extrato, através da fórmula:

C μg/kg = (S x Y x V)/(X x W)

onde,

S = volume (em μL) do padrão de AFB1 que apresentou fluorescência com

intensidade igual à apresentada pela amostra

Y = concentração do padrão de AFB1 (em μg/mL)

V = volume (em μL) utilizado para ressuspender o resíduo da amostra

X = volume (em μL) aplicado do extrato da amostra que apresentou fluorescência

com intensidade igual à apresentada pelo padrão

W = quantidade (em g) de amostra aplicada

Os valores de W para o método farmacopêico (WI) e para o método

desenvolvido para análise em alimentos (WII) foram calculados levando-se em

consideração os esquemas de diluições aplicados, sendo

WI = (M x 100 x 120)/(200 x 200) e WII = (M x 150 x 150)/(300 x 300)

onde,

M = quantidade (em g) de amostra

157

555...222...222 ––– RRREEESSSUUULLLTTTAAADDDOOOSSS EEE DDDIIISSSCCCUUUSSSSSSÃÃÃOOO

Os resultados obtidos na avaliação de contaminação natural por aflatoxina B1

indicaram que a amostra utilizada estava livre de contaminação.

Foram realizadas dez replicatas de cada nível de concentração utilizando cada

técnica de extração aplicada, sendo os resultados obtidos para a recuperação de

aflatoxina B1 apresentados na Tabela 5.1.

Tabela 5.1 – Recuperação de aflatoxina B1 (AFB1) obtida por método farmacopêico

(Método I) e por método descrito por Soares e Rodriguez-Amaya (Método II)

Réplica Concentração de AFB1 (μg/kg)

Método I Método II 1 0,30 0,74 1,60 4,40 0,33 0,68 1,55 4,41

2 0,30 0,76 1,63 4,39 0,31 0,74 1,62 4,32

3 0,32 0,75 1,58 4,32 0,30 0,71 1,62 4,29

4 0,30 0,71 1,61 4,41 0,32 0,73 1,58 4,39

5 0,35 0,75 1,64 4,37 0,31 0,68 1,61 4,33

6 0,31 0,68 1,58 4,39 0,30 0,73 1,55 4,29

7 0,32 0,74 1,63 4,38 0,33 0,75 1,70 4,35

8 0,32 0,68 1,66 4,30 0,30 0,69 1,64 4,41

9 0,32 0,68 1,63 4,24 0,33 0,73 1,61 4,30

10 0,33 0,72 1,65 4,29 0,32 0,76 1,70 4,32

Média 0,317 0,721 1,621 4,349 0,315 0,720 1,618 4,341

DP 0,016 0,032 0,028 0,057 0,013 0,029 0,052 0,047

CAFB1 (μg/kg) 0,5 1,0 2,0 5,0 0,5 1,0 2,0 5,0

R (%) 63,40 72,10 81,05 86,98 63,00 72,00 80,90 86,82

CAFB1: concentração final de AFB1 adicionada à amostra.

R (%): porcentagem de AFB1 recuperada em cada método aplicado

158

A Figura 5.4 apresenta o gráfico de correlação entre as recuperações de

aflatoxina B1 obtidas pelo método farmacopêico (USP, 2005) e pelo método de

Soares e Rodriguez-Amaya (1989).

y = 0,9980x + 0,000005R2 = 0,999274

0

1

2

3

4

5

0 1 2 3 4

Método I

Mét

odo

II

5

FIGURA 5.4 – Curva de regressão linear obtida na comparação da eficiência de extração

entre os métodos USP, 2005 (Método I) e descrito por Soares e Rodriguez-Amaya

(Método II)

Os resultados, apresentados na Tabela 5.1 e Figura 5.4, indicam coeficiente

de correlação entre as duas técnicas de extração utilizadas de 0,9996 e recuperação

acima de 70%, para nível de contaminação superior a 1,0 μg/kg de amostra.

159

555...222...333 ––– CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSÃÃÃOOO

Os resultados obtidos na avaliação do método oficial de extração de

aflatoxinas, preconizado na Farmacopéia Americana, indicam sua adequação para a

detecção de micotoxinas em amostras de drogas vegetais.

160

555...333 ––– PPPAAARRRTTTEEE BBB::: PPPeeesssqqquuuiiisssaaa dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaasss,,, ooocccrrraaatttoooxxxiiinnnaaa AAA eee ccciiitttrrriiinnniiinnnaaa eeemmm dddrrrooogggaaasss

vvveeegggeeetttaaaiiisss

É esperado que drogas vegetais estejam contaminadas por amplo espectro de

microrganismos, sendo os fungos componentes normais da microflora destes

materiais. Altas cargas fúngicas e a presença de cepas toxigênicas são indicativas da

possibilidade de contaminação com micotoxinas (EFUNTOYE, 1999; ELSHAFIE et al,

1999, 2002; HALT, 1998; LUTOMSKI e KEDZIA, 1980; MANDEEL, 2005; YONG e

COUSIN, 2001;).


555...333...111...111 ––– AAAmmmooossstttrrraaasss

Neste estudo, foram utilizadas as mesmas 91 amostras, abrangendo 65 tipos

de drogas vegetais distintas, apresentadas na Tabela 2.1.

161



EEExxxtttrrraaaçççãããooo ––– UUUSSSPPP,,, 222000000555

Água deionizada

Diclorometano PA, Merck

Metanol PA, Merck

Reagente acetato de zinco – cloreto de alumínio

Composição: Acetato de zinco (200 g/L) e Cloreto de alumínio (50 g/L)

Solução de cloreto de sódio a 10%

Hexano PA, Merck





Tolueno PA, Merck


Acetona PA, Merck



Ácido trifluoroacético, Sigma


162

Solução de ácido sulfúrico a 50%

Solução etanólica de BF3

Tolueno PA, Merck

Padrão de micotoxinas PPaaddrrããoo ddee mmiiccoottooxxiinnaass

Aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, Sigma

Ocratoxina A, Sigma

Citrinina, Sigma





Espátulas






vidro




163




Freezer, Brastemp




A avaliação da presença de aflatoxinas, ocratoxina A e citrinina foi realizada

por cromatografia em camada delgada de extrato obtido por método oficial (USP,

2005).



ácido fórmico (50:40:10) e a visualização foi realizada sob luz ultravioleta (365 nm),

para verificar a presença de fluorescência característica, bem como a comparação

entre as distâncias Rf de padrões e amostra.

A confirmação química da identidade da micotoxina foi realizada por técnicas

adequadas.

A presença de aflatoxinas foi confirmada por derivatização com ácido

trifluoracético (SCOTT, 1995), por aplicação de solução aquosa de ácido sulfúrico

(50%) após o desenvolvimento do cromatograma (CHOURASIA, 1995; REIF e

164

METZGER, 1995; ROY e CHOURASIA, 1989; ROY e KUMARI, 1991) e por

cromatografia bi-dimensional (SCOTT, 1995).

A presença de ocratoxina A foi confirmada por cromatografia bi-dimensional e

por exposição do cromatograma a vapor de NH3 (SCOTT, 1995).

A presença de citrinina, pela exposição do cromatograma a vapor de NH3

seguida da aplicação de solução etanólica de BF3 (CHOURASIA, 1995; ROY e

KUMARI, 1991).


A análise micotoxicológica das amostras de drogas vegetais não revelou a

presença de aflatoxinas, ocratoxina A ou citrinina em qualquer das 91 amostras

analisadas.

Embora tenham sido detectados fungos toxigênicos em 35 amostras (Tabela

4.1), fica evidente que presença destes microrganismos não implica necessariamente

na produção de micotoxinas, principalmente se estes fungos não estiveram

submetidos a condições favoráveis à expressão de sua capacidade toxigênica.

Alguns estudos indicam a ausência de micotoxinas em amostras de produtos

naturais, mesmo em amostras altamente contaminadas por cepas de Aspergillus spp,

como Elshafie et al (2002), que não detectaram aflatoxinas em nenhuma das 15

amostras altamente contaminadas com Aspergillus flavus.

165

Em nenhuma das 100 amostras de plantas medicinais avaliadas por Abou-Arab

et al (1999) foram detectadas micotoxinas, embora tenham sido isoladas cepas de

Aspergillus, Penicillium e Fusarium. Resultados similares foram obtidos por Aziz et al

(1998), que detectaram alta incidência de várias espécies de Aspergillus, Penicillium

e Fusarium, com capacidade para produção de micotoxinas em meios sintéticos, mas

não detectaram a ocorrência de micotoxinas em amostras em amostras de plantas

medicinais, e por Hitokoto et al (1978), que verificaram alta freqüência de Aspergillus

e Penicillium, mas não detectaram micotoxinas em amostras de drogas vegetais

analisadas.

Alguns autores sugerem que drogas vegetais não oferecem condições para a

expressão da capacidade toxigênica dos contaminantes, sendo este o motivo para a

baixa ocorrência natural de micotoxinas (ABOU-ARAB et al, 1999; LUTOMSKI e

KEDZIA, 1980). No entanto, Efuntoye (1999) verificou a produção de micotoxinas por

cepas de Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus e Aspergillus ochraceus em

amostras de plantas medicinais em níveis comparáveis aos obtidos em meios

sintéticos, assim como Ventura et al (2004), que determinaram a ocorrência de

aflatoxinas em amostras de plantas medicinais intencionalmente contaminadas com

Aspergillus parasiticus e por Chourasia e Roy (1991), que também determinaram a

ocorrência de aflatoxinas em amostras intencionalmente contaminadas com

Aspergillus flavus.

Apesar de não ter sido detectada a ocorrência de micotoxinas neste estudo,

vários trabalhos verificaram a ocorrência de diversas micotoxinas em amostras de

drogas vegetais e preparações de origem vegetal. Omurtag e Yazicioglu (2004)

166

verificaram a ocorrência de fumonisina B1 em 2% das amostras de chás e plantas

medicinais analisadas.

Tassaneeyakul et al (2004) detectaram ocorrência natural de aflatoxina B1 em

18% das amostras de preparações de origem vegetal, em concentrações que

variaram entre 1,7 e 14,3 μg/kg. Halt (1998) detectou ocratoxina A em 14% das

amostras de plantas medicinais analisadas.

Chourasia (1995) detectou a ocorrência de aflatoxina B1, ocratoxina A e

citrinina em 64%, 4% e 2% das amostras de drogas vegetais.

Roy e Kumari (1991) verificaram a ocorrência de aflatoxina B1 em quase todas

as amostras de plantas medicinais analisadas, em concentrações entre 1,0 e 11,8

μg/kg, além da ocorrência de citrinina.

81% das amostras de plantas medicinais analisadas por Roy e Chourasia

(1989) apresentaram aflatoxina B1, em concentrações entre 1,4 e 11,1 μg/kg,

enquanto que Roy et al (1988) detectaram ocorrência natural de aflatoxina B1 em

93% das amostras de drogas vegetais analisadas, em concentrações que variaram

entre 0,9 e 12,0 μg/kg.


A análise micotoxicológica das amostras de drogas vegetais não revelou a

presença das micotoxinas estudadas em qualquer das 91 amostras analisadas,

embora tenha sido detectada a presença de fungos toxigênicos em parte das

167

amostras analisadas, evidenciando que estes podem não ter sido expostos a

condições favoráveis à expressão de sua capacidade toxigênica.

168

555...444 ––– PPPAAARRRTTTEEE CCC::: AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo dddaaa tttééécccnnniiicccaaa dddeee iiimmmuuunnnoooeeexxxtttrrraaaçççãããooo,,, uuutttiiillliiizzzaaannndddooo cccooollluuunnnaaa

dddeee iiimmmuuunnnoooaaafffiiinnniiidddaaadddeee AAAffflllaaaTTTeeesssttt®®®,,, pppaaarrraaa aaa dddeeettteeecccçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaasss eeemmm dddrrrooogggaaasss

vvveeegggeeetttaaaiiisss

A purificação do extrato de amostra é essencial nos métodos analíticos para

micotoxinas, especialmente quando a cromatografia é utilizada na determinação

final, sendo que a utilização de colunas de imunoafinidade tem se tornado uma

importante técnica de purificação, particularmente com a disponibilidade comercial

de colunas para aflatoxinas, ocratoxina A, fumonisinas, zearalenona e deoxinivalenol

(HAGE, 1998; PEARSON et al, 1999; SCOTT e TRUCKSESS, 1997; SOLFRIZZO et al,

1998; VENTURA et al, 2005; ZHANG et al, 2005).

A técnica de imunoextração refere-se à utilização de colunas de

imunoafinidade para a remoção do analito ou grupo de analitos de uma amostra

antes de sua determinação, quantitativa ou qualitativa. Envolve a adsorção do analito

presente no extrato, seguida de posterior liberação e detecção (HAGE, 1998;

PEARSON et al, 1999; SCOTT e TRUCKSESS, 1997).

A coluna de imunoafinidade é um tipo de coluna de extração em fase sólida,

que envolve o uso de anticorpos imobilizados em um suporte inerte. A Figura 5.5

apresenta uma esquematização referente ao uso de colunas de imunoafinidade para

detecção de aflatoxinas. O extrato de amostra é aplicado à coluna de

imunoafinidade, sendo a micotoxina presente adsorvida pelos anticorpos imobilizados

na coluna, enquanto outros componentes do extrato não são retidos, sendo

portanto, eliminados. Em seguida, a micotoxina é removida pelo uso de eluente

169

adequado, que rompe a ligação micotoxina-anticorpo, liberando a micotoxina para

ser detectada.

FIGURA 5.5 – Esquema do princípio de utilização de colunas de imunoafinidade

Devido à presença de anticorpos, as colunas de imunoafinidade oferecem

maior especificidade que os métodos tradicionais de extração líquido-líquido ou de

extração em fase sólida aos procedimentos de purificação, entretanto, existem

fatores que podem influenciar sua habilidade de ligação com as micotoxinas e a

capacidade de recuperação destas no substrato, tais como a quantidade de

anticorpos, que precisa ser suficiente para adsorver altas concentrações de

micotoxinas, o volume do extrato e a velocidade do fluxo de passagem pela coluna,

além do tipo de solvente utilizado para separar as micotoxinas ligadas aos anticorpos

(HAGE, 1998; SCOTT e TRUCKSESS, 1997; TRUCKSESS, 2000).

Os solventes mais utilizados para extração de aflatoxinas em alimentos são

compostos por misturas de metanol e água, nas proporções 60 + 40 (v/v) ou 80 +20

(v/v); de acetonitrila e água, nas proporções 60 + 40 (v/v) ou 75 +25 (v/v) ou de

acetona e água, nas proporções 80 + 20 (v/v) ou 85 +15 (v/v). Altas concentrações

170

destes solventes requerem a diluição para reduzir a concentração de metanol para

16 a 30%, de acetronitrila para 7% e acetona para 8,5%, antes da aplicação na

coluna de imunoafinidade (SCOTT e TRUCKSESS, 1997).

Entre as vantagens da utilização de colunas de imunoafinidade podem ser

citadas a maior especifidade do método – que permite eliminar a maioria dos

interferentes presentes no extrato, a purificação do extrato, a concentração do

analito, a facilidade de uso e a rapidez da análise, o baixo consumo de solventes e

utilização de soluções aquosas para a extração das micotoxinas, substituindo os

solventes como clorofórmio e diclorometano (HAGE, 1998; PEARSON et al, 1999;

SCOTT e TRUCKSESS, 1997).

Alguns estudos utilizam as colunas de imunoafinidade durante procedimentos

para a detecção de aflatoxinas em amostras de drogas vegetais e outros produtos

naturais, sendo o método de extração e purificação proposto neste estudo, uma

modificação destes estudos previamente publicados (REIF e METZGER, 1995;

STROKA et al, 2000; TASSANEEYAKUL et al, 2004; VENTURA et al, 2004).



Neste estudo, foi utilizada a droga vegetal alcachofra, pulverizada em moinho.

171


Padrão de aflatoxina B1 PPaaddrrããoo ddee aaffllaattooxxiinnaa BB11

Solução padrão-estoque de Aflatoxina B1, Sigma.

Concentração: 1,28 μg/mL, confirmada por método

espectrofotométrico (SCOTT, 1995).


EEExxxtttrrraaaçççãããooo

Água deionizada

Cloreto de sódio, Merck

Metanol PA, Merck

Tween 20®, Merck





Tolueno PA, Merck


Acetona PA, Merck




Tolueno PA, Merck

172


Coluna de imunoafinidade AflaTest®, Vicam




Espátulas







vidro







Freezer, Brastemp


173


555...444...111...333...111 ––– PPPrrreeepppaaarrraaaçççãããooo dddaaasss aaammmooossstttrrraaasss aaarrrtttiiifffiiiccciiiaaalllmmmeeennnttteee cccooonnntttaaammmiiinnnaaadddaaasss

Alíquotas de 5 g de amostra pulverizada de alcachofra (livre de aflatoxina B1)

foram pesadas, em frasco de vidro com boca larga.

Em seguida, foram contaminadas pela adição de solução padrão de aflatoxina

B1 em quantidade suficiente para obter concentração final de 1,0 μg/kg de amostra,

2,0 μg/kg de amostra, 5,0 μg/kg de amostra e 10,0 μg/kg de amostra.

Após a evaporação do solvente da solução padrão, as amostras foram

submetidas à técnica de imunoextração utilizando coluna de imunoafinidade

AflaTest®, com a finalidade de verificar a recuperação de aflatoxina B1.

555...444...111...333...222 ––– IIImmmuuunnnoooeeexxxtttrrraaaçççãããooo

Sobre alíquota de 5 g da amostra, foram adicionados 30 mL de metanol a

70% e 1 g de cloreto de sódio, sendo sendo a mistura mantida sob agitação, em

agitador horizontal do tipo shaker, por 40 minutos e, em seguida, filtrada.

174


adicionados 50 mL de solução aquosa de Tween 20® a 1%. A mistura foi submetida

à agitação por 5 minutos e, em seguida, foi realizada nova filtração.

A coluna AflaTest® foi pré-condicionada com 10 mL de água deionizada e 10

mL de solução aquosa de Tween 20® a 1%, com fluxo de 3 mL/min. Em seguida, 50

mL do filtrado foram passados pela coluna AflaTest®, com fluxo constante de 3

mL/min. Em seguida, a coluna AflaTest® foi lavada com duas porções de 10 mL de

água deionizada e, então foi seca por passagem de ar por 2 a 3 segundos.

A aflatoxina foi então eluída da coluna AflaTest® com duas porções de 1,0 mL

de metanol, com fluxo de 1 mL/min. O eluato foi coletado em frasco de vidro com

boca larga, sendo, em seguida, realizada a evaporação do solvente em banho-maria

a 80ºC e o resíduo, congelado até o momento do uso.

A figura 5.6 apresenta a esquematização das técnicas de extração efetuadas.

175

Droga vegetal 5 gramas

Metanol a 70%: 30 mL

Cloreto de sódio: 1 g

Shaker: 40 min Filtração

FIGURA 5.6 – Esquema do procedimento para imunoextração de aflatoxina B1 em drogas

vegetais, utilizando coluna de imunoafinidade AflaTest®

Metanol (2x): 1,0 mL

Água deionizada (2x): 10 mL

Filtrado 20 mL

Tween 20® a 1%: 50mL Filtração

Filtrado 50 mL

Eluato

176

Um segundo experimento foi realizado utilizando solução aquosa de etanol a

70%, no lugar de metanol a 70%, para a extração da micotoxina adicionada em

quantidade suficiente para obter concentração final de 10 μg/kg de amostra.

555...444...111...333...333 ––– DDDeeettteeecccçççãããooo

As micotoxinas foram detectadas por cromatografia em camada delgada.

Foram marcados spots na cromatoplaca, localizados a 2,0 cm da base inferior

da placa e com distância mínima de 1,0 cm entre eles.

O resíduo obtido foi ressuspendido em 50 μL de clorofórmio e alíquota de 10

μL do extrato foi aplicada, com auxílio de microsseringa, em um spot marcado. Em

seguida, foram aplicadas alíquotas de 2 μL, 1,5 μL e 1,0 μL da solução padrão de

aflatoxina B1 (concentração 1,28 μL/mL) em spots marcados.



ácido fórmico (50:40:10) e a visualização foi realizada sob luz ultravioleta (365 nm),

para verificar a presença de fluorescência característica, bem como a comparação da

intensidade da fluorescência e entre as distâncias Rf de padrões e amostra.

177

555...444...111...333...444 ––– TTTaaaxxxaaa dddeee rrreeecccuuupppeeerrraaaçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm dddrrrooogggaaasss vvveeegggeeetttaaaiiisss

ooobbbtttiiidddaaa pppooorrr i iimmmuuunnnoooeeexxxtttrrraaaçççãããooo

Para avaliar a recuperação obtida, calculou-se a concentração de AFB1

(μg/kg), através da fórmula:

C μg/kg = (S x Y x V)/(X x W)

onde,

S = volume (em μL) do padrão de AFB1 que apresentou fluorescência com

intensidade igual à apresentada pela amostra

Y = concentração do padrão de AFB1 (em μg/mL)

V = volume (em μL) utilizado para ressuspender o resíduo da amostra

X = volume (em μL) aplicado do extrato da amostra que apresentou fluorescência

com intensidade igual à apresentada pelo padrão

W = quantidade (em g) de amostra aplicada, sendo seu valor calculado a partir da

fórmula

(M x 20 x 50)/(30 x 70)

onde,

M é a quantidade (em g) de amostra.

178


Foram realizadas dez replicatas, para cada concentração de aflatoxina B1,

sendo os resultados obtidos para a recuperação apresentados na Tabela 5.2.

TABELA 5.2 – Recuperação de aflatoxina B1 (AFB1) obtida por imunoextração utilizando

coluna AflaTest®

Réplica Recuperação de AFB1 (μg/kg)

1 9,37 4,54 1,70 0,72 9,29

2 9,29 4,45 1,65 0,76 9,30

3 9,32 4,50 1,64 0,79 9,12

4 9,23 4,57 1,65 0,82 9,17

5 9,15 4,41 1,62 0,78 9,19

6 9,27 4,48 1,66 0,76 9,29

7 9,41 4,49 1,72 0,81 9,34

8 9,38 4,50 1,65 0,74 9,33

9 9,39 4,59 1,63 0,75 9,25

10 9,21 4,46 1,69 0,73 9,34

Média 9,302 4,499 1,661 0,766 9,262

DP 0,087 0,055 0,032 0,033 0,077

CAFB1 (μg/kg) 10,0 5,0 2,0 1,0 10,0*

R (%) 93,02 89,98 83,05 76,60 92,62

* Extração utilizando solução aquosa de etanol

CAFB1: concentração final de AFB1 adicionada à amostra.

R (%): porcentagem de AFB1 recuperada em cada método aplicado

179

Os resultados obtidos na recuperação de aflatoxina B1 por imunoextração

foram compatíveis com os resultados obtidos por outros pesquisadores. Yang et al

(2005) verificaram médias de recuperação entre 84,49 e 98,12% de aflatoxina B1

em amostras de medicamentos naturais utilizados na medicina tradicional chinesa.

Zhang et al (2005) verificaram média de recuperação de aflatoxinas da ordem de

90%, em amostras de plantas medicinais e extratos vegetais.

Os dados apresentados na Tabela 5.2 indicam a possibilidade de utilizar

solução aquosa de etanol para a extração de aflatoxina B1 em amostras de drogas

vegetais. A média de recuperação da micotoxina em extrato etanólico foi de 92,62%,

enquanto que a média de recuperação da micotoxina em extrato metanólico foi de

93,02%.

A Tabela 5.3 apresenta os dados da porcentagem de recuperação de

aflatoxina B1 obtidos para as técnicas de extração descrita na Farmacopéia

Americana e de imunoextração.

TABELA 5.3 – Comparação entre as taxas de recuperação de Aflatoxina B1 em drogas

vegetais obtidas por método de imunoextração e por método farmacopêico

Método de extração Recuperação de AFB1 (%)

10,0 μg/kg 5,0 μg/kg 2,0 μg/kg 1,0 μg/kg

Imunoextração 93,02 89,98 83,05 76,60

Farmacopéia Americana --------- 86,98 81,05 72,10

Os dados apresentados na Tabela 5.3 indicam que a técnica de imunoextração

utilizando colunas de imunoafinidade apresentam melhores resultados na

180

recuperação de diferentes concentrações de aflatoxina B1 em drogas vegetais em

relação ao método farmacopêico. Estes resultados foram compatíveis com aqueles

obtidos por Carvajal et al (1990), que verificaram 82,0% e 93,0% de recuperação de

aflatoxina B1 em amendoim artificalmente contaminado (10 μg/kg) para o método

convencional de extração (método CB, AOAC) e para o método de imunoextração,

respectivamente.

A Figura 5.7 apresenta cromatograma obtido na avaliação do método de

imunoextração de aflatoxina B1, sendo que (A) representa extrato obtido por

extração conforme Farmacopéia Americana e (B) representa extrato obtido por

imunoextração.

(A) (B)

FIGURA 5.7 – Placa cromatográfica obtida na avaliação da técnica de imunoextração em

relação ao método farmacopêico para detecção de aflatoxina B1 em amostra de

alcachofra, sendo que (A) representa extrato obtido por método oficial e (B), o extrato

obtido por imunoextração.

181

Conforme verificado na Figura 5.7, a utilização de coluna de imunoafinidade

antes do procedimento de detecção por cromatografia em camada delgada permitiu

a purificação do extrato e facilitou a visualização da micotoxina presente, sem a

necessidade de efetuar testes adicionais, como cromatografia bi-dimensional.

A utilização de colunas de imunoafinidade permitiu maior rapidez, eficiência e

menor consumo de solventes na detecção de aflatoxinas B1 em amostras de drogas

vegetais artificialmente contaminadas.


A utilização de colunas de imunoafinidade demonstrou ser alternativa

satisfatória para a detecção de aflatoxina B1 em amostras de drogas vegetais,

permitindo a purificação do extrato, maior precisão e sensibilidade, além de

facilidade e rapidez na execução analítica e menor consumo de solventes.

182

555...555 ––– PPPAAARRRTTTEEE DDD::: PPPeeesssqqquuuiiisssaaa dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm eeexxxtttrrraaatttooo fffllluuuiiidddooo dddeee aaalllcccaaaccchhhooofffrrraaa

aaarrrtttiiifffiiiccciiiaaalllmmmeeennnttteee cccooonnntttaaammmiiinnnaaadddaaa c ccooommm ccceeepppaaa aaaffflllaaatttoooxxxiiigggêêênnniiicccaaa dddeee AAAssspppeeerrrgggiiilllllluuu f asss fflllaavvvuuusss

Alguns autores sugerem que drogas vegetais não oferecem condições para a

expressão da capacidade toxigênica dos contaminantes, sendo este o motivo para a

baixa ocorrência natural de micotoxinas (ABOU-ARAB et al, 1999; LUTOMSKI e

KEDZIA, 1980).

O presente estudo teve por finalidade verificar a ocorrência de micotoxinas em

amostra de droga vegetal artificialmente contaminada com cepa toxigênica de

Aspergillus flavus, após ter sido mantida sob condições que permitissem a expressão

da capacidade aflatoxigênica do fungo (umidade: 88%; temperatura: 26 + 1 ºC) e

verificar também a ocorrência da micotoxina em preparação derivada desta matéria-

prima.



Neste estudo, foi utilizada a droga vegetal alcachofra.

183


Cepa microbiana CCeeppaa mmiiccrroobbiiaannaa

Foi utilizada cepa de Aspergillus flavus isolada em amostra de droga

vegetal com capacidade para produção de aflatoxina B1.

Meio de cultura MMeeiioo ddee ccuullttuurraa

Agar Dextrose Batata, Difco

Agar Sabouraud com cloranfenicol (0,5%), Difco


Solução de cloreto de sódio 0,9%, estéril

EEExxxtttrrraaaçççãããooo

Água deionizada

Cloreto de sódio, Merck

Metanol PA, Merck

Tween 20®, Merck





Tolueno PA, Merck


Acetona PA, Merck

184




Tolueno PA, Merck


Coluna de imunoafinidade AflaTest®, Vicam




Espátulas







vidro



Autoclave, Sercon



185



Freezer, Brastemp

Percolador



555...555...111...333...111 ––– PPPrrreeepppaaarrraaaçççãããooo dddooo iiinnnóóócccuuulllooo dddeee AAAssspppeeerrrgggiiilllllluuu asss ffflllaavvvuuusss

Cepa de Aspergillus flavus, isolada em amostra de droga vegetal, com

capacidade para produção de aflatoxina B1 foi inoculada em placas contendo Agar

Dextrose Batata, seguindo-se de incubação a (26 + 1) ºC, por 10 a 15 dias. Após o

período de incubação, o crescimento fúngico foi removido da superfície do meio de

cultura, com auxílio de espátula estéril, transferido a frasco de vidro contendo

pérolas de vidro e 25 mL de solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% estéril e após

agitação vigorosa, a suspensão foi filtrada e o filtrado submetido à contagem do

número de conídios/mL.

A determinação do número de conídios/mL da suspensão obtida foi realizada

por técnica de semeadura em profundidade utilizando Agar Sabouraud com

186

cloranfenicol (0,5%). A suspensão de Aspergillus flavus foi ajustada, com solução

estéril de cloreto de sódio a 0,9%, para conter 106 conídios/mL.

555...555...111...333...222 ––– CCCooonnntttaaammmiiinnnaaaçççãããooo aaarrrtttiiifffiiiccciiiaaalll dddeee aaalllcccaaaccchhhooofffrrraaa,,, mmmaaatttééérrriiiaaa---ppprrriiimmmaaa,,, cccooommm

AAAssspppeeerrrgggiiilllllluuu f asss fflllaavvvuuusss

Sobre porção de 350 g de alcachofra, em recipiente de vidro, foram

adicionados 350 mL de água destilada estéril. A mistura foi inoculada com 3,5 mL de

suspensão ajustada de Aspergillus flavus, homogeneizada e incubada a (26 + 1) ºC

por 14 dias, no escuro.

Como controle positivo para a produção de toxina, foram pesadas 350 g de

arroz, em frasco de vidro, sobre os quais foram adicionados 350 mL de água

destilada estéril. A mistura foi inoculada com 3,5 mL de suspensão ajustada de

Aspergillus flavus e incubada a (26 + 1) ºC por 14 dias, no escuro.

555...555...111...333...333 ––– PPPrrreeepppaaarrraaaçççãããooo dddeee eeexxxtttrrraaatttooo fffllluuuiiidddooo dddeee aaalllcccaaaccchhhooofffrrraaa

Após período de incubação, a droga vegetal foi autoclavada. Porção de 250 g

foi utilizada na preparação de extrato fluido, empregando o “processo A” de

percolação, conforme indicado na Farmacopéia Brasileira, 2a edição (1959) em álcool

187

etílico diluído (263 mL de álcool etílico em 250 mL de água destilada) como líquido

extrator.

555...555...111...333...444 ––– AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo dddaaa ppprrreeessseeennnçççaaa dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 e eemmm aaalllcccaaaccchhhooofffrrraaa,,, mmmaaatttééérrriiiaaa---

ppprrriiimmmaaa v vveeegggeeetttaaalll

Após autoclavação da droga vegetal, porção de 50 g da amostra de alcachofra

foi separada para a pesquisa de aflatoxina B1.

A pesquisa da micotoxina foi realizada por cromatografia em camada delgada

de extrato obtido por técnica de imunoextração utilizando coluna de imunoafinidade

AflaTest®, conforme descrito no Capítulo V – Parte C.



ácido fórmico (50:40:10) e a visualização realizada sob luz ultravioleta (365 nm).

O mesmo procedimento foi utilizado para avaliar a produção de aflatoxina B1

em arroz.

188

555...555...111...333...555 ––– AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo dddaaa ppprrreeessseeennnçççaaa dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm eeexxxtttrrraaatttooo fffllluuuiiidddooo dddeee

aaalllcccaaaccchhhooofffrrraaa

Porção de 50 mL do extrato fluido de Alcachofra foi utilizada para a pesquisa

de aflatoxina B1.

A pesquisa da micotoxina foi realizada por cromatografia em camada delgada

de extrato obtido por técnica de imunoextração utilizando coluna de imunoafinidade

AflaTest®, conforme descrito no Capítulo V – Parte C.



ácido fórmico (50:40:10) e a visualização realizada sob luz ultravioleta (365 nm).

A confirmação química da identidade da micotoxina foi realizada por aplicação

de solução aquosa de ácido sulfúrico (50%) após o desenvolvimento do

cromatograma (CHOURASIA, 1995; REIF e METZGER, 1995; ROY e CHOURASIA,

1989; ROY e KUMARI, 1991).


A análise cromatográfica do extrato de arroz revelou a presença de aflatoxina

B1, indicando que as condições de incubação foram adequadas para a expressão da

capacidade toxigênica da cepa de Aspergillus flavus utilizada no estudo.

189

Os resultados obtidos na análise cromatográfica da matéria-prima alcachofra

artificialmente contaminada revelou a presença de aflatoxina B1, indicando a matéria-

prima vegetal forneceu substrato adequado à expressão da capacidade toxigênica da

cepa de Aspergillus flavus, quando a esta foi oferecida condições adequadas em

termos de temperatura e umidade.

Com relação à análise cromatográfica do extrato fluido de alcachofra

preparado com matéria-prima intencionalmente contaminada, verificou-se a presença

de aflatoxina B1, indicando que a contaminação da matéria-prima vegetal pode ser

transferida à preparação derivada.


Apesar de hipóteses de que as drogas vegetais não são substratos adequados

à produção de micotoxinas, a análise micotoxicológica de amostra artificialmente

contaminada com cepa toxigênica de Aspergillus flavus revelou a presença da

aflatoxina B1, indicando a possibilidade da ocorrência de contaminação com

micotoxinas, quando os contaminantes fúngicos encontrem condições favoráveis ao

seu desenvolvimento e à produção de toxinas. Além disso, os resultados deste

estudo indicaram que a eventual contaminação da matéria-prima pode ocasionar em

contaminação de preparações derivadas.

190

666 ––– CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSÃÃÃOOO FFFIIINNNAAALLL

A análise da contaminação microbiana em amostras de drogas vegetais

revelou que 92,3% das espécies vegetais estavam em desacordo com um ou mais

parâmetros microbiológicos, considerando-se as especificações adotadas para a

enumeração da carga microbiana presente e para a pesquisa de microrganismos

específicos.

Verificou-se a presença de Bacillus cereus, Citrobacter spp, Escherichia coli,

Enterobacter spp, Klebsiella spp, Staphylococcus spp, Acinetobacter spp,

Pseudomonas spp e Stenotrophomonas spp em 6,5%, 1,1%, 24,2%, 50,5%, 49,5%,

2,2%, 26,4%, 4,4% e 1,1% das amostras de drogas vegetais analisadas,

respectivamente.

Com relação à contaminação fúngica, verificou-se a presença de Aspergillus

flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Aspergillus

fumigatus, outros Aspergillus spp, Penicillium citrinum, Penicillium chhrysogenum,

Alternaria spp, Chaetomium spp, Cladosporium spp, Mucor spp, Paecilomyces spp,

Phoma spp, Rhizopus spp e Trichoderma spp em 63,7%, 12,1%, 28,6%, 57,1%,

8,8%, 26,4%, 34,1%, 14,3%, 1,1%, 2,2%, 4,4%, 4,4%, 1,1%, 2,2%, 9,9% e 2,2%

das amostras analisadas, respectivamente. A presença de contaminação por gêneros

fúngicos conhecidos por sua capacidade em produzir micotoxinas evidencia a

potencialidade de contaminação por micotoxinas.

191

89,9% das cepas isoladas em 91 amostras de drogas vegetais

corresponderam a gêneros de importância do ponto de vista micotoxicológico

(Aspergillus e Penicillium), sendo que 21,97% destas cepas comprovaram a

capacidade em produzir micotoxinas, como aflatoxinas (42,9%), ocratoxina A

(22,4%) e citrinina (34,7%).

Apesar de ter sido detectada a presença de fungos toxigênicos em 35

amostras de drogas vegetais, a análise micotoxicológica revelou a ausência de

aflatoxinas, ocratoxina A e citrinina em todas as amostras analisadas, indicando que

a presença de cepas toxigênicas não implica na detecção de micotoxinas,

principalmente se não estiveram submetidos a condições favoráveis à expressão de

sua capacidade toxigênica.

Quando oferecidas condições adequadas de umidade, temperatura e tempo,

verificou-se a produção de aflatoxina B1 por cepa toxigênica de Aspergillus flavus

inoculada em amostra de droga vegetal, sendo que a micotoxina foi detectada em

preparação derivada desta matéria-prima.

Os dados obtidos sugerem que drogas vegetais podem ser consideradas

produtos de alto risco, sendo necessário definir medidas adequadas de controle

higiênico-sanitário para garantir a qualidade e segurança deste tipo de produto

desde a coleta, armazenamento, manipulação até o produto final.

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