UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS

DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045

CITOMETRIA DE FLUXO

Trabalho realizado pela Doutoranda de Imunologia da UFBA Danielle Dantas Lima sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Cláudia Brodskin e

Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

o DEFINIÇÃO:

• É uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas

microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Permite a

análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo conhecida

também por citometria de fluxo multiparamétrica. Através de um

aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de

características físicas e/ou químicas de uma simples célula. O

citômetro de fluxo é um aparelho utilizado para avaliação da

emissão de fluorescência das células (FACS – Fluorescence Activated

Cell Sorter).

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

• Os anticorpos monoclonais são os reagentes de escolha

devido à sua especificidade, reação cruzada mínima e

reprodutibilidade. O citômetro de fluxo mede as

propriedades de dispersão de luz pelas as células e a

emissão de luz de anticorpos monoclonais associados a

fluorocromos e ligados à superfície de uma célula.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

• VANTAGENS

• Mede múltiplos parâmetros em células individuais;

• Grande número de células analisadas com rapidez;

• Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos;

• Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares;

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

o APLICAÇÕES

• Fenotipagem dos leucócitos

• Fenotipagem de células tumorais

- Diagnóstico e classificação das leucemias e dos

linfomas

• Análise de DNA

• Análise da função dos neutrófilos

• Contagem de reticulócitos

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

o APLICAÇÕES EM MEDICINA VETERINÁRIA

• Quantificação de subpopulações linfocitárias

• Quantificação das células CD34+ como indicação da

capacidade de reconstituição hematopoiética após o

transplante de células-tronco

• Avaliação de eritrócitos

• Avaliação de plaquetas

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

METODOLOGIA

• As células, uma vez em suspensão, são orientadas em um fluxo laminar e

interceptadas uma a uma por um feixe de luz (LASER).

• Um número de detectores são apontados ao local onde o fluxo passa

através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou

FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) além de um ou

mais detectores fluorescentes. Cada partícula suspensa passando através

do feixe dispersa a luz de uma forma, e os fluorocromos fluorescentes

encontrados na partícula podem ser excitados emitindo luz de menor

frequência do que o da fonte de luz. Esta combinação de luz dispersa e

fluorescente é melhorada pelos dectetores, e analisando as flutuações

de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente)

é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e

química de cada partícula.

METODOLOGIA

Detector de dispersão de luz em ângulo de 90º Complexidade celular

SSC (Side Scatter)

Detector de dispersão de luz frontal

Tamanho celularFSC (Forward Scatter)

Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm

METODOLOGIA

ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)

ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)

LASER

CÉLULA

METODOLOGIA

3)Dispersão lateral de luz

1)Suspensão de células

Laser3)Dispersão de luz para a frente

4)Filtro

6) Análise de dados

5)A luz refletida passa através de filtros e é detectada por tubos fotomultiplicadores que convertem o sinal luminoso em sinal eletrônico

2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula

METODOLOGIA

Linfócito TCD4

Anticorpos monoclonais marcados

Linfócito TCD8

Citometria de fluxo

Luz fluorescenteLaser

Contagem das células

METODOLOGIA

Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal)

Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro.Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente

E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmenteOs círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos

METODOLOGIA

Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência)

Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3-

Neste quadrante estão as células CD4- e CD3-

(células que não linfócitos)

Neste quadrante estão as células CD4- e CD3+

(outros linfócitos que não Th)

Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3+

(linfócitos Th)

METODOLOGIA