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    Aulas prticas

    Biologia Molecular Licenciatura Bioqumica

    Trabalho 1. Extraco de DNA genmico de Drosophila melanogasterSemana: 6 8 de Maro

    Trabalho 2.Extraco de DNA plasmdico de Escherichia coliSemana: 13 15 de Maro

    Trabalho 3. Anlise electrofortica de DNA digerido com enzimas derestrioSemana: 20 22 de Maro

    Trabalho 4. Elaborao do mapa de restrio de um plasmdeorecombinanteSemana: 3 5 de Abril

    Trabalho 5. PCR - Polimerase Chain ReactionSemana: 10 12 de Abril

    Trabalho 6.Transformao de Escherichia colicom DNA plasmdicoSemana: 17 19 de Abril

    Trabalho 7. Sequenciao de DNASemana: 15 17 de Maio

    Trabalho 8. Clonagem de cDNA -TUB (Parte I)Semana: 22 24 de Maio

    Trabalho 9. Clonagem de cDNA -TUB (Parte II)Semana: 5 - 7 de Junho

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    BIOLOGIA MOLECULAR I

    Protocolos Experimentais

    Cludio Sunkel

    Instituto de Cincias Biomdicas Abel Salazar

    Universidade do Porto

    20012/2013

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    Precaues a ter nos trabalhos de Biologia Molecular

    Segurana pessoal

    Agentes qumicos - Grande parte dos reagentes utilizados em Biologia Molecular so

    carcinognicos, mutagnicos, txicos, inflamveis ou altamente reactivos. Deve-se

    sempre consultar as indicaes disponibilizadas pelos fabricantes ou atravs da internet:

    http://physchem.ox.ac.uk/MSDS

    http://www.epa.gov/enviro/html/emci/chemref/

    http://siri.org

    http://hazard.com

    http://www-portfolio.stanford.edu/100369

    Radiaes - Muitos trabalhos com cidos nucleicos envolvem a utilizao de

    nucleotides marcados radioactivamente, nomeadamente com 32P.

    Agentes Biolgicos O modelo biolgico com que se trabalha pode ser patognico.

    Materiais biolgicos como anticorpos, hormonas e clulas podem conter agentes

    patognicos e a manipulao de plasmdeos bacterianos pode levar a problemas de

    disseminao de resistncia a antibiticos.

    Electricidade Uma das tcnicas mais utilizadas na manipulao e anlise de cidos

    nucleicos e protenas a electroforese em que se empregam elevadas voltagens.

    Proteco do material em anlise

    DNA e RNA degradado por DNases (ou RNases) e desnaturado reversivelmente

    com o aumento da temperatura.

    Protenas So degradadas por proteases e desnaturadas irreversivelmente com o

    aumento da temperatura e, por vezes reversivelmente, com alteraes de pH e agentes

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    qumicos que promovam oxidao. H inibidores qumicos de RNAases e proteases

    disponveis comercialmente que so de ampla utilizao.

    Reagentes Devem ser de elevado grau de pureza (suitable for molecular biology), de

    modo a se encontrarem isentos de proteases, DNases e RNases. No entanto, esto

    sempre sujeitos a contaminao aps abertura das embalagens por spatulas, poeiras, etc.

    Material de vidro A autoclavagem desnatura irreversivelmente as DNAases e as

    proteases. As RNases so apenas desnaturadas reversivelmente. Para as desnaturar de

    um modo irreversvel, deve-se empregar calor seco prolongado: 180 - 200C, durante

    ~12h.

    Material de plstico descartvel Este material isento de DNAases, RNAases e

    protease, sendo tambm sujeito a contaminaes aps a abertura das respectivas

    embalagens

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    AULA 1

    Extraco de DNA genmico de Drosophila melanogaster

    O procedimento bsico de qualquer protocolo de extraco de DNA envolve lise

    celular, com libertao de todo o material intracelular e purificao do DNA. O

    processo de rompimento das clulas a parte do protocolo que mais varia se

    compararmos os diferentes mtodos de extraco de diferentes materiais biolgicos:

    bactrias, leveduras, clulas vegetais, clulas animais, etc. Com a lise celular, todos os

    compostos intracelulares so libertadas para a soluo: protenas, lpidos,

    polissacardeos, cidos nucleicos, molculas orgnicas de baixo peso molecular e ies.

    Nos protocolos vulgarmente utilizados para a purificao de DNA genmico, a lise

    celular geralmente promovida por rompimento mecnico ou se necessrio por aco

    enzimtica que cataliza a degradao da parede celular. Em ambos os casos, frequente

    empregar-se um detergente para completar a lise. Assim, a purificao do DNA

    consistir em libertar o DNA de todos os compostos referidos, o que feito usualmente

    por precipitaes diferenciais e aco de enzimas especificas como proteases e

    RNAases.

    Nas precipitaes diferenciais, recorre-se geralmente a extraces repetidas com

    fenol/clorofrmio/lcool isoamlico (25:24:1, v/v/v), em que o fenol e o clorofrmio

    desnaturam as protenas, ficando estas solubilizadas na fase orgnica enquanto os cidos

    nucleicos permanecem na fase aquosa. Os passos posteriores de purificao baseiam-se

    na insolubilidade do DNA em etanol na presena de concentraes relativamente

    elevadas de caties monovalentes. Em soluo vo permanecer solutos orgnicos e

    resduos de fenol e clorofrmio. Posteriormente, utilizado etanol a 70%, no qual se

    dissolvem a maioria dos caties, resultando DNA praticamente puro no precipitado.

    O DNA genmico extrado por estes processos pode ser usado para a construo

    de bancos genmicos, para anlise de Southern blot, como molde para amplificao

    in vitro por PCR, entre outras aplicaes moleculares possveis. O DNA deve ser

    guardado solubilizado a 70C (ou 20C). No entanto, a congelao e descongelao

    sucessivas provoca quebras nas cadeias de DNA. Como tal, para armazenamento por

    longos perodos, o DNA dever ser guardado em alquotas. Se o armazenamento for porum curto perodo de tempo, guardado a 4C. Regra geral, o DNA dissolvido, para

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    armazenamento, em tampo TE (pH 8,0) em que o EDTA previne a degradao do

    DNA por aco queladora de metais pesados e caties que promovem a quebra das

    ligaes fosfodister por aco das DNAases.

    1. Extrao de DNA genmico de Drosophila melanogaster

    Este trabalho tem por objectivo a continuao do isolamento de DNA genmico

    deDrosophila melanogaster, e a verificao das consequncias da aco de tratamentos

    fsicos sobre a integridade do DNA isolado.

    Foram recolhidas cerca de 200 moscas adultas, e homogeneizadas em 5 ml de

    tampo de lise previamente arrefecido em gelo.

    Tampo de lise:

    - 100 mM Tris-HCl (pH, 8.0)

    - 50 mM NaCl

    - 50 mM EDTA (pH, 8.0)

    - 1 % SDS

    - 0,15 mM espermina

    - 0,15 M espermidina

    O homogeneizado foi depois centrifugado a 1000 rpm, durante 1 minuto. O

    sobrenadante, correspondendo suspenso de ncleos foi posteriormente transferido

    para um tubo Falcon.

    Adicionou-se 50 l de soluo de proteinase K (a 10 mg/ml) suspenso de

    ncleos e procedeu-se incubao a 37 C, durante 2 horas.

    O trabalho experimental a ser realizado compreender o isolamento de DNAgenmico das moscas a partir da fraco de ncleos isolados e ressuspendida em 500 l.

    1. Adicionar 500 l de soluo de fenol equilibrado em tampo TE (10 mM Tris-

    HCl pH, 8.0; 1 mM EDTA pH, 8.0) suspenso de ncleos. Agitar

    cuidadosamente por inverso do tubo. Centrifugar a 5000 rpm, durante 2

    minutos e transferir a fase aquosa (correspondente fase superior) para um novo

    tubo.

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    2. Adicionar 500 l da mistura fenol/clorofrmio/lcool isoamlico (25:24:1, v/v/v)

    e agitar cuidadosamente por inverso do tubo. Proceder a uma nova

    centrifugao a 5000 rpm durante 2 minutos. A fase aquosa novamente

    transferida para um novo tubo.

    3. Adicionar 500 l da soluo de clorofrmio, repetindo-se a mistura da

    preparao por inverso dos tubos. Proceder a uma nova centrifugao a 5000

    rpm durante 2 minutos. A fase aquosa novamente transferida para um novo

    tubo.

    4. Adicionar fase aquosa 100 l de soluo de NaCl (1 M) e 900 l de etanol

    absoluto frio, misturar bem e centrifugar a 12000 rpm durante 10 minutos a 4C.

    5. Remover cuidadosamente o sobrenadante com uma micropipeta Adicionar ao

    DNA precipitado 500 l de uma soluo de lavagem de etanol 70% (frio) e

    centrifugar a 12000 rpm durante 2 minutos a 4C.

    6. Remover cuidadosamente o sobrenadante como no passo 5, tentando eliminar

    todas as gotas de etanol que tenham ficado aderentes s paredes do microtubo.

    Deixar o microtubo aberto durante 5 minutos na estufa a 37C para secar

    completamente o sedimento.

    7. Dissolver o sedimento em 50 l de tampo TE.

    8. Guardar a -20C.

    Determinao da concentrao e grau de pureza do DNA

    O mtodo mais usado para a determinao da concentrao DNA o mtodo

    espectrofotomtrico. Baseia-se na absoro de radiao ultravioleta, por parte dos

    cidos ncleicos. A quantidade de radiao ultravioleta absorvida directamente

    proporcional quantidade de DNA na amostra. Assim, a leitura de absorvncia a 260

    nm proporcional quantidade de cidos nucleicos, sendo a seguinte a

    proporcionalidade:

    Absorvncia Equivalncia

    ~50 g/ml dsDNA

    260 nm ~37 g/ml ssDNA

    ~40 g/ml ssRNA

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    Para a determinao do grau de pureza a leitura da absorvncia feita a 280 nm

    que proporcional quantidade de protenas e fenol presentes na amostra. O grau de

    pureza calculado atravs da relao A260/A280 que dever ser entre 1,8 e 2,2 para

    amostras consideradas puras. Para valores inferiores a 1,8, considera-se a amostra

    contaminada com protenas e fenol.

    No entanto, por vezes a quantidade de DNA no suficiente para ser

    determinada espectrofotometricamente (< 250 ng/ml), ou o DNA pode se encontrar

    intensamente contaminado com outras substncias que absorvem no comprimento de

    onda ultravioleta (RNA por exemplo), impedindo uma correcta anlise da amostra. Uma

    maneira rpida de estimar a quantidade de DNA em tais amostras utilizar a

    fluorescncia, induzida pela radiao ultravioleta, emitida pelo brometo de etdeo

    intercalado na cadeia de cidos nucleicos. Como a quantidade de fluorescncia

    proporcional massa total de DNA, a quantidade de cidos nucleicos na amostra pode

    ser facilmente estimada por comparao da fluorescncia da amostra com aquela de

    uma srie de padres. Um dos padres que se pode utilizar o DNA de clivado com

    HindIII, que produz uma gama de fragmentos com vrias dimenses, correspondendo

    cada banda a uma concentrao de DNA bem definida.

    2. Determinao da concentrao e grau de pureza do DNA por

    espectrofotometria

    1. Ligar o espectrofotmetro e regular para 260 nm.

    2. Fazer o zero da absorvncia com 1 ml de gua ultra-pura numa cuvette de

    quartzo.

    3. Na mesma cuvette adicionar 695 l de gua ultra-pura e 5 l da amostra deDNA (diluio de 140). Tapar a cuvette com parafilm e inverter vrias

    vezes.

    4. Fazer a leitura da absorvncia a 260nm.

    5. Repetir o procedimento e fazer a leitura a 280nm.

    6. Calcular a concentrao de DNA e o grau de pureza da amostra.

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    AULA 2(continuao da aula anterior)

    Verificao da aco de tratamentos fsicos sobre a integridade do DNA

    genmico

    Cada um dos grupos proceder s condies abaixo indicadas:

    1. Retirar 10 l da amostra de DNA genmico para um tubo eppendorf para

    posteriormente correr em gel.

    2. Retirar 10 l da amostra de DNA genmico para um tubo eppendorf e

    vortexar vigorosamente durante 2 minutos. Colocar em gelo.

    3. Retirar 10 l da amostra de DNA genmico para um tubo eppendorf e

    aquecer em gua em ebulio, durante 10 minutos e depois arrefecer em

    gelo.

    4. Retirar 10 l da amostra de DNA genmico para um tubo eppendorf e

    sujeitar a mltiplas passagens atravs da ponta de uma pipeta e depois

    conservar em gelo.

    AULA 2

    Extraco de DNA plasmdico de Escherichia coli

    Para alm do seu DNA genmico (com cerca de 4 milhes de pares de bases)

    muitas bactrias possuem grandes quantidades de pequenas molculas de DNA

    denominadas plasmdeos, as quais podem chegar a conter vrios milhares de pares de

    bases. Estas molculas de DNA, hoje em dia extremamente manipuladas pelo homem,

    revelaram-se bastante teis em Engenharia Gentica por permitirem numerosas

    aplicaes moleculares. Algumas destas aplicaes iro ser evidenciadas no decorrerdas aulas prticas. Os plasmdeos bacterianos so molculas de DNA

    extracromossmico, circulares de cadeia dupla e replicao autnoma. Nos habitats

    naturais, os plasmdeos so frequentes podendo conter genes que conferem aos seus

    hospedeiros caractersticas (fentipos) que podero constituir vantagem selectiva.

    Destes fentipos, contam-se a resistncia a antibiticos, a resistncia a metais pesados,

    produo de enzimas de restrio, produo de toxinas, produo de aminocidos raros

    e a produo ou catabolismo de molculas orgnicas complexas. Muitos plasmdeospossuem ainda a capacidade de transferir o seu DNA para outros hospedeiros que

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    podero ser de estirpes diferentes e, at de espcies diferentes por um processo

    denominado conjugao bacteriana na qual est envolvido um gene: mob.

    Na replicao dos plasmdeos esto envolvidos vrios genes que podero ser

    exclusivamente do genoma do hospedeiro ou ento, deste e do prprio plasmdeo.

    Apesar da replicao ser independente da replicao do cromossoma bacteriano,

    depende sempre de enzimas e protenas codificadas pelo hospedeiro para a sua

    replicao. O local de origem de replicao (ori) juntamente com os elementos de

    controlo cis constituem o replicon ou replicador. Para replicadores diferentes o

    mecanismo de replicao diferente, podendo envolver mais ou menos genes (e

    consequentemente mais ou menos enzimas) do hospedeiro. Uma consequncia do tipo

    de replicador do plasmdeo constitui uma propriedade extremamente importante: o

    nmero de cpias por clula. Plasmdeos cujo mecanismo de replicao no depende

    grandemente de protenas codificadas exclusivamente pelo genoma so ditos multicpia

    (mais de 20 cpias). Por outro lado, os plasmdeos em que a replicao est fortemente

    dependente de protenas do hospedeiro, apresenta um baixo nmero de cpias por clula

    (menos de 20 cpias). Tal deve-se ao facto da sua replicao estar dependente de da

    sntese de factores de replicao pelo hospedeiro (que apenas ocorre no inicio da diviso

    celular) e de protenas iniciadoras da replicao.

    Os plasmdeos so tambm caracterizados pelas marcas selectivas que exibem.

    As marcas selectivas so fentipos conferidos por alelos dominantes plasmdicos que

    permitem distinguir clulas portadoras desse plasmdeo das no portadoras, atravs de

    testes simples em que se tenta evidenciar esse fentipo. As marcas selectivas mais

    comuns em plasmdeos bacterianos so as de resistncia a antibiticos. Assim, clulas

    portadoras destes plasmdeos so resistentes a um determinado antibitico, enquanto

    que as que no o possuem mantm a susceptibilidade. Por exemplo, no caso frequente

    da ampicilina, o gene plasmdico que lhe confere a resistncia codifica uma -lactamaseque cataliza a degradao do anel -lactmico caracterstico das penicilinas. As clulas

    portadoras deste plasmdeo so capazes de formar colnias em meios de cultura

    contendo ampicilina, enquanto que as clulas que no o possuem perdem a viabilidade

    nesses meios.

    Aos plasmdeos de ocorrncia natural, foram feitas alteraes para melhorar as

    suas qualidades para as vrias aplicaes na Biologia Molecular, entre as quais a

    clonagem e expresso de genes. Assim foram criados os chamados vectores plasmdicosde clonagem e os vectores plasmdicos de expresso. Por manipulao das marcas

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    selectivas, dos replicadores e de sequncias sem funo aparente, foram criados novos

    plasmdeos com marcas selectivas convenientes, com maior nmero de cpias e mais

    pequenos em tamanho. Por outro lado foram introduzidas novas sequncias

    (reconhecidas por enzimas de restrio) de modo a aumentar o nmero de locais de

    clonagem (locais de clonagem mltipla) e no caso dos vectores de expresso foram

    introduzidos promotores de expresso fortes a montante do local de clonagem.

    Deste modo, para serem teis em Biologia Molecular, os plasmdeos devem

    possuir:

    (i) uma origem de replicao, estando esta, se possvel, sob controlo relaxado,

    permitindo a replicao autnoma independente do cromossoma bacteriano, originando

    vrias cpias de plasmdeo por clula.

    (ii) locais de corte nico para enzimas de restrio de classe II, permitindo

    linearizar o plasmdeo, introduzir no local de corte o fragmento de DNA estranho de

    interesse, e recircularizar a molcula resultante.

    (iii) genes responsveis por resistncia a antibiticos, permitindo assim

    seleccionar facilmente as clulas portadoras do plasmdeo.

    (iv) locais de corte nico referidos em (ii) dentro de um ou mais dos genes

    referidos em (iii), permitindo a seleco de clulas contendo o plasmdeo recombinante,

    uma vez que o gene fica inactivo pela insero.

    O primeiro passo na utilizao deste tipo de vectores , obviamente, o seu

    isolamento da bactria hospedeira. Este trabalho tem como objectivo a preparao em

    pequena escala, para uso de rotina, do plasmdeo pSK-polo deE. coli.

    A estratgia de purificao de plasmdeos, a partir de uma cultura bacteriana,

    muito semelhante estratgia utilizada na preparao de DNA genmico. No entanto,

    na preparao de plasmdeos necessrio separar o DNA plasmdico da enormequantidade de DNA cromossomal, que tambm est presente nas clulas bacterianas.

    Devido sua dimenso e s formas conformacionais que pode adquirir, particularmente

    a forma circular fechada - denominada cccDNA (covalently-closed-circular DNA), o

    DNA plasmdico pode ser facilmente separado do DNA cromossmico.

    Quando a lise bacteriana efectuada em condies cuidadosamente controladas,

    a maioria do DNA cromossmico sedimentado com os resduos celulares atravs de

    uma centrifugao, deixando o DNA plasmdico em soluo. Alternativamente, o DNAcromossmico pode ser desnaturado a pH bsico (Birnboim & Doly, 1979) ou por

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    fervura rpida (Holmes & Quigley, 1981), originando cadeias simples de DNA. Aps a

    neutralizao, ou o arrefecimento, a desnaturao do cccDNA plasmdico facilmente

    reversvel, no acontecendo o mesmo com o DNA cromossmico, o que vai permitir a

    sua fcil separao. Em qualquer dos casos, para uma purificao completa, necessria

    uma desproteinizao da soluo, assim como de outros passos suplementares de

    purificao.

    Neste trabalho, ser seguido para isolamento de DNA plasmdico: o

    procedimento de minipreparao de DNA por fervura rpida, vulgarmente denominado

    miniprep ,o qual correntemente utilizado no isolamento de pequenas quantidades de

    DNA parcialmente purificado (1 - 5 g).

    1. Extraco de DNA plasmdico de Escherichia coli(miniprep)

    1 Inoculao da estirpe de E. coli (contendo o plasmdeo a purificar) em 10 ml

    de meio LB contendo o antibitico apropriado na concentrao desejada.

    2 Incubar a 37C durante a noite sob agitao.

    3 Colocar 1,5 ml de cultura num tubo Eppendorf e centrifugar as clulas a

    durante 3 minutos velocidade mxima numa microcentrifuga. Aspirar o

    sobrenadante com uma micropipeta.

    4 Adicionar mais 1.5 ml da cultura bacteriana ao sedimento obtido e repetir o

    passo 1.

    5 Adicionar 200 l de tampo STET e ressuspender o sedimento com uma

    micropipeta ou vortex.

    6 Adicionar 4 l de lisozima (a 50 mg/ml) e incubar temperatura ambiente

    durante 5 minutos.

    7 Incubar a 95C durante 1 minuto.

    8 Centrifugar o lisado celular durante 10 minutos velocidade mxima na

    microcentrifuga.

    9 Descartar o sedimento e adicionar 200 l de isopropanol ao sobrenadante e

    vortexar.

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    10 Centrifugar velocidade mxima durante 10 minutos.

    11 Aspirar o sobrenadante com uma micropipeta e deixar secar o sedimento

    (DNA plasmdico) ao ar durante 30 minutos ou na estufa a 37C durante 10

    minutos.

    12 Ressuspender o DNA em 30 l da gua ultra-pura.

    13 Verificar o estado da preparao plasmdica por electroforese em gel de

    agarose 1%. Aplicar 5 l da amostra misturados com 5 l de tampo de

    aplicao.

    Aplicar tambm em gel de agarose a amostra de DNA genmico isolada na aula

    anterior.

    Electroforese de DNA em gel de agarose

    A electroforese de DNA consiste na separao de diferentes fragmentos de DNA

    de acordo com as suas diferentes mobilidades num campo elctrico. A electroforese

    pode ser analtica, tendo por objectivo a anlise de determinada amostra de DNA por

    identificao de fragmentos constituintes, quantificao e determinao do peso

    molecular. Este mtodo pode tambm ser utilizado como um mtodo preparativo para

    separar e purificar fragmentos de DNA especficos. As bandas de DNA podem ser

    directamente visualizadas no gel de agarose atravs da colorao com brometo de

    etdio, permitindo a deteco, no mnimo, de 1 ng.

    Num campo elctrico, definido pela diferena de potencial em Volts e pela

    distncia entre os etctrodos em centmetros (V/cm), as molculas de DNA migram para

    o elctrodo positivo (nodo) devido s cargas negativas dos grupos fosfato. Esta

    migrao retardada pelo atrito das molculas com o suporte da electroforese. Sendo a

    relao carga/massa igual para os diferentes fragmentos de DNA, o parmetro principal

    a condicionar a migrao do DNA a dimenso dos fragmentos. A mobilidade dos

    diferentes fragmentos varia de forma inversamente proporcional ao logaritmo decimal

    do peso molecular (numero de pares de bases), dado o maior atrito com a matriz com o

    aumento do nmero de pares de bases. A conformao do DNA igualmente um

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    parmetro importante a ter em conta na migrao do DNA. Consideram-se trs

    conformaes do DNA: forma I o DNA circular fechado (cccDNA, covalently closed

    circular DNA); forma II o DNA circular com uma quebra numa ligao fosfodister

    (nicked); forma III o DNA linear em cadeia dupla (dsDNA, double stranded

    DNA). Duma maneira geral, sob condies normais, cccDNA migra mais rapidamente

    do que os fragmentos do mesmo tamanho de dsDNA porque a conformao circular tem

    menor raio hidrodinmico devido aos super enrolamentos. Na forma II, os enrolamentos

    desaparecem devido quebra de uma ligao fosfodister o que faz com que seja a

    forma mais lenta de migrao dado apresentar o maior raio hidrodinmico.

    A distncia de migrao dos vrios fragmentos depende tambm da voltagem

    aplicada e da concentrao de agarose empregue. Pelas mesmas razes da influncia do

    peso molecular na mobilidade, o aumento da concentrao da agarose leva a um

    retardamento da migrao electrofortica. A concentrao de agarose a usar deve ser

    adaptada gama de tamanhos de fragmentos que se pretende resolver.

    Para a visualizao do DNA aps a corrida, usa-se brometo de etdeo como

    corante especifico do DNA por ter a capacidade de se intercalar entre pares de bases.

    Sob radiao ultra-violeta, o brometo de etdeo emite fluorescncia, surgindo corado

    apenas o DNA.

    2. Preparao de gel de agarose 1% para separao electrofortica do

    DNA genmico isolado.

    1. Pesar 0,4g de agarose para um matraz e adicionar 40 ml de tampo 1xTAE.

    2. Num forno micro-ondas, aquecer 30 segundos o tampo e a agarose at esta

    se dissolver totalmente.

    3. Depois de arrefecer a soluo de agarose, adicionar 1l de soluo debrometo de etdeo (10 mg/ml).

    4. A soluo de agarose ainda fundida vertida sobre um molde, utilizando-se

    um pente para a formao dos poos, onde sero colocadas as amostras de

    DNA. O gel deixado arrefecer para que solidifique.

    5. Cuidadosamente remover o pente e colocar o gel na tina de electroforese

    submergido em tampo 1xTAE.

    6. Aps colocao do tabuleiro na tina de electroforese, cobrir o gel comtampo de electroforese, 1 a 2 mm acima da superfcie do gel.

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    7. amostra de DNA, misturar o tampo de aplicao (Azul bromofenol

    0,25% (p/v); Glicerol 0,30% (p/v)) numa relao de 5l de tampo por cada

    10 l de amostra.

    8. Aplicar cuidadosamente as amostras e o marcador de pesos moleculares nos

    respectivos poos.

    9. Quando todas as amostras tiverem sido aplicadas, colocar a tampa da tina e

    conectar os cabos fonte de alimentao.

    10. As electroforeses so realizadas a voltagem constante, do elctrodo negativo

    para o positivo.

    Visualizao

    11. No final da electroforese, retirar o gel da tina de electroforese, drenar o

    excesso de tampo e vizualizar num transiluminador de U.V.

    12. Tomando como referncia a distncia (mm) percorrida pelos fragmentos de

    DNA padro, cujas dimenses so conhecidas (pb), construr em papel semi-

    logartmico, um grfico do log dos fragmentos do DNA padro vs. a

    mobilidade no gel dos fragmentos.

    13. Tomando a distncia percorrida pelo DNA amostra e aplicando esse valor no

    grfico determinar as dimenses dos fragmentos do DNA da amostra.

    Alternativamente, utilizando a equao da recta da calibrao, determinar

    as dimenses dos fragmentos.

    O fenol um forte oxidante. Evitar inalar e contacto com a pele. Colocar os resduosde fenol e o material com que tenha entrado em recipientes prprios.

    O brometo de etdeo um agente mutagnico potente, usar sempre luvas e colocar

    em recipiente prprio todo o material que tenha entrado em contacto com este corante

    As radiaes U.V. so extremamente perigosas, particularmente para os olhos,provocando leses na retina. Evitar qualquer exposio dos olhos a estas radiaes.

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    AULA 3

    Anlise electrofortica de DNA digerido com enzimas derestrio

    Os rpidos avanos da investigao cientifica, em particular da Biologia

    Molecular, que tiveram lugar nas duas ultimas dcadas foram possveis em grande parte,

    devido capacidade de isolar determinados segmentos de interesse de DNA

    procaritico e eucaritico. A clonagem de genes requer que as molculas de DNA sejam

    cortadas de um modo muito preciso e reprodutvel. Atravs da utilizao das enzimas de

    restrio esse objectivo facilmente conseguido, pois possuem a capacidade de ligao

    especfica a determinados locais de DNA de cadeia dupla (sequncia de

    reconhecimento) e sua posterior clivagem, no interior dessa sequncia ou adjacente aela. De acordo com as caractersticas de corte, as endonucleases de restrio so

    classificadas em trs tipos. As enzimas do tipo I e III, para alm da aco nuclesica,

    tm aco modificadora (metilao) no mesmo domnio de reconhecimento da protena.

    Apesar destas enzimas reconhecerem sequencias especificas de DNA, a actividade

    nuclesica ocorre de modo aleatrio na proximidade da sequencia de reconhecimento e

    dependente de ATP. Acresce que as enzimas do tipo III apenas efectuam metilao

    numa das cadeias. Por estas razes, as enzimas do tipo I e III no so frequentementeusadas em investigao de rotina em Biologia Molecular.

    As endonucleases de restrio de tipo II so sistemas binrios em que uma das

    subunidades tem aco nuclesica e a outra de metilao. Ambas as aces so

    efectuadas em locais especficos dentro da sequncia reconhecida. A maior parte das

    enzimas de restrio do tipo II, reconhecem sequncias com 4 8 pares de bases com

    simetria palindrmica. A enzima EcoRI (produzida porEscherichia coli) reconhece a

    sequncia GAATTC, enquanto AluI (produzida porArthrobacter luteus) corta em

    AGCT. Como h especificidade para o local de corte, estas enzimas podem ser usadas

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    para a degradao de molculas de DNA com obteno de fragmentos de menor

    tamanho, cujas extremidades so conhecidas em termos de sequncia nucleotdica. As

    sequncias das extremidades e o tamanho dos fragmentos obtidos variam de acordo com

    a enzima de restrio usada.

    Dada a possibilidade de manipulao em locais especficos do DNA, as enzimas

    de restrio constituem nos dias de hoje, ferramentas bsicas em Biologia Molecular.

    Duma maneira geral, so usadas para o estabelecimento de mapas de restrio de

    fragmentos de DNA cuja sequncia desconhecida, fragmentao de DNA genmico

    para separao electrofortica e posterior anlise, criao de fragmentos de DNA para

    subclonagem num vector apropriado e a criao de sondas marcadas para anlises por

    southern e northern.

    Existem trs tipos de extremidade resultantes do corte consoante o modo de

    corte da cadeia dupla. Enzimas de restrio que cortam exactamente no meio da

    sequncia do palindroma (Sma I) originam extremidades sem nenhuma das duas cadeias

    protuberante (blunt ends). Outras enzimas cortam na extremidade 5do palindroma

    reconhecido originando extremidades protuberantes 5de 2-4 bases na forma de cadeia

    simples (EcoRI) denominadas por extremidades 5coesivas (5 sticky-ends). Outras

    enzimas cortam na extremidade 3do palindroma originando extremidades protuberantes

    3de 2-4 bases na forma de cadeia simples (KpnI) denominadas por extremidades 3

    coesivas (3 sticky-ends).

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    Como estas enzimas de restrio so, na sua maioria, especficas em relao

    sequncia de reconhecimento e corte, duas molculas de DNA diferentes que foram

    digeridas com a mesma enzima, por exemploBamHI, possuiro extremidades 5 iguais

    que podem assim emparelhar utilizando as bases que ficaram em cadeia simples, numa

    reaco catalisada por uma DNA Ligase. O resultado da ligao destas duas cadeias ser

    uma molcula recombinante.

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    Dois factores so essenciais para a eficincia de corte das endonucleases de

    restrio: pureza do DNA e o tampo de digesto. As impurezas habituais presentes em

    amostras de DNA (protenas, fenol, clorofrmio, EDTA, SDS e a elevada concentrao

    de sais) podem inibir por completo determinadas enzimas de restrio. A influncia de

    todos estes factores varia de enzima para enzima, pelo que se devem ter em conta

    quando se verifica ausncia de actividade, assegurando-se que as condies de reaco

    foram as ideais.

    Os componentes essenciais dos tampes de digesto so: tampo Tris (pH 7.5-

    8.0), ies de magnsio, cloro, sdio, e potssio; um agente redutor como ditioeritriol,

    ditiotreitol ou 2-mercaptoetanol. Embora haja especificidade da actividade em relao a

    todos estes factores, o mais importante a concentrao de ies (fora inica). Assim,

    dividem-se as enzimas em trs gupos: as que requerem elevada fora inica, mdia

    fora inica e baixa fora inica. Esta propriedade particularmente importante para

    digestes com vrias enzimas de restrio em que impossvel a digesto simultnea

    com enzimas que requerem foras inicas diferentes. Nestes casos, as digestes devem

    ser feitas em separado, comeando pela enzima de menor fora inica, desnaturar a

    enzima por calor, ajustar a concentrao de sais e proceder segunda digesto. As

    consequncias do uso de condies no ideais em digestes com enzimas de restrio

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    so a ausncia de actividade ou o fenmeno de star activity em que a enzima perde a

    especificidade para a sequncia de reconhecimento, passando a fazer cortes no s nos

    locais especficos mas tambm noutros locais.

    Um factor que pode ser importante em alguns casos o grau de metilao do

    DNA. A produo de enzimas de restrio um mecanismo de defesa das bactrias

    contra a infeco por DNA exgeno. Para precaver a aco contra o prprio DNA, estas

    enzimas de restrio promovem a metilao de nucletidos, ficando ento a sequncia

    de reconhecimento imune sua aco. Assim, quando se trabalha com DNA plasmdico

    proveniente de estirpes bacterianas com uma elevada capacidade de metilao, deve-se

    ter em ateno, tambm, a sensibilidade da enzima a usar para a metilao dos

    nucletidos da sequncia de reconhecimento. A estratgia mais usada o uso de estirpes

    bacterianas manipuladas geneticamente para a perda dessa capacidade.

    A acrescentar aos cuidados a ter nas condies de digesto, as enzimas de

    restrio so extremamente instveis e de elevado preo. Assim, devem-se cumprir

    normas rigorosas para evitar desperdcios e perdas de actividade.

    Normas de utilizao das enzimas de restrio

    a) As enzimas de restrio so extremamente caras e susceptveis de

    contaminao. Colocar as enzimas SEMPRE NO GELO (ou noStratacooler). Aps

    cada utilizao coloc-las novamente a -20C.

    b) No contaminar as enzimas entre si ou com o DNA: para isso utilizar sempre

    tips novas e esterilizadas todas as vezes que retirar enzima do recipiente onde se

    encontra.

    c) 1 unidade de enzima de restrio define-se como a quantidade necessria para

    a digesto completa de 1g de DNA, durante 1 h, nas condies recomendadas detamponamento do meio e de temperatura.

    d) Quando pretendida a anlise imediata em gel dos produtos digeridos, so

    utilizados pequenos volumes de reaco. Para digestes de grandes quantidades de

    DNA, ou nos casos em que a enzima se encontra muito diluda, esta no pode contribuir

    com mais de 10% do total do volume da reaco, pois o glicerol em que esta se encontra

    armazenada pode inibir a sua actividade.

    1. Digesto de DNA plasmdico com enzimas de restrio

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    1. Pipetar para um tubo eppendorf, usando pontas de pipeta diferentes e limpas,

    por esta ordem:

    15l de H2O destilada e esterilizada

    2l de 5tampo de enzima de restrio

    2l de DNA plasmdico

    1l de enzima de restrio (EcoRI,HindIII)

    Misturar cuidadosamente batendo levemente com o dedo no fundo do tubo.

    2. Incubar a 37 C durante 1 hora

    3. Preparar um gel 1% de agarose (40 mL)

    4. Preparar as amostras para carregar o gel em trs tubos eppendorf:

    5 l de marcador de peso molecular (Bioline)

    5 l de DNA no digerido + 5 l de tampo de aplicao

    20 l de DNA digerido + 5 l de tampo de aplicao

    5. Carregar o gel com as trs amostras

    6. Correr o gel a 100V at a frente do gel chegar a cerca de dois teros do gel.

    7. Visualizar o DNA num transiluminador de U.V.

    5l HyperLadder/lane, 1% agarose

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    AULA 4

    Elaborao do mapa de restrio de um plasmdeo

    recombinante

    O isolamento de genes envolve, normalmente, o rastreio de bancos de DNA

    genmico clonados em vectores apropriados. Uma vez que estes fragmentos de DNA

    so quase sempre, demasiado grandes para poderem ser manuseados directamente, de

    interesse obter fragmentos de menores dimenso que permitam o seu estudo e

    manipulao posteriores. As utilizao de enzimas de restrio que cortam o DNA em

    sequncias especificas permite a construo de mapas fsicos ao longo da molcula de

    DNA, por originarem fragmentos menores em que o peso molecular determinado em

    gel de agarose e a sequencia nucletidica das extremidades conhecida (corresponde

    sequencia de reconhecimento da enzima de restrio utilizada na reaco). A construo

    de mapas de restrio detalhados possibilita a escolha da fragmentos de DNA de

    menores dimenses que podem ser subclonados para trabalhos posteriores. Os mapas de

    restrio para alm de permitirem a localizao fsica do local de corte de vrias

    enzimas ao longo do DNA so igualmente teis na identificao de fragmentos de DNA

    homlogos entre outras potenciais aplicaes.

    Neste trabalho pretende-se a elaborao do mapa de restrio de um plasmdeo

    recombinante que contm um gene que codifica para uma subunidade da enzima NADH

    desidrogenase da cadeia respiratria. Dois fragmentos de DNA (L e R) foram inseridos

    no plasmdeo pGEM-3. Elaborar para cada uma das molculas recombinantes o mapa

    de restrio com base na anlise do peso molecular dos fragmentos obtidos aps

    digesto de cada plasmdeo recombinante com as enzimas de restrio SalI, HindIII,

    PstI,XhoI,PvuII, SacI eBamHI.

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    PCR Polimerase Chain Reaction

    Trabalho 5

    Instituto de Cincias Bioqumicas Abel Salazar

    Universidade do Porto

    2006/2007

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    AULA 5

    PCR Polimerase Chain Reaction

    A reaco de polimerase em cadeia (PCR) um mtodo rpido que permite aamplificao in vitro de um segmento especifico de DNA ou RNA. Tal como a

    clonagem molecular, a tcnica de PCR permitiu a concretizao de ensaios e trabalhos

    moleculares que at ento seriam impossveis. O numero de aplicaes do PCR parece

    ser infinito, estando ainda em crescimento. Incluem a clonagem directa a partir de DNA

    genmico ou cDNA, mutagenese in vitro e engenharia gentica do DNA;

    fingerprinting de amostras forenses; ensaios para a determinao da presena deagentes infecciosos, diagnostico pr-natal de doenas genticas, anlise de variaes de

    sequencias alelicas, anlise da estrutura de transcritos de RNA, footprinting

    genmico, e sequenciao directa de DNA genmico e cDNA.

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    A base terica da reaco de PCR para a amplificao de um dado segmento de

    DNA encontra-se representada na figura. Neste processo explorada a actividade

    cataltica de uma DNA polimerase e envolve dois iniciadores oligonucleotdicos

    (primers), que flanqueiam o fragmento de DNA a ser amplificado (sequncia alvo), e

    sucessivos ciclos de aquecimento e arrefecimento. Cada ciclo da reaco envolve

    desnaturao de DNA de cadeia dupla (promovida por aquecimento), hibridao dos

    primers s suas sequncias complementares e extenso destes com a referida DNA

    polimerase. Nucletidos so adicionados s extremidades 3' dosprimers, de acordo com

    o molde de DNA alvo. Cada segmento de DNA sintetizado de novo, cuja extremidade 5'

    no mais do que o primer, torna-se uma nova sequncia alvo para um novo ciclo, o

    que resulta numa amplificao exponencial do DNA alvo original. O primeiro ciclo

    resulta na sntese de novas cadeias de tamanho indeterminado, que tal como as cadeias

    moldes, vo hibridar com os primers. No entanto estes produtos so apenas acumulados

    aritmeticamente com os subsequentes ciclos de desnaturao, hibridao e extenso,

    pelo que pouco contribuem para o produto final da reaco de PCR. Aps uma srie de

    hibridaes de primers, extenses e dissociaes dos produtos formados, o

    comprimento das cadeias de DNA amplificadas ser fixo, porque as suas extremidades

    sero definidas pelas extremidades 5' dos primers oligonucleotdicos.

    Apesar de ser necessria a optimizao de muitas variveis para a execuo

    correcta de uma reaco de PCR, o parmetro mais critico normalmente o correcto

    desenho dos primers a usar na reaco. A escolha correcta dos primers dita

    frequentemente o sucesso ou insucesso da amplificao. Deste modo, o desenho atento

    e cuidado dos primers a usar pode poupar tempo valioso de investigao e

    simultaneamente reduzir os custos do trabalho. A maior parte das regras para o desenho

    deprimers so empricas sem garantia de sucesso. No entanto, o seu cumprimento ir

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    aumentar significativamente a probabilidade de um PCR com sucesso. Vrios

    parmetros devem ser tomados em considerao para garantir uma correcta hibridao

    dos primers. O primeiro destes a escolha de primers que possuam uma sequncia

    nica na regio a ser amplificada. A sequncia do primer deve complementar

    correctamente a sequncia de bases da cadeia molde. O segundo parmetro a ser

    considerado a incluso de um resduo G ou C na terminao 3do primer. O G-C

    clamp que se forma ajuda a uma correcta hibridao na terminao 3 (devido s fortes

    pontes de hidrognio entre os pares de bases G/C) e eficiente extenso da nova cadeia.

    No entanto, a presena de mais de trs G ou C seguidos na terminao 3deve ser

    evitada. Osprimers devem ser desenhados sem qualquer homologia entre eles de modo

    a impedir a hiptese de emparelhamento entre ambos. Minimizar a formao de

    hbridos parciais entre os pares deprimers essencial uma vez que estes dimeros sero

    sintetizados preferencialmente em relao a qualquer outro produto de PCR desejado.

    Auto-complementaridade entre sequencias (com mais de 4 bases) contguas noprimer

    indesejada de modo a evitar a formao de estruturas secundrias noprimer(hairpins).

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    A composio de bases doprimer um importante parmetro a ser considerado.

    De um modo geral osprimers devero possuir entre 17 a 25 nucletidos e um contedo

    em G/C entre 45 e 55%. igualmente importante possuir pares de primers com

    temperaturas de hibridao (Tm) semelhantes. A temperatura de hibridao depende

    directamente da dimenso e composio doprimere pode ser calculada pela expresso:

    Tm = (n G+C 4C) + (n A+T 2C)

    A Tm calculada para ambos osprimers da reaco no dever diferir em mais de 5 C.

    Em Drosophila melanogaster, o gene polo, codifica uma protena cinase

    necessria para a correcta progresso da mitose celular. Neste trabalho, a partir da

    sequncia de cDNA fornecida, os alunos tero de desenhar primers destinados

    amplificao por PCR do gene polo. Recorrendo reaco de PCR a partir de DNA

    genmico e de cDNA os alunos tero de inferir sobre a presena de regies intrnicas

    na sequencia do gene.

    1. Procedimento experimental

    A Desenho dos primers

    1. Desenhar os primers oligonucleotdeos 9R1 (sense primer) e 9R2IC

    (antisense primer) obedecendo s regras para a correcta escolha deprimers

    2. Calcular a temperatura de hibridao dos primers .(Tm) de acordo com a

    formula fornecida.

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    Para oprimer sense considerar a sequncia:

    5 AGCTATGCTATGCTATGCTAGCCAGTCAGCTGAACGTG 3

    Para o primer antisense considerar a sequncia:

    5 TCTAATTCCAAGCCAATTGCCAAAAAGGAACCG 3

    B Amplificao por PCR

    1. Preparar as misturas de reaco num tubo de PCR de acordo com a seguite

    composio para um volume de reaco final de 50 l:

    cDNA 1 ng, DNA genmico 5 ng

    Primers: 0,1 M 9R1

    0,1 M 9R2IC

    dNTPs : 200 M

    Tampo de reaco 1

    Taq DNA polimerase: 0,25 U

    Perfazer o volume com H2O ultrapura estril.

    Nota: Adicionar todos os componentes da mistura, excepto a Taq

    polimerase. Misturar suavemente e centrifugar. S ento aplicar a Taq polimerase, que

    dever ser misturada muito suavemente com a ponta da pipeta.

    Quadro resumo das quantidades a usar:

    Mistura de reao Volume (ul) Volume (ul)

    cDNA 1 -

    gDNA - 1

    Tampo da reao 5x 5 5

    Primer1 1 1

    Primer 2 1 1

    dNTPs 8 8

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    Mgcl2 6 6

    dH2O x x

    Taq polimerase 0,25 0,25

    Volume total da reao 50 50

    2. Colocar os vrios tubos no suporte do amplificador termocclico e efectuar

    um programa com 40 ciclos e com a seguinte sequncia de temperaturas:

    Desnaturao 94C -15 segundos

    Hibridao 50C - 30 segundos

    Extenso 72C - 1 minutoaps o ltimo ciclo: 72C - 10 minutos

    3.Retirar os tubos do termo-amplificador e coloc-los a 4C.

    4. Efectuar uma electroforese em gel de agarose 1 %. Registar os resultados

    AULA 6

    Transformao de Escherichia colicom DNA plasmdico

    Transformao o processo de introduo de DNA em clulas. Esta tcnica foiinicialmente explorada em estudos clssicos de gentica. Com o avano da engenharia

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    gentica, a transformao de bactrias com plasmdeos recombinantes tornou-se uma

    tcnica bsica de extrema importncia para a amplificao de fragmentos de DNA

    especficos. A primeira descrio de trasnformao de E. coli data de 1970 quando

    Mandel e Higa demonstraram que clulas de E. coli tratadas com solues geladas de

    cloreto de clcio e depois brevemente aquecidas, podiam importar para o seu interior

    DNA do bacterifago . Embora nunca se tenha conseguido compreender o mecanismo

    de transformao, est bem estabelecido que a exposio de clulas de E. coli a caties

    na presena de baixas temperaturas induz um estado de competncia em que as clulas

    so capazes de importar DNA exgeno. Atravs da experimentao emprica, o

    processo de transformao foi modificado para melhorar a eficincia e reprodutibilidade

    de modo a adaptar esta tcnica rotina da Biologia Molecular. Assim, foram feitas

    modificaes no tempo de exposio das clulas ao clcio; foram usados outros caties

    como o rubdio, mangans e potssio, e a adio de outros compostos como o

    dimetilsulfxido, ditiotreiol ou cobalto de hexamina. Muitas das alteraes introduzidas

    levaram a uma melhoria da eficincia embora, por vezes, sem se conseguir explicar as

    razes, sendo frequente a adopo de protocolos diferentes de acordo com o laboratrio

    e tambm de acordo com o experimentador.

    Neste trabalho, efectuado o processo qumico de transformao mais usado-a

    tcnica clssica que utiliza cloreto de clcio para a preparao de clulas competentes.

    Neste mtodo as clulas so cultivadas at meio da fase exponencial, lavadas e

    concentradas com uma soluo de cloreto de clcio. O DNA adicionado suspenso e

    depois as clulas so sujeitas a um choque trmico. Aps breve incubao em meio no

    selectivo, so espalhadas em placa com meio selectivo. A eficincia da transformao

    calculada em funo do n de transformantes por g de DNA. Na transformao com o

    mtodo do cloreto de clcio podem ser obtidas eficincias superiores a 108

    transformantes/g DNA. No entanto, em rotina laboratorial de esperar obter valores naordem dos 106-7 transformantes/g DNA. Para obter uma boa eficincia do processo de

    transformao vrios factores so essenciais: colheita das clulas na fase exponencial de

    crescimento; manuteno das clulas no gelo; contacto prolongado das clulas com

    cloreto de clcio e o uso de reagentes de mxima pureza e limpeza do material. Se

    qualquer destes parmetros no for cumprido, a eficincia da transformao pode ser

    drasticamente reduzida.

    Imediatamente a seguir transformao por choque trmico, adicionado meiono selectivo s clulas e procede-se a uma breve incubao (30-60 min a 37 C) para

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    que ocorra expresso do gene plasmdico de resistncia ao antibitico, de modo a haver

    suficiente protena sintetizada para conferir resistncia no momento em que as clulas

    forem plaqueadas no meio selectivo. No caso frequente de seleco de transformantes

    resistentes ampicilina, o gene plasmdico que confere a resistncia codifica a enzima

    -lactamase responsvel pela degradao do antibitico. Depois de sintetizada, esta

    enzima segregada para o exterior celular, formando-se uma zona em redor das

    colnias transformantes com menor concentrao de antibitico. Assim, em placas com

    incubao muito prolongada, pode ocorrer o surgimento de colnias satlite,

    identificveis por serem muito pequenas comparativamente s colnias de

    transformantes, e que so resultantes do crescimento de clulas no transformadas, mas

    que deste modo so viveis no meio selectivo.

    Foram construdos dois plasmdeos diferentes a utilizar neste trabalho, de forma

    a exemplificar os tipos de vectores usados e como seleccionar clulas transformadas

    com plasmdeos recombinantes. O plasmdeo clssico pBR322 na sua forma original

    possui genes responsveis pela resistncia tetraciclina e ampicilina. Este plasmdeo foi

    modificado dando origem ao plasmdeo pBR322-CAT, o qual tem inserido o gene CAT

    (codifica a enzima bacteriana Clornfenicol acetil transferase) no local do gene que

    codifica a resistncia tetraciclina que fica assim inactivo.

    O segundo plasmdeo, pEMBL9, pertence a uma nova gerao de vectores onde

    a insero de fragmentos de DNA se d numpolylinkerlocalizado na extremidade 5 do

    gene que codifica a enzima -galactosidase. O plasmdeo contem tambm todos os

    elementos do promotor necessrios induo da expresso desta enzima nas bactrias

    transformadas com este plasmdeo quando expostas lactose, o seu indutor natural.

    Quando as clulas transformadas com este plasmdeo so cultivadas em meio

    MacConkey/Lactose/Ampicilina, a lactose induz a expresso da -galactosidase,permitindo a sua metabolizao com produo de substncias acdicas que vo alterar o

    pH do meio em torno da colnia. Esta alterao de pH identificada por um indicador

    (neutral red) no agar de MacConkey, produzindo colnias vermelhas. No meio

    Mac/Lac/Amp, colnias de bactrias com plasmdeos contendo um fragmento exgeno

    inserido nopolylinker, e que portanto no possuem actividade -gal, adquirem uma cor

    amarela. O plasmdeo pEMBL-CAT foi construdo pela insero, nos locais BamHI e

    HindIII, do gene CAT. A clonagem deste gene no polylinkerpermite estudar a induoda sua expresso em resposta presena de lactose no meio. A correcta induo do CAT

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    permite que as clulas portadoras deste gene sejam resistentes ao cloranfenicol quando

    crescidas na presena de lactose.

    Material:

    Escherichia coli JM101

    Plasmdeos:

    - pEMBL9

    - pMEBL9-CAT

    - pBR322

    - pBR322-CAT

    Meios de Cultura:

    - LB

    - LA

    - Mac/Lac

    Placas de cultura:

    - LA/Amp

    - LA/Amp/Tet

    - Mac/Lac/Cloranfenicol

    1. Preparao de clulas competentes

    1. Inocular 50 ml de LB com a estirpe apropriada deE. coli e incubar a 37 C

    com agitao durante a noite.

    2. Inocular 200 ml de LB, previamente aquecido a 37 C, com 2 ml da cultura

    anterior e incubar a 37 C com agitao, at DO600 de 0,2-0,375.3. Colocar a cultura em tubos pr-arrefecidos e deixar no gelo durante 15

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    minutos.

    4. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos, a 4C.

    5. Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender lentamente o

    sedimento em 20 ml de uma soluo 100 mM CaCl2 (previamente arrefecida). Incubar

    no gelo durante 20 minutos.

    6. Centrifugar novamente a 3000 rpm durante 15 minutos, a 4C.

    7. Ressuspender as clulas em 0.5 ml de soluo 100 mM CaCl2 (a 4 C).

    Incubar em gelo durante 4-24 horas.

    Nota: A eficincia de transformao aumenta consideravelmente durante a

    incubao em gelo at 24 horas. Aps este perodo, as clulas perdem

    rapidamente a sua competncia.

    Para manter as clulas competentes durante mais tempo, adiciona-se glicerol

    (concentrao final 10% v/v) s clulas competentes e congela-se a mistura a

    -70C.

    2. Transformao

    1. Descongelar uma alquota de clulas E. coli JM101 competentes em gelo.

    2. Alquotar 5 l de soluo de DNA plasmdico em quatro microtubos

    identificados com o nome do plasmdeo. Manter os tubos em gelo.

    3. A cada microtubo, adicionar 50 l de clulas competentes (microtubo

    no identificado) e misturar com movimentos circulares com a ponta da

    pipeta.

    Tubo n Plasmdeo

    1 pEMBL9

    2 pEMBL9-CAT3 pBR322

    4 pBR322-CAT

    5 Nenhum (tubo contendo apenas clulas)

    4. Incubar em gelo durante 20 minutos.

    5. Provocar um choque trmico s clulas, colocando o microtubo num banho a

    42 C durante 2 minutos.

    6. Colocar novamente em gelo, durante 2 minutos.7. Adicionar 200 l de meio LB e incubar a 37 C durante 30 minutos

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    com agitao.

    8. Plaquear as clulas de acordo com a seguinte tabela:

    Tubo n Volume (l) Meio de cultura

    1 125 Mac/Lac/Amp

    125 LA/Amp

    2 125 Mac/Lac/Amp

    125 LA/Amp

    3 125 LA/Amp/Tet

    125 LA/Amp

    4 125 LA/Amp/Tet

    125 LA/Amp

    5 125 LA/Amp

    9. Incubar as placas de petri a 37 C durante a noite.

    10. Tomar nota do nmero e cor das colnias crescidas em cada uma das

    placas com meio Mac/Lac

    11. Para induzir a expresso do gene CAT e testar a resistncia das

    clulas ao cloranfenicol, transferir, com palitos esterelizados, 10 colnias

    individuais (das placas crescidas no meio inicial fornecidas) para novos

    meios de acordo com a seguinte tabela:

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    Plasmdeo Meio inicial Novo meio

    pEMBL9 LA/Amp Mac/Lac/Clo

    pEMBL9-CAT LA/Amp Mac/Lac/Clo

    pBR322-CAT LA/Amp Mac/Lac/Clo

    12. Incubar as placas a 37C durante a noite e verificar o crescimento das

    colnias nos diferentes meios.

    13. Determine as eficincias de transformao para os 4 plasmdeos.

    Observe as diferenas nos vrios meios em que as 4 estirpes foram

    plaqueadas. Verifique se h ou no induo da expresso do gene CATem

    meio com lactose.

    AULA 7

    Sequenciao de DNA

    O sucesso da clonagem de um dado gene de interesse apenas o incio de umasegunda etapa de anlises que tm como propsito final a caracterizao estrutural e

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    funcional desse gene. Determinar a sequencia nucletidica de um gene de extrema

    importncia, uma vez que esta representa em ultima anlise a caracterizao da sua

    estrutura gentica. Um dos requerimentos para a sequenciao de DNA a capacidade

    de obter fragmentos definidos de DNA. Deste modo, existe uma forte interdependncia

    entre a clonagem e a sequenciao de DNA, uma vez que a clonagem possibilita a

    obteno de um elevado numero de amostras de fragmentos definidos de DNA.

    No contexto da tecnologia de DNA recombinante, o conhecimento da sequencia

    de DNA um pr-requisito para a sua posterior manipulao. A sequenciao do DNA

    seguida da procura assistida por software de locais de restrio frequentemente o meio

    mais rpido para a obteno de mapas de restrio extremamente detalhados. Esta

    informao particularmente til quando vectores, destinados superexpresso de

    protenas ou construo de fuses proteicas, so utilizados para a subclonagem do gene

    de interesse. Determinada a sequencia nucletidica, recorre-se identificao assistida

    por software das regies codificantes (ORFs) para posterior alinhamento com

    sequncias nucletidicas e aminoacdicas registadas nas bases de dados. Geram-se

    assim importantes pistas acerca da funo e estrutura do gene clonado e do seu produto,

    bem como da relao evolutiva com genes semelhantes. O conhecimento da sequencia

    de DNA igualmente um pr-requisito para uma anlise detalhada das regies

    regulatrias no-codificantes 5e 3 de um dado gene (auxiliando assim na pesquisa de

    mecanismos de regulao da expresso do gene) e para a potencial aplicao de

    mutagnese dirigida. Aplicaes da sequenciao de cidos nucleicos incluem ainda a

    deteco de alteraes no DNA que sejam relevantes em doenas genticas, bem como

    o conhecimento de regies alvo na sequencia para uma aco mais eficaz de um dado

    frmaco na protena resultante.

    Em meados da dcada de 70, quando as tcnicas de clonagem molecular

    comearam a dar bons resultados, foram tambm desenvolvidos mtodos simples paradeterminar a sequncia de nucletidos do DNA. O investigador Robert Holley, tinha

    criado cerca de 10 anos antes, um mtodo de sequenciao de tRNA que foi inmeras

    vezes aplicado ao DNA nos anos 70, mas os resultados eram desanimadores. Nas

    Universidades de Harvard e de Cambridge, os investigadores Gilbert e Sanger,

    respectivamente, trabalharam durante longos anos na descoberta de um mtodo de

    sequenciao de DNA. Como resultado dos seus trabalhos surgiram duas tcnicas de

    sequenciao: o mtodo da degradao qumica de Maxam e Gilbert e o mtodoenzimtico de Sanger. Embora muito diferentes no que respeita a princpios, ambos os

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    mtodos geram populaes de oligonucletidos que comeam num ponto fixo e

    terminam num resduo particular. Os pontos de terminao so nucletidos especficos,

    mas ocorrem aleatoriamente ao longo do DNA. Quatro tipos de populaes de

    fragmentos podem ser criados durante a reaco, populaes essas que terminam no

    nucletido A, C, G ou T. Em cada uma destas populaes existiro no final da reaco

    inmeros fragmentos de DNA tendo cada um deles um tamanho diferente. Estas

    populaes de DNA so visualizadas por electroforese em gel desnaturante de

    poliacrilamida em condies que permitem diferenciar fragmentos cujo comprimento

    difere em apenas um nucletido. As quatro populaes correm lado a lado em gel e no

    final do processo a ordem dos nucletidos pode ser lida pela imagem observada no gel.

    O mtodo de Gilbert, actualmente em desuso, baseia-se na marcao radioactiva

    de um dos extremos do fragmento de ADN e sua subsequente degradao parcial

    atravs de reaces especficas para determinadas bases do DNA. Deste modo, a

    posio de cada base na cadeia de ADN poderia ser determinada medindo a distncia

    entre o ponto de degradao e a extremidade radioactiva visualizada por

    autoradiografia.

    O mtodo de terminao das cadeias de Sanger de longe o mais difundido na

    sequenciao de DNA. Esta tcnica caracteriza-se pelo uso de didesoxinucletidos

    (ddNTPs) que uma vez incorporados nas cadeias de DNA crescente impedem a sua

    extenso pela DNA polimerase. Este tipo de nucletidos em vez do grupo OH em C3,

    que estabelece a ligao fosfodister com o nucletido vizinho, tm um tomo de H que

    impede a formao dessa ligao obrigando o alongamento da cadeia a terminar nesse

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    ponto. Neste mtodo, um primer hibridiza com uma regio de uma cadeia simples de

    DNA e so efectuadas quatro reaces diferentes em que est presente uma DNA

    polimerase e os 4 desoxirribonucletidos que habitualmente constituem a cadeia de

    DNA (dNTPs). Oprimerutilizado est marcado radioactivamente ou com um composto

    fluorescente. Cada uma destas 4 reaces contm uma pequena proporo do respectivo

    didesoxirribonucletido (ddNTP).

    Quando uma pequena quantidade de um destes tipos de nucletidos includa

    numa reaco de sntese de DNA que contm os 4 nucletidos convencionais (dNTPs)

    ocorre uma competio entre o processo de elongao da cadeia de DNA e o processo

    menos frequente de terminao da cadeia. Os produtos de reaco sero um conjunto de

    cadeias de oligonucletidos cujos comprimentos so determinados pela distncia entre a

    extremidade 5 do primer utilizado para iniciar a sntese de DNA e os locais de

    terminao da cadeia. Por exemplo, numa reaco contendo ddATP todos os pontos de

    terminao das cadeias correspondero a zonas normalmente ocupadas pela base A

    convencional. Utilizando cada um dos 4 ddNTPs em 4 reaces enzimticas separadas,

    os vrios fragmentos obtidos terminam nas posies habitualmente ocupadas pelas

    bases A, T, C e G na cadeia molde. Separando estas populaes de oligonucletidos por

    electroforese pode ser determinada a localizao de cada banda por emisso de

    fluorescncia ou aps exposio a um filme de raio X. Quando as 4 populaes correm

    lado a lado no gel de sequenciao a sequncia de DNA sintetizada pode ser lida na

    direco 5para 3 lendo as bandas do fundo do gel para o topo.

    Mais recentemente, em vez de ser o primera estar marcado com um composto

    fluorescente so os ddNTPs que esto marcados. Cada ddNTP est marcado com um

    fluorforo de cor diferente. Deste modo basta uma reaco de sequenciao e no

    quatro como at aqui. Os produtos de sequenciao so corridos em gis existentes no

    interior de capilares muito finos (electroforese capilar) e visualizados com detectoreslasers em aparelhos automticos.

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    Nesta aula terico/prtica pretende-se demonstrar a aplicao da tcnica de

    sequenciao de Sanger assim como a aplicao de PCR para a clonagem de cDNA. A

    experincia consistiu em isolar uma protena por mtodos bioqumicos e determinar a

    sequncia dos primeiros 10 aminocidos da regio N-terminal. Com base na sequncia

    de aminocidos foram desenhados primers degenerados para amplificao do

    correspondente cDNA por PCR a partir de uma biblioteca de cDNA orientada. Como

    segundo primer na reaco de PCR utilizou-se um primer do vector no qual a biblioteca

    foi construda. Os vrios produtos de PCR obtidos foram posteriormente clonados num

    plasmdeo de forma orientada (5EcoRI para 3HindIII). Foram isolados trs clones

    independentes que foram sequenciados utilizando um primer do vector localizado na

    regio 3 do local de insero dos fragmentos de PCR.

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    a) Determine a sequncia de cada clone de forma a obter a sequncia original de

    cada cDNA amplificado.

    b) Identifique os locais de clonagem EcoRI e HindIII

    c) Identifique o primer degenerado em cada clone que foi utilizado para a reaco

    de PCR.

    d) Baseado na sequncia de aminocidos previamente determinada indique qual

    dos trs clones codifica para a protena que se pretende clonar.

    Sequncia de aminocidos:

    N terminal-Ser-Tyr-Cys-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Ala-C terminal

    AULA 8

    Clonagem de cDNA -TUBParte IA. Digesto e purificao de DNA

    1. O plasmdeo recombinante pSK-TUB foi previamente digerido com EcoRI deacordo com o protocolo descrito no trabalho da aula 3.

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    2. Aplicar no gel o marcador de pesos moleculares, o plasmdeo recombinante pKS-

    TUB no digerido, e os produtos da digesto resultantes do passo 1.

    3. Correr o gel a 100V at a frente do gel chegar a cerca de dois teros do gel.

    4. Visualizar o DNA num transiluminador de U.V.

    5. Com uma lmina de bisturi limpa, excisar as bandas do gel, correspondentes aos

    produtos da digesto.

    6. Colocar cada banda num eppendorf e determinar o respectivo peso.

    7. Adicionar 1l de Membrane Binding Solution por cada 1 mg de gel. Vortexar

    vigorosamente e incubar a 65 C at a agarose estar completamente dissolvida.

    8. Transferir a mistura dissolvida para uma Mini-coluna SV previamente inserida num

    tubo colector.

    9. Centrifugar velocidade mxima durante 1 minuto. Descartar o filtrado e voltar a

    colocar a coluna dentro do tubo.

    10. Adicionar 700 l de Membrane Wash Solution. Centrifugar velocidade mxima

    durante 1 minuto. Descartar o filtrado e voltar a colocar a coluna dentro do tubo.

    11. Repetir o passo 10 com 500 l de Membrane Wash Solution.

    12. Cuidadosamente transferir a mini-coluna para um tubo eppendorf limpo. Adicionar

    50 l de gua ultra-pura e centrifugar velocidade mxima durante 1 minuto.

    13. Descartar a mini-coluna e guardar o DNA em gelo para posterior manipulao.

    B. Ligao

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    1. Pipetar para um tubo eppendorf, usando pontas de pipeta diferentes e limpas, por esta

    ordem: 5 l de vector pKS (resultante da digesto)

    10 l de cDNA -TUB

    4l de Tampo de ligao (5)

    1 l T4-Ligase

    Misturar cuidadosamente batendo levemente com o dedo no fundo do tubo.

    2. Incubar a 37 C durante 1 hora, ou a 4C durante a noite.

    3. Congelar a mistura a 20C.

    Parte II

    C. Transformao (realizado em laboratrio)

    1. Descongelar uma alquota de clulas E. coli JM101 competentes em gelo.

    2. Colocar num eppendorf 5 l de pKS e num outro 5 l da mistura da ligao da aula

    anterior. Usar 5 l de Agua ultra-pura como controlo negativo.

    3. A cada microtubo, adicionar 50 l de clulas competentes e misturar com

    movimentos circulares com a ponta da pipeta.

    4. Incubar em gelo durante 20 minutos.

    5. Provocar um choque trmico s clulas, colocando o microtubo num banho a 42 C

    durante 2 minutos.

    6. Colocar novamente em gelo, durante 2 minutos.

    7. Adicionar 200 l de meio LB e incubar a 37 C durante 30 minutos com agitao

    8. Plaquear as clulas em meio Mac/Lac/Amp.

    9. Incubar as placas de petri a 37 C durante a noite.

    RESULTADOS

    10. Avaliar o sucesso da clonagem.