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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica) CAIO MATHEUS PRATES BATALHA FARIA Estudo do papel de mTOR na regulação da atividade de reparo do DNA mitocondrial humano Versão original da Dissertação São Paulo Data de depósito na SPG: 05/09/2017
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica)
CAIO MATHEUS PRATES BATALHA FARIA
Estudo do papel de mTOR na regulação da atividade
de reparo do DNA mitocondrial humano
Versão original da Dissertação
São Paulo
Data de depósito na SPG:
05/09/2017
CAIO MATHEUS PRATES BATALHA FARIA
Estudo do papel de mTOR na regulação da atividade
de reparo do DNA mitocondrial humano
São Paulo
2017
Dissertação apresentado ao Instituto
de Química da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de
Mestre em Ciências (Bioquímica).
Orientadora: Profa. Dra Nadja Cristhina
de Souza Pinto
AGRADECIMENTOS
Agradeço à profa. Nadja C. de Souza Pinto, minha orientadora, por ter
aceitado orientar alguém que veio de uma área tão diferente. Agradeço pela
paciência, que certamente não foi pouca, e por tudo que me ensinou.
À todos os meus companheiros de laboratório, por toda a ajuda, e pelas
discussões sobre diversos temas.
À Carolina Maria Berra, pós-doc do laboratório, que no início teve muita
paciência comigo e me ensinou muitas coisas.
À profa. Alicia J. Kowaltowski, por permitir o uso irrestrito de seu laboratório,
bem como a todos os membros do laboratório, por serem sempre prestativos.
Às agências financiadoras, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de mestrado (Processo 144089/2014-9) e
Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte
financeiro ao laboratório (Processos 08/57721-3 e 10/51906-1)
A todos aqueles que eu não citei, mas que também contribuíram de alguma
forma para o meu trabalho.
E, por fim, mas não menos importante, ao LUCA (last universal common
ancestor), sem o qual nenhum de nós estaríamos aqui.
RESUMO
FARIA, C M P B. Estudo do papel de mTOR na regulação da atividade de reparo
do DNA mitocondrial humano. 2017. 123 f. Dissertação (Mestrado) – Instituto de
Química, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.
mTOR (mammalian target of rapamycin) é uma proteína com papel central no
crescimento, na proliferação e na manutenção das células, que participa da
formação de dois complexos, mTORC1 e mTORC2. Diversos estudos associam
menor atividade de mTOR, em especial o complexo 1, com efeitos protetores contra
o envelhecimento e mesmo aumento da expectativa de vida máxima. Alterações no
DNA têm sido propostas desde cedo na história dos estudos bioquímicos sobre o
envelhecimento como um fator causar da perda de função dos organismos com a
idade. Muitos estudos já foram realizados tentando analisar diversos aspectos do
acúmulo de alterações no DNA e da capacidade de reparo com a idade. No entanto,
a possível relação entre mTOR e reparo de DNA foi muito pouco explorada, em
especial em relação ao DNA mitocondrial. Este estudo teve como objetivo avaliar o
papel de mTOR na regulação dos níveis de reparo de DNA, em especial da via de
reparo por excisão de bases (BER). Os resultados demonstraram que,
aparentemente, mTOR surte algum efeito na regulação de duas enzimas da via BER
(APE1 e Polγ), além de TFAM, diminuído os níveis das três, tanto no núcleo quanto
nas mitocôndrias. No entanto, a atividade de incisão de oligonucleotídeos de APE1
não demonstrou alteração, e indução de apoptose por indução de estresse oxidativo
revelou que células com menor expressão de mTOR se encontravam mais
resistentes. Adicionalmente, a inibição de mTOR pareceu não alterar o número de
cópias de DNA mitocondrial e a massa mitocondrial, sugerindo que as células com
knockdown de mTOR possuem uma maior reserva respiratória. Em conjunto, os
resultados sugerem um possível envolvimento de mTOR na regulação de BER,
mesmo que indiretamente, embora não estaja claro por qual via, ou por qual
complexo de mTOR.
Palavras-chave: mTOR, envelhecimento, reparo de DNA, mitocôndrias, reparo por
excisão de bases.
ABSTRACT
FARIA, C M P B. Study of the role of mTOR in the regulation of the activity of
DNA repair in human mitochondria. 2017. 123 f. Dissertação (Mestrado) – Instituto
de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.
mTOR (mammalian target of rapamycin) is a central protein in the regulation of cell
growth, proliferation and maintenance, that participates in the formation of two
complexes, mTORC1 and mTORC2. Several studies associate a lower activity of
mTOR, especially complex 1, with beneficial effects against aging, and even
increased maximum lifespan. DNA alterations have been proposed since the
beginnings of the history of the biochemical studies on aging to be a cause of the
loss of function that in observed in organisms with age. Several studies have been
carried out to analyze several aspects of DNA alterations and DNA repair with age.
However, the possible relationship between mTOR and DNA repair has not been
explored satisfactorily, especially in relation to mitochondrial DNA. This study had the
objective of evaluating the role of mTOR in the regulation of the levels of DNA repair,
especially the base excision repair (BER) pathway. The results showed that,
apparently, mTOR has some effect in the regulation of two enzymes of the BER
pathway (APE1 and Polγ), as well as TFAM, decreasing their levels, both in the
nucleus and in the mitochondria. However, APE1 oligonucleotide incision activity was
not diminished, and apoptosis induction by methylene blue treatment revealed that
cells with mTOR knockdown were more resistant. Addicionally, mTOR inhibition
didn’t seem to alter mitochondrial DNA copy number and mitochondrial mass,
suggesting that mTOR knockdown cells have more respiratory reserve. Taken
together, these results suggest a possible role for mTOR in the regulation of BER,
even if indirectly, although it is not clear through which pathway, or which mTOR
complex.
Keywords: mTOR, aging, DNA repair, mitochondria, base excision repair.
SUMÁRIO
1. Introdução............................................................................................................13
1.1. Uma breve história do envelhecimento.................................................13
1.2. Reparo de DNA.....................................................................................22
1.2.1. Reparo por excisão de bases (BER)..........................................26
1.2.2. Alterações no DNA ao longo da vida.........................................30
1.2.3. Alterações na atividade de reparo ao longo da vida..................31
1.3. Mitocôndrias..........................................................................................34
1.3.1. Estrutura e função mitocondrial.................................................35
1.3.2. DNA mitocondrial.......................................................................37
1.3.3. Dano no DNA mitocondrial.........................................................38
1.3.4. Geração de espécies reativas de oxigênio................................39
1.3.5. Reparo de lesões no DNA mitocondrial.....................................40
1.4. Mechanistic Target of Rapamycin (mTOR)...........................................42
1.4.1. mTORC1…………………………………………………………….43
1.4.2. mTORC2…………………………………………………………….48
1.4.3. mTOR e envelhecimento…………………………………………..49
1.4.4. Efeitos de mTOR na mitocôndria...............................................51
1.4.5. mTOR e reparo de DNA.............................................................52
2. Objetivos..............................................................................................................55
2.1. Objetivos gerais....................................................................................55
2.2. Objetivos específicos............................................................................55
3. Materiais e métodos............................................................................................56
3.1. Modelos utilizados.................................................................................56
3.1.1. Células HEK293T.......................................................................56
3.1.2. Fígado de camundongo.............................................................56
3.2. Cultivo celular........................................................................................57
3.3. Seleção clonal.......................................................................................57
3.4. Isolamento de mitocôndrias..................................................................58
3.5. Preparação de extratos proteicos.........................................................60
3.5.1. Extratos proteicos para western blot..........................................60
3.5.2. Extratos proteicos para ensaio de atividade enzimática............61
3.5.3. Quantificação da concentração de proteínas nas amostras......61
3.5.4. Concentração de amostras........................................................62
3.6. Western blot..........................................................................................62
3.7. RT-qPCR – Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction…….64
3.7.1. Análise dos níveis de expressão gênica....................................64
3.7.2. Quantificação do número de cópias de DNA mitocondrial.........66
3.8. Medida de parâmetros bioenergéticos..................................................66
3.9. Atividade de Citrato Sintase..................................................................67
3.10. Ensaio de incisão de APE1...................................................................68
3.11. Proliferação celular após tratamento com azul de metileno
fotossensibilizado.......................................................................................69
3.12. Identificação da população sub-G1 por citometria de fluxo..................71
4. Resultados...........................................................................................................73
4.1. Seleção clonal.......................................................................................73
4.2. Wester blot............................................................................................75
4.2.1. Western blot de extratos celulares totais...................................75
4.2.1.1. Expressão de APE1 em extratos totais.................75
4.2.1.2. Expressão de TFAM em extratos totais................77
4.2.1.3. Expressão de Polγ em extratos totais...................79
4.2.2. Western blot de extratos mitocondriais......................................80
4.2.2.1. Pureza das amostras mitocondriais......................80
4.2.2.2. Expressão de APE1 em extratos mitocondriais....81
4.2.2.3. Expressão de TFAM em extratos mitocondriais....83
4.2.2.4. Expressão de Polγ em extratos mitocondriais......84
4.2.3. Western blot de amostras de fígado de camundongo...............85
4.3. Reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real.............86
4.4. Ensaio de incisão de APE1...................................................................87
4.4.1. Curvas de calibração.................................................................88
4.4.2. Ensaio de incisão com extrato total...........................................91
4.4.3. Ensaio de incisão com extrato mitocondrial...............................92
4.5. Medida de parâmetros bioenergéticos..................................................93
4.5.1. Taxa de consumo de oxigênio...................................................93
4.5.2. Taxa de acidificação do meio.....................................................96
4.6. Quantificação do número de cópias de DNAmt....................................98
4.7. Medida da Atividade de Citrato Sintase................................................99
4.8. Proliferação celular após tratamento com azul de metileno
fotossensibilizado.....................................................................................100
4.9. Identificação da população sub-G1 por citometria de fluxo................100
12
5. Discussão..........................................................................................................103
6. Conclusões e perspectivas..............................................................................113
7. Referências........................................................................................................114
13
1. INTRODUÇÃO
O envelhecimento é um processo natural de perda de função gradual dos
sistemas biológicos que afeta os organismos vivos, e que resulta no aumento da
taxa de mortalidade dos indivíduos com o passar do tempo. Com exceção de um
pequeno grupo de organismos nos quais não conseguimos detectar sinais
conhecidos de envelhecimento, muitos dos quais apresentam, ao contrário, um
aumento de suas taxas de crescimento e fecundidade ao longo da vida (Finch,
1990), o envelhecimento é ubíquo. Tal processo ocorre continuamente ao longo do
tempo de vida do organismo, após o final de seu período de desenvolvimento,
apesar de alguns autores argumentarem que existem evidências de que ele atinge
um platô em idades bem avançadas (Mueller & Rose, 1996).
Desde os primórdios da humanidade o homem tentou entender e controlar o
processo de envelhecimento, lançando mão de quaisquer artefatos culturais e
técnicas que sua cultura dispunha. De fato, dada a ubiquidade do envelhecimento e
da morte na vida e na sociedade, talvez não seja grande surpresa constatar que
nada menos que o primeiro livro da história da humanidade já tratasse do tema. No
Épico de Gilgamesh, épico sumério e primeiro exemplo de literatura da história, o rei
Gilgamesh percebe, após presenciar a morte de seu melhor amigo, Enkidu, que não
importa quantos grandes feitos sejam realizados em vida, por mais que o indivíduo
seja lembrado, ele envelhecerá, morrerá, se tornará pó, e estará condenado a uma
eternidade de sofrimento em um mundo dos mortos que não distinguia entre bons e
maus (George, 2003). Tal percepção impeliu Gilgamesh, assim como muitos outros
heróis, mitológicos ou históricos, a começar uma jornada em busca de uma forma de
se tornar imortal. No entanto, até onde pudemos comprovar, seus esforços foram
infrutíferos, a não ser por inspirar algumas belas lendas. Foi apenas na segunda
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metade do século 20, após grandes avanços na compreensão do funcionamento e
estrutura dos sistemas biológicos, que a humanidade começou a propor hipóteses
científicas para explicar a sequência de eventos moleculares que levam ao
envelhecimento. Desde então, diversas organelas e vias moleculares foram
implicadas no processo. Embora estejamos longe de um consenso, e a literatura
cientifica seja rica em evidências contraditórias que precisam ser entendidas de
modo a criar uma teoria mais robusta, algumas moléculas e organelas de destacam
na literatura como possíveis participantes dos mecanismos pelos quais Tanatos e
Geras, filhos da noite Nix, e antigas personificações da morte e da velhice na
mitologia grega, exercem sua cruel influência sobre a vida. Dentre tais mecanismos,
incluem-se alterações no DNA (nuclear e/ou mitocondrial) e a atividade de mTOR
(mechanistic target of rapamycin), um regulador central do crescimento.
1.1. Uma breve história das teorias do envelhecimento
Diversas teorias científicas foram propostas ao longo da história para tentar
explicar o processo de envelhecimento. De fato, o debate científico sobre as causas
do envelhecimento surgiu logo após a publicação da teoria da evolução, por Charles
Darwin. Em edições mais tardias de “Da Origem das Espécies por Meio da Seleção
Natural ou a Preservação de Raças Favorecidas na Luta pela Vida”, Darwin dedicou
um capítulo, “Contestações diversas feitas à teoria da seleção natural”, à respostas
para objeções levantadas por outros cientistas de sua época. Uma das objeções
levantadas foi a de que o envelhecimento e a falta de longevidade crescente em
animais não se encaixava na teoria da seleção natural. O argumento era de que
como a longevidade tinha valor ao aumentar o tempo de sobrevivência, e,
15
consequentemente, as oportunidades de reprodução dos organismos, se a seleção
natural fosse verdade, como propunha Darwin, o resultado deveria ser que cada
geração sucessiva de indivíduos tivesse sua longevidade aumentada. Desta forma,
o envelhecimento, e seus efeitos adversos, seria postergado a cada geração pelo
processo da seleção natural. Para tentar defender sua teoria, a resposta de Darwin
foi a seguinte (Darwin, 1872):
“Um crítico sustentou recentemente, fazendo pompa de uma grande exatidão matemática, que a longevidade é uma grande vantagem para todas as espécies, de maneira que aquele que crê na seleção natural deve dispor a sua árvore genealógica de maneira que todos os descendentes tenham uma longevidade maior que os seus antepassados! O nosso crítico não conceberia como uma planta bianual, ou uma forma animal inferior, pudessem penetrar num clima frio e perecer aí cada Inverno; e, contudo, em razão de vantagens adquiridas pela seleção natural, sobreviver de ano para ano pelas suas sementes ou pelos seus ovos? M. E. Ray Lankester discutiu recentemente este assunto, e concluiu, pelo menos enquanto a complexidade excessiva da questão lhe permite julgar, que a longevidade está ordinariamente em relação com o grau que ocupa cada espécie na escala da organização, e também com a soma de despesa que ocasionam tanto a reprodução como a atividade geral. Ora, estas condições devem provavelmente ter sido largamente determinadas pela seleção natural.”
Pela resposta dada por Darwin, sua crença parecia ser de que a seleção
natural era responsável por determinar a longevidade de uma espécie. No entanto,
ele não pôde explicar como isso poderia ocorrer, e quais possíveis benefícios
poderiam existir de modo a explicar porque determinada longevidade foi selecionada
em uma determinada espécie. Curiosamente, ao dizer que os indivíduos sobrevivem
“de ano para ano pelas suas sementes ou pelos seus ovos”, Darwin parece propor
que a unidade de seleção seria a informação genética (embora ele não usasse esse
termo), e não o indivíduo, um debate que ocorreria muito tempo depois (Lewontin,
1974; Williams, 1966). Alfred Russel Wallace, também propôs em suas notas uma
explicação para o envelhecimento (Weismann et al., 1889):
16
“quando um ou mais indivíduos provêm um número suficiente de sucessores, eles mesmos, consumidores de recursos em taxas constantemente maiores, são um mal para seus sucessores...a seleção natural, portanto, os elimina.”
Essa explicação é notadamente similar àquela oferecida posteriormente por
Ausgust Weismann. O cientista alemão foi o primeiro a elaborar com mais detalhes
uma teoria sobre o envelhecimento. Weismann é famoso por refutar a teoria de que
características adquiridas poderiam ser herdadas, uma ideia que ainda era
defendida por Darwin. De fato, o termo “neodarwinismo” foi primeiramente criado
para designar essa versão do darwinismo proposta por Weismann, que exclui a
herança de características adquiridas. Seu experimento mais famoso foi cortar as
caudas de camundongos em sucessivas gerações, de forma a demonstrar que não
havia diferença no crescimento da cauda em seus descendentes. Em sua palestra
de 1881 no encontro da Associação de Naturalistas Alemães em Salzburgo, com o
título de “A Duração da Vida”, Weismann foi o primeiro a propor formalmente uma
teoria para explicar o envelhecimento de acordo com a seleção natural. Weismann
rejeitava a ideia de que a longevidade dos indivíduos era determinada por desgastes
devidos às limitações fisiológicas impostas pela forma como os organismos são
construídos, e defendia que a longevidade era programada para servir às
necessidades da espécie (Weismann, 1892). Em seus trabalhos, Weismann
articulou diversas teorias para explicar as causas e a necessidade da morte. Entre
estas, inclui-se a ideia de que se houvesse algum indivíduo imortal em uma espécie,
mesmo que ele não morresse por acidente com o tempo, ele acumularia lesões ao
longo de sua existência. Segundo Weismann, essas lesões não seriam reparadas
perfeitamente, e se acumulariam durante o tempo, resultando em um organismo
menos apto. Como esse organismo mais velho continuaria consumindo recursos que
seriam melhor utilizados para suprir membros mais jovens e aptos da espécie,
17
haveria uma pressão seletiva para matar o indivíduo em idades mais avançadas.
Uma das formas pelas quais Weismann tentou explicar essa limitação no reparo de
lesões foi através do limite de replicação de células somáticas. Posteriormente,
Weismann propôs que uma vez estabelecida uma vantagem para a morte, outras
características que tivessem um efeito adverso na imortalidade do organismo, em
troca de uma outra vantagem, não sofreriam resistências para serem selecionadas.
Essa ideia está em linha com a teoria da panmixia proposta por Weismann, que
propõe que traços inúteis para um organismo escapam da ação da seleção natural,
e, eventualmente, desaparecem (Kirkwood & Cremer, 1982; Weismann, 1892). Mais
para o final da vida, Weismann aparentemente mudou de ideia, e passou a renunciar
o aspecto adaptativo do envelhecimento. Alternativamente, ele passou a propor que
organismos que segregam linhagens germinativas e somáticas devem investir mais
recursos na reprodução ao invés de na manutenção do soma, e essa renúncia da
manutenção acarreta no envelhecimento.
Décadas depois, J. B. S. Haldane, famoso por suas contribuições para a
formalização matemática da seleção natural, propôs algo similar à teoria da
panmixia de Weismann. Ao observar os efeitos da doença de Huntington, e a idade
avançada em que se manifesta, Haldane intuiu que certos traços poderiam escapar
da seleção natural por se manifestarem muito tardiamente na vida do indivíduo, em
idades aonde populações naturais dificilmente chegariam. Tal ideia foi
posteriormente aproveitada por Peter Medawar. Medawar, nascido no Brasil de um
pai brasileiro e uma mãe inglesa, e radicado no Reino Unido durante sua
adolescência, contribuiu significativamente para o desenvolvimento de teorias
evolucionárias sobre o envelhecimento, além de ter sido agraciado com um Prêmio
Nobel por suas contribuições para o campo da imunologia. Dentre suas
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contribuições, é atribuída a Medawar a ideia de “acúmulo de mutações”, em que a
evolução permite que alelos com efeitos deletérios se acumulem em idades mais
avançadas, aonde escapariam da seleção natural, em virtude de animais não
viverem muito na natureza. De fato, é atribuído a Medawar a ideia de que animais
não envelhecem significativamente na natureza a ponto de que o envelhecimento
seja prejudicial. No entanto, evidências acumuladas desde então demonstram que
tal afirmação não é verdadeira, e o envelhecimento ocorre e afeta a vida de diversos
animais em seus ambientes naturais (Nussey et al., 2013). Subsequentemente, G.
C. Williams definiu a ideia do que é hoje conhecido como “antagonismo pleiotrópico”.
Williams argumentou que a seleção natural não prejudicaria a seleção de genes com
pleiotropias antagonista. Ou seja, que controlassem mais de uma característica,
dentre as quais uma que tivesse como efeito colateral o envelhecimento, dado que
outra oferecesse um benefício compensatório para o indivíduo em idades menos
avançadas. Estudos conduzidos em Drosophila melanogaster sugerem que talvez a
teoria de acumulo de mutações de Medawar seja mais pertinente do que a ideia de
antagonismo pleiotrópico de Williams (Charlesworth & Hughes, 1996; Hughes et al.,
2002), embora hajam resultados conflitantes (M. R. Rose et al., 2002). Em 1966,
William Hamilton ofereceu a primeira formulação matemática com o intuito de
demonstrar a diminuição das forças da seleção natural com a idade dos indivíduos,
embasando as proposições anteriores sobre acumulo de mutações e antagonismo
pleiotrópico (Hamilton, 1966). Uma década depois, Thomas Kirkwood, baseado nas
ideias tardias de Weismann, propôs a teoria do soma dispensável, que estabelece
que organismos possuem uma quantidade limitada de recursos que devem investir
em reprodução e manutenção, e que a alocação de recursos para reprodução
impede uma manutenção perfeita do soma (Kirkwood, 1977).
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No todo, esses desenvolvimentos sumarizam as principais ideias por traz da
teoria evolucionária do envelhecimento moderna. No entanto, apesar de haverem
bastantes evidências corroborando essa teoria (Michael R. Rose, 1991), muitas
observações ainda desafiam esse paradigma. A existência de animais semelparos,
que morrem logo após seu evento reprodutivo, e de animais com senescência
negligível, que não apresentam sinais detectáveis de envelhecimento, são exceções
importantes. Adicionalmente, a teoria evolucionária do envelhecimento moderna
estabelece que o envelhecimento é um processo multifatorial, ocasionado pelo
pequeno efeito de muitos genes (Rose, 1991). Portanto, o aumento da expectativa
de vida ocasionado por knockouts singulares de alguns genes apresenta um desafio
para alguns aspectos da teoria (Johnson, 2002). Além do mais, algumas
manipulações genéticas parecem retardar o envelhecimento sem afetar a
reprodução (Dillin et al., 2002; Marden et al., 2003; Simon et al., 2003). Animais
eussociais, como formigas e abelhas, aonde uma única fêmea é responsável pela
reprodução, também são uma evidência contrária a uma troca entre manutenção e
reprodução; inclusive, existem evidências de que se reproduzir aumenta a
longevidade em formigas rainhas (Schrempf et al., 2005). Estudos em barrigudinhos
(“guppies”, Poecilia reticulata) reportaram que animais com uma maior taxa de
mortalidade extrínseca evoluíram de modo a se maturarem mais cedo e investir mais
em reprodução, mas não apresentaram sinais de envelhecimento precoce (Reznick
et al., 2004). Por fim, a teoria evolucionária clássica do envelhecimento não
consegue explicar porque, se a taxa de envelhecimento não sofre pressão seletiva,
os fenótipos apresentados durante o envelhecimento em espécies de mamíferos são
tão similares.
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Com o tempo, diversas teorias moleculares sobre as causas do
envelhecimento foram propostas. Devido à sua grande variedade, não cabe
descrever todas aqui. Apenas as mais relevantes para o trabalho serão descritas. No
entanto, é importante descrever em linhas gerais suas diferenças, de modo a
entender melhor o contexto aonde esse trabalho se encaixa. Teorias sobre
envelhecimento podem ser agrupadas em dois grandes grupos: teorias sobre
acúmulo de danos e teorias sobre morte programada. Como existem variações na
forma como diversos autores usam esses termos, é importante defini-los aqui. Por
teorias de acúmulo de danos, entende-se nesse trabalho teorias que propõem que
organismos envelhecem devido ao acúmulo de danos provenientes tanto de fontes
extrínsecas quanto do funcionamento do próprio metabolismo, sem componente
genético determinante. Por outro lado, alguns autores classificam como
programadas algumas teorias pelo simples fato de nas últimas décadas termos
descoberto genes cuja manipulação altera significativamente a expectativa de vida.
No entanto, eles usam o termo morte programada no sentido de que existe um
componente genético na morte, ou seja, o envelhecimento depende em parte da
ativação e desativação de genes ao longo do tempo. Apesar disso, essas mudanças
na expressão gênica são consideradas sem valor adaptativo, e meras negligências
da evolução por falta de pressão seletiva, ou mesmo resultado do acúmulo de
danos. Portanto, para fins desse trabalho, essas teorias serão classificadas como
teorias de acúmulo de danos. Por teorias de morte programada, serão entendidas
aqui teorias que propõem que o envelhecimento, e consequente morte do
organismo, possui um valor adaptativo, e, portanto, foi selecionado pela evolução
(Longo et al., 2005). Essas teorias, similares em essência às ideias iniciais de
Weismann, Darwin e Wallace, postulam que a taxa de envelhecimento e a
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longevidade de organismos é controlada pela evolução. Desta forma, indivíduos
seriam sacrificados altruisticamente de forma a trazer benefícios para a espécie,
provavelmente por evitar competição entre gerações diferentes. Adicionalmente, tal
mecanismo poderia promover uma maior adaptabilidade evolutiva para as espécies
(Goldsmith, 2008), permitindo que elas evoluam mais rapidamente quando as
condições ambientais, e, consequentemente, as pressões seletivas, variarem. Tais
teorias dependem de uma presunção implícita de que a unidade de seleção é a
informação genética, e não os indivíduos. Atualmente, as teorias de acúmulo de
danos representam o paradigma da área.
Paralelamente aos desenvolvimentos em teoria evolucionária,
cientistas tentaram avançar na compreensão dos mecanismos bioquímicos
responsáveis pelos fenótipos associados ao envelhecimento. Embora o debate
sobre envelhecimento se estenda até Darwin, foi apenas na década de 50 que as
primeiras teorias sobre os mecanismos bioquímicos envolvidos no envelhecimento
foram propostas, iniciando com a proposição do papel de espécies reativas de
oxigênio como fatores causadores do envelhecimento (Harman, 1956). Conforme
mencionado anteriormente, nem todas são pertinentes a esse trabalho, mas serão
aqui descritas as teorias de envelhecimento relacionadas ao DNA nuclear, DNA
mitocondrial e mTOR (mechanistic target of rapamycin). Em função de seu papel
essencial na manutenção da informação genética, o possível papel de alterações em
DNA como evento fundamental ao envelhecimento logo ganhou protagonismo. O
primeiro a propor que danos ao DNA desempenham um papel causal no
envelhecimento foi o físico Gioacchino Failla, em 1958 (Failla, 1958), seguido pelo
também físico Leo Szilard um ano depois (Szilard, 1959). A teoria evoluiu ao longo
das décadas, mas sua mensagem principal é a mesma: o acúmulo de danos e
22
mutações no DNA ao longo da vida do organismo altera o padrão e os produtos da
expressão gênica, levando a um desequilíbrio em todo o sistema, que passa a
operar de forma subótima. Isso, por sua vez, leva ao acúmulo de mais erros,
resultando em um ciclo vicioso cujo resultado final seria o envelhecimento. Apesar
de sua elegância, essa teoria sofre do mesmo problema que a maioria das teorias
que tentam explicar as causas do envelhecimento: a difícil separação entre causa e
efeito em um processo biológico possivelmente multifatorial e relativamente pouco
compreendido. É claro que outras biomoléculas, além do DNA, podem acumular
danos com a idade. No entanto, danos ao DNA podem ter um papel particularmente
importante, uma vez que, ao contrário de outras moléculas que podem ser
degradadas e ressintetizadas com facilidade, o DNA deve ser mantido durante toda
a vida de uma célula.
1.2.1. Reparo de DNA
A área de reparo de DNA e mutagênese tem uma longa história.
Curiosamente, os primeiros estudos sobre os efeitos mutagênicos da radiação
ionizante e da radiação UV, realizados nas décadas de 30 e 40, precedem a
descoberta de que o material genético era feito de DNA. De fato, muitos ainda
acreditavam que o material genético era feito de proteínas, e que era estável
(Friedberg, 1997).
O primeiro mecanismo de reparo de DNA descoberto foi a
fotorreativação enzimática. Descoberto independentemente por dois laboratórios nos
EUA na década de 40 (Dulbecco, 1949; Kelner, 1949), a fotorreativação enzimática
consiste no reparo de dímeros de ciclobutano de pirimidina no DNA, que são
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gerados por exposição à radiação UV, e que podem bloquear a replicação e a
transcrição do DNA. Nessa via de reparo, a remoção do dano se dá através de
hidrólise dos dímeros de pirimidina catalisada por uma enzima que é ativada pela luz
visível. Durante a década de 50, foram feitas observações de que o reparo de
danos causados por luz UV também ocorria na ausência de luz visível. No entanto,
foi apenas na década de 60 que foi descoberto que modificações induzidas por
radiação UV poderiam ser reparadas por meio da excisão de nucleotídeos, tanto em
bactérias como em mamíferos (Boyce & Howard-Flanders, 1964; Howard-Flanders
et al., 1962; Pettijohn & Hanawalt, 1964; Rasmussen & Painter, 1964; Setlow &
Carrier, 1964). Nas décadas seguintes, os mecanismos envolvidos no processo
foram sendo elucidados, e, com a descoberta das DNA-glicosilases por Tomas
Lindahl (Lindahl, 1974), e a observação de que uracila era excisada do DNA não em
um oligonucleotídeo, mas como uma base livre, foi criada a distinção entre “reparo
por excisão de nucleotídeos”, que excisa pequenos fragmentos de oligonucleotídeos
durante o reparo de lesões grandes que causam distorção na hélice (como dímeros
de pirimidina), e “reparo por excisão de bases”, que excisa uma única base do DNA
(bases não-canônicas, como uracila, ou modificadas, como 8-oxo-guanina). A
seguir, outras vias de reparo de DNA foram descobertas, demonstrando a
complexidade da tarefa, e a imensa necessidade da vida em manter sua informação
genética conservada. Em mamíferos, cinco vias de reparo de DNA foram
identificadas, cada uma lidando com diferentes classes de lesão (embora em alguns
casos haja sobreposição de substratos). Estas são:
Reparo por reversão direta;
Reparo por excisão de bases;
Reparo por excisão de nucleotídeos;
24
Reparo de pareamento errôneo;
Reparo de quebra de fita dupla (por recombinação homóloga ou junção de
pontas não-homólogas).
Adicionalmente, as vias de sinalização em resposta a danos ao DNA também
são incluídas no estudo de reparo de DNA, assim como a síntese de DNA
translesão.
Essas vias de reparo agem na manutenção de diversos tipos de danos,
provenientes, principalmente, das seguintes fontes (revisto por Alexeyev et al.,
2013):
1) Dano por alquilação: proveniente de fontes endógenas (S-
adenosilmetionina, que pode metilar DNA não-enzimaticamente) e
exógenas (por exemplo, agentes quimioterapeuticos);
2) Dano hidrolítico: ocorre através da formação de sítios abásicos,
resultado da hidrólise de ligações glicosídicas, e desaminação
hidrolítica de bases, predominantemente citosina;
3) Formação de adutos volumosos: proveniente de fontes endógenas
(por exemplo, estrogênios) e exógenas (por exemplo, fumaça de
tabaco e exposição química);
4) Bases mal-pareadas: formadas em decorrência de erros de replicação
ou a incorporação de nucleotídeos contendo bases modificadas, como
nucleotídeos oxidados;
5) Quebras de fita de DNA: ocorrem tanto na forma de quebras de fita
simples (SSBs, do inglês single-strand breaks) e quebras de fita dupla
25
(DSBs, do inglês double-strand breaks), que podem ser resultado de
ataque de espécies oxidativas ou bloqueio da forquilha de replicação;
6) Dano oxidativo: proveniente da reação com espécies reativas de
oxigênio (EROs), que são produzidas por compostos exógenos ou em
decorrência do metabolismo normal de organismos aeróbicos; incluem
bases oxidadas e quebras de fita simples.
As vias de reparo de DNA são de extrema importância para manter a
informação genética conservada, e permitir o funcionamento adequado dos
mecanismos celulares. Sem o correto reparo de alterações no material genético,
genes podem sofrer mutações (alterando padrões de expressão gênica), replicação
e transcrição podem ser bloqueadas, e a fita de DNA pode ser quebrada (podendo
resultar na morte da célula). Enquanto eventos citotóxicos podem ser resolvidos
através de mecanismos de morte celular, eventos mutagênicos podem resultar em
alterações nos mecanismos de controle do ciclo celular, com resultados como
senescência ou carcinogênese. Câncer é o nome dado a um conjunto de doenças
ocasionadas por mutações que desregulam o ciclo celular e fazem uma célula se
replicar descontroladamente. Mutações são decorrências de alterações no DNA não
reparadas, que após pelo menos dois eventos replicativos se fixam como bases
canônicas, e não podem mais ser reconhecidas como alterações. Essas mutações
se acumulam durante a vida, e, alguns propõem, podem ser uma das causas do
envelhecimento. No entanto, existem argumentos de que a pressão seletiva para se
proteger contra mutações oncogênicas poderia ter sido suficientemente forte para
aprimorar os mecanismos de reparo de forma que, dentro do tempo de vida normal
dos organismos, não haja acúmulo de mutações suficientes para que estas sejam
26
responsáveis por um declínio geral no funcionamento do organismo, como o
envelhecimento (de Grey, 2007). Outros ainda propõem que seriam as lesões
citotóxicas as principais contribuintes para o envelhecimento (Hoeijmakers, 2009),
talvez por colaborarem para a exaustão das células-tronco, que devem se dividir
mais para repor as células mortas.
No contexto desse trabalho, a via de reparo por excisão de bases é a mais
relevante, uma vez que suas enzimas serão analisadas, assim como a resposta a
estresse oxidativo, cujo reparo é feito por BER. Portanto, a via BER será descrita em
detalhes a seguir.
1.2.2. Reparo por excisão de bases (BER)
A via de reparo por excisão de bases (BER, do inglês base excision repair) é
responsável por reparar alterações covalentes pequenas em um único nucleotídeo e
que não distorcem significativamente a hélice de DNA, o tipo de alteração mais
comum nas células. Embora todas as vias sejam de extrema importância para o
funcionamento correto das células, a via de BER parece essencial, uma vez que,
com exceção das enzimas pertencentes à família das glicosilases, que são
responsáveis pelo reconhecimento inicial das alterações, todos os outros
componentes catalíticos são essenciais, uma vez que a deleção dos genes que
codificam essas proteínas em camundongos resultou em letalidade embrionária
(Maynard et al., 2009; Puebla-Osorio et al., 2006; Sugo et al., 2000; Tebbs et al.,
1999; Xanthoudakis et al., 1996). Uma via molecularmente simples e com poucos
passos enzimáticos, a via BER é conservada desde bactérias até humanos, e atua
tanto no DNA nuclear como no mitocondrial (Muftuoglu et al., 2014; Zharkov, 2008).
27
No núcleo, BER é principalmente ativa na fase G1 do ciclo celular (Dianov &
Hubscher, 2013). A via possui poucos passos, descritos a seguir:
i) Reconhecimento e remoção da base alterada:
Após ocorrida a alteração no DNA, ocorre remodelamento da
cromatina no sítio danificado, seguido por reconhecimento por uma
DNA glicosilase (Odell et al., 2013). Existem 11 DNA glicosilases
conhecidas, cada uma responsável por reconhecer e excisar uma
classe de dano, embora haja uma certa sobreposição de substratos
(Huffman et al., 2005; Krokan & Bjoras, 2013). DNA glicosilases podem
ser classificadas em dois tipos: monofuncionais e bifuncionais. As
glicosilases monofuncionais possuem apenas uma atividade de
glicosilase, que hidrolisa a ligação N-glicosídica e libera a base
alterada. Glicosilases bifuncionais possuem uma atividade adicional,
de AP liase, que hidrolisa a ligação fosfodiester no sítio abásico
resultante da liberação da base alterada (Jacobs & Schar, 2012). 8-
oxoguanina DNA glicosilase (OGG1) e Nei-like DNA glicosilase 3
(NEIL3) podem funcionar tanto como glicosilases monofuncionais como
bifuncionais (Svilar et al., 2011). A atividade de glicosilase cria um sítio
abásico, ao remover a base alterada, através de um processo aonde a
base alterada é girada, sendo reposicionada do interior da dupla hélice
para o exterior, permitindo à enzima clivar a ligação N-glicosídica
(Fromme et al., 2004). O tipo de glicosilase utilizada determinará a
subvia utilizada subsequentemente. Caso uma glicosilase
monofuncional seja utilizada, a subvia utilizada será a BER de
fragmento curto. No caso de uma bifuncional, a subvia BER de
28
fragmento longo será a escolhida (Dianov & Hubscher, 2013). Nas
glicosilases monofuncionais, a base é clivada através do ataque
nucleofílico em C1’ do substrato com uma molécula de água ativada
(Fromme et al., 2004). No caso das bifuncionais, a catálise ocorre
através de um resíduo de lisina ativada na enzima (Dodson & Lloyd,
2002);
ii) Clivagem da fita e processamento das pontas:
Na via de reparo de fita curta, o sítio abásico é clivado por uma
AP-endonulcease (em humanos por APE1, apurinic/apyrimidinic
endonuclease 1), que cliva a ligação fosfodiester do lado 5’ do sítio
abásico e gera um resíduo hidroxila no terminal 3’ e uma deoxirribose
fosfato (dRP, do inglês deoyribose phosphate) no terminal 5’. Na via de
reparo de fita longa, a glicosilase bifuncional envolvida é que cliva a fita
no lugar de APE1. No entanto, a quebra de fita resultante da atividade
de uma glicosilase-liase possui um terminal aldeído 3’-α,β-insaturado
(no caso de NTH1 e OGG1) ou 3’-fosfato (no caso das glicosilases da
família nei-like endonuclease VIII). Esses dois terminais não suportam
os próximos passos, que envolvem polimerização e ligação e, portanto,
devem ser processados. O terminal aldeído 3’- α,β-insaturado é
removido por APE1, e o terminal 3’-fosfato é removido por PNKP1
(polynucleotide kinase/phosphatase protein 1);
29
iii) Processamento final e síntese de DNA:
Nessa etapa, a 5’-dRP é removida pela atividade 5’-dRP-liase,
seguida da incorporação de nucleotídeos; ambas as atividades são
catalisadas pela mesma proteína, Polβ (no núcleo) ou Polγ (na
mitocôndria). Na via de reparo de fita curta, um único nucleotídeo é
adicionado, enquanto que na via de reparo de fita longa, uma
sequência de 2 a 11 nucleotídeos é incorporada, o que resulta no
deslocamento da fita a jusante, formando uma estrutura em aba. Essa
estrutura é então processada por FEN1 (flap endonuclease 1). Nessa
subvia, Polβ pode ser substituída pelas polimerases replicativas Polδ e
Polε, na presença de PCNA;
iv) Ligação:
Por fim, a DNA ligase III (LIG3) catalisa a junção das duas pontas da
fita de DNA.
A figura abaixo exemplifica a via BER, para alterações corrigidas pela
glicosilase UNG1, que remove uracilas do DNA.
30
Figura 1 – Exemplificação da via de reparo por exição de bases (BER) para UNG1. (1) uma sequência de DNA possui uma uracila incorporada erroneamente; (2) UNG1 gira a base modificada do interior da dupla hélice para o exterior, e cliva a ligação N-glicosídica; (3) APE1 se liga ao sítio abásico, e cliva a fita de DNA; (4) Polγ cataliza a remoção da deoxiribose fosfato; (5) Polγ incorpora um novo nucleotídeo na fita; (6) LIG3 cataliza a junção das duas pontas da fita de DNA; (7) a fita de DNA se encontra reparada (Mori et al., 2017).
1.2.3. Alterações no DNA ao longo da vida
Muitas evidências demonstram que, de fato, há acumulo de alterações no
DNA com o tempo em vários modelos experimentais incluindo mamíferos, como
camundongos (Dolle et al., 1997; Dolle & Vijg, 2002; Martin et al., 1985; Vijg, 2000) e
humanos (Esposito et al., 1989; Lu et al., 2004). Uma meta-análise de 36 estudos
sobre o tema revelou uma forte correlação positiva entre danos ao DNA e
31
envelhecimento (Soares et al., 2014). De fato, duas intervenções que aumentam a
longevidade em camundongos, restrição calórica e supressão do eixo somatotrófico,
causam uma redução na frequência de mutações (Garcia et al., 2008). No entanto, é
importante atentar para o fato de que essas intervenções melhoram diversos
parâmetros no organismo, e que, portanto, a diminuição na frequência de mutações
pode não ser o fator causador do aumento na longevidade, mas meramente um
efeito colateral da melhora em determinados parâmetros que podem ser causa
comum entre o acúmulo de mutações e o envelhecimento.
1.2.4. Alterações na atividade de reparo ao longo da vida
Outra forma de se analisar o papel do DNA no envelhecimento é observando
como variam as atividades dos mecanismos de reparo de DNA ao longo da vida, ao
invés de meramente observar o acúmulo de lesões. Embora hajam menos
evidências nessa área, algumas correlações podem ser observadas.
Em relação a atividades da via BER, estudos em camundongos
demonstraram que há uma diminuição na atividade de Polβ com a idade (Cabelof et
al., 2002; Kaneko et al., 2002; Krishna et al., 2005; Rao, 2007), assim como uma
diminuição na atividade de Polγ, a DNA polimerase mitocondrial (Kaneko et al.,
2002). No entanto, outros estudos observaram um aumento no nível de enzimas da
via BER com a idade (Lu et al., 2004; Souza-Pinto et al., 1999), indicando que mais
dados são necessários para estabelecer uma correlação definitiva.
Estudos analisando a via NER apresentaram resultados mais conflitantes em
relação a alterações na eficiência de reparo de danos induzidos por UV com a idade
(Best, 2009). Alguns estudos demonstraram uma atividade reduzida de NER com a
32
idade (Hazane et al., 2006; Takahashi et al., 2005; Yamada et al., 2006), enquanto
outros não observaram tal redução (Merkle et al., 2004). No entanto, as
metodologias utilizadas nos estudos foram diferentes, tornando uma comparação
direta difícil. Apesar de ainda não haver evidências experimentais suficientes, alguns
autores propõem que alterações na eficiência de NER e o consequente acúmulo de
lesões que essa via deveria reparar são um mecanismo causal do envelhecimento
(Hoeijmakers, 2009). Tal convicção se deve ao fato de que mutações em genes que
codificam proteínas da via NER resultam em alguns fenótipos que se assemelham a
envelhecimento precoce. Por esse motivo, várias dessas síndromes são
classificadas como progérias segmentadas.
Um estudo que mediu a eficiência de reparo de quebras de fita de DNA
causadas por concentrações subletais de peróxido de hidrogênio em células de
jovens (19 a 26 anos), idosos (69 a 75 anos) e centenários (100 a 107 anos),
reportou que as células provenientes dos centenários possuíam uma eficiência de
reparo similar às células dos jovens, e que ambas eram superiores às células
provenientes dos idosos (Chevanne et al., 2007). No mesmo estudo, a expressão de
PARP1 (poliADP ribosilase), uma proteína envolvida na sinalização de dano no
DNA, foi significativamente menor nas células dos idosos em relação aos
centenários e aos jovens, e foi detectado um nível significativamente maior da
proteína Ku70 em centenários. Esses resultados sugerem que há uma redução na
eficiência de reparo de quebras de fita dupla com a idade, e que uma maior
atividade de reparo de DNA, como observado nos centenários, está correlacionada
com uma maior longevidade. Em outros estudos, foi demonstrado que os níveis de
NAD+ caem com a idade, e considerando que NAD+ é substrato de PARP1, assim
como de SIRT1, outra proteína cuja manipulação aumenta a expectativa de vida em
33
leveduras, moscas e camundongos, a atividade dessas proteínas também deve cair.
Nessa condição, o tratamento com NMN (mononucleotídeo de nicotinamida), um
precursor de NAD+, restaura a atividade de PARP1 e previne o acúmulo de lesões
com o tempo, talvez através da inibição da formação de um complexo inibitório de
PARP1 com DBC1 (deleted in breast cancer 1) (J. Li et al., 2017). De fato, uma
correlação positiva entre os níveis de PARP1 e longevidade em mamíferos já foi
observada anteriormente (Grube & Burkle, 1992).
Outros estudos analisaram a via de reparo de quebra de fita dupla por ligação
de pontas não homólogas (NHEJ). Evidências apontam para uma diminuição
significativa da atividade da via NHEJ em neurônios do córtex de ratos com a idade
(Sharma, 2007; Vyjayanti & Rao, 2006), em concordância com um aumento de
quebras de fitas duplas (Rao, 2007). Essa observação correlaciona com uma
redução no número de células-tronco hematopoiéticas com a idade (Rossi et al.,
2007), indicando que essa via de reparo é relevante para a longevidade e resposta
ao estresse. Em outro experimento em humanos, a expressão das proteínas Ku70 e
Mre11, componentes das vias NEHJ e HR (reparo por recombinação homóloga)
estava diminuída em idosos quando comparada a adultos jovens. Além disso, os
níveis de Ku70 estavam significativamente mais altos em indivíduos provenientes de
uma vila na Coreia do Sul aonde a população possui a maior expectativa de vida
média do país quando comparados a uma população controle, composta por
indivíduos que vivem em localidades próximas, com estilo de vida similar, porém
com expectativas de vida menores (Ju et al., 2006). Similarmente, diminuições nos
níveis de mRNA de Ku70 com a idade em células-tronco hematopoiéticas e
progenitoras também foram observadas em outro estudo em humanos (Prall et al.,
2007). Por fim, uma análise in silico buscando identificar genes relacionados ou não
34
ao envelhecimento concluiu que genes da via NHEJ são importantes para o
envelhecimento em humanos (Freitas et al., 2011).
De modo geral, podemos observar correlações positivas entre atividade de
reparo de DNA e longevidade em mamíferos (Cortopassi & Wang, 1996; Francis et
al., 1981; Hart & Setlow, 1974), assim como no verme Caenorhabditis elegans,
aonde a capacidades de reparo de DNA correlacionou com a longevidade em
diferentes linhagens (Hyun et al., 2008). No entanto, alguns argumentam que tal
correlação possa ser um artefato devido a espécies com maior longevidade serem
geralmente maiores, e animais maiores supostamente tenderem a ter uma maior
taxa de reparo de DNA (Promislow, 1994). Adicionalmente, alguns propõem que
algumas dessas mudanças possam ser adaptativas, de modo a compensar outras
mudanças que ocorrem durante o envelhecimento, e não causativas. Desta forma,
mais estudos são necessários para esclarecer se tais correlações são causais ou
artefatos de diferenças fisiológicas e adaptativas entre as espécies, ou respostas a
outros eventos que estejam de fato causando o envelhecimento.
1.3. Mitocôndrias
As mitocôndrias têm um papel central no funcionamento das células, estando
envolvidas em uma grande quantidade de vias centrais para o funcionamento do
organismo. No entanto, mitocôndrias se destacam de outras organelas por serem
uma das duas organelas que possuem DNA próprio (DNA mitocondrial, DNAmt); os
cloroplastos, em células fotossintetizantes, também possuem DNA. Devido às suas
características, Lynn Margulis propôs em 1966 que mitocôndrias (assim como
cloroplastos) se originaram de bactérias que entraram em uma relação simbiótica
35
com outras células procarióticas ancestrais, provavelmente Archea, possibilitando a
evolução das células eucarióticas (Sagan, 1967). Sua hipótese foi ignorada por
muito tempo no meio científico, com a própria Lynn Margulis lembrando que seu
artigo original foi recusado em 15 periódicos científicos até ser aceito (Knoll, 2012).
Foi apenas na década de 80, com a descoberta de que os DNAs de mitocôndrias e
cloroplastos são diferentes do DNA nuclear, e se assemelham ao de bactérias, que
a teoria passou a ser mais aceita (revisto em Gray, 2012).
1.3.1. Estrutura e função mitocondrial
Mitocôndrias são as principais responsáveis pela geração de energia em
células aeróbicas, na forma de adenosina trifosfato (ATP), através da fosforilação
oxidativa. Essa organela é envolta por duas membranas lipídicas que, juntas, criam
dois compartimentos mitocondriais separados: a matriz mitocondrial, envolta pela
membrana mitocondrial interna, e o espaço intermembranas, delimitado pelas
membranas mitocondriais interna e externa. Na matriz, encontram-se diversas
enzimas, responsáveis por suas diversas funções metabólicas, assim como o DNA
mitocondrial. A membrana interna abriga os complexos proteicos que realizam o
transporte de elétrons de coenzimas reduzidas (NADH e FADH2) para o oxigênio
molecular, com concomitante bombeamento de prótons para o espaço
intermembrana, e a fosforilação de ADP em ATP, acoplada ao consumo dessa força
próton-motora gerada pelo bombeamento de prótons (complexos I ao V). Essa
membrana apresenta uma elevada razão proteína/lipídeos e baixa permeabilidade a
íons e outros solutos. Além disso, a membrana interna apresenta diversas
dobraduras, denominadas cristas, cujo propósito é aumentar a área de superfície da
membrana sem aumentar o espaço ocupado pela organela dentro da célula. Essa
36
característica é relevante à função mitocondrial, fazendo com que as cristas
aumentem o potencial de geração de energia da mitocôndria sem aumentar o seu
tamanho, de forma análoga a como os giros e sulcos aumentam a área de superfície
do córtex cerebral sem aumentar o espaço ocupado pelo cérebro. Na membrana
interna, também se encontram proteínas de transporte, que transportam
seletivamente moléculas que serão utilizadas nos processos metabólicos realizados
na matriz. A membrana externa, por sua vez, é altamente permeável a moléculas
com massa molar menor ou igual a 5.000 Daltons, devido à alta quantidade de
porinas que possui (Nicholls & Ferguson, 2002).
Além de sua função na geração de energia, a mitocôndria também está
envolvida em outros processos, como metabolismo de biomoléculas (através do ciclo
do ácido cítrico), metabolismo de aminoácidos e balanço de nitrogênio (através de
parte do ciclo da ureia), metabolismo de ácidos graxos (através da β-oxidação),
sinalização, desenvolvimento, morte celular (por apoptose, necrose e autofagia), e
controle do ciclo celular e do crescimento celular, além de outros processos (Nicholls
& Ferguson, 2002; Voet & Voet, 2011). A mitocôndria também é um importante sítio
de geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) endógenos, produzidos pela
redução parcial do oxigênio molecular durante o transporte de elétrons na cadeia
respiratória (Kowaltowski et al., 2009).
Treze subunidades de 4 dos 5 complexos constituintes da fosforilação
oxidativa são codificadas no DNAmt e transcritas e traduzidas dentro da mitocôndria.
Dessa forma, a estabilidade do DNAmt é essencial para o bom funcionamento da
célula e, consequentemente, do organismo. No entanto, dados da literatura indicam
que o DNAmt acumula mutações ao longo do tempo, que podem levar à disfunção
mitocondrial, e consequente disfunção no organismo como um todo. Diversos
37
autores associam tal acúmulo de danos no DNAmt com o envelhecimento. Uma das
principais causas de dano no DNAmt, e, consequentemente, uma das causas
hipotetizadas do envelhecimento, pode ser o ataque por EROs geradas dentro da
mitocôndria (Harman, 1956). De fato, a hipótese, proposta por Denhan Harman em
1956, de que EROs eram responsáveis pelo envelhecimento, é possivelmente a
mais antiga explicação bioquímica sobre o envelhecimento. EROs são produzidos
de diversas maneiras, mas um de seus principais sítios de produção é a própria
mitocôndria. Por esse motivo, vias de reparo do DNAmt são de extrema importância,
e sua regulação pode ser um determinante da longevidade do organismo.
1.3.2. DNA mitocondrial
O genoma mitocondrial consiste em moléculas de DNA circular com um
tamanho de aproximadamente 16,5 kb (em mamíferos) e duas fitas, denominadas
fita leve (OL, do inglês light strand) e fita pesada (OH, do inglês heavy strand), que
diferem em suas massas, devido a diferentes proporções de purinas em cada
(Anderson et al., 1981). Além dos 13 polipeptídeos da forsforilação oxidativa, o
DNAmt codifica 22 RNAs transportadores (RNAt) e 2 RNAs ribossomais (RNAr). As
subunidades codificadas no DNAmt incluem 7 subunidades do Complexo I (ND1,
ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5 e ND6), uma do Complexo III (citocromo B), 3 do
Complexo IV (COXI, COXII e COXIII) e 2 do Complexo V (ATPase 6 e ATPase 8). O
DNAmt não possui íntrons entre as regiões codificadoras, e possui apenas uma
região não-codificadora conservada, a alça de deslocamento (D-loop, do inglês
displacement loop), que contém os promotores de transcrição das duas fitas (light
strand promoter, LSP; heavy strand promoter, HSP) e a origem de replicação da fita
38
pesada (OH). A origem de replicação da fita leve (OL) se encontra a cerca de 6 kb de
distância de OH (Anderson et al., 1981). A Figura 1 ilustra a organização geral do
DNAmt.
Figura 2 - Mapa do DNA mitocondrial humano. Origens de replicação das fitas pesada e leve (OH e OL); subunidades 1-6 do Complexo I (NDI-ND6); subunidades 1-3 do Complexo IV (COX1-COX3); subunidades 6 e 8 do Complexo V (ATP6 e ATP8); e citocromo b do Complexo III (Cyt b) (adaptado de Alexeyev et al., 2013)).
1.3.3. Dano no DNA mitocondrial
O DNAmt, assim como o DNA nuclear, é constantemente exposto à
diversos fatores endógenos e exógenos que podem danificá-lo. Tais danos, se não
reparados, comprometem a estabilidade genômica e podem provocar doenças,
como câncer, e perda de função da mitocôndria. Os danos provocados por EROs no
DNAmt são os mais abundantes, e, talvez consequentemente, os mais estudados.
EROs podem provocar danos em outras macromoléculas também, mas seus efeitos
no DNA podem ser mais relevantes para a célula, uma vez que mutações podem
resultar em RNAs e proteínas incorretas ou instáveis. No DNAmt, seus efeitos
39
podem ser ainda maiores do que no DNA nuclear, uma vez que o DNAmt se
encontra associado à membrana mitocondrial interna (Albring et al., 1977), principal
sítio de geração de EROs na célula, e não possui a proteção das histonas. No
entanto, vale ressaltar que TFAM (mitochondrial transcription factor A) se liga, e
parece recobrir completamente o DNAmt, e pode exercer uma função análoga às
histonas no DNA nuclear, e proteger o DNAmt de danos por EROs (Canugovi et al.,
2010).
1.3.4. Geração de espécies reativas de oxigênio
A geração intracelular de EROs pode ocorrer em diversos sítios, como nas
mitocôndrias, nos peroxissomos, no retículo endoplasmático, ou mesmo no citosol,
através de diversas reações (Holzerova & Prokisch, 2015). Em células não-imunes,
e em condições fisiológicas, o principal sítio de produção de EROs na célula é a
mitocôndria, através do vazamento de elétrons da cadeia de transporte de elétrons.
A principal ERO produzida é o radical ânion superóxido (O2 ●-), através da redução
monoeletrônica de oxigênio molecular nos complexos I e III (Kowaltowski et al.,
2009). Em meio aquoso, O2●- é relativamente pouco reativo, mas pode gerar
espécies mais reativas, como ●OH, através de reações subsequentes. O2●- é
convertido a H2O2 pela enzima superóxido dismutase (Mn-SOD e Cu,Zn-SOD) na
matriz mitocondrial e no espaço intermembranas. Em seguida, H2O2 pode ser
convertido a O2 e H2O pela enzima catalase fora das mitocôndrias (principalmente
nos peroxissomos) – embora hajam evidências de catalase em mitocôndrias de
fígado (Salvi et al., 2007) e coração (Radi et al., 1991) de ratos, ou pelos pares
redox GSSG/GSH e NADP+/NADPH, através de reações catalisadas por glutationa
40
peroxidase e redutase, e NAD+/NADH, através de reação catalisada por NADH
peroxidase (Nicholls & Ferguson, 2002). No entanto, na presença de metais de
transição, como Fe2+ e Cu3+, H2O2 pode ser reduzido, e após cisão homolítica gerar
●OH, cuja reatividade com biomoléculas é limitada apenas por sua taxa de difusão.
O radical hidroxila pode reagir de duas formas com o DNA: abstraindo
hidrogênios e se adicionando. A abstração de hidrogênios ocorre em um dos cinco
carbonos da 2’-dRP, numa ordem de preferência determinada pela acessibilidade do
carbono, de C5’ até C1’ (em ordem decrescente de preferência) (Aydogan et al.,
2002; Balasubramanian et al., 1998; J. Miller et al., 1994). Essa abstração gera um
radical no carbono atacado, que ocasiona rearranjos intramoleculares, resultando
frequentemente em quebras na fita de DNA (Breen & Murphy, 1995; Pogozelski &
Tullius, 1998). Já a adição de ●OH ocorre em ligações duplas nas bases
nitrogenadas (Sonntag, 1987) – C4, C5 e C8 em purinas, e C5 e C6 em pirimidinas.
1.3.5. Reparo de lesões no DNA mitocondrial
A mitocôndria utiliza quase todas as vias de reparo de DNA que foram
descritas no núcleo. Todas as enzimas essenciais da via BER já foram localizadas
em mitocôndrias de mamíferos, e a via foi reconstituída in vitro usando extratos
mitocondriais. Outra via de reparo já identificada em mitocôndrias é a via de
reversão direta. Tanto MGMT (do inglês O6-methyl-guanine DNA methyl
transferase), que catalisa a remoção de grupos metila em guaninas, quanto
fotoliases, que revertem dímeros de pirimidinas, já foram identificadas em
mitocôndrias de vertebrados e plantas. Evidências experimentais também indicam a
existência das vias de reparo de bases mal-pareadas (de Souza-Pinto et al., 2009),
recombinação homóloga e junção de pontas não homólogas de DNA (revisto em
41
Alexeyev et al., 2013). Não há ainda evidências na literatura acerca da existência de
reparo por excisão de nucleotídeos na mitocôndria, apesar de componentes dessa
via já terem sido identificados em mitocôndrias de mamíferos, como CSA e CSB
(Aamann et al., 2010; Kamenisch et al., 2010), e XPD (J. Liu et al., 2015). Devido a
presença de diversas cópias de DNAmt em mitocôndrias, a possibilidade que
genomas significativamente danificados, ou contendo lesões que não possam ser
reparadas, sejam degradados deve ser considerada. Entretanto, a importância
desse processo na manutenção da integridade do DNAmt ainda não está
esclarecida (revisto em Alexeyev et al., 2013).
Mecanisticamente, a via BER mitocondrial é análoga à via BER caracterizada
no núcleo, com algumas pequenas diferenças. Primeiramente, enquanto o
nucleotídeo alterado é substituído através da ação de Polβ, δ ou ε no núcleo, na
mitocôndria é Polγ que age. Adicionalmente, das 11 glicosilases, apenas 6 foram,
até o momento, localizadas nos compartimentos mitocondriais: UNG, MYH, OGG1,
NTH1, Neil1 e AAG.
Apesar da via de reparo por excisão de bases mitocondrial estar bem
caracterizada bioquimicamente, os mecanismos envolvidos na sua regulação ainda
não estão claros. A observação de que a proteína p53 pode modular a atividade de
BER mitocondrial (de Souza-Pinto et al., 2004) sugere que proteínas envolvidas na
resposta a lesões de DNA no núcleo podem também ter papéis análogos na
mitocôndria. Por outro lado, proteínas envolvidas no controle da função mitocondrial,
como mTOR, também respondem a diversos tipos de estresses que causam lesões
em DNA. Desta forma, é importante determinar se a ativação dessas vias também
modula as atividades de reparo de DNA em mitocôndrias.
42
1.4. Mechanistic Target of Rapamycin (mTOR)
mTor (mechanistic target of rapamycin, previamente mammalian target of
rapamycin) é uma proteína que foi inicialmente identificada por ser o alvo molecular
de rapamicina (conhecido clinicamente por sirolimus), um fármaco utilizado no
tratamento de diversos tipos de câncer, e que foi identificado pela primeira vez por
uma expedição à Ilha de Páscoa (conhecida no idioma nativo como Rapa Nui, de
onde provém o nome do composto) em 1964 com a finalidade de colher amostras de
solo para identificar novos agentes antimicrobianos. Em bactérias isoladas de uma
dessas amostras, foi encontrada a rapamicina, que demonstrou propriedades
imunossupressivas, antitumorais e antifúngicas (Eng et al., 1984; Martel et al., 1977;
Vezina et al., 1975). Posteriormente, descobriu-se que o mecanismo de ação da
rapamicina se dava através da formação de um complexo com FKBP12, com ganho
de função, que resultava na inibição de vias de crescimento e proliferação (Chung et
al., 1992). No entanto, apenas dois anos depois é que mTOR foi identificado como
alvo molecular do complexo rapamicina-FKBP12 (Brown et al., 1994; Sabatini et al.,
1994; Sabers et al., 1995), além de ser homólogo ao gene TOR (DRR) em leveduras
(Cafferkey et al., 1993; Heitman et al., 1991; Kunz et al., 1993).
mTOR é uma serina/treonina cinase da família PIKK (phosphatidylinositol 3-
kinase-related kinase), presente em todas as espécies de eucariotos examinadas
até hoje (Wullschleger et al., 2006), indicando um alto grau de conservação durante
a evolução. A proteína mTOR existe em dois complexos supramoleculares,
mTORC1 e mTORC2 (mTOR complex 1 e 2, respectivamente), que diferem nas
proteínas associadas a mTOR. Os dois complexos possuem papéis distintos na
43
célula. Dados experimentais indicam que mTORC1 é o principal mediador da
sinalização de disponibilidade de nutrientes e possui papel central na regulação do
crescimento celular. mTORC2, por sua vez, parece estar envolvido na organização
espacial do citoesqueleto. A atividade de mTORC1 é afetada pelos níveis de
mitógenos, energia e nutrientes, principalmente aminoácidos (Wei & Zheng, 2011).
De forma geral, maiores níveis de energia/nutrientes levam à fosforilação de
mTORC1, e consequente aumento de sua atividade, que consiste em fosforilar
proteínas que promovem o crescimento celular, ativando-as, e proteínas que
promovem a autofagia, inibindo-as. Escassez de substratos, ao contrário, leva à
inibição de mTORC1, e consequente inibição de proteínas que promovem o
crescimento celular e ativação das que promovem autofagia.
1.4.1. mTORC1
Estruturalmente mTORC1 é composto por mTOR, Raptor (regulatory protein
associated with mTOR), mLST8 (mammalian lethal with Sec13 protein 8), DEPTOR
(DEP domain containing mTOR interacting protein) e PRAS40 (proline-rich Akt
substrate of 40 kDa) (Hara et al., 2002; D. H. Kim et al., 2002; D. H. Kim et al., 2003).
A função de Raptor é ajudar a recrutar os substratos de mTOR, ao se ligar em um
motivo estrutural (TOS, de TOR signaling motif) presente em diversos de seus
substratos (Nojima et al., 2003; Schalm et al., 2003). Já mLST8 age se associando
com o domínio catalítico de mTORC1 e possivelmente estabilizando a alça de
ativação da cinase (H. Yang et al., 2013). No entanto, possivelmente mLST8 é
dispensável para as funções essenciais de mTORC1 (Guertin et al., 2006). DEPTOR
e PRAS40 agem como duas subunidades inibitórias (Peterson et al., 2009; Sancak
44
et al., 2007; Vander Haar et al., 2007; Wang et al., 2007). Estudos sobre a estrutura
de mTORC1 revelam que o complexo forma um dímero de cerca de 1-mDa, com
interface de dimerização entre sequências HEAT(um motivo estrutural composto de
repetições de duas alfa hélices ligadas por uma pequena alça, cujo acrônimo é a
inicial de quatro proteínas nas quais essa estrutura é achada: Huntingtin, elongation
factor 3 (EF3), protein phosphatase 2A (PP2A), and the yeast kinase TOR1) de
mTOR, assim como entre Raptor e mTOR (Aylett et al., 2016; Baretic et al., 2016;
Yip et al., 2010). mTORC1 é o alvo do complexo rapamicina-FKBP12, que se liga no
domínio FRB (FKBP-rapamycin binding domain) de mTOR, e age tornando a fenda
catalítica de mTOR mais estreita, dificultando o acesso de substratos ao sítio
catalítico (H. Yang et al., 2013).
À montante, mTORC1 sofre influência de diversas vias. Entre elas, inclui-se o
eixo da insulina/IGF-1, através de PI3K e Akt; os níveis de AMP e ATP, através de
AMPK; e da sinalização dos níveis de estresse, através de vias ainda pouco
caracterizadas. Todos esses sinais convergem para o complexo TSC1-TSC2, que
serve como um fator de troca de GTPase (GEF, do inglês, GTPase exchange factor)
para Rheb, que, quando ligada à GTP, ativa mTOR através de uma ligação direta
(Manning & Cantley, 2003). A sinalização dos níveis de aminoácidos não necessita
da intermediação de Rheb, pois passa por um conjunto diferente de pequenas
GTPases, RagA/B e RagC/D.
À jusante, mTORC1 exerce sua influência através de diversas proteínas e em
diversos processos, estando envolvido na síntese de proteínas, e no metabolismo de
lipídeos, aminoácidos e glicose, além da regulação da autofagia. Embora o papel de
mTORC1 na regulação da tradução seja bem conhecido, ainda não está claro como
ele afeta tipos específicos de mRNAs, mas análises de global ribosome footprinting
45
sugerem que, embora inibição aguda de mTOR suprima tradução de uma forma
geral, ela afeta mais profundamente mRNAs contendo motivos TOP-like (terminal
oligopyrimidine like), que incluem a maioria dos genes envolvidos em síntese de
proteínas (Hsieh et al., 2012; Thoreen et al., 2012). O mecanismo de ação de
mTORC1 na síntese de proteínas se dá principalmente através da fosforilação de
S6K1 (p70S6 Kinase 1) e 4EBP (eIF4E Binding Protein). S6K1 é fosforilado por
mTORC1 em um motivo hidrofóbico, Thr389, permitindo a sua fosforilação e
ativação subsequente por PDK1. S6K1 em mamíferos, assim como seus ortólogos
em outras espécies, fosforila diversas proteínas que promovem a tradução de
mRNAs, incluindo eIF4B, um regulador positivo do complexo eIF4F, que se liga ao 5’
cap (Holz et al., 2005). S6K1 também fosforila e promove a degradação de PDCD4,
um inibidor de eIF4B (Dorrello et al., 2006), e aumenta a eficiência de tradução de
mRNAs que sofreram splicing através de sua interação com SKAR, um componente
do complexo de junção de exons (Ma et al., 2008). Logo, através da fosforilação e
consequente ativação de S6K1, mTORC1 induz a biossíntese de proteínas, que
resulta em crescimento celular. Por outro lado, 4EBP tem sua função inibida através
da fosforilação por mTORC1 em múltiplos sítios, que faz com que a proteína perca
sua associação com o fator de tradução eIF4E (Brunn et al., 1997; Gingras et al.,
1999). Sem a inibição, a função de 4EBP seria de sequestrar eIF4E, impedindo a
formação do complexo eIF4F. A liberação de eIF4E, por sua vez, induz a tradução
de mRNAs dependentes de 5’-cap. Deste modo, a inibição de 4EBP por mTORC1
também contribui para o crescimento celular.
mTORC1 também influencia a autofagia, regulando-a negativamente. Desta
forma, quando mTORC1 é ativado, o crescimento celular é promovido, e a autofagia
inibida. Quando mTORC1 é desativado, o crescimento é desativado e a célula
46
aumenta a atividade autofágica, passando a reaproveitar componentes oriundos da
autofagia de moléculas defeituosas, de modo a compensar pela menor entrada de
nutrientes (revisto em Pan et al., 2012). Quando a célula possui nutrientes o
suficiente, mTORC1 fosforila ULK1, uma cinase que forma um complexo com
ATG13, ATG101 e FIP2000 e age na formação do autofagossomo. Essa fosforilação
por mTORC1 previne sua ativação por AMPK, um importante ativador da autofagia
(J. Kim et al., 2011). mTORC1 também fosforila, inibindo, TFEB (fator de transcrição
EB), responsável pelo controle da expressão de genes relacionados à biogênese de
lisossomos e de componentes da autofagia (Martina et al., 2012; Roczniak-Ferguson
et al., 2012; Settembre et al., 2012). Além disso, a inibição aguda de mTORC1
aumenta rapidamente a proteólise dependente de proteossomas através de um
aumento na ubiquitinação de proteínas (Zhao et al., 2015), ou um aumento na
abundância de chaperonas proteossomais através da inibição de Erk5 (Rousseau &
Bertolotti, 2016). Interessantemente, hiperativação genética de mTORC1 também
demonstrou sinais de aumento na atividade proteossomal, aumentando a expressão
de subunidades do proteossomo à jusante de Nrf1 (Zhang et al., 2014).
Possivelmente esse aumento na degradação de proteínas observado durante a
superativação de mTORC1 tenha ocorrido de forma a balancear o aumento na taxa
de síntese de proteínas. No entanto, pouco ainda de sabe sobre como mTORC1
regula o sistema de degradação por proteossoma-ubiquitina.
Devido a função de mTORC1 em promover o crescimento das células, é
normal que ele também esteja envolvido na regulação do metabolismo de lipídeos,
uma vez que células em crescimento necessitam de mais lipídeos para a formação
de novas membranas e a ampliação de velhas. O mecanismo de ação pelo qual
mTORC1 promove a síntese de novo de lipídeos é a fosforilação do fator de
47
transcrição SREBP (sterol responsive element binding protein), que controla a
expressão de genes envolvidos na síntese de ácidos graxos e colesterol (Porstmann
et al., 2008). Normalmente, SREBP é ativado quando os níveis de esteróis estão
muito baixos. No entanto, mTORC1 é capaz de ativar SREBP por outras vias, uma
dependente de S6K1 (Duvel et al., 2010), e outra pela fosforilação de Lipin1, que
inibe SREBP quando não fosforilado por mTORC1 (Peterson et al., 2011).
Similarmente à necessidade de células em crescimento de produzirem mais
lipídeos, a necessidade de nucleotídeos durante o crescimento celular também é
aumentada. Na síntese de nucleotídeos, mTORC1 age através da fosforilação, por
meio de S6K1, de CAD (carbamoil fosfato sintase), um componente importante da
via de síntese de novo de pirimidinas (Ben-Sahra et al., 2013; Robitaille et al., 2013).
Na síntese de purinas, mTORC1 age através do aumento da expressão de MTHFD2
dependente de ATF4, um componente importante do ciclo de tetrahidrofolato
presente nas mitocôndrias, que produz unidades de um-carbono para a síntese de
purinas (Ben-Sahra et al., 2016).
Em relação ao metabolismo de glicose, mTORC1 promove uma alteração no
balanço do metabolismo de forma a favorecer a glicólise ao invés da fosforilação
oxidativa. De fato, superativação de mTORC1 em células cancerígenas parece ser
um importante contribuinte para a ocorrência do efeito Warburg (Courtnay et al.,
2015). mTORC1 aumenta a transcrição do fator de transcrição HIF1α, que promove
a tradução de diversas enzimas envolvidas na glicólise, como PFK (fosfofruto
cinase) (Duvel et al., 2010). A ativação de SREBP por mTORC1 também age
aumentando o fluxo através da via de pentose fosfato, que gera NADPH e outros
metabolitos intermediários necessários para o crescimento e proliferação.
48
1.4.2. mTORC2
Diferentemente de mTORC1, mTORC2 é insensível à rapamicina, embora
tratamento prolongado com rapamicina iniba mTORC2 indiretamente, possivelmente
através da impossibilidade de mTORs ligados a rapamicina serem incorporados na
formação de novos complexos mTORC2 (Lamming et al., 2012; Sarbassov et al.,
2006). mTORC2 também possui mTOR, mLST8 e DEPTOR (Peterson et al., 2009).
No entanto, no lugar de Raptor, mTORC2 possui Rictor (rapamycin insensitive
companion of mTOR) (Jacinto et al., 2004; Sarbassov et al., 2004). Adicionalmente,
mTORC2 possui outras subunidades regulatórias: mSin1 (Frias et al., 2006; Jacinto
et al., 2006; Q. Yang et al., 2006) e Protor1/2 (Pearce et al., 2007; Thedieck et al.,
2007; Woo et al., 2007).
Enquanto mTORC1 possui um papel central na regulação do crescimento e
do metabolismo, mTORC2 age na regulação da proliferação e da sobrevivência,
principalmente através da fosforilação de diversas enzimas membros da família AGC
(nomeada assim por causa das proteínas cinases das famílias A, G e C -
PKA/PKG/PKC) de proteínas cinases. Através da fosforilação de PKCα, mTORC2
regula o citoesqueleto de actina (Jacinto et al., 2004; Sarbassov et al., 2004).
mTORC2 também fosforila PKCδ (Gan et al., 2012), PKCγ, PKCε (Thomanetz et al.,
2013) e PKCζ (X. Li & Gao, 2014), todas proteínas envolvidas em diversos aspectos
do remodelamento do citoesqueleto e da migração celular. SGK1, outra cinase da
família AGC, também é fosforilada por mTORC2, ativando-a, e regulando o
transporte de íons e a sobrevivência celular (Garcia-Martinez & Alessi, 2008). Outra
função importante de mTORC2 é a fosforilação e ativação de Akt (Sarbassov et al.,
49
2005), promovendo sobrevivência, proliferação e crescimento celular através da
fosforilação e inibição de outras proteínas, entre elas GSK3β (um regulador do
metabolismo), TSC2 (um inibidor de mTORC1) e FoxO1/3a (um fator de transcrição
envolvido em sobrevivência e proliferação celular). Fosforilação de Akt por mTORC2
parece ser essencial para a fosforilação de alguns substratos in vivo, como
FoxO1/3a, mas não para outros, como TSC2 (Guertin et al., 2006; Jacinto et al.,
2006).
1.4.3. mTOR e envelhecimento
Devido ao seu papel central na regulação do metabolismo e da resposta a
estresses, alguns autores propuseram que mTOR tem um papel importante no
processo de envelhecimento, e sua regulação poderia ser um dos mecanismos
pelos quais agem os efeitos de extensão da longevidade observados em condições
de restrição de calorias. Deste modo, a inibição de mTOR teria efeitos
prolongadores na longevidade (Blagosklonny, 2006).
As primeiras evidências do papel de mTOR no envelhecimento vieram de
estudos em C. elegans, aonde a expressão reduzida de homólogos de mTOR
(ceTOR, conhecido previamente como let-363) ou Raptor (daf-15) levou a um
aumento na longevidade dos organismos (Jia et al., 2004; Vellai et al., 2003).
Resultados semelhantes foram obtidos em Drosophila (Kapahi et al., 2004), levedura
(Kaeberlein et al., 2005) e camundongos (Anisimov et al., 2010; C. Chen et al., 2009;
Harrison et al., 2009; Lamming et al., 2012; R. A. Miller et al., 2011; Wilkinson et al.,
2012; Wu et al., 2013). De fato, rapamicina é o único composto farmacológico
conhecido até o momento capaz de aumentar a expectativa de vida máxima nesses
50
modelos com evidências consistentes (Bjedov et al., 2010; Harrison et al., 2009;
Powers et al., 2006; Robida-Stubbs et al., 2012). Adicionalmente, Drosophila,
leveduras, e C. elegans com redução na atividade de mTOR, não apresentam
aumento da longevidade em regimes de restrição calórica (Hansen et al., 2007;
Kaeberlein et al., 2005; Kapahi et al., 2004). Isso é relevante, uma vez que restrição
calórica é a única outra intervenção que tem demonstrado uma capacidade de
aumentar a longevidade de forma consistente em uma gama diversa de organismos.
Não surpreendentemente, devido ao papel de mTOR como sensor de nutrientes e
energia, muitos especularam desde cedo que o mecanismo pelo qual a restrição
calórica aumenta a longevidade nos seres vivos envolveria mTOR. Tais resultados
suportam essa hipótese. No entanto, os mecanismos exatos pelos quais mTOR
aumenta a longevidade ainda não são completamente compreendidos. Uma
possibilidade é que a diminuição do crescimento, e consequente menor tradução
generalizada, diminua a taxa com que produtos indesejados se acumulem nas
células, como EROs e proteínas danificadas, simplesmente fazendo com que as
células demorem mais para se desgastarem. Outra possibilidade é que o maior nível
de autofagia promovido por níveis menores de mTOR seja responsável por reciclar
componentes defeituosos, como proteínas e organelas, mantendo o estado de
funcionamento da célula melhor. Uma terceira hipótese é ainda a de que o efeito
prolongador da vida promovido pela inibição de mTOR seria resultado de uma
melhora na capacidade de autorrenovação de células-tronco, como evidenciado pela
melhora na capacidade de autorrenovação de células-tronco hematopoiéticas e
intestinais em camundongos (C. Chen et al., 2009; Yilmaz et al., 2012). Tal
argumento está em linha com a hipótese de que a perda da capacidade de
renovação de células-tronco é um ponto chave no envelhecimento, uma vez que,
51
teoricamente, a quantidade e natureza dos danos acumulados em tecidos não
importaria, uma vez que, ao atingirem um estado crítico, as células danificadas
poderiam ser repostas por células novas e sem defeitos, advindas da divisão de
células-tronco.
Por fim, dados os efeitos registrados de mTOR no envelhecimento, é natural
que muitos tenham aventado a possibilidade de utilizar inibidores de mTOR como
fármacos para amentar a longevidade. Enquanto que tal intervenção poderia
apresentar uma série de possíveis efeitos colaterais, como imunossupressão e
intolerância a glicose, um teste clínico recente com tratamento de idosos com
everolimus, um derivado de rapamicina, se mostrou seguro, além de apresentar uma
melhora na função imune (Mannick et al., 2014). Outros regimes de dosagem
alternativos também foram propostos que talvez possam aumentar a longevidade
com efeitos colaterais reduzidos (Arriola Apelo et al., 2016). Os últimos anos viram
um aumento no desenvolvimento de derivados da rapamicina, conhecidos como
“rapalogs” (rapamycin and its analogs), com o objetivo de tornar a inibição de mTOR
mais eficiente, e/ou isolar a inibição de mTORC1 da de mTORC2, aumentando a
possibilidade de descobrimento de algum análogo que seja mais seguro para
consumo humano.
1.4.4. Efeitos de mTOR na mitocôndria
mTORC1 regula diretamente a biogênese e o turnover mitocondrial em
mamíferos e em outros organismos modelo inferiores. Em músculos esqueléticos de
ratos, rapamicina reduz a expressão de genes que codificam componentes da
fosforilação oxidativa, através da redução da expressão de reguladores da
52
transcrição de proteínas mitocondriais, como PGC1α e NRF-1 (Cunningham et al.,
2007). Outras evidências também apontam para um envolvimento de mTOR no
metabolismo mitocondrial. Inibição do complexo mTORC1 por meios farmacológicos
ou genéticos resulta em uma diminuição dos níveis de respiração mitocondrial e da
respiração desacoplada, induzindo um estado de dependência aumentada da
glicólise aeróbica (Schieke et al., 2006). Além disso, mTOR também pode estar
envolvido no controle da apoptose, uma vez que se encontra em complexo com
VDAC1 e Bcl-xl, proteínas evolvidas no controle da apoptose, na membrana
mitocondrial externa (Ramanathan & Schreiber, 2009). Todas essas evidências
apontam para um papel importante de mTOR na mitocôndria. De fato, um aumento
da mitofagia foi observado em modelos celulares que portavam um DNAmt com uma
mutação patogênica após a administração de rapamicina, resultando na redução de
DNAmt mutado e no reestabelecimento parcial dos níveis de ATP (Dai et al., 2014).
Deste modo, a investigação dos efeitos da inibição de mTOR na mitocôndria,
principalmente nos aspectos concernentes ao reparo do DNAmt, são de extrema
importância para a elucidação dos mecanismos que regulam o processo de
envelhecimento.
1.4.5. mTOR e reparo de DNA
Algumas evidências apontam para um papel de mTOR na modulação dos
níveis de reparo de DNA. A inibição de mTOR por KU0063794 causa um aumento
nos níveis proteicos de MGMT (O-6-methylguanine-DNA methyltransferase) em
células de glioblastoma T98G in vitro, muito embora a inibição cause uma
diminuição dos níveis globais de síntese de proteínas (Smalley et al., 2014), o que
53
parece indicar que a regulação da síntese de MGMT se dá por meios alternativos, e
pode ser ativada em condições de estresse. Por outro lado, em células de câncer de
mama MCF7, inibição de mTOR através do tratamento com rapamicina resulta em
uma supressão significativa de recombinação homóloga e de NHEJ, dois
mecanismos utilizados no reparo de quebras de fita dupla induzidas por radiação
ionizante (H. Chen et al., 2011). Essa supressão é condizente com observações
anteriores de que inibidores de mTOR possuem efeito radiossensibilizador (Albert et
al., 2006; Ekshyyan et al., 2009). Além disso, vias de resposta a danos no DNA
inibem mTORC1 através da indução de genes regulados por p53, incluindo PTEN,
TSC2 e AMPKβ, uma subunidade regulatória de AMPK, todos aumentando a
atividade de TSC, com consequente inibição de mTORC1 (Feng et al., 2007). Por
fim, evidências apontam para o envolvimento de mTORC1 na regulação da
expressão de NDRG1 (N-myc downstream-regulated gene 1), além de MGMT, em
algumas linhagens de camundongos com alta longevidade (Dominick et al., 2017),
supostamente através da regulação do complexo CCR4-NOT, um regulador pós-
transcricional. Maior expressão de NDRG1 parece estar associada com melhorias no
reparo de DNA, através de uma maior estabilidade de MGMT (Weiler et al., 2014).
Entretanto, apesar da importância histórica das teorias de envelhecimento por
alterações no DNA, e da importância atual do papel de mTOR no processo, devido
as evidências acumuladas, o estudo da relação entre atividades de reparo de DNA e
mTOR foi apenas timidamente explorado. Em relação ao DNA mitocondrial,
aparentemente nada foi produzido ainda. Desta forma, o papel dessa proteína na
regulação de reparo em mitocôndrias, uma organela cuja função é diretamente
afetada pela cascata de sinalização de mTOR, ainda não foi investigado, o que torna
54
essa uma área de investigação relevante para o entendimento dos processos que
ocorrem em organismos vivos, em especial o envelhecimento.
55
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
Dado o envolvimento de mTOR na regulação da taxa de envelhecimento -
dentro de certo limite - e o papel teórico das alterações no DNA, tanto nuclear como
mitocondrial, proposto para o envelhecimento, decidimos investigar a interface entre
esses dois fenômenos; ou seja, este estudo teve o objetivo de investigar se parte do
efeito protetor conferido por uma sinalização menor de mTOR durante o
envelhecimento poderia se dar por meio de uma maior proteção ao genoma, dando
especial atenção ao genoma mitocondrial.
2.2. Objetivos específicos
1. Avaliar os níveis de expressão e atividade de enzimas da via de reparo por
excisão de bases em células com menor expressão de mTOR, com o
objetivo de estabelecer o mecanismo pelo qual mTOR pode participar da
manutenção da estabilidade do DNAmt;
2. Investigar as alterações metabólicas provocadas pela variação na expressão
de mTOR, assim como variações no número de cópias de DNAmt e massa
mitocondrial;
3. Determinar a citotoxicidade de agentes que induzem estresse oxidativo
mitocondrial, com o objetivo de determinar se a diminuição nos níveis de
mTOR protege as células de agentes que causam lesões oxidativas em DNA
mitocondrial.
56
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Modelos utilizados
3.1.1. Células HEK293T
As células HEK293T utilizadas nos experimentos foram obtidas através de
uma doação do Laboratory of Molecular Gerontology, NIA, NIH, EUA. As células
tiveram a expressão do gene mTOR silenciada em um projeto anterior (Dias, 2013),
através da transfecção das células com vetores plasmidiais expressando short
hairpin RNAs (shRNAs) específicos para o gene (Origene, USA – número de acesso:
TF320364). Adicionalmente, células transfectadas com plasmídeos com sequências
embaralhadas foram utilizadas como controle.
3.1.2. Fígado de camundongos
Com o intuito de complementar algumas análises feitas no projeto, foram
utilizadas amostras de fígado de camundongo cedidas pelo professor William
Festuccia, do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. As
amostras de fígado eram oriundas de camundongos C57BL/6J, com deleção tecido-
específica dos genes TSC e Raptor, resultando em superativação e silenciamento
de mTORC1, respectivamente. Uma amostra controle também foi disponibilizada. Os
experimentos envolvendo manipulação animal foram realizados no laboratório do
Prof. Festuccia, e foram aprovados pela CEUA-ICB, sob número 115/2016.
57
3.2. Cultivo celular
As células foram rotineiramente cultivadas em meio de cultura Dulbeco’s
Modified Eagle Medium – DMEM contendo 25 mM de glicose (LGC Biotecnologia),
10% de soro fetal bovino (GIBCO), 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de
streptomicina. O meio de cultura contendo todos esses aditivos passa, então, a ser
denominado meio completo. As culturas foram mantidas em incubadoras a 37°C e a
5% de CO2, em uma atmosfera úmida.
A manutenção da cultura foi realizada sempre que a mesma atingiu 80 a 90%
de confluência. O procedimento se deu através da remoção do meio por sucção,
utilizando pipetas Pasteur acopladas em bomba a vácuo, seguido por lavagem da
cultura com Phosphate Buffered Saline – PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4
8 mM, KH2PO4 1,5 mM pH 7,6) estéril a 37°C. Após isso, as células foram
dissociadas pela adição de 300 µL de tripsina 0,25% (m/v) (em PBS+ vermelho de
fenol) a 37°C por cerca de 2 minutos ou até se desprenderem do substrato onde
estavam sendo cultivadas. Por fim, as células foram ressuspendidas em meio
completo, diluídas de 5 a 10 vezes e novamente plaqueadas e mantidas em
incubadora. Denominamos esse procedimento padrão de repicagem.
3.3. Seleção clonal
De modo a reduzir a variação genética na população de células com
expressão reduzida de mTOR, e, consequentemente, as variações experimentais,
foram clonadas duas linhagens para os experimentos: uma transfectada com shRNA
para o gene mTOR, e outra que havia sido transfectada com um plasmídio contendo
uma sequência embaralhada (scrambled), com o intuito de servir como controle.
58
Para tal, as células de cada linhagem foram semeadas em uma densidade de
aproximadamente 1 célula/poço em placas de 96 poços, e cultivadas em meio
completo seguindo o procedimento padrão. Devido à baixa quantidade de células,
alguns poços ficaram sem células, e outros com uma ou poucas células. As placas
foram então mantidas em uma incubadora por cerca de 10 dias, e, então,
observadas no microscópio. O número de células presentes originalmente no poço,
durante o plaqueamento, foi identificado com base no número de colônias em cada
poço, uma vez que cada célula semeada forma uma colônia ao seu redor. Os poços
com uma única colônia tiveram suas células suspendidas e passadas para uma
placa de 24 poços, para que fosse possível uma expansão maior. O procedimento
foi repetido, passando-se as células para uma placa de 6 poços assim que o poço
atingiu confluência. Por fim, as células foram transferidas para garrafas para serem
cultivadas de forma regular.
3.4. Isolamento de mitocôndrias
As frações mitocondriais foram isoladas conforme descrito em Maynard et al.
(2010). Cada linhagem foi cultivada em meio completo em 50 placas de Petri de 150
cm² até atingirem confluência de 80-90%. Todas as etapas do procedimento de
isolamento foram realizadas a 4 °C. As células foram removidas das placas com o
auxílio de um cell scraper e colocadas em um único tubo para cada linhagem. A
seguir, as suspensões celulares foram centrifugadas a 5.000 g por 10 minutos, e o
sobrenadante descartado. Os precipitados foram lavados em tampão MSHE (0,21 M
manitol, 70 mM sacarose, 10 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 1 mM EGTA, 2 mM EDTA,
0,15 mM spermina, 0,75 mM spermidina, 5 mM DTT, 1x inibidor de proteases
59
(Roche)). A seguir, os precipitados foram ressuspensos em 1 volume de MSHE, e
foram acrescentadas pequenas alíquotas de 10 μL de uma solução de digitonina 5%
em DMSO, até que cerca de 90-95% das células estivessem permeáveis ao corante
vital azul de tripan. A permeabilização foi acompanhada em uma câmera de
Neubauer. Após confirmada a permeabilização, as células foram homogeneizadas
utilizando cerca de 20 passagens do pistão de um homogeneizador vidro-vidro do
tipo Potter. A suspensão resultante foi então transferida para um tubo e centrifugada
a 700 g por 12 min. O sobrenadante foi transferido para outro tubo, e centrifugado a
9.000 g por 10 minutos; o precipitado, composto por células intactas e núcleos, foi
armazenado a -80 °C. Uma alíquota do sobrenadante da última centrifugação,
contendo a fração citosólica, foi armazenada a -80 °C; o precipitado, contendo a
primeira fração mitocondrial crua, foi ressuspenso em 0,5 mL de 1:1 (vol:vol)
Percoll:2xMSHE. Essa solução foi então cuidadosamente adicionada em cima de
uma solução 1:1 (vol:vol) Percoll:2xMSHE em um tubo de ultracentrifugação de 12
mL. As amostras foram então centrifugadas em uma ultra centrífuga Beckman com
rotor 70Ti a 50.000 g por 1h10min. A banda contendo a fração mitocondrial foi então
cuidadosamente removida e transferida para outro tubo, e a amostra resultante
sofreu uma lavagem final com 10 mL MSHE a 5.000 g por 10 minutos, com o intuito
de remover o Percoll. Por fim, o sobrenadante foi removido, e os precipitados
contendo as amostras mitocondriais foram armazenadas a -80 °C até o momento de
uso.
60
3.5. Preparação de extratos proteicos
3.5.1. Extratos proteicos para western blot
As células em cultura foram ressuspendidas através do procedimento de
repicagem, e em seguida centrifugadas a 700 g por 10 minutos para que se
precipitassem. O sobrenadante foi então removido, e as células precipitadas foram
ressuspendidas em PBS, e novamente centrifugadas nas mesmas condições, de
modo a lavar as células, eliminando os componentes do meio completo que
poderiam interferir na quantificação exata da concentração de proteínas. Após a
centrifugação, o sobrenadante foi removido, e as células precipitadas foram
armazenadas a -20°C até o momento da extração.
Os passos descritos a seguir para a extração de proteínas para western blot
foram utilizados tanto para a extração de proteínas de células, coletadas conforme
descrito no parágrafo anterior, quanto para a extração de proteínas de mitocôndrias
isoladas, coletadas conforme descrito na seção anterior. As amostras (células ou
mitocôndrias isoladas) foram descongeladas em gelo e ressuspendidas em 2-5
volumes de tampão de extração RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM; SDS
0,05%; desoxicolato de sódio 0,5%; NP40 0,5%) acrescido de inibidor de proteases
(Protease inhibitor cocktail tablets (Roche) ou PMSF 1 mM). As amostras suspensas
em RIPA foram deixadas por 30 minutos no gelo, e, após isso, centrifugadas a
16.000 g durante 10 minutos. Ao final da centrifugação, o sobrenadante contendo as
proteínas foi coletado.
61
3.5.2. Extratos proteicos para ensaio de atividade enzimática
Os extratos proteicos para os ensaios de atividade enzimática foram
preparados de forma distinta dos extratos para western blot, com a finalidade de
preservar a atividade das enzimas. Para isso, as amostras foram suspensas em um
tampão contendo 20 mM Hepes-KOH (pH 7.0), 150 mM KCl, 2 mM EDTA, 1% Triton
X-100 (Promega), e inibidor de protease (Roche); e incubadas por 1 h a 4°C, sob
agitação. Ao fim da incubação, as amostras foram centrifugadas a 50.000 g por 1 h a
4°C. Os sobrenadantes foram, então, coletados, e foi adicionado glicerol até uma
concentração de 10% da solução final, e armazenados a -80°C.
3.5.3. Quantificação da concentração de proteínas nas amostras
Os extratos proteicos produzidos através dos métodos de extração descritos
anteriormente tiveram suas concentrações de proteínas totais quantificadas através
de um de dois métodos a seguir, dependendo da disponibilidade de reagentes:
Lowry et al. (1951) e Bradford (1976).
Em ambos os casos, foi utilizada uma microplaca transparente de 96 poços
(Greiner Bio-one, Brasil), e a leitura das absorbâncias foi realizada em um
espectrofotômetro SpectraMax M3 (Molecular Devices). No método de Lowry, foram
utilizados os reagentes Folin-Ciocalteu e Biureto, e a leitura da absorbância foi feita
a 650 nm. No método de Bradford, as proteínas foram quantificadas utilizando o
reagente de Bradford (Quick Start™ Bradford 1x Dye Reagent, Bio-Rad) segundo
recomendações do fabricante, e a leitura da absorbância foi feita a 595 nm. A curva-
padrão para a quantificação de proteínas foi construída utilizando BSA, nos dois
casos.
62
3.5.4. Concentração de amostras
Extratos proteicos com concentrações muito baixas para utilização em
Western Blots foram concentradas utilizando o kit Amicon® Ultra Centrifugal Filters
(Millipore), seguindo as recomendações do fabricante.
3.6. Western Blot
Para identificação dos níveis de proteínas de interesse nas amostras, foi
utilizada a técnica de western blot, cujo procedimento é descrito a seguir.
Inicialmente, as proteínas nas amostras foram separadas por tamanho
utilizando uma eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS -
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). Para tal, foram preparados géis com diferentes
porcentagens de poliacrilamida (8%, 10% ou 12%), dependendo do tamanho da
proteína a ser analisada. Em seguida, as amostras misturadas com tampão de
amostra (Tris-Cl 300 mM, pH 6,8, SDS 10%, glicerol 50%, β-mercaptoetanol 25%,
azul de bromofenol 0,1 % (m/v)) foram aquecidas a 95°C por 5 minutos, com a
finalidade de desnaturar as proteínas e permitir que (i) a estrutura terciária das
proteínas não afete a migração pelo gel, e (ii) que o SDS possa envolver toda a
cadeia polipeptídica conferindo à proteína uma carga negativa proporcional ao seu
comprimento. As amostras desnaturadas foram então aplicadas no gel de
poliacrilamida, semi-imerso em tampão de corrida Novex® Tris-Glicina SDS
(Invitrogen®), em quantidades entre 5 a 40 µg de proteína total, dependendo da
proteína analisada, e foi aplicada uma voltagem de 125 V por 1h30. Desta forma, as
proteínas envolvidas por uma carga negativa migraram em direção ao polo positivo
63
através dos poros do gel de poliacrilamida, com velocidade proporcionalmente
inversa ao tamanho da cadeia.
Após separadas, as proteínas foram eletroforéticamente transferidas para
uma membrana de PVDF a 100 V, por 4h, enquanto imersas em tampão de
transferência Novex® Tris-Glicina (Invitrogen®), contendo 10% (vol:vol) metanol. Com
as proteínas ligadas à superfície da membrana, o acesso dos anticorpos é mais fácil
do que seria se elas estivessem no interior do gel de poliacrilamida. Após a
transferência, sítios de ligação de proteínas inespecíficos foram bloqueadas pela
incubação em solução 5% de leite em pó desnatado em TBS-Tween 0,05% (Tris-Cl
20 mM, NaCl 150 mM, Tween® 20 0,05%, pH 7,4), por 1h a temperatura ambiente.
Ao final do bloqueio, a membrana foi incubada com anticorpos específicos
para cada proteína analisada, em 1% de leite em pó desnatado em TBS-Tween
0,05%, overnight, a 4°C, sob agitação leve. A membrana foi, então, lavada três
vezes, por 5 minutos, com TBS-Tween 0,05%, e incubada com anticorpos
secundários fluorescentes em 1% de leite em pó desnatado em TBS-Tween 0,05%,
por 1h a temperatura ambiente, sob agitação leve, e protegidas da luz. Por fim, a
membrana foi lavada 3 vezes com 20 mL de TBS-Tween 0,05%, por 15 minutos
cada, e as bandas das proteínas detectadas através da utilização do equipamento
Odyssey Li-Cor.
64
3.7. RT-qPCR – Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction
3.7.1. Análise dos níveis de expressão gênica
As amostras contendo as células a serem analisadas tiveram seu RNA
extraído com o kit RNeasy Micro Kit, Qiagen©, segundo recomendações do
fabricante. Todas as amostras foram tratadas com 8 U de RNase-free DNase I
(Ambion®) por 15 min a 30 °C, para eliminar o DNA nas amostras.
Em seguida, o cDNA correspondente foi preparado utilizando o kit High
Capacity cDNA Reverse Transcription® (Applied Biosystems®). Para cada 20 μL de
reação foi adicionado 2 μg de RNA. As amostras foram inicialmente aquecidas a 25
°C por 10 min e a reação ocorreu a 50 °C por 2 h, terminando com um aquecimento
por 15 min a 75 °C, com a finalidade de inativar a transcriptase reversa. Todas as
amostras foram tratadas com 5 U de RNase H (DNase-free – Ambion®) por 30 min a
37 °C, que degrada RNA de duplex RNA:DNA restando somente o cDNA
sintetizado. A RNase H foi inativada por aquecimento durante 10 min a 72 °C.
Os níveis de mRNA foram medidos por RT-qPCR, com primers específicos
para os mRNAs dos genes de interesse, e utilizando HPRT como gene
normalizador. As reações foram realizadas com o kit 2X SYBR® Green PCR Master
Mix (Applied Biosystem®). Cada 25 μL de reação continha 12,5 μL 2X SYBR®
Green PCR Master Mix, 5 pmoles de cada iniciador e 100 ng de cDNA molde. As
reações e leituras foram realizadas no equipamento 7300 Real Time PCR System
(Applied Biosystems®).
A sequência dos iniciadores utilizados é apresentada na Tabela 1 abaixo:
65
Tabela 1 – Sequências dos iniciadores utilizados para análise de expressão gênica.
Primer Sequência de nucleotídeos
mTOR Forward CTCAACATCGAGCATCGCATCATG mTOR Reverse ACCAGAAAGGGCACCAGCCAATATAG APE1 Forward ACAAAGAGGCAGCAGGAG APE1 Reverse GAGGTCTCCACACA HPRT1 Forward TGACATGTGCCGCCTGCGAG HPRT1 Reverse GTGGTCGCTTTCCGTGCCGA
Todas as reações no experimento foram feitas em triplicata. O limiar para
detecção da fluorescência foi ajustado manualmente, e o ciclo aonde a fluorescência
cruza o limiar - Ct (cycle threshold) – foi utilizado na comparação das amostras. A
comparação foi feita através do método ΔΔCt (Pfaffl, 2001), considerando a
eficiência da reação e os valores de Ct, de acordo com a equação a seguir:
ΔΔCt𝑎𝑙𝑣𝑜/𝑟𝑒𝑓 =𝐸𝑎𝑙𝑣𝑜
ΔCt alvo(controle−inquirido)
𝐸𝑟𝑒𝑓ΔCt ref(controle−inquirido)
onde: E é a eficiência da reação de cada par de iniciadores, ΔCt é diferença entre os
Ct, alvo é o gene cuja expressão se deseja analisar, ref é o gene normalizador,
controle é a linhagem celular controle, e inquirido é a linhagem celular experimental.
O teste estatístico usado para comparar as médias dos valores de ΔΔCt foi o
teste t de Student para observações não-pareadas. Foi estabelecido o valor de
p<0,05 como suficiente para existir uma diferença estatística significativa.
66
3.7.2. Quantificação do número de cópias de DNA mitocondrial
Para a quantificação do número de cópias de DNAmt, o DNA total das células
em cultura foi extraído com o kit Dneasy Blood and Tissue (Qiagen, Alemanha). O
DNA, ao final da extração, foi suspenso em 100 µl de tampão AE, fornecido
juntamente com o kit utilizado, e quantificado em espectrofotômetro NanoDrop 1000
Spectrophotometer (Thermo Scientific) a 260 nm. As reações de RT-qPCR (volume
final de 25 µl) foram montadas utilizando, cada uma, 20 ng de DNA total e a mistura
de reagentes provida pelo Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied
Biosystems, EUA). Os experimentos foram realizados no equipamento 7300 Real
Time PCR System (Applied Biosystems, EUA).
A sequência dos iniciadores utilizados é apresentada na tabela 2 abaixo:
Tabela 2 – Sequências dos iniciadores utilizados para análise do número de cópias de DNAmt.
Primer Sequência de nucleotídeos
ND1 Forward ACTACGCAAAGGCCCCAACG ND1 Reverse GAGCTAAGGTCGGGGCGGTG HPRT1 Forward TGACATGTGCCGCCTGCGAG HPRT1 Reverse GTGGTCGCTTTCCGTGCCGA
3.8. Medida de parâmetros bioenergéticos
De modo a se medir as alterações causadas pela diminuição da expressão do
gene mTOR no metabolismo das células, foram realizadas medidas da taxa de
consumo de oxigênio e de acidificação do meio de cultura em células aderidas,
utilizando o equipamento Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyser (Seahorse
Bioscience, EUA). O equipamento possui dois sistemas de detecção, sensíveis a
mudanças de pH e concentração de oxigênio no meio de cultura. A taxa de
acidificação do meio extracelular é proporcional à taxa de produção de lactato pela
67
glicólise, funcionando, portanto, como uma medida da atividade desta via. O eletrodo
de oxigênio mede a concentração de oxigênio dissolvido no meio extracelular, que é
diretamente proporcional ao consumo de oxigênio pelas células, e permite inferir a
taxa de fosforilação oxidativa.
As células foram semeadas em XF24-well cell culture microplates
numa densidade de 3x104 células/poço e incubadas por 24 horas a 37°C. Foi
utilizado meio de cultura DMEM completo contendo 10mM de glicose, suplementado
com piruvato e uridina na concentração final de 0,1 g/l. Antes do ensaio no
Seahorse, as células foram incubadas por 1 hora sem CO2 em meio completo sem
bicarbonato de sódio. Uma vez dentro do equipamento, todo o processo é
automatizado, iniciando-se na ausência de inibidores da respiração mitocôndria para
estabelecer a taxa de consumo de oxigênio basal. Medidas adicionais são realizadas
após a injeção de quatro compostos que afetam a capacidade bioenergética das
células: oligomicina (1 µM) na porta A, CCCP (1 µM) na porta B, e antimicina e
rotenona (ambos 1 µM) nas portas C e D, injetados ao mesmo tempo. O
experimento foi realizado medindo-se simultaneamente as taxas de consumo de
oxigênio e a acidificação do meio em tempo real.
3.9. Atividade de Citrato Sintase
A atividade de citrato sintase (EC 2.3.3.1) foi analisada conforme descrito em
Hansford and Castro (1982). Nesse ensaio, foi adicionado um volume final de 190 μL
de solução em cada poço de uma placa de 96 poços. A solução final continha Tris-
HCl 0,1 M, pH 8,1, acetil-CoA 300 μM, DTNB 100 μM, oxaloacetato 500 μM, Triton
X-100 0,1% (m/v). A reação foi iniciada através da adição de 2 μL de extrato proteico
68
na concentração de 4 mg/mL (8 μg de proteína por poço). A atividade de citrato
sintase foi medida no leitor de microplacas SpectraMax 190 (Molecular Devices©),
no comprimento de onda de 412 nm, com uma leitura a cada 19 segundos (sendo 15
s para aquisição, 3 s para agitação e 1 s de espera), durante 5 min a 30 °C. A
atividade enzimática foi estimada através da formação do DNTB-CoA derivado da
reação e o valor foi calculado a partir do coeficiente de extinção molar do TNB
(ε=13,6∙10-6 M-1∙cm-1 ou 13,6 μM-1∙cm-1) e ajustado a fim de representar o número
de mols de citrato formado por min por miligrama de proteína (nmol/min/mg).
3.10. Ensaio de incisão de APE1
A atividade da enzima APE1 foi avaliada utilizando um ensaio in vitro. O
substrato utilizado foi um oligonucleotídeo com 30 pares de base que contém um
único tetrahidrofurano, um análogo estrutural ao sítio abásico que é reconhecido e
processado por APE1. O substrato foi sintetizado pela Midland Certified Reagent
Company Inc. (Midland, TX, EUA). A sequência do substrato utilizado nesse estudo
é apresentada na Tabela 3, sendo que a modificação que torna a sequência
substrato para a enzima está destacada em negrito.
TABELA 3 - Sequência do substrato de APE1. F representa tetrahidrofurano, substituto do sitio
abásico.
Enzima Sequência de nucleotídeos do substrato
APE1 5’-ATA TAC CGC GG(F) CGG CCG ATC AAG CTT ATT
3’-TAT ATG GCG CC G GCC GGC TAG TTC GAA TAA
69
O oligonúcleotídeo utilizado como substrato foi marcado fluorimetricamente na
extremidade 3’ com Alexa Fluor® 647-aha-dCTP (A32771 – Molecular Probes)
conforme descrito em Soltys et al. (2015).
O ensaio de incisão foi realizado conforme descrito em Weissman et al.
(2007). As reações continham: 25 mM Hepes–KOH (pH 7.4), 25 mM KCl, 0.1 mg/ml
BSA, 5 mM MgCl2, 10% glicerol, 0,05% Triton X-100 e 25 ng de extrato. As reações
foram iniciadas pela adição de 50 fmoles de substrato, e incubadas a 37°C por 15
min. Após o período de incubação, as reações foram finalizadas através do
aquecimento das amostras a 90°C por 10 minutos, com a finalidade de interromper a
reação enzimática. Em seguida, foi adicionado tampão de amostra (95% formamida
Hi-Di, 5 mM EDTA) e todas as amostras foram desnaturadas por 5 min a 80°C. Por
fim, as amostras foram aplicadas em um gel desnaturante de acrilamida (23%
acrilamida e 7 M de ureia, em tampão TBE - 0,22 M Tris-HCl; 0,18 M ácido bórico; 5
mM EDTA; pH 8,3), e submetidas a uma tensão de 15 W por 2 h, enquanto semi-
imersas em tampão TBE, com a finalidade de promover a migração dos
oligonucleotídeos em direção ao polo positivo, e separar oligonucleotídeos clivados
(menores, e com migração mais rápida) de não clivados (maiores, e de migração
mas lenta). Os géis foram então revelados em scanner de imagens Typhoon TRIO
(GE Healthcare) e quantificados usando o software ImageQuant (GE Healthcare).
3.11. Proliferação celular após tratamento com azul de metileno
fotossensibilizado
De modo a avaliar o efeito citostático e citotóxico do tratamento com azul de
metileno (AM) fotossensibilizado, foi medida a proliferação celular em 24 horas após
70
o tratamento. Para tal, foram semeadas 1,5 x 105 células/poço em placa de 24
poços, em meio completo. No dia seguinte, as soluções de AM, em meio DMEM
High Glucose sem soro ou antibióticos, foram preparadas nas concentrações de 50,
25, 10, 5, 1 e 0,5 µM, a partir de diluições seriadas. Imediatamente antes do
tratamento, o meio completo de cultura foi removido e cada poço lavado com
tampão PBS estéril. Deste passo em diante, todo o procedimento foi realizado no
escuro, utilizando apenas luz azul indireta. Neste ponto, foram fixados três poços
com solução de ácido tricloroacético (TCA) 10%, para a determinação da população
inicial no momento do tratamento. Os outros poços receberam somente DMEM
(controle) ou DMEM + AM, em triplicata. As placas foram mantidas em incubadora
durante 30 minutos para haver a incorporação do corante. Em seguida, o meio
contendo AM foi removido e as culturas lavadas duas vezes com PBS estéril, sendo
que na segunda lavagem foi mantido o PBS. As placas foram então irradiadas com
LED vermelho (λ ≈ 700 nm) por 30 minutos, a 12 centímetros de distância das
células, que corresponde a uma energia de 4,24 J cm-2 min-1.
Após a fotossensibilização do AM, o PBS foi substituído por meio completo e
as placas mantidas em incubadora por 24 horas. Ao final desse tempo, o meio de
cultura foi removido, as culturas lavadas com PBS e fixadas com TCA 10%.
A proliferação celular após o tratamento com AM foi verificada através da
quantificação do conteúdo de ácidos nucleicos em espectrofotômetro Spectra Max
M3 (Molecular Devices, EUA), pela leitura da absorbância a 260 nm. Para essa
finalidade, as células fixadas foram lisadas com solução de hidróxido de sódio 1 M e
homogeneizadas para a liberação do conteúdo celular antes das respectivas
quantificações. A medida da proliferação celular foi calculada por meio da seguinte
fórmula:
71
𝑃𝑎 = 100(𝐴𝑎 − 𝐴0)
(𝐴24 − 𝐴0)
Onde,
Pa: % de proliferação da condição “a”;
Aa: média das absorbâncias obtidas para as amostras tratadas com a condição “a”
após 24 horas de incubação; e
A24: média das absorbâncias obtidas para as amostras não tratadas com AM após
24 horas de irradiação.
3.12. Identificação da população sub-G1 por citometria de fluxo
A determinação da indução de apoptose foi feita pela medida da população
sub-G1 em células tratadas com azul de metileno, através de análises em citômetro
de fluxo utilizando o agente intercalante de DNA iodeto de propídeo (Sigma). As
células de cada linhagem foram plaqueadas em uma densidade de 3x105
células/poço em placas de Petri, em meio completo. As placas utilizadas ao longo do
experimento foram previamente tratadas com polilisina para melhorar a adesão
celular, evitando perda de células durante as trocas de meio e lavagens com PBS.
Após 48 horas em cultura, as células foram tratadas com azul de metileno e
irradiadas, conforme descrito no tratamento para proliferação celular. Neste
experimento, foram utilizadas três concentrações de azul de metileno: 1, 5 e 25 µM.
Cada ponto experimental foi feito em triplicata, com uma triplicata adicional sem
tratamento.
72
Ao final das 24 horas após o tratamento com azul de metileno, o meio de
cultura foi transferido para tubos de 15 mL e as células foram lavadas duas vezes
com tampão PBS, sendo que o PBS também foi recolhido. As células que estavam
aderidas foram desprendidas com o uso de tripsina e transferidas para os
respectivos tubos contendo o meio de cultura e o PBS previamente recolhidos. Os
tubos foram centrifugados a 1.000 g por 10 minutos, e o precipitado celular
resultante foi suspenso em 1 mL de PBS e, então, transferido para microtubos.
Esses foram submetidos a uma nova centrifugação (1.000 g, por 10 minutos) e os
precipitados foram suspensos em etanol 70% gelado e armazenados a -20°C até o
dia da análise no citômetro.
No dia da análise de citometria, as amostras foram centrifugadas a 3.200 g
por 15 minutos a 4°C, e o precipitado foi suspenso em 1 mL de PBS. A amostra foi
novamente centrifugada a 3.200 g por 15 minutos a 4°C, e o precipitado suspenso
em 300 µL de solução contendo iodeto de propídeo (RNAse A 200 µg/mL, iodeto de
propídeo 20 µg/mL, Triton-X 100 0,1% em PBS). As amostras foram mantidas por 1
hora a temperatura ambiente e protegidas da luz. O material foi então analisado no
citômetro de fluxo BD-FACS Verse (BD Biosciences). Os resultados foram então
analisados no software FlowJo v10.
73
4. Resultados
4.1. Seleção clonal
Os modelos celulares utilizados nesse estudo foram obtidos através de um
procedimento de clonagem de populações estavelmente transformadas com um
plasmídeo expressando shRNAs específicos para mTOR e controle (scrambled). Tal
procedimento foi realizado de modo a se obter linhagens isogênicas, e diminuir a
variabilidade dos resultados. Após realizado o procedimento de clonagem, as
linhagens obtidas tiveram seus níveis de expressão de mTOR medidos através de
western blot e RT-qPCR. Foram selecionados dois clones apresentando knockdown
para mTOR: um com uma expressão de cerca de 50% em relação ao normal
(denominado KD1), e outro com uma expressão quase nula (denominado KD2),
além de um clone com plasmídeo embaralhado para servir de controle. A figura
abaixa apresenta os níveis de expressão mTOR medidos por Western Blot:
WT Scr KD1 KD2
mTOR - 289 KDa
Lamina B2 - 68 KDa
Figura 3 – (A) Nível de expressão de mTOR em células selvagens (WT: wild type), clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com cerca de 50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). Foram utilizadas 40 µg de amostra, e uma concentração de anticorpos de 1:100 (mTOR) e 1:1000 (Lamina B2). (B) O gráfico representa a expressão relativa de mTOR normalizada pela expressão de lamina B2 (68 kDa). O resultado representa a média ± desvio padrão de dois experimentos, realizados em duplicata.
B
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
WT Scr ctrl KD1 KD2
Exp
ressão
rela
tiv
a d
e
mT
OR
Scr
A
74
O clone da linhagem transfectada com o plasmídio scrambled apresentou um
nível de expressão de mTOR maior do que o da linhagem selvagem. Outros clones
foram testados, e os resultados foram similares, embora alguns apresentassem
níveis de expressão de mTOR menor do que a linhagem selvagem. A linhagem não
selecionada também apresentou nível de expressão de mTOR bem abaixo do
normal (resultado não apresentado), indicando que o processo de clonagem não foi
o responsável pela alteração. Tal resultado sugere que talvez a sequência
scrambled tenha se inserido em algum sítio genômico que resultou em alteração do
nível de expressão de mTOR. De modo a se prosseguir com o estudo, foram
utilizados clones scrambled oriundos de um projeto anterior, uma vez que a
sequência do plasmídeo é a mesma. A expressão de mTOR na nova linhagem
scrambled, bem como nas linhagens com knockdown de mTOR selecionadas
anteriormente, foi medida através de RT-qPCR, devido a falta de anticorpo para
realização de mais western blots. A figura abaixo demonstra os níveis de expressão
de mRNA para as linhagens utilizadas no projeto:
Figura 4 – Níveis de expressão de mRNA de mTOR em células selvagens (WT: wild type), clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com cerca de
50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). As medidas foram feitas por RT-qPCR, utilizando a expressão de HPRT como normalizador. O resultado é a média ± desvio padrão de dois experimentos, realizados em triplicata.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
WT Scr KD alto KD baixoExp
ressão
Rela
tiv
a d
e
mT
OR
KD1 KD2
75
4.2. Western blot
Com o objetivo de verificar se os níveis de mTOR alteram a expressão de
proteínas de reparo de DNA, foram realizados western blots para proteínas
componentes da via BER, tanto mitocondrial quanto nuclear, além de TFAM. Como
menor expressão de mTOR está associada a um aumento na longevidade, e muitos
hipotetizam que alterações no DNA são causas do envelhecimento, nossa hipótese
era de que enzimas da via BER estariam com expressão elevada em linhagens com
knockdown de mTOR. As proteínas analisadas foram: APE1, Polγ e TFAM.
Adicionalmente, também tentou-se analisar os níveis de UDG, Polβ e OGG1. No
entanto, os anticorpos utilizados não apresentaram resultados satisfatórios e os
resultados não são apresentados.
4.2.1. Western blot de extratos celulares totais
4.2.1.1. Expressão de APE1 em extratos totais
A primeira enzima a ter seus níveis quantificados foi APE1. APE1 é uma
endonuclease essencial para BER, cuja ausência causa letalidade embrionária
(Maynard et al., 2009; Puebla-Osorio et al., 2006; Sugo et al., 2000; Tebbs et al.,
1999; Xanthoudakis et al., 1996). Ela é responsável por clivar a fita de DNA no sítio
abásico, após remoção da base modificada pelas glicosilases. As imagens abaixo
apresentam os resultados do western blot da enzima APE1 em extratos celulares
totais.
76
O western blot das linhagens revelou uma diminuição na expressão de APE1
nas duas linhagens com expressão diminuída de mTOR. O nível de expressão de
APE1 no clone KD1, com cerca de metade da expressão de mTOR, mostrou uma
grande variabilidade, embora sempre se mantendo abaixo da metade dos níveis dos
controles. Já o clone com pouquíssima expressão de mTOR (KD2) demonstrou
níveis quase indetectáveis de APE1, com pouquíssima variação. Tal resultado foi
contrário ao esperado, uma vez que se esperava que a inibição de mTOR elevaria o
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
WT Scr KD1 KD2
Ex
pre
ss
ão
re
lati
va
de
AP
E1
Figura 5 – (A) Nível de expressão de APE1 em extrato total em células selvagens (WT: wild type), clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com cerca de 50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). Foram utilizadas 15 µg de amostra, e uma concentração de anticorpos de 1:500 (APE1) e 1:1000 (Lamina B2). (B) Quantificação da membrana em A; o gráfico representa a expressão de APE1 normalizada pela expressão de Lamina B2. O resultado representa a média ± desvio padrão de três experimentos, realizados em duplicata.
WT Scr KD1 KD2
Lamina B2 - 68 KDa
APE1 - 35 KDa
A
B
77
nível de expressão das proteínas de reparo de DNA. Inicialmente, deduzimos que
talvez o ritmo de crescimento menor, com consequente diminuição do metabolismo,
de células mTOR-KD estivesse causando uma diminuição nos níveis de EROs,
diminuindo a necessidade de reparo no DNA pela via BER. Adicionalmente, como
APE1 está envolvida em algumas vias de sinalização, sua expressão diminuída
poderia estar servindo de regulação para outras vias (Ramana et al., 1998).
4.2.1.2. Expressão de TFAM em extratos totais
TFAM (transcription factor A mitochondrial) é um fator de transcrição presente
apenas nas mitocôndrias. Embora TFAM não seja propriamente uma enzima de
reparo de DNA, evidências apontam para um possível papel de TFAM na regulação
do reparo do DNA mitocondrial (Canugovi et al., 2010; Tonolli, 2013). TFAM envolve
as moléculas de DNAmt, regulando o acesso de enzimas ao DNA, de forma análoga
à cromatina no DNA nuclear. Devido a isso, é possível que TFAM tenha dois
importantes papéis na proteção do DNAmt: (i) proteger fisicamente o DNAmt de
danos (ao envolvê-lo), como dano oxidativo, ao qual a mólecula de DNAmt é
constantemente sujeita devido a sua localização próxima à cadeia de transporte de
elétrons, o principal sítio gerador de EROs na célula; e (ii) regular o acesso de
enzimas de reparo de DNA, através do relaxamento e compactação da estrutura de
TFAM ao redor do DNAmt. Por esse motivo, a investigação dos níveis de TFAM com
a alteração dos níveis de mTOR pode fornecer uma ideia da variação do nível de
proteção do DNAmt. Embora TFAM esteja presente apenas nas mitocôndrias, esses
resultados foram produzidos com extratos totais. Resultados com extratos
mitocondriais serão apresentados adiante.
78
Figura 6 – (A) Nível de expressão de TFAM em extrato total em extrato total em células selvagens (WT: wild type), clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com cerca de 50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). Foram utilizadas 15 µg de amostra, e uma concentração de anticorpos de 1:500 (TFAM) e 1:1000 (Lamina B2). (B) Quantificação da membrana em A; o gráfico representa a expressão de TFAM normalizada pela expressão de Lamina B2. O resultado representa a média ± desvio padrão de dois experimentos, realizados em duplicata.
Conforme demonstrado na figura, os níveis proteicos de TFAM apresentaram
uma diminuição moderada na linhagem com maior knockdown de mTOR, exibindo
um comportamento inverso ao esperado, assim como APE1. Curiosamente, com
esses níveis menores de TFAM, o DNAmt teoricamente estaria mais exposto a
danos.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
H Scr KD1 KD2
Exp
ressão
rela
tiv
a d
e T
FA
M
WT Scr KD1 KD2
Lamina B2 - 68 KDa
TFAM - 28 KDa
A
B
79
4.2.1.3. Expressão de Polγ em extratos totais
A polimerase γ é a única polimerase mitocondrial, e é responsável por
adicionar nucleotídeos na fita de DNA sendo reparada por BER, no gap criado após
remoção da lesão. Assim como TFAM, os níveis de Polγ foram medidos tantos em
extratos totais como mitocondriais, apesar de Polγ estar presente apenas no
compartimento mitocondrial. A figura abaixo demonstra os níveis de expressão de
Polγ, medidos em extrato total. Uma vez que Polγ se encontra apenas nas
mitocôndrias, seu nível em extrato total é muito pequeno, e, portanto, o sinal
produzido pelos anticorpos foi bem fraco.
O nível de expressão de Polγ pareceu estar alterado na linhagem KD2, com
menor expressão. No entanto, a detecção da expressão foi muito baixo para que
uma quantificação mais precisa fosse feita. Apesar de diversas tentativas com
concentrações crescentes de anticorpo, não foi possível melhorar o sinal.
WT Scr KD1 KD2
Polγ - 140 KDa
Lamina B2 - 68 KDa
Figura 7 - Nível de expressão de Polγ em extrato total em células selvagens (WT: wild type), clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com cerca de 50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). Foram utilizadas 50 µg de amostra, e uma concentração de anticorpos de 1:100 (Polγ) e 1:1000 (Lamina B2).
80
4.2.2. Western blot de extratos mitocondriais
4.2.2.1. Pureza das amostras mitocondriais
De modo a se avaliar os níveis de APE1 dentro do compartimento
mitocondrial, assim como os níveis de TFAM e Polγ com maior definição,
mitocôndrias das linhagens utilizadas foram isoladas. Após o procedimento de
cultivo das células e isolamento das mitocôndrias, um western blot foi feito marcando
proteínas presentes no núcleo e na mitocôndria com o intuito de se verificar se o
isolamento foi eficiente, e houve nenhuma ou pouca contaminação nuclear. A
verificação da pureza das frações mitocondriais é de extrema importância, uma vez
que a presênça de contaminação pode dar uma noção errada dos níveis, ou da
atividade enzimática, das proteínas analisadas no compartimento mitocondrial. Para
se analisar a pureza, foram marcadas duas proteínas, uma presente apenas no
núcleo, e outra apenas na mitocôndria. A figura abaixo mostra uma membrana com
marcações de LaminaB2 (68 kDa), presente apenas no núcleo das células, e COX
IV (17 kDa), presente apenas nas mitocôndrias.
LaminaB2
COX IV
- 68 kDa
- 17 kDa
WT Scr KD1 KD2 WT Scr KD1 KD2
Mitocondrial Nuclear
Figura 8 – Teste de pureza dos extratos mitocondriais em células selvagens (WT: wild type), clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com cerca de 50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). Lamina B2 foi utilizada como marcador nuclear, e COX IV como marcador mitocondrial. Foram utilizados 15 µg de amostra, e uma concentração de 1:500 para ambos os anticorpos.
81
Conforme se pode observar na figura, as amostras mitocondriais isoladas não
apresentaram níveis detectáveis de lamina B2, com exceção da linhagem selvagem,
que apresentou níveis muito baixos (quantificados em 4,93% de lamina B2 em
relação ao total, Lamina B2 + COX IV), dentro do aceitável. Essas amostras foram
então utilizadas em experimentos subsequentes.
4.2.2.2. Expressão de APE1 em extratos mitocondriais
Dada o resultado de que APE1 se encontra reduzida em extratos totais de
linhagens com knockdown de mTOR, decidimos analisar a quantidade de APE1 no
compartimento mitocondrial também apresentava variações. Desta forma, seria
possível que, caso a integridade do genoma mitocondrial fosse mais crítica que a do
nuclear, esperaríamos não ver diminuição dos níveis de APE1 nas mitocôndrias, ao
contrário do núcleo. Adicionalmente, caso a diminuição de APE1 em extrato total
fosse devida a uma necessidade de diminuir a atividade de APE1 como fator de
transcrição, tal diminuição poderia ser desnecessária nas mitocôndrias, aonde a
função como fator de transcrição não é ainda conhecida. Para tal, foi realizado um
western blot para determinar os níveis de APE1 nas mitocôndrias. A membrana
abaixo apresenta os resultados do experimento. Devido a necessidade de grandes
quantidades de amostra para se obter uma visualização razoável das bandas de
APE1, apenas um experimento pode ser realizado.
82
Figura 9 – (A) Nível de expressão de APE1 em extrato mitocondrial em células selvagens (WT: wild type), clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com
cerca de 50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). Foram utilizados 25 µg de amostra, e uma concentração de anticorpos de 1:200 (APE1) e 1:1000 (COX IV). (B) Quantificação da membrana em A; o gráfico representa a expressão de APE1 normalizada pela expressão de COX IV. O resultado representa a média de um experimento, realizado em duplicata.
Devido ao experimento ter sido realizado apenas uma vez por falta de
amostra, não é possível ter uma noção perfeita da variabilidade dos resultados. No
entanto, é possível observar que a amostra KD2 ainda apresentou níveis detectáveis
de APE1 (~30%), levando-se em consideração que em todos os western blots em
extrato total os níveis de APE1 estavam praticamente indetectáveis. Desta forma,
parece que, embora os níveis de APE1 tenham aparentemente diminuído nas
linhagens com menor expressão de mTOR, essa diminuição foi menos acentuada
nas mitocôndrias quando comparada aos níveis totais de APE1 nas células.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
WT Scr KD1 KD2
Exp
ressão
rela
tiv
a d
e A
PE
1
WT Scr KD1 KD2
COX IV - 15 KDa
APE1 - 35 KDa
A
B
83
4.2.2.3. Expressão de TFAM em extratos mitocondriais
Embora TFAM tenha sido analisado anteriormente em extratos totais, seus
níveis foram novamente medidos em extrato mitocondrial, esperando-se obter maior
definição nas imagens. Conforme mencionado anteriormente, TFAM poderia estar
protegendo o genoma mitocondrial de forma análoga às histonas no DNA nuclear. A
expressão de TFAM foi medida utilizando apenas amostras mitocondriais. O
resultado é apresentado na figura abaixo.
Figura 10 – (A) Nível de expressão de TFAM em extrato mitocondrial em células selvagens (WT: wild type),
clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com cerca de 50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). Foram utilizados 25 µg de amostra, e uma concentração de anticorpos de 1:500 (TFAM) e 1:1000 (COX IV). (B) Quantificação da membrana em A; o gráfico representa a expressão de TFAM normalizada pela expressão de COX IV. O resultado representa a média ± desvio padrão de dois experimentos, realizados em duplicata.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
H Scr KD1 KD2
Exp
ressão
rela
tiv
a d
e T
FA
M
Cox IV
TFAM
- 17 KDa
- 28 KDa
WT Scr KD1 KD2 A
B
84
Conforme pode ser observado na figura acima, os níveis de TFAM diminuíram
nas duas linhagens com knockdown de mTOR, corroborando o resultado em extrato
total, e refutando a hipótese inicial de que menores níveis de mTOR aumentariam os
níveis de TFAM, protegendo o DNAmt.
4.2.2.4. Expressão de Polγ em extratos mitocondriais
Similarmente à TFAM, os níveis de Polγ foram também analisados tanto em
extrato total quanto em mitocondrial, de modo a aumentar a definição das imagens.
As figuras abaixo apresentam os resultados.
Figura 11 – (A) Nível de expressão de Polγ em extrato mitocondrial em células selvagens (WT: wild type), clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com cerca de 50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). Foram utilizados 25 µg de amostra, e uma concentração de anticorpos de 1:100 (Polγ) e 1:1000 (COX IV). (B) Quantificação das membranas; o gráfico representa a expressão de Polγ normalizado pela expressão de COX IV. O resultado representa a média ± desvio padrão de dois experimentos, realizados em duplicata.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
H Scr KD1 KD2
Exp
ressão
rela
tiv
a d
e P
olγ
WT Scr KD1 KD2
COX IV
Polγ
- 17 KDa
- 140 KDa
A
B
85
Acompanhando o padrão observado nas outras proteínas analisadas, os
níveis de Polγ se mostraram menores nas linhagens com knockdown de mTOR,
indicando uma atividade de polimerase menor nessas mitocôndrias, e contrariando a
hipótese inicial.
4.2.3. Western blot de amostras de fígado de camundongo
Com o objetivo de corroborar a alteração dos níveis de expressão de APE1
em outro modelo, medimos os níveis proteicos de APE1 em amostras de fígado de
camundongo cedidas pelo professor William Festuccia, do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo. As amostras consistiam em tecidos de
animais com deleção dos genes Raptor e TSC, resultando em repressão e
superativação, respectivamente, de mTORC1, assim como um controle selvagem.
As proteínas das amostras foram extraídas, e submetidas a análise por western blot.
A figura abaixo demonstra os resultados para 6 amostras: um controle (WT); duas
com deleção de TSC, e superativação de mTORC1 (TSC KO1 e KO2); e três com
deleção de Raptor, e inibição de mTORC1 (Raptor KO1, KO2 e KO3).
Figure 12 – Níveis de expressão de APE1 em tecidos selvagens (WT: wild type), tecidos com deleção de TSC, e
consequente superativação de mTORC1 (TSC KO1 e KO2) e tecidoscom deleção de Raptor, e consequente inibição de mTORC1 (Raptor KO1, KO2 e KO3). Foram utilizados 25 µg de amostra, e uma concentração de anticorpos de 1:500 (APE1) e 1:100 (Lamina B2).
APE1
Lamina B2
- 35 KDa
- 68 KDa
Extrato total de amostras de fígado (25 µg)
WT TSC TSC Raptor Raptor Raptor
KO1 KO2 KO1 KO2 KO3
86
Apesar de uma grande concentração de anticorpo contra Lamina B2 ter sido
utilizado, não foi possível produzir um sinal muito forte de Lamina B2 na membrana,
dificultando uma quantificação mais precisa. No entanto, uma análise visual dos
resultados indica que não houveram grandes variações nas quantidades de APE1
com a superativação ou inibição de mTORC1. Um resultado que contrasta com a
queda brusca nos níveis de APE1 observada nas amostras com knockdown de
mTOR. Isso sugere duas possibilidades: (i) que alguma variável relacionada ao
tecido/modelo esteja contribuindo para a variação dos níveis de APE1 observados,
ou (ii) que APE1 não é afetado por mTORC1, mas sim por mTORC2. A segunda
opção é possível, uma vez que as amostras de fígado possuem deleções apenas
em genes que afetam a função de mTORC1, uma vez que o modelo utilizado no
resto do projeto apresenta deleção de mTOR, afetando, portanto, os dois
complexos.
4.3. Reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real
Com o intuito de avaliar se a diminuição na expressão de APE1 também
poderia ser observada no nível de mRNA, foi utilizada a técnica qRT – PCR. Este
experimento é importante tanto para corroborar a diminuição da expressão através
da quantificação dos níveis de proteínas, quanto para entender em que ponto ocorre
a regulação desses níveis de expressão. Desta forma, os níveis de RNA mensageiro
de APE1 nas linhagens estudadas foram quantificados. O gráfico abaixo demonstra
o resultado da quantificação, expresso em termos de expressão relativa de mRNAs.
Os níveis relativos de mRNA de APE1 foram normalizados por pela expressão de
um gene expresso constitutivamente (HPRT).
87
Figura 13 - Níveis de mRNA de APE1 em células selvagens (WT: wild type), clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com cerca de 50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). Expressão em relação aos níveis da linhagem selvagem (WT). A normalização foi feita em relação aos níveis de mRNA de HPRT. O resultado representa a média ± desvio padrão de dois experimentos, realizados em triplicata.
O padrão de expressão de mRNA de APE1 seguiu o mesmo padrão de níveis
proteicos detectado por western blot: uma expressão baixa em KD1, e uma
expressão praticamente indetectável em KD2. Tal resultado corrobora a diminuição
da expressão de APE1 nas linhagens com menor expressão de mTOR.
4.4. Ensaio de incisão de APE1
Com o intuito de avaliar se os níveis menores de APE1 nas células se
traduziram em alteração na atividade de incisão de sítios abásicos, foram realizados
ensaios de atividade enzimática de APE1, utilzando oligonucleotídeos contendo um
tetrahidrofurano, uma modificação análoga ao sítio abásico que serve de substrato
para APE1. Essa modificação torna o sítio específico para APE1, uma vez que na
via BER a atividade AP-liase de glicosilases do tipo II também pode clivar o sítio
abásico, mas não reconhece o tetrahidrofurano.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
WT Scr KD1 KD2
Exp
ressão
rela
tiv
a d
e
AP
E1
88
Os ensaios foram realizados conforme Weissman et al. (2007), com a
diferença de que os oligonucleotídeos foram marcados fluorimetricamente, ao invés
de radioativamente.
4.4.1. Curvas de calibração
Antes da realização dos ensaios, foram construídas curvas de atividade com
diferentes concentrações proteicas das amostras, para determinar quais
concentrações de extratos seriam utilizadas nos experimentos comparativos. Tanto
amostras de extrato total quanto amostras mitocondriais foram calibradas desta
forma.
A figura abaixo demonstra o resultado do ensaio de atividade em função de
concentração de extrato para as amostras de proteínas de extrato total, com
concentrações diferentes. A partir da imagem acima, foram realizadas quantificações
das bandas, e construída uma curva de calibração, expressando a quantidade de
fmoles de oligonucleotídeos incisados por minuto em cada condição.
89
Figura 14 – (A) Ensaio de calibração. O ensaio foi realizado com concentrações crescentes de amostra (0, 5, 10,
15 e 25 ng). As bandas representam os oligonucleotídeos marcados fluorimetricamente, e com sítios contendo tetrahidrofurano, análogo ao sítio abásico. As bandas superiores representam os oligonucleotídeos não clivados por APE1, e as inferiores os clivados. (B) Quantificação de atividade enzimática com valores obtidos em A, demonstrando a quantidadede fmoles de oligonucleotídeos incisados por minuto em relação ao total para diferentes quantidades de amostra de extrato total. Resultado representa a média ± desvio padrão de dois experimentos, realizados em duplicata.
A partir da curva acima, a quantidade de 15 ng, que apresenta cerca de 50%
de incisão, foi selecionada para os ensaios de incisão comparativos entre amostras
de extrato total das diferentes linhagens.
Uma curva similar de atividade versus concentração proteica de extrato foi
construída para determinar a quantidade de amostra a ser usada nos experimentos
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 5 10 15 20 25 30
fmo
les
/min
de
du
ple
x in
cis
ad
o
Quantidade de amostra (ng)
Quantidade de extrato total (ng)
0 5 10 15 25 0 5 10 15 25
A
B
90
com extratos mitocondriais. A figura abaixo apresenta os resultados da eletroforese
de DNA para as amostras mitocondriais.
Figura 15 – (A) Ensaio de calibração. O ensaio foi realizado com concentrações crescentes de amostra (0, 20,
35, 50 e 65 ng). As bandas representam os oligonucleotídeos marcados fluorimetricamente, e com sítios contendo tetrahidrofurano, análogo ao sítio abásico. As bandas superiores representam os oligonucleotídeos não clivados por APE1, e as inferiores os clivados. (B) Quantificação de atividade enzimática demonstrando a quantidade de fmoles de oligonucleotídeos incisados por minuto em relação ao total para diferentes quantidades de amostra de extrato mitocondrial. O resultado representa a média ± desvio padrão de dois experimentos, realizados em duplicata.
A partir da figura acima, a quantidade de 50 ng foi escolhida para os ensaios
de incisão com amostras de extratos mitocondriais. Com a conclusão das curvas de
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 10 20 30 40 50 60 70
fmo
les
/min
de
du
ple
x in
cis
ad
o
Quantidade de amostra (ng)
Curva de calibração de extrato mitocondrial
Quantidade de extrato mitocondrial (ng)
0 20 35 50 65 0 20 35 50 65
A
B
91
calibração, foi possível seguir para a próxima etapa, de realização do ensaio de
atividade enzimática de APE1.
4.4.2. Ensaio de incisão com extrato total
A medida da atividade de incisão de substrato contendo tetrahidrofurano com
extratos totais foi realizada utilizando 15 ng de extrato, como determinado
anteriormente, e em dois tempos de incubação diferentes: 5 e 15 minutos. A figura
abaixo mostra os resultados para os dois experimentos.
Figura 16 – (A) Ensaio de incisão de APE1 com extrato total, realizado com incubação de amostra e
substrato por 5 e 15 minutos. (B) Quantificação dos ensaios de incisão com extrato total. Ctrl-: sem extrato protéico; WT: linhagem selvagem; Scr: linhagem transfectada com plasmídeo embaralhado; KD1: linhagem com aproximadamente 50% de mTOR; KD2: linhagem com pouquíssimo mTOR. O resultado representa a média ± desvio padrão de dois experimentos, em duplicata.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Ctrl- WT Scr KD1 KD2 Ctrl- WT Scr KD1 KD2
fmo
les/m
in d
e d
up
lex
inc
isad
o
Linhagem
Ensaio de incisão em extrato total 5 minutos 15 minutos
Ctrl- WT Scr KD1 KD2 Ctrl- WT Scr KD1 KD2
Extrato Total (15 ng de proteínas)
5 minutos 15 minutos A
B
92
Conforme pode ser observado, curiosamente, apesar dos níveis muito
menores de APE1 em KD2, as atividades de incisão medidas apresentaram
pequena variação.
4.4.3. Ensaio de incisão com extrato mitocondrial
O ensaio de incisão com extratos mitocondriais foi realizado de forma similar ao
ensaio com extratos totais, com dois tempos de incubação (5 e 15 minutos). A figura
abaixo mostra os resultados para os dois experimentos.
Figura 17 – (A) Ensaio de incisão de APE1 com extrato mitocondrial, realizado com incubação de amostra e
substrato por 5 e 15 minutos. (B) Quantificação dos ensaios de incisão com extrato mitocondrial. Ctrl-: sem extrato protéico; WT: linhagem selvagem; Scr: linhagem transfectada com plasmídeo embaralhado; KD1:
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Ctrl- WT Scr KD1 KD2 Ctrl- WT Scr KD1 KD2
fmo
les
/min
de
du
ple
x
inc
isa
do
Linhagem
Ensaio de incisão em extrato mitocondrial 5 minutos 15 minutos
Ctrl- WT Scr KD1 KD2 Ctrl- WT Scr KD1 KD2
Extrato Mitocondrial (50 ng de proteínas)
5 minutos 15 minutos
A
B
93
linhagem com aproximadamente 50% de mTOR; KD2: linhagem com pouquíssimo mTOR. O resultado representa a média ± desvio padrão de dois experimentos, realizados em duplicata.
Assim como no experimento com extrato total, não pode ser detectada
variação muito grande na atividade de incisão de APE1. De fato, os níveis de incisão
de APE1 nas linhagens KD1 e KD2 em 5 minutos foram ligeiramente maiores em
relação aos controles. Um resultado curioso, uma vez que tanto a quantificação dos
níveis de proteína por western blot como dos níveis de mRNA por qRT-PCR
detectaram baixíssimos níveis, praticamente indetectáveis, em KD2.
4.5. Medida de parâmetros bioenergéticos
Durante a investigação das alterações causadas pelo knockdown de mTOR
nas células, decidimos investigar como se comportam os parâmetros bionergéticos
das células. Para isso, foram medidas a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de
acidificação do meio extracelular, indicadores do metabolismo aeróbico e
anaeróbico, respectivamente. De modo a se aprofundar a análise, durante o
processo de medição, foram injetadas algumas substâncias que afetam o
funcionamento da cadeia de transporte de elétrons, permitindo observar como as
diferentes linhagens lidavam com essas diferentes condições.
4.5.1. Taxa de consumo de oxigênio
A taxa de consumo de oxigênio por células aderidas em substrato sólido foi
medida através da variação da concentração de oxigênio no meio de cultura dentro
das microcâmaras formadas na placa de cultura durante a fase de aquisição de
94
dados pelo equipamento. Logo, quanto maior a taxa de consumo de oxigênio do
poço com determinada linhagem, maior será a diminuição observada na
concentração de oxigênio pelos detectores. As figuras abaixo apresentam os
resultados obtidos, apresentados de duas formas. Na primeira, valores absolutos de
consumo de oxigênio são demonstrados; na segunda, os resultados são
demonstrados como variações (em porcentagem) em relação aos valores basais.
Figura 18 - Taxa de consumo de oxigênio (pMoles/min) no decorrer do experimento (min). As linhas
verticais representam momentos aonde uma determinada substância foi injetada nos poços. As substâncias injetadas foram: (A) oligomicina, (B) CCCP, (C) rotenona e (D) antimicina. As curvas representam as linhagens WT (vermelho), Scr (lilás), KD1 (azul) e KD2 (verde).
95
Figura 19 - Taxa de consumo de oxigênio (pMoles/min) no decorrer do experimento (min), em relação aos
valores basais. As linhas verticais representam momentos aonde uma determinada substância foi injetada nos poços. As substâncias injetadas foram: (A) oligomicina, (B) CCCP, (C) rotenona e (D) antimicina. As curvas representam as linhagens WT (vermelho), Scr (lilás), KD1 (azul) e KD2 (verde).
De acordo com as medidas, a respiração basal das células com maior
knockdown de mTOR (KD2) parece menor, o que é condizente com a atividade
conhecida da proteína. No entanto, as variações em relação à respiração basal,
quando inibidores específicos da fosforilação oxidativa foram adicionados foram
similares nas quatro linhagens. Inibição da ATP sintase com oligomicina (porta A)
diminui a taxa de consumo de oxigênio de todas as linhagens de forma similar,
enquanto que o desacoplamento com CCCP (porta B) parece aumentar a taxa de
consumo de oxigênio das linhagens também de forma similar. Antimicina e rotenona
(portas C e D) inibem completamente o consumo de oxigênio.
96
4.5.2. Taxa de acidificação do meio
A taxa de acidificação do meio foi medida simultâneamente à taxa de
consumo de oxigênio. A medida é realizada através da detecção da concentração de
prótons no meio extracelular, em meio não tamponado. Em células em cultura, a
acidificação do meio extracelular é decorrente, majoritariamente, da produção de
lactato na glicólise, e consequentemente a acidificação do meio reflete a taxa
glicolítica não associada à fosforilação oxidativa. É importante observar que embora
diversos outros processos nas células possam ocasionar um aumento na
concentração de prótons, o fato de a concentração no experimento variar de forma
que espelhe a variação na taxa de consumo de oxigênio conforme as substâncias
nas portas vão sendo injetadas, indica que esses prótons realmente são oriundos de
uma mudança no balanço entre metabolismo aeróbico e anaeróbico na célula. As
figuras abaixo demonstram os resultados do experimento.
Figura 20 - Taxa de acidificação do meio (mpH/min) no decorrer do experimento (min). As linhas verticais
representam momentos aonde uma determinada substância foi injetada nos poços. As substâncias injetadas foram: (A) oligomicina, (B) CCCP, (C) rotenona e (D) antimicina. As curvas representam as linhagens WT (vermelho), Scr (lilás), KD1 (azul) e KD2 (verde).
97
Figura 21 - Taxa de acidificação do meio (mpH/min) no decorrer do experimento (min), em relação aos valores
basais. As linhas verticais representam momentos aonde uma determinada substância foi injetada nos poços. As substâncias injetadas foram: (A) oligomicina, (B) CCCP, (C) rotenona e (D) antimicina. As curvas representam as linhagens WT (vermelho), Scr (lilás), KD1 (azul) e KD2 (verde).
Conforme pode ser observado, a curva de taxa de acidificação do meio
mostrou também que a linhagem KD2 apresenta uma atividade glicolíica menor do
que as outras. Isso indica que, como tanto o metabolismo aeróbico como anaeróbico
estão diminuídos, as células KD2 possuem um consumo total de energia menor.
Isso condiz com a função de mTOR, que, quando menos ativo, inibe o crescimento,
e, portanto, o consumo de energia.
98
4.6. Quantificação do número de cópias de DNAmt
Devido a menor taxa de consumo de oxigênio observada nas linhagens com
knockdown de mTOR, decidimos medir o número de cópias de DNA mitocondrial,
com o intuito de observar se a menor taxa de consumo de oxigênio poderia estar
relacionada a uma diminuição na população mitocondrial e/ou número menor de
cópias de DNAmt, que estariam possivelmente traduzindo menos componentes para
a formação dos complexos da cadeia respiratória, resultando numa menor taxa de
consumo de oxigênio. As medidas foram feitas por RT-qPCR. A figura abaixo
apresenta o resultado observado.
Figura 22 – Número relativo de cópias de DNAmt, medido por RT-PCR, em células selvagens (WT: wild type), clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com cerca de 50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). O número de cópias foi normalizado em relação ao gene nuclear de cópia única HPRT, e é apresentado relativo ao numero de cópias da linhagem selvagem. O resultado representa a média ± desvio padrão de dois experimentos, em triplicata.
Conforme pode ser observado, não houve diminuição significativa do número
de cópias de DNA mitocondrial nas duas linhagens com menor expressão de mTOR.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
WT Scr KD1 KD2
Nú
me
ro d
e c
óp
ias
rela
tiva
s d
e D
NA
mt
Número de cópias relativas de DNAmt
99
4.7. Medida da Atividade de Citrato Sintase
Como não foi possível detectar uma menor quantidade de cópias de DNAmt
na linhagem KD2, decidimos investigar se um número menor de mitocôndrias
poderia ser o responsável pela menor taxa de consumo de oxigênio, mesmo que
cada mitocôndria possuísse um número maior de cópias de DNAmt. Para tal,
utilizamos a medida da atividade da enzima citrato sintase como indicativo do
número de mitocondrias, uma vez que sua atividade por mitocôndria é relativamente
constante (Srere, 1974). Para realizar tal medida, a atividade enzimática foi estimada
através da formação do produto colorimétrico DNTB-CoA, pela reação de TNB com
CoA. A figura abaixo apresenta os resultados.
Figura 23 –Atividade específica de citrato sintase em extratos celulares de células selvagens (WT: wild type),
clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com cerca de 50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). O gráfico representa média ± desvio padrão de dois experimentos, realizados em triplicata.
A atividade específica obtida foi similar nas quatro linhagens. Como a taxa de
conversão depende da quantidade de enzimas, e a quantidade de enzimas, nesse
caso, é proporcional ao número de mitocôndrias, os resultados indicam que as
0
10
20
30
40
WT Scr KD1 KD2
Ati
vid
ad
e e
sp
ec
ífic
a
mU
/mg
de
pro
teín
a
Atividade de Citrato Sintase
100
quatro linhagens não diferem significativamente no número de mitocôndrias. Desta
forma, com quantidades similares de DNAmt e de massa mitocondrial,
aparentemente a linhagem KD2 possui uma reserva respiratória maior, respirando
muito menos do que sua capacidade respiratória permite.
4.8. Proliferação celular após tratamento com azul de metileno
fotossensibilizado
O experimento de proliferação celular após tratamento com azul de metileno
fotossensibilizado foi realizada conforme o protocolo apresentado. No entanto, não
foi possível obter um resultado para a proliferação. Isso ocorreu pois, após tentar
realizar o experimento diversas vezes, descobriu-se que células com knockdown
para mTOR possuem uma aderência muito menor que células selvagens. Como o
modelo celular utilizado (HEK293T) já possui baixa aderência, a menor aderência
devido ao knockdown de mTOR tornou o experimento inviável. Apesar de diversas
tentativas, e do tratamento com poli L-lisina para aumentar a aderência das células,
grandes quantidades eram perdidas ao final do experimento, devido as diversas
lavagens pelas quais os poços com as células deveriam passar. Como o
experimento visa a quantificar a proliferação celular, a perda de células devido a
baixa aderência altera completamente os resultados finais.
4.9. Identificação da população sub-G1 por citometria de fluxo
A quantificação da população sub-G1 após o tratamento com azul de metileno
foi feita com o intuito de determinar se o knockdown de mTOR modifica a resposta
101
celular a danos oxidativos. As células tratadas com azul de metileno foram
irradiadas, induzindo a formação de oxigênio singlete, que ataca biomoléculas, entre
elas o DNAmt. Grandes quantidades de dano no DNAmt podem levar ao início de
um processo de apoptose nas células. Durante a apoptose, o DNA nuclear é clivado
em pequenos fragmentos de aproximadamente 180 pb, e múltiplos desse valor.
Quando as células são tratadas com iodeto de propídeo, um intercalante de DNA
que emite fluorescência após ligação ao DNA, é possível ver a intensidade do sinal
emitido por cada célula, que será proporcional à quantidade de DNA presente na
célula. Com esses valores, é possível estimar a quantidade de células em cada
etapa do ciclo celular, devido à variação na quantidade de DNA que ocorre durante o
ciclo. Em células em processo de apoptose, os fragmentos menores de DNA saem
da células após a permeabilização. Desta forma, quando marcadas com iodeto de
propídeo, essas células apresentam quantidades de DNA menores do que as
presentes em células na fase G1. Desta forma, a proporção de células antes do pico
de G1 pode ser utilizada como indicativo da proporção de células que sofreram
apoptose devido ao tratamento com azul de metileno. A figura abaixo apresenta os
resultados obtidos.
102
Figura 24 – Proporção de células em sub-G1, com quantidade de DNA menor que células em G1, em células selvagens (WT: wild type), clones de células controle transfectadas com um plasmídio scrambled (Scr), clones de células mTOR knockdown com cerca de 50% de expressão (KD1) e clones de células mTOR knockdown com expressão quase nula (KD2). As células foram tratadas com concentrações crescentes de azul de metileno, e irradiadas. O gráfico representa a média ± desvio padrão de dois experimentos, realizados em triplicata. * Student’s t-test: p<0,05.
Os resultados indicam que as células com knockdown de mTOR
apresentaram uma proporção de células em sub-G1 significativamente menor que
as outras linhagens. A proporção de células em sub-G1 é menor na linhagem KD2
em todos as concentrações de azul de metileno, e menor em KD1 em 25 uM de azul
de metileno. Desta forma, o experimento indica que células com knockdown de
mTOR estão menos suscetíveis à indução de apoptose após dano oxidativo do que
as linhagens controle. Esse resultado é curioso, uma vez que os resultados
anteriores demonstraram uma redução na expressão de APE1, uma enzima
essencial para o reparo de dano oxidativo, com níveis praticamente indetectáveis em
KD2, a linhagem que apareceu mais protegida nos resultados.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
0 uM 1 uM 5 uM 25 uM
Po
pu
laç
ão
Su
b G
1 (
%)
Concentração de AM
Proporção de células sub-G1 por citometria de fluxo
WT
Scr
KD1 (~55% expression)
KD2 (~0% expression)
*
*
103
5. Discussão
Diversos experimentos demonstram um aumento na longevidade de
mamíferos em modelos com a inibição da atividade de mTOR (Anisimov et al., 2010;
C. Chen et al., 2009; Harrison et al., 2009; Jia et al., 2004; Kaeberlein et al., 2005;
Kapahi et al., 2004; Lamming et al., 2012; R. A. Miller et al., 2011; Vellai et al., 2003;
Wilkinson et al., 2012; Wu et al., 2013), tornando essa proteína alvo constante de
estudos sobre os mecanismos moleculares envolvidos no processo de
envelhecimento. Alterações no DNA (tanto nuclear quanto mitocondrial), por sua
vez, também são frequentemente citadas como possíveis mecanismos causadores
do envelhecimento (Failla, 1958; Szilard, 1959). Desta forma, analisar a interface
entre essas duas linhas de estudo é relevante para aprofundarmos nosso
entendimento acerca do envelhecimento. Poucos estudos analisaram a influência de
mTOR em vias relacionadas à manutenção do DNA. Em especial, nenhum estudo
de que temos notícia avaliou o papel de mTOR na regulação da manutenção do
DNAmt; um papel importante que possivelmente poderia ser exercido por mTOR,
dado seu envolvimento em homeostase metabólica, e o fato de mTORC1 ser um
regulador de PGC1α e NRF-1, reguladores importantes da biogênese mitocondrial
(Cunningham et al., 2007).
Neste estudo, foram utilizadas linhagens clonais de HEK293T com expressão
reduzida de mTOR, bem como células controle sem alteração na expressão de
mTOR. A clonagem das células com knockdown de mTOR teve como objetivo criar
linhagens isogências com diferentes níveis de repressão da expressão de mTOR.
Inerente à metodologia de transfecção, populações de células transfectadas são
heterogêneas, apresentando diferentes níveis de expressão do gene alvo do
knockdown. Essa variabilidade, além de poder afetar os resultados, pode fazer com
104
que variantes que se multipliquem mais rápido dominem a cultura celular com o
tempo. No caso de um gene como mTOR, que está envolvido no crescimento e
proliferação celular, essa etapa é especialmente importante para evitar que células
com knockdown menos eficiente se propaguem mais rápido e, por seleção, eliminem
as com knockdown mais forte. As Figuras 3 e 4 demonstram o sucesso do processo
de clonagem, e a geração de duas linhagens isogênicas: KD1 e KD2, utilizadas para
explorar os efeitos do knockdown de mTOR.
A primeira estratégia utilizada para verificar se mTOR pode participar da
regulação das vias de reparo de DNA, principalmente na mitocondria, foi avaliar a
expressão de proteínas envolvidas nessas vias. Inicialmente, as medidas dos níveis
de proteínas através de western blot revelaram que a expressão de APE1, Polγ e
TFAM se encontravam diminuídas nas linhagens com knockdown de mTOR, com
uma diminuição mais acentuada na linhagem KD2. APE1, em particular, apresentou
níveis praticamente indetectáveis em KD2 em todas as replicatas com amostras de
extratos totais (Figura 5), e níveis consideravelmente mais baixos no extrato
mitocondrial (Figura 9). Tal diminuição da expressão foi corroborada através da
quantificação do mRNA de APE1 por qRT-PCR (Figura 13). Essa diminuição
contrasta com o resultado esperado, uma vez que menor expressão e ativação de
mTOR está associada a efeitos protetores em resposta a estresses, e APE1 é uma
enzima essencial da via BER, cuja deleção em camundongos provoca letalidade
embrionária (Maynard et al., 2009; Puebla-Osorio et al., 2006; Sugo et al., 2000;
Tebbs et al., 1999; Xanthoudakis et al., 1996). Uma das bases alteradas reparadas
pela via BER é a 8-oxo-guanina, produto do ataque de EROs, que têm sido
historicamente associadas com envelhecimento (Harman, 1956), embora hajam
evidências contraditórias em relação a essa hipótese (revisto em Y. Liu et al., 2014).
105
Desta forma, dado que menor expressão de mTOR está relacionada a maior
longevidade, seria curioso notar que uma enzima que evitaria o acúmulo de lesões
provocadas por EROs poderia estar diminuida em situações de inibição de mTOR,
aonde a longevidade aumenta. Como não foram realizadas medidas de acúmulo de
danos oxidativos ao DNA nesse estudo não podemos fazer correlações diretas entre
a diminuição da expressão de APE1 e o acúmulo de lesões em DNA. Curiosamente,
é importante observar que, nos extratos mitocondriais (Figura 9), os níveis de APE1,
embora muito menores que os valores dos controles, eram bem mais elevados que
os valores demonstrados em extratos totais (Figura 5), nos quais a expressão de
APE1 em KD2 era praticamente indetectável. Isso demonstra que, aparentemente,
houve uma redução preferencial de APE1 nuclear/citosólica, em relação à
mitocondrial. Tal disparidade pode evidenciar uma importância maior dada pela
célula na manutenção do DNAmt em relação ao nuclear, embora mais experimentos
seriam necessários para suportar essa hipótese. Em especial, mais replicatas de
uma amostra mitocondrial seriam necessárias, uma vez que a quantidade de
mitoncôndrias isoladas foi suficiente apenas para um western blot de APE1.
Adicionalmente, é importante ter em mente que APE1 também possui uma atividade
redox capaz de estimular a ligação ao DNA de vários fatores de transcrição no
núcleo (revisto em Kelley et al., 2012). Essa atividade de fator de transcrição de
APE1 é regulada pela oxidação por EROs de resíduos de cisteína, e afeta o estado
redox tanto de fatores de transcrição ubíquos (como AP-1, Egr-1, NF-κB, p53,
CREB e HIF-1α) quanto de tecido-específicos (como PEBP-2, Pax-5, Pax-8 e TTF-
1). Logo, é possível que a diminuição observada nos níveis de APE1 tenha como
objetivo, principal ou paralelo, a diminuição da expressão dos genes sob controle de
APE1. Isso poderia explicar, possivelmente, porque houve uma diminuição mais
106
acentuada em extrato total, em relação ao extrato mitocondrial, uma vez que a maior
parte de APE1 em extrato total se encontra no núcleo, aonde pode ser exercida sua
função de coativador transcricional. Desta forma, se o objetivo da regulação de
APE1 por vias efetoras de mTOR fosse diminuir a co-ativação dos fatores de
transcrição sob influência de APE1, sua diminuição no núcleo, e não nas
mitocôndrias, seria essencial. Adicionalmente, como APE1 se transloca para o
núcleo em resposta a estresse oxidativo (Ramana et al., 1998), num cenário de
possível menor geração de EROs, devido a uma maior reserva respiratória das
células (Figura 17), seria razoável imaginar que a atividade de APE1 seria menos
requerida no núcleo em relação às mitocôndrias. Além do mais, é importante frisar
que o efeito de aumento da longevidade observado através da inibição de mTOR é
mediado pelo complexo mTORC1. O modelo utilizado nesse projeto possui
knockdown para mTOR, afetando, portanto, os dois complexos (mTORC1 e
mTORC2). Experimentos futuros serão necessários para determinar qual o
complexo envolvido nesse caso. Caso mTORC2 seja o responsável pela menor
expressão de APE1, é possível que essa menor expressão não ocorra em cenários
de aumento da longevidade, quando mTORC1 é inibido. No entanto, como existe um
feedback entre os dois complexos de mTOR, é possível, dada a força da inibição de
APE1, que ela ainda se mostre presente apenas com a inibição de mTORC1. Por
outro lado, nas avaliações dos níveis de APE1 em amostras de fígado de
camundongo com inibição e superativação de mTORC1, alterações nos níveis de
APE1 não foram detectadas (Figura 12). Tal resultado pode ser tecido-específico,
mas também pode indicar que APE1 pode estar sob controle de mTORC2, o que é
corroborado pelo fato de alguns dos fatores de transcrição afetados por APE1
estarem sob controle de mTORC2, através de sua influência em Akt, como p53 e
107
NF-κB e CREB (revisto em Kelley et al., 2012). Em especial, algumas evidências
apontam para um possível papel de p53 na regulação de BER, através de APE1
(Poletto et al., 2016). Poletto e colaboradores demonstraram uma regulação
negativa da expressão de APE1 por p53, possivelmente através da interação de p53
com o fator de transcrição Sp1, desestabilizando sua ligação com o DNA. Assim, a
superexpressão de p53 estaria associada a uma repressão nos níveis de APE1.
Como p53 é afetado por mTORC2 através de Akt/MDM2, menores níveis de
mTORC2 ocasionariam uma menor atividade de Akt, que, consequentemente,
estimularia menos MDM2, inibindo sua interação inibitória com p53, que estaria
superativado, e, portanto, inibindo a expressão de APE1. Quanto à função biológica,
foi postulado que esse mecanismo de regulação de APE1 por p53 teria como função
a regulação dos níveis de APE1 em resposta a quebras de fita simples de DNA, uma
vez que evitaria um acúmulo maior de quebras de fita simples, geradas por APE1,
que não são reparadas rápido o suficiente por outros componentes de BER. Desta
forma, é possível também que no modelo estudado nesse projeto uma diminuição na
expressão de mTOR tenha gerado, por meio possivelmente de uma diminuição no
metabolismo geral das células, uma menor quantidade de lesões oriundas de fontes
endógenas, diminuindo talvez a expressão de outras proteínas da via BER. Tal
diminuição requeriria uma diminuição concomitante de APE1, uma vez que níveis
muito maiores de APE1 em relação ao resto da via acabariam gerando muitas
quebras de fita simples que não seriam reparadas com velocidade suficiente.
Infelizmente, não foi possível avaliar os níveis de expressão das glicosilases (como
OGG1 e UDG) devido a problemas com os anticorpos.
Após a constatação da existência de uma menor expressão de APE1 em
linhagens knockdown de mTOR, foi medida a atividade de incisão de APE1 através
108
de um ensaio de atividade enzimática, tanto em extratos totais quanto mitocondriais.
Curiosamente, não foi possível detectar uma queda na atividade de incisão nas
linhagens com knockdown de mTOR em nenhum dos dois extratos (Figuras 14 e
15), mesmo em KD2, no qual a expressão de APE1 foi praticamente indetectável,
tanto por western blot quanto por qRT-PCR. Teoricamente, o sítio tetrahidrofurano,
análogo ao sítio abásico que serve de substrato para APE1, deveria ser específico
para APE1, evitando assim a ação de outras endonucleases/AP-liases. No entanto,
dado o resultado, não podemos descartar a possibilidade de outras enzimas terem
realizado a atividade de endonuclease. Vale ressaltar que os níveis de incisão
medidos foram altos, o que pode ter mascarado diferenças entre as linhagens. De
qualquer forma, se confirmados esses resultados podem indicar que a diminuição
significativa dos níveis proteicos de APE1, nesse modelo experimental, pode não
resultar em alterações significativas do reparo de lesões oxidativas. Por outro lado, a
diminuição nos níveis de APE1 observada pode estar ligada a sua atividade redox,
com a atividade de endonuclease de APE1 sendo compensada por outra(s)
enzima(s).
Similarmente, a diminuição da expressão de Polγ e TFAM também vai contra
o esperado (Figuras 6, 7, 10 e 11), embora a diminuição da expressão de TFAM
com inibição de mTORC1 já tenha sido observada na literatura (Morita et al., 2015).
TFAM possivelmente exerce um papel protetor no DNAmt, provavelmente ao
envolver o DNAmt e protegê-lo de danos por espécies reativas de oxigênio, e regular
a acessibilidade das enzimas de reparo de DNA (Tonolli, 2013). Uma menor
quantidade de TFAM poderia significar que o DNAmt está mais exposto a dano,
dado que a quantidade de DNAmt na célula fosse a mesma. A hipótese de que os
níveis menores de TFAM fossem decorrentes de menores números de cópias de
109
DNAmt foi testada através da quantificação do número de cópias de DNAmt por
qRT-PCR (Figura 21), e os resultados não mostraram diferenças significativas entre
as linhagens. Esse resultado contrasta com alguns resultados na literatura, que
demonstraram uma diminuição do número de cópias de DNAmt com a inibição de
mTORC1 (Nacarelli et al., 2014), embora não se saibam os efeitos de mTORC2
nesse caso. A diminuição de Polγ, apesar de essa ser também importante para
BER, pode estar relacionada à menor taxa de crescimento e proliferação das
linhagens com knockdown de mTOR. Inibição de mTOR provoca uma diminuição
geral no metabolismo, evidenciado pelas medidas de taxa de consumo de oxigênio e
taxa de acidificação do meio (Figuras 17, 18, 19 e 20). Além do mais, como o
número de cópias de DNAmt e atividade de citrato sintase (indicando a massa
mitocondrial) não estavam diminuídos (Figura 22), isso indica que a menor utilização
de energia pelas células resulta em um aumento na reserva respiratória (Figura 17),
a diferença entre a taxa de respiração utilizada e a capacidade máxima. Em cenários
como esse, o fluxo de elétrons pela cadeia de transporte de elétrons é mais
constante, e ocorrem menos vazamentos de elétrons, que poderiam produzir radical
ânion superóxido. Assim, com uma menor geração de EROs, talvez fosse
necessária menos atividade de Polγ no reparo do DNAmt. Uma menor geração de
EROs com a inibição de mTOR estaria de acordo com a literatura (Miwa et al., 2016;
Nacarelli et al., 2014).
A realização do experimento de citometria de fluxo, com células tratadas com
azul de metileno (Figura 23), teve por objetivo avaliar a sensibilidade das células a
danos causados por estresse oxidativo mitocondrial. O azul de metileno (AM) é um
composto fenotiazínico de estrutura tricíclica, que apresenta uma cor azul intensa, e
uma carga positiva líquida em pH fisiológico. AM é um fotossensibilizador, com
110
máximo de absorção em 656 nm (Calzavara-Pinton et al., 2012). Como a maioria
dos fotossensibilizadores, AM gera oxigênio singlete de forma eficiente por reações
fotoquímicas do tipo II (Oleinick et al., 2002). Devido à sua carga, foi inicialmente
proposto que AM teria localização mitocondrial. No entanto, foi demonstrado que há
colocalização significativa de AM em lisossomas (Gabrielli et al., 2004; Mellish et al.,
2002). Dentre as possíveis respostas celulares à formação de lesões oxidativas está
a indução de apoptose. Desta forma, ao tratar as quatro linhagens com azul de
metileno, foi possível verificar, através da quantidade de células em sub-G1 (um
indicativo de morte celular), quais linhagens pareciam mais resistentes ao estresse
oxidativo. Conforme pode ser observado na Figura 23, as linhagens com knockdown
de mTOR apresentaram uma quantidade menor de células em sub-G1, com KD2
apresentando pouquíssima variação em todas as concentrações de AM. Isso indica
que, possivelmente, as células com menos mTOR estão de fato protegidas do dano
por estresse oxidativo, pelo menos quando utilizada população sub-G1 como
medida. Se esse resultado fosse interpretado em face à diminuição dos níveis
proteicos de APE1 detectada em células mTOR-KD, pareceria um pouco
contraditório. No entanto, conforme foi observado no ensaio de incisão, a atividade
de incisão permaneceu inalterada, indicando que talvez não tenha havido nenhum
prejuízo na atividade da via BER, pelo menos no reparo de danos causados por
estresse oxidativo. Muito embora deva ser notado que a relação de mTOR com
apoptose não é completamente compreendida, e em pelo menos alguns contextos
uma menor sinalização de mTOR pode inibir apoptose, talvez através da liberação
do feedback negativo de mTORC1 na via de insulina/PI3K/Akt. De fato, uma
sinalização mais elevada de Akt foi observada em biopsias de pacientes de câncer
111
após o tratamento com everolimus, um análogo de rapamicina (Tabernero et al.,
2008).
Um outro desenho experimental para avaliar a proliferação de células tratadas
com AM, não pôde ser concluído. Isso se deve ao fato de as células KD2, com
knockdown mais forte de mTOR, possuírem aderência ao substrato muito reduzida.
Essa propriedade impediu a realização do experimento devido a necessidade de
muitas etapas envolvendo a troca de soluções nos poços. Mesmo com o número de
trocas sendo diminuído através da eliminação de lavagens e utlização de um meio
de cultura transparente, evitando a necessidade de retirada do meio para irradiação,
ainda houve grande perda de células nos poços da linhagem KD2, com mais de 80%
das células sendo removidas durante o experimento. Como uma boa execução do
experimento depende da conservação do número de células, de modo a se poder
avaliar a proliferação através da quantidade de DNA, a perda massiva de células em
uma das linhagens tornou o experimento inviável. Essa diminuição da aderência de
células com expressão reduzida de mTOR é consistente com o que é reportado na
literatura (L. Chen et al., 2015).
Nesse estudo investigamos diretamente se os níveis proteicos de mTOR afetam
atividades de reparo de DNA e a susceptibilidade celular a agentes que induzem
estresse oxidativo mitocondrial. Em conjunto, nossos resultados indicam que
diminuições nos níveis de mTOR alteram pelo menos duas enzimas da via BER,
APE1 e Polγ, além de TFAM. No entanto, as diminuições nos níveis dessas enzimas
parecem, pelo menos em primeira análise, não afetar a capacidade de incisão e de
proteção contra estresse oxidativo das células, indicando que mais análises devem
ser feitas para entender melhor o que está ocorrendo a nível molecular nos modelos.
Possivelmente, outras vias compensatórias podem estar agindo. As alterações nos
112
níveis de mTOR também não afetaram a capacidade respiratória das células, pelo
menos com as medidas utilizadas. Adicionalmente, não sabemos exatamente qual
complexo de mTOR estaria envolvido na regulação, embora hajam algumas
suspeitas de que mTORC2 seja o responsável. Tudo isso indica que, embora ainda
não perfeitamente compreedido, mTOR tem alguma influência na regulação da
manutenção do genoma, tanto nuclear quanto mitocondrial. Mais estudos serão
necessários para corroborar e explorar os detalhes, bem como a extensão, dessa
influência de mTOR.
113
6. Conclusões e perspectivas
mTOR parece afetar os níveis de expressão de APE1 através de um de seus
dois complexos, com algumas suspeitas indicando que o complexo 2 pode
ser o envolvido no processo. Experimentos inibindo os dois complexos
separadamente no mesmo modelo poderiam elucidar qual está envolvido.
Adicionalmente, após a identificação do complexo envolvido, inibição de
proteínas à jusante de mTORC 1 ou 2 ajudaria a elucidar a via envolvida na
regulação de APE1;
Os níveis menores de expressão de APE1 não acarretaram, pelo menos com
as metodologias utilizadas, em menor capacidade de incisão ou menor
resistência a estresse oxidativo. Outros experimentos poderiam ser feitos para
complementar a análise e corroborar os achados;
A inibição de mTOR não pareceu alterar o número de cópias de DNAmt ou a
massa mitocondrial. Isso indica que a capacidade respiratória das células
continua a mesma; e
TFAM e Polγ também tiveram suas expressões diminuídas; como o número
de cópias de DNAmt é igual em todas as linhagens, isso sugere que o DNAmt
deve estar menos coberto por TFAM, deixando-o mais exposto. No entanto, a
medida de população sub-G1 após tratamento com AM indicou níveis
menores de morte celular, indicando que, apesar de provavelmente estar
mais exposto a estresse oxidativo induzido por AM, as células estão mais
protegidas.
114
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