2 Biologia da Propagação Clonal

No processo evolutivo das técnicas de propagação de plantas, o

desenvolvimento da ciência, aliado ao processo produtivo, mostrou-se sempre

necessário para alcançar os objetivos almejados na multiplicação e preservação de

material genético selecionado. O conhecimento de algumas áreas da propagação de

plantas é considerado imprescindível ao bom desempenho no processo de

multiplicação destas. Hartmann et al. (2002), por exemplo, citam a arte da

propagação, a ciência da propagação e o conhecimento das plantas.

A arte da propagação: o sucesso da propagação de plantas requer domínio da técnica para manipulação adequada do seu crescimento. Características como habilidade, prática, dedicação e experiência pessoal na condução do processo de propagação das plantas são indispensáveis. A existência de informações científicas de determinadas técnicas e uma ampla aplicação das mesmas, para as mais variadas espécies e usos, facilitam a adoção de uma em detrimento da outra de forma mais racional e viável na propagação daquela planta.

A ciência da propagação: a propagação de plantas requer perspicácia e conhecimento quanto a morfogênese, desenvolvimento e crescimento, bem como, conhecimento básico de física, química, nutrição e aspectos de ecologia do ambiente de propagação. Estes conhecimentos podem ser obtidos empiricamente durante o processo de propagação das plantas e incrementados pelo conhecimento adquirido no ensino formal de química, física, botânica, genética e fisiologia de plantas, assim como das informações científicas advindas dos avanços obtidos na pesquisa científica.

12

O conhecimento das plantas: no processo evolutivo das técnicas de propagação, as várias técnicas foram avaliadas, aperfeiçoadas e, ou, ajustadas às diferentes exigências fisiológicas e ambientais de cada espécie, em função dos objetivos desejados, das experiências adquiridas, avanços tecnológicos e da estrutura disponível. Assim, o sucesso da propagação está no conhecimento das plantas e das técnicas adequadas a ela em uma dada condição e necessidade.

As três áreas de conhecimento da propagação de plantas mencionadas são

complementares e necessárias, em que a teoria compartilhada com a prática, aliada

ao conhecimento da planta que está sendo multiplicada permitem alcançar os

objetivos com maior eficiência e qualidade.

A maioria das espécies lenhosas normalmente é de natureza heterozigótica,

imposta pela alogamia quase que obrigatória no processo de reprodução das

plantas e, na maioria das espécies, a forma principal e natural de propagação é por

via seminal. Diante disso, a alternativa utilizada no setor florestal para a obtenção de

materiais superiores, visando atingir determinados propósitos, foi a utilização da

propagação vegetativa no processo de produção de mudas clonais.

As expressões “propagação vegetativa”, “propagação assexuada” e

“propagação clonal” de plantas têm sido utilizadas rotineiramente para designar a

multiplicação e produção de novas plantas usando propágulos vegetativos de uma

planta ou clone específico. No entanto, em algumas situações, determinada

expressão pode ser preferida em função dos objetivos que esta busca enfocar;

assim, a expressão “propagação assexuada” tem sido utilizada, principalmente,

quando pretende-se referenciar o modo de reprodução de uma planta; a expressão

“propagação vegetativa” tem sido utilizada mais para referenciar a forma de

propagação de uma planta em um processo de produção de mudas; e quando se

tratar de produção de mudas de um determinado clone, a expressão “propagação

clonal” tem sido empregada. Logicamente que estas expressões têm sido utilizadas

de forma indiscriminada, e que em muitas das situações elas são formas alternativas

de expressar a forma de propagação de uma determinada planta. Outras

expressões como “propagação agâmica” e “propagação somática” também são

encontradas na literatura para referenciar este tipo de propagação de plantas. No

entanto, de forma geral, a expressão “propagação vegetativa” tem sido aquela com

maior difusão nas diversas áreas que atuam com a propagação de plantas.

13

Princípios Biológicos da Propagação de Plantas

Na propagação vegetativa, a mitose é o processo responsável pelo controle,

desenvolvimento e crescimento das plantas, na qual é mantida a identidade genética

da planta matriz. Dessa forma, um propágulo constitui-se de parte de uma

determinada planta usada para produzir uma ou mais novas plantas. Entre os vários

tipos de propágulos incluem-se as sementes (propagação sexuada), estacas,

estruturas florais, segmentos vegetativos e vários tipos de estruturas especializadas

como gemas, calos, bulbos, estolões. O uso de um propágulo em detrimento de

outro está em função dos objetivos desejados, da espécie, disponibilidade de

material vegetativo e estrutura de propagação disponível.

A ciência da propagação vegetativa de plantas baseia-se em alguns dos

princípios básicos da biologia. Em um processo de organogênese in vitro, por

exemplo, segundo Peres (2002), várias são as etapas envolvidas na regeneração de

uma planta (Figura 1).

Figura 1 - Etapas envolvidas na regeneração de uma planta em um processo de propagação

por organogênese in vitro. Adaptado de Peres (2002).

“Organogênese” significa o processo de neoformação de partes aéreas,

raízes ou de outros tipos de explantes, na condição in vitro ou in vivo; contrastando

com a “embriogênese” na qual se forma uma estrutura semelhante ao embrião, com

eixo polar (radícula - parte aérea) completo. A condição in vitro indica, literalmente,

no vidro, termo aplicado para designar crescimento de células, tecidos ou órgãos

vegetais em meio de cultura, sob condições assépticas.

“Desdiferenciação” constitui-se no processo pelo qual uma célula

diferenciada perde suas características específicas, reassumindo atividades

meristemáticas, ou seja, processo de alcançar um estado meristemático não

diferenciado em células previamente diferenciadas.

Propágulo

Desdiferenciação

Aquisição de competência Indução

Determinação Diferenciação Regeneração Planta

14

O termo “competência” é usado para descrever o potencial de uma

determinada célula ou tecido em se desenvolver em uma forma particular, como por

exemplo, a competência para iniciar enraizamento adventício, um embrião ou uma

flor. O desenvolvimento da competência por um tecido requer certa quantidade de

tempo e, ou exposição a um sinal endógeno ou exógeno.

A “indução” indica o que causa a iniciação ou desenvolvimento de uma

estrutura ou processo. O termo “determinação”, refere-se ao grau de

comprometimento que um grupo de células tem perante a um direcionamento

naquele momento. A “diferenciação” significa as mudanças fisiológicas, morfológicas

e anatômicas que ocorrem em uma célula, tecido, órgão ou planta, durante o

desenvolvimento do estado meristemático ou juvenil para o adulto.

Todo o processo de regeneração de uma planta pela propagação vegetativa

somente é possível dada a totipotencialidade das células vegetais em manifestar,

em momentos diferentes e sob estímulos apropriados, a potencialidade em iniciar

um novo indivíduo multicelular. Em vista da “totipotência” que toda célula viva

possui, esta tem potencial para reproduzir um organismo inteiro, desde que possua

informação genética para tal expressão gênica. O termo “expressão gênica” refere-

se aos padrões de desenvolvimento e crescimento das plantas, decorrente da

informação genética contida no genoma daquela planta, associada às condições

ambientais. Dessa forma, as variações fenotípicas observadas em plantas são

manifestações resultantes das informações genéticas para formação de suas

estruturas, padrões de crescimento e funções, exercendo controle primário no

processo de propagação.

Embora a organogênese seja um processo considerado empírico, segundo

Peres (2002), o desenvolvimento de um protocolo é facilitado se forem seguidos

alguns princípios e conhecimentos fisiológicos. De acordo com este autor,

normalmente o sucesso da propagação por organogênese in vitro é dependente

principalmente da etapa de aquisição de competência, pois quando um explante

falha em desenvolver organogênese in vitro, essa se dá normalmente na etapa de

aquisição de competência. Contudo, pouco se conhece, até o momento, sobre os

mecanismos envolvidos neste processo.

De acordo com o exposto, o conhecimento dos princípios básicos da biologia

ajuda a compreender melhor a propagação de uma planta, facilitando a sua

multiplicação clonal, assim como acompanhar a história do desenvolvimento do

15

organismo durante o seu ciclo vital, ou seja, a “ontogenia” da planta.

Ação Hormonal nas Plantas

Hormônios vegetais são um grupo de substâncias orgânicas de ocorrência

natural que, em pequenas concentrações, influenciam os processos fisiológicos de

crescimento, diferenciação e desenvolvimento (DAVIES, 1995). São substâncias

conhecidas há muito tempo, entretanto, sua ação nas plantas foi melhor entendida

nos últimos anos.

Dentre os hormônios de plantas mais conhecidos e de interesse na

propagação de plantas destacam-se as auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e

ácido abscísico. Em certas condições, essas substâncias possuem efeito quando

aplicadas nas plantas exogenamente, sendo denominadas de reguladores de

crescimento vegetal e, ou fitorreguladores.

Auxinas: São compostos com atividade biológica similar aquela do ácido indol-3-

acético (AIA), incluindo a capacidade de promover o alongamento de coleóptilos de

segmentos de caules, divisão celular em culturas de calos em presença de

citocininas, formação de raízes adventícias em folhas ou caules destacados e outros

fenômenos do desenvolvimento relacionados com a ação do AIA (TAIZ & ZEIGER,

2004).

Segundo Válio (1985), as auxinas são sintetizadas nas plantas,

principalmente, em regiões de crescimento ativo, como o meristema apical, gemas

axilares e folhas jovens, sendo translocadas para diferentes órgãos, segundo o

mecanismo de transporte polar e basípeto. O AIA é a principal auxina nos vegetais

superiores (TAIZ & ZEIGER, 2004) e, segundo os mesmos autores, embora quase

todos os tecidos vegetais sejam capazes de produzir baixos níveis de AIA, os

meristemas apicais, as folhas jovens, os frutos e as sementes em desenvolvimento

são os principais locais de síntese deste hormônio. A aplicação da auxina em órgãos isolados promove aumento da resposta,

paralelamente ao aumento da concentração até certo nível, após o qual ocorre um

efeito inibitório. Entretanto, a resposta da planta à auxina endógena ou exógena,

16

varia tanto com a natureza do tecido, quanto com a concentração da substância

presente.

As principais aplicações das auxinas na propagação de plantas são a

indução de raízes adventícias em estacas e o controle da morfogênese na

micropropagação. Segundo Taiz & Zeiger (2004), as auxinas também promovem o

crescimento de caules e coleóptilos, inibem o crescimento de raízes, regulam a

dominância apical, retardam o início da abscisão foliar e regulam o desenvolvimento

das gemas florais e frutos.

Fisiologistas têm buscado definir o modo de ação química das auxinas nas

plantas. Acredita-se que a promoção de crescimento pelas auxinas ocorre por meio

de dois mecanismos: a) pela promoção de transporte de íons de H+

O equilíbrio entre a auxina e citocinina é uma das relações primárias na

propagação de plantas, em que uma alta relação auxina/citocinina favorece o

enraizamento; uma baixa relação favorece a formação de brotações e; um alto nível

de ambas favorece o desenvolvimento de calo. Vale salientar, também, que a

interação entre citocinina, ácido abcísico e giberelinas controla a dormência de

pelas paredes

celulares, aumentando sua extensão; e b) pela indução da transcrição de RNAm

específico necessário para promover o crescimento. Em morfogênese, a aplicação

de auxina parece capaz de apagar programas de diferenciação celular, revertendo

células em estado de diferenciação e reabilitando a divisão celular.

Dentro do grupo das auxinas, Taiz & Zeiger (2004) salientam que o AIA

ocorre em todos os vegetais, mas outros compostos relacionados apresentam

atividade auxínica; mostarda e milho contém ácido indol-3-butírico (AIB). Além do

AIA, várias outras substâncias com funções regulatórias de crescimento semelhante

e com aplicação na propagação das plantas são produzidas sinteticamente: ácido

indol-3-butírico (AIB), ácido naftalenoacético (ANA), o 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-

D), entre outros.

Citocininas: Constituem um grupo de hormônios de grande importância no

crescimento das plantas, visto os efeitos na divisão celular e diferenciação de

gemas. Os meristemas dos ápices radiculares são as regiões da planta de maior

síntese de citocininas livres, as quais parecem se mover pelo xilema até a parte

aérea, juntamente com a água e os sais minerais absorvidos pelas raízes (TAIZ &

ZEIGER, 2004).

17

sementes.

Além dos efeitos na divisão celular, as citocininas também são importantes

na morfogênese in vitro pela indução do caule, no crescimento de caules e raízes,

na expansão foliar, no movimento dos nutrientes, no retardamento da senescência

foliar, entre outros (DAVIES, 1995; TAIZ & ZEIGER, 2004).

As citocininas de maior interesse na propagação de plantas e de ocorrência

natural são a Zeatina (ZEA) e a Isopenteniladenina (2iP). Quanto às citocininas

produzidas sinteticamente, além das citadas anteriormente, existem a 6-

benzilaminopurina (BAP), Cinetina (KIN) e o Thidiazuron (TDZ).

Giberelinas, Ácido Abscísico e Etileno: As giberelinas ocorrem em altas

concentrações nas sementes imaturas e nos frutos em desenvolvimento e possuem

importante função na germinação e no controle da dormência. Ocorrem também em

altas concentrações em ápices caulinares, sendo transportadas no interior da planta

pelo xilema e floema (DAVIES, 1995). Entre as funções nas plantas estão aquelas

relacionadas com a promoção do alongamento de brotações por meio da divisão

celular e alongamento, além da regulação da transição da fase juvenil para a adulta

em muitas plantas lenhosas. Mais de 125 formas de giberelinas foram encontradas

nas plantas, embora somente algumas se apresentam fisiologicamente ativas e, em

particular GA1 e GA4, são responsáveis pelos efeitos nas plantas, sendo as demais

precursores ou metabólitos (TAIZ & ZEIGER, 2004). O ácido giberélico (GA3

Na Tabela 1 é apresentado um resumo das principais classes de

) é uma

das mais importantes como produto comercial.

O ácido abscísico enquadra-se na classe de inibidores de crescimento e é

considerado importante em muitas atividades das plantas. Na propagação de

plantas, este inibidor está envolvido na germinação e dormência, bem como, na

embriogênese e produção das sementes (HARTMANN et al., 2002).

O etileno é um regulador de crescimento gasoso com estrutura química

muito simples e que, segundo Hartmann et al. (2002), pode ter efeitos profundos no

crescimento das plantas, incluindo a epinastia quando em altas concentrações,

senescência e abscisão de folhas e frutos, promoção do florescimento, estimulação

das gemas laterais e estimulação da produção do látex. Na propagação, o etileno

pode induzir enraizamento adventício, estimular a germinação em algumas

sementes e superar dormência.

18

reguladores de crescimento e os respectivos componentes mais aplicados na

propagação das plantas. Salienta-se que as concentrações de uso e formas de

preparo variam muito em função da técnica de propagação adotada, do tipo de

material e da espécie utilizada.

Tabela 1 - Classes de reguladores de crescimento e respectivos componentes mais

aplicados na propagação das plantas.

Classes de Reguladores

Abreviatura Massa Molar (g mol-1

Nome Químico )

AUXINAS

AIA 175,2 Ácido indol-3-acético AIB 203,2 Ácido indol-3-butírico ANA 186,2 Ácido naftalenoacético 2,4-D 221,0 Ácido 2,4-diclorofenoxiacético

CITOCININAS

Zea 219,2 N6

2iP -(4-hidroxi-3-metilbut-2 enil) aminopurina (zeatina)

203,2 Isopenteniladenina BAP 225,3 6-benzilaminopurina TDZ 220,2 Thidiazuron KIN 215,2 6-furfuriloamino-purina

GIBERELINAS GA 346,4 3 Ácido giberélico

INIBIDORES ABA 264,3 Ácido abscísico

Outros hormônios: além das substâncias citadas, outros compostos químicos

naturais ocorrem em plantas e são considerados como hormônios. Incluem-se nesta

classe as poliaminas, os brassinoesteróides, os jasmonatos, os salicilatos, alguns

complexos oligossacarídeos e inositol trifosfato.

Juvenilidade e Maturação em Plantas Lenhosas

As plantas apresentam ao longo de sua vida consecutivos períodos de

crescimento vegetativo (formação de caule, folhas e raízes) e de desenvolvimento

reprodutivo (formação de flores, frutos e sementes), determinados por padrões

sazonais baseados em mudanças climáticas (temperatura, luz e/ou precipitação) e

pela resposta às mudanças durante o ciclo de vida.

Ciclos de vida superiores a dois anos caracterizam as plantas perenes, as

quais apresentam repetidos ciclos vegetativo-reprodutivos, anualmente,

bianualmente ou em períodos mais longos. Em geral, arbustos têm maior período de

19

juvenilidade em relação às árvores e, embora a fase madura ocorra em plantas

herbáceas anuais e perenes, esta é geralmente menor quanto à duração e, as

mudanças nas características morfo-fisiológicas associadas às trocas de fase, são

menos distintas do que em outras plantas (HACKETT, 1987). As mudanças

ocorridas durante estes ciclos apresentam grande importância no processo de

propagação de plantas, em que pode-se caracterizar as seguintes fases (Figura 2):

Fase juvenil: caracterizada pela predominância de características juvenis; correspondente ao estádio inicial de crescimento vegetativo das plantas após a germinação e, em algumas plantas, pela incapacidade dos meristemas apicais em induzir florescimento, mesmo que condições favoráveis para tal existam. Fase de transição juvenil/adulta: caracteriza-se pela transição entre a fase vegetativa e reprodutiva, ou seja, pela passagem da planta da fase juvenil para uma condição madura. Fase adulta: corresponde àquela fase com predominância de características maduras em relação às juvenis. É caracterizada, principalmente, pela fase reprodutiva das plantas, ou seja, pela fase em que ocorre o florescimento e frutificação da planta.

Figura 2 – Fases do ciclo de vida das plantas perenes.

O ciclo de vida de muitas espécies refere-se às fases juvenil e adulta, nas

quais as características morfológicas e fisiológicas são diferentes. Após a

germinação da semente, a planta inicia uma fase de crescimento vegetativo muito

vigoroso, durante a qual a floração não pode ser induzida, mesmo que as condições

Fase juvenil Fase de transição Fase adulta

Semente Senescência

20

externas sejam favoráveis (SALISBURY & ROSS, 1978). Assim, a fase juvenil de

algumas plantas é caracterizada pelo não florescimento, grande vigor e presença de

espinhos; a fase adulta pelo florescimento e frutificação, reduzido vigor e ausência

de espinhos (HARTMANN et al., 2002).

Quanto à regulação da troca de fase, evidências predominantes sugerem

que a planta necessita ter um determinado tamanho antes de entrar na fase adulta

(HACKETT, 1987). Além disso, segundo Hackett & Murray (1993), as mudanças

ocorridas em função da troca de fase com o desenvolvimento da planta variam de

espécie para espécie, sendo que as maiores alterações ocorrem no período

precedente à maturação, resultando em formas transicionais. Segundo estes

autores, as características relacionadas à maturação são estáveis, porém reversíveis

para determinadas características, variando em decorrência do tempo de

desenvolvimento. Para Greenwood (1992), a maturação é uma determinação celular

regulada por fatores intrínsecos e extrínsecos das células do meristema apical.

A maturação freqüentemente é confundida com a idade cronológica, embora

a maturação seja reversível sob certas condições e a idade provavelmente não. De

forma geral, com o avanço da idade, a planta ou órgão tende à senescência e morte,

enquanto o meristema apical adulto de plantas pode ter sua juvenilidade restaurada,

ou seja, rejuvenescida (HUANG et al., 1990). Segundo Hackett & Murray (1993),

as características de maturação se arquivam em função da sua relativa

estabilidade e são transmitidas por meio das divisões celulares de uma

geração somática para a próxima. Com base na conceituação de maturação apresentada por Fortanier &

Jonkers (1976), pode-se descrever três tipos de idade em uma planta:

Idade cronológica: refere-se ao tempo decorrido desde a germinação da semente até a data de observação da planta, ou seja, é a idade registrada do tempo de vida de uma planta ou propágulo. Idade ontogenética: refere-se a passagem da planta por sucessivas fases de desenvolvimento, as quais incluem a embriogênese, germinação, crescimento vegetativo e reprodutivo. Corresponde a maturação da planta, passando pela fase juvenil, de transição juvenil-adulta e adulta. Idade fisiológica: corresponde ao aspecto de vigor fisiológico da planta, como sanidade e status nutricional e hídrico. Refere-se aos aspectos negativos da idade, tais como a perda de vigor, aumento da susceptibilidade às condições adversas ou a deterioração em geral.

21

De modo geral, em algumas espécies florestais, há um gradiente de

juvenilidade ontogenética em direção à base da árvore, sendo este variável entre

espécies (HACKETT, 1987), o que promove um aumento da maturação em função

da maior proximidade com o meristema apical (GREENWOOD & HUTCHISON,

1993). A maior juvenilidade da região basal das plantas se deve ao fato de que os

meristemas mais próximos da base foram formados em uma fase com maior grau de

juvenilidade, dada a proximidade com a fase de germinação, do que os das regiões

terminais que possuem maior grau de maturação (Figura 3).

O conhecimento do gradiente de juvenilidade em plantas lenhosas é de

grande importância em um processo de propagação clonal, uma vez que a origem

dos propágulos vegetativos utilizados possui efeito marcante na produção de mudas

e no comportamento da futura planta. Os propágulos vegetativos de diferentes

posições da planta retêm os níveis específicos de juvenilidade (ou maturidade)

quando são retirados da planta e propagados vegetativamente. Como resultado, a

morfologia e a fisiologia das plantas resultantes dos propágulos oriundos das

diferentes partes da planta matriz podem apresentar diferenças significativas dentro

das três categorias de fase juvenil, juvenil/adulta e adulta.

O conhecimento da espécie, a definição dos objetivos a serem alcançados

com determinada técnica de propagação vegetativa, a escolha e o uso correto dos

propágulos vegetativos é de extrema importância. Quando desejado um

comportamento mais juvenil da planta a ser propagada, deve-se utilizar propágulos

oriundos das partes mais juvenis (fase juvenil) da planta matriz. Por outro lado,

Figura 3 – Gradiente de juvenilidade em plantas lenhosas. (A): região com maior grau de juvenilidade ontogenética. (B): região com maior grau de maturidade ontogenética. A

B

22

quando se deseja uma planta com comportamento maduro, tal como a manifestação

do florescimento precoce e porte reduzido, deve-se preferir propágulos oriundos das

partes mais adultas (fase adulta) da planta matriz.

Na propagação vegetativa das plantas, os conceitos apresentados

anteriormente são de grande importância em função dos diferentes tipos de

propagação de plantas e dos objetivos almejados. A compreensão do ciclo de vida

das plantas facilita o entendimento da biologia da propagação e serve como suporte

nas atividades de multiplicação clonal em espécies florestais. O entendimento da

troca da fase juvenil para a adulta permite conduzir com maior sucesso o processo

de clonagem de árvores selecionadas, resultando em maior eficiência da etapa de

seleção, melhoramento e clonagem e, conseqüentemente, em uma silvicultura clonal

intensiva mais eficiente.

Efeitos da Maturação

Na propagação clonal em espécies florestais, as principais conseqüências

da mudança da fase juvenil para a adulta de uma planta, estão relacionadas aos

efeitos no crescimento, efeito topófise e ciclófise, mudanças nas características

foliares e caulinares, capacidade de enraizamento, competência reprodutiva,

alterações bioquímicas e expressão gênica.

A mudança de fase em espécies florestais é um fenômeno bem mais

complexo, onde estão envolvidos um número bem maior de alterações do que as

aqui apresentadas, as quais, na sua maioria, ainda não são bem conhecidas e

entendidas.

Hábito e Vigor de Crescimento das Plantas Entre os principais efeitos da maturação relacionados ao crescimento de

espécies florestais estão aqueles relacionados com o hábito de crescimento e os

efeitos no crescimento em altura e diâmetro das plantas.

O crescimento das brotações das plantas pode variar em função da

maturidade dos propágulos que as originaram. Segundo Greenwood & Hutchison

(1993), na propagação vegetativa pela enxertia ou estaquia, por exemplo, as plantas

23

originadas de propágulos juvenis possuem maior tendência em apresentar hábito de

crescimento ortotrópico do que aquelas plantas originadas de propágulos mais

maduros. Dependendo da espécie, pode-se observar plantas com nítido hábito de

crescimento plagiotrópico quando esta origina-se de propágulo vegetativo maduro

na propagação clonal. O crescimento plagiotrópico refere-se à situação em que

algumas plantas propagadas vegetativamente assumem um crescimento desviado

da posição vertical (ortotropia) e continuam seu crescimento de forma similar a uma

ramificação lateral (crescimento plagiotrópico).

Segundo dados experimentais de Greenwood & Hutchison (1993) e Parker

et al. (1998), árvores originadas por enxertia ou enraizamento de estacas de

propágulos juvenis de Tsugar canadensis e Pinus taeda tendem a exibir maior

número de brotações por unidade de área, bem como maior tendência ao

crescimento ortotrópico, em comparação com aquelas de propágulos maduros.

Em Araucaria angustifolia e Coffea arabica, mudas produzidas por

enraizamento de estacas coletadas de brotações laterais continuam tendo

crescimento plagiotrópico, enquanto estacas coletadas de brotações da parte apical

se desenvolvem normalmente (HARTMANN et al., 2002), sendo a mesma resposta

encontrada em Platanus occidentalis (LAND et al., 1995).

Para espécies do gênero Eucalyptus, não foram encontrados estudos

referentes aos efeitos de gradientes de maturidade dos propágulos utilizados na

propagação. Porém, em níveis de viveiro e campo, podem-se observar plantas com

características que lembram o crescimento plagiotrópico (Figura 4).

Figura 4 – Hábito de crescimento em mudas. (A): Eucalyptus sp.; (B): Grevillea robusta. Crescimento ortotrópico à esquerda e plagiotrópico à direita, respectivamente.

Na literatura têm sido amplamente abordados os conceitos de topósise e

ciclófise, embora estes ainda não sejam bem compreendidos. Em espécies

florestais, estes efeitos possuem especial importância, visto as dificuldades

A B

24

encontradas na propagação vegetativa em várias situações na produção de mudas.

Para o presente caso, topófise refere-se ao efeito na propagação clonal resultante

da diferença de estágio de desenvolvimento potencial fisiológico do meristema

apical, quando comparado com outras áreas meristemáticas da planta,

independentemente do processo de maturação do meristema apical (DODD &

POWER, 1988). Em outras palavras, o fenômeno de topófise pode ser entendido

como um efeito da origem do propágulo vegetativo que se manifesta nos processos

assexuados de reprodução, através da menor ou maior performance na propagação

vegetativa. A ciclófise refere-se ao efeito na propagação clonal decorrente do

processo de maturação do meristema apical. É o estádio em que se encontram as

regiões meristemáticas da planta no momento da seleção do propágulo vegetativo

(DODD & POWER, 1988). Pode-se dizer que o efeito topófise relaciona-se com a

idade fisiológica e o efeito ciclófise relaciona-se com a idade ontogenética.

Os termos topósise e ciclófise podem se confundir quando analisados

quanto à morfologia dos propágulos vegetativos envolvidos no processo de

propagação clonal. Nesse processo, a minimização destes efeitos está na utilização

de propágulos vegetativos fisiologicamente mais novos e em idade ontogenética

mais juvenil quanto possível. Exceções são apresentadas em algumas coníferas

florestais, como a Araucaria angustifólia, na qual pode ser observado que os

propágulos vegetativos provenientes das brotações apicais (ortotrópicas) originam

plantas com crescimento tipicamente na vertical, enquanto que propágulos

provenientes das brotações laterais (plagiotrópicas) resultam em plantas com

crescimento na horizontal, independentemente da idade dos propágulos vegetativos.

Crescimento em Altura e Diâmetro das Plantas Informações científicas contemplando a influência do grau de maturação do

propágulo vegetativo no crescimento em altura e diâmetro das plantas propagadas

vegetativamente, são pouco conhecidas e compreendidas. No entanto, segundo

Greenwood & Hutchison (1993), a capacidade de crescimento em altura e diâmetro

de uma planta pode ser afetada pelo uso de propágulos vegetativos provenientes de

árvores de diferentes idades. Segundo estes autores, pesquisas demonstram a

redução na capacidade de crescimento em altura e diâmetro, com o envelhecimento

ontogenético, na propagação clonal por enxertia e/ou por estaquia a partir de

25

propágulos com diferentes idades. Salientam, ainda, que isto pode ser decorrente do

decréscimo da capacidade de enraizamento com o aumento da maturação, onde

menores crescimentos em altura e diâmetro podem ser função de um menor vigor do

sistema radicial em propágulos mais maduros utilizados em um processo de

propagação clonal. Propágulos vegetativos mais juvenis não somente produzem

maior crescimento do caule, mas também sustentam maior produção de folhas e

biomassa (GREENWOOD, 1992).

O estádio juvenil possibilita o maior crescimento vegetativo da planta e a

produção de grande área foliar, como também a produção de fotoassimilados a

serem, posteriormente, utilizados no desenvolvimento dos frutos e do sistema

radicular, facilitando a absorção de água e íons do solo (BOLIANI, 1986).

Alguns autores têm sustentado que o reduzido crescimento em diâmetro e

altura em árvores mais velhas é devido ao aumento da complexidade e tamanho da

árvore, isto é, à idade e não à maturação (HACKETT, 1987; ZIMMERMANN et al.,

1985, citados por GREENWOOD & HUTCHISON, 1993). Mas, de acordo com

estes, o fato de enxertos de mesmo tamanho inicial, de árvores com diferentes

idades, apresentarem taxas de crescimento diferenciadas indica que o decréscimo

do potencial de crescimento é também relacionado às características de maturação.

A mesma conclusão pode ser extraída de pesquisa realizada por Parker et al.

(1998), que, avaliando mudas originárias de enxertia em plantas de Pinus elliottii,

após seis anos no campo, observaram crescimentos em altura e diâmetro

significativamente superiores em mudas resultantes de enxertos com idade de 6 a 9

anos (juvenis), em comparação com aquelas de enxertos com idades acima de 40

anos. Enfim, as informações científicas indicam que menor vigor pode ser

decorrente do envelhecimento, maturação ou ambos.

Anatomia Foliar e Caulinar Durante o desenvolvimento ontogenético, a planta apresenta uma série de

alterações morfológicas e fisiológicas relacionadas com partes foliares e caulinares,

tais como mudanças de forma (Figura 4), dimensão, pigmentação (clorofila e

antocianina), atividade fotossintética, entre outras. Segundo vários autores

(BOLIANI, 1986; HACKETT, 1987; FOUDA, 1996; HARTMANN et al., 2002), estas

mudanças decorrem da troca da fase juvenil para a adulta, afetando sensivelmente a

26

propagação vegetativa das plantas. Em Eucalyptus, por exemplo, na fase juvenil as

folhas são largas, extensas e sem pecíolo, enquanto na fase adulta são alongadas e

apresentam um pecíolo distinto (Figura 5A e 5C). Diferenças similares podem ser

observadas para algumas espécies do gênero Pinus (Figura 5B).

Figura 5 - Diferenças morfológicas entre brotos na fase juvenil e adulta de algumas plantas lenhosas. (A): Eucalyptus benthamii, (B): Pinus canariensis; (C): Eucalyptus globulus. Brotos adultos à esquerda e juvenis à direita, respectivamente.

Em algumas situações tem sido relatada a maior resistência foliar a doenças

com o envelhecimento ontogenético e, segundo Greenwood & Hutchison (1993),

especula-se que seja devido a maior resistência a penetração do fungo. Segundo

FOUDA (1996), folhas de ramos juvenis apresentam forma mais cônica, a epiderme

recoberta por uma fina camada de cutícula com alta densidade estomatal, mesófilo

espesso com ductos de resina menores e em menor concentração do que em folhas

adultas; ramos juvenis apresentam córtex, floema, zona cambial, medula e raios do

xilema e floema mais espessos do que adultos.

Em Tectona grandis, o número de elementos de vaso, comprimento e

largura dos elementos de vaso e de fibra foram menores em estacas caulinares

oriundas de plantas juvenis, com dois meses de idade (HUSEN & PAL, 2006). Estes

valores cresceram com o aumento da idade da planta matriz, sendo maiores

naquelas de 30 anos. Segundo os autores, as referidas características anatômicas

podem ser usadas como marcadores confiáveis do grau de maturação na espécie

estudada e, talvez, para outras espécies.

Capacidade de Enraizamento Adventício Uma das mais consistentes expressões da maturação em plantas lenhosas

A B

C

27

refere-se ao potencial de regeneração, em que a redução da capacidade do

enraizamento de propágulos vegetativos, com o envelhecimento ontogenético, tem

sido considerado como um dos principais efeitos na propagação clonal.

Vários estudos indicam que o potencial de enraizamento de propágulos

vegetativos, obtidos em diferentes alturas da planta matriz, varia com o gradiente de

maturação. Assim, propágulos coletados do ápice e dos ramos laterais das plantas

geralmente apresentam menor potencial de enraizamento do que aqueles coletados

das regiões mais próximas à base da árvore, embora ocorram grandes variações em

termos de espécies.

Para a maioria das espécies lenhosas, estacas de mudas juvenis,

provenientes de sementes, enraízam facilmente, enquanto outras provenientes de

plantas mais velhas o fazem com maiores dificuldades, ou definitivamente não

enraízam. Vale salientar que a juvenilidade muitas vezes se perde antes mesmo da

planta alcançar a maturação reprodutiva.

Estudos em plantas de Tsugar heterophylla têm indicado que o potencial de

enraizamento de propágulos coletados de diferentes alturas da árvore matriz trazem

evidências da existência de um gradiente de maturação, com o grau de maturação

aumentando à medida que se aproxima do ápice da planta (GREENWOOD &

HUTCHISON, 1993).

O gradiente de maturação e seus efeitos no enraizamento podem variar

entre as diferentes espécies. Para Eucalyptus grandis, por exemplo, trabalhos têm

evidenciado que estacas cotiledonares têm alto potencial de enraizamento,

enquanto estacas coletadas acima do 150 nó apresentam baixo enraizamento ou

não enraízam (HACKETT, 1987). Para Eucalyptus viminalis e Eucalyptus pauciflora,

Hackett (1987), relata que o alto potencial de enraizamento é perdido

completamente após o 4o nó. Em Eucalyptus camaldulensis, esse mesmo autor

relata enraizamento de 40-50% em estacas do 100o nó e em Eucalyptus deglupta,

100% de enraizamento em estacas coletadas acima do 100o

Há várias décadas tem sido estudado o efeito da idade sobre o

enraizamento de estacas de Hevea brasiliensis (seringueira). Gregory (1951) cita

que além da diminuição dos índices de enraizamento com o aumento da idade da

planta fornecedora de propágulos, o tempo de enraizamento também é bastante

influenciado. Segundo este autor, nesta época dados experimentais com matrizes de

Hevea brasiliensis indicaram que estacas obtidas com plantas de 1 mês de idade

nó.

28

apresentaram 95% de enraizamento aos 28 dias, sendo observado a redução

gradual do percentual de enraizamento e aumento do tempo de resposta ao

enraizamento a medida que as estacas foram obtidas de matrizes mais velhas.

Estas resultaram em apenas 7,5% de enraizamento aos 65 dias em plantas com 13

meses de idade e nenhuma resposta a partir de 24 meses de idade nas condições

experimentais adotadas. Também, Stahel (1947) cita que a propagação de Hevea

brasiliensis por estacas é bem sucedida somente quando estacas são coletadas de

plantas muito novas ou de partes basais do caule de plantas mais velhas.

Para Ilex paraguariensis (erva-mate), Sand (1989) obteve enraizamento de

91,7% e 39,4% em estacas caulinares e foliares, respectivamente, provenientes de

plantas matrizes de um ano de idade, enquanto que apenas 6,8% e 2,6% para

aquelas oriundas de plantas de 60 anos. Estes resultados indicam que o fator

juvenilidade se perde após três anos de idade, sem, no entanto, terem ainda

alcançada a maturação reprodutiva, a qual iniciaria após o quinto e sexto ano de

vida.

Além do aumento dos percentuais de enraizamento em propágulos mais

juvenis, a melhor qualidade e a maior rapidez de formação do sistema radicial

também têm sido citadas (GOMES, 1987), denotada pelo aumento no vigor radicial

(número e comprimento de raízes) relatado por Schneck (1996). Sand (1989) avaliou

o comprimento médio das maiores raízes de estacas oriundas de plantas de erva-

mate com seis meses, 18 meses e 60 anos de idade em comparação com estacas

oriundas de rebrotes de plantas de 60 anos. Obteve 11,5; 10,6; 8,4; e 5,8 cm,

respectivamente, para os quatro tratamentos, ressaltando a importância do fator

juvenilidade dos propágulos no vigor do sistema radicial.

De maneira geral, pode-se admitir que quanto mais juvenil for o propágulo

vegetativo a ser propagado, maior é a chance de sucesso de enraizamento quer em

termos de percentual, rapidez de formação e qualidade das raízes, quer pela

capacidade de crescimento da nova planta.

Competência Reprodutiva A competência reprodutiva, definida como a capacidade das plantas para a

formação de estruturas reprodutivas sob condições naturais ou induzidas, tem sido

utilizada tradicionalmente como critério para caracterizar a fase adulta da planta, ou

29

seja, a mudança da fase juvenil para adulta (HACKETT & MURRAY,1993;

HARTMANN et al., 2002). Na maioria dos casos, a produção regular de flores é o

único critério prático para identificação do final da fase juvenil em uma planta

(HACKETT, 1987).

Entretanto, recentemente este critério de troca de fase tem sido bastante

questionado, uma vez que a inaptidão de plantas jovens em florescer não

necessariamente indica incompetência reprodutiva, visto que a manipulação das

condições ambientais ou tratamentos hormonais pode induzir a floração

repetidamente nestas plantas (GREENWOOD & HUTCHISON, 1993). Na grande

maioria dos casos, porém, a competência reprodutiva se manifesta quando a planta

apresenta um tamanho mínimo e entra no estado maduro.

Na maioria das coníferas, características como a relação de estróbilos

masculinos e femininos produzidos têm sido usada como melhor indicador do estado

de maturação quando comparado à competência reprodutiva. De modo geral,

quanto maior a idade destas plantas, maior a produção de estróbilos masculinos em

relação aos femininos (GREENWOOD & HUTCHISON, 1993).

Alterações Bioquímicas Uma série de estudos têm sido conduzidos em espécies lenhosas visando a

identificação de marcadores bioquímicos de juvenilidade dos propágulos. Em

Castanea sativa, Vazquez & Gesto (1982) encontraram maiores teores endógenos

de substâncias promotoras de enraizamento em propágulos juvenis. Garcia et al.

(2000) avaliaram possíveis diferenças na composição protéica de vários órgãos

juvenis e adultos de plantas de oliveira (Olea europeae). Concluíram que a

composição protéica de órgãos adultos e juvenis de uma mesma planta ou de

plantas diferentes foi qualitativamente similar, porém, pelo menos um grupo de

polipeptídeos de 29 kDa foi mais fortemente expresso em tecidos adultos. Relações

similares também foram obtidas em vários cultivares de diferentes origens genéticas.

Níveis endógenos de reguladores de crescimento têm sido medidos em

tecidos juvenis e maduros de várias espécies por diferentes autores. Segundo

extensa revisão realizada por Hackett (1987), há diferenças dos conteúdos

endógenos de auxinas e outros promotores entre tecidos juvenis e adultos, os

maiores teores foram encontrados em propágulos juvenis em relação aos maduros.

30

Estudos realizados por Mullins (1985), Fouret et al. (1986), Moncalén et al (2001)

resultaram na conclusão de que propágulos maduros apresentaram maior conteúdo

de ABA, quando comparado aos juvenis. Resultados similares foram encontrados

para cultivares de macieira. Moncalén et al (2001) e Andrés et al. (2002) concluíram

que a relação citocinina / IAA decresce com o decorrer da maturação dos

propágulos. Day et al. (1995) concluíram que folhas juvenis continham mais

citocininas ativas do que folhas adolescentes ou adultas. Geneve (1985), citado por

Hackett (1987), encontrou diferenças significativas entre conteúdo de etileno em

tecidos maduros e juvenis, porém, estas diferenças não afetaram o percentual de

enraizamento.

Em estudo com Pinus radiata, Fraga et al. (2002) concluíram que indivíduos

juvenis foram caracterizados por um menor grau de metilação de DNA e uma alta

relação de poliaminas livres e poliaminas solúveis conjugadas com ácido perclórico,

enquanto que árvores adultas mostraram maior grau de metilação no DNA e uma

baixa relação de poliaminas livres e poliaminas solúveis conjugadas com ácido

perclórico. Baseados nestes resultados, os autores propuseram que ambos os

indicadores estariam relacionados com a perda da habilidade morfogênica com o

avanço da maturação e, conseqüentemente, com a não-aptidão de estabelecimento

in vitro de propágulos adultos de Pinus radiata.

Além das variações entre tecidos juvenis e adultos citadas anteriormente,

outras têm sido relatadas, como a concentração de proteínas solúveis em tecidos,

concentração de DNA em folhas (ALI & WESTWOOD, 1966), teor de poliaminas

(REY et al., 1994), conteúdo de clorofila (HUANG et al., 2003) e de antocianina nas

folhas (GREENWOOD, 1992; HACKETT & MURRAY, 1993).

Expressão Gênica A expressão gênica também é influenciada pelos efeitos da maturação dos

tecidos vegetais, pois a ativação ou supressão gênica transcricional ocorre de forma

diferenciada ao longo do desenvolvimento das plantas. Pesquisas têm reportado o

efeito da idade ontogenética dos propágulos na expressão gênica, principalmente

dos genes relacionados à fotossíntese. Hutchison et al. (1990) mostraram que a

família do gene CAB é mais fortemente expressada em propágulos juvenis de

plantas de Larix SP crescendo sob condições de luz em relação a propágulos

31

adultos. Os mesmos autores não encontraram diferenças na expressão dos genes

rbc S com a idade. Woo et al. (1994) demonstraram que os pecíolos juvenis e

adultos de Hedera helix crescidos in vitro responderam diferentemente a expressão

de HW 101 e HW 103 mRNA. Na seqüência, Kuo et al. (1995) descreveram um

sistema de fosforilação em Sequoia no qual uma proteína de 32 kDa pode ser

fosforilada somente em tecidos adultos enquanto que naqueles juvenis uma proteína

de 31 kDa foi fosforilada.

De modo geral, existem poucas informações disponíveis quanto ao

relacionamento entre a expressão gênica e a mudança de fase (maturação) em

plantas lenhosas. Os modelos buscando explicar a regulação da expressão gênica

na maturação são mais especulativos do que preditivos.

Rejuvenescimento e Revigoramento

Na silvicultura clonal, a seleção dos clones ocorre normalmente na fase

adulta da árvore devido a maior confiança no processo seletivo, visto a árvore

expressar o seu máximo potencial silvicultural, tecnológico, adaptação a sítios

específicos, entre outras, na idade de rotação desejada, para determinada

finalidade.

Em geral, a eficiência do processo seletivo dos clones é inversamente

relacionada com a facilidade de propagação vegetativa. Dessa forma, para obtenção

de sucesso na multiplicação de plantas adultas, é necessário explorar a maior

capacidade de propagação de material juvenil, seja pela utilização de propágulos

provenientes de partes juvenis da planta, seja pela promoção do rejuvenescimento

de partes da planta adulta.

Rejuvenescimento pode ser considerado como uma forma de reverter a

planta do estádio adulto para o juvenil, recuperando a competência da totipotência.

Em geral, algumas características relacionadas à maturação mostram-se mais fáceis

de serem revertidas do que outras e os respectivos tratamentos para promoção do

rejuvenescimento influenciam de forma diferenciada, sugerindo que o

rejuvenescimento ocorre em termos relativos e não absolutos (HACKETT &

MURRAY, 1993). De forma geral, pode-se dizer que a maturação é estável, mas

32

reversível ou manipulável em certas condições, e que o rejuvenescimento pode

ocorrer de forma total, parcial ou progressiva.

Uma série de métodos para reverter ou manter a juvenilidade das plantas

tem sido descritos: aplicação de ácido giberélico; propagação vegetativa seriada;

poda drástica ou poda de gemas apicais; neodiferenciação de gemas; apomixia,

meiose para células, indução de ramos adventícios em porções de raízes, utilização

do crescimento juvenil originado dos esferoblastos (crescimento em forma de

“verrugas” que às vezes são encontradas no caule), entre outros. Hackett (1987) cita

a propagação sexuada natural como sendo o método mais eficiente em promover o

rejuvenescimento de partes adultas de uma planta, uma vez que se origina a parte

mais juvenil da planta (embrião) a partir da parte mais madura (órgão frutífero).

Entretanto, entre os métodos de rejuvenescimento mais utilizados na área

florestal, relacionam-se à propagação vegetativa seriada pela enxertia, pela estaquia

e pela micropropagação, sendo os demais menos estudados e relatados, resultando

em menores conhecimentos dos seus efeitos sobre o rejuvenescimento ou

manutenção da juvenilidade.

Com relação ao revigoramento, esta metodologia consiste em adotar

práticas culturais que propiciem maior vigor fisiológico à planta de tal forma que

origine propágulos vegetativos com melhor performance na propagação clonal.

Dessa forma, a adoção de manejo nutricional e hídrico buscam uma melhoria na

condição fisiológica da planta, assim como o uso da poda drástica visa a indução de

brotações dormentes em regiões mais juvenis, constituindo-se em um método de

revigoramento eficiente em um processo de propagação clonal.

Rejuvenescimento por Enxertia Seriada

Neste processo, propágulos maduros são enxertados em partes juvenis de

um porta-enxerto e, a partir de sua brotação, são coletados novos propágulos os

quais são novamente enxertados em um novo porta-enxerto juvenil, e assim

seriadamente até obter os resultados desejados (Figura 6). Dessa forma, o

rejuvenescimento pela enxertia seriada consiste em enxertar em série propágulos

vegetativos do clone desejado.

A enxertia seriada é um método de rejuvenescimento que demanda muito

tempo (ELDRIDGE et al., 1994), podendo ainda apresentar problemas de

33

incompatibilidade (KIM et al., 1993) em algumas espécies florestais. Para Eucalyptus

e Pinus este método de rejuvenescimento tem sido aplicado em algumas

circunstâncias nos programas de silvicultura clonal.

Figura 6 - Esquema para rejuvenescimento pela técnica da enxertia seriada visando a restauração da competência ao enraizamento adventício de estaca de Pinus taeda.

O grau de rejuvenescimento obtido depende do número de re-enxertias do

enxerto no porta-enxerto juvenil, bem como da espécie/clone envolvido (HUANG et

al., 1990). Resultados experimentais têm mostrado que duas (KIM et al., 1993),

quatro (KAO & HUANG, 1993; ASSIS, 1996) ou quatro a seis (ELDRIDGE et al.,

1994) re-enxertias são suficientes para rejuvenescer o material até o ponto deste

enraizar facilmente, tendo-se suas variações em termos de espécie/clone.

A técnica de rejuvenescimento por enxertia seriada foi empregada com

sucesso na obtenção de material juvenil satisfatório para o enraizamento de estacas

de matrizes selecionadas de Pinus oocarpa e Pinus caribaea var. hondurensis, após

a terceira enxertia seriada (MURAYAMA & FERRARI, 1988). Em experimentos de

enxertia seriada com Eucalyptus x trabuti, Siniscalco e Pavolettoni (1988) concluíram

que propágulos adultos foram revertidos a condições juvenis, de forma gradual

1a Enxertia

Árvore

Selecionada

Obtenção de resposta ao Enraizamento

2a Enxertia

Enxertia “n”

34

conforme os sucessivos ciclos de enxertia. Nas seis re-enxertias feitas, os resultados

de sobrevivência dos enxertos encontrados foram: 52%, 69%, 78%, 71%, 57% e

76%, respectivamente, da primeira até a sexta re-enxertia.

Para seringueira (Hevea brasiliensis), Muzik & Cruzado (1958) testando o

enraizamento de propágulos oriundos de plantas com uma a cinco enxertias

seriadas (matrizes de 8 a 10 anos de idade), obtiveram em torno de 30% de

enraizamento em oito semanas com estacas coletadas de plantas com a quarta e

quinta re-enxertia. Segundo os mesmos autores, estacas coletadas do clone original

e da primeira, segunda e terceira enxertias, não obtiveram nenhuma resposta para

enraizamento.

O fato de enxertar propágulos adultos de uma planta em porta-enxertos

juvenis promover o rejuvenescimento evidencia a translocação de substâncias da

parte juvenil (porta-enxerto) para a parte adulta (enxerto), induzindo um estádio mais

juvenil nesta última. No entanto, Hackett (1987) salienta que o potencial de

enraizamento (que atualmente ainda é a maior expressão de maturidade ou

juvenilidade) de tecidos juvenis e adultos é uma característica das células do sítio de

iniciação radicial, não sendo, portanto, relacionado à translocação de promotores ou

inibidores.

Alternativamente, o rejuvenescimento pela enxertia seriada realizada em

condições in vitro, denominada de enxertia in vitro ou microenxertia, pode ser obtido

com maior rapidez e eficiência em comparação a enxertia convencional, uma vez

que propágulos com menores dimensões e mais juvenis são utilizados. A

microenxertia ou enxertia in vitro consiste em enxertar, sob condições assépticas,

um meristema ou ápice caulinar sobre um porta-enxerto estabelecido in vitro.

Aplicações da enxertia in vitro, visando o rejuvenescimento de algumas espécies de

plantas, são descritas por diversos autores. Pliego-Alfaro & Murashige (1987) e

Zaczek & Steiner (1997), por exemplo, obtiveram resultados satisfatórios mediante o

uso da enxertia in vitro com explantes coletados de plantas adultas, mostrando a

restauração da competência ao enraizamento para Persea americana e Quercus

rubra. Huang et al. (1996) citam que sucessivas enxertias in vitro, em curtos

intervalos de tempo, a partir de ápices meristemáticos extraídos de tecidos adultos

de Sequoia sempervirens, restauraram características juvenis mais rapidamente,

podendo esta técnica ser aplicada com o propósito de rejuvenescimento.

Kretzschmar & Ewald (1994) e Ewald & Kretzschmar (1996) também confirmaram a

35

influência do rejuvenescimento por meio da enxertia in vitro, em explantes oriundos

de árvores adultas de Larix na propagação clonal desta espécie. Em Eucalyptus,

Bandeira (2004) concluiu que a enxertia in vitro apresenta potencial de aplicação no

rejuvenescimento de clones adultos de interesse comercial.

Rejuvenescimento por Estaquia Seriada Neste processo, propágulos maduros (estacas) são enraizados e a partir de

sua brotação, são coletados novos propágulos (estacas) os quais são novamente

enraizados e, assim, seriadamente, até obter os resultados desejados. Desta forma,

o rejuvenescimento pela estaquia seriada consiste em enraizar em série, propágulos

adultos do clone desejado.

O efeito da confecção de estacas a partir de brotações das estacas

enraizadas em relação ao rejuvenescimento em Eucalyptus spp, resultando em

efeito positivo sobre o enraizamento, foi citado por Eldridge et al. (1994). Segundo

estes autores, resultados satisfatórios no enraizamento de Eucalyptus, decorrentes

do efeito do rejuvenescimento, podem ser obtidos após duas ou mais gerações de

estaquia seriada.

Segundo Wendling (2002), em avaliação da miniestaquia seriada em quatro

clones de Eucalyptus grandis, após sete subcultivos, esta técnica mostrou-se mais

eficiente no rejuvenescimento de clones com menor grau de juvenilidade, para as

características de enraizamento, sobrevivência, vigor radicial e aéreo. O

reaparecimento de características morfológicas juvenis e melhoria no enraizamento

de estacas pelo uso da estaquia seriada, também foi mencionado por Bonga &

Aderkas (1993).

Entretanto, apesar destas citações de uso da estaquia seriada visando o

rejuvenescimento em espécies florestais, ainda existem poucos relatados com base

científica, embora a técnica seja considerada potencial para tal propósito.

Rejuvenescimento por Micropropagação O rejuvenescimento por micropropagação consiste em estabelecer em

cultura in vitro explantes do clone desejado, subcultivar sucessivamente em meio de

cultura adequado com reguladores de crescimento, resultando em plantas com

características mais juvenis.

36

Em muitos casos, os resultados obtidos pelo uso da micropropagação

visando obter efeitos de rejuvenescimento são comparáveis aos da enxertia e

estaquia seriada. Nestas condições, rejuvenescimento parcial tem sido obtido pelos

sucessivos subcultivos de meristemas apicais de brotos micropropagados,

proporcionando melhoria no enraizamento de gemas alongadas in vitro. Segundo

Bonga & Aderkas (1993), após cinco ou seis subcultivos in vitro, clones adultos de

Eucalyptus são considerados suficientemente rejuvenescidos ou com reatividade

capaz de permitir uma subseqüente propagação por estaquia. Entretanto, vale

salientar que as dificuldades inerentes ao processo de micropropagação, bem como,

a própria resposta das espécies à cultura in vitro, proporciona respostas

diferenciadas, onde somente após alguns subcultivos pode-se avaliar a resposta do

rejuvenescimento.

Segundo Franclet et al. (1987), a técnica da micropropagação é eficiente no

rejuvenescimento de propágulos maduros, embora muitas espécies arbóreas

maduras não possam ser micropropagadas em escala comercial, provavelmente em

razão da falta de otimização das condições de cultura in vitro e do número

insuficiente de subcultivos adotados. Em experimento conduzido com explantes de

Sequoia sempervirens coletados de árvores com 50 e 500 anos de idade, esses

autores chegaram à conclusão de que o principal fator de rejuvenescimento pela

micropropagação foi o tempo de exposição dos explantes a citocinina BAP

(benzilaminopurina). Assim, menores períodos entre um subcultivo e outro

aumentaram o rejuvenescimento, principalmente, dos propágulos das árvores de

500 anos.

Uma aplicação direta do rejuvenescimento pela micropropagação seriada na

área florestal é a propagação clonal pela microestaquia, a qual é baseada no

máximo aproveitamento da juvenilidade dos tecidos vegetais, cujo desenvolvimento

e aplicação em Eucalyptus tiveram como origem os trabalhos realizados por Assis et

al. (1992). Na propagação clonal de alguns clones de Eucalytpus pela microestaquia

no Brasil, onde o objetivo principal é a melhoria da performance de enraizamento

das microestacas, resultados satisfatórios têm sido obtidos após 10 a 12 subcultivos

pela micropropagação, onde os efeitos de rejuvenescimento alcançados são

atribuídos principalmente aos subcultivos intensivos e da utilização da citocinina

BAP (benzilaminopurina) nos meios de cultura.

Titon (2001), avaliando a sobrevivência na saída da casa de vegetação,

37

enraizamento na saída da casa de sombra e sobrevivência das mudas aos 50 dias,

observou, em clones de Eucalyptus, resultados superiores na microestaquia em

relação à miniestaquia. Essa diferença foi mais pronunciada em clones com maior

dificuldade de enraizamento, indicando, nesses casos, possível efeito de

rejuvenescimento dos clones com o uso da microestaquia. Para o mesmo

experimento, as mudas oriundas da microestaquia apresentaram altura e diâmetro

de colo aos 50 dias e peso de matéria seca de raiz aos 28 dias iguais ou superiores

aos da miniestaquia, reforçando a suposição de maior grau de juvenilidade das

microestacas em detrimento das miniestacas.

Também resultados de pesquisa obtidos por Xavier et al. (2001) apontaram

a eficiência do rejuvenescimento de dois clones híbridos de Eucalyptus grandis pela

micropropagação, a qual foi constatada pela superioridade dos resultados obtidos

na microestaquia sobre a miniestaquia, em relação ao percentual e velocidade de

enraizamento. No entanto, tem sido constatado que após algum período de coleta

de microestacas nas microcepas, estas têm perdido gradativamente o grau de

juvenilidade obtido pelo rejuvenescimento quanto ao enraizamento, indicando que o

rejuvenescimento obtido pela micropropagação não é permanente. Da mesma

forma, o uso de mudas de microestacas não reproduz os mesmos efeitos de

juvenilidade das mudas de micropropagação.

Apesar das dificuldades encontradas para propagação clonal pela

micropropagação de clones de Eucalyptus, esta tem sido considerada como a

principal técnica potencial para incrementar o enraizamento de gemas alongadas in

vitro, principalmente devido aos recentes avanços com plantas transgênicas,

embriogênese somática e a tecnologia de sementes sintéticas usadas para restaurar

a condição juvenil de plantas fisiologicamente maduras.

De modo geral, a micropropagação tem sido considerada como uma técnica

com grande potencial no rejuvenescimento de espécies florestais. Entretanto, esta

técnica ainda carece de desenvolvimento científico para sua plena utilização, além

de ser uma técnica onerosa e exigir mão-de-obra especializada.

Revigoramento Vegetativo De forma geral, pode-se caracterizar o revigoramento como certas práticas

culturais visando propiciar maior vigor fisiológico em brotações da planta de tal forma

38

que proporcione propágulos vegetativos vigorosos e responsivos à propagação

clonal.

Existem inúmeras formas de se obter o revigoramento vegetativo, sendo que

uma das principais utilizadas na silvicultura clonal é pelas podas drásticas ou corte

raso. Neste processo, propágulos juvenis são obtidos pelo abate de árvores adultas

selecionadas buscando induzir o crescimento de gemas dormentes existentes na

base da cepa. Este procedimento de obtenção de propágulos vegetativos está

baseado no fato de que as características juvenis são mantidas naquela porção de

crescimento da árvore. Assim, com base no gradiente de juvenilidade em árvores,

brotações juvenis surgem a partir das gemas dormentes presentes na porção da

cepa remanescente, após serem dadas às condições para crescimento em função

da retirada do efeito de dominância apical exercido pela parte aérea decepada pelo

abate da árvore. Este sistema tem sido usado com sucesso na produção de estacas

mais juvenis de Eucalyptus, onde após a decepa da árvore, as brotações obtidas

são utilizadas como a base para a propagação clonal comercial desta espécie.

Outras formas de obtenção de brotações juvenis como o anelamento e o uso do

fogo na base da planta matriz também são citadas (ALFENAS et al., 2004).

O revigoramento por tratos silviculturais também tem sido adotado com

eficiência no processo de propagação clonal. Dentre estes, citam-se adubações,

irrigações e manejo direcionado para a obtenção de maior número possível de

brotações vigorosas.

Outra forma de revigoramento em plantas são as podas sucessivas, as quais

visam aumentar a produção de propágulos vigorosos e manter a juvenilidade dos

mesmos. Este procedimento é o que vem sendo adotado em jardins clonais, nos

seus diferentes sistemas de manejo das cepas, em que as mesmas são mantidas

baixas para produção de brotações juvenis aptas para a formação de propágulos

com bom potencial de enraizamento.

O melhor conhecimento das exigências nutricionais, hídricas e de manejo

dos clones componentes de programas de silvicultura clonal também leva à

formação de brotações mais vigorosas e aptas para o processo de propagação

vegetativa. Em Eucalyptus, isto se comprova pelo fato de que clones com maior

tempo no programa de clonagem respondem melhor ao enraizamento e formação

das mudas, visto seu melhor conhecimento e ajuste mais refinado de suas

exigências.

39

Em algumas situações, ocorre certa confusão entre revigoramento e

rejuvenescimento, em que revigoramento refere-se ao vigor fisiológico

proporcionado pela prática adotada, enquanto que o rejuvenescimento obtido pelas

diferentes técnicas citadas anteriormente buscam a obtenção de uma reversão da

maturação para uma condição mais juvenil.

Efeito “C” (Efeito da “Clonagem”)

O “efeito C” ou “efeito da clonagem”, amplamente conhecido no setor

florestal, refere-se aos efeitos não genéticos, decorrentes das interações de ações

no processo de produção de mudas, interações com o meio ambiente, interação

nutricional e fisiológica (efeito ciclófise e topófise), o qual modifica a resposta

esperada na clonagem, ou seja, crescimento por igual das plantas originárias de um

mesmo clone.

Segundo Scarassati (1993), o efeito “C” que causa esta alteração nos clones

não pode e não deve ser visto como uma anomalia do desenvolvimento da planta,

mas sim como um fator que não pode ser controlado durante o processo e, ou que

por falta de conhecimento adequado, não é controlado. De forma geral, o efeito “C”

pode ser agrupado em efeito decorrente das variações ambientais, variações no

padrão de qualidade das mudas produzidas e dos aspectos de morfologia e

fisiologia dos propágulos vegetativos utilizados na propagação clonal.

Entre os efeitos ambientais, pode-se citar aqueles relacionados com a

densidade de plantio, competição nutricional, diferenças entre a região de seleção e

a região do plantio do clone (interação clone x ambiente), idade de avaliação, entre

outros. Quantos aos efeitos decorrentes do padrão de qualidade das mudas, estes

são aqueles atribuídos a desuniformidade no processo de produção das mesmas,

levando a heterogeneidade na sua qualidade, gerando padrões de respostas de

crescimento desiguais no futuro plantio clonal.

O efeito “C” decorrente dos aspectos de morfologia e fisiologia dos

propágulos vegetativos recai, principalmente, sobre os efeitos ciclófise e topófise.

Com o advento das técnicas de miniestaquia e microestaquia, as variações em

40

termos morfológicos e fisiológicos entre mudas de um mesmo clone têm sido

reduzidas (diminuição do efeito “C”) em virtude de uma menor variação nos padrões

de propágulos utilizados.

Frampton & Foster (1993) citaram que o efeito “C” tem merecido a atenção

da comunidade científica e a sua quantificação tem sido realizada por diversas

maneiras, como a instalação de testes clonais visando mensurar a magnitude do

efeito “C” decorrente do efeito da idade ontogenética.

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