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Captulo 1 Introduo

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1.1 O Sistema Nervoso Central

O Sistema Nervoso divide-se em Sistema Nervoso Central, em ingls, Central

Nervous System (CNS) e Sistema Nervoso Perifrico, em ingls, Peripheral Nervous

System (PNS). Ao CNS chegam as informaes relacionadas com os sentidos (viso,

audio, olfacto, paladar e tacto) e dele partem as ordens destinadas aos msculos e

glndulas. Ele constitudo por encfalo (constitudo pelo crebro, cerebelo e tronco

cerebral) e pela medula espinhal, que se situa dentro do canal raquidiano e a partir da

qual se ramificam os nervos (figura 1).

Figura 1- Sistema Nervoso Central [Fonte: www.images.com/image/281944/illustration-of-t...].

http://www.images.com/image/281944/illustration-of-the-brain-spinal-cord-and-peripheral-nerves-anterior-view-shown-are-the-location-in-the-body-left-and-a-detail-of-the-brain-spinal-cord-and-upper-peripheral-nerves-right/?&results_per_page=1&detail=TRUE&page=57

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No CNS existem a substncia cinzenta e a substncia branca. A substncia

cinzenta corresponde s partes do CNS nas quais se concentram os corpos celulares e os

dendritos das clulas nervosas, a substncia branca quase s constituda por axnios

de clulas nervosas. O CNS tambm contm muitas outras clulas que pertencem ao

tecido conjuntivo e em conjunto denominam-se glia ou neuroglia. H cinco tipos de

clulas gliais: os astrcitos, os oligodendrcitos, as clulas de Schwann, clulas da

microglia e clulas ependimrias. Estas clulas desempenham diversas funes, entre as

quais, a formao da mielina (material lipoproteico que envolve as fibras e aumenta a

velocidade de transmisso dos impulsos nervosos) e desempenham um papel importante

nos processos imunitrios que tm lugar no CNS. Os nervos unem o encfalo e a

medula espinhal (CNS) s regies perifricas. Os neurnios so clulas especializadas

que intervm na obteno de sensaes, no processamento de informao, no processo

cognitivo, bem como no controlo da actividade muscular e glandular. Cada neurnio

(figura 2) formado por um corpo celular, ncleo celular, situado no interior do corpo

celular e um ou vrios prolongamentos. Estes prolongamentos denominam-se dendritos,

quando transmitem os impulsos para o corpo da clula ou axnios quando transmitem

os impulsos para o exterior (Kahle et al, 1993; Garcia e Coelho, 2009).

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Figura 2 - Neurnio. Impulso nervoso num nervo normal e num nervo lesado [Fonte:

http://angola-africa.forum-ativo.com/o-nosso-corpo-f26/doencas-degenerativas-t107.htm].

A comunicao entre os neurnios um processo rpido, graas ao revestimento

dos neurnios com bainha de mielina e que requer energia. Existem nos axnios

segmentos descontnuos de mielina, essenciais para a conduo rpida do impulso

nervoso. Os canais de sdio (Na+) sensveis voltagem produzem impulsos nervosos e

esto concentrados nos ndulos de Ranvier (pequenos segmentos de axnio

desmielinizado que se encontram entre os interndulos de mielina individuais). O

impulso nervoso propaga-se rapidamente de ndulo em ndulo, segundo um processo

denominado conduo saltatria (Dutta et al, 2006). Quando h leso da mielina (figura

http://angola-africa.forum-ativo.com/o-nosso-corpo-f26/doencas-degenerativas-t107.htm

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2), ocorre uma lentificao na transmisso do impulso nervoso e a comunicao

neuronal fica comprometida.

1.2 A maquinaria mitocondrial como principal fonte de energia

Os neurnios so altamente dependentes da energia do metabolismo oxidativo e

os axnios em particular consomem quantidades significativas de adenosina trifosfato

(ATP), o qual usado primeiramente para fornecer energia ao sdio/potssio ATPase

(Na+/K

+), para remover os ies de Na

+ que entram no axnio durante a passagem do

impulso nervoso.

Os nutrientes provenientes da dieta alimentar, nomeadamente os hidratos de

carbono, so metabolizadas em piruvato, no citosol celular, que depois convertido, na

matriz mitocondrial, em acetil-cenzima A, que processado por enzimas de fase aquosa

no ciclo dos cidos tricarboxlicos (TCA) ou ciclo de Krebs. Este ciclo gera NADH e

FADH2, intermedirios com elevado potencial redutor, que so dadores de electres

para a Cadeia Respiratria Mitocondrial, em ingls, Mitochondrial Respiratory Chain

(MRC), na membrana interna mitocondrial (Kid, 2005).

As mitocndrias, para alm de serem consideradas uma espcie de centrais

energticas das clulas, so tambm o local de um nmero importante de funes

celulares, incluindo as vias essenciais do metabolismo intermedirio, biossntese de

amino-cidos, metabolismo de esterides, controlo da concentrao do Ca2+

e apoptose.

Estes organelos possuem mltiplas cpias do seu prprio genoma e maquinaria de

traduo, que funciona de forma semi-autnoma. O genoma mitocondrial humano

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(mtDNA) consiste numa molcula circular de DNA em dupla hlice, com cerca de 16,6

kb, que contm 37 genes codificantes para 13 polipeptdeos essenciais para o sistema da

MRC, bem como 22 tRNAs e 2 rRNAs necessrios para a sntese proteica mitocondrial

(Leonard et al, 2000). O nmero de mitocndrias por clula depende da necessidade

energtica de cada tecido. A principal funo da mitocndria gerar energia,

essencialmente na forma de ATP. A mitocndria gera mais de 90% das necessidades de

ATP da clula (Kid, 2005) e contribui para a sinalizao e regulao intracelular,

desempenhando tambm um papel central na manuteno da homeostase da composio

inica da clula (Navarro et al, 2007).

A mitocndria um organelo citoplasmtico delimitado por um sistema de dupla

membrana: a membrana mitocondrial externa, em ingls, Mitochondrial Externe

Membrane (MEM), que permevel a pequenas molculas e ies, as quais se movem

atravs de canais transmembranares formados por uma famlia de protenas integradas

na membrana, chamadas porinas. Estas protenas formam canais aninicos dependentes

de voltagem, sensveis ao potencial da MEM, que permitem a troca de metabolitos entre

a mitocndria e o citoplasma (Navarro et al, 2007). A membrana mitocondrial interna,

em ingls, Mitochondrial Interne Membrane (MIM) apresenta invaginaes para o

interior da matriz, formando cristas, onde se localizam os complexos multienzimticos

I, II, III, IV e V, que, em conjunto com os transportadores intermedirios coenzima Q e

citocromo c, formam o sistema da MRC, onde ocorre a fosforilao oxidativa,

OXPHOS (Grazina, 2004). Neste processo (figura 3), os electres provenientes da

oxidao dos substratos (aminocidos, carbohidratos e cidos gordos) so transferidos

ao longo dos vrios componentes, ocorrendo o bombeamento de protes para o espao

intermembranar, atravs dos complexos I (NADH desidrogenase, NQR), III (ubiquinol

citocromo c reductase, QCR) e IV (citocromo c oxidase, COX), estabelecendo um

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gradiente electroqumico que, ao ser dissipado atravs do complexo V (ATP sintetase),

liberta energia usada para a sntese de ATP, a partir de adenosina difosfato (ADP) e

fosfato inorgnico, catalisada por este complexo enzimtico.

Figura 3- Representao esquemtica dos componentes da cadeia respiratria mitocondrial e da

via da fosforilao oxidativa [adaptada de mips.gsf.de/proj/medgen/pictures/rescha_hm.gif].

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Os diferentes substratos com potencial redutor cedem electres em locais

diferentes da MRC. Por exemplo, o glutamato e o piruvato so metabolizados com

produo de NADH, que oxidado ao nvel do complexo I, o succinato oxidado a

fumarato ao nvel do complexo II (succinato desidrogenase), envolvendo o cofactor

FADH2; a oxidao dos cidos gordos produz NADH, que oxidado no complexo I,

mas tambm pode originar glicerol-3-fosfato (ou tambm pode ser proveniente da di-

hidroxi-acetona-fosfato formada no processo da gliclise), cuja oxidao, pela glicerol-

3-fosfato desidrogenase mitocondrial, produz FADH2, que cede os seus electres

coenzima Q ou ubiquinona, transferindo electres ao complexo III. A ubiquinona um

transportador intermedirio, que transfere os electres a partir dos complexos I e II para

o complexo III. Este, por sua vez, reduz o citocromo c, o qual cede electres ao

complexo IV, que catalisa a reduo de oxignio (O2), o aceitador final de electres da

MRC, a gua (H2O) (Leonard et al, 2000). O complexo IV contm 2 tomos de Cu em

adio aos tomos de Fe hmicos dos citocromos a e a3 (os tomos de cobre alternam

entre os estados de oxidao Cu+ e Cu

2+), o tomo de Fe do citocromo a3 est

intimamente associado ao tomo de Cu(B), e o outro tomo de cobre Cu(A) est a uma

curta distncia do heme do citocromo a. O citocromo c, uma protena que est inserida

na superfcie exterior da membrana interna da mitocndria e transfere electres, um de

cada vez, para o citocromo a e para o Cu(A). Na matriz mitocondrial, os electres so

cedidos para o citocromo a3 e para o Cu(B). Estes shutles de electres permitem que 4

electres e 4 protes sejam captados por molculas de O2 ligadas ao citocromo a3-Fe2+

,

(Mckee T et al, 1999), formando-se ento 2 molculas de gua, segundo a equao 1.

O2(g) + 4 H+ + 4e

- 2H2O (aq) (1)

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Estes complexos proteicos, excepto o CII, que codificado exclusivamente pelo

DNA nuclear (nDNA), so constitudos por mltiplas subunidades codificadas por este

genoma e pelo DNA mitocondrial, mtDNA (Taylor et al, 2005).

Em resumo, a mitocndria utiliza oxignio para produzir ATP. Ao processo

mitocondrial de transferncia de electres e sntese de ATP chamamos OXPHOS

(Ghafourifar et al, 2008), que consiste numa via metablica, catalisada por protenas

constitutivas da MIM que medeiam a transferncia de electres entre os complexos da

MRC e na libertao vectorial de H+ para o espao intermembranar e reentrada de H

+

para a matriz atravs do F0 com sntese de ATP pela F1-ATP sintetase (Navarro et al,

2007), conforme o esquema representativo da MRC apresentado na figura 3.

1.2.1 Mitocndria: fonte e alvo de espcies reactivas

A mitocndria desempenha diversas funes na clula, para alm da produo

de ATP. de destacar o papel crucial que desempenha na regulao da apoptose,

atravs de protenas pr- e anti-apoptticas, localizadas na membrana mitocondrial

externa, bem como factores indutores da apoptose (AIFs), localizados na matriz

mitocondrial, ou pela libertao de citocromo c da MRC/MIM. Desempenha ainda a

funo de tampo celular de Ca2+

e uma fonte importante de radicais livres (Turrens et

al, 1985; Orth et al, 2001).

Um radical livre qualquer espcie qumica que contenha um ou mais pares de

electres desemparelhados, que alteram a reactividade qumica de um tomo ou

molcula tornando-os mais reactivos do que o correspondente elemento ou composto e

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conferem-lhe a capacidade de aceitar electres de outras molculas por um processo de

oxidao-reduo. Os radicais livres celulares mais comuns so o radical hidroxilo

(OH.), o radical superxido (O2

-.) e o xido ntrico (NO

.). Os radicais livres e outras

molculas afins so muitas vezes classificados como espcies reactivas de oxignio

(ROS) e so um sub-produto do metabolismo celular, que surge pelo facto de durante o

processo de OXPHOS e em mitocndrias funcionais, 1 a 4% do O2 na mitocndria no

ser completamente reduzido a H2O, surgindo assim as ROS em vrios locais da clula,

mas so principalmente produzidos ao nvel da MRC (Grazina e Oliveira, 2001). Apesar

da maior parte do oxignio ser reduzido a gua pelo complexo IV da MRC, uma fraco

reduzida parcialmente a anio superxido ao nvel do complexo I ou da ubiquinona. A

formao de O2-. aumenta com o incremento do fluxo de electres atravs da MRC,

como por exemplo no consumo elevado de O2 ou pelo bloqueio do fluxo de electres

quando h inibio do complexo I da MRC pela rotenona, ou do complexo III pela

antimicina A.

O NO., por si s, em concentraes fisiolgicas, no reactivo; contudo, pode

ser facilmente convertido numa srie de molculas mais reactivas denominadas espcies

reactivas de nitrognio (RNS) (Brown et al, 2002). Apesar de ser um radical livre e um

poderoso oxidante apenas com 1 electro livre, desemparelhado, ele no reage

prontamente com a maior parte das molculas orgnicas que, na sua maioria, possuem

orbitais de valncia que esto totalmente preenchidas. Consequentemente, uma reaco

que envolva NO., deixa a molcula orgnica com um electro desemparelhado,

resultando da um radical orgnico intermedirio. Tais reaces tendem a possuir

energia de activao elevada e so, geralmente, lentas. Contudo, o NO. pode reagir

rpida e directamente atravs do electro desemparelhado, tanto com radicais orgnicos

como com centros de oxignio, podendo da resultar uma variedade de intermedirios

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extremamente reactivos. O NO. reage com o O2, uma vez que o oxignio molecular

possui um tripleto no estado fundamental, contendo 2 electres desemparelhados com

spins paralelos em orbitais separadas, uma de cada tomo de oxignio. As reaces

prosseguem por passos de um electro, produzindo uma srie de espcies de oxignio

parcialmente reduzidas, que so citotxicas. Estas espcies so o O2-., o HO

. e o

perxido de hidrognio (H2O2). O mecanismo geralmente aceite para a produo de

radicais hidroxilo e peroxinitrito envolve a presena do O2-.segundo as reaces 2 a 5

(Gilgun-Sherki et al, 2004; Rubbo et al, 2008).

NO. + .O-O.

.- ONOO

- (2)

ONOO-+ H

+ ONOOH

(3)

ONOOH .OH + NO2

. (4)

2H+ + O2

. + O2

. H2O2 + O2

(5)

O NO. reage rapidamente com metais de transio que tm estados de oxidao

que diferem de um electro, como por exemplo, o io frrico (Fe3+

) e o io ferroso

(Fe2+

). A maioria das aces fisiolgicas do NO. ocorre quando este se liga ao Fe

2+ do

grupo heme da guanilato ciclase causando activao da produo de guanosina

monofosfato cclica, em ingls, cyclic guanosine monophosphate (cGMP) (Brown,

2002).

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A reaco do NO. com o anio superxido gera o anio peroxinitrito (ONOO

-),

um oxidante forte, capaz de danificar protenas, lpidos, membranas, DNA e organelos

subcelulares (Cross et al, 1997).

As mitocndrias so uma das principais fontes de ROS e RNS. Estima-se que 1 a

4% do total do oxignio consumido na mitocndria convertido em ROS. O aumento

de ROS pode modificar lpidos e protenas e causar alteraes significativas do

potencial transmembranar mitocondrial, (Ghafourifar et al, 2008). As ROS tambm

podem induzir um aumento da permeabilidade transitria mitocondrial, implicada no

despoletar da morte celular por apoptose (Ghafourifar et al, 2008).

Em condies normais, as clulas possuem vrios mecanismos de defesa contra

os danos induzidos pelos radicais livres. Existem defesas antioxidantes capazes de

degradar os radicais livres. O anio superoxido transformado, pela superoxido

dismutase (SOD) em H2O2, que, por aco da catalase, convertido em gua. No

entanto, o H2O2 em concentraes muito elevadas e na presena de Fe2+

livre, pode

levar formao de espcies ainda mais lesivas, tal como o radical HO., pela reaco de

Fenton e de Haber-Weiss (Grazina e Oliveira, 2001; Ghafourifar et al, 2008). Quando

existe produo excessiva de ROS e RNS ou o desequilbrio entre a sua produo

celular e a capacidade das clulas para se defenderem destas espcies ocorre o processo

denominado stresse oxidativo (Gilgun-Sherki et al, 2004; Mao et al, 2009), sendo este

um dos mecanismos propostos para explicar a etiopatogenia de vrias doenas do CNS,

incluindo a MS (Lutskii et al, 2007). O stresse oxidativo pode causar danos celulares e,

subsequentemente, morte celular, uma vez que os ROS podem oxidar componentes

celulares crticos, tais como lpidos, protenas e DNA, em especial o mtDNA, que tem

sido implicado tanto no envelhecimento como no aparecimento de doenas

neurodegenerativas (Jacobson et al, 2005; Grazina et al, 2006; Mao et al, 2009). Tal

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como os aminocidos excitatrios e neurotransmissores, as ROS so particularmente

activas no crebro e no tecido neuronal. Uma vez que a quantidade de ROS formada

depende da quantidade de oxignio consumido, clulas como os neurnios, com

actividade metablica mais elevada, ou segmentos neuronais enriquecidos em

mitocndrias, tais como as sinapses, produzem nveis mais elevados de ROS.

As RNS causam stresse nitrosilativo, que contribui para a destruio da mielina

e das clulas da glia que participam na sua formao, os oligodendrcitos. Tem sido

sugerida na literatura (Calabrese et al, 2002; Gilgun-Sherki et al, 2004; Ghafourifar et

al, 2008) uma correlao directa entre o NO. e o bloqueio da conduo observado na

MS, uma vez que os dadores de NO. causam uma obstruo reversvel na conduo,

tanto em axnios normais como nos desmielinizados, quer no CNS, quer no PNS.

Adicionalmente, a conduo em axnios desmielinizados e remielinizados

particularmente sensvel ao bloqueio por NO., o que pode ser devido ao seu efeito

directo sobre a neurotransmisso glutamatrgica. Foi demonstrado que o receptor N-

metil-D-aspartato (NMDA) inactivado por nitrosilao e, para alm disso, observou-se

que a formao de S-nitrosoglutationa (GSNO) pode causar diminuio dos nveis de

glutatio reduzido (GSH) e, consequentemente, activar modificaes redox na

sinalizao celular, bem como modificar enzimas intracelulares chave, tais como as que

constituem os complexos da MRC (Shiva et al, 2001; Calabrese et al, 2002).

Em condies patolgicas, as RNS so produzidos em grande quantidade,

especialmente o NO., proveniente da microglia activada, por aco da sintetase do xido

ntrico (NOS) induzida (iNOS) ou a partir das clulas endoteliais, por aco da NOS

endgena (eNOS).

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As principais fontes de espcies reactivas no processo inflamatrio so as

mitocndrias danificadas e a microglia activada (Emerit et al, 2004).

1.3 A Esclerose Mltipla

Um crebro adulto contem de cerca de 1011

- 1012

neurnios, os quais so

mantidos e protegidos por pelo menos o dobro de clulas da glia. Existem vrios tipos

de clulas da glia, sendo os mais conhecidos, os oligodendrcitos, microglia e

astrcitos. Durante muito tempo, foi considerado que as clulas da glia providenciavam

apenas suporte estrutural para ajudar a proteger os neurnios, mais recentemente, foi

sugerido que as clulas da glia, especialmente os astrcitos, exercem funes

semelhantes s dos neurnios. Os oligodendrcitos tm como principal funo, elaborar

uma bainha de constituio lipdica volta da maioria dos axnios que a atravessam, a

bainha de mielina. A microglia o equivalente aos macrfagos-moncitos, no sistema

nervoso. Os astrcitos participam na constituio da barreira hematoenceflica, em

ingls, Blood-Brain Barrier (BBB), e encefaloliquididiana (Garcia e Coelho, 2009). O

endotlio dos pequenos vasos sanguneos no crebro muito menos permevel a

molculas do que outros endotlios vasculares, mas deixa passar pequenas molculas

tais como a glucose e outras substncias lipossolveis, muitas outras so excludas do

crebro pela BBB que tambm exclui os fagcitos, num crebro saudvel (Emerit et al,

2004).

A Esclerose Mltipla, em ingls, Multiple Sclerosis (MS) uma doena do CNS

mediada pelo sistema imunitrio. At data, a sua causa ainda pouco clara mas

acredita-se que resulta de uma resposta anormal do sistema imunitrio a um ou mais

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antignio de mielina, que se desenvolvem em indivduos geneticamente susceptveis,

depois de expostos a agentes causais no definidos. Caracteriza-se por uma acumulao

de macrfagos (microglia e crebro) e linfcitos, no CNS (massa branca e massa

cinzenta), conduzindo desmielinizao, destruio dos axnios (Mao et al, 2009) e

formao de placas esclerticas (Kalman et al, 1999).

As principais caractersticas neuropatolgicas so a perda de oligodendrcitos,

desmielinizao, diminuio neuroaxonal associada inflamao e, possivelmente,

disfuno mitocondrial (Andrews et al, 2005; Kumleh et al, 2006; Dutta et al, 2006;

Kalman et al, 2007; McQualter et al, 2007; Ghafourifar et al, 2008). O curso da doena

resulta no seu agravamento, podendo ocorrer perodos sem manifestaes clnicas

(remisses), que alternam com surtos da doena (exarcerbaes) (Andrews et al, 2005).

Com o decorrer do tempo, os doentes podem desenvolver leses crnicas que

promovem a leso axonal irreversvel, daqui resultando que a fase denominada

relapsing-remitting (RRMS) evolui para uma fase secundria progressiva (SPMS), fase

esta que caracterizada por no haver recuperao ou recuperao mnima (Mao et al,

2009).

A MS caracteriza-se por ser uma doena heterognea, com uma hereditariedade

moderada e uma componente ambiental significativa. A complexidade desta patologia

resulta do facto de no ser possvel prever a expresso do fentipo a partir do

conhecimento dos efeitos dos factores etiolgicos individuais considerados por si s,

sendo necessrio um estudo multidisciplinar para esta doena (Oksenberg et al, 2008).

A MS uma patologia relativamente comum, afectando mais de 2 milhes de

pessoas em todo o mundo. O risco da doena est associado latitude, sendo menor em

crianas e velhos e maior nas mulheres e na populao caucasiana. A incidncia da MS

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parece ter aumentado consideravelmente no ltimo sculo, com maior expresso nas

mulheres (Oksenberg et al, 2008). possvel que alguns dos mltiplos factores

envolvidos sejam defeitos ao nvel do DNA, tanto no genoma nuclear como no

mitocondrial, infeces virais, hipoxia e stresse oxidativo, baixa exposio luz solar

ou nveis insuficientes de vitamina D, nveis aumentados de macrfagos e linfcitos no

crebro (Mao et al, 2009). A figura 4 sumariza as possveis causas para a MS.

A prevalncia da MS maior na Escandinvia, Islndia, Ilhas Britnicas e

Amrica do Norte (1 - 2: 1.000) do que no Sul da Europa (figura 5).

De acordo com alguns observadores, esta distribuio geogrfica implica um

agente patognico ambiental que se encontra distribudo de forma ubqua. Apesar desta

distribuio geogrfica da MS poder tambm ser explicada, pelo menos em parte, por

variaes regionais de factores de risco gentico, curiosamente sabe-se que a exposio

residencial ou ocupacional de doentes com MS luz solar pode estar associada com

uma baixa taxa de mortalidade, com a vitamina D a mediar o processo de abrandar a

progresso da doena. Uma vez que a radiao ultravioleta o principal catalizador da

sntese endgena da vitamina D3 nos humanos e que os nveis de vitamina D3 so mais

baixos comummente nas latitudes a Norte do que a Sul, isto poder explicar a razo pela

qual os pases do sul da Europa, tm taxas mais baixas de MS nas suas populaes (Mao

et al, 2009).

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Foram realizados vrios estudos para encontrar loci de susceptibilidade gentica

associados MS, que apontam para o cromossoma 6p21.3, em particular do gene que

codifica o antignio leucocitrio humano (HLA), bem como para os cromossomas 5p14

e 17q22 (Kalman et al, 1999).

Figura 4 - Factores que podem contribuir para o desenvolvimento e progresso da MS

[Adaptado de Mao et al, 2009].

Esclerose

Mltipla

Factores genticos

Infeco viral

Exposio

solar

reduzida

(Vit D)

Hip

oxia

Stresse o

xid

ativo

Acumulao Macrfagos

Linfcitos

no crebro

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Figura 5 Distribuio geogrfica da Esclerose Mltipla no mundo [Fonte:

http://sofija.wordpress.com/2007/01].

A hiptese mais antiga para a etiologia da MS a de doena infecciosa causada

por um micro-organismo. Contudo, aps dcadas de pesquisa, no se encontrou nenhum

agente infeccioso especfico na MS. Mesmo assim, muitos neurologistas e

investigadores so da opinio de que o vrus Epstein-Barr e o Coronavrus podem estar

envolvidos na patogenia da MS atravs do seu neurotropismo e ataque ao sistema

imunitrio (Mao et al, 2009).

A investigao de aspectos neuropatolgicos avaliados por imagiologia destaca a

contribuio da inflamao na neurodegenerescncia que ocorre na MS (Kalman et al,

2007). As leses resultantes da inflamao sugeriram a existncia de uma resposta auto-

http://sofija.wordpress.com/2007/01

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imune contra os componentes da mielina do CNS. Acredita-se que h muitas clulas

envolvidas no processo da doena, tais como as clulas T CD4+ reactivas mielina, as

clulas T CD25+ regulatrias, as quais podem controlar as clulas CD4+ auto-reactivas,

as clulas B reactivas mielina, as clulas killer CD8+, macrfagos e a microglia do

crebro. Estas clulas infiltram-se em reas discretas de tecido no CNS, onde vo

provocar danos nos neurnios (leses nos axnios) e nos oligodendrcitos, que se

traduzem em alteraes relacionadas com a desmielinizao, resultando da a formao

de placas esclerticas. A desmielinizao pode conduzir a leses mais profundas nos

axnios e perda neuronal, sendo estas as principais caractersticas da doena e, ao

mesmo tempo, os factores principais responsveis pela progresso da doena e

incapacidade do indivduo (Ziemssen et al, 2005).

O ambiente intracelular, especialmente o balano inico, so crticos para a

manuteno das funes neuronais. O desequilbrio inico uma das hipteses para

explicar o mecanismo chave da fisiopatologia da MS.

Durante a progresso da doena, os mediadores inflamatrios, incluindo

citocinas, oxidantes e NO., so libertados pela microglia ou so gerados por hipoxia,

fenmeno que se segue leso dos tecidos e que se acredita resultar numa disfuno do

metabolismo oxidativo nos axnios desmielinizados. Estes mediadores diminuem a

concentrao de ATP e perturbam a funo mitocondrial, causando falha na Na+/K

+-

ATPase, a enzima que responsvel pela correco rpida dos nveis de Na+ e K

+ e pela

extorso do Na+ a partir do axnio, o que previne o influxo patolgico deste io tanto

nos axnios em repouso como em actividade. Por sua vez, a hipoxia considerada um

factor de stresse fisiolgico, que induz uma resposta de dano na replicao do DNA.

Tambm induz a inibio da actividade da Na+/K

+-ATPase e, para alm disso, as ROS

tambm aumentam a degradao desta enzima. Quando as altas concentraes intra-

20

axonais de Na+ resultantes desta falha, causam aumento da actividade da bomba

Na+/Ca

2+, com o efluxo de Na

+, a requerer um nvel mais elevado de influxo de Ca

2+,

activam-se as proteases intra-axonais, resultando na fragmentao do neurofilamento e

perturbao do transporte e integridade do axnio, conduzindo, por ltimo,

degenerescncia neuronal. De facto, a perda de actividade da ATPase Na+/K

+parece ser

que mais contribui para o contnuo declnio neurolgico nos estadios crnicos da MS

(Mao et al, 2009).

Tendo em conta a limitao existente, relativa aos mecanismos etiopatognicos

da MS, foram desenvolvidos modelos experimentais com animais, em particular de

encefalomielite autoimune experimental (EAE), com o objectivo de clarificar as causas

e consequncias desta doena, determinar mecanismos de perda de axnios na MS e

avaliar a eficcia de terapias neuroprotectoras. Este modelo tem sido muito usado para

avaliar a eficcia de tratamentos imunomodulatrios na MS, que envolve a formao de

uma resposta auto-imune na periferia imunolgica, imunizando animais com protenas

de mielina. Neste modelo simplificado, a EAE pode ser induzida por imunizao dos

animais susceptveis com um nmero de antignios de mielina, incluindo protena de

mielina bsica (BMP), protena proteolipdica (PLP) e glicoprotena da mielina do

oligodendrodendrcito (MOG) (Mao et al, 2009). A doena tambm pode ser passada

de um animal afectado para um saudvel, transferindo clulas T reactivas mielina, os

animais desenvolvem ento um padro patolgico que bastante diferente do humano

mas onde se podem encontrar algumas marcas comuns MS humana, nomeadamente,

leses inflamatrias focais no sistema nervoso (Ziemssen et al, 2005). Existem algumas

limitaes em usar a EAE como modelo para estudar a MS: primeiro porque a MS

uma doena espontnea enquanto a EAE induzida, depois porque a MS tem uma

grande heterogeneidade gentica na populao humana. Por isso, para entender a

21

progresso e a patologia da MS em ratos, seria necessrio estudar mltiplos modelos

que melhor se assemelhassem s caractersticas humanas (Mao et al, 2009).

1.4 Mecanismo molecular da inflamao

A MS uma das doenas do CNS que possui maior componente de inflamao,

desmielinizao, astrogliose e danos nos axnios (Rejdak et al, 2008). Nesta doena, o

sistema imunitrio destri as bainhas de mielina das fibras das clulas nervosas do

crebro e medula espinal (Adibhatla et al, 2008). A BBB responsvel pelo transporte

selectivo de molculas e clulas, da circulao para o CNS. Durante o estado de doena,

como por exemplo na MS, torna-se permevel e permite a infiltrao de molculas e

muitas clulas perifricas no crebro. Algumas dessas clulas so as clulas T e B, que

ficaram activas durante o processo inflamatrio e que passaram a BBB, indo alojar-se

no local da leso. A, as clulas T so reactivadas pelos antignios da mielina, libertam

citocinas e activam a microglia, que comea a destruir a bainha de mielina. A

desmielinizao conduz disfuno, primeiro reversvel, depois irreversvel, dos

axnios, cujas propriedades de conduo vo ficar deterioradas e contribuir para os

sintomas clnicos associados a remisses (Ziemssen et al, 2005). As clulas T podem

induzir a expresso de iNOS nas clulas da glia ao estabelecer contacto com elas (Saha

et al, 2006). A penetrao da BBB envolve inicialmente a captura de leuccitos pelas

clulas endoteliais atravs das selectinas. Os leuccitos aderem ao endotlio atravs de

interaces ligando-receptor das molculas de adeso celular, e as quimiocinas

produzidas localmente conduzem a migrao direccionada atravs do endotlio. O

Antignio-1 Associado a Funo Leucocitria, do ingls, leucocyte function-associated

22

antigene-1 (LFA-1) e o Antignio-4 Muito Tardio, do ingls, very late antigen-4 (VLA-

4) so membros das molculas de adeso do tipo integrinas, que esto envolvidas no

trfego e extravaso dos leuccitos. O LFA-1 expresso exclusivamente nos leuccitos

e interage com os seus ligandos, com as molculas de adeso-1/-2/-3, para promover

uma variedade de eventos de adeso celular necessrios para o sistema imunitrio, quer

em casos normais quer patolgicos. O VLA-4 expresso maioritariamente nos

linfcitos, moncitos e eosinfilos e interage com o seu ligando, a molcula-1 vascular

de adeso celular, durante a inflamao crnica (MCQualter et al, 2007). Est bem

documentado que, na MS, as molculas de adeso, tais como as selectinas-E, e a

molcula-1 de adeso celular, so expressas durante as leses activas do CNS, nas

clulas endoteliais dos microvasos. Qualquer clula T activada, que expresse molculas

de adeso, pode ligar-se s molculas de adeso correspondentes na superfcie do

endotlio, iniciando assim, a travessia do primeiro componente da BBB. Segue-se a

extravaso da camada endotelial e as clulas T activadas que se dirigem ao tecido

perivascular devem passar atravs da membrana basal endotelial composta por

colagnio tipo IV. As clulas T utilizam enzimas da matriz, conhecidas por

metaloproteinases, e outras capazes de degradar a matriz, que fazem clipes selectivos

nos componentes da matriz extracelular, para facilitar a transmigrao da lmina basal.

O colagnio tipo IV marcado selectivamente pelas metaloproteinases 2 e 9 da matriz,

as quais podem ser detectadas em doentes com MS. Uma vez passada a BBB, outras

clulas inflamatrias, tais como as clulas T CD4+ e CD8+, macrfagos, granulcitos e

clulas B, invadem rapidamente o CNS em resposta ao estmulo quimiotctico e

disseminam-se na substncia branca (McQualter et al, 2007).

A figura 6 resume o processo da imunopatogenese da MS. Em (A), mostra-se o

conceito patognico da MS baseado na predisposio genmica, em que os doentes

23

herdam traos que conduzem a uma resposta imunitria alterada. Quando encontram um

agente infeccioso, surge uma resposta imunitria das suas protenas no sistema linftico

perifrico. Os antignios especficos das clulas T e B activados atravessam a BBB e

atingem os prprios antignios expressos pelos oligodendrcitos e neurnios. Em

concertao com a resposta imunitria inata no CNS, as clulas T e B causam danos

inflamatrios. A susceptibilidade dos oligodendrcitos e neurnios aos danos

inflamatrios e a capacidade de reparao e reorganizao do CNS, determinam a

extenso e as consequncias funcionais dos danos inflamatrios. Em (B) apresenta-se o

esquema da imunopatologia da leso na MS. Um certo nmero clulas de imunitrias e

do CNS esto envolvidas no desenvolvimento das leses e na sua reparao. As clulas

T e B e os macrfagos infiltram-se nas leses. As clulas T CD4+ encontram-se

localizadas na bainha perivascular. Estas clulas tornam-se reactivadas pelos antignios

presentes nas clulas dendrticas e nas clulas da microglia, libertando localmente

citocinas e outros mediadores inflamatrios e, desse modo, atraindo os macrfagos para

as leses. As clulas T CD8+ infiltram-se no parnquima e, para alm de libertarem

outros mediadores inflamatrios, atacam directamente as clulas que expressam

antignio leucocitrio humano classe I, tais como neurnios e oligodendrcitos. As

clulas B encontram-se no espao perivascular e meninges, onde libertam anticorpos

IgG. Estes anticorpos ligam protenas, que se expressam na superfcie de

oligodendrcitos e neurnios. Os anticorpos ligados podem fixar o complemento

iniciando assim a cascata do complemento ou induzindo macrfagos fagocitose

mediada pelo anticorpo. Os macrfagos activados por sua vez, tambm libertam

molculas txicas e inflamatrias (ex: NO.), as quais vo danificar predominantemente

oligodendrcitos e neurnios. Os astrcitos reactivos vo induzir a gliose na fronteira da

24

leso, seguindo-se o dano inflamatrio, os oligodendrcitos proliferam e remielinizam

os axnios danificados (Hemmer et al, 2006).

Figura 6- Imunopatognese da MS [Fonte: Hemmer et al, 2006].

25

Foram feitos vrios estudos em humanos, tanto em colheitas ps-mortem como

em bipsias de tecido cerebral, tendo-se verificado que ocorrem precocemente leses

significativas nos axnios, denominadas leses desmielinizantes, e que h uma

correlao directa entre o grau de leso axonal aguda e a magnitude da resposta

inflamatria. Os dados da literatura permitiram sugerir que, na MS, as leses axonais

agudas so secundrias ao surgimento de uma variedade de mediadores inflamatrios

txicos incluindo o TNF, o Interfero e o NO., sendo este ltimo, um dos principais

candidatos a mediador txico primrio dos danos agudos observados nos axnios. Na

fase aguda da MS, o NO. encontra-se presente em nveis elevados, ao mesmo tempo que

a actividade dos axnios decai na sua presena. Fizeram-se experincias que

confirmaram esta vulnerabilidade, apoiando a hiptese de que os axnios apresentam as

fases iniciais da degenerao, quando esto a conduzir impulsos nas frequncias

fisiolgicas enquanto esto expostos ao NO., mesmo que seja a baixas concentraes

(Smith et al, 2001).

Os estudos por espectroscopia de ressonncia magntica (MRS) in vivo so

consistentes com as marcas neuropatolgicas das leses que ocorrem precocemente nos

axnios de doentes com MS. Esta tcnica permite medir um marcador especfico do

neurnio, o N-acetilaspartato (NAA), o qual sintetizado na mitocndria e expresso

pelos neurnios de um crebro adulto e um dos ndices mais especficos da densidade

e da integridade dos axnios na substncia branca. A flutuao, ou a descida, do nvel

de NAA, indica uma disfuno mitocondrial presente no incio da doena e indica a

perda neuroaxonal em leses crnicas. O NAA est diminudo nas leses agudas da MS

e parcialmente reversvel na recuperao. Esta reversibilidade correlaciona-se com a

fase de remisso da MS enquanto a reduo permanente de NAA foi observada na fase

de exacerbao (Andrews et al, 2005; Kalman et al, 2007).

26

1.5 Stresse oxidativo e desmielinizao

Existem mltiplos factores que podem precipitar a ocorrncia de stresse

oxidativo, envolvendo diferentes vias e conduzindo degenerescncia neuronal e

(Gilgun-Sherki et al, 2004). O CNS contm grandes quantidades de lpidos,

essencialmente nas membranas celulares, sendo, por isso, muito susceptvel

peroxidao lipdica, em ingls, lipid peroxidation, (LPO). Este um dos processos

reguladores mais importantes do metabolismo das principais biomolculas e est

subjacente a fenmenos de plasticidade celular, podendo influenciar o suporte

energtico das clulas e do corpo como um todo (Lutskii et al, 2007). Por exemplo, a

cardiolipina um fosfolpido que se encontra exclusivamente na membrana

mitocondrial e essencial para o bom funcionamento da MRC (Adibhatla et al, 2008).

Se as membranas da clula sofrerem distrbios ao nvel funcional ou estrutural,

em resultado da aco de elevadas concentraes de ROS e de produtos da peroxidao

lipdica resultantes do stresse oxidativo, esto criadas as condies de base para o

desenvolvimento de patologia. O stresse oxidativo encarado como um dos

mecanismos subjacentes patogenia de vrias doenas do CNS, incluindo a MS

(Lutskii et al, 2007;Ghafourifar et al, 2008).

A desmielinizao deve-se, primariamente, ao facto da mielina ser uma

membrana lipoproteica constituda por mais de 80% de fosfolpidos, glicolpidos e

esterides, sendo por isso susceptvel LPO. Por outro lado, deve-se tambm s

caractersticas do CNS, nomeadamente capacidade insuficiente dos sistemas de defesa

antioxidante, perante condies de stresse oxidativo intenso.

Durante a fase aguda da MS, os nveis de produtos resultantes do stresse

oxidativo encontram-se aumentados e/ou os nveis de enzimas ou outras defesas

27

antioxidantes encontram-se diminudos, quer no sangue, quer no liquido

encefalorraquidiano, em ingls, cerebrospinal fluid, (CSF) (Sayer et al, 2008). O stresse

oxidativo na MS pode ser uma consequncia dos nveis elevados de ROS e RNS,

resultantes da reaco inflamatria, que reflectem maioritariamente a falha do sistema

energtico da microglia activada. Foi observado que, nos doentes com MS, as clulas

mononucleares activadas produziam quantidades elevadas de ROS e RNS e foram

descritos danos oxidativos no DNA, incluindo o mtDNA, em associao com a

inflamao das placas crnicas activas (Sayer et al, 2008). Sabe-se que os macrfagos e

a microglia expressam metaloproteinases e geram ROS na substncia branca. Estudos

recentes que envolvem o cortex cerebral na MS, indicam que a produo microglial de

ROS tambm est provavelmente envolvida na desmielinizao cortical (Mao et al,

2009).

1.6 Disfuno da mitocndria como causa da neurodegenerescncia na MS

A investigao actual aponta para o envolvimento de anomalias especficas, ao

nvel mitocondrial, no desenvolvimento e progresso da MS, nomeadamente: 1)

defeitos ao nvel do mtDNA, 2) expresso anormal dos genes mitocondriais, 3)

actividade enzimtica mitocondrial anormal, 4) actividade reparadora do DNA

mitocondrial deficiente e 5) disfuno mitocondrial (figura 7).

28

Figura 7- Anomalias mitocondriais em doentes com MS. Modelo proposto por Mao et

al, 2009, com base na investigao mais recente [Esquema adaptado de Mao et al, 2009].

Neste modelo proposto por Mao et al, 2009, para alm da dinmica anormal da

mitocndria (aumento da fisso e diminuio da fuso em neurnios afectados pela

MS), os autores tambm propem que as anomalias mitocondriais e a falha energtica

mitocondrial possa ter implicaes noutras vias celulares, incluindo o aumento da

Mudanas

estruturais da

mitocndria

Expresso gnica

anormal

Reparao deficiente

do mtDNA

Anomalias mitocondriais na MS

Defeitos no

mtDNA

Aumento

de ROS

e danos oxidativos

Actividade

enzimtica

mitocondrial

anormal

29

desmielinizao e inflamao em neurnios e tecidos que se encontram afectados na

MS.

Desde que a sequncia total do mtDNA foi publicada, em 1981, tm surgido

cada vez mais descobertas de mutaes do mtDNA associadas a doenas (Grazina,

2004, Grazina et al, 2006). O mtDNA constitui a pequena parte extra nuclear do

genoma humano. As mutaes deletrias, incluindo variaes de sequncia ou delees

do mtDNA afectam frequentemente o funcionamento do CNS.

Existem diversos estudos na literatura que apontam para o possvel

envolvimento do mtDNA na MS, principalmente devido ao facto de se ter constatado

com mais frequncia uma transmisso da doena de me para filho do que de pai para

filho. Alm disso, foi observada uma associao da MS com uma doena mitocondrial

Neuropatia ptica Hereditria de Leber (LHON). Estudos moleculares recentes, ao

nvel do mtDNA, mostraram a presena de variaes de sequncia primrias de LHON

(patognicas) nos nucletidos 3460 e 11778, em doentes com MS que apresentavam

neurite ptica proeminente (PON). Foi tambm observada, na MS, uma frequncia

superior de variaes de sequncia secundrias de LHON (polimorfismos no-

patognicos per se), marcadores de haplogrupos nos nucletidos 13708G>A, 4216T>C

e 4917A>G. Existem outros estudos que demonstraram a ausncia de alteraes do

mtDNA em doentes com MS. Concluiu-se ser necessrio fazer um estudo em larga

escala de doentes e controlos no sentido de apresentar concluses mais concretas e

definitivas sobre o envolvimento das variaes de sequncia, polimorfismos e

haplotipos do mtDNA na MS (Kalman et al, 1999).

O mtDNA muito susceptvel aos radicais livres devido ausncia de histonas

protectoras e baixa capacidade de reparao. Quando aumentam os danos oxidativos

30

no mtDNA, ocorrem variaes de sequncia que podem alterar, de forma severa, as

funes mitocondriais, incluindo a OXPHOS, com diminuio da velocidade de

transferncia de electres, actividades enzimticas e, por ltimo, dos nveis energticos

na clula (Andrews et al, 2005; Ghafourifar et al, 2008).

A hiptese de que a mitocndria deve desempenhar um papel importante na

etiopatogenia da MS, foi apoiada pela observao de danos oxidativos no mtDNA, em

placas esclerticas crnicas de doentes com esta patologia (Andrews et al, 2005).

Em 2000, Lu et al propuseram que a mitocndria disfuncional pode conduzir ao

processo inflamatrio na MS. Estes autores demonstram que a reduo na actividade do

complexo I, observada nas placas esclerticas crnicas, estava associada leso

oxidativa do mtDNA (11). O mecanismo subjacente a estes danos poder envolver uma

deficincia energtica, provocada pela inibio da MRC por NO., em que este entraria

em competio pelo local de ligao do O2 inibindo o complexo IV, ou, quando em

maiores quantidades, poderia causar inibio dos complexos I e IV por aco do

ONOO- (8). Como o complexo IV est envolvido no bombeamento de protes para o

espao intermembranar, que essencial para a sntese de ATP, foi proposto (Andrews,

2005) que ocorria uma falha ao nvel da Na+/K

+- TPase dependente de energia, o que

conduziria a um aumento secundrio de Na+ intra-axonal e, subsequentemente, a um

aumento do Ca2+

intra-axonal via trocador Na+/Ca

2+ (figura 8).

Foi proposto que o aumento da concentrao intracelular de ies Ca2+

, resultante

da reduo na concentrao de ATP, pode levar degenerescncia dos axnios por

activao de vrias enzimas degradativas. Colocou-se, ento, a hiptese de que a morte

neuronal possa surgir em resultado da exposio dos axnios a NO., em particular

devido sobrecarga de ies Na+ resultante do impulso nervoso (Smith et al, 2001).

31

Figura 8- Fluxos inicos axonais durante a transmisso do impulso nervoso. Sequncia

hipottica de eventos em situao: (a) normal; (b) de dfice energtico, com depleo de ATP

[Adaptado de Andrews et al, 2005].

A inibio da MRC por NO. pode ocorrer por duas vias distintas: (i) inibio por

NO., rpida, selectiva, reversvel, do complexo IV; (ii) inibio por RNS lenta, no-

selectiva, irreversvel, de diversos componentes mitocondriais. A via de inibio

reversvel (i) da COX por NO. ocorre para nveis de concentrao na ordem dos

32

nanomolar, de tal modo que o NO., produzido localmente na mitocndria pela NOS,

um potencial regulador da MRC. Pode ligar-se ao local de ligao do oxignio de dois

modos diferentes, bloqueando a ligao do O2 em qualquer deles. Este local do

complexo IV constitudo por dois metais, o ferro do grupo heme a3 e o cobre do centro

CuB, em que o oxignio se liga entre eles e rapidamente reduzido. O NO. tanto pode

ligar-se ao citocromo a3, originando citocromo a32+

-NO, ou ao CuB2+

surgindo CuB+-

NO, em que o NO pode sofrer hidratao rapidamente para formar nitrito (NO2-

). Estas

reaces de inibio podem ocorrer simultaneamente, pelo menos in vitro, mas a

primeira favorecida para nveis elevados de citocromo reduzido e baixos nveis de

oxignio, enquanto a segunda favorecida para as condies opostas (Brown et al,

2002).

Observou-se que o NO. produzido endogenamente pode causar a inibio da

MRC em alguns tipos de clulas, geralmente por competio com o oxignio; de tal

modo, que o NO. pode aumentar muito a Km aparente da respirao por oxignio.

Concluiu-se que o NO. pode induzir a entrada das clulas em hipoxia, mesmo com

nveis relativamente elevados de oxignio, e induzir leso tecidular. Quando a

inflamao activada e a expresso de iNOS estimulada em diversos tipos de clulas,

como macrfagos, microglia, astrcitos e clulas endoteliais, produz-se NO. suficiente

para inibir, no apenas a sua prpria MRC mas tambm a das clulas circundantes, via

inibio reversvel da COX.

Observou-se que, em clulas de cultura expostas a NO., aps ter ocorrido

inibio reversvel da COX, algumas horas aps a exposio, surgiu uma inibio

irreversvel (ii) da MRC, em mltiplos locais, provavelmente devido converso do

NO. em RNS. Um dos efeitos que surgia mais rapidamente era a inactivao do

complexo I, possivelmente devido S-nitrosilao deste complexo, seguindo-se a

33

inibio da aconitase do TCA e do complexo II da MRC, provavelmente devido

remoo de ferro dos centros de ferro-enxofre, sob condies nas quais pode ocorrer a

formao de peroxinitrito. Este pode inibir os complexos I, II/III, IV (Mahad et al,

2008) e V da MRC, a aconitase, a SOD mitocondrial, dependente de mangansio (Mn-

SOD), a creatina cinase e provavelmente muitas outras protenas. O peroxinitrito um

poderoso oxidante que tambm pode causar danos no DNA, induzir peroxidao

lipdica e aumentar a permeabilidade da mitocndria aos protes (Brown et al, 2002).

Para alm da inibio da respirao, o NO. tem outros efeitos na mitocndria,

relevantes no desencadeamento de morte celular: 1) aumento da produo de ROS e

RNS; 2) induo do poro de transio mitocondrial (MPT) pelas RNS (Brown et al,

2002), estando o envolvimento de ambos proposto na etiopatogenia da MS.

Os antioxidantes podem retardar ou anular os efeitos do stresse oxidativo e

proteger as clulas e os tecidos contra o efeito deletrio das ROS e RNS. Contudo, nos

doentes com MS podem desenvolver-se dfices ao nvel das defesas antioxidantes

durante o decurso da doena, em resultado da inflamao crnica, acompanhada pelo

aumento do stresse oxidativo. Estes eventos moleculares acompanham a alterao da

funo mitocondrial, ocorrendo perturbaes ao nvel da homeostase do clcio, levando

por sua vez reduo dos nveis de ATP (Smith et al, 2006; Ghafourifar et al, 2008),

como j foi referido anteriormente. Estas alteraes bioqumicas esto associadas

apoptose dos neurnios da retina, crebro e da medula espinal (Kalman et al, 2007).

O desenvolvimento de estratgias que permitissem reverter o metabolismo

anormal e restaurar o funcionamento normal e a sobrevivncia dos neurnios

constituiriam a abordagem teraputica ideal na MS, sendo actualmente uma realidade

distante.

34

Captulo 2 Materiais e mtodos

35

2.1 Materiais

Todos os reagentes usados so do mais elevado grau de pureza comercialmente

disponvel.

2.2 Amostragem

Os doentes descritos neste estudo foram seguidos na consulta especializada de

Neurologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra. Todos eles tinham uma histria

clnica de MS com mais de 5 anos de durao. Adicionalmente, foram recolhidas

amostras de indivduos saudveis, sem qualquer doena neurodegenerativa conhecida,

voluntrios, para servirem de controlo. Todos os indivduos mencionados neste estudo

deram o seu consentimento informado para a realizao do estudo.

Na avaliao da actividade enzimtica dos complexos da MRC entraram: i) 50

indivduos controlo com uma mdia de idades de 31,7 anos (21 49) (mnimo

mximo), sendo 18 indivduos do sexo masculino e 32 do sexo feminino (Grazina,

2004); ii) 50 indivduos doentes MS com uma mdia de idades de 40,56 anos (22 61)

(mnimo mximo), sendo 15 indivduos do sexo masculino e 35 do sexo feminino.

Nos estudos genticos foi usada a seguinte amostragem: i) 216 indivduos

controlo com uma mdia de idades de 51,7 anos (1 90) (mnimo mximo), sendo 82

indivduos do sexo masculino e 134 do sexo feminino (Oliveira, 2007); ii) 87 indivduos

doentes, com MS, com uma mdia de idades de 43,3 anos (22 63) (mnimo

mximo), sendo 26 indivduos do sexo masculino e 61 do sexo feminino.

Usou-se a Escala de Kurtzke ampliada, em ingls, Extended Disability Status Scale

(EDSS), para avaliao da severidade na MS de todos os doentes que foi de, na altura da

anlise, 3,7 2,3 (mdia desvio padro), numa gama de (1 8) (mnimo mximo),

36

sendo a mdia de durao da doena em anos 11,3 8,7 (mdia desvio padro) numa

gama de (1 39) (mnimo mximo).

2.3 Mtodos

2.3.1 Isolamento de linfcitos

Partindo de 10 ml de sangue venoso colhido para tubos com EDTAK3 a uma

concentrao de 0,34 M, fez-se uma diluio de 1:1 em soluo salina de tampo fosfato

PBS (phosphate-buffered saline: NaCl 120 mM, KCl 2,7 mM, SIGMA), a 10 mM e

pH=7,4 a 25C. A soluo diluda foi cuidadosamente colocada sobre um volume de 10

ml de Ficoll (Ficoll-Paque Plus; GE Healthcare Bio-Science AB Uppsala, Sweden),

num tubo cnico de 50 ml (tipo Falcon). O tubo foi centrifugado a 800 g durante 20

minutos a 20C (Centrifuga SIGMA 302 K, com rotor 11133). A camada superior do

plasma e o anel de linfcitos foram retirados cuidadosamente e transferidos para um

novo tubo de centrifugao, ao qual adicionmos 10 ml de PBS. Fez-se nova

centrifugao a 800 g durante 10 minutos a 20 C para obter o sedimento celular. O

sobrenadante foi removido e os linfcitos foram ressuspensos em 100 - 200 l de PBS,

consoante o rendimento celular.

37

2.3.2 Medio da actividade enzimtica dos complexos da MRC

Foi utilizada a tcnica de espectrofotometria de absoro molecular para medir a

actividade enzimtica dos complexos da MRC. A espectroscopia no ultravioleta visvel

(UV/VIS) envolve a espectroscopia de fotes (espectrofotometria). Esta tcnica utiliza

luz na faixa do visvel, do ultravioleta (UV) prximo e do infravermelho prximo. Para

se obter informao sobre a absoro de uma amostra, ela inserida no caminho ptico

do aparelho, a a luz UV e/ou visvel num certo comprimento de onda (ou uma faixa de

comprimentos de ondas) passada pela amostra. O espectrofotmetro mede a

quantidade de que luz foi absorvida pela amostra.

A absorvncia (A) a quantidade de luz absorvida por uma soluo. Atravs dela,

chegamos ao valor da concentrao (c), atravs da Lei de Beer- Lambert (equao 6),

onde I0 a radiao incidente no composto, It a radiao transmitida, o coeficiente

de extino molar e l o percurso da radiao que atravessa a amostra (dada pela

espessura do tubo de reaco em cm). Para a medir com preciso, necessrio eliminar

a disperso da luz e na ausncia de turbidez, A igual densidade ptica (DO), assim

sendo, convencionmos usar A em vez de DO.

(6)

A actividade enzimtica dos diferentes complexos da MRC medida atravs da

absoro selectiva de radiao a determinado comprimento de onda (), por diversos

compostos especficos em soluo na cuvette.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Espectrofotometriahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Luzhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Espectro_vis%C3%ADvelhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Radia%C3%A7%C3%A3o_ultravioletahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Radia%C3%A7%C3%A3o_infravermelha

38

O espectrofotmetro utilizado (SLM Aminco 2000) permite a monotorizao

espectral de A em condies de nico ou duplo comprimento de onda, em funo do

tempo. Quando em duplo comprimento de onda, permite monitorizar A por ter a

capacidade de fazer passar dois feixes de luz monocromtica com 2 comprimentos de

onda diferentes, ao mesmo tempo, por uma nica cuvete contendo a amostra e o meio

de reaco com o cromforo. A um dos monocromadores (monocromador 2) fica

atribudo o comprimento de onda de referncia (ref) (usualmente o ponto isobstico no

espectro de absoro do cromforo) e ao outro (monocromador 1) fica atribudo o

comprimento de onda da amostra (amostra), associado a um pico (ou vale) vizinho do

ponto isobstico no espectro de absoro do cromforo. O valor da DO ao ref

permanece constante e a medio da amostra corresponde diferena de DO entre os

dois comprimentos de onda. Este mtodo permite monitorizar a cintica de pequenas

alteraes de A, as quais normalmente no seriam detectadas, devido absoro e

disperso elevadas. J que ambos os feixes atravessam a mesma poro de uma nica

cuvete, os efeitos de sedimentao e disperso da amostra so cancelados.

O registo espectral exibido no monitor, observando-se os eixos de acordo com

escalas pr definidas a partir do painel de controlo e traado, ao mesmo tempo, num

registador Graphtee Pen Plotter MP 4400 ligado ao espectrofotmetro.

Todas as medidas so adquiridas no espectrofotmetro em duplo comprimento de

onda, medindo a variao da diferena de absorvncia dos 2 comprimentos de onda, ao

longo do tempo, a 37C. O protocolo foi seguido de acordo com Rustin et al (1994),

com algumas modificaes (Grazina, 2004).

Os linfcitos isolados a partir do sangue perifrico foram usados para a avaliao

espectrofotomtrica das actividades dos complexos II (succinato desidrogenase, SDH,

EC1.6.5.1), III (ubiquinol citocromo c reductase, QCR, EC1.10.2.2), IV (citocromo c

39

oxidase, COX, EC1.9.3.1), II+III (succinato-citocromo c oxiredutase, SCCR,

EC1.3.99.1), e CS (citrato sintetase, CS, EC 4.1.3.7). A citrato sintetase usada como

enzima marcadora mitocondrial (Grazina, 2004).

Os meios usados foram: Tampo 1 - KH2PO4 10 mM, BSA 1 mg/ml, pH=6,5 e

Tampo 2 EDTA, KH2PO4 10 mM, BSA 1 mg/ml, pH=7,8.

Todos os reagentes usados so SIGMA, excepto ditionito de sdio (Na2S2O4) e

Cianeto de potssio (KCN), que so MERCK.

2.3.3 Complexo II

A SDH medida a 600 nm pela reduo do 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP)

80 mM, iniciada pelo succinato 5M, em tampo 2. Inibe-se com a reaco com

malonato 5 mM.

2.3.4 Complexo II+III e complexo III

A SCCR medida a 550 nm seguindo a reduo do citocromo c 60 mM pelo

complexo III acoplado oxidao do succinato 5 mM, em tampo 2. A actividade do

complexo III avaliada na presena de decilubiquinol (DUQH2) 80 mM.

40

2.3.5 Complexo IV

A citocromo c oxidase medida velocidade mxima, seguindo a oxidao do

citocromo c reduzido 10 mM em tampo 1, a 550 nm, usando o dodecilmaltoside 1,25

mM como detergente permeabilizante da membrana externa mitocondrial com o

objectivo de facilitar a entrada do citocromo c reduzido, sem comprometer a integridade

membranar.

2.3.6 Citrato sintetase

A citrato sintetase responsvel pela reaco de condensao da acetil-CoA com

o oxaloacetato, que ocorre ao nvel da matriz mitocondrial e a primeira reaco do

ciclo de Krebs. Este ensaio segue a reaco do cido 5-ditiobis 2-nitrobenzoico 0,4 M

(DTNB), com a coenzima A, a qual formada a partir da reaco da acetil-CoA 0,2 mM

e oxalaoacetato 8 mM catalizada pela citrato sintetase e medida a 412 nm em tampo 2,

usando Triton X-100 a 20% como detergente que permite a permeabilizao das

membranas mitocondriais.

2.3.7 Concentrao de Protena

O teor proteico das amostras foi determinado pelo mtodo de Bradford

(Bradford, 1976). Este mtodo baseia-se na alterao de cor de um corante (Brilliant

Blue G) em resposta s vrias concentraes proteicas. Efectuou-se uma curva padro

41

com albumina plasmtica bovina (BSA) a 0.4%. Depois de obter a curva padro

procede-se determinao da quantidade de protena da amostra, diluda com Triton X-

100 a 2% e H2O mili-Q, na porporo de 1:6. A medio foi feita a 595 nm.

Os resultados espectrofotomtricos so convertidos em nmol de substrato

oxidado/minuto/mg de protena.

2.4 Critrio de deficincia para a MRC

A actividade enzimtica considerada deficiente quando tem valores abaixo de

40% de actividade, considerando o valor mdio normalizado para a CS (Grazina, 2004).

2.5 Anlise estatstica

Os resultados so apresentados como mdia desvio padro, mnimo e mximo

do grupo indicado. Os dados seguem uma distribuio gaussiana, ou seja, passam o

teste da normalidade quando p0,05. A significncia estatstica, para os resultados

bioqumicos, determinada usando o teste t de Student no emparelhado, sempre que o

teste de normalidade apresente p0,05. No caso dos resultados no passarem este teste,

ser aplicado o teste de Mann-Whitney.

Os testes de qui-2 e exacto de Fisher para as probabilidades so realizados para

esclarecer se h diferenas estatisticamente significativas nas frequncias genticas

42

observadas entre doentes MS e o grupo controlo, tanto para haplogrupos como para

alteraes do mtDNA.

Uma diferena considerada estatisticamente significativa quando p

43

Captulo 3 Resultados e discusso

44

3.1 Anlise Bioqumica da MRC

3.1.1 Resultados

Analismos a actividade enzimtica dos complexos da MCR em linfcitos de 50

doentes com MS.

Na tabela I esto sumariadas as caractersticas desse grupo.

Tabela I Caracterizao dos doentes com MS.

Nmero de indivduos 50

Sexo F/M 35F/15M

Idade mdia (anos) SD (mn-mx) 40,6 10,9 (2261)

EDSS mdia (anos) SD (mn-mx) 4,5 2,3 (18)

Idade de incio mdia (anos) SD (mn-mx) 29,8 10,5 (15-52)

Durao mdia da doena (anos) SD (mn-mx) 13,4 8,4 (2-34)

Legenda F: feminino; M: masculino; EDSS: Escala de Kurtzke ampliada; (Mdia (SD:

Desvio padro); (mn-mx): (mnimo mximo).

Na tabela II apresentam-se os resultados para a actividade especfica (valor

mdio desvio padro (SD)) dos complexos II, III, IV e do segmento II + III da MRC,

expressos em nmol/min/mg prot.

Todos os valores passaram no teste da normalidade, excepto para o CIV no

grupo MS (p* = 0,0447).

Na tabela III apresentamos os quocientes (valor mdio desvio padro) entre a

actividade especfica para cada complexo e a actividade da CS. Ao normalizar os

valores para a citrato sintetase corrigem-se, no apenas as diferenas na densidade

celular e composio das amostras, mas tambm uma potencial diferena no nmero de

mitocndrias.

45

Tabela II Actividade enzimtica especfica para os complexos II, III, IV e segmento

CII+III da MRC de controlos e doentes.

Actividade enzimtica (nmol/min/mg prot) (mdia SD) (mn-mx)

C II C III C IV C II+III CS

Controlos

(n=50)

30,43 13,79

(12,0-77,32)

78,10 43,48

(18,60-177,0)

133,5 40,67

(6,10-249,0)

26,58 12,88

(1,79-56,27)

76,79 23,56

(40,45-176,3)

Doentes MS

(n=50)

22,51 12,61

(8,42-66,46)

105,1 63,39

(17,16-340,1)

75,98 50,55

(10,01-212,3)

*

39,49 22,87

(8,6-109)

100,6 58,45

(44,43-406,0)

Legenda Mdia Desvio padro: (SD); (mn-mx): (mnimo mximo).

Tabela III Actividade enzimtica dos complexos II, III e IV segmento CII+III da

MRC, corrigido para a CS.

Actividade enzimtica da MRC corrigida para a CS mdia SD (mn-mx)

C IV/CS C II/CS C III/CS C II+III/CS

Controlo

(n=50)

1,69 1,01

(0,53-5,27)

0,35 0,22

(0-1,32)

0,93 0,77

(0-3,6)

0,55 0,37

(0,14-1,84)

Doentes MS

(n=50)

0,75 0,34

(0,18-1,59)

0,23 0,07

(0,07-0,52)

1,17 0,80

(0,20-4,49)

0,40 0,14

(0,11-0,86)

Legenda . Mdia Desvio padro: (SD); (mn-mx): (mnimomximo).

Todos os valores passaram no teste da normalidade.

A anlise de comparao das mdias das actividades dos vrios complexos para os

dois grupos de estudo, doentes e controlos, pelo teste t de Student ou pelo teste de

Mann-Whitney (quando os resultados no passaram o teste de normalidade), mostrou

que existia uma diferena significativa na actividade dos complexos II (p*=0,0114), IV

(p**=0,0050) , II+III (p***=0,0008) e da CS (p**=0,0088), em valor absoluto, no

grupo dos doentes. Aps correco para a CS, apenas a actividade do complexo IV

46

apresentou reduo significativa nos doentes (p*=0,0189). No entanto, foi necessrio

verificar para cada doente se tinha ou no dfice da MRC.

Os resultados da Tabela IV e figura 9 so relativos ao grupo MS, para averiguar os

dfices ao nvel dos complexos da MCR, para cada doente.

Tabela IV Resultados da avaliao dos dfices especficos na actividade dos

complexos da MRC, nos doentes com MS.

MS (%)

N 52

Def. Isolado IV 40

Def. Isolado III 2

Def. Isolado II 0

Def Isolado II+III 2

Def Combinado (IV+II+(II+III)) 0

Def Combinado (IV+II) 0

Def. Combinado (IV+(II+III)) 4

Legenda N: percentagem de indivduos MS com apresentao Normal; Def: dfice; Def.

Isolado: percentagem de indivduos com dfice isolado de um complexo especfico; Def.

Combinado: percentagem de indivduos com dfice combinado de dois ou mais complexos.

Figura 9 Representao grfica dos resultados da avaliao de dfices da MRC nos doentes

com MS. Def.: dfice.

47

Considerando que existe dfice num complexo se a sua actividade for inferior a

40% da mdia da actividade de referncia normalizada para a CS, verificmos que 44%

dos doentes apresentavam deficincia em apenas um complexo e 4% dos doentes

apresentam mais do que um complexo com deficincia.

Dos dados apresentados na tabela IV, podemos concluir que os dfices mais

frequentes so do complexo IV da MRC em 44% dos doentes avaliados, seguida pela

deficincia do segmento II+III em 6% dos indivduos, quer na forma isolada, quer na

forma combinada. No foram encontrados dfices isolados do complexo II, o que est

de acordo com o facto de o CII ser codificado no genoma nuclear. Os dfices isolados

do complexo III esto presentes em 2% dos doentes. Os dfices combinados dos

complexos IV e II+III encontram-se presentes em 4% dos doentes MS.

3.1.2 Discusso

Segundo a literatura, a formao do NO. pode contribuir para a diminuio de

energia e para a morte celular neuronal (Heales et al, 1999). A anlise do CSF de

doentes com MS indica a presena de actividadade da NOS (Calabrese et al, 2002;

Rejdak et al, 2008; Sayre et al, 2008).

Nos dados por ns analisados verificmos que o dfice mais frequente na MRC

ao nvel do complexo IV (Tabela IV e figura 9), o que est de acordo com trabalhos

anteriores (Duncan et al, 2005; Beltrn et al, 2000; Shiva et al, 2001; Brown et al,

2002). Segundo estes autores, o complexo IV o local de aco do NO. na mitocndria

mais bem caracterizado. O NO. compete com o O2 para se ligar ao centro de Cu

2+ da

COX. Esta ligao reversvel e competitiva aumenta o Km aparente do complexo IV

48

para o O2. Consequentemente, mesmo nveis fisiolgicos relativamente baixos de NO.

resultam na inibio da enzima citocromo c oxidase.

Verificmos tambm que 2% dos doentes com MS apresentam o complexo III

deficiente (Tabela IV). O trabalho de Dutta et al (2006) refere uma diminuio de 40%

na actividade do complexo III em fraces enriquecidas em mitocndrias isoladas de

crtex de doentes MS ps-mortem, quando comparadas com um grupo controlo. Eles

verificaram que nestes doentes, a MCR ficava com uma capacidade diminuda para

trocar electres ao nvel dos complexos I e III. Brown et al (2005) referem a inibio do

CIII pelo peroxinitrito. A formao deste composto comea quando o O2 no

totalmente reduzido a H2O pelos complexos I e III, e, em vez disso, reduzido a O2-.. O

NO e o O2- combinam-se para formar ONOO

-. A disfuno do complexo I e III conduz

tanto deficincia bioenergtica como ao aumento crnico na produo de ROS e RNS

(Beretta et al, 2004).

No que diz respeito ao nosso grupo de estudo, apenas 2% dos doentes MS

apresentam dfice ao nvel do segmento II+III (Tabela IV), enquanto os complexos II e

III no parecem mais afectados. O ensaio do segmento II+III requer quinona endgena,

Poderoso, 1996 sugeriu no seu trabalho que o NO. e possivelmente, o ONOO

- reagem

directamente com o ubiquinol e Heales et al (1999), concluiu que esta descoberta podia

sugerir uma explicao para a perda irreversvel da actividade do segmento II+III, que

ocorre logo a seguir exposio do ONOO- e sugere que a perda oxidativa da

ubiquinona possa ocorrer, sob certas condies, in vivo.

Os dfices combinados dos complexos IV, III e II esto presentes em 4% dos

doentes com MS, conforme os dados da Tabela V. A diminuio da actividade

enzimtica dos complexos da MRC podero ser uma consequncia tanto da inibio

49

enzimtica causada pelas ROS ou pelas RNS, como pela diminuio da expresso

proteica, devido a alteraes genticas.

3.2 Estudos genticos

3.2.1 Resultados

Comparmos os resultados obtidos da anlise do mtDNA de linfcitos em 216

controlos e 87 doentes. Os dados demogrficos e as caractersticas das doenas

encontram-se sumarizadas na tabela V.

Tabela V Caracterizao dos doentes com MS.

Nmero de indivduos 87

Sexo F/M 61 F/26 M

Idade (anos) SD (mn-mx) 43,3 10,8 (22-63)

EDSS (anos) SD (mn-mx)) 3,7 2,3 (1-8)

Idade de incio (anos) SD (mn-mx)) 31,9 10,7 (15-57)

Durao da doena (anos) SD (mn-mx)) 11,3 8,7 (1-39)

Legenda F: feminino; M: masculino; EDSS: Escala de Kurtzke ampliada; (Mdia (SD:

Desvio padro); (mn-mx): (mnimo mximo).

50

3.2.1.1 Haplogrupos mitocondriais

A caracterizao dos haplogrupos mitocondriais foi feita por PCR-RFLP, de

acordo com o protocolo previamente descrito (Oliveira, 2007). Foram usados primers

especficos para amplificar, por PCR, os fragmentos que contm as caractersticas

polimrficas da cada haplogrupo (H, JT, I, X), sendo os grupos menos frequentes na

populao europeia (V, U, HV, O, L, K, PV e T) classificados como outros. O

nmero de indivduos em cada haplogrupo foi determinado pela presena ou ausncia

do respectivo polimorfismo no mtDNA.

Os resultados do nosso laboratrio, no que diz respeito distribuio dos

haplogrupos mitocondriais, para controlos e doentes MS, encontram-se na tabela VI.

Tabela VI Frequncia dos haplogrupos mitocondriais para controlos e doentes MS e

anlise estatstica (teste exacto de Fisher).

Haplogrupo

Controlos

(n=216)

frequncia

(percentagem)

Doentes MS

n=(87)

frequncia

(percentagem)

p OR

H 85/216 (39,4%) 27/87 (32,1%) 0,1536 1,4770

JT 37/216 (17,2%) 20/87 (22,9%) 0,2570 0,6925

I 8/216 (3,7%) 3/87 (3,4%) 1,0000 1,0770

X 6/216 (2,8%) 6/87 (6,9%) 0,1099 0,3857

Outro 80/216 (37%) 31/87 (34,7%) 1,0000 1,0310

Legenda OR: odds ratio.

51

A frequncia global dos haplogrupos nos dois grupos de estudo no

significativamente diferente, apesar das diferenas de distribuio dos haplogrupos entre

os controlos e os doentes (figura 10).

Figura 10 Distribuio dos haplogrupos mitocondriais entre doentes MS controlos normais.

As principais diferenas entre os dois grupos esto no halpogrupo H, onde a

distribuio de 39,4% nos controlos vs. 32,1% nos doentes (p=0,1536), no haplogrupo

JT onde a distribuio de 17,2% nos controlos vs. 22,9% nos doentes (p=0,2570) e no

haplogrupo X onde a distribuio 2,8% nos controlos vs 6,9 % nos doentes

(p=0,1099).

52

3.2.1.2 Variaes de sequncia do mtDNA

No nosso laboratrio foi analisado o DNA de 50 indivduos no grupo controlo e

de 87 indivduos no grupo de doentes MS para as variaes de sequncia do mtDNA

nas posies dos nucletidos 3460, 4216, 4917, 11778, 13708, 14459, 14484 e 15257,

conforme descrito anteriormente (Grazina, 2007), com o objectivo de verificar as

distribuies para as variaes primrias e secundrias de LHON. As mutaes

patognicas 3460, 11778, 14459 e 14484 no foram detectadas em nenhuma amostra.

Tabela VII Frequncia de ocorrncia das variaes de sequncia do mtDNA para

controlos e doentes MS e anlise estatstica pelo teste de Fisher.

Variao de sequncia do mtDNA Controlos

(n=50)

frequncia

(percentagem)

Doentes MS n=(87)

frequncia

(percentagem)

p OR

ausente 43/50 (86%) 38/87 (43,8%) ***0,0001 7,921

13708 G>A 0/50 (0%) 5/87 (5,7%) 0,1582 0,1485

4216 T>C 1/50 (2%) 0/87 (0%) 0,3650 5,303

4216 T>C, 13708 G>A 1/50 (2%) 10/87 (11,5%) 0,0558 0,1571

4216 T>C, 13708 G>A, 15257 G>A 0/50 (0%) 4 /87(4,6%) 0,2963 0,1837

4216 T>C, 4917A>G 1/50 (2%) 10/87 (11,5%) 0,0558 0,1571

4917A>G 1/50 (2%) 0/87 (0%) 0,3650 5,303

O 2/50 (2%) 0/87 (0%) 0,1315 9,021

Legenda N: indivduos sem variaes de sequncia secundrias de LHON; O: outras alteraes;

OR: odds ratio.

53

Pela anlise dos dados com o teste de 2, observamos que existe significncia

estatstica (2 = 25,87 com p*** =0,0005) para a distribuio das frequncias entre os

dois grupos.

A variao do nucletido 13708G>A foi observada em 5,7% dos doentes,

estando ausente nos controlos. A combinao das variaes dos nucletidos 4216T>C,

13708G>A est presente em 6,9% dos doentes e em 2% dos controlos. O nmero de

indivduos com as variaes do mtDNA pesquisadas ausentes significativamente

superior no grupo controlo (p=0,033; tabela VII): 88% vs. 71,3%.

3.2.2 Discusso

No nosso estudo no encontrmos qualquer associao entre a presena de um

haplogrupo em particular e a ocorrncia de MS. Isto est de acordo com estudos

anteriores (Mihailova et al, 2006) apesar de outras investigaes mostrarem que h

associao entre os haplogrupos J e X ou JT e o desenvolvimento de MS,

respectivamente (Otaegui et al, 2004; Houshmand M et al, 2005). Contudo em estudos

comparativos deve ser dada ateno seleco dos controlos e importncia ao passado

gentico da populao, para poder obter concluses vlidas.

3.2.3 Correlao Bioqumica Gentica

Fomos analisar, pelo teste de 2, se existiria associao tanto entre os

haplogrupos H e JT como entre os indivduos com ou sem variaes de sequncia ao

54

nvel do mtDNA e os dfices ao nvel da MRC identificados no grupo de doentes MS.

Da anlise resultou que 2 = 4,857 e p=0,0881, no sendo a diferena estatisticamente

significativa, sugerindo que no existe associao entre as variveis dos estudos

bioqumicos e genticos dos haplogrupos mitocondriais, na amostragem analisada de 50

doentes, em cujas amostras se analisou a MRC.

Tabela VIII Distribuio dos haplogrupos H e JT em doentes com MRC com dfice

ou normal e anlise estatstica (teste exacto de Fisher).

Haplogrupo MRC com dfice MRC Normal Teste exacto de

Fisher

H 4/50 (8%) 10/50 (20%) p = 0,478

JT 8/50 (16%) 3/50 (6%) p = 0,1997

Outros 38/50 (76%) 37/59 (74%) p = 1,0000

Por outro lado, quando testmos a associao entre os haplogrupos H, JT e

outros para os doentes com MRC deficiente ou normal, com o teste exacto de Fisher,

verificmos que no existem diferenas estatisticamente significativas.

Fomos ento verificar se existia associao entre dfice da MRC e a presena de

variaes de sequncia do mtDNA. Apresentamos os resultados estatsticos na tabela

IX.

55

Tabela IX Distribuio de doentes com ou sem alteraes ao nvel do mtDNA no

grupo de doentes com MRC deficiente e normal.

mtDNA MRC Normal MRC com Dfice Teste exacto de Fisher

Sem alteraes 24/26 (92,3%) 14/24 (58,3%) p** = 0,0074

Com alteraes 2/26 (7,7%) 10/24 (41,7%) OR = 8,571

RR = 3,789

Legenda: **p

56

MS (Xinhua et al, 2008), sendo estas ideias reforadas pelos resultados obtidos no

presente trabalho.

57

Captulo 4 Concluses

58

Os resultados obtidos com o presente trabalho reforam a hiptese da disfuno

mitocondrial como resultado de leso oxidativa. Num futuro prximo, esperamos poder

dar novas contribuies para elucidar este aspecto com mais pormenor.

Dado o papel central da mitocndria em tantas funes celulares importantes,

incluindo a produo de energia, razovel que a sua disfuno seja um contributo

chave no processo neurodegenerativo desta doena. Consequentemente os tratamentos

dirigidos mitocndria e os tratamentos neuroprotectores, ou a combinao de

neuroprotectores e imunomodeladores poderiam representar uma abordagem mais

racional terapia da MS.