Capitulo-12_Purificação de Produtos Biotecnológicos

BIOENGENHARIA

Capítulo -12 – Purificação de Produtos Biotecnológicos

12.1 – Introdução12.2 – Definição e Escolha do Processo de Purificação12.3 – Clarificação12.4 – Rompimento de Células Microbianas12.5 – Purificação de Baixa Resolução12.6 – Purificação de Alta Resolução12.7 – Tratamentos Finais12.8 – Exercícios Resolvidos

12.1 – Introdução

A diversidade e crescente importância apresentada pelos produtos biotecnoló- gicos incentivou o desenvolvimento de vários processos de purificação, (ope- rações unitárias), bem como estímulou a introdução de modificações genéticas no desenvolvimento do microorganismo, com o objetivo de aumentar a resolu- ção na purificação, integrando as etapas de desenvolvimento do processo.

Produtos da indústria biotecnológica são altamente diversificados : - Ácidos orgânicos - Antibióticos - Polissacarídeos - Hormônios - Aminoácidos - Peptídeos - Proteínas Suas localizações na célula também variam conforme o produto.

Portanto, não há processos de purificação de aplicação geral.

O processo de purificação pode ser dividido em 4 etapas principais :

Etapas do Processo Objetivo da Etapa Operações Unitárias

ClarificaçãoSeparação de células e seus fragmentos do meio de cultivo.

- Filtração convencional- Centrifugação- Filtração tangencial- Floculação

Rompimento de CélulasPromover a retirada do produto das células para o meio de cultivo.

- Homogeinização- Moagem em moinho de

bolas- Rompimento químico- Rompimento enzimático

Purificação de Baixa Resolução

Separação da molécula alvo, por exemplo uma proteína, em relação a moléculas com características físico-químicas significativamente diferentes, tais como água, ions, pigmentos, ácidos nucleicos, polissacarídeos e lipídeos).

- Precipitação- Ultrafiltração- Extração em sistemas de

duas fases líquidas.

Purificação de Alta Resolução

Compreende a separação de classes de moléculas com algumas características físico-químicas semelhantes, como por exemplo proteínas.

- Cromatografia de troca iônica

- Cromatografia de afinidade biológica ou química.

- Cromatografia de fase reversa

- Cromatografia de exclusão molecular.

Tratamentos FinaisOperações de acondicionamento final do produto.

- Cristalização- Liofilização- Secagem

Etap

as d

e um

Pro

cess

o de

Pur

ifica

ção

Etap

as d

e um

Pro

cess

o de

Pur

ifica

ção

Baixa resolução

Alta resolução

A definição das operações unitárias de um processo de purificação dependedo uso da molécula alvo, suas características físico-químicas, bem como aquelasdas impurezas.

Produtos destinados a usos terapêuticos são, obviamente, os que requeremmaior nível de pureza e, portanto, a complexidade do processo de purificação émaior.

Uma medida dessa complexidade é o custo do processo de purificação emrelação ao custo final do produto, o qual pode chegar a 80%.

Em resumo, pode dizer que o sucesso técnico e econômico do processo está re-lacionado à seleção adequada das técnicas e da ordem de aplicação das mesmas.de forma geral, algumas regras podem ser analisadas para uma abordagem inicial:- Escolha de processos de purificação baseados nas diferenças apresentadas em uma dada propriedade físico-química das moléculas (produto e impurezas);- Remoção das impurezas presentes em maior concentração nas etapas iniciais do processo;- Aplicação de técnicas de alta resolução em relação ao produto, nas etapas finais do processo.

12.2 – Definição e Escolha do Processo de Purificação

OPERAÇÃO UNITÁRIA CARACTERÍSTICAS DETERMINANTES

CentrifugaçãoDensidade e tamanho das células,Viscosidade do meio.

Filtração convencional Compressibilidade e tamanho das células.

Microfiltração Tamanho das células ou partículas.

Homogeinização Resistência física da parede celular ao gradiente de pressão.

Moinho de bolasResistência física da parede celular à tensão de cisalhamento.

Extração em SDFA precipitação Solubilidade de proteínas.

Cromatografia de troca iônica Mobilidade eletroforética de proteínas.

Ultrafiltração, gel filtração Massa molecular

A determinação da características do produto e das principais impurezas éfundamental no sucesso das operações subsequentes de purificaçãopropriamente dita, uma vez que o fracionamento está baseado nas proprie-dades físico-químicas das moléculas envolvidas :

Alguns critérios norteiam a escolha das op. unitárias de clarificação e homogeinização :-Grandes volumes de suspensões de leveduras são eficientemente clarificados por centrifugação, enquanto que para volumes moderados de suspensões , uma comparação entre a centrifugação e a filtração tangencial pode ser feita.-Micoorganismos filamentosos, por outro lado, são clarificados através de filtração convencional, devido à reduzida velocidade de sedimentação destes organismos de baixa densidade.

A modificação da estrutura de moléculas é um recurso importante para o aumento do poderde resolução de determinadas operações de purificação e, consequentemente , redução donúmero de etapas envolvidas.- Por exemplo, a introdução de sequências terminais à estrutura da proteína alvo que a enderecem para o espaço periplásmico e implementação destas modificações via em- genharia genética, possibilita a extração apenas das moléculas do espaço periplasmá- tico, o que significa menor contaminação da molécula alvo.- Por exemplo, um peptídeo humano de ação diurética e hipotensiva, de apenas 2 kda, foi modificado pela introdução da sequência relativa a uma proteína natural de E. coli , a tioredoxina de 11.700 kda, e uma sequência de 6 histidinas em seu gene estrutural, constituindo uma molécula de fusão. A primeira modificação teve por objetivo aumentar o nível de produção intracelular do peptídeo e protege-lo da ação de proteases; a segun- da modificação destina-se a tornar a molécula passível de purificação em processo cro- matográfico por afinidade com ions níquel imobilizados na matriz. A molécula foi totalmente purificada unicamente por este processo, aplicado à fase solúvel das células rom- pidas. Após a purificação, foi necessária uma hidrólise efetuada por enzima específica sobre o sítio introduzido para este fim (sítio de clivagem), a fim de se obter o peptídeo somente.

A adsorção em leito expandido tem sido cada vez mais adotada, pois possibilita aredução do número de etapas, uma vez que a captura de proteínas se dá a partirde meios que contém partículas, procedimento que viabiliza a clarificação de umasuspensão ou de um homogeinizado de células e a purificação da molécula alvoem uma única operação. Além disso, a redução do tempo de processamento dimi-nui a possibilidade de hidrólise da molécula alvo por ação de proteases, normal-mente presentes quando se trata de produtos intracelulares.

É importante comentar que além das caracterizações físico-químicas das moléculas, também devem ser consideradas características inerentes às operações. Por exemplo, na gel filtração ocorre diluição significativa, isto é, a concentração das moléculas nas frações coletadas é menor que a concentração no meio injetado na coluna. Por essa razão, a gel filtração é empregada na última etapa de um processo de purificação, pois do contrá- rio, acarretaria umento do volume do meio a ser tratado ao longo do processo. Ao final do processo, pode-se empregar a utrafiltração para ajuste da concentração. A cromatografia de troca iônica, ao contrário da gel filtra- ção, promove o aumento da concentração das moléculas.

12.3 – ClarificaçãoA separação de células suspensas de um meio de cultivo é frequentemente aprimeira operação unitária de purificação. O meio resultante, isento de células,é denominado clarificado ou filtrado.

As operações unitárias, nesta primeira etapa após o processo de fermentação,podem ser :

-Decantação-Filtração Convencional-Filtração Tangencial-Centrifugação

A figura abaixo ilustra a faixa de dimensão de partícula e a operação unitária :

Classificação de operações unitárias de clarificação em função das dimensões de células microbianas

12.3.1 - Decantação

Processo de separação sólido-líquido que tem como força propulsora a ação da gravidade sobre as partículas sólidas.

A velocidade de ascensão do líquido (e de decantação das partículas sólidas) é a principal variável e é afetada por : ρL e ρS ; μ(T) ; dp e φp Concentração de sólidos em suspensão (Lei de Stokes, Velocidade Terminal)

EntradaSuspensãoSólidos

SaídaClarificado

SaídaLamaRastelo

MedidorDensidade

BombaVelocidadeVariável

MecanismoDe Elevação Torque

QA , CA

QL , CL

QB, CB

QCzonalimite

VL

Dimensionamento Básico de Decantadores ( Área )- Método pela Velocidade de Ascensão

Considera a velocidade de ascensão e concentração em todas as interfaces das zonas de clarificação,garantindo que a mínima velocidade de ascensão do líquido não provoque o arrastamento de partículassólidas (máx. área).

Fluxo de Líquido na Zona Limite (interface) QC = QA – QB

VL = QA - QB S = QA - QB

S VL

Fluxo Mássico de Sólidos em Regime Contínuo

QA . CA = QB . CB QB = QA . CA CB

VL Conhecido e tabelado pelo histórico de operação em instalações existentes.

S = QA . ( 1 - CA ) VL CB

12.3.2 - Filtração

Filtro Rotativoa Vácuo

12.3.3 - Centrifugação

Na filtração, o objetivo é a obtenção do meio clarificado, enquanto que nacentrifugação, além deste adiciona-se o objetivo de obter uma massa decélulas de forma que proporcione a recuperação e o reciclo destas célu-las recuperadas para os fermentadores.

Quando as células ou o caldo fermentadodevem voltar ao biorreator, pode-se usarcentrífugas esterilizáveis por vapor.

Fc deve ser mencionado na caracterização de uma centrifugação juntamente com o tempo adotado para se obter determinado grau de clarificação.

12.4 – Rompimento de Células Microbianas

Biomolécula Alvo

12.4.1 - Rompimento Mecânico

Muito utilizados industrialmente.

Dois equipamentos predominantes : - Homogeinizador - Moinho de bolas

O tamanho e aaforma das células, assim a estrutura da parede celular, são fatores determinantes para o tipo de processo a ser utilizado.

- Os homogeinizadores são, basicamente, constituídos de pistões projetados para aplicar altas pressões à suspensão celular, forçando sua passagem através de um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície em uma câmara de baixa pressão.

12.4.2 - Rompimento Não-Mecânico

1) Choque Osmótico

Não ocorre rompimento total das células;

Pode propiciar a permeabilização seletiva;

As células são mantidas por 30 minutos em meio com concentração de sacarose de ~20% (m/v), separadas por centrifugação e ressuspensas em água destilada a 4ºC.

Mais indicado para bactérias Gram-negativas, pois possuem parede celular mais sensível que as Gram-positivas.

Rompimento total e permeabilização seletiva

2. Congelamento-Descongelamento

As células passam por repetidos ciclos de congelamento e descongelamento, formando-se cristais de gelo que podem perfurar a célula e provocar seu total rompimento ou lesioná-la formando poros permeáveis à biomolécula-alvo.

Fatores que mais influenciam: ◦ tipo e idade da célula; ◦ Temperatura◦ Velocidades dos ciclos de congelamento e descongelamento;

Método de difícil implantação em grande escala

Enzimas sensíveis ao congelamento podem ser inativadas

3. Termólise (Aquecimento)

Consiste no aquecimento da suspensão celular em banho termostatizado, com injeção direta de vapor, tambor rotativo ou em spray-drier.

Sãos os mais utilizados para rompimento em larga escala devido à sua simplicidade;

Principalmente utilizados para algas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias destinadas à produção de proteína microbiana;

Apresenta a vantagem de gerar fragmentos celulares com maiores dimensões e, portanto, de mais fácil remoção por filtração ou centrifugação.

Rompimento total de células de uma suspensão de E. coli (bactéria Gram-negativa), ocorre com aquecimento a 90 ºC por 15 minutos com liberação de enzimas intracelulares

Uma suspensão de Bacilus megaterium nas mesmas condições proporciona o rompimento de menos da metade das células (bactéria Gram-positiva- camada mais espessa de peptideoglicano)

12.4.3 - Rompimento Químico

1. ÁlcalisAdequado quando a molécula-alvo é estável em pH maior que 11Método simples e de baixo custo;Ocasiona geração de poluentes;

2. DetergentesSão capazes de dissociar proteínas e lipoproteínas das paredes celulares, provocando a formação de poros e liberar a molécula-alvo;A célula pode ser totalmente rompida;Ex.: lauril sulfato de sódio, Triton, etc. Formação de espuma e desnaturação e/ou precipitação de proteínas

3. SolventesConsiste na desidratação das células, sendo os solventes mais utilizados o etanol, metanol, tolueno e acetona;Adequado para biomoléculas que não sejam desnaturadas na presença do solvente empregado;

12.4.4 - Rompimento Enzimático

Lise enzimática:

Mecanismo de rompimento: membrana citoplasmática é rompida pela pressão osmótica interna, após a parede celular, ou parte dela, ser removida por ação das enzimas, permitindo que o conteúdo intracelular seja liberado.

Adequado para recuperação de biomoléculas sensíveis ao rompimento mecânico, temperatura, tensão de cisalhamento e elevadas pressões.

Fatores a ser considerados: presença de inibidores, possibilidade de reciclo da enzima.

Sistema enzimático deve ser adequado para cada tipo de microrganismo:

◦ Leveduras: glucanases, proteases e mananases, as quais hidrolisam componentes específicos da parede, como glucanas, proteínas e mananas.

◦ Bactérias Gram-negativas: enzimas que ajam sobre as ligações covalentes da estrutura do peptideoglicano

Parede Celular Bacteriana Peptideoglicano

Ex.: lisozima, catalisa ahidrólise das ligações

glicosídicas do peptideoglicano, mais

eficiente no rompimentos de bactérias Gram positivas.

Preservação da Biomolécula-alvo

Adição de inibidores de proteases (para diminuir o efeito da degradação de proteínas);

Adição de agentes redutores (para evitar a oxidação dos sítios ativos das enzimas após o rompimento);

Adição de nucleases ou proteases podem melhorar as características do meio, desde que não destruam a molécula de interesse;

Alteração de pH pode melhorar a viscosidade do meio.

12.5 – Purificação de Baixa Resolução

Concentração e/ou Purificação de Baixa Resolução consiste na separação da molécula alvo, por exemplo uma proteína, em relação a moléculas com características físico-químicas significativamente diferentes, tais como água, ions, pigmentos, ácidos nucleicos, polissacarídeos e lipídeos).

As principais operações unitárias envolvidas neste processo são :

-Precipitação

-Ultrafiltração (filtração por membranas)

-Extração em sistemas de duas fases líquidas.

12.5.1 – Precipitação da Molécula Alvo

Uma perturbação , química ou física, em uma solução protéica causa a formação de partículas insolúveis de proteína, recuperadas posteriormente por uma operação de separação sólido-líquido

Precipitação :Sem elevada capacidade de separação de diferentes proteínas

Método de moderado poder de purificação

Precede processos de elevada resolução : cromatografia

Método agressivo

Proteínas precipitadas têm sua estrutura tridimensional modificada Função bioquímica depende da estrutura desta estrutura (enzima)

Portanto, só é viável quando a adequada conformação da proteína é recuperada após a precipitação

Os meios que contêm a proteína a ser purificada apresentam, em geral misturas de diferentes biomoléculas e as precipitações devem ser conduzidas em duas ou mais etapas :

Primeira etapa → remoção de proteínas indesejáveis menos solúveis

Seguintes etapas → precipitação de um ou mais biomolécula alvo

Ppt simples, em um único estágio → concentração

Ppt fracionada → largamente utilizada industrialmente para a purificação

Inconvenientes :

•Pouca reprodutibilidade dos resultados obtidos em laboratório•Redução da eficiência observada com o aumento da escala

- O sobrenadante de uma precipitação fracionada é o material inicia para o próximo fracionamento e podem ocorrer mudanças conformacionais e perdas.- Principal variável é a concentração de precipitante. Porém, pH, temperatura, força iônica e concentração de proteínas também podem ser usadas como variáveis.

Precipitação Fracionada

Em soluções aquosas a precipitação pode ocorrer por :

Precipitante Princípio Vantagens Desvantagens Sais neutros

(Salting-out)Interações hidrofóbicas pela

redução da camada de hidratação da proteína

- Uso universal - Corrosivo

- Baixo custo - Liberação de amônia em pH alcalino

Polímeros não-iônicos Exclusão da proteína da fase aquosa reduzindo a quantidade de água disponível para a solvatação da

proteína

- Uso de pequenas quantidades de precipitante

- Aumento da viscosidade

Calor interações hidrofóbicas e interferência das moléculas de água

nas ligações de hidrogênio,

- Baixo custo - Risco de desnaturação- Simples

Polieletró-litos Ligação com a molécula de proteína atuando como agente floculante


- Risco de desnaturação

Precipitação isoelétrica Neutralização da carga global da proteína pela alteração do pH do

meio



Sais metálicos Formação de complexos - Uso de pequenas quantidades de precipitante


Solventes orgânicos Redução da constante dielétrica do meio aumentando as interações eletrostáticas intermoleculares

- Facilidade de reciclagem - Risco de desnaturação de proteínas

- Facilidade na remoção do precipitado

- Inflamável e explosivo

Precipitantes e princípios :

Estrutura das ProteínasEstrutura das ProteínasConstituição

◦ Aminoácidos (aa) com elevada massa molar (> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos, apenas 20 constituem as proteínas.

◦ Os 20 aa das proteínas se diferenciam pela cadeia lateral R, que determina o caráter ácido ou básico do aa em solução.

Estrutura das Proteínas

Estrutura primária: refere-se à seqüência dos aminoácidos na cadeia linear peptídica.

Estrutura secundária: refere-se ao grau de ordenação espacial da cadeia polipeptídica. São estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.

Estrutura terciária: refere-se ao arranjo espacial obtido pelas dobraduras e enrolamentos da estrutura secundária. Envolve a otimização de várias interações (hidrofóbicas, eletrostáticas e de van der Waals) e pontes de hidrogênio entre vários grupos na estrutura da proteína.

As estruturas secundária e terciária conferem à proteína a sua estrutura tridimensional.

Estrutura das Estrutura das ProteínasProteínas

Estrutura quaternária: envolve a associação de subunidades terciárias de proteínas. Para sua estabilização concorrem ligações iônicas, pontes de hidrogênio, forças de van der Waals, pontes bissulfeto e interações hidrofóbicas.

Solubilidade de Proteínas

Região Hidrofóbica

(Apolar) Regiões Hidrofílicas(Polares)

Determina sua solubilidade

Além dos aa, íons ferro e cobre, oligossacarídeos e lipídeos conferem diferentes solubilidades às proteínas.

Solubilidade: resultado global das interações atrativas e repulsivas entre moléculas do solvente e soluto;

É favorecida quando há interações repulsivas entre moléculas de soluto e atrativas entre moléculas do soluto e solvente;

Interações entre soluto e solvente são não covalentes => interações eletrostáticas e forças de Van der Waals;

pH: grande influência => altera o grau de dissociação dos grupamentos;

◦Carga total zero leva ao da agregação devido à repulsão => perfis de solubilidade em diferentes valores de pH

O ponto de solubilidade mínima é igual ou próximo ao ponto isoelétrico (pI), que corresponde ao valor de pH no qual a proteína possui carga global igual a zero.

pH e distribuição de cargas:

pI

- - + +

De modo geral, o solvente é aquoso, e, alterando-se as propriedades do meio por mudanças na força iônica e no pH, por adição de solventes orgânicos miscíveis e polímeros orgânicos, altera-se a solubilidade das proteínas.

DesnaturaçãoDesnaturação X X PrecipitaçãoPrecipitaçãoA desnaturação compreende a destruição da

estrutura terciária de uma molécula de proteína e a formação de cadeias polipeptídicas ao acaso.- as variáveis pH, temperatura e solventes orgânicos, dependendo dos valores, causam desnaturação das proteínas.

A precipitação compreende a modificação da estrutura tridimensional da molécula de proteína.- as mesmas variáveis, dependendo dos valores, causam precipitação das proteínas.

A precipitação deve permitir que a conformação adequada da proteína seja recuperada, para que a mesma possa “exercer” sua função bioquímica após o processo.

Precipitação por saisPrecipitação por saisNeutralização das cargas superficiais com redução da camada de hidrataçãoSalting-out: adição de sais que promovem o aprisionamento de moléculas de água que tornam-se escassas e o consequente consumo das moléculas de água nas regiões hidrofóbicas, que expostas interagem e se agregam.Os sais mais adequados são aqueles

que apresentam elevada solubilidade, ex.: citrato de sódio, sulfato de sódio e sulfato de amônio.

◦ Salting-in: redução na concentração de sais induz interações iônicas e agregação entre moléculas de proteína.

Método mais comumente usado para separação de proteínas é o da adição de sais neutros (salting out)

Globulinas se precipitam sob força iônica baixa

Precipitação por solventes A solubilidade das proteínas varia com a distribuição

dos resíduos hidrofílicos e hidrofóbicos na superfície da molécula;

Álcoois de cadeia inferior, acetona, éteres e outros: precipitantes;

Deve ser miscível em água, não reagir diretamente com as moléculas e ser bom precipitante;

Mais usados: metanol, etanol e acetona;

Mecanismo da Precipitação por Solventes

Agregação de proteínas por interações eletrostáticas entre superfícies com cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgânico.

Variáveis que afetam o processo◦Temperatura: 20 – 30 ºC estimulam a

desnaturação < 0º C podem garantir que não haja desnaturação

adição do solvente temperatura => deve ser lenta e sob refrigeração

◦pH: próximo ao pI favorece a precipitação

Precipitação por polímeros PEG (polietilenoglicol), polímero de alta massa molar,

neutro e miscível em água, disponível em diversos graus de polimerização;◦ Em geral, proporções de polímero (15 a 30%);◦ 4000 g/mol ou mais são os mais eficientes◦ Mecanismo: exclusão da proteína do meio aquoso;◦ Concentração depende do tamanho da molécula a

ser precipitada e da massa molar do polímero, sendo inversamente proporcional à concentração da proteína;

◦ Remoção do polímero: ultrafiltração, adição de etanol, separação pela formação de duas fases aquosas pela adição de sais.

Polieletrólitos: polímeros iônicos solúveis em água; usados devido ao baixo custo e pouca concentração residual;◦ Policátion polietilenoimina e poliânion ácido poliacrílico,

utilizados para precipitar ácidos nucléicos e proteínas.◦ Mecanismo: Ocorre a agregação à proteína (floculação)

ou eletrostático (neutralização de cargas); a proteína e o polieletrólito devem ter cargas opostas , por isso, deve-se operar longe do ponto isoelétrico da proteína.

Precipitação pela temperatura Mecanismo:1) diminuição: redução na solubilidade; 2) aumento: desnaturação => exposição de grupos hidrofóbicos que interagem e formam complexos insolúveis;

Precipitação isoelétricaResulta da atração eletrostática das proteínas

quando estas estão próximas a seu pI;Método bastante simples: ajuste do pH

◦ Próximo ao pI a repulsão eletrostática é mínima => precipitação isoelétrica, por interação entre as zonas hidrofóbicas;

Vantagem: baixo custoDesvantagem: possibilidade desnaturação Obs.: Método útil para precipitar proteínas

indesejáveis e otimizar outros tipos de precipitação;

12.5.2 – Separação por Membranas

Os processos mais empregados para purificação de bioprodutos são os que utilizam a diferença de pressão como força motriz;

Em razão da natureza e do tipo de solutos e da presença ou não de partículas em suspensão, existem diferentes membranas com diferentes tamanhos e distribuição de poros caracterizando 4 principais processos:

◦ Microfiltração;◦ Ultrafiltração;◦ Nanofiltração.◦ Osmove inversa.

A membrana atua como uma barreira seletiva permitindo a passagem de determinados componentes enquanto impede a passagem de outros.

Vantagens da Separação por Membranas

Economia de Energia :Os PSM, em sua grande maioria, promovem a separação sem que ocorra mudança de fase.

Seletividade :Em algumas aplicações estes processos se apresentam como a única alternativa técnica de separação.

Separação de Compostos Termolábeis :São operados à temperatura ambiente, podendo ser aplicados no fracionamento de misturas envolvendo substâncias termossensíveis amplamente empregados na indústria farmacêutica e de alimentos.

Simplicidade de Operação e Escalonamento :São simples do ponto de vista operacional e em termos de escalonamento(scaleup)..Os sistemas são modulares e os dados para o dimensionamento de uma planta podem ser obtidos a partir de equipamentos pilotos operando com módulos de membrana de mesma dimensão daqueles utilizadosi ndustrialmente. Além disso, a operação dos equipamentos com membranas é simplese nãoi ntensiva em mão-de-obra.

Classificação dos Sistemas :

FORÇA MOTRIZ : - Concentração - Pressão - Potencial Elétrico - Temperatura

Principais características dos processos que utilizam diferença de pressão como força motriz :

Faixas de tamanho de poros das membranas

Microfiltração É similar a uma filtração clássica que utiliza membranas

sintéticas como barreira seletivaEmprega membranas microporosas, isotrópicas ou

anisotrópicas, com tamanho de poros entre 0,05 a 5 mmÉ empregada para reter partículas em suspensão, tanto no

ar quanto em misturas aquosasSão membranas totalmente permeáveis aos compostos

solúveis, independentemente do valor de suas massas molares

Aplicação: filtração estéril, tanto de líquidos (mosto) quanto de gases (ar).

Ultrafiltração Emprega membranas microporosas anisotrópicas, com

diâmetros de poros entre 1 e 500 nm.

Capaz de reter macromoléculas em solução, e permeável a todos os solutos de baixa massa molar

O limite de retenção de uma membrana de ultrafiltração é definido como o valor da massa molar de uma macromolécula rejeitada em 95% pela membrana

Aplicações :-Utilizada na purificação quanto na concentração de proteínas e enzimas-Indústria alimentícia–pré concentração do leite e recuperação de proteínas do

soro do queijo,-Indústria automobilística e têxtil– recuperação de pigmentos para reciclo da

água

Nanofiltração

Osmose Inversa Utiliza membranas anisotrópicas densas, portanto, são

permeáveis apenas ao solvente, em geral, água, retendo, praticamente, todas as moléculas solúveis e materiais em suspensão;

Alta pressão faz a água atravessar a membrana no sentido da solução mais concentrada para a menos concentrada.

Osmose Inversa

Diafiltração

12.5.3 – Separação por Extração Líquido-Líquido

• Utilizada na purificação de antibióticos e ácidos orgânicos;

• Consiste na separação da molécula-alvo e impurezas baseada em suas diferentes solubilidades nas fases líquidas

Vantagens

Sistemas de duas fases aquosas são formados pela reunião de determinados polímeros, polieletrólitos, ou polímeros em combinação com solutos de baixa massa molar formando quatro grupos de combinações :

◦ 2 polímeros não-iônicos.◦ Polieletrólito e um polímero não-iônico;◦ 2 polieletrólitos ◦ Polímero não-iônico e um composto de baixa massa

molecular

Extração em sistemas de duas fases aquosas

Sistemas formados por polietilenoglicol e um sal são intensamente empregados por apresentarem rápida separação das fases, baixo custo e elevada seletividade na separação de moléculas com base na solubilidade

Extração em sistemas de duas fases aquosas

Duas soluções aquosas imiscíveis; Molécula-alvo P apresenta maior solubilidade na fase de topo em relação à fase de fundo;

Maior grau de pureza da molécula-alvo se os contaminantes apresentarem solubilidade maior na fase de fundo

Diagrama de Equilíbrio em sistemas de Diagrama de Equilíbrio em sistemas de duas fases aquosas (SDFA)duas fases aquosas (SDFA)Curva de equilíbrio de um sistema PEG/fosfatoCurva de equilíbrio de um sistema PEG/fosfato

Reta TMB: linha de amarração (“tie-line”)

Curvas de equilíbrio do sistema PEG/fosfato Curvas de equilíbrio do sistema PEG/fosfato de potássio em função dos parâmetros de potássio em função dos parâmetros massa molecular e pH do meiomassa molecular e pH do meio

Coeficiente de Partição (K)

Grandeza adimensional que representa a relação entre as concentrações da molécula de interesse na fase de topo e na fase de fundo no equilíbrio:

K= CTi

CFi

CTi = Concentração de soluto i na fase de topo (g/L); CFi= Concentração de soluto i na fase de fundo (g/L);

Utilizado para avaliação da extensão das separações nos sistemas de duas fases aquosas;Ocorrência de purificação: coeficientes distintos para a molécula de interesse e para as demais moléculas.

Fatores que influenciam no coeficiente de partição K

Interações hidrofóbicasCargas superficiais / pHDiferença de potencial elétrico entre as

fasesEfeito de salting-out da fase salinaDiferenças de viscosidadeDiferenças de densidadeDiagramas de fases (ex.: concentração de

PEG e sal)Massa molecular da biomolécula

12.6 – Purificação de Alta Resolução

Concentração e/ou Purificação de Alta Resolução consiste na separação da molécula alvo, em relação a moléculas com algumas características físico-químicas semelhantes, tais como algumas proteínas.

As principais operações unitárias envolvidas neste processo são :

-Cromatografia de exclusão molecular

-Cromatografia de troca-iônica

-Cromatografia de interação hidrofóbica

- Cromatografia de afinidade

Cromatografia

Princípio Geral:

Retenção e Liberação da molécula-alvo.

A matriz sólida é capaz de reter a molécula por um determinado período de tempo (tempo de retenção),

normalmente por processo de adsorção.

Eluição do fluido e consequente separação da molécula-alvo.

Cromatografia

CromatografiaCromatografia

Cromatografia de exclusão Cromatografia de exclusão molecularmolecular

Processo:

Os solutos de um meio líquido (proteínas, peptídeos, anticorpos) são adsorvidos ou retidos em um leito de material poroso;

As moléculas sofrem partição em virtude das diferenças no tamanho das espécies entre um solvente (fase móvel) e uma fase estacionária de porosidade definida;

A posterior remoção gradual dos solutos por ação de uma fase líquida móvel (eluente), resulta na separação das diferentes moléculas

Cromatografia de exclusão molecular

A ordem de recuperação seletiva das moléculas no fluxo eluente tem início com as maiores moléculas, prosseguindo em direção às menores.

Separação por tamanho das moléculas


Eluição de uma mistura de três proteínas de massas moleculares diferentes em uma coluna de permeação em gel, com a formação de faixas distintas à medida que a amostra permeia a coluna


Aplicações:

◦Dessalinização

◦Determinação de massas moleculares

◦Determinação de tamanho de poros

Baseia-se na afinidade que componentes de uma amostra tem com os sítios iônicos em uma matriz sólida, ou seja, existe uma competição entre íons de interesse e contaminantes pelos grupos carregados da matriz ou da fase estacionária.

As resinas empregadas apresentam elevada capacidade de adsorção de proteínas

A fase estacionária, eletricamente carregada, tem a capacidade de reter solutos que estão na fase móvel e apresentam cargas de sinais opostos

Controle de pH e força iônica

Cromatografia de troca-iônica

Matrizes de troca-iônica:

Trocadores aniônicos: contém grupos positivamente carregados e adsorvem proteínas com carga líquida negativa

Trocadores catiônicos: contém grupos negativamente carregados e adsorvem proteínas com carga líquida positiva

Após serem adsorvidos à matriz, os solutos podem ser eluídos por deslocamento com outros íons, com a mesma carga da proteína adsorvida, porém com maior força de interação com a fase estacionária.

Cromatografia de troca-iônica

Princípio básico da cromatografia de troca iônica

Cromatografia de troca-iônicaCromatografia de troca-iônica

Cromatografia de interação hidrofóbica

Baseia-se na retenção das moléculas pela interação da sua região hidrofóbica com a matriz

A proteína é colocada em meio com elevada concentração de sal (expõe a região hidrofóbica, aumentando a interação com a matriz)


Molécula de proteína Molécula de proteína


Modelos de adsorçãoModelos de adsorção

a: modelo uniponto; b e c: adsorção uniponto; d: forças hidrofóbicas de intensidades diferentes em razão das irregularidades na superfície da matriz.

Técnica de separação altamente específica que depende das interações entre os pares de materiais biológico: enzima-substrato, enzima-inibidor, antígeno-anticorpo.

O ligante é imobilizado em uma matriz porosa

Cromatografia de Afinidade


Alta especificidade

Separação de formas ativas de formas desnaturadas


Alta especificidadeAlta especificidade

Separação de formas nativas de formas Separação de formas nativas de formas desnaturadasdesnaturadas

O complexo formado entre o ligante e a proteína tem que O complexo formado entre o ligante e a proteína tem que ser reversível;ser reversível;

A proteína é eluída e o ligante regenerado.A proteína é eluída e o ligante regenerado.

Cromatografia – Ampliação Cromatografia – Ampliação de Escalade Escala

Critérios:

Manter os mesmos graus de pureza, rendimento, atividade biológica e, se possível, rendimento, alcançados em escala de bancada;

Purificação de miligramas a gramas de produto;

Principal característica: aumento do diâmetro da coluna e a manutenção constante da altura do leito cromatográfico, exceto para exclusão molecular (ainda deve ser aumentado em 10 % a altura do leito);

Parâmetros que devem ser mantidos constantes: Volume da fase estacionária; Grau de empacotamento; Altura do leito cromatográfico; Velocidade linear de alimentação (vazão volumétrica dividida

pela área de corte transversal da coluna).

Parâmetros que devem ter o valor aumentado: Diâmetro da coluna; Fluxo volumétrico; Volume de amostra

Cromatografia – Ampliação de Escala

Colunas industriais• Altura de leito em torno de 30 cm e diâmetro da ordem de 1 m.• Maiores volumes de colunas da ordem de 700 a 2000 L (ex.:

purificação do soro de queijo)

Cromatografia – Ampliação de Escala

12.7 – Tratamentos Finais

Operações para acondicionamento final do produto

-Liofilização

-Cristalização

-Secagem

Capitulo-12_Purificação de Produtos Biotecnológicos

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