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Captulo 19 Fosforilao Oxidativa e Fotofosforilao A fosforilao oxidativa o estgio final do metabolismo produtor de energia nos organismos aerbicos. Todas as etapas oxidativas na degradao dos carboidratos, gorduras e aminocidos convergem para esse estgio final da respirao celular onde, a energia proveniente da oxidao responsvel pela sntese de ATP. A fotofosforilao o meio pelo qual os organismos fotossintticos capturam a energia da luz solar a fonte fundamental de energia na biosfera e a usam para produzir ATP. A fosforilao oxidativa e a fotofosforilao em conjunto, so responsveis pela maioria do ATP sintetizado por vrios organismos aerbicos na maior parte do tempo. Nos eucariotos, a fosforilao oxidativa ocorre nas mitocndrias e a fotofosforilao, nos cloroplastos. A fosforilao oxidativa envolve a reduo do O2 a H2O com eltrons doados pelo NADH e FADH2, e ocorre igualmente na presena de luz ou na escurido. A fotofosforilao envolve a oxidao da H2O a O2, onde o NADP+ o aceptor de eltrons e absolutamente dependente da energia luminosa. Apesar das diferenas, estes dois processos conversores de energia, altamente eficientes, apresentam mecanismos fundamentalmente semelhantes. Nosso entendimento atual da sntese do ATP na mitocndria e cloroplastos est baseado na hiptese, introduzida por Peter Mitchell em 1961, de que as diferenas na concentrao transmembrana de prtons so os reservatrios para a energia extrada das reaes de oxidao biolgicas. Esta teoria quimiosmtica tem sido aceita como um dos grandes princpios unificadores da biologia no sculo XX. Ela permite a compreenso dos processos de fosforilao oxidativa e fotofosforilao e para transdues de energia aparentemente distintas tais como o transporte ativo atravs de membranas e o movimento dos flagelos das bactrias. A fosforilao oxidativa e a fotofosforilao so mecanisticamente similares em trs aspectos: (1) Ambos os processos envolvem o fluxo de eltrons atravs de uma cadeia de transportadores ligados membrana. (2) A energia livre disponvel atravs deste fluxo de eltrons montanha abaixo (exergnico), est acoplada ao transporte de prtons montanha acima, atravs de uma membrana impermevel ao prton, conservando a energia livre da oxidao dos combustveis como um potencial eletroqumico transmembrana (pg. xxx). (3) O fluxo transmembrana de prtons no sentido do seu gradiente de concentrao atravs de canais proticos especficos, fornece a energia livre para a sntese do ATP, que catalisada por um complexo proteico ligado membrana (ATP sintase) e que acopla o fluxo de prtons fosforilao do ATP.

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Este captulo comea com a fosforilao oxidativa. Inicialmente sero descritos os componentes da cadeia de transporte de eltrons, a sua organizao em grandes complexos funcionais na membrana interna da mitocndria, a seqncia do fluxo de eltrons atravs deles e os movimentos de prtons que acompanham este fluxo. O prximo tpico o notvel complexo enzimtico que, atravs da catlise rotacional captura a energia do fluxo de prtons na forma de ATP. Ento, sero considerados os mecanismos regulatrios que coordenam a fosforilao oxidativa atravs das vrias vias catablicas que oxidam combustveis. Com este entendimento da fosforilao oxidativa mitocondrial, ser abordada ento a fotofosforilao, comeando com a absoro da luz por pigmentos fotossintticos, seguido pelo fluxo de eltrons, direcionado pela luz, da H2O para o NADP+ e a base molecular para o acoplamento do fluxo de eltrons e prtons. Finalmente, sero abordadas as similaridades de estrutura e mecanismo entre as ATP sintases dos cloroplastos e mitocndrias bem como as bases evolutivas para essa conservao do mecanismo.

Albert L. Lehninger 1917 1986

Fosforilao Oxidativa Reao de Transferncia de Eltrons na Mitocndria A descoberta em 1948, por Eugene Kennedy e Albert Lehninger, de que as mitocndrias so os stios da fosforilao oxidativa nos eucariotos, marcou o incio da fase moderna dos estudos das transdues de energia biolgica. As mitocndrias, tais como as bactrias gramnegativas, possuem duas membranas (Fig. 19-1). A membrana mitocondrial externa facilmente permevel a pequenas molculas (Mr , 5000) e ons que se movem livremente atravs de canais transmembrana formados por uma famlia de proteinas integrais de membrana chamadas porinas. A membrana interna impermevel maioria das molculas pequenas e ons, incluindo prtons (H+). As nicas espcies que atravessam a membrana interna so aquelas para as quais existem transportadores especficos. A membrana interna contm os componentes da cadeia respiratria e a ATP sintase. A matriz mitocondrial cercada pela membrana interna, contm o complexo da piruvato desidrogenase e as enzimas do ciclo do cido ctrico, a via da -oxidao dos cidos graxos e as vias de oxidao dos aminocidos. Em resumo, ela contm todas as vias da oxidao dos combustveis, exceto a gliclise que ocorre no citosol. A membrana interna, seletivamente permevel, segrega os intermedirios e as enzimas das vias metablicas

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citoslicas atravs de processos metablicos que ocorrem na matriz. Entretanto, transportadores especficos carregam piruvato, cidos graxos e aminocidos ou seus derivados -ceto para o interior da matriz garantindo o acesso maquinaria do ciclo do cido ctrico. Semelhantemente, o ADP e o Pi so transportados especificamente para o interior da matriz medida que o ATP recm-sintetizado transportado para fora.

figura 19-1 Anatomia bioqumica de uma mitocndria. As circunvolues (cristas) da membrana interna proporcionam uma superfcie muito grande. A membrana interna de uma nica mitocndria do fgado pode ter mais de 10.000 conjuntos de sistemas de transferncia de eltrons (cadeias respiratrias) e molculas de ATP sintase, distribudas sobre toda a superfcie da membrana. Mitocndrias do corao, que apresentam cristas muito abundantes e portanto uma rea de membrana interna muito maior, contm cerca de trs vezes mais conjuntos de sistemas de transferncia de eltrons que as mitocndrias do fgado. O reservatrio mitocondrial das coenzimas e intermedirios est funcionalmente separado do reservatrio citoplasmtico. As mitocndrias dos invertebrados, plantas e microrganismos eucariotos so semelhantes s mostradas aqui, embora haja muita variao no tamanho, na forma e no grau de enrolamento da membrana interna. Veja o Captulo 2 para outros detalhes da estrutura mitocondrial.

Os eltrons so canalizados para transportadores universais de eltrons A fosforilao oxidativa comea com a entrada de eltrons na cadeia respiratria. Muitos desses eltrons so provenientes da ao de desidrogenases que coletam eltrons das vias catablicas e os canalizam para aceptores universais de eltrons nucleotdeos de nicotinamida (NAD+ ou NADP+) ou nucleotdeos de flavina ((FMN ou FAD). Desidrogenases associadas a nucleotdeo de nicotinamida catalisam reaes reversveis dos seguintes tipos gerais: Substrato reduzido + NAD+ substrato oxidado + NADH + H+ Substrato reduzido + NADP+ substrato oxidado + NADPH + H+ A maioria das desidrogenases que atuam no catabolismo so especficas para o NAD+ como receptor de eltrons (Tabela 19-1). Algumas esto no citosol, outras nas mitocndrias e outras ainda apresentam isoenzimas citoslica e mitocondrial.

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As desidrogenases ligadas ao NAD removem dois tomos de hidrognio dos seus substratos. Um deles transferido como um on hidreto (:H-) ao NAD+ e o outro liberado como H+ no meio (veja Fig. 14-15). O NAD+ tambm pode coletar equivalentes redutores de substratos trabalhados pelas desidrogenases ligadas ao NADP. Isto possvel devido piridina nucleotdeo transidrogenase, que catalisa a reao: NADPH + NAD+ NADP+ + NADH O NADH e o NADPH so transportadores de eltrons hidrossolveis que se associam reversivelmente com as desidrogenases. O NADH carrega os eltrons derivados das reaes catablicas at o seu ponto de entrada na cadeia respiratria, o complexo da NADH desidrogenase, descrito a seguir. O NADPH geralmente fornece eltrons para as reaes anablicas. Nem o NADH nem o NADPH podem atravessar a membrana interna da mitocndria, mas os eltrons que elas carregam podem ser lanados atravs dela, como ser visto adiante.

tabela 19-1 Algumas reaes importantes catalisadas por desidrogenases ligadas ao NAD(P)H Reao* Ligadas ao NAD -Cetoglutarato + CoA + NAD+ succinil-CoA + CO2 + NADH + H+ L-Malato + NAD+ oxaloacetato + NADH + H+ Piruvato + CoA + NAD+ acetil-CoA + CO2 + NADH + H+ Gliceraldeido-3-fosfato + Pi + NAD+ 1,3-difosfoglicerato + NADH + H+ Lactato + NAD+ piruvato + NADH + H+ -hydroxiacil-CoA + NAD+ -cetoacil-CoA + CO2 + NADH + H+ Ligadas ao NADP Glicose-6-fosfato + NADP+ 6-fosfogluconato + NADPH + H+ Ligadas ao NAD ou NADP L-glutamato + H2O + NAD(P)+ -cetoglutarato + NH4+ + NAD(P)H Isocitrato + NAD(P)+ -cetoglutarato + CO2 + NAD(P)H + H+ * Estas reaes e suas enzimas foram discutidas nos Captulos 15 a 18. mitocndria; C, citosol. M MeC M designa C M MeC M C C M Localizao

As flavoprotenas apresentam um nucleotdeo flavina, o FMN ou o FAD, fortemente ligado, s vezes at covalentemente (veja Fig. 14-16). O nucleotdeo de flavina oxidado pode

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aceitar um eltron (dando origem a uma forma semiquinona) ou dois (originando FADH2 ou FMNH2). A transferncia de eltrons ocorre porque a flavoprotena tem um potencial de reduo maior que o do composto oxidado. O potencial de reduo padro de um nucleotdeo de flavina, diferente daquele do NAD ou NADP, depende da protena qual ele est associado. Interaes locais com grupos funcionais na protena distorcem os orbitais dos eltrons no anel da flavina, alterando as estabilidades relativas das formas oxidadas e reduzidas. Assim, o potencial de reduo padro relevante o da flavoprotena especfica e no o do FAD ou FMN isolado. O nucleotdeo de flavina deveria ser considerado parte do stio ativo das flavoprotenas e no um reagente ou produto na reao de transferncia de eltrons. Como as flavoprotenas podem participar tanto na transferncia de um como de dois eltrons, elas podem funcionar como intermedirios entre reaes onde dois eltrons so doados (como nas desidrogenaes) e aquelas onde um eltron aceito (como na reduo de uma quinona a hidroquinona, descrita a seguir).

Os eltrons passam atravs de uma srie de transportadores ligados membrana A cadeia respiratria mitocondrial consiste de uma srie de transportadores de eltrons que atuam seqencialmente, a maioria dos quais so protenas integrais de membrana que apresentam grupos prostticos capazes de aceitar ou doar um ou dois eltrons. Na fosforilao oxidativa ocorrem trs tipos de transferncia de eltrons: (1) transferncia direta de eltrons, tal como na reduo do Fe3+ a Fe2+; (2) transferncia como um tomo de hidrognio (H+ + e-) e (3) transferncia como um on hidreto (:H-), que possui dois eltrons. O termo equivalente redutor usado para designar um nico equivalente de eltron transferido na reao de oxidao-reduo. Alm do NAD e das flavoprotenas, trs outros tipos de molculas transportadores de eltrons funcionam na cadeia respiratria: uma quinona hidrofbica (ubiquinona) e dois tipos diferentes de protenas que contm ferro (citocromos e ferro-enxofre protenas).

figura 19-2 Ubiquinona (Q ou coenzima Q). A reduo completa da ubiquinona requer dois eltrons e dois prtons e ocorre em duas etapas atravs de um intermedirio radicalar semiquinona. A ubiquinona (tambm chamada de coenzima Q, ou simplesmente Q) uma benzoquinona lipossolvel que apresenta uma longa cadeia lateral isoprenide (Fig. 19-2). A

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plastoquinona (encontrada nos cloroplastos das plantas) e a menaquinona (encontrada nas bactrias) so compostos muito parecidos e desempenham papis anlogos ao da ubiquinona, transportando eltrons atravs de cadeias de transferncia de eltrons associadas membrana. A ubiquinona pode aceitar um eltron, originando o radical semiquinona (QH), ou dois eltrons para formar ubiquinol (QH2) (Fig. 19-2). Semelhantemente aos transportadores flavoprotenas, ela de atuar na juno entre um doador de dois eltrons e um receptor de um eltron. Como a ubiquinona pequena e hidrofbica, ela se difunde livremente na camada lipdica da membrana interna mitocondrial e pode transportar equivalentes redutores entre outros transportadores de eltrons menos mveis na membrana. Como ela carrega tanto prtons quanto eltrons, ela desempenha um papel central no acoplamento do fluxo de eltrons ao movimento de prtons. Os citocromos so protenas que apresentam como caracterstica uma intensa absoro da luz, devido aos seus grupos prostticos heme, que contm ferro (Fig. 19-3). As mitocndrias contm trs classes de citocromos designados por a, b e c que podem ser distinguidos por diferenas nos seus espectros de absoro de luz. Cada tipo de citocromo no seu estado reduzido (Fe2+) possui trs bandas de absoro na regio do visvel (Fig. 19-4). A banda de maior comprimento de onda est prxima de 600 nm nos citocromos do tipo a, prxima de 560 nm no tipo b, e prxima de 550 nm no tipo c. Para se distinguir entre citocromos muito parecidos de um tipo, algumas vezes se usa o valor exato do mximo de absoro nos seus nomes, como no citocromo b562.

figura 19-3 Grupos prostticos dos citocromos. Cada um deles consiste de quatro anis de cinco tomos, contendo nitrognio numa estrutura cclica chamada de porfirina. Os quatro tomos de nitrognio esto coordenados com um on Fe central que pode estar na forma Fe2+ ou Fe3+. A ferro protoporfirina IX encontrada nos citocromos do tipo b, na hemoglobina e mioglobina (veja Fig. 6-17). O heme C est covalentemente ligado protena do citocromo c atravs de ligaes tiosteres de dois resduos de Cis. O heme A, encontrado nos citocromos do tipo a, possui uma longa cauda isoprenide ligada a um dos anis de cinco tomos. O sistema de dupla ligao conjugada (sombreada em vermelho) do anel da porfirina responsvel pela absoro da luz visvel por estes hemes. Os cofatores heme dos citocromos a e b esto fortemente, mas no-covalentemente, ligados s suas protenas associadas; os grupos heme dos citocromos do tipo c esto ligados covalentemente atravs de resduos de Cis (Fig. 19-3). Similarmente s flavoprotenas, o potencial de reduo padro do tomo de ferro no heme de um citocromo depende da sua

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interao com as cadeias laterais da protena e portanto, diferente para cada citocromo. Os citocromos do tipo a e b e alguns do tipo c so protenas integrais da membrana interna da mitocndria. Uma notvel exceo o citocromo c da mitocndria, uma protena solvel que se associa com a superfcie externa da membrana interna da mitocndria atravs de interaes eletrostticas. Ns abordamos o citocromo c nas discusses iniciais da evoluo das protenas (ver Adendo 5-2) e na estrutura de protena (ver Fig. 6-18a).

figura 19-4 Espectro de absoro do citocromo c nas suas formas oxidada (vermelho) e reduzida (azul). Tambm esto marcadas as bandas , e caractersticas da forma reduzida.

Helmut Beinert Nas ferro-enxofre protenas, inicialmente descobertas por Helmut Beinert, o ferro est presente no no heme, mas associado a tomos de enxofre inorgnico ou tomos de enxofre de resduos de Cis na protena, ou ambos. Esses centros de ferro-enxofre (Fe-S) variam desde estruturas simples com um nico tomo de Fe coordenado a quatro grupos CisSH at centros Fe-S mais complexos com dois ou quatro tomos de Fe (Fig. 19-5). As protenas ferro-enxofre Rieske (denominadas aps sua descoberta) so uma variao neste tema, onde um tomo de Fe est coordenado a dois resduos de His ao invs de dois resduos de Cis. Todas as protenas ferro-enxofre participam de transferncias de um eltron onde cada tomo de ferro do arranjo ferro-enxofre est oxidado ou reduzido. Pelo menos oito protenas ferro-enxofre funcionam na transferncia de eltrons da mitocndria. O potencial de reduo das protenas ferro-enxofre varia de 0.65 V a +0.45 V, dependendo do microambiente do ferro na protena.

figura 19-5 Centros Fe-S. Os centros Fe-S das protenas ferro-enxofre podem ser simples como em (a), com um nico Fe rodeado por tomos de S de quatro resduos de Cis. Outros centros incluem tanto tomos inorgnicos e tomos de S de Cis, como nos centros 2Fe-2S (b) ou 4Fe-4S (c). A ferredoxina da cianobactria Anabaena 7120 (d) possui um centro 2Fe-2S. (Observe que apenas os tomos S inorgnicos esto contados nestas designaes. Por exemplo, no centro 2Fe-2S (b), cada on Fe est de fato rodeado por quatro tomos de S). O potencial de reduo

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padro exato do ferro nestes centros depende do tipo de centro e da sua interao com as protenas associadas. Na reao completa catalisada pela cadeia respiratria mitocondrial, os eltrons se movem do NADH, succinato ou algum outro doador primrio de eltrons atravs das flavoprotenas, ubiquinona, protenas ferro-enxofre, citocromo e finalmente para o O2. A anlise dos mtodos usados para determinar a seqncia onde esses carregadores atuam instrutiva, uma vez que a mesma abordagem geral tem sido usada para estudar outras cadeias de transporte de eltrons, tais como as dos cloroplastos. Primeiro, o potencial de reduo padro de cada um dos carregadores de eltrons foi determinado experimentalmente (Tabela 19-2). Espera-se que os carregadores funcionem em ordem crescente do potencial de reduo, uma vez que os eltrons fluem espontaneamente dos carregadores de menor Eo para carregadores com Eo maiores. A ordem dos carregadores deduzida por este mtodo NADH Q citocromo b citocromo c1 citocromo c citocromo a citocromo a3 O2. Note contudo que a ordem dos potenciais de reduo padro no necessariamente a mesma que a dos potenciais de reduo verdadeiros em condies celulares, que dependem da concentrao das formas reduzida e oxidada. Um segundo mtodo para determinar a sequncia dos carregadores de eltrons envolve a reduo experimental da cadeia completa de carregadores quando se fornece uma fonte de eltrons, mas nenhum aceptor de eltrons (sem O2). Quando o O2 introduzido abruptamente no sistema, a velocidade com que cada transportador de eltrons se oxida (medida espectroscopicamente) mostra a ordem na qual os transportadores funcionam. O transportador mais prximo do O2 (na extremidade da cadeia) libera seu eltron primeiro, o segundo transportador a partir da extremidade o prximo a ser oxidado e assim por diante. Tais experimentos confirmaram a seqncia deduzida a partir dos potenciais de reduo padro.

tabela 19-2 Potenciais de reduo padro da cadeia respiratria e dos transportadores de eltrons relacionados Reao redox (meia-reao) 2H+ + 2e- H2 NAD+ + H+ + 2e- NADH Eo (V) -0,414 -0,320

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NADP + H + 2e- NADPH+ +

-0,324 -0,300 0,045 0,077 0,220 0,254 0,290 0,550 0,816

NADH desidrogenase (FMNH2) + 2 H+ + 2e- NADH desidrogenase (FMNH2) Ubiquinona + 2H+ + 2e- ubiquinol Citocromo b (Fe3+) + e- citocromo b (Fe2+) Citocromo c1 (Fe3+) + e- citocromo c1 (Fe2+) Citocromo c (Fe3+) + e- citocromo c (Fe2+) Citocromo a (Fe3+) + e- citocromo a (Fe2+) Citocromo a3 (Fe3+) + e- citocromo a3 (Fe2+) O2 + 2H+ + 2e- H2O

Para uma confirmao final, agentes que inibem o fluxo de eltrons atravs da cadeia tm sido usados combinados com medidas do grau de oxidao de cada transportador. Na presena de O2 e um doador de eltrons os transportadores que atuam antes da etapa inibida ficam totalmente reduzidos e, aqueles que atuam depois do bloqueio, ficam completamente oxidados (Fig. 19-6). Usando-se vrios inibidores que bloqueiam a cadeia em diferentes locais, a seqncia completa foi deduzida e, ela a mesma prevista pelas duas abordagens anteriores.

figura 19-6 Mtodo para determinar a sequncia dos transportadores de eltrons. Este mtodo mede os efeitos de inibidores da transferncia de eltrons sobre o estado de oxidao de cada transportador. Na presena de um doador de eltrons e de O2, cada inibidor produz um padro caracterstico de transportadores oxidados/reduzidos: aqueles que esto antes do bloqueio ficam reduzidos (azul) e aqueles que esto depois do bloqueio ficam oxidados (vermelho).

Os transportadores de eltrons funcionam em complexos multienzimticos Os transportadores de eltrons da cadeia respiratria esto organizados em complexos supramoleculares embebidos na membrana que podem ser fisicamente separados. O tratamento brando da membrana mitocondrial interna com detergentes permite a resoluo de quatro nicos complexos transportadores de eltrons, cada um capaz de catalisar a transferncia de eltrons atravs de uma parte da cadeia (Fig. 19-7; Tabela 19-3). Os

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complexos I e II catalisam a transferncia de eltrons para a ubiquinona a partir de dois doadores de eltrons diferentes: o NADH (complexo I) e o succinato (complexo II). O complexo III transporta eltrons da ubiquinona at o citocromo c e, o complexo IV completa a seqncia transferindo eltrons do citocromo c para o O2. Vamos agora analisar com mais detalhes a estrutura e a funo de cada complexo da cadeia respiratria mitocondrial.

figura 19-7 Separao dos complexos funcionais da cadeia respiratria. A membrana mitocondrial externa inicialmente removida atravs de tratamento com o detergente digitonina. Fragmentos da membrana interna so ento obtidos por ruptura osmtica da mitocndria e, os fragmentos so cuidadosamente dissolvidos em um segundo detergente. A mistura resultante das protenas da membrana interna resolvida, atravs de cromatografia de troca inica, nos diferentes complexos (I at IV) da cadeia respiratria, cada um com sua composio protica nica (ver Tabela 19-3) e, a enzima ATP sintase (algumas vezes chamada de complexo V). Os complexos (I a IV) isolados catalisam as transferncias entre doadores (NADH e succinato), transportadores intermedirios (Q e citocromo c) e O2, conforme mostrado. In vitro, a ATP sintase apresenta apenas a atividade de hidrlise do ATP (ATPase) mas no a de sntese do ATP.

tabela 19-3 Componentes proticos da cadeia de transferncia de eltrons da mitocndria

Complexo enzimtico

Massa (kDa)

Nmero de subunidades* 42 (14) 5 1 1 13 (3-4)

Grupo prosttico FMN, Fe-S FAD, Fe-S Heme, Fe-S Heme Hemes, CuA, CuB

I NADH desidrogenase II Succinato desidrogenase III Ubiquinona: citocromo oxidorredutase Citocromo c IV Citocromo oxidase

850 140 c 250 13 160

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*Nmero de subunidades em bactria entre parnteses.

Citocromo c no parte de um complexo enzimtico, mas se move livremente entre os

complexos III e IV como uma protena solvel.

Complexo I: NADH at ubiquinona A Figura 19-8 ilustra a relao entre os complexos I, II e a ubiquinona. O complexo I, tambm chamado de NADH: ubiquinona oxidorredutase, uma grande molcula de enzima composta por 42 cadeias polipeptdicas diferentes, incluindo uma flavoproteina ligada a FMN e pelo menos seis centros Fe-S (Tabela 19-3). A microscopia eletrnica de alta resoluo mostra que o complexo I tem a forma de L, com um brao do L na membrana e o outro prolongando-se em direo da matriz. Conforme mostrado na Figura 19-9, o complexo I catalisa simultnea e obrigatoriamente dois processos acoplados: (1) a transferncia exergnica de um on hidreto do NADH para a ubiquinona e um prton da matriz: NADH + H+ + Q NAD+ + QH2 (19-1)

e (2) a transferncia endergnica de quatro prtons da matriz para o espao intermembranoso. Entretanto, o complexo I uma bomba de prton movida pela energia da transferncia de eltrons e, a reao que ela catalisa vetorial: ela movimenta os prtons em uma direo especfica de um local (a matriz, que se torna negativamente carregada com a sada de prtons) para outro (o espao intermembranoso, que se torna positivamente carregado). Para enfatizar natureza vetorial do processo, a reao global geralmente escrita com subscritos que indicam a localizao dos prtons: P para o lado positivo da membrana interna (o espao intermembranoso), N para o lado negativo (a matriz). NADH + 5H+N + Q NAD+ + QH2 + 4 H+P (19-2)

O amital (uma droga barbitrica), a rotenona (um produto vegetal comumente usado como inseticida) e a piericidina (um antibitico) inibem o fluxo de eltrons dos centros Fe-S do complexo I para a ubiquinona (Tabela 19-4) e por isso bloqueia todo o processo de fosforilao oxidativa. O ubiquinol (QH2, a forma completamente reduzida, Figura 19-2) difunde-se na membrana interna, do complexo I at o complexo III, onde oxidado a Q em um processo que envolve o movimento de prtons para o lado externo (da matriz para o citosol).

Complexo II: succinato at ubiquinona No Captulo 15 encontramos o complexo II com o nome de succinato desidrogenase; a nica enzima do ciclo de Krebs que ligada

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membrana. Embora menor e mais simples que o complexo I, ele contm dois tipos de grupos prostticos e pelo menos quatro protenas diferentes (Tabela 19-3). Uma protena possui um FAD ligado covalentemente e um centro Fe-S com quatro tomos de Fe; uma segunda protena ferro-enxofre tambm est presente (ver frontispcio). Os eltrons passam do succinato para o FAD e ento, atravs dos centros Fe-S, para a ubiquinona (Fig. 19-8).

figura 19-8 Via dos eltrons do NADH, succinato, acil-CoA graxo e glicerol-3-fosfato at a ubiquinona. Eltrons do NADH passam por uma flavoprotena e uma srie de protenas ferro-enxofre (no complexo I) e depois vo para Q. Os eltrons do succinato passam por uma flavoprotena e vrios centros Fe-S (no complexo II) em seu caminho para Q. O glicerol-3fosfato doa eltrons para uma flavoprotena (glicerol-3-fosfato desidrogenase) na superfcie externa da membrana mitocondrial interna, da qual eles passam para Q. A acil-CoA desidrogenase (a primeira enzima na -oxidao) transfere os eltrons para a flavoprotena transferidora de eltrons (ETF). A partir da, os eltrons passam para Q via ETF-ubiquinona oxidorredutase.

figura 19-9 NADH:ubiquinona oxidorredutase (complexo I). O complexo I catalisa a transferncia de um on hidreto do NADH para o FMN, do qual dois eltrons passam atravs de uma srie de centros Fe-S para a protena ferro-enxofre N-2 no brao da matriz do complexo. A transferncia de eltrons da N-2 para a ubiquinona no brao da membrana forma QH 2, que difunde para a bicamada lipdica. Ela tambm dirige a expulso de quatro prtons por par de eltrons, da matriz. O mecanismo detalhado que acopla a transferncia de eltrons e prtons no complexo I ainda no conhecida mas, provavelmente envolve um ciclo Q similar quele no complexo III onde QH2 participa duas vezes por par de eltron (ver Fig. 19-11). Este fluxo de prtons produz um potencial eletroqumico atravs da membrana mitocondrial interna (lado N negativo, lado P positivo), que conserva alguma energia liberada pelas reaes de transferncia de prtons. Este potencial eletroqumico dirige a sntese de ATP.

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Outros substratos para as desidrogenases mitocondriais tambm passam eltrons para a cadeia respiratria ao nvel da ubiquinona, mas no atravs do complexo II. A primeira etapa na -oxidao dos acil-CoA graxo, catalisada pela flavoprotena acil-CoA desidrogenase, envolve a transferncia de eltrons do substrato para o FAD da desidrogenase, depois para uma flavoprotena transferidora de eltrons (FTE) que, por sua vez passa seus eltrons para a FTE-ubiquinona oxidorredutase (Fig. 19-8). Esta enzima, passa os eltrons para a cadeia respiratria reduzindo a ubiquinona. O glicerol-3-fosfato, formado atravs da liberao do glicerol devido degradao dos triacilglicerois ou atravs da reduo da diidroxiacetona formada na via glicoltica, oxidado pela glicerol-3-fosfato desidrogenase (veja Fig. 17-4). Esta enzima uma flavoprotena localizada na superfcie externa da membrana mitocondrial interna e, tal como a succinato desidrogenase e a acilCoA desidrogenase, ela canaliza eltrons para a cadeia respiratria reduzindo a ubiquinona (Fig. 19-8). O importante papel da glicerol-3-fosfato desidrogenase em transportar equivalentes redutores do NADH citoslico para a matriz mitocondrial ser descrito posteriormente (ver Fig. 19-27). O efeito de cada uma destas enzimas transferidoras de eltrons contribuir para o reservatrio de ubiquinona reduzida. A QH2 de todas estas reaes reoxidada pelo complexo III, o componente seguinte da cadeia de transferncia de eltrons da mitocndria.

tabela 19-4 Alguns agentes que interferem com a fosforilao oxidativa e a fotofosforilao Tipo de interferncia Inibio eltrons da transferncia Composto de Cianeto Monxido de carbono Antimicina A Bloqueia a transferncia de Alvo/modo de ao Inibe a citocromo oxidase

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eltrons do citocromo b para o citocromo c Mixotiazol Rotenona Amital Piericidina A DCMU Inibio da ATP sintase Aurovertina Oligomicina Venturicidina DCCD Desacoplamento da fosforilao da FCCP transferncia de eltrons DNP Valinomicina Termogenina Bloqueia o fluxo de prtons atravs de Fo e CFo Carregadores hidrofbicos de prtons Ionforo para K+ Forma poros condutores de prtons na membrana interna nas mitocndrias de tecido gorduroso marron Inibio da troca ATP-ADP Atractilosdeo Inibe a adenina nucleotdeo translocase Compete com QB pelo stio de ligao em FSIII Inibe F1 Inibe Fo e CFo Impede a transferncia de eltrons do centro Fe-S para a ubiquinona

Complexo III: ubiquinona at citocromo c O complexo III, o prximo complexo respiratrio e tambm chamado de complexo dos citocromos bc1 ou ubiquinona-citocromo c oxidorredutase, acopla a transferncia de eltrons do ubiquinol (QH2) para o citocromo c com o transporte vetorial de prtons da matriz para o espao intermembranoso. A determinao das estruturas desse enorme complexo (Fig. 19-10) e do complexo IV (abaixo) atravs de cristalografia de raios X em 1995-1998 foram marcos no estudo da transferncia de eltrons mitocondriais, propiciando a armao estrutural para integrar as inmeras observaes bioqumicas sobre a funo dos complexos.

figura 19-10

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Complexo do citocromo bc1 (complexo III). O complexo um dmero de monmeros idnticos, cada um deles com 11 subunidades diferentes. (a) Estrutura do monmero. O centro funcional formado por trs subunidades: o citocromo b (verde) com seus dois hemes (bH e bL; vermelho claro), a protena ferro-enxofre Rieske (prpura) com seu centro 2Fe-2S (amarelo) e o citocromo c1 (azul) com seu heme (vermelho). (b) A unidade funcional dimrica. O citocromo c1 e a proteina ferro-enxofre Rieske se projetam a partir da superfcie P e podem interagir com o citocromo c (mostrado aqui, mas no como parte do complexo funcional) no espao intermembranoso. O complexo apresenta dois stios de ligao distintos para a ubiquinona, QN e QP, que correspondem aos stios de inibio por duas drogas que bloqueiam a fosforilao oxidativa. A antimicina A, que bloqueia o fluxo de eltrons do heme bH para Q, se liga a QN, prximo ao heme bH no lado N (matriz) da membrana. O mixotiazol, que impede o fluxo de eltrons de QH2 para a protena ferro-enxofre Rieske, se liga a QP, prximo ao centro 2Fe-2S e ao heme bL no lado P da membrana. A estrutura dimrica essencial para o funcionamento do complexo III. A interface entre os monmeros forma duas cavidades, cada uma contendo um stio QP de um monmero e um stio QN do outro. O movimento dos intermedirios da ubiquinona ocorre dentro dessas cavidades protegidas. O complexo III se cristaliza em duas conformaes distintas (no mostradas). Em uma delas, o centro ferro-enxofre Rieske est prximo do seu aceptor de eltrons, o heme do citocromo c1, mas relativamente distante do citocromo b e do stio de ligao QH2, atravs do qual ele recebe os eltrons. Na outra configurao, o centro Fe-S se afastou do citocromo c1 em direo ao citocromo b. Acredita-se que a protena Rieske oscila entre estas duas conformaes onde ela primeiramente reduzida e depois oxidada. Baseado na estrutura do complexo III e nos estudos bioqumicos detalhados da reaes redox, foi proposto um modelo razovel para a passagem dos eltrons e prtons atravs deste complexo. A equao global para as reaes redox deste ciclo Q (Fig. 19-11) : QH2 + 2 cit c1(oxidado) + 2H+N Q + 2 cit c1(reduzido) + 4H+P (19-3)

O ciclo Q acomoda o comutador entre o carregador de eltrons (ubiquinona) e os carregadores de um eltron (citocromos b562, b566 e c1) e explica a estequiometria de quatro prtons translocados por par de eltrons que passa atravs do complexo, para o citocromo c. Embora o caminho dos eltrons atravs deste segmento da cadeia respiratria complicado, o efeito global da transferncia simples: QH2 oxidado a Q e duas molculas de citocromo c so reduzidas.

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O citocromo c (Fig. 6-18) uma protena solvel do espao intermembranoso. Aps o seu nico heme aceitar um eltron do complexo III , o citocromo c se move em direo do complexo IV para doar o eltron para um centro de cobre binuclear nesta enzima.

figura 19-11 O ciclo Q. O caminho dos eltrons atravs do complexo III mostrado pelas setas azuis. No lado P da membrana, duas molculas de QH2 so oxidadas at Q no stio QP, liberando quatro prtons no espao intermembranoso. Cada QH2 doa um eltron (via centro Fe-S Rieske) ao citocromo c1 e um eltron (via citocromo b) para a molcula de Q no stio QN, reduzindo-o em duas etapas a QH2. Esta reduo tambm utiliza dois prtons captados da matriz.

Complexo IV: Citocromo c at O2 No passo final da cadeia respiratria, o complexo IV, tambm chamado citocromo oxidase, transporta dois eltrons do citocromo c para o oxignio molecular, reduzindo-o a H2O. O complexo IV uma protena grande (13 subunidades; Mr 204.000) da membrana mitocondrial interna. As bactrias apresentam uma forma mais simples, com somente trs ou quatro subunidades, mas ainda capaz de catalisar tanto a transferncia de eltrons como o bombeamento de prtons. A comparao dos complexos da mitocndria e da bactria sugere que trs subunidades so crticas para a funo (Fig. 19-12). A subunidade II mitocondrial contm dois ons cobre complexados aos grupos SH de dois resduos de Cis em um centro binuclear (CuA) (Fig. 19-12b) que lembram as protenas de centros 2Fe-2S. A subunidade I contm dois grupos heme designados a e a3 e um outro ons cobre (CuB). O heme a3 e o CuB formam um segundo centro binuclear que aceita eltrons do heme a e ento os transfere para o O2 ligado ao heme a3. A transferncia de eltrons atravs do complexo IV ocorre do citocromo c para o centro CuA, do heme a para o heme a3-centro CuB e, finalmente para o O2 (Fig. 19-13). Para cada quatro eltrons que passam atravs deste complexo, a enzima consome quatro substratos H+ da matriz (lado N) convertendo o O2 em 2 H2O. Ela tambm usa a energia desta reao redox para bombear um prton para o espao intermembranoso (lado P) para cada eltron transportado, aumentando o potencial eletroqumico produzido pelo transporte de prtons, induzido pelas reaes redox, atravs dos complexos I e III. A reao global catalisada pelo complexo IV : 4 cit c(reduzido) + 8H+N + O2 4 cit c(oxidado) + 4H+P + 2H2O (19-4)

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Esta reduo de quatro eltrons do O2 envolve centros redox que transportam apenas um eltron de cada vez e, ela deve ocorrer sem gerar intermedirios incompletamente reduzidos, tais como o perxido de hidrognio ou radicais hidroxila livres, que so espcies muito reativas que podem danificar os componentes celulares. Os intermedirios permanecem fortemente ligados ao complexo at serem completamente convertidos em gua.

figura 19-12 Subunidades crticas da citocromo oxidase (complexo IV). mostrado o complexo bovino. (a) O centro do complexo IV apresenta trs subunidades. A subunidade I (amarela) tem dois grupos heme, a e a3 (vermelho) e um on cobre, CuB (esfera verde). O heme a3 e o CuB formam um centro Fe-Cu binuclear. A subunidade II (azul) contm dois ons Cu (esferas verdes) complexadas com os grupos SH de dois resduos de Cis em um centro binuclear, CuA, que se assemelha aos centros 2Fe-2S das protenas ferro-enxofre. Este centro binuclear e o stio de ligao do citocromo c esto localizados em um domnio da subunidade II que se projeta do lado P da membrana interna para o espao intermembranoso. A subunidade III (verde claro) aparentemente essencial para o funcionamento do complexo IV, mas o seu papel no bem conhecido. (b) O centro binuclear do CuA. Os ons Cu (esferas verdes) compartilham igualmente os eltrons. Quando o centro reduzido, eles apresentam cargas formais Cu1+Cu1+ e quando oxidados, Cu1,5+Cu1,5+. Os ligante ao redor dos ons Cu incluem duas His (azul escuro), duas Cis (amarelo), um Asp (vermelho) e uma Met (alaranjado).

figura 19-13 O caminho dos eltrons atravs do complexo IV. As trs protenas crticas para o fluxo dos eltrons so I, II e III. O contorno mais claro inclui as outras dez protenas do complexo. A transferncia de eltrons atravs do complexo IV comea quando cada uma das duas molculas de citocromo c reduzido doam um eltron para o centro binuclear CuA. Os eltrons ento passam, atravs do heme a, para o centro Fe-Cu (citocromo a3 e CuB). O oxignio ento se liga ao heme a3 e reduzido at seu derivado perxido (O22-) por dois eltrons do centro Fe-Cu. A liberao de mais dois eltrons do citocromo c converte o O22- em duas molculas de gua, consumindo quatro substratos prtons da matriz. Simultaneamente, quatro outros prtons so bombeados da matriz atravs de um mecanismo ainda desconhecido.

figura 19-14

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Resumo do fluxo de eltrons e prtons atravs dos quatro complexos da cadeia respiratria. Os eltrons alcanam Q atravs dos complexos I e II. QH2 funciona como um transportador mvel de eltrons e prtons. Ela transfere eltrons para o complexo III, que os transfere para uma outra conexo mvel, o citocromo c. O complexo IV transfere ento os eltrons do citocromo c reduzido para o O2. O fluxo de eltrons atravs dos complexos I, III e IV acompanhado por um fluxo de prtons da matriz para o espao intermembranoso. Lembrar que os eltrons da -oxidao dos cidos graxos tambm podem entrar na cadeia respiratria atravs de Q (ver Fig. 19-8).

A energia da transferncia dos eltrons conservada eficientemente em um gradiente de prtons A transferncia de dois eltrons do NADH, atravs da cadeia respiratria, para o oxignio molecular pode ser escrita como: NADH + H+ + O2 NAD+ + H2O (19-5)

Esta reao global altamente exergnica. Para o par redox NAD+/NADH, Eo 0,320V e, para o par O2/H2O, Eo 0,816V. Portanto, o Eo para esta reao +1,14V e, a variao de energia livre padro (Eq.14-5) : Go = nFEo = (2)(96,5kJ/V.mol)(1,14V) = 220 kJ/mol (de NADH) Essa mudana de energia livre padro baseada na considerao de que as concentraes de NADH e NAD+ so iguais (1 M). Na mitocndria que respira ativamente, a ao de vrias desidrogenases mantm a relao NADH/NAD+ acima da unidade e, a verdadeira mudana de energia livre para a reao mostrada na Eq. 19-5 de fato, substancialmente maior (mais negativa) que 220 kJ/mol. Um clculo semelhante para a oxidao do succinato mostra que a transferncia de eltrons do succinato (Eo do fumarato/succinato = 0,031V) para o O2 tem uma variao de energia livre padro menor, mas ainda negativa, da ordem de 150 kJ/mol. A maior parte dessa energia usada para bombear os prtons para fora da matriz. Para cada par de eltrons transferidos para o O2, quatro prtons so bombeados para fora pelo complexo I, quatro pelo complexo III e dois pelo complexo IV (Fig. 19-14). Portanto, a equao vetorial para o processo : NADH + 11 H+N + O2 NAD+ + 10 H+P + H2O (19-7) (19-6)

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A energia eletroqumica inerente a essa diferena na concentrao de prtons e separao de cargas representa uma conservao temporria da maior parte da energia da transferncia dos eltrons. A energia armazenada nesse gradiente, denominada fora prton motriz, apresenta dois componentes: (1) a energia potencial qumica devido a diferena na concentrao de uma espcie qumica (H+) em duas regies separadas pela membrana e, (2) a energia potencial eltrica que resulta da separao de carga quando um prton se move atravs da membrana sem um contra on (Fig. 19-15).

figure 19-15 Fora prton motriz. A membrana interna da mitocndria separa dois compartimentos de diferente [H+], resultando em diferenas na concentrao qumica (pH) e distribuio de carga () atravs da membrana. O efeito global a fora prton motriz (G) que pode ser calculada como mostrado. Isto explicado com mais detalhes no texto.

Conforme mostrado no Captulo 12, a mudana de energia livre para a criao de um gradiente eletroqumico por uma bomba de ons : G= -RT ln (C2/C1) + ZF (19-8)

onde C2/C1 a razo entre as concentraes para o on que se desloca; Z o valor absoluto da sua carga (1 para o prton) e a diferena de potencial eltrico transmembrana, dada em volts. Para prtons a 25oC, ln (C2/C1)= 2,3(log [H+]P - log [H+]N)= 2,3(pHN - pHP)= 2,3 pH e a Eq, 19-8 se reduz a: G= - 2,3 RT pH + F (19-9)

=(5,70 kJ/mol) pH + (96,5 kJ/mol) Em uma mitocndria que respira ativamente, o medido 0,15-0,2 V e o pH da matriz cerca de 0,75 unidades mais alcalino que o do espao intermembranoso, de tal modo que a mudana de energia livre calculada para bombear prtons para fora da ordem de + 20 kJ/mol (de H+), a maior parte da qual proveniente da poro eltrica do potencial eletroqumico. Uma vez que a transferncia de dois eltrons do NADH para o O2 acompanhada pelo bombeamento para fora de 10 H+ (Eq. 19-7) aproximadamente 200 kJ

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dos 220 kJ liberados pela oxidao de um mol de NADH, so conservados no gradiente de prtons. Quando os prtons se deslocam espontaneamente a favor do seu gradiente eletroqumico, a energia disponibilizada para produzir trabalho. Nas mitocndrias, cloroplastos e bactrias aerbicas, a energia eletroqumica no gradiente de prtons direciona a sntese de ATP a partir de ADP e Pi. Ns voltaremos energtica e estequiometria da sntese de ATP direcionada pelo potencial eletroqumico no gradiente de prtons, posteriormente neste captulo.

As mitocndrias das plantas tm mecanismos alternativos para oxidar o NADH A mitocndrias das plantas fornecem ATP durante os perodos de baixa iluminao ou escurido atravs de mecanismos inteiramente anlogos aqueles usados pelos organismos no fotossintticos. Na luz, a principal fonte de NADH mitocondrial a reao onde a glicina produzida pela fotorespirao convertida em serina (Fig. 20-39): 2 Glicina + NAD+ serina + NADH + H+ + CO2 + NH+4 Por razes discutidas no Captulo 20, as plantas devem efetuar esta reao mesmo quando no tm necessidade de usar NADH para produzir ATP. Para regenerar o NAD+ a partir de NADH desnecessrio, a mitocndria das plantas transfere eltrons do NADH diretamente para a ubiquinona e da ubiquinona diretamente para o O2, desviando-os dos complexos III e IV e suas bombas de prtons. A energia em NADH dissipada na forma de calor, que algumas vezes pode ser de valor para a planta (Adendo 19-1). Contrariamente citocromo oxidase (complexo IV), a QH2 oxidase alternativa no inibida por cianeto. A oxidao do NADH resistente ao cianeto, de fato uma marca caracterstica dessa via de transporte de eltrons em plantas.

Adendo 19-1 Vias Respiratrias Alternativas e Calor, Plantas mal cheirosas Muitas plantas floridas atraem insetos polinizadores liberando molculas odorferas que mimetizam uma fonte de alimento natural de insetos ou locais potenciais de postura de ovos. As plantas polinizadas por moscas ou escaravelhos que normalmente ali se alimentam ou pem seus ovos em esterco ou carne podre, algumas vezes usam compostos com mau cheiro para atrair esses insetos. Uma famlia de plantas malcheirosas a Araceae, que inclui os filodendros, os copos-de-lrio e de uma espcie de couve mau cheirosa. Essas plantas apresentam folhas

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delgadas densamente empacotadas em uma estrutura ereta chamada espdice, rodeada por uma folha modificada chamada espata. A espdice libera odores de carne putrefata ou esterco. Antes da polinizao a espdice tambm se aquece, em muitas espcies de 20 at 40C acima da temperatura ambiente. A produo de calor (termognese) ajuda a evaporao das molculas odorferas para uma melhor disperso. Como a carne putrefata e o esterco so geralmente quentes devido ao metabolismo hiperativo dos micrbios carniceiros, o prprio calor tambm pode atrair insetos. No caso da couve mau cheirosa (Fig.1), que floresce no final do inverno ou no comeo da primavera quando a neve ainda cobre o solo, a termognese permite que a espdice cresa atravs da neve. Como esta espcie de couve aquece sua espdice ? Embora as mitocndrias das plantas, fungos e eucariotos unicelulares apresentam sistemas de transporte de eltrons que so essencialmente os mesmos que os dos animais, elas apresentam uma via respiratria alternativa. Nesta via, a QH2 que resistente ao cianeto, transfere os eltrons do reservatrio de ubiquinona diretamente para o oxignio, desviando-os das duas vias de translocao de prtons dos complexos III e IV (Fig. 2). A energia que poderia ser conservada como ATP liberada como calor. A mitocndria das plantas tambm apresenta uma NADH desidrogenase alternativa que insensvel rotenona, um inibidor do complexo I (ver Tabela 19-4), que transfere eltrons do NADH na matriz diretamente para a ubiquinona, desviandoos do complexo I e seu associado bombeamento de prtons. As mitocndria das plantas apresentam ainda uma outra NADH desidrogenase, na face externa da membrana interna, que fica defronte ao espao intermembranoso e transfere os eltrons do NADPH ou NADH para a ubiquinona, desviando-os novamente do complexo I. Assim, quando os eltrons entram na via respiratria alternativa atravs da NADH desidrogenase insensvel a rotenona, a NADH desidrogenase externa, ou succinato desidrogenase (complexo II) e passam para o O2 via oxidase alternativa resistente ao cianeto, a energia no conservada como ATP, mas liberada como calor. A couve mau cheirosa pode usar o calor para derreter a neve, produzir um fedor podre ou atrair escaravelhos ou moscas. figura 1 Espcie de couve oriental mau cheirosa figura 2 Carregadores de eltrons da membrana interna da mitocndria das plantas. Os eltrons podem fluir atravs dos complexos I, III e IV, como na mitocndria dos animais ou atravs de carregadores alternativos especficos de plantas pelas vias mostradas com setas azuis.

A Sntese de ATP

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Como o gradiente de concentrao de prtons transformado em ATP ? Vimos que a transferncia de eltrons libera e, a fora prton motriz conserva energia livre mais que suficiente (cerca de 200 kJ) por mol de pares de eltrons para formar um mol de ATP que requer 50 kJ (veja Adendo 14-2). Portanto, a fosforilao oxidativa mitocondrial no representa nenhum problema termodinmico. Vamos agora considerar o mecanismo qumico que acopla o fluxo de eltrons com a fosforilao. O modelo quimiosmtico proposto por Peter Mitchell o paradigma para este mecanismo. De acordo com o modelo (Fig. 19-6), a energia eletroqumica inerente da diferena na concentrao de prtons e da separao de cargas atravs da membrana mitocondrial interna, a fora prton motriz, dirige a sntese de ATP medida que os prtons fluem passivamente de volta para a matriz atravs de um poro de prtons associado ATP sintase. Para enfatizar esse papel crucial da fora prton motriz, a equao da sntese do ATP dada por: ADP + Pi + nH+P ATP + H2O + nH+N Peter Mitchel 1920-1992 (19-10)

A definio operacional de acoplamento mostrada na Figura 19-17. Quando mitocndrias isoladas so suspensas em uma soluo tampo contendo ADP, Pi e um substrato oxidvel como o succinato, ocorrem trs processos facilmente mensurveis: (1) o substrato oxidado (succinato produz fumarato), o O2 consumido e (3) o ATP sintetizado. O consumo de oxignio e a sntese de ATP dependem da presena de um substrato oxidvel (neste caso, o succinato) bem como de ADP e Pi.

figura 19-16 O modelo quimiosmtico. Nesta representao simples da teoria quimiosmtica aplicada mitocndria, os eltrons do NADH e outros substratos oxidveis passam atravs de uma cadeia de carregadores arranjados simetricamente na membrana interna. O fluxo de eltrons acompanhado por uma transferncia de prtons atravs da membrana produzindo um gradiente qumico (pH) e um gradiente eltrico (). A membrana interna da mitocndria impermevel aos prtons e eles podem voltar para a matriz somente atravs de canais especficos para prtons (Fo). A fora prton motriz que direciona os prtons de volta para a matriz propicia a energia para a sntese de ATP que catalisada pelo complexo F 1 associado a Fo.

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figura 19-17 Acoplamento da transferncia de eltrons e sntese de ATP na mitocndria. Em experimentos para demonstrar o acoplamento, as mitocndria so suspensas em um meio tamponado e um eletrodo de O2 usado para monitorar o consumo de O2. Em intervalos de tempo determinados, so removidas amostras que so analisadas para se verificar a presena de ATP. (a) A adio de apenas ADP e Pi resulta em um pequeno ou nenhum aumento tanto da respirao (consumo de O2, preto) como da sntese de ATP (vermelho). Quando o succinato adicionado, a respirao comea imediatamente e o ATP sintetizado. A adio de cianeto (CN), que bloqueia a transferncia de eltrons entre a citocromo oxidase e o O2, inibe tanto a respirao quanto a sntese de ATP. (b) Mitocndrias supridas com succinato respiram e sintetizam ATP apenas quando o ADP e o Pi forem adicionados. A adio subseqente de venturicidina ou oligomicina, inibidores da ATP sintase, bloqueia tanto a sntese de ATP quanto a respirao. O dinitrofenol (DNP) um desacoplador e permite que a respirao continue sem a sntese de ATP. Como a energia da oxidao do substrato dirige a sntese do ATP na mitocndria, no inesperado que inibidores do transporte de eltrons para o O2 (cianeto, monxido de carbono, antimicina A) bloqueiem a sntese de ATP (Fig. 19-17a). Mais surpreendente o achado de que o inverso tambm verdade: inibio da sntese de ATP bloqueia a transferncia de eltrons na mitocndria intacta. Este acoplamento obrigatrio pode ser demonstrado em mitocndrias isoladas suprindo-as de O2 e substratos oxidveis, mas no ADP (Fig. 19-17b). Nestas condies no ocorre nenhuma sntese de ATP e a transferncia de eltrons para o O2 no acontece. O acoplamento da oxidao e fosforilao tambm pode ser demonstrado usando-se oligomicina ou veturicidina, antibiticos txicos, que se ligam ATP sintase na mitocndria. Estes compostos so potentes inibidores da sntese de ATP e da transferncia de eltrons atravs da cadeia de carregadores para o O2 (Fig. 19-17b). Como j conhecido que a oligomicina no interage diretamente com os carregadores de eltrons, mas somente com a ATP sintase, a transferncia de eltrons e a sntese de ATP so obrigatoriamente acopladas, isto , uma no ocorre sem a outra. A teoria quimiosmtica explica prontamente a dependncia da sntese de ATP na mitocndria do transporte de eltrons. Quando o fluxo de prtons para o interior da matriz, atravs do canal de prtons da ATP sintase bloqueado (com oligomicina por exemplo), no existe nenhum caminho para o retorno dos prtons para a matriz e, a contnua extruso de prtons provocada pela atividade da cadeia respiratria gera um grande gradiente de prtons. A fora prton motriz aumenta at que o custo (energia livre) do bombeamento de prtons

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para fora da matriz contra esse gradiente se iguale ou exceda a energia liberada pela transferncia dos eltrons do NADH para o O2. Neste ponto, o fluxo de eltrons cessa, a energia livre do processo de fluxo de eltrons acoplado ao bombeamento de prtons torna-se zero e o equilbrio estabelecido. Entretanto, certas condies e reagentes podem desacoplar a oxidao da fosforilao. Quando mitocndrias intactas so rompidas com detergentes ou cisalhamento fsico, os fragmentos de membrana resultantes ainda podem catalisar a transferncia de eltrons do succinato ou NADH para o O2 mas nenhuma sntese de ATP acoplada a esta respirao. Certos compostos qumicos causam o desacoplamento sem romper a estrutura mitocondrial. Entre os desacopladores qumicos esto includos o 2,4-dinitrofenol (DNP) e a carbonilcianeto-p-trifluormetoxi fenilhidrazina (FCCP) (Tabela 19-4; Fig. 19-18), ambos cidos fracos com propriedades hidrofbicas. A hidrofobicidade destes compostos permite que eles se difundam rapidamente atravs da membrana da mitocndria. Aps entrarem na matriz mitocondrial na forma protonada, eles podem liberar um prton, dissipando assim o gradiente de prtons. Ionforos tais como a valinomicina (ver Fig. 12-37; tabela 19-4) permitem que ons inorgnicos passem facilmente atravs das membranas. Os ionforos desacoplam a transferncia de eltrons da fosforilao oxidativa dissipando a contribuio eltrica do gradiente eletroqumico atravs da membrana da mitocndria.

figura 19-18 Dois desacopladores qumicos da fosforilao oxidativa. Tanto o DNP como o FCCP possuem um prton dissocivel e so muito hidrofbicos. Eles carregam prtons atravs da membrana mitocondrial interna, dissipando o gradiente de prtons. Eles tambm desacoplam a fotofosforilao (pg. xxx). Se o papel da transferncia de eltrons na sntese de ATP mitocondrial apenas bombear prtons para criar o potencial da fora prton motriz, um gradiente de prtons criado artificialmente deveria ser capaz de substituir a transferncia de eltrons para dirigir a sntese de ATP. Essa predio do modelo quimiosmtico foi testada e confirmada experimentalmente (Fig. 19-19). Mitocndria manipuladas de modo a se impor uma diferena de concentrao de prtons e uma separao de cargas atravs da membrana interna sintetizam ATP na ausncia de um substrato oxidvel. A fora prton motriz sozinha suficiente para conduzir a sntese de ATP.

figura 19-19

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Evidncia do papel do gradiente de prton na sntese

de ATP. Um gradiente

eletroqumico imposto artificialmente comanda a sntese de ATP na ausncia de um substrato oxidvel como um doador de eltrons. Neste experimento de duas etapas, mitocndrias isoladas so inicialmente incubadas em um tampo de pH 9 contendo KCl 0,1 M. (a) Um lento vazamento do tampo e do KCl para o interior da mitocndria eventualmente provoca um equilbrio da matriz com o meio circunvizinho. No esto presentes quaisquer substratos oxidveis. (b) As mitocndrias so agora separadas do tampo de pH 9 e ressuspensas em um tampo de pH 7 contendo valinomicina mas no KCl. A mudana de tampo cria uma diferena de duas unidades de pH atravs da membrana interna da mitocndria. O fluxo de K+ para fora, sem o seu contraon e contra o seu gradiente de concentrao, promovido pela valinomicina cria um desbalanceamento de cargas atravs da membrana (matriz negativa). A soma do potencial qumico, devido diferena de pH, com o potencial eltrico, devido separao de cargas, uma fora prton motriz suficientemente grande para suportar a sntese de ATP na ausncia de um substrato oxidvel.

Efraim Racker 1913-1991

A ATP sintase tem dois domnios funcionais, Fo e F1 A ATP sintase mitocondrial uma ATPase do tipo F (veja Fig. 12-31c; Tabela 12-4), similar na estrutura e mecanismo s ATP sintases de cloroplastos e bactrias. Esse grande complexo enzimtico da membrana mitocondrial interna catalisa a formao de ATP a partir de ADP e Pi acompanhado do fluxo de prtons do lado P para o N da membrana (Eq. 19-10). A ATP sintase, tambm chamada complexo V, apresenta dois componentes distintos: F1, uma protena perifrica de membrana e Fo que uma protena integral de membrana. A letra o subscrita em Fo significa sensvel oligomicina. F1 foi o primeiro fator identificado como essencial para a fosforilao oxidativa. Ele foi identificado e purificado a partir da membrana mitocondrial interna por Efraim Racker e seus colegas no incio dos anos 60. In vitro, pequenas vesculas formadas a partir da membrana mitocondrial interna promovem a sntese de ATP acoplada transferncia de eltrons. Quando F1 extrado cuidadosamente dessas vesculas, as vesculas despojadas ainda contm as cadeias respiratrias intactas e a poro Fo da ATP sintase. Estas vesculas podem catalisar a transferncia de eltrons do NADH para o O2 mas no podem produzir um gradiente de prtons: Fo apresenta um poro de prtons atravs do qual esses prtons vazam to rapidamente quanto so bombeados pela transferncia de eltrons e, sem um gradiente de prtons as vesculas desprovidas do

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componente F1 no podem fazer ATP. Isoladamente, o componente F1 catalisa a hidrlise do ATP (o reverso da sntese) e por isso foi originalmente chamado F1ATPase. Quando purificado e adicionado s vesculas despojadas ele se reassocia com o componente Fo fechando seu poro de prtons e restaurando a capacidade da membrana de acoplar a transferncia de eltrons e a sntese de ATP.

O ATP estabilizado em relao ao ADP, na superfcie de F1 Experimentos de troca isotpica usando F1 purificado revela um fato notvel sobre o mecanismo cataltico da enzima: na sua superfcie, a reao ADP + Pi ATP + H2O rapidamente reversvel, isto , a variao da energia livre para a sntese de ATP prxima de zero ! Quando o ATP hidrolisado por F1 (o reverso da sntese de ATP) em gua marcada com 18O, o Pi que formado apresenta o tomo 18O. Medidas cuidadosas do teor de 18O no Pi formado in vitro pela hidrlise enzimtica do ATP catalisada pela F1 revelam que o Pi contm no um mas trs ou quatro tomos de 18O (Fig. 19-20). Isto indica que a ligao pirofosfato terminal do ATP quebrada e refeita repetidamente antes que o Pi deixe a superfcie da enzima. Com o Pi livre para se movimentar em seu stio de ligao, cada hidrlise insere ao acaso o 18O em cada uma das quatro posies no Pi. Esta reao de troca ocorre nos complexos FoF1 no energizados (sem nenhum gradiente de prtons) e com o complexo F1 isolado pois no requer aplicao de energia.

figura 19-20 Mecanismo cataltico de F1: experimento de troca com 18O. F1 solubilizado de membrana mitocondrial incubado com ATP na presena de gua marcada com 18O. Em intervalos de tempo definidos uma mostra retirada da soluo e analisada para a incorporao do 18O no Pi produzido pela hidrlise do ATP. Em minutos, o Pi apresenta trs ou quatro 18O indicando que tanto a hidrlise quanto a sntese do ATP ocorreram vrias vezes durante o perodo de incubao. Estudos cinticos das velocidades de sntese e hidrlise do ATP confirmam a concluso de que o Go para sntese do ATP na enzima prxima de zero. Atravs de medidas de velocidade de hidrlise (k1= 10 s-1) e sntese (k-1= 24 s-1), a constante de equilbrio calculada para a reao: k1 Enz-ATP Enz-(ADP + Pi) k-1

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: Keq= k-1/ k1= 24 s-1/10 s-1= 2,4 A partir desta Keq, o Go prximo de zero. Isto contrasta com a Keq da ordem de 105 (Go= - 30,5 kJ/mol) para o ATP livre em soluo (no na superfcie da enzima). O que explica essa enorme diferena ? A ATP sintase estabiliza o ATP em relao ao ADP + Pi ligando mais fortemente o ATP e liberando energia suficiente para contrabalanar o custo de fazer ATP. Medidas cuidadosas das constantes de ligao mostram que a FoF1 liga o ATP com uma afinidade muito grande (Kd 10-12 M) e o ADP com uma afinidade muito menor (Kd 10-8). Esta diferena no Kd corresponde a uma diferena de cerca de 40 kJ/mol na energia de ligao e, essa energia de ligao desloca o equilbrio na direo da formao do produto ATP.

O gradiente de prtons comanda a liberao de ATP da superfcie da enzima Embora a ATP sintase equilibra o ATP com o ADP + Pi sintetizado de novo, o ATP no pode deixar a superfcie da enzima na ausncia de um gradiente de prtons. este gradiente de prtons que ajuda a enzima a liberar o ATP formado em sua superfcie. O diagrama de coordenadas de reao do processo (Fig. 19-21) ilustra a diferena entre o mecanismo da sntese do ATP e aquele de vrias outras enzimas que catalisam reaes endergnicas. Para a sntese contnua de ATP, a enzima deve oscilar entre a forma que liga o ATP muito fortemente e a forma que libera o ATP. Estudos qumicos e cristalogrficos da ATP sintase mostraram a base estrutural para essa alternncia de funo.

figura 19-21 Diagrama de coordenadas da reao para a ATP sintase e uma enzima tpica. Em uma reao catalisada por uma enzima tpica (esquerda) alcanar o estado de transio () entre o substrato e o produto a maior barreira de energia a ser sobrepujada. Na reao catalisada pela ATP sintase (direita), a liberao do ATP da enzima e no a formao do ATP, a maior barreira de energia. Embora a mudana de energia livre para a formao do ATP a partir do ADP + Pi em soluo aquosa, grande e positiva, a forte ligao do ATP enzima garante energia de ligao suficiente para levar a energia do ATP ligado enzima prxima aquela do ADP + Pi. Na superfcie da enzima, a reao portanto rapidamente reversvel e a constante de equilbrio aproximadamente 1. A energia livre requerida para a liberao do ATP garantida pela fora prton motriz.

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John E. Walker

Cada subunidade da ATP sintase pode assumir trs configuraes diferentes A F1 mitocondrial apresenta nove subunidades de cinco tipos diferentes, com a composio 33. Cada uma das trs subunidades apresenta um stio cataltico para a sntese do ATP. A determinao cristalogrfica da estrutura de F1 por John E. Walker e colegas, revelou detalhes estruturais muito teis para explicar o mecanismo cataltico da enzima. A parte de F1 em forma de maaneta, uma esfera achatada de 8 mm de altura e 10 mm de espessura, consistindo de subunidades e alternadas arranjadas semelhantemente aos gomos de uma laranja (Fig. 19-22a, b, c). Os polipeptdeos que formam o caule na estrutura cristalina de F1 esto arranjados assimetricamente, com um domnio de uma nica subunidade que caracteriza uma haste que atravessa F1 e um outro domnio de primariamente associado a uma das trs subunidades , designada -vazia (Fig. 19-22c). Embora a sequncia de aminocidos das trs subunidades sejam idnticas, as suas conformaes so diferentes, em parte devido associao da subunidade com apenas um das trs. As estruturas das subunidades e no foram reveladas nesses estudos cristalogrficos. As diferenas conformacionais entre as subunidades se ampliam para diferenas nos stios de ligao do ATP/ADP. Quando os pesquisadores cristalizaram a protena na presena de ADP e App(NH)p, um anlogo estrutural muito parecido com o ATP que no pode ser hidrolisado pela atividade ATPase de F1, o stio de ligao de uma das trs subunidades foi ocupado pelo App(NH)p, o segundo foi ocupado pelo ADP e o terceiro ficou vazio (Fig. 19-22c). As correspondentes conformaes da subunidade foram designadas -ATP, -ADP e -vazia. Essa diferena na ligao do nucleotdeo entre as trs subunidades crtica para o mecanismo desse complexo. App(NH)p (-imidoadenosina-5Ligao - no hidrolizvel trifosfato)

figura 19-22

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Complexo da ATP sintase mitocondrial. (a) Estrutura do complexo F1 deduzida a partir de estudos cristalogrficos e bioqumicos. Na F1, trs subunidades e trs esto arranjadas como os gomos de uma laranja, com alternncia das subunidades (sombreado cinza) e (sombreado prpura) ao redor de uma haste central, a subunidade (verde). (b) Estrutura cristalina de F1 vista de lado. Duas subunidades e uma foram removidas para mostrar a haste central (subunidade ) e os stios de ligao para o ATP (vermelho) e ADP (amarelo) nas subunidades . As subunidade e no esto mostradas aqui. (c) F1 vista por cima (isto , do lado N da membrana), mostrando as trs subunidades , as trs e a haste central (subunidade ). Em cada subunidade , perto da sua interface com a subunidade vizinha existe um stio de ligao para o nucleotdeo que crtico para a atividade cataltica. A nica subunidade se associa fundamentalmente com um dos trs pares , forando cada uma das trs subunidades a assumirem conformaes ligeiramente diferentes, com diferentes stios de ligao para nucleotdeos. Na enzima cristalina, uma subunidade (-ADP) apresenta o ADP (amarelo) em seu stio de ligao, a prxima (-ATP) contm o ATP (vermelho) e, a terceira (-vazia) no contm nenhum nucleotdeo ligado. O complexo Fo que constitui o poro de prtons composta de trs subunidades a, b e c em uma proporo ab2c10-12. A subunidade c um polipeptdio pequeno (Mr 8.000) muito hidrofbico, constitudo fundamentalmente por duas hlices transmembrana, com uma pequena volta se projetando do lado da matriz na membrana. A estrutura cristalina da FoF1 de levedura, deduzida em 1999, mostra o arranjo das subunidades c. Existem 10 subunidades c nas leveduras, cada uma com duas hlices transmembrana quase perpendiculares ao plano da membrana e arranjadas em dois crculos concntricos (Fig. 19-22d, e). O crculo interior composto das hlices amino-terminal de cada subunidade c. O crculo exterior, de cerca de 55 de dimetro, formado pelas hlices caboxila-terminais. As subunidades e de F1 formam uma perna-e-p que se projeta do fundo (membrana) da F1 e se apoia firmemente no anel das subunidades c. Um desenho esquemtico (Fig. 19-22f) combina a informao estrutural dos estudos da FoF1 bovina e de levedura.

figura 19-22 (continuao) (d) Vista lateral da estrutura da FoF1. Trata-se de uma composio, onde as coordenadas cristalogrficas da F1 mitocondrial bovina (sombras prpuras e cinzas) foram combinadas com as da Fo mitocondrial de levedura (sombras amarelo e laranja). As subunidades a, b, e no fazem parte da estrutura cristalina mostrada aqui. (e) Estrutura da FoF1 de levedura vista a partir do fim na direo do lado P para o lado N. As estruturas maiores visveis nesta

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seo transversal so as duas hlices transmembranas de cada uma das dez subunidades c arranjadas em crculos concntricos. (f) Estrutura do complexo FoF1 deduzida a partir de estudos bioqumicos e cristalogrficos. As duas subunidades b de Fo se associam firmemente s subunidades e de F1, mantendo-as fixas em relao membrana. Em Fo, o cilindro de subunidades c, enterrado na membrana, est ligado haste constituda pelas subunidades e de F1. medida que os prtons fluem atravs da membrana do lado P para o lado N via Fo, o cilindro e a haste rodam e as subunidades de F1 mudam de conformao medida que a subunidade se associa a cada uma delas.

Paul Boyer A catlise rotacional a chave para o mecanismo de mudana de ligao para a sntese do ATP Baseado em detalhados estudos cinticos e de associao de ligantes, da reao catalisada pela FoF1, Paul Boyer props um mecanismo onde os trs stios ativos de F1 giram catalisando a sntese de ATP (Fig. 19-23). Uma subunidade comea na conformao ADP, que liga ADP + Pi do meio circunvizinho. A subunidade muda ento de conformao, assumindo a forma -ATP, que liga fortemente e estabiliza o ATP, efetuando um equilbrio imediato do ADP + Pi com o ATP na superfcie da enzima. Finalmente, a subunidade muda para a conformao -vazia, que tem baixa afinidade pelo ATP e, o recm sintetizado ATP deixa a superfcie da enzima. Uma nova rodada da catlise comea quando esta subunidade assume a forma -ADP e liga ADP + Pi. As mudanas conformacionais fundamentais para este mecanismo so dirigidas pela passagem dos prtons atravs da poro Fo da ATP sintase. A corrente de prtons atravs do poro Fo provoca a rotao do cilindro de subunidades c e da subunidade a ele ligada, ao redor do eixo da subunidade , que perpendicular ao plano da membrana. A subunidade atravessa o centro do esferide 33 que mantido estacionrio em relao superfcie da membrana pelas subunidade b2 e (Fig. 19-22f). A cada 120 de rotao, entra em contato com uma subunidade diferente e esse contato fora esta subunidade a assumir a conformao -vazia. As trs subunidades interagem de tal modo que quando uma assume a conformao -vazia, a sua vizinha de um lado deve assumir a forma -ADP e a outra vizinha, a forma ATP. Desse modo, uma rotao completa da subunidade provoca uma mudana da

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subunidade nas trs conformaes possveis e, a cada rotao completa, trs ATP so sintetizados e liberados na superfcie da enzima. Uma forte predio deste modelo de mudana de ligao que a subunidade deve rodar em uma direo quando FoF1 est sintetizando ATP e na direo oposta quando a enzima est hidrolisando ATP. Esta predio foi confirmada atravs de experimentos elegantes nos laboratrios de Masamitsu Yoshida e Kazuhiko Kinoshita Jr. A rotao de em uma nica molcula de F1 foi detectada microscopicamente ligando-se um longo, fino e fluorescente polmero de actina e aguardando ela se mover em relao a 33 imobilizada em uma lmina de microscpio, medida que o ATP era hidrolisado. Quando todo o complexo FoF1 (e no apenas F1) foi usado em um experimento similar, o anel de subunidade c girou com (Fig. 19-24). A haste girou na direo prevista de 360. A rotao no foi to regular, mas ocorreu em trs discretos passos de 120. Conforme j calculado a partir da velocidade de hidrlise do ATP por uma molcula de F1 e o arraste friccional no longo polmero de actina, a eficincia deste mecanismo em converter energia qumica em movimento quase 100%. Segundo Boyer, ela uma esplndida mquina molecular.

figura 19-23 Modelo da mudana de ligao para a ATP sintase. O complexo F1 tem trs stios no equivalentes para a ligao dos nucleotdeos de adenina, um para cada par de subunidades e . Em um dado momento, um destes stios est na conformao -ATP (que liga ATP fortemente), um segundo est na conformao -ADP (ligao frouxa) e um terceiro est na conformao -vazia (ligao muito frouxa). A fora prton motriz provoca a rotao da haste central (a subunidade , mostrada como uma ponta de flecha verde) que entra em contato com cada um dos pares de subunidades sucessivamente. Isto acarreta uma mudana conformacional cooperativa onde o stio -ATP convertido na conformao -vazia e o ATP liberado. O stio -ADP convertido na conformao -ATP que promove a condensao de ADP + Pi, ligados a ela, para formar ATP. A conformao -vazia se transforma em um stio -ADP, que liga frouxamente ADP + Pi provenientes do solvente. O modelo, baseado em resultados experimentais, requer que

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pelo menos dois dos trs stios catalticos se alternem em atividade. O ATP no pode ser liberado de um stio se e at que o ADP + Pi estejam ligados ao outro.

figura 19-24 Demonstrao experimental da rotao de F1 e F1 geneticamente construda contendo um certo nmero de resduos de His adere fortemente a uma lmina de microscpio coberta com um complexo de Ni. A biotina ligada covalentemente subunidade c. A proteina avidina, que se liga fortemente biotina, ligada covalentemente a longos filamentos de actina marcados com uma sonda fluorescente. A ligao da biotina avidina, une os filamentos de actina com a subunidade c. Quando o ATP adicionado para estimular a atividade ATPase da F1, observa-se o filamento marcado girar continuamente em uma direo demonstrando que o cilindro de subunidades c de Fo gira. Em outro experimento (no mostrado), a ligao do filamento de actina diretamente na subunidade mostrou que ela tambm gira. Provavelmente o cilindro e a haste se movem como uma unidade.

O acoplamento quimiosmtico acarreta uma estequiometria no inteira de consumo de O2 e sntese de ATP Antes da aceitao geral do modelo quimiosmtico para a fosforilao oxidativa, assumia-se que a equao da reao global teria a seguinte forma: ADP + Pi + x()O2 + xH+ + xNADH ATP + xH2O + xNAD+ (19-11)

onde o valor de x, s vezes chamado razo P/O ou razo P/2e, sempre era um nmero inteiro. Quando mitocndrias intactas so suspensas em uma soluo contendo um substrato oxidvel tal como o succinato ou NADH e fornecido O2, a sntese de ATP bem como a diminuio do O2 podem ser medidas rapidamente. Entretanto, a medida de P/O complicada pelo fato de que a mitocndria intacta consome ATP em muitas reaes que ocorrem na matriz e consome O2 para propsitos outros que no a fosforilao oxidativa. A maioria dos experimentos produzem razes P/O (ATP para O2) maiores que 2 quando o NADH o doador de eltrons e maiores que 1 quando o succinato o doador. Consideradose que P/O deve ser um valor inteiro, a maioria dos pesquisadores concordaram que a razo P/O deveria ser 3 para o NADH e 2 para o succinato. Durante anos estes valores foram encontrados em artigos de pesquisas e livros textos. Com a introduo do paradigma quimiosmtico para o acoplamento da sntese do ATP transferncia de eltrons, no existe nenhum requisito terico para a razo P/O ser

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inteira. As questes relevantes sobre a estequiometria tornam-se: quantos prtons so bombeados para fora atravs da transferncia de eltrons de um NADH para o O2 e quantos prtons devem entrar atravs do complexo FoF1 para proporcionar a sntese de uma molcula de ATP ? A medida do fluxo de prtons tecnicamente complicada. Deve-se levar em considerao a capacidade tamponante da mitocndria, o vazamento no produtivo de prtons atravs da membrana interna e o uso do gradiente de prtons para funes diferentes da sntese de ATP, como por exemplo o transporte de substratos atravs da membrana mitocondrial (descrito a seguir). O valor de consenso para os prtons bombeados para fora por par de eltrons 10 para o NADH e 6 para o succinato. O valor experimental mais aceito para o nmero de prtons requeridos para proporcionar a sntese de uma molcula de ATP 4, dos quais 1 usado para transportar Pi, ATP e ADP atravs da membrana mitocondrial (veja a seguir). Se 10 prtons so bombeados para fora por molcula de NADH e 4 devem entrar para produzir um ATP, a razo P/O baseada em prtons 2,5 para o NADH como doador de eltrons e 1,5 (6/4) para o succinato. Sero usados os valores de P/O de 2,5 e 1,5 ao longo deste livro, mas os valores 3,0 e 2,0 ainda so encontrados na literatura bioqumica. A palavra final acerca da estequiometria de prtons provavelmente no ser escrita at que os detalhes completos do mecanismo de reao da FoF1 sejam conhecidos.

A fora prton motriz energiza o transporte ativo Embora o papel primrio do gradiente de prtons na mitocndria fornecer energia para a sntese do ATP, a fora prton motriz tambm comanda vrios processos de transporte essenciais fosforilao oxidativa. A membrana mitocondrial interna geralmente impermevel a espcies carregadas, exceto para dois sistemas especficos da membrana, o transporte de ADP e Pi para dentro da matriz e o do ATP para fora, no citosol (Fig. 19-25). A adenina nucleotdeo translocase, embebida na membrana interna, liga o ADP3- no espao intermembranoso e o transporta para a matriz, trocando-o com uma molcula de ATP4-, que transportada simultaneamente para fora (veja Fig. 14-1 para as formas inicas do ATP e ADP). Como esse contra transporte desloca quatro cargas negativas para fora, para cada trs transportadas para dentro, sua atividade favorecida pelo gradiente eletroqumico transmembrana, que acarreta uma carga negativa lquida matriz. A fora prton motriz direciona a troca ATP-ADP. A adenina nucleotdeo translocase especificamente inibida pelo atractilosdio, um glicosdio txico formado por uma espcie de cardo. Se o transporte de ADP para dentro da mitocndria e o do ATP para fora inibido, o ATP citoslico no pode ser regenerado a partir do ADP, explicando a toxicidade do atractilosdio (Tabela 19-4). Um segundo sistema de transporte de membrana essencial para a fosforilao oxidativa a fosfato translocase, que promove o co-transporte de um H2PO-4 e um H+ para dentro da

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matriz. Este processo de transporte tambm favorecido pelo gradiente de prtons transmembrana (Fig. 19-25). Observe que ele requer um prton para se mover do lado P para o lado N da membrana interna, consumindo uma parte da energia do transporte de eltrons.

figura 19-25 Adenina nucleotdeo e fosfato translocases. Os sistemas de transporte da membrana mitocondrial interna transportam ADP e Pi para dentro da matriz e o ATP recm-sintetizado para o citosol. A adenina nucleotdeo translocase uma contra transportadora, isto , a mesma protena desloca o ADP para dentro da matriz e o ATP para fora. O efeito de substituir o ATP4- pelo ADP3- o efluxo lquido de uma carga negativa, que favorecida pela diferena de carga atravs da membrana interna (lado externo positivo). Em pH 7, o Pi est presente como HPO42- e H2PO4- e, a fosfato translocase especfica para o H2PO4-. No h fluxo lquido de carga durante o co-transporte do HPO42- e H+, mas a concentrao relativamente baixa de prtons na matriz favorece o movimento dos ons H+ para dentro. Assim, a fora prton motriz responsvel por fornecer energia tanto para a sntese do ATP bem como para transportar substratos (ADP e Pi) para dentro e o produto (ATP) para fora da matriz mitocondrial.

Sistemas de lanadeiras so requeridos para a oxidao mitocondrial do NADH citoslico A NADH desidrogenase da membrana mitocondrial interna das clulas animais pode aceitar eltrons apenas do NADH na matriz. Sabendo que a membrana interna no permevel ao NADH, como o NADH gerado pela gliclise, no citoplasma, pode ser reoxidado a NAD+ pelo O2 via cadeia respiratria ? Sistemas especiais de lanadeiras transportam os equivalentes redutores do NADH citoslico para dentro da mitocndria por uma rota indireta. A lanadeira de NADH mais ativa, que funciona nas mitocndrias do fgado, rim e corao, a lanadeira malato-aspartato (Fig. 19-26). Os equivalentes redutores do NADH citoslico so inicialmente transferidos ao oxaloacetato citoslico produzindo malato, pela ao da malato desidrogenase citoslica. O malato formado passa atravs da membrana interna para a matriz, atravs do transportador malato--cetoglutarato. Na matriz, os equivalentes redutores so passados para o NAD+, pela ao da malato desidrogenase matricial, formando o NADH. Este NADH pode ento transferir os seus eltrons diretamente para a cadeia respiratria. Cerca de 2,5 molculas de ATP so geradas medida que este par de eltrons transferido para o O2. O oxaloacetato citoslico deve ser

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regenerado atravs de reaes de transaminao para a atividade dos transportadores de membrana comear um outro ciclo. O msculo esqueltico e o crebro utilizam uma lanadeira de NADH diferente, lanadeira do glicerol-3-fosfato (Fig. 19-27). Ela difere da lanadeira malato-aspartato pelo fato de ceder os equivalentes redutores do NADH (via ubiquinona) para o complexo III e no o I (Fig. 19-8), fornecendo assim energia suficiente para sintetizar apenas 1,5 molculas de ATP para cada par de eltrons. As mitocndrias das plantas superiores possuem uma NADH desidrogenase orientada externamente, que pode transferir os eltrons diretamente do NADH citoslico para a cadeia respiratria, ao nvel da ubiquinona. Uma vez que essa via desvia esses eltrons da NADH desidrogenase e do movimento de prtons a ela associado, a produo de ATP a partir do NADH citoslico menor que a do NADH gerado na matriz (Adendo 19-1).

figura 19-26 A lanadeira malato-aspartato. Esta lanadeira para transportar equivalentes redutores do NADH citoslico para a matriz mitocondrial usada no fgado, rins e corao. O NADH citoslico (espao intermembranoso) cede dois equivalentes redutores para o oxaloacetato, produzindo malato. O malato transportado atravs da membrana interna pelo transportador malato--cetoglutarato. Na matriz, o malato cede dois equivalentes redutores ao NAD+ e o NADH resultante oxidado pela cadeia respiratria. O oxaloacetato formado a partir do malato no pode passar diretamente para o citosol. Ele primeiramente transaminado a aspartato , que passa para o citosol atravs do transportador glutamatoaspartato . O oxaloacetato regenerado no citosol , completando o ciclo.

figura 19-27 A lanadeira glicerol-3-fosfato. Este meio alternativo de deslocar equivalentes redutores do citosol para a matriz mitocondrial opera no msculo esqueltico e no crebro. No citosol, a diidroxiacetona fosfato aceita dois equivalentes redutores do NADH numa reao catalisada pela glicerol-3-fosfato desidrogenase citoslica. Uma isoenzima da glicerol-3-fosfato desidrogenase ligada superfcie externa da membrana interna, transfere dois equivalentes redutores do glicerol-3-fosfato localizado no espao intermembranoso at a ubiquinona. Observe que esta lanadeira no envolve sistema de transporte atravs da membrana.

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Regulao da Fosforilao Oxidativa A fosforilao oxidativa produz a maioria do ATP produzido nas clulas aerbicas. A oxidao completa de uma molcula de glicose at CO2 produz trinta ou trinta e dois ATP (Tabela 19-5). Por comparao, em condies anaerbicas (fermentao lctica) a gliclise produz apenas dois ATP por glicose. Assim, o surgimento da fosforilao oxidativa acarretou um tremendo aumento na eficincia energtica do catabolismo. A oxidao completa do palmitoil-CoA, at CO2, que tambm ocorre na matriz mitocondrial, produz 108 ATP (veja Tabela 17-1). Um clculo similar pode ser feito para o ATP produzido pela oxidao de cada um dos aminocidos (Captulo 18). As vias de oxidao aerbicas que resultam na transferncia de eltrons para o O2 so responsveis pela maior parte do ATP sintetizado no catabolismo. Desse modo, a regulao da produo de ATP pela fosforilao oxidativa para garantir as necessidades flutuantes da clula por ATP absolutamente essencial.

tabela 19-5 Produo de ATP a partir da oxidao completa da glicose Processo Gliclise Produto direto 2 NADH (citoslico) 2 ATP Oxidao do piruvato (2 por glicose) Oxidao do Acetil-CoA no ciclo do cido ctrico (2 por glicose) 2 NADH (matriz mitocondrial) 6 NADH (matriz mitocondrial) 2 FADH2 2 ATP ou 2 GTP Produo total por glicose mitocndria. 30 ou 32 * O nmero depende do tipo do sistema de lanadeira que transfere equivalente redutores na ATP final 3 ou 5* 2 5 15

A fosforilao oxidativa regulada pelas necessidades energticas celulares A velocidade da respirao (consumo de O2) na mitocndria fortemente regulada. Ela geralmente limitada pela disponibilidade do ADP como substrato para a fosforilao. A dependncia da velocidade de consumo de O2 em relao disponibilidade do aceptor de Pi, o ADP (veja Fig.19-17b), chamada controle aceptor da respirao pode ser dramtica. Em

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alguns tecidos animais, o quociente do controle aceptor, a razo entre a velocidade mxima do consumo de O2 induzida pelo ADP e a velocidade basal na ausncia do ADP, pelo menos 10. A concentrao intracelular do ADP uma medida do estado energtico das clulas. Uma outra medida relacionada o quociente da ao das massas do sistema ATP-ADP: [ATP]/([ADP][Pi]). Normalmente este quociente muito alto, de tal modo que o sistema ATP-ADP est quase totalmente fosforilado. Quando a velocidade de algum processo que requer energia (sntese de protenas, por exemplo) aumenta, a velocidade de transformao do ATP em ADP e Pi aumenta, diminuindo o quociente da ao das massas. Com mais ADP disponvel para a fosforilao oxidativa, a velocidade da respirao aumenta, provocando a regenerao do ATP. Isto continua at que o quociente da ao das massas retorna ao seu alto nvel normal, instante em que a respirao diminui novamente. A velocidade da oxidao dos combustveis celulares regulada com tal sensibilidade e preciso de tal modo que o quociente [ATP]/([ADP][Pi]) varia apenas ligeiramente na maioria dos tecidos, mesmo durante variaes extremas na demanda energtica. Em resumo, o ATP formado to rpido quanto usado na velocidade em que usado nas atividades celulares que requerem energia.

As mitocndrias desacopladas no tecido adiposo marrom produzem calor H uma extraordinria e instrutiva exceo regra geral de que a respirao diminui quando o suprimento de ATP for adequado. A maioria dos mamferos recm nascidos, incluindo o homem, apresenta um tipo de tecido chamado tecido adiposo marrom, onde a oxidao dos combustveis ao invs de produzir ATP serve para gerar calor para manter o recm nascido aquecido. Este tecido adiposo especializado marrom devido a presena de um grande nmero de mitocndrias e, portanto de grandes quantidades de citocromos, cujos grupos heme absorvem intensamente a luz visvel. As mitocndrias do tecido adiposo marrom so similares quelas de outras clulas dos mamferos em todos os aspectos, exceto que elas apresentam uma notvel protena em suas membranas internas. A termogenina, tambm chamada de protena desacopladora (Tabela 19-4) proporciona uma via para os prtons retornarem matriz sem passar atravs do complexo FoF1 (Fig. 19-28). Como resultado deste desvio de prtons, a energia da oxidao no conservada pela formao do ATP mas dissipada como calor, que contribui para manter a temperatura corporal do recm nascido. Os animais que hibernam tambm dependem das mitocndrias desacopladas do tecido adiposo marrom para gerar o calor durante o longo perodo de dormncia (veja Adendo 17-1).

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figura 19-28 Gerao de calor pela mitocndria desacoplada. A protena desacopladora (termogenina) das mitocndrias do tecido adiposo marrom, fornecendo uma via alternativa para os prtons reentrarem na matriz mitocondrial, faz com que a energia conservada pelo bombeamento dos prtons seja dissipada como calor.

As vias de produo do ATP so reguladas de uma maneira coordenada As principais vias catablicas possuem mecanismos reguladores coordenados e ajustados, que lhes permitem funcionar conjuntamente de uma maneira econmica e auto-reguladora para produzir ATP e os precursores biossintticos. As concentraes relativas de ATP e ADP controlam no apenas as velocidades da transferncia de eltrons e a fosforilao oxidativa, mas tambm as velocidades do ciclo do cido ctrico, a oxidao do piruvato e a gliclise (Fig. 19-29). Toda vez que o consumo de ATP aumenta, a velocidade da transferncia de eltrons e da fosforilao oxidativa aumenta. Simultaneamente, a velocidade da oxidao do piruvato via ciclo do cido ctrico aumenta, aumentando desta forma o fluxo de eltrons na cadeia respiratria. Esses eventos podem, por sua vez, provocar um aumento na velocidade da gliclise, aumentando a velocidade da formao do piruvato. Quando a converso do ADP em ATP diminui a concentrao do ADP, o controle aceptor diminui a transferncia de eltrons e, portanto a fosforilao oxidativa. A gliclise e o ciclo do cido ctrico tambm diminuem, uma vez que o ATP um inibidor alostrico da fosfofrutoquinase-1 (veja Fig. 1518) e da piruvato desidrogenase (veja Fig. 16-15). A fosfofrutoquinase-1 inibida no apenas pelo ATP, mas pelo citrato, o primeiro intermedirio do ciclo do cido ctrico. Quando o ciclo est ocioso, o citrato se acumula dentro da mitocndria e ento extravasa para o citoplasma. Quando as concentraes do ATP e do citrato esto elevadas, eles produzem uma inibio alostrica combinada da fosfofrutoquinase-1, que maior que a soma dos seus efeitos individuais, desacelerando a gliclise.

figura 19-29 Regulao das vias produtoras de ATP. Este diagrama mostra a regulao coordenada da gliclise, da oxidao do piruvato, do ciclo do cido ctrico e fosforilao oxidativa pelas concentraes relativas do ATP, ADP e AMP e pelo NADH. Altas [ATP] (ou baixas [ADP] e [AMP]) produzem baixas taxas da gliclise, oxidao do piruvato, oxidao do acetato via ciclo do cido ctrico e fosforilao oxidativa. Todas estas quatro vias so aceleradas quando

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a utilizao do ATP e a formao do ADP, AMP e Pi, aumentam. A coordenao da gliclise e do ciclo do cido ctrico pelo citrato que inibe a gliclise, suplementa a ao do sistema da adenina nucleotdeo. Alm disso, nveis elevados de NADH e de acetil-CoA tambm inibem a oxidao do piruvato a acetil-CoA. Quocientes [NADH]/[NAD+] elevados inibem as reaes das desidrogenases do ciclo do cido ctrico (veja Fig. 16-15).

Mutaes nos genes mitocondriais causam doena humana As mitocndrias possuem o seu prprio genoma, uma molcula circular de DNA de fita dupla. O cromossomo mitocondrial humano (Fig.19-30) contm 37 genes (16.569 pares de bases), incluindo 13 que codificam protenas da cadeia respiratria (Tabela 19-6). Os genes restantes codificam molculas de RNA ribossmico e de transferncia, essenciais para a maquinaria sintetizadora de protenas da mitocndria. Muitas das protenas mitocondriais esto codificadas por genes nucleares, sintetizadas nos ribossomos citoplasmticos e, ento importadas pos-translacionalmente e montados dentro da mitocndria (veja Fig.27-39). Um crescente nmero de doenas humanas pode ser atribudo a mutaes nos genes mitocondriais. Estas doenas so invariavelmente herdadas da me, uma vez que todas as mitocndrias de um embrio em desenvolvimento so derivadas do vulo da me. Uma doena rara chamada neuropatia ptica hereditria de Leber (LHON) afeta o sistema nervoso central, incluindo os nervos pticos, causando a perda bilateral da viso no incio da maioridade. Uma nica base alterada no gene mitocondrial ND4 (Fig. 19-30a) provoca a troca de um resduo de Arg por um de His na cadeia polipeptdica do complexo I e o resultado uma mitocndria parcialmente deficiente na transferncia de eltrons do NADH para a ubiquinona. Embora essas mitocndrias podem produzir algum ATP atravs da transferncia de eltrons do succinato, elas aparentemente no podem suprir ATP suficiente para suportar o metabolismo muito ativo dos neurnios. Como conseqncia, o nervo ptico lesado, levando cegueira. Uma nica mudana de base no gene mitocondrial para citocromo b, um componente do complexo III, tambm produz LHON demonstrando que a patologia resulta de uma reduo geral da funo mitocondrial e no especificamente de um defeito no transporte de eltrons atravs do complexo I.

figura 19-30

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Genes mitocondriais e mutaes. (a) Mapa do DNA mitocondrial humano, mostrando os genes que codificam as protenas do complexo I, a NADH desidrogenase (ND1 a ND6); o citocromo b do complexo III (Cit b); as subunidades da citocromo oxidase (complexo IV) (COI a COIII) e duas subunidades da ATP sintase (ATPase 6 e ATPase 8). As cores dos genes correspondem quelas dos complexos mostrados na Figura 19-7. Tambm esto includos os genes para os RNAs ribossmicos (rRNA) e para vrios RNAs de transferncia especficos para mitocndria. A especificidade dos RNAs de transferncia (tRNA) est indicada pelos cdigos de uma letra para os aminocidos. As setas indicam as posies das mutaes causadoras da neuropatia ptica hereditria de Leber (LHON) e a epilepsia mioclnica e a doena da fibra vermelha rasgada (MERRF). Os nmeros em parnteses indicam a posio nos nucleotdeos alterados (o nucleotdeo nmero 1 est no topo do crculo). (b) Micrografia eletrnica presentes na mitocndria mutante. de uma mitocndria anormal do msculo de um indivduo com MERRF, mostrando as incluses de protenas paracristalinas algumas vezes

Epilepsia mioclnica e doena da fibra vermelha rasgada A epilepsia mioclnica, MERRF, causada por uma mutao no gene mitocondrial que codifica um tRNA especfico para leucina (leucina-tRNA). Es