Capítulo 3. Materiais e...

Capítulo 3. Materiais e Métodos

Sumário

Neste capítulo descrevem-se os materiais e métodos utilizados durante a dissertação. Inclui-se no

capítulo a caracterização da área de estudo, a construção da base de dados para registar a informação sobre

a micoflora das uvas, e o processo de análise de dados.

1. Área de estudo.............................................................................................................................. 122

2. Plano de amostragem ................................................................................................................... 144

3. Enumeração de fungos filamentosos............................................................................................ 145

4. Avaliação da capacidade ocratoxigénica das estirpes de Aspergillus........................................... 159

5. Construção duma base de dados para documentação da micoflora das uvas ............................... 161

6. Determinação da OTA em uvas ................................................................................................... 170

7. Avaliação da influência da composição química do estado de maturação e variedade de uva na

produção de OTA .................................................................................................................................. 175

8. Análise dos dados......................................................................................................................... 180

121

CAPÍTULO 3. MATERIAIS E MÉTODOS

1. Área de estudo

Das 32 regiões demarcadas Portuguesas, seleccionaram-se 4 para recolher uvas e

conduzir o estudo durante 3 anos (2001-2003): 2 no norte do país, Vinhos Verdes e

Douro, e 2 no sul: Alentejo e Ribatejo (V. Capítulo 2, Figura 2.4). O critério de selecção

baseou-se na diversidade de climas e distribuição geográfica. Em 2003, foram

adicionalmente estudadas amostras da região Demarcada do Dão e da Ilha da Madeira, e

mais um local na região do Douro.

Nesta secção apresenta-se uma caracterização sucinta das regiões estudadas e do tipo

de vinhos nela produzidos. Para informações adicionais podem ser consultados os

seguintes sítios da WWW1: IVV, para informações gerais e legislação sobre todas as

regiões; Comissão Vitivinícola Regional dos Vinhos Verdes (CVRVV) para informações

sobre a região dos Vinhos Verdes; Instituto do Vinho do Porto (IVP), para informações

sobre o vinho do Douro e Porto; Comissão Vitivinícola Regional do Alentejo (CVRA),

para informações sobre vinhos do Alentejo.

1.1. Região Demarcada dos Vinhos Verdes

A região dos Vinhos Verdes localiza-se no noroeste de Portugal (V. Capítulo 2,

figura 2.4), na zona tradicionalmente conhecida como Entre-Douro-e-Minho. Tem como

limites a norte o rio Minho (fronteira com a Galiza), a nascente e a sul zonas

montanhosas que constituem a separação natural entre o Entre-Douro-e-Minho Atlântico

e as zonas do país mais interiores de características mais mediterrânicas, e por último o

Oceano Atlântico que constitui o seu limite a poente.

Orograficamente, a região apresenta-se como “um vasto anfiteatro que, da orla

marítima, se eleva gradualmente para o interior” (Amorim Girão, citado no sítio da

1 URLs: IVV: http://www.ivv.min-agricultura.pt/; CVRVV: http://www.cvrvv.pt/; IVP:

http://www.ivp.pt/pt/index.asp; CVRA: http://www.vinhosdoalentejo.pt/

122

http://www.cvrvv.pt/

http://www.ivp.pt/pt/index.asp


CVRVV2), expondo toda a zona à influência do oceano Atlântico, fenómeno reforçado

pela orientação dos vales dos principais rios, que correndo de nascente para poente

facilitam a penetração dos ventos marítimos. Como tal, a região apresenta temperaturas e

amplitudes térmicas moderadas, pluviosidade elevada e insolação baixa.

Durante a vindima, é frequente a ocorrência de chuva, que cria condições

frequentes para o aparecimento de podridão, em particular de Botrytis cinerea, que pode

conduzir à antecipação das vindimas.

É a maior região demarcada nacional, representando 15% da área vitícola

nacional. Os Vinhos Verdes regra geral têm baixo teor alcoólico e são derivados de

mostos medianamente ricos em açúcar, mas ricos em ácido, de pH baixo, com suficientes

teor de azoto. Nestes vinhos as fermentações são totais. O tempo de fermentação

alcoólica de um mosto pode ser prolongado até três a quatro semanas. Os vinhos tintos

são encorajados a fazer a fermentação maloláctica, que consiste na transformação do

ácido málico em ácido láctico.

A Região Demarcada Vinhos Verdes está dividida em 9 sub-regiões: Amarante,

Ave, Baião, Basto, Cávado, Lima, Monção, Paiva e Sousa representadas no mapa

geográfico da Figura 3.1.

Quanto à classificação das Zonas Vitícolas Europeias, a região está inserida na

zona CIa (Regulamento (CE) nº 1493/1999, de 17 de Maio de 1999).

2 URL: http://www.vinhoverde.pt/pt/vinhoverde/regiao1.htm

123


Figura 3.1. Região Demarcada dos Vinhos Verdes (retirado do sítio da CVRVV. URL:

http://www.vinhoverde.pt/pt/vinhoverde/mapaRDVV.htm)

124


1.2. Região Demarcada do Douro

O Douro é das regiões mais antigas do país. Localiza-se no nordeste de Portugal

(V. Capítulo 2, figura 2.4), na bacia hidrográfica do Douro, rodeada de montanhas que

lhe dão características climáticas particulares. A região estende-se por área total de cerca

de 250 000 ha, estando dividida em três sub-regiões naturalmente distintas, por factores

climáticos e sócio – económicos: Baixo Corgo, Cima Corgo e Douro superior (Figura

3.2).

Figura 3.2. Localização das 3 sub-regiões do Douro (retirado do sítio do IVP. URL:

http://www.ivp.pt/pt/Regiao/, acedido a 12/02/05)

O clima da região do Douro é muito distinto da região dos Vinhos Verdes. A

individualidade do Douro deve-se à sua localização, sendo grande a influência que

exercem as serras do Marão e de Montemuro, servindo como barreira à penetração dos

ventos húmidos de oeste. Situada em vales profundos, protegidos por montanhas, a região

caracteriza-se por ter invernos muito frios e verões muito quentes e secos.

O Douro pertence à Zona Vitícola Europeia CIIIb (Regulamento (CE) nº

1493/1999, de 17 de Maio de 1999). Nesta região produz-se vinho do Douro e o vinho do

Porto, que é produzido por paragem da fermentação com adição de aguardente vínica a

77%. O vinho do Porto é um vinho licoroso, e a doçura do vinho advém de açúcares

125

http://www.ivp.pt/pt/Regiao/


naturais nas uvas não fermentados, sem qualquer concentração prévia. O tempo de

fermentação e maceração é muito curto comparado com os outros vinhos (dois a 3 dias)3.

1.3. Região Alentejo

O Alentejo localiza-se no sul de Portugal (V. capítulo 2, Figura 2.4). É a maior

província do país, é limitado a Norte pelo Rio Tejo, a Noroeste pela Estremadura, a Oeste

pelo Oceano Atlântico, a Este pela fronteira com Espanha e a Sul pelo Algarve. A

hidrografia é constituída fundamentalmente pelas bacias do Guadiana e do Sado. Esta

província tem em média 19,9 habitantes por Km2, a mais baixa densidade populacional

de Portugal e uma das mais baixas da Europa. A cultura da vinha tem um papel social

muito importante, o que se evidencia pelo facto dos concelhos com maior área de vinha

serem também aqueles em que a densidade populacional é superior à média da região. A

área de vinha no Alentejo ronda os 13.500 ha, o que corresponde apenas a cerca de 5% da

área dedicada à cultura em todo o país. Encontra-se nos solos mais pobres da região,

sendo uma cultura basicamente estreme, com excepção de algumas vinhas velhas e

encontra-se instalada em terrenos com declives suaves (excepto a zona de Portalegre,

onde predomina a vinha em encosta), cuja exposição dominante é a Sul. Esta província

encontra-se subdividida em quatro unidades, designadas por Alto Alentejo, Alentejo

Central, Baixo Alentejo e Alentejo Litoral. Existe no Alentejo uma Denominação de

Origem Controlada - DOC Alentejo, com oito sub-regiões vitivinícolas: Borba, Évora,

Granja/Amareleja, Moura, Portalegre, Redondo, Reguengos e Vidigueira (Figura 3.3).

Em termos vitícolas, o Alentejo Central é a unidade mais importante uma vez que aqui se

inserem as zonas vitícolas de Borba, Évora, Redondo, Reguengos e parte de

Granja/Amareleja.

3 Para descrição detalhada do processo de vinificação do vinho do Porto, consultar o sítio do IVP. URL:

http://www.ivp.pt/pt/Enologia/enologia1.shtm

126


Figura 3.3. Delimitação geográfica das subregiões vitícolas do Alentejo. (retirado do sítio de

clubvintage.com. URL: http://www.clubvintage.com/regioes_detalhe.asp?id=35, acedido a 12/02/05)

As zonas vitivinícolas do Alentejo situam-se na faixa Ibero-Mediterrânea, com

características climáticas mediterrânicas aliadas a uma acentuada continentalidade. O

clima da região é caracterizado por Primaveras e Verões excessivamente quentes e secos.

Os valores relativos à insolação são muito elevados, particularmente no trimestre que

antecede as vindimas, contribuindo para a perfeita maturação das uvas e qualidade dos

vinhos. São de facto condições marcadamente favoráveis à síntese e acumulação dos

açúcares e à concentração de matérias corantes na película dos bagos. A insolação anual é

de aproximadamente 3000 horas. Desde há alguns anos que a grande maioria das vinhas

alentejanas está sujeita a uma prática de protecção integrada, o que reduz

significativamente a utilização de pesticidas, seleccionando os menos tóxicos e

racionalizando ainda a sua aplicação. Em virtude das condições climatéricas existentes na

vindima, a podridão é rara e as principais doenças causadas por fungos são doenças do

lenho, como a esca, escoriose e eutipiose.

Na região produzem-se essencialmente vinhos brancos e tintos. As condições

alentejanas são favoráveis para a sobrematuração dos cachos e, como tal, coloca-se muito

ênfase na determinação correcta da data da vindima.

127

http://www.clubvintage.com/regioes_detalhe.asp?id=35


1.4. Região Ribatejo

A região do Ribatejo situa-se acima do rio Tejo (V. Capítulo 2, Figura 2.4), a

norte de Lisboa. O clima do Ribatejo é sul-mediterrânico temperado, menos quente que o

Alentejo, influenciado pelo rio que a percorre. No Ribatejo, há três regiões de

características diferenciadas: são designadas por lezíria (“campo” ou “borda-d'água”),

bairro e charneca. A lezíria corresponde à planície, inundável pelo rio Tejo. O bairro, na

margem direita do Tejo, adjacente à planície aluvial, surge com um relevo pouco

acentuado, de formações areníticas, calcárias e argilosas que apresentam tonalidades

variadas. A charneca, estende-se da margem esquerda do Tejo até ao Alentejo. É uma

área de solos pobres, condicionando-a a um amplo revestimento florestal de sobreiros,

eucaliptos e pinheiros. O grau alcoométrico volúmico do vinho produzido nesta região

toma valores mais elevados devido ao aquecimento dos bagos pela reflexão do sol nas

areias brancas em que a vinha é implantada. Estão definidas 6 sub-Regiões no Ribatejo:

Almeirim, Cartaxo, Chamusca, Coruche, Santarém e Tomar (Figura 3.4). Todas as sub-

regiões compreendem vinhas na lezíria e/ou bairro, mas apenas as sub-regiões Almeirim,

Chamusca e Coruche têm vinhas na charneca.

Figura 3.4. Localização geográfica das sub-regiões do Ribatejo (retirado de clubvintage.com. URL:

http://www.clubvintage.com/regioes_detalhe.asp?tipo=2, acedido a 12/02/05)

128

http://www.clubvintage.com/regioes_detalhe.asp?tipo=2


1.5. Região Dão

A área geográfica correspondente à Denominação de Origem Dão (V. Capítulo 2,

figura 2.4) fica enquadrada pelas Serras da Estrela, Buçaco, Caramulo, Nave, Lousã e

Açor. As serras dominam a paisagem e formam um verdadeiro anel à volta da Região

Demarcada do Dão. A região do Dão possui um clima bastante chuvoso no Inverno. No

Verão o tempo é quente e seco. Existem também vários microclimas, dependentes da

altitude e da inclinação das zonas. Existem 7 sub-regiões: Alva, Besteiros, Castendo,

Serra da Estrela, Silgueiros, Terras de Azurara e Terras de Senhorim. A região tem

vocação para a produção de espumantes naturais.

1.6. Região Madeira

A ilha da Madeira possui um clima muito seco, com pouca precipitação, e

temperaturas amenas. No entanto, a humidade do ar é elevada. A área geográfica

correspondente à Denominação de Origem "Madeira" abrange toda a ilha. Nesta região

microclimática, de terrenos saibrosos, de solos vulcânicos e basálticos, a vinha cultiva-se

em socalcos, nas encostas soalheiras, principalmente na zona sul da Ilha da Madeira. É

aqui que se produz o vinho da Madeira, um vinho licoroso de fabrico semelhante ao

vinho do Porto, mas com um processo de envelhecimento muito mais complexo, que

envolve o aquecimento do vinho por “estufagem” até aproximadamente 45 a 50 ºC. O

Vinho da Madeira aquando das descobertas marítimas portuguesas tomou os nomes de

Vinho da Volta, Vinho da Roda da Índia, Vinho da Roda e ainda Vinho da Torna

Viagem. O vinho era exportado para outros continentes de barco. Verificou-se ao

regresso do barco que o vinho que não foi vendido tinha qualidade superior à de quando

foi enviado. Quando passava pelas regiões quentes e com os balanços dos navios, o vinho

sofria um envelhecimento prematuro e vantajoso. Desta forma conseguia-se envelhecer

um vinho em poucos meses, o que em situações normais levaria muitos anos a

envelhecer. O processo de estufagem deriva desta descoberta.

129


1.7. Locais estudados

Em cada região, seleccionaram-se 1 a 3 quintas para estudo. Em 2003, incluíram-se

quintas de 2 regiões adicionais: Madeira e Dão, exclusivamente na vindima. No Douro

superior, foi incluído um local extra, com condições climatéricas diversas. No total,

foram estudados 12 locais (Tabela 3.1).

Tabela 3.1. Locais donde foram recolhidas amostras de uvas em cada região e sub-região

Região Sub-região Locais estudados

Localidade mais próxima Latitude

(GMS)

Longitude

(GMS)

Alentejo Évora Évora 38° 33' 38" N 7° 54' 30" W

Reguengos Reguengos de Monsaraz 38° 25' 27" N 7° 32' 04" W

Dão Silgueiros Viseu 40° 39' 39" N 7° 54' 34" W

Douro Baixo Corgo Régua 41° 09' 30" N 7° 47' 02" W

Cima Corgo Pinhão 41° 11' 35" N 7° 32' 51" W

Douro superior Sra. da Ribeira 41° 09' 30" N 7° 14' 51" W

Madeira Câmara de Lobos 32° 38' N 16° 56' W

Ribatejo Almeirim Almeirim 39° 12' 34" N 8° 37' 46" W

Vinhos Verdes Monção Melgaço 42° 06' 49" N 8° 15' 36" W

Lima Arcos de Valdevez 41° 50' 50" N 8° 25' 14" W

1.8. Caracterização climática e bioclimática dos locais de

estudo

No modelo bioclimático de Rivas-Martinez, os principais parâmetros bioclimáticos

que condicionam a distribuição das espécies são a temperatura e a precipitação. Os dados

climatológicos usados para caracterização climática dos locais foram os das estações

meteorológicas mais próximas (Tabela 3.2), com base nas normais climatológicas de

1951-1980 do Instituto de Meteorologia para todos os locais à excepção da Madeira, em

que as normais a que tivemos acesso foram as de 1931-1960. As normais climatológicas

130


correspondem aos dados de 30 anos de estudos climáticos. No sítio do Instituto de

Metereologia, foi possível conseguir cartas com a representação gráfica da distribuição

geográfica da temperatura e precipitação com base nas normais de 1961-1990.

Tabela 3.2. Estações meteorológicas donde se obtiveram os dados climatológicos para caracterização dos

locais onde foram recolhidas uvas

Código Estação Período Localização

Latitude Longitude

A Funchal 1931-1960 32º 38Ń 16º 55´W

B Régua 1951-1980 41º 10Ń 7º 48´W

C Pinhão/S. Bárbara 1951-1980 41º 10Ń 7º 33´W

D Viseu 1951-1980 40º 40Ń 7º 54´W

E Monção/Valinha 1967-1980 42º 04Ń 8º 23´W

F Braga/Posto agrário 1951-1980 41º 33Ń 8º 24´W

G Santarém/Escola Agrícola 1951-1980 39º 15Ń 8º 42´W

H Évora 1951-1980 38º 34Ń 7º 54´W

I Évora/Mitra 1951-1980 38º 32Ń 8º 01´W

J Évora/Currais 1951-1980 38º 31Ń 7º 47´W

1.9. Regime de temperaturas

As principais características do regime termoclimático da área de estudo estão

indicadas na Figura 3.5 e na Tabela 3.3.

Da Figura 3.5 e da Tabela 3.3 observa-se que nos locais estudados as

temperaturas no Verão podem ir até próximo dos 40 ºC. O mês mais quente do ano é

normalmente Julho e mais raramente Agosto. O mês mais frio no Continente é

invariavelmente Janeiro, e na Madeira é Fevereiro. O local mais quente é o Pinhão,

seguido de Évora e Régua. Viseu e Braga são relativamente frescos no Verão, com as

temperaturas a rondar os 20 ºC. Monção no Verão é mais quente que Braga. Viseu é o

local em que as temperaturas são mais frias no Inverno. Em geral, o Inverno é pouco

rigoroso, mas ocasionalmente atingem-se temperaturas negativas. O local com menor

amplitude térmica é o Funchal, na ilha da Madeira. No território continental, os locais

131


mais interiores têm maiores amplitudes térmicas que os mais litorais. A amplitude

térmica mais elevada foi registada no Pinhão.

E

B-C F

G

D

H-J

E

B-C F

G

D

H-J

E

B-C F

G

D

H-J

Figura 3.5. Cartas com a representação da distribuição geográfica dos valores médios da temperatura do

ar em Portugal Continental com base nas Normais Climatológicas 1961-90: esquerda- temperatura mínima

anual; centro- temperatura média anual; direita- temperatura máxima anual. As letras representam a

localização aproximada das estações meteorológicas respectivas utilizadas neste estudo

132


Tabela 3.3. Dados termoclimáticos principais relativos às estações meteorológicas estudadas.

T=temperatura média anual; MQ=mês mais quente do ano; Tmax=temperatura média de MQ;

Max=temperatura máxima absoluta; MF=mês mais frio do ano; Tmin=temperatura média de MF;

M=temperatura média das máximas de MF; m=temperatura média das mínimas de MF; Min=temperatura

mínima absoluta; AT=amplitude térmica anual; Min<0=valores médios de n.º de dias/ano com

temperaturas negativas; Max>25=valores médios de n.º de dias/ano com temperaturas superiores a 25 ºC

Estação T MQ Tmax Max MF Tmin M m Min AT Min<0 Max> 25

A 18,7 Agosto 22,1 37,4 Fevereiro 15,3 18,5 13,1 4,4 6,7 0 29

B 17,7 Julho 23,0 42 Janeiro 8,1 12,5 3,6 -6,5 14,9 17,9 125,6

C 15,6 Julho 24,4 42,1 Janeiro 7,9 12,5 3,5 -5 16,5 16,1 129,6

D 13 Julho 20,5 38,5 Janeiro 6,6 11,1 2,1 -8,5 13,9 32,8 87,5

E 14,4 Julho 21,4 39 Janeiro 8,6 12,5 4,7 -5 12,8 4,6 82,3

F 14 Julho 20,2 38,9 Janeiro 8,7 12,8 4,5 -4,1 11,5 11,9 81,3

G 16 Agosto 22,8 42,2 Janeiro 9,9 14,4 5,5 -4,5 12,9 5,2 123,0

H 15,6 Agosto 23 40,6 Janeiro 9,3 12,5 6,1 -5 13,7 1,8 105,8

I 15,4 Agosto 23,1 41,6 Janeiro 8,6 13,4 3,8 -7,1 14,5 11,0 118,7

J 15,6 Julho 23,4 42,3 Janeiro 8,8 13,6 4 -5,6 14,6 13,4 135,0

1.10. Regime de precipitações

As principais características do regime termoclimático da área de estudo estão

indicadas na Figura 3.6 e na Tabela 3.4.

Os únicos locais com precipitações elevadas são Viseu, Braga e Monção. Estes

locais estão incluídos na região do Dão e Vinhos Verdes, que são muito chuvosas. Dos

locais estudados, o mais seco é o Funchal, na Ilha da Madeira. Os meses mais secos no

Verão são Julho e Agosto.

133


E

B-C F

G

D

H-J

E

B-C F

G

D

H-J

E

B-C F

G

D

H-J

Figura 3.6. Cartas com a representação da distribuição geográfica dos valores médios anuais da

precipitação em Portugal Continental com base nas Normais Climatológicas 1961-90: esquerda- quantidade

de precipitação anual (mm); centro- nº de dias com precipitação superior a 1 mm; direita- nº de dias com

precipitação superior a 10 mm. As letras representam a localização aproximada das estações

metereológicas respectivas utilizadas neste estudo

134


Tabela 3.4. Dados ombroclimáticos principais relativos às estações climatológicas analisadas.

P=precipitação total anual; MCh=mês mais chuvoso do ano; Pmax=precipitação total de MCh; MS=mês

mais seco do ano; Pmin=precipitação total de MS; Max=precipitação diária máxima; P0,1=número de

dias/ano com precipitação (P>0,1mm); P10=número de dias/ano com precipitação abundante (P>10mm).

Estação P Mch Pmax MS Pmin Max P0,1 P10

A 513,7 Novembro 81,0 Julho 1,4 107,0 65 16

B 950 Fevereiro 136,3 Julho 11,4 83,8 110,7 33,2

C 671,7 Fevereiro 91,7 Agosto 10,8 63,7 95,2 23,9

D 1229,3 Fevereiro 176,7 Julho 13,9 112,0 116,0 44,1

E 1235,4 Janeiro 209,8 Agosto 17,9 76,7 137,7 43,9

F 1514,8 Janeiro 217,1 Julho 20,9 114,0 130,4 52,3

G 736,9 Janeiro 109,4 Julho 3,6 104,5 97,6 25,2

H 642,6 Janeiro 94,4 Agosto 3,0 86,4 100,6 21,6

I 664,6 Janeiro 97,7 Julho/Agosto 3,1 93,3 85,1 23,0

J 567,4 Janeiro 80,7 Agosto 2,4 49,0 97,4 18,7

1.11. Insolação

O número de horas de luz (tempo de sol descoberto) é importante para a cultura

da vinha e maturação das uvas. Os valores de insolação estão indicados na Tabela 3.5.

Da Tabela 3.5 observa-se que os locais Santarém e Évora no sul de Portugal são

as que registam níveis de insolação mais elevados.

135


Tabela 3.5. Dados relativos à insolação das estações climatológicas analisadas. It=insolação total anual;

MImax=mês com maior insolação do ano; I%=percentagem registada de insolação face a insolação máxima

possível calculada com base em tábuas astronómicas; - dados não obtidos

Estação It MImax I%

A 2431,5 Agosto 61

B 2294,6 Julho 74

C 2332,6 Julho 70

D 2532,6 Julho 74

E - - -

F - - -

G 2701,6 Julho 81

H 2869,5 Julho 85

I - - -

J - - -

1.12. Temperatura e precipitação em Setembro

Setembro é regra geral o mês das vindimas, momento em que as uvas estão

maduras, e mais susceptíveis ao ataque de fungos. Por isso, interessa conhecer as

condições climáticas nesta altura do ano. A temperatura e precipitação registadas no mês

de Setembro nas estações climatológicas consideradas estão indicadas na Tabela 3.6.

As temperaturas registadas no mês de Setembro são relativamente elevadas,

rondando os 20 ºC. Os valores de precipitação mais elevados foram observados em

Braga, na região dos Vinhos Verdes. Estas condições favorecem a podridão por fungos,

em particular por B. cinerea. No Funchal e em Évora, registaram-se os níveis de

precipitação mais baixos.

136


Tabela 3.6. Temperaturas médias (T), média das temperaturas máximas (Max) e mínimas (Min), e

precipitação total (P) do mês de Setembro registadas nas estações climatológicas consideradas

Estação T Max Min P

A 22,0 24,7 19,4 24,0

B 20,6 28,3 12,8 40,9

C 21,4 28,9 13,9 36,2

D 18,0 25,1 10,8 56,8

E 19,2 25,4 13,1 55,4

F 18,4 24,9 11,8 77,7

G 21,2 28,3 14,1 33,4

H 21,1 26,9 15,3 25,0

I 20,9 28,2 13,6 27,7

J 21,2 29,0 13,4 19,3

1.13. Caracterização bioclimática dos locais estudados

A caracterização bioclimática foi feita de acordo com os índices e critérios de

Rivas-Martinez seleccionados por Honrado (2003), indicados no anexo I. Na Tabela 3.7

encontra-se descrita a diagnose climática dos locais das estações meteorológicas.

Da diagnose bioclimática resultante temos que as estações metereológicas

pertencem todos ao mesmo bioclima, Mediterrânico Pluvio-estacional Oceânico, com a

excepção de Braga, que é de macrobioclima temperado na sua variante Submediterrânica.

Existe uma diversidade considerável de climas onde se localizam as estações

metereológicas, quanto às amplitudes térmicas, temperatura e precipitação. Regra geral,

as estações localizadas mais no interior do país têm uma continentalidade mais

acentuada. A maior parte dos locais pertence ao termotipo Mesomediterrânico inferior,

mas o Funchal e Santarém registaram valores de temperatura totais mais elevados,

pertencendo ao termótipo Termomediterrânico. Os locais mais húmidos são Viseu,

Monção e Braga. No Douro, o Pinhão é mais seco que a Régua, e no Sul, Santarém mais

húmido que Évora.

137


Tabela 3.7. Diagnose bioclimática dos locais das estações meteorológicas

Estação Bioclima Continentalidade Termotipo Ombrótipo

A Mediterrânico

Pluvio-estacional Oceânico

Eu-hiperoceânico Termomediterrânico

inferior

Seco inferior

B Mediterrânico


Euoceânico Mesomediterrânico

inferior

Sub-húmido

inferior

C Mediterrânico



inferior

Seco superior

D Mediterrânico



superior

Húmido

inferior

E Mediterrânico


Semi-hiperoceânico Mesomediterrânico

inferior

Húmido

inferior

F Submediterrâneo Oceânico Semi-hiperoceânico Mesomediterrânico

inferior

Húmido

superior

G Mediterrânico


Semi-hiperoceânico Termomediterrânico

superior

Sub-húmido

inferior

H Mediterrânico



inferior

Seco superior

I Mediterrânico



inferior

Seco superior

J Mediterrânico



inferior

Seco superior

1.14. Castas

Para este estudo, foram seleccionadas castas brancas e tintas recomendadas para

as regiões. Ao todo, foram analisadas 13 castas nacionais, 10 tintas e 3 brancas (Tabela

3.8). As únicas castas brancas analisadas foram Alvarinho e Loureiro na região dos

Vinhos Verdes e Boal na Ilha da Madeira. Para fins comparativos, incluiu-se no estudo

Cabernet Sauvignon, uma casta autorizada em muitas regiões portuguesas, neste caso

proveniente do Ribatejo e Dão. A designação das castas foi a recomendada pelo livro da

sinonímia das castas do IVV.

138


1.15. Vinhas amostradas

No total, foram estudadas 17 vinhas. A localização e casta estão indicadas na Tabela

3.8.

Tabela 3.8. Vinhas e castas estudadas entre 2001 e 2003

Código da vinha Região Local Código da Quinta Casta

1 Vinhos Verdes Melgaço V1 Alvarinho

2 Vinhos Verdes Arcos de Valdevez V2 Loureiro

3 Vinhos Verdes Arcos de Valdevez V2 Vinhão

4 Douro Régua Do1 Tinta Barroca

5 Douro Pinhão Do2 Touriga Franca

6 Douro Sra. da Ribeira Do3 Tinta Barroca

7 Ribatejo Almeirim R1 Periquita

8 Ribatejo Almeirim R2 Tinta Miúda

9 Ribatejo Almeirim R2 Cabernet Sauvignon

10 Alentejo Reguengos A1 Aragonês

11 Alentejo Évora A2 Periquita

12 Douro Cedovim Do4 Mistura

13 Dão Viseu Da1 Cabernet Sauvignon

14 Dão Viseu Da2 Touriga Nacional

15 Alentejo Évora A1 Trincadeira

16 Madeira Câmara de Lobos M1 Boal

17 Madeira Câmara de Lobos M1 Tinta Negra Mole

1.16. Caracterização climática dos anos de estudo

A caracterização geral anual será feita de acordo com as indicações fornecidas

pelo Instituto de Metereologia4, nos períodos entre Setembro a Agosto do ano seguinte.

4 URL do sítio: http://www.meteo.pt; URL da página consultada:

http://www.meteo.pt/InformacaoClimatica/Anos/Anos.htm

139

http://www.meteo.pt/


Fornecem-se adicionalmente as informações específicas para o mês de Setembro de cada

ano.

1.16.1. Setembro de 2000 a Agosto de 2001

A quantidade de precipitação anual (Setembro a Agosto) foi superior aos valores

das normais 1961-90 em todo o território continental, com excepção da região de Faro

onde foi um pouco inferior ao valor normal. Os meses que mais contribuíram para a

quantidade de precipitação anual foram Dezembro, Janeiro e Março. Registaram-se

valores da temperatura do ar superiores aos valores das normais climatológicas em todo o

território continental, excepto na região de Vila Real, onde a temperatura máxima foi

ligeiramente inferior.

1.16.2. Setembro de 2001 a Agosto de 2002

Em Portugal Continental o mês de Setembro caracterizou-se por temperaturas

médias superiores aos valores médios em todas as regiões estudadas. A quantidade de

precipitação esteve acima dos valores normais na região de Lisboa e nas regiões a sul do

rio Tejo, com excepção das regiões de Alvalade e Portalegre. Nas restantes regiões do

território a quantidade de precipitação foi igual ou inferior aos valores médios.

A quantidade de precipitação anual (Setembro a Agosto) esteve abaixo dos

valores médios das normais 1961-90. No ano anterior (2000/01) verificou-se a situação

contrária.

Registaram-se valores da temperatura média do ar ligeiramente inferiores aos

valores das normais climatológicas no interior da região norte e superiores no restante

território, com os maiores desvios positivos na região de Portalegre.

140


1.16.3. Setembro de 2002 a Setembro de 2003

Em Portugal Continental o mês de Setembro caracterizou-se por temperaturas

máximas e médias muito inferiores aos valores médios em quase todo o território.

Os valores da quantidade de precipitação foram muito superiores aos valores médios.

Excederam-se, nalguns locais, os totais mensais e os máximos diários de precipitação até

agora registados em Setembro. A quantidade de precipitação anual (Setembro a Agosto)

esteve acima dos valores médios das normais 1961-90 em todo o território, com excepção

das regiões de Elvas e Beja, onde esteve acima do valor das normais climatológicas.

Registaram-se valores da temperatura média do ar superiores aos valores das normais

climatológicas em todo o território. Registaram-se também, no mês de Agosto, alguns

máximos absolutos da temperatura máxima diária.

O mês de Setembro de 2003 caracterizou-se por temperaturas superiores aos valores

médios em todo o território.

Os valores da quantidade de precipitação foram inferiores aos valores médios em

todas as regiões continentais estudadas.

1.17. Estados de maturação estudados

Durante o período de maturação do bago, entre Junho e Outubro, foram colhidas

amostras em 3 estados de maturação: bago ervilha, pintor e vindima. Os estados de

maturação foram-nos indicados pelos viticultores.

1.18. Total de amostras de uvas analisadas

Na Tabela 3.9 estão indicadas as datas de colheita de todas as amostras usadas

para este estudo.

141


Tabela 3.9. Data de colheita de amostras de uvas em todos os estados de maturação e vinhas

Vinha Bago ervilha Pintor Vindima

2001 2002 2003 2001 2002 2003 2001 2002 2003

1 27-06 04-07 09-07 30-07 28-08 31-07 18-09 12-09 12-09

2 25-06 04-07 09-07 30-07 28-08 31-07 14-09 - 12-09

3 25-06 04-07 09-07 30-07 28-08 31-07 27-09 18-09 24-09

4 13-06 18-06 16-06 23-07 20-07 18-07 17-09 16-09 07-09

5 06-06 18-06 16-06 23-07 20-07 18-07 26-09 24-09 27-09

6 06-06 18-06 16-06 23-07 20-07 18-07 17-09 11-09 07-09

7 29-06 21-06 16-06 01-08 06-08 31-07 21-09 13-09 10-09

8 29-06 21-06 16-06 01-08 06-08 31-07 13-09 13-09 10-09

9 29-06 21-06 16-06 01-08 06-08 31-07 13-09 13-09 10-09

10 29-06 - - 01-08 06-08 31-07 28-09 13-09 -

11 29-06 - - 01-08 06-08 31-07 28-09 13-09 20-08

12 - - - - - - - - 06-10

13 - - - - - - - - 07-10

14 - - - - - - - - 07-10

15 - - - - - - - - 20-08

16 - - - - - - - - 08-09

17 - - - - - - - - 08-09

Salientam-se as seguintes observações quanto à data de recolha das amostras:

• o estado de bago ervilha atingiu-se mais cedo no ano de 2001 comparativamente

aos outros anos. Em 2002 e 2003 não foi possível obter amostras do Alentejo,

situação que se solucionou na recolha de amostras subsequentes;

• O pintor atingiu-se muito tardiamente em 2002 na região dos Vinhos Verdes,

quase com 1 mês de diferença face aos outros anos no mesmo local;

• A vindima da vinha 5 no Douro faz-se aproximadamente 10 dias mais tarde que

as vinhas 4 e 6;

• A casta Vinhão matura mais tardiamente que o Loureiro, e é colhida duas

semanas mais tarde. Em 2002, não foi possível obter amostra de Loureiro devido

a chuvas súbitas que aumentaram o risco de podridão, e as vindimas foram

antecipadas sem aviso;

142


• A data da vindima no Alentejo variou consideravelmente, sendo a vindima mais

tardia feita no ano de 2001.

Na Tabela 3.10 está indicado o número de amostras totais em cada ano, região e

estado de maturação.

Tabela 3.10. Número de amostras analisadas em cada ano, região e estado de maturação

Região Amostras recolhidas

Bago ervilha Pintor Vindima

Tota

l

01 02 03

Tota

l 01 02 03

Tota

l 01 02 03

Tota

l

Alentejo 2 0 0 2 2 2 2 6 2 2 2 6 14

Douro 3 3 3 9 3 3 3 9 3 3 4 10 28

Ribatejo 3 3 3 9 3 3 3 9 3 3 3 9 27

V.Verdes 3 3 3 9 3 3 3 9 3 2 3 8 26

Dão 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2

Madeira 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2

Total 11 9 9 29 11 11 11 33 11 10 16 37 99

1.19. Análise de mostos

Em 2001, foram recolhidas amostras de mostos de uva destinados ao fabrico de

vinho em 3 fases distintas: i) antes da adição comercial de sulfuroso; ii) após adição

comercial de sulfuroso; iii) após início de fermentação. As amostras foram cedidas

por adegas nas regiões de: Vinhos Verdes, na sub-região de Monção e de Arcos de

Valdevez; Douro, no Cima Corgo; Ribatejo, em Almeirim. As amostras foram

retiradas de preferência imediatamente antes do transporte. Quando não foi possível,

as amostras foram refrigeradas até transporte e transportadas para o laboratório nas

mesmas condições que as uvas.

143


Tabela 3.11. Amostras de mosto analisadas em 2001

Sub-região Mosto

Antes SO2 Depois SO2 Depois fermentação

Arcos de Valdevez - 1 tinto

1 branco

1 tinto

1 branco

Almeirim 1 tinto 1 tinto -

Cima Corgo 1 tinto 1 tinto -

Monção 1 branco 1 branco -

2. Plano de amostragem

As amostras são constituídas por 10 cachos de uva colhidos ao longo de dois

transeptos diagonais previamente traçados na vinha, consoante indicado na Figura 3.7.

Figura 3.7. Esquema do plano de recolha de 10 cachos na vinha ao longo de 2 transectos diagonais

A escolha dos locais de amostragem na vinha foi definida à priori. A escolha do

cacho na planta não obedeceu a nenhum critério particular de localização. Foram

colhidos cachos para análise sem podridão aparente, representativos dos estados

144


observados na vinha. Quando foram detectados cachos com podridão, estes foram

colhidos e analisados à parte.

2.1. Colheita dos cachos

Sempre que possível os cachos foram colhidos com tesouras de poda usadas nas

vinhas, tocando o mínimo possível nos cachos. O cacho, ainda preso à vinha, era

colocado num envelope de papel A4 de fole com abertura lateral aberto pela primeira vez

no momento da colheita e com a tesoura de poda cortou-se o engaço. O envelope foi

imediatamente fechado após o acto de colheita.

2.2. Transporte para o laboratório

Os envelopes fechados foram colocados numa arca refrigeradora com

termoacumuladores e transportados de carro até ao laboratório. O tempo que decorreu

entre a colheita dos cachos e a chegada ao laboratório foi entre 1 a 6 horas. As amostras

colhidas na ilha da Madeira foram colocadas em caixas rígidas e transportadas de avião,

num intervalo de 3 a 4 horas entre a colheita e a chegada ao laboratório.

3. Enumeração de fungos filamentosos

Para detecção de fungos nas uvas, usaram-se métodos de plaqueamento. Usaram-se

placas de Petri de plástico, triplamente ventiladas para permitir aerificação, de 94 mm de

diâmetro e 16 mm de altura, estéreis, da Greiner (referência 633180). Usaram-se dois

procedimentos: plaqueamento directo das uvas sem desinfecção superficial e com

desinfecção superficial, que se descrevem de seguida:

145


Plaqueamento directo sem desinfecção superficial. De cada cacho, foram

seleccionados aleatoriamente 5 bagos, cortaram-se ao meio e colocaram-se

assepticamente em placas de Petri com meio de cultura (Figura 3.8). O processo decorreu

à chama, com bisturi e pinça flamejados.

Plaqueamento directo com esterilização superficial. De cada cacho, foram

seleccionadas aleatoriamente 5 bagos, colocados num matraz de 250 ml. Adicionou-se

uma solução de lixívia comercial com 4% de cloro diluída 10 vezes até perfazer 250 ml,

mexendo com uma pinça durante alguns segundos. Cobriu-se com um vidro de relógio e

deixou-se estar durante 2 minutos, agitando algumas vezes. No fim deste tempo,

decantou-se a solução e plaquearam-se as uvas imediatamente, conforme recomendado

por Pitt e Hocking (1997).

Meio de cultura. O meio de cultura para isolamento usado foi DRBC, Dichloran Rose

Bengal Chloramphenicol agar (Oxoid CM727). O DRBC é um meio de cultura adequado

à análise de fungos filamentosos em alimentos frescos com elevada actividade de água

como frutos (Pitt & Hocking, ob. cit.). Este meio contém rosa de bengal e diclorano, que

restringem o crescimento dos fungos sem afectar a germinação. A combinação destes

inibidores restringe o crescimento de espécies fúngicas de crescimento galopante, como

Rhizopus e Mucor, que tem um crescimento muito rápido reduzindo o tempo de vida da

placa de isolamento. No entanto, com a presença de uvas no meio de cultura, nem sempre

foi possível controlar o crescimento destes fungos (Figura 3.9). A presença de

cloranfenicol previne o crescimento de bactérias. Este meio é fototóxico (Chilvers et al.,

1999) e foram tomadas precauções no sentido de minimizar a sua exposição à luz.

Condições de incubação. As placas foram incubadas no escuro numa estufa a 25 ºC,

aproximadamente 7 dias, voltadas para cima, não seladas.

Detecção e registo de fungos filamentosos observados. A partir do 2º dia de incubação,

as placas foram monitorizadas diariamente ou de dois em dois dias ao estereomicroscópio

para a presença de fungos filamentosos. Sempre que possível, a identificação até ao

146


género era feita ao estereomicroscópio, com base na presença de estruturas de reprodução

especializadas, e o género presente registado na placa, conforme indicado na Figura 3.8.

Figura 3.8. Placa de isolamento com 5 dias de incubação onde se observam fungos do género Penicillium a

crescer em uvas

Figura 3.9. Placa de isolamento ao fim de 5 dias de incubação invadida por Rhizopus sp.

Sempre que se detectou micélio estéril, as placas foram colocadas debaixo de luz

negra para induzir a esporulação, numa dispositivo desenhado para o efeito. A presença

de micélio estéril não foi registada, visto que nenhuma informação pode ser inferida

acerca da presença destes fungos. A informação dos géneros detectados em cada bago é

147


possível através duma referência na tampa da placa e base da placa, que se faz coincidir.

Desta forma, no final do tempo de incubação, o número de partículas em que foi

detectada a presença de cada espécie é registado. No caso de placas contaminadas com

fungos de crescimento rápido como Mucorales, quando não foi possível avaliar o número

de bagos colonizados, considerou-se por defeito 1 bago colonizado com a espécie

invasiva.

3.1. Isolamento de fungos das uvas

Exemplares representativos de cada género, géneros não identificados, e todos os

exemplares de Aspergillus e Penicillium foram isolados com agulha, à chama. Nalguns

casos o processo realizou-se ao estereomicroscópio. O inóculo foi transferido com uma

agulha esterilizada à chama duma área jovem da colónia para meios de malte (MEA),

aveia (OA), agar de Czapek (CZ), agar de Czapek com extracto de levedura (CYA) ou

água da torneira (TWA) com papel de filtro, conforme o grupo taxinómico, como

indicado na Tabela 3.12. A pureza da colónia obtida foi verificada por inspecção visual

cuidada ao estereomicroscópio.

Tabela 3.12. Meios de cultura em que foram isolados os fungos dos diferentes grupos taxonómicos

detectados

Grupo taxonómico Meio de cultura

Ascomycetes (Neurospora, Chaetomium) OA, TWA com papel de filtro

Aspergillus CZ, CYA

Coelomycetes OA

Dematiáceos OA

Eurotium CYA20S, M40Y

Fusarium TWA com papel de filtro

Penicillium MEA

Zygomycota MEA

148


3.2. Meios de cultura usados no isolamento de estirpes

A formulação dos meios de cultura MEA, CZ, CYA, CYA20S será apresentada na

secção 3.5 do presente capítulo. A formulação dos meios OA e TWA com papel de filtro

encontra-se descrita no livro de Santos et al. (1998). A formulação de M40Y é indicada

no catálogo da colecção de culturas alemã DSMZ na lista de meios de cultura (M40Y:

meio nº 187) que pode ser acedido electronicamente5. Esterilizaram-se os meios de

cultura a 121 ºC, 15 minutos na autoclave.

• OA:meio de agar com aveia

30 g de flocos de aveia

15 g de agar Nº3 (Oxoid L13)

Água destilada

Cozer os flocos de aveia em lume brando durante cerca de 2 horas. Filtrar por um pano de algodão

fino. Medir e completar o volume com água até perfazer um litro. Acrescentar o agar e esterilizar.

• M40Y: meio para fungos osmofílicos

400 g de sacarose (extra pura, Merck)

20 g de extracto de malte (Oxoid, L39)

5 g de extracto de levedura (Difco 212750)

20 g de agar Nº3 (Oxoid L13)

1l de água destilada

• TWA com papel de filtro: meio de agar com água da torneira com papel de

filtro

15 g de agar Nº 3 (Oxoid L13)

papel de filtro

1l de água da torneira

5 URL: http://www.dsmz.de/media/media.htm (acedido em 12/02/05)

149

http://www.dsmz.de/media/media.htm


Autoclavar a água com o agar. À parte, cortar e esterilizar rectângulos de papel de filtro. Após o

meio vertido nas placas solidificar, adicionar um rectângulo de papel de filtro.

3.3. Conservação das estirpes isoladas

Estirpes representativas dos géneros encontrados, das espécies de Penicillium

identificadas e todas as estirpes de Aspergillus isoladas foram conservadas, para

construção duma colecção de fungos isolados de uvas portuguesas para documentação e

futuros estudos. A conservação de estirpes dos grupos encontrados não apresenta

dificuldades de maior visto que produzem abundantemente esporos. Inicialmente, as

estirpes isoladas foram conservadas em gel de sílica ou em tubo com meio de cultura a 4

ºC, conforme descrito por Santos (2004). Mas rapidamente se verificou que para o

número de estirpes isoladas, estes métodos eram muito dispendiosos em termos de

espaço. Como tal, adoptou-se por conservar as estirpes a – 80 º C.

3.3.1. Conservação a –80 ºC

Material: Glicerol (p.a., aproximadamente 87%, Merck)

Frascos universais de vidro de 30 ml

Pipetas Pasteur de vidro estéreis

Criovials de 2 ml (Nalgene)

Canetas de frio

Missangas

Cryo Freezing Container (Nalgene)

2- propanol (p.a., Merck) Criovials com missangas. As missangas foram adquiridas em casas comerciais. Lavaram-se

abundantemente com água corrente e deixaram-se numa solução de ácido clorídrico a 2% durante a noite.

No dia seguinte, foram novamente lavadas com água corrente, mergulhadas em água destilada, e de seguida

foram secas numa estufa. Depois de completamente secas, foram autoclavadas em frascos de vidro

150


transparente a 121 ºC, 15 minutos. Os crivials foram enchidos até ¼ da sua capacidade com as missangas

numa câmara de fluxo laminar, e fechados.

Frascos com glicerol. Autoclavaram-se alíquotas de 10 ml duma solução de glicerol 10% em

frascos de vidro de 30 ml.

Procedimento: Duma cultura pura em placa, de aspecto saudável e bem esporulada, faz-se uma suspensão de

esporos em glicerol a 10% previamente esterilizado a 121 ºC, 15 minutos, da seguinte forma: com uma

pipeta Pasteur estéril, coloca-se aproximadamente 1 ml da solução de glicerol numa área da colónia. A

solução fica em forma de gota, devido à hidrofobicidade dos esporos, e com a pipeta Pasteur, soltam-se

os esporos dessa área raspando a ponta da pipeta na colónia, e aspira-se de seguida a suspensão.

Coloca-se a suspensão em criovials de 2 ml contendo missangas previamente lavadas e esterilizadas

até ¼ do frasco, a cobrir as missangas. Colocam-se os frascos no Cryo Freezing Container, um

recipiente com 2-propanol que permite o arrefecimento dos criovials a uma taxa controlada de 1 grau

por minuto na arca a -80 ºC. Para obter a estirpe no estado activo, retira-se os criovials da arca,

mantêm-se no recipiente gelado até manuseamento, aquece-se a porção superior das missangas com o

calor das mãos e, com ajuda duma agulha esterilizada, retira-se uma missanga para uma placa com

meio de cultura voltando a congelar o frasco. Desta forma, um criovial permite vários

rejuvescenimentos (Figura 3.10). A técnica mostrou-se eficaz, visto que todas as estirpes

rejuvenescidas estavam viáveis. Por cada estirpe, foram guardados dois criovials, para fazerem parte

do banco de células de trabalho (BT) e banco de células de colecção (BC). No caso de culturas que não

esporulam abundantemente, cortou-se o meio de cultura com fungo crescido e colocam-se porções no

criovial com a solução. Neste caso, um criovial serve para um rejuvescenimento, e foram guardados 6

criovials, 3 em cada banco.

Figura 3.10. Cultura de Aspergillus rejuvenescida a partir da missanga (centro da colónia) dum criovial a

-80 ºC

151


3.3.2. Conservação em gel de sílica (Santos, 2004)

Material: Frascos universais de 30 ml

Silica gel

Leite desnatado em pó (Oxoid, L31)

Pipetas Pasteur de vidro

Procedimento: Prepara-se uma solução de leite desnatado a 5% e autoclava-se a 121 ºC durante 5

minutos. Enchem-se os frascos com silica gel até ¼ e esterilizam-se por calor seco a 180 ºC,

durante 3 horas. No dia antes da conservação, colocam-se os frascos no congelador a -20 ºC. As

culturas e leite desnatado colocam-se no frigorífico a 4 ºC.

A partir dum tubo com uma cultura esporulada, prepara-se uma suspensão de esporos e

adiciona-se a um frasco arrefecido com sílica seco e esterilizado. Deixa-se secar na estufa com

tampa ligeiramente desarrolhada a 25 ºC, durante 10 a 15 dias. Quando bem seco, fecha-se e

guarda-se num ambiente seco com indicador de humidade.

3.3.3. Conservação a 4 ºC (Santos, 2004)

Material:

Tubos de 12 ml (Greiner, 164161)

Meio de cultura

Procedimento Crescem-se culturas em tubo e após esporuladas, colocaram-se a 4 ºC.

3.4. Segurança e higiene no laboratório de micologia

As recomendações sobre regras de higiene e cuidados a ter no laboratório de

micologia de Santos et al. (1998) foram seguidas. Especial atenção foi tomada aos ácaros,

152


pequenos aracnídeos que podem estar presentes em materiais vegetais. Após

plaqueamento das uvas, todas as placas são inspeccionadas ao estereomicroscópio, e o

restante material vegetal processado ou descartado, e as bancadas do laboratório

cuidadosamente limpas com álcool a 70% e pulverizadas com lixívia comercial diluída

10 vezes. Se ao fim de 2 dias for detectada a presença de ácaros em alguma placa, esta e

as placas vizinhas ficam de quarentena, numa tina com água, para prevenir a

contaminação de outras placas, até ao fim do tempo de incubação.

No final do tempo de incubação, as placas de isolamento e culturas foram

autoclavadas a 121 ºC, 20 minutos.

3.5. Identificação e caracterização dos fungos

A identificação dos fungos baseou-se na microscopia óptica das estruturas

reprodutoras especializadas, sexuais e assexuais, e na morfologia da colónia. No entanto,

para a caracterização de estirpes de Aspergillus secção Nigri, usou-se SEM. Na

caracterização de algumas estirpes de Penicillium, usou-se o perfil de metabolitos

secundários em TLC.

3.5.1. Observação da morfologia das culturas

As culturas foram observadas ao estereomicroscópio (Leica MZ125, com sistema

de iluminação Leica CLS 150X). Para registar as cores da colónia, usou-se o código de

cores do livro de cor Methuen (Kornerup & Wanscher, 1978).

3.5.2. Condições de cultivo para identificação até ao género

Os fungos foram identificados até ao género tipicamente ao fim de 7 dias, ou até

que surjam estruturas reprodutoras. As placas foram incubadas na estufa a 25 ºC no

153


escuro, voltadas para cima, não seladas. Em alguns casos, para induzir a esporulação, as

placas foram colocadas debaixo de luz negra, em ciclos de 12 horas.

3.5.3. Condições de cultivo para a identificação de Aspergillus e

Penicillium até à espécie

A identificação de Aspergillus até à espécie foi conduzida em CZ, ao fim de pelo

menos 10 dias. Os teleomorfos de Aspergillus foram identificados em CY20S, ao fim de

15 dias. A identificação de Penicillium foi conduzida em CZ e MEA, ao fim de 7 a 9

dias. A formulação de MEA, CYA e CYA20S pode ser encontrada no manual de

identificação de Aspergillus de Klich e Pitt (1988). Autoclavou-se os meios de cultura a

121 ºC, 15 minutos.

• MEA: meio de agar com extracto de malte

20 g de extracto de malte (Oxoid L39)

1 g de peptona (Oxoid )

22 g de glucose monohidratada (para fins bioquímicos, Merck)


1 l de água destilada

• CYA: agar de Czapek com extracto de levedura



1 g de K2HPO4

10 ml de concentrado de Czapek



Concentrado de Czapek (com metais vestigiais)

30 g de NaNO3 (p.a., Merck)

154


5 g de KCl (p.a., Merck)

5 g de MgSO4.7H2O (grau para biologia molecular, Calbiochem)

0,1 g de FeSO4.7H2O (p.a., Merck)

0,1 g de ZnSO4.7H2O (extra puro, Merck)

0,05 g de CuSO4.5H2O

100 ml de água destilada

• CYA20S: agar de Czapek com extracto de levedura e sacarose a 20%

1 g de K2HPO4

10 ml de concentrado de Czapek





3.5.4. Preparação das estruturas para observação ao microscópio óptico

Após observar as culturas ao estereomicroscópio e verificar a sua pureza, as

estruturas reprodutoras foram localizadas e com uma agulha esterilizada à chama, retirou-

se material duma área em esporulação activa. O líquido de montagem mais

frequentemente usado nas preparações microscópicas foi o azul de algodão, mas

ocasionalmente foram usados a lactofucsina e o azul de lactofenol. Ao fazer preparações

microscópicas de culturas muito esporuladas (v.g., Aspergillus e Penicillium), lavou-se

previamente o material a observar com álcool a 96%, para remoção dos esporos. Quando

foi necessário observar ao microscópio as estruturas reprodutoras imobilizadas, usou-se a

técnica da fita-cola, que consiste em pressionar a superfície adesiva de fita-cola contra a

colónia, colocá-la numa lâmina voltada para cima, aplicar uma gota de solução corante e

cobrir com uma lamela.

O microscópio usado foi um Leica DMR, que permite observação tanto de campo

claro como de contraste diferencial de interferência (também conhecido como

microscópio de Nomarski).

155


3.6. Manuais de identificação

Os manuais de referência para cada grupo de fungos estão indicados na Tabela

3.13. Os fungos foram identificados com base em manuais especializados em micologia

alimentar e do solo, visto que o solo é o reservatório de quase todos os fungos.

Tabela 3.13 Manuais de identificação usados para identificação dos Ascomycota e Zygomycota detectados

Manuais de identificação Grupo de fungos

Pitt & Hocking, 1997 Geral para fungos em alimentos

Domsch et al. (1993) Fungos do solo

Barron (1968) Fungos do solo

Ellis (1971) Dematiáceos

Raper & Fennell, 1965; Pitt &

Hocking, 1988

Aspergillus e teleomorfos

Pitt (1979; 1988) Penicillium e teleomorfos

von Arx (1980) Géneros que esporulam em cultura pura

3.7. Preparação de Aspergillus para observação ao SEM

Foram usados dois procedimentos para preparação de amostras para observação

ao SEM. Inicialmente, fixaram-se as amostras com tetróxido de ósmio, lavaram-se e

desidrataram-se através duma série progressiva de soluções de álcool a 25%, 50%, 75%,

95% e 100%. Secaram-se as amostras num excicador, montaram-se nos suportes,

cobriram-se com ouro, e foram observadas de imediato ao SEM. Exemplos de imagens

obtidas por este processo são as fotografias de SEM do capítulo 2 (V. capítulo 2, Figura

2.7, p. 107). Mais tarde, confirmou-se que, tal como mencionado por Kozakiewicz

(1989), que estes passos são desnecessários visto que os esporos são estruturas

naturalmente desidratadas. Como tal, esfregaram-se os suportes com fita de carbono em

áreas esporuladas de culturas de CZ com um mês de idade, cobriram-se de ouro e

observaram-se imediatamente. As imagens de SEM apresentadas no capítulo 3

156


(Resultados) foram todas obtidas pelo último processo mencionado. O SEM usado foi um

Leica Cambridge S360.

3.8. Confirmação da identificação de Aspergillus secção Nigri

Estirpes representativas de Aspergillus negros foram enviadas para confirmação

pela perita Dra. Zofia Kozakiewicz (representante do Reino Unido da ICPAS) e para

análise molecular (grupo do Dr. Javier Cabañes). Os resultados foram consistentes no que

diz respeito à distinção das espécies unisseriadas, agregado A. niger e A. carbonarius.

3.9. Diferenciação de Penicillium

Visto que a identificação de Penicillium não foi feita com recurso a técnicas

moleculares, o nome da espécie (v.g., P. miczinskii, P. simplicissimum) diz respeito ao

sentido lato.

A distinção entre P. glabrum e P. spinulosum não foi feita, visto que tal como

descrito, se verificou que as duas espécies formam uma interface (Pitt, 1988). Algumas

estirpes foram facilmente identificadas como P. glabrum ou P. spinulosum, mas outras

não puderam ser atribuídas a uma das espécies com segurança. Como tal, optou-se por se

apresentar os dados respeitantes ao grupo P. glabrum/P. spinulosum, tendo em

consideração que a distinção entre estas duas espécies não se considera relevante até ao

momento da escrita desta dissertação no que diz respeito à produção de micotoxinas, e

que as duas espécies são muito próximas e partilham requisitos ecofisiológicos

semelhantes (Pitt et al., 1990).

157


3.10. Perfis de metabolitos secundários de estirpes de

Penicillium

As culturas foram crescidas em YES durante 7 dias, e analisadas de acordo descrito

por Paterson e Bridge (1994) e Abrunhosa (2001): foram retiradas 3 cilindros de agar

com um fura-rolhas de 4 mm de diâmetro, e aplicados numa placa de TLC (sílica gel 60

em folhas de alumínio, Merck, Lisboa, Portugal). A fase móvel foi tolueno/acetato de

etilo/ácido fórmico (5:4:1, v/v/v). Os solventes usados são de grau para HPLC e foram

adquiridos da Merck. A formulação do meio YES é descrita de seguida:

• YES: meio de agar com extracto de levedura com sacarose





Esterilizar a 121 ºC, 15 minutos.

O extracto de levedura foi adquirido preferencialmente da Difco com base nos

trabalhos de Filtenborg e colaboradores (1990), que verificaram que esta marca de

extracto de levedura era mais adequada à análise de metabolitos secundários.

3.11. Fotografias dos espécimens identificados

As fotografias dos espécimens foram tiradas com um máquina digital de 3,3

Megapíxeis (JVC GC-X3). Quando necessário, foi feito tratamento de imagem no Corel

Photo Paint para correção de luminosidade e cor.

158


4. Avaliação da capacidade ocratoxigénica das estirpes de

Aspergillus

Para avaliar o potencial ocratoxigénico das estirpes de espécies de Aspergillus

descritas como produtoras de OTA, usou-se o meio CYA. Para verificar se a capacidade

produtora se mantinha em uva, fez-se um rastreio a um número representativo de estirpes

produtoras e não produtoras de OTA em CYA em meio com extracto de uva (GJ50).

4.1. Estirpes analisadas

A lista de estirpes analisadas, com código, espécie, data de isolamento e amostra de

uvas donde foi isolada (origem) encontra-se no anexo II. O número de estirpes analisadas

de cada espécie entre 2001 e 2003 por plaqueamento directo está indicado na tabela 4.2

do capítulo 4 (p. 202).

4.2. Reagentes químicos e materiais

Os solventes usados foram de grau HPLC e foram fornecidos pela Merck (Lisboa,

Portugal). Os filtros de seringa usados têm 0,45 µm de poro (Acrodisc). Os frascos para

conter as amostras são de cor de âmbar de 4 ml com tampas de teflon (Supelco). Antes da

injecção no cromatógrafo, as amostras foram transferidas para frascos brancos de 2 ml

(Chromacol). Na formulação dos meios de cultura, foram usados os mesmos reagentes

indicados na secção anterior.

4.3. Rastreio de produção de OTA pelas estirpes

As estirpes de Aspergillus foram isoladas em CYA, e a produção de OTA foi

testada no mesmo meio, preferencialmente na placa de isolamento, após verificação

159


cuidada da pureza da cultura ao estereomicroscópio. A capacidade das estirpes

produzirem OTA num meio à base de extracto de uva (GJ50) também foi testada. A

formulação do meio GJ50 descreve-se de seguida:

• GJ50: meio de agar com extracto de uva a 50%

500 ml de extracto de uva

20 g de agar N º 3 (Oxoid L13)

500 ml água destilada

Preparação do extracto de uva:

1-2 kg de uvas

Homogeneizar as uvas na misturadora cerca de 1 minuto. Centrifugar o homogeneizado a

8500 r.p.m. durante 5 minutos. Decantar o sobrenadante. Colocar o sobrenadante a 4 ºC durante a

noite para estabilizar. Filtrar por filtros de microfibra de vidro de 1,5 µm de poro e de 110 mm de

diâmetro (Whatman). Medir 500 ml. Autoclavar a 90 ºC, 30 minutos.

Autoclavar a água e o agar a 121 ºC, 15 minutos. Adicionar os 500 ml de extracto de uva e

autoclavar novamente a mistura a 102 ºC, 5 minutos.

O método usado para rastreio da capacidade de produção de OTA pelas estirpes foi

o de Bragulat et al. (2001), e consiste no seguinte: as estirpes foram inoculadas em CYA

e incubadas a 25 ºC, no escuro, durante 7 dias. Ao fim do tempo de incubação, retiraram-

se com um fura-rolhas 3 cilindros de agar de 3 áreas da colónia distintas: próximo do

centro, meio da colónia e próximo da periferia. Os cilindros de agar foram colocados em

frascos com 500 µl de metanol. Ao fim de 1 hora, o metanol foi filtrado e evaporado a ca

de 50 ºC com corrente de azoto. O resíduo foi ressuspendido em fase móvel e injectado

no HPLC. A OTA nas amostras foi determinada e confirmada conforme descrito nas

secções 7.7 e 7.8, respectivamente. O limite de detecção deste método foi de 0,1 µg OTA

por kg de cilindros de agar (peso fresco).

160


4.4. Ensaio interlaboratorial

Foram fornecidas a 6 laboratórios (incluindo o nosso) 4 estirpes, sem informações

sobre a espécie, para que o teor de OTA nas culturas fosse determinado. O resultado da

identificação coincidiu com a identidade das estirpes determinada pela Dra. Z.

Kozakiewicz, e o resultado quanto à determinação de OTA obtido no nosso laboratório

(P4) foi concordante com o de 3 dos laboratórios (Tabela 3.14).

Tabela 3.14. Resultado do ensaio interlaboratorial quanto à detecção da OTA produzida por 4 estirpes (P4:

resultados obtidos no nosso laboratório)

Nº Espécie Teor de

OTA

P1 P2 P4 P7 P8 P10

1 Agregado A. niger Muito baixo OTA- OTA- OTA- OTA- OTA- OTA+

2 A. carbonarius Elevado OTA+ OTA+ OTA+ OTA+ OTA+ OTA+

3 A. aculeatus Baixo OTA- OTA- OTA- OTA- OTA- OTA+

4 Agregado A. niger Negativo OTA- OTA- OTA- OTA+ OTA- OTA+

O laboratório P10 usou um método de HPLC diferente dos restantes laboratórios e

não efectuou a confirmação por derivatização com BF3 conforme descrito na secção 7.8,

o que pode justificar a ocorrência de falsos positivos.

5. Construção duma base de dados para documentação da

micoflora das uvas

À medida que as amostras de uvas foram analisadas quanto à sua micoflora e as

estirpes isoladas e avaliadas quanto à produção de OTA, tornou-se necessário um sistema

de informação que permitisse registar os dados resultantes da análise micológica das

uvas, bem como facilitar o acesso à informação nele depositada. No entanto, criar um

sistema de registo de informação apresenta uma dificuldade inata: seleccionar a

informação a registar. Dados não registados implicam perda de conhecimento, mas

161


registar tudo é impraticável. Nesta secção, explana-se o processo de conceptualização da

base de dados, os modelos e ferramentas usados, e a aplicação desenvolvida. A base de

dados é um repositório de informação sobre a micoflora das uvas, que permite

posteriormente a realização de análises estatísticas ou exploração informática aos dados

nela registados, descritos no capítulo seguinte.

5.1. Software

A base de dados foi elaborada recorrendo ao Microsoft Access XP, e os

formulários de interacção foram elaborados com recurso a uma aplicação desenvolvida

no Microsoft Visual Basic versão 6.

5.2. Modelo da base de dados

A base de dados foi desenvolvida com base no modelo entidade-relação (E-R)

(Teorey, 1999). Neste modelo, a informação encontra-se estruturada em entidades, que

correspondem a um dado tema ou assunto (v.g., proveniência das uvas). As entidades

associam-se através do estabelecimento de relações. Cada entidade tem várias

características, designadas de atributos (v.g., nome da quinta, casta de uvas). A

informação respeitante a uma entidade é registada numa tabela. Os atributos são os

campos da tabela. Os campos duma tabela podem ter vários valores, ou seja: o atributo

“casta de uvas” pode ser ter o valor Loureiro, Vinhão, Tinta Barroca, etc. Os atributos

numa tabela são de dois tipos: identificadores e descritivos. Os campos identificadores ou

chaves (campos id) permitem a identificação única duma instância da entidade. O

atributo identificador da tabela chama-se chave primária. Através das chaves, as tabelas

podem ser relacionadas, bem como os registos respeitantes a uma dada instância. Os

atributos descritivos especificam características que não são únicas duma dada instância

(v.g., nome da quinta, casta de uvas). As relações entre as tabelas podem ser de um para

um, um para muitos ou muitos para muitos. Para mais informações sobre a

162


conceptualização, implementação e gestão de bases de dados, dever-se-á consultar

(Connolly et al., 1998).

Figura 3.11. Exemplo de duas entidades relacionadas num modelo E-R. A entidade região de origem das

uvas (designada por “Regioes”) é uma tabela com 3 atributos: 1 identificativo (id_regiao) e dois

descritivos: o nome da região (cujo valor pode ser Alentejo, Dão, Douro, Madeira, Ribatejo ou Vinhos

Verdes) e observações (v.g., sul de Portugal). A entidade “Locais” liga-se à entidade “Regioes” com uma

relação de 1 para muitos, pois uma região pode ter vários locais. A entidade “Locais” possui dois atributos

chave: um atributo identificativo (id_local) e um atributo identificativo da tabela regiões, que permite fazer

a ligação entre os dados das duas tabelas. Possui dois atributos descritivos: o nome do local (v.g., EVAG) e

observações (v.g. em Arcos de Valdevez)

5.3. Estrutura da base de dados

A base de dados foi feita para responder a questões como:

• Quais os fungos encontrados numa dada região no bago ervilha no ano de

2002?

• Qual o local, região ou ano em que foram encontrados mais espécies de

Aspergillus?

• Qual a origem das estirpes isoladas?

• Quantas estirpes foram isoladas da quinta A?

• Quantos produtores de OTA foram encontrados?

Com base nas perguntas a que se queria dar resposta, seleccionaram-se os temas e

atributos a registar. Os principais temas considerados são: i) origem das uvas; ii) a placa

163


de isolamento; iii) as espécies detectadas e iv) as estirpes isoladas. A estrutura da base de

dados é apresentada de seguida centrada em cada um destes temas.

As relações entre as tabelas podem ser observadas na Figura 3.12. Todas as tabelas

têm campos de observações, que permitem registar informações relevantes não indexadas

noutros campos.

5.3.1. Origem das uvas

Para a amostra ser identificada, necessita de informação sobre a sua origem,

estado de maturação e data de colheita. O estado de maturação e a data da colheita estão

ligados à placa de isolamento (secção seguinte). A tabela que contém informações sobre a

origem das uvas, designada por proveniência das uvas (Figura 3.12), está relacionada

com as tabelas que contêm informação sobre o local (quinta) e casta das uvas. Como um

local pode ter várias castas, e a mesma casta ser estudada em vários locais, a relação entre

as duas tabelas é de muitos para muitos, e faz-se com recurso a uma tabela de ligação

(castas por quintas). A tabela local relaciona-se com a tabela regiões (Figura 3.11). Além

dos atributos identificativos, a tabela proveniência das uvas têm mais dois atributos:

UvaRaquis, um campo binário que especificava se a amostra provinha de bagos de uva

ou de ráquis (os resultados apresentados dizem respeito a dados de bagos de uva), e

amostra, que indica qual o ponto de amostragem onde foi colhido o cacho.

5.3.2. Placa de isolamento

A placa de isolamento cruza informações sobre a origem das uvas, estado de

maturação das uvas e data de colheita, e os fungos detectados nas amostras. A cada placa

de isolamento foi dado um código. O código reflecte a data de isolamento, região, local e

ponto de amostragem, consoante indicado na Figura 3.13.

164


165

Quando existe mais que uma casta por local, a casta faz parte do código (v.g.,

para uma amostra da região dos Vinhos Verdes, da EVAG, casta Loureiro, ponto de

amostragem 6, o código é: 25/6VVEVAL6).

As informações que se obtêm da placa de isolamento estão estruturadas na tabela

“Amostragens”. Esta tabela possui campos identificativos que lhe permitem relacionar-se

com a proveniência das uvas e com o meio de cultura (campo “meios”) e procedimento

usado para detecção de fungos filamentosos (campo “metodos”). Possui um campo

identificativo próprio (id_amostragens) e o código atribuído manualmente. No campo

data, é introduzida a data da amostragem (dia/mês/ano). Relaciona-se com a tabela

maturação, onde estão indicados os estados de maturação analisados.

5.3.3. Espécies

A informação que se considerou relevante quanto às espécies foi o nome,

micotoxinas produzidas, propriedades e habitats. As espécies detectadas em cada placa de

isolamento estão ligadas à tabela “amostragens” pela tabela de ligação

“EspeciesPorAmostragem”, onde o nº de bagos colonizados por cada espécie fica

registado.

5.3.4. Estirpes isoladas

As estirpes isoladas estão ligadas à placa de isolamento e, portanto, partilham de

todas as informações sobre a origem e processo de isolamento. Estão relacionadas com a

espécie, e tem campos de informação adicional sobre: i) data de isolamento; ii) produção

de OTA; iii) confirmação da identificação; iv) código. O código é constituído pelos dois

últimos dígitos do ano de isolamento, por um U, que indica que a estirpe derivou de uvas,

seguido de iniciais do género e de um número de ordem sequencial (Figura 3.14)


166

Figura 3.12. Modelo conceptual da base de dados. As entidades estão representadas em tabelas (caixas azuis). O nome da tabela está indicado a branco com

fundo azul no topo da caixa. Os atributos estão listados nos espaços brancos. O atributo identificativo (chave primária) está a negrito. As relações entre as tabelas

estão representadas por uma linha negra. O 1 e ∞ indicam que a relação é de um para muitos


6/6 DC2Data de colheita

Ponto de amostragem

Local

Região

6/6 D 2CData de colheita

Ponto de amostragem

Local

Região

6/6 D 2CData de colheita

Ponto de amostragem

Local

Região

Figura 3.13. Código de uma amostra de uvas de bago ervilha (colhida em 6 de Junho) proveniente do

Douro, local Do2 (C é a sigla da Quinta), que corresponde ao ponto de amostragem 2

01UAs363Ano 2001

Uvas

rgillus

Número de estirpe

Aspe

01U 363AsAno 2001

Uvas

rgillus

Número de estirpe

Aspe

Figura 3.14. Código duma estirpe de Aspergillus isolada de uvas em 2001. O código de estirpe é

constituído pelo ano de isolamento, inicial do material de onde foi isolado, siglas do género de fungo, e

código sequencial para a estirpe

Formulários

Para introduzir informação na base de dados, foi criada uma aplicação em Visual

Basic disponibilizando vários formulários. Um formulário serve para criar registos numa

tabela. A sequência de preenchimento dos formulários acompanha o processo de análise

das uvas: após ter sido criado o registo dos métodos, meios e origem das uvas, preenche-

se o formulário respeitante à amostragem (Figura 3.15). Em seguida, cria-se o registo

para as espécies, e adicionam-se à lista de espécies detectadas, juntamente com o número

de bagos colonizados. Depois destes registos estarem criados, preenche-se os registos

respeitantes ao isolamento de estirpes, quando existem.

167


Figura 3.15. Formulários usados para inserir registos sobre a placa de isolamento (formulário amostragens,

lado esquerdo), que através do botão isolamentos, dá acesso ao formulário isolamentos, que tem

informação sobre as estirpes

5.4. Questionários

Os questionários foram construídos seleccionando as tabelas e campos de que se

deseja obter informação. Um exemplo da construção dum questionário para saber o

número de bagos colonizados com as espécies de Aspergillus negros Aspergillus niger e

Aspergillus carbonarius nas regiões em 2003 nos estados de maturação analisados está

indicado na Figura 3.16. O resultado do questionário está indicado na Figura 3.17.

A informação obtida dos questionários pode ser exportada directamente para outras

aplicações, como Word, Excel ou SPSS.

168


Figura 3.16. Exemplo da construção dum questionário para saber qual o número de bagos colonizados com

os Aspergillus negros A. niger e A. carbonarius nas regiões em 2003 nos estados de maturação analisados.

Após selecção das tabelas que contêm a informação desejada, seleccionam-se os campos a pesquisar, e a

informação desejada, especificando os critérios

169


Figura 3.17. Resultado do questionário construído conforme representado na Figura 3.16, com o número

de bagos colonizados com Aspergillus niger e Aspergillus carbonarius em 2003 nas regiões nos estados de

maturação estudados

6. Determinação da OTA em uvas

Nesta secção descreve-se o procedimento de validação dum método de extracção de

OTA das uvas. O método de determinação de OTA no mosto foi idêntico ao método de

referência para análise de vinhos.

6.1. Reagentes químicos e materiais

Os solventes usados foram de grau HPLC e foram fornecidos pela Merck (Lisboa,

Portugal). A OTA foi fornecida pela Sigma. Para limpeza da amostra, usaram-se colunas

de imunoafinidade OchraPrep da Vicam (Boston, USA).

170


6.2. Colheita e preparação das amostras

As uvas foram colhidas de acordo com o plano de amostragem definido para a

análise micológica, em que se colheram 10 cachos em diferentes locais da vinha, nas

vinhas definidas. Foram analisados uvas aparentemente saudáveis, sem podridão visível.

Um cacho com podridão visível causada por Botrytis, T. roseum e A. carbonarius

encontrado na vinha 5 em 2002 fora dos pontos de amostragem pré-definidos foi

analisado em separado.

Para propósito de análise de OTA, separaram-se os bagos dos engaços e fez-se uma

amostra global, através da mistura dos bagos de todos os cachos. No total foram

analisadas 66 amostras. As amostras colhidas em 2002 foram congeladas a –20 ºC até à

data da análise.

Os bagos foram homogeneizados numa misturadora (Moulinex) de 1,5 litros de

capacidade durante ca de 10 minutos, com 1 minuto de intervalo cada 3 minutos, para

minimizar o aquecimento. O peso médio das amostras globais no bago verde, pintor e

vindima foi de 0,360, 1,815 e 3,070 kg, respectivamente. Do homogeneisado, retiraram-

se 3 alíquotas de 50 gramas. Uma foi analisada imediatamente e 2 foram congeladas a –

20 ºC, para eventuais réplicas ou estudos confirmatórios.

6.3. Validação de método de extracção de OTA em uvas

Para extracção de OTA das uvas, usou-se a solução de diluição usada no método

de referência de análise de vinhos como solução de extracção. Visto que as uvas têm uma

matriz sólida, foi necessário avaliar se a solução bicarbonada era capaz de extrair

eficazmente a OTA da massa sólida das uvas. Para avaliar o desempenho do método,

fizeram-se amostras com adição de padrão e comparou-se o procedimento de extracção

com outro previamente validado para uvas passas. O método de uvas passas foi

seleccionado visto que se considerou que a matriz é semelhante.

171


6.4. Experiências de adição de padrão

Nas experiências de adição de padrão, fizeram-se 6 réplicas em dias diferentes

para estimar a taxa de recuperação e desvios padrões relativos em condições de

repetibilidade, RSDr, e de reprodutibilidade (precisão intermédia), RSDR. Estas

experiências foram feitas para duas concentrações de OTA, 0,05 µg/kg e 1 µg/kg. A OTA

foi adicionada em 1 ml de metanol a 0,5 kg de uvas homogeneizadas previamente

analisadas e com resultado negativo quanto à presença de OTA no copo da misturadora.

Permitiu-se que a amostra equilibrasse durante 1 hora, e em seguida, misturou-se por ca

de 1 minuto. Retiraram-se 6 alíquotas de 50 g cada. Três foram analisadas imediatamente,

e as outras 3 foram congeladas a –20 ºC para análise noutro dia.

6.5. Comparação dos métodos com uvas naturalmente

contaminadas

Para obter amostras naturalmente contaminadas com OTA, uvas de mesa da casta

Dominga, a que foram inflingidos alguns danos com uma agulha, foram pulverizadas

com uma suspensão de esporos da estirpe de A. carbonarius MUM03.59 na concentração

de 103 esporos/ml. As uvas foram incubadas em caixas de plástico a 25 ºC, durante 3 e 6

dias, para se obterem níveis diferentes de contaminação (Figura 3.18).

172


Figura 3.18. Aspecto das uvas de mesa (casta Dominga) ao fim de 6 dias de incubação após pulverização

com uma suspensão de esporos de A. carbonarius MUM03.59

As uvas naturalmente contaminadas foram analisadas pelos 2 métodos conforme

descrito nas secções anteriores. Para obter várias concentrações, fizeram-se diluições do

material contaminado com homogeneizado de uvas não contaminadas, em diferentes

proporções, para obter 0,5 kg de amostra, e misturou-se ca 1 minuto.

6.6. Extracção com solução bicarbonada e PEG

Colocam-se 50 g de homogeneizado numa proveta de 250 ml e adiciona-se

solução A (5% NaHCO3, 1% PEG 8000) até perfazer 150 ml. Agita-se, e transfere-se a

mistura para tubos de centrífuga de 250 ml e coloca-se em agitação com agitador

magnético durante ca de 30 minutos. Após este período, centrifuga-se a 8500 r.p.m.

durante 20 minutos a 4 ºC. Filtra-se o sobrenadante por um filtro de vidro de 1,5 µm de

110 mm de diâmetro (Whatman 934-AHTM) e recolhe-se o filtrado num cilindro

graduado. Deste filtrado, passam-se 20 ml por uma coluna de imunoafinidade.

173


6.7. Extracção com metanol acidificado

Este procedimento foi descrito para uvas passas (MacDonald et al., 1999) e foi

por nós adaptado para uvas frescas. A adaptação consistiu em: i) omitir o passo de

hidratação, desnecessário em uvas frescas; ii) usar-se a misturadora Moulinex para

homogeneização; iii) diluir-se a mistura com solução A ao invés de PBS.

A 50 g de uvas homogeneizadas adicionam-se 50 ml de metanol e 5 ml de ácido

ortofosfórico 0,1 M na misturadora, e mistura-se durante 2 minutos. Filtra-se a mistura

por um filtro de microfibra de vidro de 1,5 µm de poro e recolhe-se o filtrado num

cilindro graduado. Desse filtrado, diluem-se 12,5 ml a 100 ml com solução A, e passa-se

o extracto diluído na coluna de imunoafinidade.

6.8. Limpeza da amostra por imunoafinidade

O método de referência de limpeza de amostras de vinho que foi usado na análise

do sobrenadante consiste em passar a amostra diluída com solução A pela coluna de IAC

de acordo com as recomendações do fabricante: ajustar o fluxo a uma taxa de 1 a 2 gotas

por segundo, lavar a coluna em seguida com solução B (2,5% NaCl; 0,5% NaHCO3),

seguida de 5 ml de água desionizada.

A OTA foi eluída com 2 ml de metanol, evaporada com uma corrente de azoto e

ressuspendida em 1 ml de fase móvel e a amostra injectada no cromatógrafo.

6.9. Quantificação

Para se determinar a OTA presente por kg de uva, usou-se a seguinte equação:

[ ] [ ]PAVA

VFVOTAOTA amostrauva ×

××= 1 (equação 1)

174


Em que:

[ ]uvaOTA representa a concentração de OTA nas uvas expressa em µg OTA por kg uva;

[ ]amostraOTA representa a concentração de OTA na alíquota da amostra injectada na

coluna determinada de acordo com a curva de calibração, em µg/ml;

V1 é o volume de de fase móvel usado para dissolver o resíduo seco em ml (=1 ml)

VF representa o volume filtrado (ml)

VA representa o volume de filtrado aplicado na IAC (ml)

PA peso da amostra teste (kg)

A OTA na amostra foi detectada e quantificada de acordo com o procedimento

descrito na secção 7.7. Os resultados apresentados derivam da equação 1 e não estão

corrigidos quanto às taxas de recuperação.

7. Avaliação da influência da composição química do estado de

maturação e variedade de uva na produção de OTA

7.1. Estirpe e inóculo

Foi usada para este estudo a estirpe de A. carbonarius MUM03.59, isolada de

mosto de uvas. O inóculo obteve-se a partir duma cultura em MEA incubada durante 5

dias a 25 ºC num tubo inclinado.

7.2. Amostras de uvas

As amostras foram colhidas em 2002, homogeneizadas e autoclavadas a 90 ºC

durante 30 minutos. Foram usadas para este estudo 5 castas nacionais e Cabernet

Sauvignon (Tabela 3.15), para propósitos comparativos.

175


Tabela 3.15. Origem e tipo de castas (branca/tinta) usadas para estudar a influência da casta na produção

de OTA por A. carbonarius

Casta Região de origem Branca/Tinta

Alvarinho Vinhos Verdes Branca

Cabernet Sauvignon Ribatejo Tinta

Loureiro Vinhos Verdes Branca

Tinta Barroca Douro Tinta

Touriga Franca Douro Tinta

Vinhão Vinhos Verdes Tinta

7.3. Determinação da composição de açúcares e ácidos

orgânicos das uvas

A principal variação na composição química das uvas no processo de maturação

diz respeito aos açúcares redutores e à acidez total. O teor destes parâmetros nas amostras

foi determinado por métodos de titulação de acordo com o descrito na regulamentação da

UE Nº 2676/90, 17 de Setembro de 1990, no laboratório de análises da CVRVV.

7.4. Avaliação da produção de OTA nas uvas

Incubação. Colocaram-se 5 g de uvas homogeneizadas em frascos universais de

vidro de 30 ml e inocularam-se os frascos com uma suspensão de esporos de 100 µl. A

suspensão de esporos foi preparada da seguinte forma: adicionou-se água esteril com

0,1% peptona aos tubos com a cultura de A. carbonarius, agitou-se para soltar os esporos

e decantou-se a suspensão para outro tubo estéril. A suspensão de esporos foi lavada e

centrifugada 3 vezes para remover a OTA em solução e ajustada a uma concentração de

106 esporos /ml. Incubaram-se os frascos inclinados, para aumentar a superfície exposta

ao ar, ligeiramente dessarolhados, para permitir trocas gasosas, durante 7 dias. As

experiências foram realizadas em triplicado.

176


Extracção de OTA. No fim do tempo de incubação, a extracção de OTA foi feita com

clorofórmio (Abrunhosa et al., 2002), com as seguintes modificações: a extracção foi

feita uma única vez em vez de duas e quantificou-se a OTA presente em 1 ml de

clorofórmio, em vez de retirar todo o clorofórmio. As modificações foram feitas por duas

razões: i) estimava-se que as concentrações de OTA fossem elevadas, não justificando

uma segunda extracção; ii) durante a mistura de clorofórmio com o meio de cultura,

forma-se frequentemente uma emulsão, que é desfeita com agitação magnética, mas não

completamente. Ao retirar volume de clorofórmio definido, esperava-se eliminar esta

fonte de variação. As taxas de recuperação foram calculadas com base na adição de OTA

a uvas homogeneizadas dos 3 estados de maturação em que não foi detectada OTA, nas

concentrações de 10, 100 e 1000 ng/g. As taxas de recuperação foram calculadas com

base nos resultados de 6 réplicas, 2 por cada estado de maturação. As taxas de

recuperação do método usado para analisar a produção de OTA nas uvas com OTA

adicionada nas concentrações de 10, 100 e 1000 µg/kg foram 56,9%, 74,8% e 79,8%,

respectivamente. O desvio padrão relativo a 10, 100 e 1000 µg/kg foi de 24,3%, 4,9% e

8,1%, respectivamente. Os resultados das amostras são apresentados sem correcção de

cálculos quanto à taxa de recuperação.

7.5. Detecção, quantificação, e confirmação da OTA

Os reagentes usados são de grau analítico e foram adquiridos à Merck. A OTA foi

adquirida na forma cristalizada à Sigma.

7.6. Preparação do padrão de OTA

Foi preparada uma solução stock de 20 µg/l em tolueno- acido acético (99:1) e

mantida a –20 ºC. A concentração de OTA desta solução foi determinada por

espectrofotometria UV a 331 nm segundo a equação 2 e verificada com regularidade,

cada vez que foi preparada uma nova solução de trabalho. A solução de trabalho foi

177


preparada na concentração de 2 µg/l, e a concentração de OTA desta solução foi de novo

verificada por espectrofotometria UV. Da solução de trabalho, foram preparados os

padrões para HPLC.

[ ]δε ×××

=1000max MA

OTA (equação 2)

Em que:

[OTA] representa a concentração de OTA na solução expressa em µg/ml;

Amax é a absorção determinada no máximo da curva de absorção (= 331 nm)

M é a massa molecular relativa da OTA (M=403,8 g/mol)

ε é o coeficiente de extinção molar da OTA nesta mistura de solventes (=5440 m2/mol)

δ é o passo óptico em cm

7.7. Detecção e quantificação por HPLC- FL

A OTA foi detectada e quantificada nas amostras por um HPLC de fase reversa

com um detector de fluorescência. O equipamento de fluorescência usado foi um sistema

Jasco FP-920, ajustado a um comprimento de onda de 330 nm para excitação e 460 nm

para emissão. As separações cromatográficas foram realizadas numa coluna Waters

Spherisorb ODS2 (4,6 mm x 250 mm; 5 µm), equipada com uma pré-coluna com a

mesma fase estacionária e operada a 30 ºC. A fase móvel foi bombeada a uma taxa de 1

ml/minuto e consistiu num programa isocrático de acetonitrilo: água: acido acético

(99:99:2, v/v/v). No caso de amostras derivatizadas com BF3 em metanol, para detecção

do metil-ester da OTA, o fluxo usado foi de 2 ml/minuto. O volume de injecção foi de

100 µl. O software de aquisição usado foi o Varian Star 5.3. As amostras foram

consideradas positivas para OTA quando foi detectado um pico com tempo de retenção

similar ao do padrão de OTA (11 minutos, aproximadamente). A OTA nas amostras foi

quantificada por substituição da ordenada na equação da recta de calibração pela altura

do pico de OTA na amostra, de acordo com a equação 3:

178


y = bx + a (equação 3)

Em que:

y é a altura do pico

b é o declive da recta

x é a concentração de OTA na amostra

a é a ordenada na origem

7.8. Identificação e confirmação da OTA

Em amostras representativas, a identidade da OTA foi confirmada através da adição

de padrão ou da formação do metil-ester da OTA com derivatização por adição de BF3

em metanol (solução a 14%, Sigma), de acordo com o descrito por Hunt et al. (1980): a

amostra foi evaporada completamente, e o resíduo seco ressuspendido em 50 µl de BF3

em metanol, e deixou-se reagir a 65 ºC, durante 15 minutos.

7.9. Calibração

As soluções padrão foram preparadas diariamente em fase móvel a partir da solução

de trabalho como indicado na secção 7.6. Usaram-se 4 concentrações: 0,05; 0,1; 1 e 10

µg/l. As curvas de calibração foram obtidas por regressão linear pelo método dos

mínimos quadrados usando a altura do pico do padrão como resposta à sua concentração.

Os coeficientes de correlação da curva de calibração foram de 0,9999 ou superiores.

O limite de detecção de OTA nas amostras de HPLC foi estabelecido em 0,03 µg/l,

determinado como a soma de a (ordenada na origem, equação 3) com 3 vezes o desvio

padrão dos y-residuais da curva de calibração (Sy/x, equação 4), de acordo com o

recomendado por Miller e Miller (1993).

179


( ) 2

12

2

ˆ

⎪⎭

⎪⎬

⎫

⎪⎩

⎪⎨

⎧

−

−=∑

n

yyS i

ii

xy (equação 4)

Em que:

xyS é o desvio padrão dos y-residuais da curva de calibração;

( 2ˆ ii yy − ) são os y residuais, em que yi é a altura do pico de OTA da amostra duma

concentração conhecida xi, e é o valor calculado de y em que x é substituído por xiy i na

recta de calibração;

n é o número de pontos de calibração.

O limite de quantificação considerado foi a concentração mais baixa do padrão usado

na curva de calibração (0,05 µg/l).

7.10. Procedimentos de segurança

A OTA é um composto tóxico e deve ser manipulada com cuidado e com as medidas

de segurança adequadas. Ao longo deste trabalho experimental usaram-se os

procedimentos de descontaminação para desperdícios laboratoriais aconselhados pela

IARC (Castegnaro et al., 1991) usando hipoclorito de sódio. O material e soluções

aquosas com OTA foram descontaminados com excesso de lixívia comercial, com pelo

menos 5% de cloro, durante a noite.

8. Análise dos dados

De seguida apresenta-se a análise de dados efectuada aos dados da composição da

micoflora das uvas e ao estudo de validação do procedimento de extracção.

180


8.1. Software

O tratamento estatístico dos dados foi realizado no software Statistic Package for

Social Sciences (SPSS) para Windows versão 11.0 e no Microsoft Excel 2000. As árvores

de decisão foram feitas no Waikato Environment for Knowledge Analysis (WEKA)

desenvolvido no âmbito do projecto de aprendizagem máquina da Universidade de

Waikato, na Nova Zelândia. Esta aplicação está disponível na internet gratuitamente e

pode ser adquirido na URL: http://www.cs.waikato.ac.nz/~ml/index.html. O uso desta

aplicação para a criação de modelos preditivos na ciência alimentar já foi sugerido por

Holmes e Hall (2002).

8.2. Testes estatísticos realizados

Verificou-se se as variáveis seguem ou não uma distribuição normal através do

teste de Kolmogorov-Smirnov. Para se avaliar se as variáveis diferem significativamente

usou-se o teste de análise de variância (ANOVA), quando as variáveis seguem uma

distribuição normal, e o teste não paramétrico Kruskal-Wallis H com aproximação ao

teste Chi-quadrado como teste de significância, quando a distribuição não foi normal.

Quando estatisticamente significativas, as diferenças entre grupos foram

localizadas, no caso das variáveis de distribuição normal, através de testes de

comparações múltiplas de pares. Usaram-se os testes de comparações múltiplas de pares

Tukey’s honestly significant difference, quando a variância era homogénea entre grupos, e

Tamhane’s T2, quando a variância não era homogénea. Como teste de homogeneidade de

variâncias, usou-se o teste Levene. Quando as variáveis não seguem uma distribuição

normal, as diferenças foram exploradas pelo mesmo teste não paramétrico para grupos de

2 amostras.

Para investigar eventuais relações lineares entre as variáveis, fizeram-se

correlações bivariadas com o coeficiente de correlação de Spearman, visto que a

distribuição dos fungos nas amostras geralmente não foi normal. As análises estatísticas

foram consideradas significativas quando P<0,05.

181

http://www.cs.waikato.ac.nz/~ml/index.html


8.3. Representação gráfica de estatísticas

Na representação gráfica de estatísticas, foram usados diagramas do tipo caixa

(ing., box plot ou box and whisker plot). No diagrama do tipo caixa estão representadas

graficamente a mediana, o primeiro quartil, o terceiro quartil, os valores máximo e

mínimo, e os outliers e extremos quando existem.

373329N =

321

Peni

cilli

um

55

50

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0-5

Outlier

Valor máximo

Terceiro quartil

Mediana

Primeiro quartil

Valor mínimo

Extremo

373329N =

321

Peni

cilli

um

55

50

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0-5

Outlier

Valor máximo

Terceiro quartil

Mediana

Primeiro quartil

Valor mínimo

Extremo

Figura 3.19. Diagrama do tipo caixa da distribuição do número de bagos colonizados com Penicillium nas

amostras de uvas dos 3 estados de maturação (1, 2 e 3 correspondem a bago ervilha, pintor e vindima,

respectivamente). Estão representadas graficamente a mediana do número de bagos colonizados com

Penicillium nas amostras, o primeiro e terceiro quartil, o valor máximo e mínimo excepto outliers e

extremos. N indica o número de amostras analisadas de cada estado de maturação

182


8.4. Árvores de decisão

Foram usadas árvores de decisão para classificar as amostras quanto à sua origem

geográfica com base na micoflora, e para classificar estirpes de Aspergillus negros com

base no tamanho dos esporos e produção de OTA.

As árvores de decisão são uma das abordagens possíveis para a classificação de items.

Com base nos atributos da amostra (no caso das amostras de uvas, os atributos

considerados foram a incidência dos géneros e espécies de fungos; no caso das estirpes de

Aspergillus negros, os atributos foram o tamanho dos esporos e a produção de OTA), o

algoritmo de classificação selecciona os atributos preditivos, i.e., os atributos que lhe dão

mais informação para a classificação do item na classe pré-definida. No caso da

classificação das amostras de acordo com a sua origem geográfica, as classes pré-

definidas foram as 4 regiões de origem estudadas durante 3 anos: Alentejo, Douro,

Ribatejo e Vinhos Verdes. No caso dos Aspergillus negros, as classes são os taxa

agregado A. niger, A. ibericus, A. carbonarius.

As árvores são constituídas por nós e ramos. Os nós não terminais representam testes

aos atributos preditivos, e os nós terminais (designados de folhas) reflectem as decisões

do modelo, i.e, os valores das classes. Em cada nível da árvore, o atributo mais

informativo que ainda não foi usado é seleccionado. O processo repete-se até que todos

os itens sejam classificados. Os ramos são caminhos de decisão, da raiz da árvore até às

suas folhas. O modelo gerado expõe o conhecimento adquirido duma forma intuitiva.

O algoritmo da árvore de decisão usado não têm como pré-requisito a normalidade

dos dados. O algoritmo de árvore de decisão usado na dissertação foi o J4.8, que é uma

implementação em JAVA do C4.5 (Quinlan, 1993). Este algoritmo baseia-se na teoria de

Informação de Shannon para medir o valor informativo dos atributos.

Os dados usados para construir o modelo de classificação designam-se por conjunto

de treino. O conjunto de treino na classificação das amostras em regiões geográficas

consoante a micoflora foi composto por 32 amostras das 4 regiões e locais estudados nos

3 anos na vindima. No caso da classificação de Aspergillus negros, o conjunto de treino

foram 25 estirpes de Aspergillus bisseriados. A árvore produzida pelo algoritmo tem

183


várias medidas estatísticas associadas e uma matriz de confusão. Na figura 3.20 está um

exemplo duma árvore de classificação.

Figura 3.20. Árvore de decisão para a classificação das amostras em regiões. Os atributos são indicados

numa oval, e as classes num rectângulo. Nas folhas do modelo, os números entre parêntesis significam o

número de itens do conjunto de treino que o nó classificou naquela folha, bem como o número de itens

incorrectamente classificados, caso existam (10.0/2.0 significa que 10 amostras foram classificadas como

sendo dos Vinhos Verdes usando o critério de <4 bagos colonizados nas amostras com A. niger; 2 amostras

foram incorrectamente classificadas por este critério)

Na matriz de confusão associada à árvore de decisão estão indicados o número de

amostras de cada classe que foram classificadas em cada uma das categorias predefinidas

(Tabela 3.16). Através dos dados indicados na matriz, é possível calcular o sucesso e

insucesso do modelo para cada classe (v.g., o sucesso do modelo para o Douro foi de 7

amostras correctas em 9, ou seja, 78%).

Tabela 3.16. Matriz de confusão da árvore de decisão representada na Figura 3.20. Nas linhas indica-se o

número total de amostras de cada uma das classes classificadas pelo modelo em cada uma das categorias

predefinidas. Por exemplo, no caso do Douro, das 9 amostras totais, 7 foram correctamente classificadas

pelo modelo como sendo do Douro, uma incorrectamente classificada como sendo do Sul e outra como

sendo dos Vinhos Verdes

Douro Sul Verdes

Douro 7 1 1

Sul 0 14 1

Verdes 0 0 8

184


Para avaliar a capacidade preditiva do modelo, i.e., verificar se o modelo é capaz de

identificar correctamente amostras de origem desconhecida duma das 4 regiões

estudadas, usou-se um método designado de validação cruzada de 10 subgrupos. O

conjunto de treino é dividido em 10 subconjuntos, assegurando o algoritmo que cada

classe está representada em proporção igual (Kohavi, 1995). Um dos subgrupos é usado

para teste e os restantes para treino. Desta forma avalia-se a taxa de sucesso preditivo do

modelo.

Para refinamento do modelo, fez-se selecção de atributos. O avaliador de atributos

seleccionado do WEKA foi o CfsSubsetEval, e os métodos usados foram o BestFirst e o

RankSearch.

8.5. Avaliação do desempenho dos métodos de extracção

A avaliação do desempenho dos métodos fez-se com base na regressão linear entre a

resposta dos métodos e a concentração de OTA nas amostras, ou na falta deste valor (nas

amostras naturalmente contaminadas), na taxa de diluição. Foram obtidos e analisados o

coeficiente de correlação r, o declive da recta (b) e a ordenada na origem (a), com o

programa Microsoft Excel 2000. O intervalo de confiança para o declive da recta (b ± tsb)

e ordenada na origem (a ± tsa) foram calculados de acordo com o descrito por Miller e

Miller (1993), com base nas equações 5 e 6, respectivamente.

( )2

12

⎭⎬⎫

⎩⎨⎧

−

=

∑i

i

xy

b

xx

SS (equação 5)

185


( )

21

2

2

⎪⎭

⎪⎬

⎫

⎪⎩

⎪⎨

⎧

−×=

∑∑

ii

ii

xya xxn

xSS (equação 6)

Em que:

xyS é calculado de acordo com a equação 4;

xi é a concentração de OTA dum padrão, e x a média;

n é o número de pontos da calibração.

O valor de t obtido foi para um nível de confiança de 95%.

O RSD é calculado com base na razão do desvio padrão e do valor médio, e é

expresso em percentagem. A taxa de recuperação é a razão entre a concentração de OTA

detectada na amostra, calculada pela equação 1, e a concentração de OTA conhecida e é

expressa em percentagem.

186

Capítulo 3. Materiais e...

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