CARACTERIZAÇÃO DE LEVEDURAS TERMOTOLERANTES …‡ÃO... · pela amizade e conselhos para o...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

CARACTERIZAÇÃO DE LEVEDURAS TERMOTOLERANTES

PARA PRODUÇÃO DE ETANOL CELULÓSICO

DANIELA ARRUDA COSTA

OURO PRETO

MINAS GERAIS – BRASIL

2011

DANIELA ARRUDA COSTA

CARACTERIZAÇÃO DE LEVEDURAS TERMOTOLERANTES

PARA PRODUÇÃO DE ETANOL CELULÓSICO

Dissertação apresentada à Universidade Federal

de Ouro Preto, como parte das exigências do

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia,

para obtenção do título de Magister Scientiae.

OURO PRETO

MINAS GERAIS – BRASIL

2011

Catalogação: [email protected]

C837c Costa, Daniela Arruda. Caracterização de leveduras termotolerantes para produção de etanol

celulósico [manuscrito] / Daniela Arruda Costa. - 2011. xiii, 61f.: il., color; graf.; tabs. Orientador: Prof. Dr. Luciano Gomes Fietto. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia Aplicada a Processos e

ao Tratamento de Doenças.

1. Fermentação - Teses. 2. Leveduras - Teses. 3. Álcool como combustível - Teses. 4. Biocombustíveis - Teses. I. Fietto, Luciano Gomes. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Título.

CDU: 582.282.23:620.92

Aos meus pais Elza e Simeão.

Aos meus irmãos, Dri, Fred e Rafa.

DEDICO.

“Sonho que se sonha só,

é apenas um sonho que se sonha só,

mas sonho que se sonha junto é realidade.”

Raul Seixas

AGRADECIMENTOS

À Deus por guiar meus passos nesta caminhada e me iluminar nos momentos

difíceis.

À Universidade Federal de Ouro Preto e ao Programa de Pós-Graduação em

Biotecnologia pela oportunidade e pelo apoio acadêmico e institucional.

À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Bioquímica e Biologia

Molecular pela acolhida e suporte.

À Capes pela bolsa concedida.

Ao CNPq e FAPEMIG pelo fomento à pesquisa.

Aos meus pais Elza e Simeão, pelo amor, dedicação e por não medirem

esforços para que eu pudesse seguir sempre em frente.

Aos meus irmãos Adriana, Frederico e Rafael, pelo incentivo, amor e alegria de

viver.

Ao Professor Dr. Luciano Gomes Fietto pela orientação, apoio e amizade.

Às professoras Dra. Andréa Barros Ribon e Dra. Juliana Lopes Rangel Fietto,

pela amizade e conselhos para o aprimoramento desde trabalho.

Aos amigos Carlos e Zamira por terem acompanhado todo o trabalho, fazendo

valiosas críticas e sugestões.

À Patrícia e Fernanda, pelo auxílio nos experimentos.

Aos amigos e colegas do Laboratório de Biotecnologia Molecular, por tornar a

estadia em Viçosa mais agradável: Adíverson, Ananda, Ancély, Aline, Carlos, Daiane,

Danielle, Felipe, Fernanda, Glauco, Héllida, Mary, Mariana, Marina, Mário, Patrícia,

Priscilla, Raphael, Silvana, Zaira e Zamira.

Aos amigos Matheus e Ramon pelo grande incentivo, apoio nos momentos

difíceis e pelos maravilhosos momentos de descontração.

Aos queridos amigos do Mestrado em Biotecnologia: Bruna, Bruno, Cris, David,

Franciny, Iara, Luciana, Rodrigo, Val e Zamira, além da Doutoranda Pauline, pelos

maravilhosos momentos que passamos juntos.

À grande amiga Val e sua família, pelo suporte, companhia e torcida.

À família Toka por estar sempre presente na minha vida.

A todos os meus amigos, pela torcida e apoio em todas as horas.

À Vó Guida, pelo carinho e orações.

À minha família, pelo incentivo e amor concedidos. Em especial aos meus

avós: Vó Surica, Vô Celso e Vô Arruda, saudades eternas.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS, TABELAS E QUADROS ............................................................ vii

RESUMO ..................................................................................................................... ix

ABSTRACT ................................................................................................................. xi

1. INTRODUÇÃO....................................................................................................... 1

2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 3

2.1 Biocombustíveis ............................................................................................. 3

2.2 Etanol celulósico ............................................................................................. 3

2.2.1 Biomassa lignocelulósica ......................................................................... 4

2.3 Processo de obtenção de etanol de segunda geração ................................... 7

2.3.1 Pré-tratamento ......................................................................................... 7

2.3.2 Hidrólise .................................................................................................. 8

2.3.3 Fermentação da biomassa hidrolisada .................................................... 9

2.3.3.1 Hidrólise e fermentação em separado (SHF) ........................................... 10

2.3.3.2 Sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) ...................................... 10

2.4 Micro-organismo fermentador ....................................................................... 11

2.4.1 Fermentação de pentoses e hexoses .................................................... 12

2.4.2 Tolerância a inibidores ........................................................................... 13

2.4.3 Termotolerância ..................................................................................... 13

2.4.4 Tolerância a etanol ................................................................................ 14

2.4.5 Levedura: Saccharomyces cerevisiae ................................................... 15

2.4.6 Levedura: Kluyveromyces marxianus .................................................... 16

3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 18

3.1 Objetivo geral ............................................................................................... 18

3.2 Objetivos específicos .................................................................................... 18

4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 19

4.1 Linhagens e meios de cultura ....................................................................... 19

4.2 Identificação molecular da levedura .............................................................. 19

4.2.1 Extração do DNA total ........................................................................... 20

4.2.2 Amplificação utilizando os iniciadores NL1 e NL4 .................................. 20

4.2.3 Purificação dos produtos de PCR e reação de seqüenciamento............ 21

4.2.4 Análise das seqüências ......................................................................... 21

4.3 Fotomicrografias das leveduras .................................................................... 21

4.4 Caracterização fisiológica ............................................................................. 22

4.4.1 Crescimento em placas ......................................................................... 22

4.4.2 Crescimento em microplacas ................................................................. 22

4.5 Ensaios de fermentação ............................................................................... 24

4.5.1 Ensaios de fermentação com glicose .................................................... 25

4.5.2 Ensaios SSF com bagaço de cana de açúcar........................................ 25

4.5.2.1 Pré-tratamento ácido-básico .................................................................... 25

4.5.2.2 Sacarificação e fermentação simultânea a 37°C e a 42°C ....................... 25

4.6 Parâmetros fermentativos ................................................................................ 26

4.7 Métodos analíticos – Concentrações de Glicose e Etanol ......................... 26

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 28

5.1 Identificação molecular da levedura ................................................................. 28

5.2 Fotomicrografia das leveduras ...................................................................... 28

5.3 Avaliação do crescimento das leveduras em meio sólido ................................. 29

5.4 Avaliação do crescimento das leveduras em meio líquido .......................... 312

5.5 Ensaios de fermentação em glicose ................................................................. 44

5.6 Ensaios de SSF com bagaço de cana de açúcar ............................................. 48

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 53

7. ANEXO ................................................................................................................ 60

vii

LISTA DE FIGURAS, TABELAS E QUADROS

Figura 1 – Esquema estrutural simplificado das fibras do material lignocelulósico . ...... 5

Figura 2 – Estrutura química da celulose . .................................................................... 6

Figura 3 – Componentes da fração da hemicelulose . .................................................. 6

Figura 4 – Estrutura química do furfural e 5- hidroximetil-furfural .................................. 8

Figura 5 – Esquema mecanístico da hidrólise enzimática da celulose. ......................... 9

Figura 6 – Desenho experimental do crescimento em placas. .................................... 22

Figura 7 – Representações esquemáticas das microplacas geradas pelo programa SoftMax Pro 5.3.. ........................................................................................................ 24

Figura 8 – Fotomicrografias utilizando o microscópio óptico Nikon Eclipse Ti-S com objetiva de 100X e abertura numérica de 1.4.. ............................................................ 29

Figura 9 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de glicose a 37°C. .................. ............................................................. 33

Figura 10 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de glicose a 42°C. .................. ............................................................. 35

Figura 11 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de glicose a 45°C.. ................. ............................................................. 36

Figura 12 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de etanol a 30°C. ................... ............................................................. 40




Figura 16 - Fermentação a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v). .................................................. 46

Figura 17 - Fermentação a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v). .................................................. 47

viii

Tabela 1 – Linhagens de leveduras utilizadas............................................................. 19

Tabela 2 - Velocidade específica de crescimento (µ) e D.O.(600) máxima em microplacas contendo meio YPD 4% em diferentes temperaturas. ............................. 38

Tabela 3 – Fermentação a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 0,1, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v). ............................................. 44

Tabela 4 - Fermentação a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 0,1, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v). ............................................. 45

Tabela 5 - Fermentação a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v). .................................................. 48

Tabela 6 - Fermentação a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v). .................................................. 48

Tabela 7 – SSF a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de bagaço de cana de açúcar 8% (p/v). ................................. 50

Tabela 8 - SSF a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de bagaço de cana de açúcar 8% (p/v). ................................. 50

Tabela 9 - Rendimento em etanol obtido com a utilização de linhagens termotolerantes de K. marxianus e S. cerevisiae, em relação a diferentes biomassas pré-tratada ....... 52

Quadro 1 – Avaliação do crescimento de linhagens de leveduras em meio YP contendo diferentes concentrações de glicose e em diferentes temperaturas *. ......... 30

Quadro 2 - Avaliação do crescimento de linhagens de leveduras em meio YPD 4% contendo diferentes concentrações de etanol e em diferentes temperaturas *............ 30

ix

RESUMO

COSTA, Daniela Arruda, M. Sc. Universidade Federal de Ouro Preto, fevereiro de

2011. Caracterização de leveduras termotolerantes para pr odução de etanol

celulósico . Orientador: Luciano Gomes Fietto.

A conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis é considerada uma

alternativa promissora para aumentar a produção de etanol. Neste contexto tem sido

demonstrado que maiores rendimentos em etanol são obtidos por meio do

acoplamento das etapas de sacarificação e fermentação, processo chamado

sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). No entanto, um dos entraves do

processo é a temperatura ótima para a realização das duas etapas; uma vez que, a

ação ótima das celulases ocorre em torno de 50°C, e nquanto que a maioria dos

organismos fermentativos cresce entre 30° e 37°C. Com o objetivo de viabilizar o

processo SSF foi isolada e identificada uma linhagem termotolerante de

Saccharomyces cerevisiae, denominada LBM-1. A fim de selecionar o micro-

organismo adequado e as condições ideais para a realização do processo SSF, foram

comparadas linhagens de leveduras das espécies S. cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE-

2) e Kluyveromyces marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086), quanto à utilização

de fonte de carbono, tolerância a etanol e termotolerância, por meio da análise do

perfil de crescimento e dos valores da velocidade específica de crescimento. De posse

dos dados de temperatura máxima suportada pelas linhagens testadas, foram

realizados ensaios de fermentação para estabelecer a quantidade ideal de inóculo a

ser utilizada. Estes ensaios foram realizados utilizando glicose como substrato e em

duas temperaturas diferentes, nas quais as leveduras tiveram um bom crescimento.

Sabendo-se a concentração ideal de inóculo a ser utilizada procedeu-se à análise

comparativa do rendimento fermentativo das linhagens testadas em processo SSF

utilizando o bagaço de cana de açúcar como substrato. O seqüenciamento da região

D1/D2 do DNA ribossomal confirmou que o isolado LBM-1 é uma linhagem de

levedura pertencente à espécie S. cerevisiae. Os experimentos realizados mostraram

que as linhagens de S.cerevisiae são mais tolerantes ao etanol, enquanto que as

linhagens de K. marxianus são mais termotolerantes. Além disso, as linhagens de S.

cerevisiae LBM-1, CAT-1 e PE-2 são termotolerantes e possuem a capacidade de

crescer e fermentar a 42°C. Por meio da caracteriza ção fisiológica, foram

estabelecidas duas temperaturas para a realização dos ensaios de fermentação, 37° e

x

42°C, nas quais todas as linhagens apresentaram um bom crescimento. Desta forma,

foram feitos experimentos de fermentação em glicose comparando duas densidades

óticas iniciais a 600 nm (D.O.(600)), 0,1 e 2, para saber qual seria a D.O.(600) ideal para

iniciar a fermentação. Os resultados mostraram que uma D.O.(600) mais alta,

correspondente a 2, favorece um aumento no rendimento do processo. Ensaios de

fermentação em glicose a 37°C apresentaram valores de rendimentos em etanol

próximos ao teórico 0,51. Nos ensaios de SSF com bagaço de cana de açúcar

realizados tanto a 37°C, quanto a 42°C, foram obtid os rendimentos muito similares.

Entretanto, a 37°C houve uma maior concentração fin al em etanol do que a 42°C.

Além disso, os ensaios de SSF juntamente com dados obtidos anteriormente pelo

grupo comprovaram que a fermentação deve ser iniciada após 72 horas de pré-

hidrólise, uma vez que neste tempo ocorre inibição das celulases pelo produto. Com

isto pode-se concluir que todas as linhagens testadas podem ser utilizadas para

viabilizar o processo SSF.

xi

ABSTRACT

COSTA, Daniela Arruda, M. Sc. Universidade Federal de Ouro Preto, February 2011.

Characterization of thermotolerant yeasts for ethan ol cellulosic production .

Advisor: Luciano Gomes Fietto.

The lignocellulosic material conversion, such as sugar cane bagasse, into fermentable

sugars has been considered a promising alternative to increase ethanol production. In

this context, it has been shown that higher ethanol yields are obtained by coupling two

stages, through the simultaneous saccharification and fermentation, process called

simultaneous saccharification and fermentation (SSF). However, one of the barries the

process is the optimum temperature for carrying out the two steps, the optimal action of

cellulases occurs around 50°C, while most of the fe rmentative organisms grows

between 30° and 37°C. Aiming to enable the process SSF has increased considerably

in recent years the isolation of thermotolerant yeasts, especially strains belonging to

the species Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus. In this context,

our group has isolated and identified molecularly a thermotolerant strain of S.

cerevisiae, called LBM-1. In order to select the appropriate micro-organism and the

ideal conditions for the realization of the SSF process, was performed the physiological

characterization of yeast strains of S. cerevisiae (LBM-1, CAT-1 and PE-2) and K.

marxianus (UFV-3, ATCC 8554 and CCT 4086), as to use of carbon source, ethanol

tolerance and thermotolerance by comparing the growth profile and the values of

specific growth rate. Take into account the physiological characterization, fermentation

tests were performed to establish the optimum amount of inoculum to be used and the

micro-organism suitable for fermentation. These tests were conducted using glucose

as substrate and at two different temperatures, in which the yeast had a good growth.

Knowing the optimal concentration of inoculum used to be carried to the fermentation

efficiency comparative analysis of the strains in SSF process using sugar cane

bagasse as substrate. The sequencing of the D1/D2 region confirmed that the isolated

LBM-1 is a yeast strain belonging to species S. cerevisiae. Physiological

characterization showed that strains of S.cerevisiae are more tolerant to ethanol,

whereas the strains of K. marxianus are more thermotolerant. Furthermore, strains of

S. cerevisiae LBM-1, CAT-1 and PE-2 are thermotolerant and have the ability to grow

and ferment at 42°C. The evaluation of stresses at high temperatures and high

concentrations of glucose showed that yeast cells require higher concentrations of

xii

sugar to grow, and this effect was called "cross tolerance". Through the physiological

characterization, both temperatures were established for the testing fermentation, 37°

and 42°C, in which all the strains showed good grow th. Thus, experiments were made

of glucose fermentation in comparing two initial optical densities 600 nm (O.D.(600)), 0,1

and 2, to know what O.D.(600) ideal to start fermentation. The results showed that

O.D.(600) higher, corresponding to 2, favors an increase in process yield. Tests for

glucose fermentation at 37°C showed values of ethan ol yields close to the theoretical

0.51. In tests of the SSF with sugar cane bagasse performed at both 37° and 42°C

were obtained income (YE / C) very similar. However, at 37°C resulted in a higher final

ethanol concentration than at 42 ° C. In addition, the SSF trials together with data

obtained previously by the group showed that the fermentation should be started after

72 hours of pre-hydrolysis, since this time is the product inhibition of cellulases. With

this we can conclude that all tested strains could potentially be upgraded to permit the

SSF process.

1

1. INTRODUÇÃO

As mudanças climáticas e a elevação nos custos do petróleo aliadas às

necessidades estratégicas de produção de energia têm motivado uma corrida sem

precedentes à produção de combustíveis alternativos, preferencialmente de fontes

renováveis. A conversão de material lignocelulósico, como bagaço de cana de açúcar,

em açúcares fermentáveis vem sendo considerada uma alternativa promissora para

aumentar a produção de etanol (Rocha e Buckeridge, 2009). A utilização de materiais

lignocelulósicos para produzir etanol envolve quatro etapas: pré-tratamento, hidrólise

enzimática, fermentação e destilação (Sun e Cheng, 2002). Tem sido demonstrado

que os maiores rendimentos em etanol são obtidos por meio do acoplamento de duas

etapas, por meio da sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) (Ballesteros et al.,

2004; Sanchez e Cardona, 2008). No entanto, um dos entraves do processo é a

temperatura ótima para a realização das duas etapas; uma vez que, a ação ótima das

celulases ocorre em torno de 50°C, enquanto que a m aioria dos organismos

fermentativos cresce entre 30 e 37°C (Olsson et al., 2006).

Com o objetivo de viabilizar o processo SSF tem aumentado consideravelmente

nos últimos anos o isolamento de leveduras termotolerantes, especialmente de

linhagens pertencentes às espécies Saccharomyces cerevisiae e Kluyveromyces

marxianus (Singh et al., 1998; Abdel-Fattah et al., 2000; Sree et al., 2000; Hari Krishna

et al., 2001; Basso et al., 2008; Fonseca et al., 2008). Neste âmbito, o grupo de

pesquisa do Laboratório de Biotecnologia Molecular da Universidade Federal de

Viçosa isolou e identificou molecularmente uma linhagem termotolerante de S.

cerevisiae, denominada LBM-1.

A fim de selecionar o micro-organismo adequado e as condições ideais para a

realização do processo SSF, foi feita a caracterização fisiológica de linhagens de

leveduras das espécies S. cerevisiae e K. marxianus, quanto à utilização de fonte de

carbono, tolerância a etanol e termotolerância, por meio da comparação do perfil de

crescimento e dos valores da velocidade específica de crescimento. A comparação foi

feita utilizando três linhagens de leveduras pertencentes a cada espécie, da seguinte

forma:

• Saccharomyces cerevisiae:

o LBM-1: novo isolado a partir de dorna de fermentação de cachaça

obtido pelo Laboratório de Biotecnologia Molecular (Departamento

2

de Bioquímica e Biologia Molecular/ Universidade Federal de

Viçosa);

o CAT-1 e PE-2: linhagens isoladas de usinas de produção de

etanol de primeira geração pela empresa Fermentec, e

amplamente utilizadas por usinas do setor sucro-energético

(Basso et al., 2008);

• Kluyveromyces marxianus:

o UFV-3: linhagem isolada do soro de queijo pelo Laboratório de

Fisiologia de Micro-organismos (BIOAGRO/Universidade Federal

de Viçosa) (Silveira et al., 2005);

o ATCC 8554: linhagem pertencente à coleção biológica American

Type Culture Collection;

o CCT 4086: linhagem pertencente à coleção biológica Coleção de

Culturas Tropicais - André Tosello Tropical Culture.

Para confirmar o isolado LBM-1 como pertencente à espécie S. cerevisiae foi

feita a caracterização molecular por meio do seqüenciamento da região D1/D2 da

subunidade 26S do rDNA.

De posse da caracterização fisiológica, foram realizados ensaios de fermentação

para estabelecer a quantidade ideal de inóculo a ser utilizada e o micro-organismo

adequado ao processo fermentativo. Estes ensaios foram realizados utilizando glicose

como substrato e em duas temperaturas diferentes, nas quais as leveduras tiveram um

bom crescimento. Sabendo-se a concentração ideal de inóculo a ser utilizada

procedeu-se à análise comparativa do rendimento fermentativo das linhagens testadas

em processo SSF utilizando o bagaço de cana de açúcar como substrato.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Biocombustíveis

As mudanças climáticas aliada às necessidades estratégicas de produção de

energia têm motivado uma corrida sem precedentes à produção de combustíveis

alternativos, preferencialmente de fontes renováveis (Rocha e Buckeridge, 2009). Por

meio do uso de recursos energéticos renováveis, o mundo pode encontrar parte da

solução para as suas necessidades energéticas, de uma maneira ambientalmente

sustentável (Hahn-Hagerdal et al., 2006).

O bioetanol é um dos mais importantes combustíveis renováveis, contribuindo

para a redução dos impactos ambientais negativos gerados pela utilização mundial

dos combustíveis fósseis (Cardona e Sanchez, 2007). Isso porque ele é produzido a

partir de biomassa que é uma matéria renovável e não contribui para o acúmulo de

dióxido de carbono na atmosfera terrestre, ou seja, o CO2 liberado durante o uso da

biomassa é absorvido novamente no processo de fotossíntese para a sua formação

(Hall, 1984; Ohgren et al., 2006).

O processo de produção do etanol ocorre por meio da fermentação microbiana

de açúcares derivados de matérias-primas agrícolas, principalmente de amido e de

sacarose. Os Estados Unidos e o Brasil detêm cerca de 70% da produção mundial de

etanol por meio de amido de milho e caldo da cana de açúcar, respectivamente

(Argueso et al., 2009).

O interesse mundial na utilização de bioetanol como fonte de energia tem

estimulado os estudos sobre o custo e a eficiência dos processos industriais para sua

produção (Siqueira et al., 2008). Neste sentido, pesquisas têm sido conduzidas para a

obtenção de eficientes organismos fermentativos, baixo custo de substratos e ótimas

condições ambientais para o processo (Cysewski e Wilke, 1978).

2.2 Etanol celulósico

Neste cenário, o Brasil desponta como o país com as tecnologias e políticas

mais avançadas do mundo devido à pioneira utilização do etanol obtido a partir da

fermentação do caldo da cana (Rocha e Buckeridge, 2009).

4

Na década de 1970, o Brasil iniciou o programa Pró-Álcool a fim de substituir a

gasolina pelo etanol e visando diminuir a dependência política e econômica em

períodos de oferta variável. A cana de açúcar foi escolhida como matéria-prima para

produzir etanol, e como conseqüência, estudos agrícolas e tecnológicos foram

intensificados, levando o Brasil a uma posição muito favorável em termos de

segurança energética. Atualmente, o Brasil possui mais de 80% de seus veículos

rodando com bioetanol, e está desenvolvendo motores para pequenos aviões

utilizarem o etanol como combustível (Soccol et al., 2010).

No entanto, deve-se notar que apenas uma parte da biomassa produzida é

utilizada para a produção de bioenergia; um terço da planta é utilizado para a

produção de álcool, um terço é o bagaço, que é queimado para produção de

eletricidade e o terço restante é deixado no campo, que é decomposta pelos micro-

organismos (Cortez et al., 2008). Portanto, um significativo aumento na produção de

etanol seria possível se tecnologias fossem desenvolvidas para converter em açúcares

fermentáveis os polissacarídeos das folhas, palha e bagaço, que juntos representam

dois terços da biomassa (Soccol et al., 2010). Atualmente, esta tecnologia vem sendo

considerada como uma alternativa promissora para aumentar a produção de etanol

necessária para atender à demanda mundial (Rocha e Buckeridge, 2009).

A implantação da tecnologia de etanol do bagaço de cana no Brasil é favorecida

pelo fato do processo de produção poder ser anexado às unidades já existentes de

indústrias de açúcar e álcool, exigindo investimentos mais baixos, infra-estrutura,

logística e fornecimento de energia. Além disso, o bagaço é gerado nas unidades

industriais, e como tal, livre de custos de transporte. Este é um cenário promissor, pois

a cada 10 milhões de toneladas de biomassa seca, 600 milhões de galões de etanol

poderiam ser produzidos, considerando o uso somente da parte celulósica (Soccol et

al., 2010).

2.2.1 Biomassa lignocelulósica

Existe uma grande variedade de matérias-primas potenciais para a produção de

etanol combustível. Gramíneas, madeiras, subprodutos de colheitas e outros resíduos

que contenham celulose (incluindo resíduos agrícolas, florestais e da indústria de

papel), são todos exemplos de fontes de material lignocelulósico (Figura 1) (Van Maris

et al., 2006; Wilkins et al., 2008). A natureza e disponibilidade de matérias-primas

lignocelulósicas em diferentes partes do mundo dependem do clima e outros fatores

5

ambientais, práticas agrícolas e desenvolvimento tecnológico (Claassen et al., 1999).

A biomassa consiste em um complexo emaranhado composto por três principais

polímeros: celulose, hemicelulose e lignina; dependendo da matéria-prima, também

possui pectina (Van Maris et al., 2006).

A celulose, principal constituinte da biomassa (33-51%), é um polímero linear

composto de milhares de subunidades de D-glicose unidas por ligações glicosídicas β-

(1-4) (Ingram et al., 1999). Normalmente polímeros lineares de celulose ocorrem como

cadeias paralelas com extensas ligações de hidrogênio, como mostrado na Figura 2

(Lee, 1997). A estrutura linear, conferida pela configuração das ligações glicosídicas,

possibilita a formação de ligações de hidrogênio intra e intermoleculares e acarreta na

agregação das cadeias celulósicas em “fibrilas elementares” com alto grau de

cristalinidade. Estes agregados conferem elevada resistência à tensão, tornam a

celulose insolúvel em um grande número de solventes e explicam, pelo menos em

parte, a sua resistência à degradação microbiana (Ding e Himmel, 2006; Matthews et

al., 2006; Canilha et al., 2010; Canilha et al., 2011).

A hemicelulose, o segundo maior constituinte da biomassa (19-34%) mostrado

na Figura 3, é um heteropolissacarídeo complexo composto por hexoses (D-glucose,

D-galactose, D-manose, L-ramnose, L-fucose), pentoses (D-xilose e L-arabinose) e

ácidos urônicos (ácido D-glucurônico e ácido D-galactourônico) (Van Maris et al.,

2006).

Figura 1 – Esquema estrutural simplificado das fibras do material lignocelulósico (Lee, 1997).

6

Figura 2 – Estrutura química da celulose (Morais, 2005).

Figura 3 – Componentes da fração da hemicelulose (Morais, 2005).

A lignina, que constitui 10-20% em peso da biomassa seca, é um polímero

aromático contendo resíduos fenólicos, tais como álcool trans-ρ-coumaril, álcool trans-

ρ-coniferil e álcool trans-ρ-sinápico. A lignina, fração da biomassa não fermentável, é

uma fonte potencial de inibidores da fermentação microbiana (Ingram et al., 1999; Van

Maris et al., 2006).

7

Do ponto de vista tecnológico, os açúcares contidos nas frações celulósicas

(glicose) e hemicelulósicas (xilose, arabinose, glicose, manose e galactose)

representam os substratos que podem ser utilizados para a produção de etanol por via

fermentativa. Entretanto, conforme ilustrado na Figura 1, a íntima associação entre as

três frações principais (celulose, hemicelulose e lignina) é tal que impõe dificuldades

para a recuperação dos monômeros constituintes com elevado grau de pureza (Sun e

Cheng, 2002).

2.3 Processo de obtenção de etanol de segunda geraç ão

Os processos para obter etanol a partir de materiais lignocelulósicos baseados

na hidrólise enzimática são métodos promissores para produzir biocombustíveis. Estes

consistem basicamente em quatro fases: pré-tratamento, hidrólise enzimática,

fermentação e destilação (Tomas-Pejo et al., 2009). O processo biológico para a

conversão de lignocelulose em etanol combustível requer: deslignificação para liberar

a celulose e hemicelulose a partir de seu complexo com lignina, despolimerização da

celulose para produzir açúcares livres e fermentação da misturas de açúcares hexoses

e pentoses para produzir etanol.

2.3.1 Pré-tratamento

O objetivo da etapa de pré-tratamento é remover a hemicelulose e a lignina,

reduzir a cristalinidade da celulose e aumentar a porosidade dos materiais; sem que

haja perda de carboidratos e a formação de bioprodutos que possam inibir os passos

subseqüentes, em especial a fermentação (Sun e Cheng, 2005). Um pré-tratamento

eficiente resulta em um aumento significativo do rendimento em açúcares

fermentáveis.

Existem diversos tipos de pré-tratamentos, com diferentes rendimentos e efeitos

distintos sobre a biomassa e conseqüente impacto nas etapas subseqüentes. No pré-

tratamento ácido, a camada de hemicelulose é hidrolisada, enquanto no pré-

tratamento alcalino, uma parte da lignina é removida e a hemicelulose pode ser

hidrolisada pela utilização de hemicelulases (Hahn-Hägerdal et. al., 2006).

8

2.3.2 Hidrólise

Durante a etapa de sacarificação, a celulose pode ser hidrolisada por

tratamento ácido ou enzimático, liberando as unidades de glicose a serem assimiladas

pela levedura na etapa de fermentação. A hidrólise ácida da celulose foi a primeira

alternativa a ser testada e apresentou inconvenientes como a produção de compostos

furfúricos (Figura 4), inibidores da fermentação e a degradação de açúcares por

exposição prolongada ao meio reacional (Zhang et al., 2006). Frente aos empecilhos

de utilização da hidrólise ácida, a hidrólise enzimática da celulose tem recebido a

atenção dos pesquisadores.

Figura 4 – Estrutura química do furfural e 5- hidroximetil-furfural (Disponível em

http://tecalim.vilabol.uol.com.br/chemitryfood.html acesso 20/01/2011)

A hidrólise enzimática da celulose é catalisada por enzimas altamente

específicas que são chamadas de celulases. A hidrólise enzimática tem apresentado

melhores resultados do que a hidrólise ácida, uma vez que não ocorre a formação de

subprodutos da glicose, embora o processo seja mais lento. A maioria das celulases

comerciais é obtida a partir de Trichoderma reesei, embora uma pequena parcela seja

obtida a partir de Aspergillus niger (Zhang e Lynd, 2004).

Três classes de enzimas constituem o complexo celulolítico: 1) exo-1,4-β-D-

glucanases (EC 3.2.1.91), que hidrolisam a cadeia celulósica a partir de suas

extremidades liberando celobioses, 2) endo-1,4-β-D-glucanases (EC 3.2.1.4), que

hidrolisam a cadeia celulósica internamente de maneira aleatória, e 3) 1,4-β-D-

glucosidases (EC 3.2.1.21), que promovem a hidrólise da celobiose em glicose e

podem também clivar unidades glicosídicas a partir de celuoligossacarídeos (Figura 5).

Coletivamente chamadas de celulases, atuam em sinergia para hidrolisar a celulose

9

criando sítios acessíveis umas para as outras e aliviando problemas de inibição pelos

produtos (Eriksson et. al., 2002; Vialjamae et. al., 2003; Canilha et al., 2010).

Figura 5 – Esquema mecanístico da hidrólise enzimática da celulose (Adaptado de Zhang et al., 2006).

Quando comparada com a hidrólise ácida, a hidrólise enzimática da celulose

geralmente é conduzida em condições mais brandas (pH 4,8 e temperatura entre 45° e

50°C), não causa problemas de corrosão e permite ma iores rendimentos (75- 85%),

além de possibilitar a fermentação simultânea à sacarificação (processo SSF,

sacarificação e fermentação simultâneas) que será discutido posteriormente. Neste

sentido, as pesquisas têm se concentrado em hidrólise enzimática como a chave para

a produção de etanol de segunda geração a um custo competitivo em longo prazo

(Philippidis e Smith, 1995; Lynd et al., 2002; Mosier et al., 2005; Alvira et al., 2010).

2.3.3 Fermentação da biomassa hidrolisada

O processo clássico para a fermentação da biomassa hidrolisada consiste num

processo seqüencial, no qual a hidrólise e a fermentação são realizadas em reatores

diferentes. Este processo é conhecido como hidrólise e fermentação em separado

10

(Separated Hydrolysis and Fermentation – SHF). Uma alternativa ao SHF é a

realização de hidrólise e fermentação em um mesmo reator, processo conhecido como

sacarificação e fermentação simultâneas (Simultaneous Saccharification and

Fermentation – SSF) (Sanchez e Cardona, 2008).

2.3.3.1 Hidrólise e fermentação em separado (SHF)

No processo seqüencial SHF, a fração de material pré-tratado que contém

celulose é submetida à hidrólise (sacarificação) por meio do uso de ácidos ou

enzimas. Uma vez que a hidrólise é completada, o hidrolisado de celulose resultante é

fermentado e convertido em etanol em um reator separado (Sanchez e Cardona,

2008).

A principal vantagem dessa estratégia é permitir que a hidrólise e a fermentação

possam ser conduzidas nas condições ótimas. Geralmente, a temperatura ótima para

as celulases está entre 45°C e 50°C, dependendo do micro-organismo produtor. E a

temperatura ótima para a maior parte dos micro-organismos produtores de etanol está

entre 30°C e 37°C (Olsson et al., 2006).

Por outro lado, a principal desvantagem é a inibição do complexo celulolítico

pelos açúcares liberados na hidrólise, principalmente celobiose e glicose que se

acumulam no meio, conferindo uma hidrólise incompleta da celulose e rendimentos

não muito altos (Wingren et al., 2005). Segundo Taherzadeh e Karimi (2007), outra

desvantagem do SHF é a possibilidade de contaminação. Como o tempo envolvido na

etapa de hidrólise é muito longo, a solução de glicídios torna-se uma fonte disponível

para os micro-organismos indesejados.

2.3.3.2 Sacarificação e fermentação simultâneas (SS F)

O processo SSF apresenta rendimentos mais atraentes do que o SHF, como

maior produtividade em etanol e menor consumo energético. Neste caso, as celulases

e micro-organismos são adicionados ao mesmo reator, permitindo que a glicose

liberada durante a hidrólise enzimática da celulose seja imediatamente convertida em

etanol e que a remoção contínua de glicose do meio minimize a inibição provocada

pelo produto final na atividade das enzimas (Ballesteros et al., 2004; Olsson et al.,

2006; Sanchez e Cardona, 2008).

11

Essa estratégia de processo apresenta inúmeras vantagens, dentre elas: a

redução da inibição das celulases pelos seus produtos de hidrólise, uma vez que os

glicídios não se acumulam no meio; menor complexidade e custo do processo,

comparado ao SHF, pois reduz o número de reatores; minimização dos riscos de

contaminação, devido às baixas concentrações de açúcar livre no meio; e maiores

rendimentos de hidrólise, já que o equilíbrio das reações enzimáticas é deslocado no

sentido de formação de mais produto, visto que a glicose é concomitantemente

consumida (Vasquez et al., 2007).

No entanto, um dos entraves do processo é a temperatura ótima para a

realização das duas etapas; uma vez que, a ação ótima das celulases ocorre em torno

de 50°C, enquanto que a maioria dos organismos ferm entativos cresce entre 30 e

37°C (Hari Krishna et al., 2001; Olsson et al., 2006). Com o objetivo de viabilizar o

processo SSF tem aumentado consideravelmente nos últimos anos o isolamento de

leveduras termotolerantes, especialmente de linhagens pertencentes às espécies

Saccharomyces cerevisiae e Kluyveromyces marxianus (Singh et al., 1998; Abdel-

Fattah et al., 2000; Sree et al., 2000; Hari Krishna et al., 2001; Basso et al., 2008;

Fonseca et al., 2008).

2.4 Micro-organismo fermentador

Tanto para a produção de etanol de primeira geração, a partir do caldo da cana

de açúcar, quanto de segunda geração, a partir de biomassas de composição

lignocelulósica, a via fermentativa é a via mais importante para a obtenção do álcool

etílico no Brasil. Um dos fatores que torna a produção de bioetanol por fermentação a

forma mais econômica de sua obtenção, é o grande número de matérias-primas

naturais e residuais, como o bagaço de cana de açúcar, existentes em todo país

(Pereira Jr. et al., 2008).

O micro-organismo predominante no processo de fermentação alcoólica é a

levedura S. cerevisiae, devido à sua capacidade de hidrolisar sacarose presente no

caldo da cana, em glicose e frutose, duas hexoses facilmente utilizadas por esta

levedura, ao alto rendimento fermentativo, mesmo na presença de oxigênio, e ao fato

desta levedura ser muito tolerante ao etanol em comparação com outras leveduras

(Sanchez e Cardona, 2008).

Para tornar viável a produção de etanol de segunda geração, estudos têm sido

feitos na identificação de linhagens de leveduras que sejam termotolerantes, tolerantes

12

ao etanol, resistentes a inibidores liberados durante o pré-tratamento do material

lignocelulósico e capazes de utilizar um amplo espectro de substratos, produzindo

grandes quantidades de etanol na temperatura ótima para a realização da

sacarificação.

Leveduras industriais devem detectar e responder rapidamente às condições de

estresse, adaptando-se aos fatores ambientais adversos por meio do ajuste de suas

atividades metabólicas a fim de evitar uma perda substancial de viabilidade. A

capacidade de tolerar vários estresses é um dos importantes critérios para selecionar

uma linhagem que seja eficiente no processo fermentativo (Zhao e Bai, 2009).

2.4.1 Fermentação de pentoses e hexoses

Linhagens de S. cerevisiae são capazes de fermentar glicose a altas taxas, até

mesmo em condições aeróbicas. Em condições anaeróbicas, a taxa de produção de

etanol em meio definido é tão alta quanto 30 mmol g biomassa -1 h -1 a 30°C (Bakker et

al., 2000). Entretanto, S. cerevisiae são incapazes de assimilar ou fermentar xilose, o

principal constituinte da fração hemicelulósica da biomassa.

As primeiras observações sobre fermentação de xiloses por leveduras datam do

início de 1980, com as espécies Pachysolen tannophilus (Slininger et al., 1982) e

Candida tropicalis (Gong et al., 1981). Pesquisas posteriores demonstraram que

outras espécies de leveduras também são capazes de fermentar xilose em etanol,

incluindo diversas espécies dos gêneros Pichia e Candida bem como algumas

linhagens de Kluyveromyces marxianus (Yablochkova et al., 2003; 2004). Cadete et

al., (2009) descreveram uma nova espécie de levedura fermentadora de D-xilose,

isolada de madeira em decomposição, e nomeada Spathaspora arborariae.

Muitos avanços foram alcançados na engenharia genética de leveduras e

bactérias para a fermentação de xilose e arabinose em etanol e outros produtos como

o ácido láctico. No entanto, a bioconversão de pentoses a etanol é ainda considerada

um desafio econômico e tecnológico (Jeffries e Shi, 1999; Jeffries e Jin, 2004).

Economicamente, é essencial que tanto a glicose quanto a xilose presentes na

biomassa lignocelulósica possam ser fermentados em etanol, para que esses recursos

renováveis possam ser usados como matéria-prima para a produção de combustível

renovável de uma forma viável (Sedlak e Ho, 2004).

13

2.4.2 Tolerância a inibidores

Durante o pré-tratamento da biomassa lignocelulósica vários subprodutos

químicos são gerados, e estes inibem os micro-organismos fermentativos. Entre

muitos compostos inibidores, o 2-furaldeído (furfural) e o 5-hidroximetil-2-furaldeído (5-

hidroximetilfurfural, HMF) são produzidos durante o pré-tratamento da biomassa,

especialmente com ácido diluído. Estes inibidores danificam as paredes e membranas

celulares, inibem o crescimento celular, reduzem atividades enzimáticas, causam

danos ao DNA, inibem a síntese de proteínas e RNA, e reduzem a produção de etanol

(Liu et al., 2004; Van Maris et al., 2006; Liu et al., 2009).

A maioria das leveduras, incluindo linhagens industriais, é suscetível a furfurais

derivados do pré-tratamento, e especialmente suscetível a combinação destes

inibidores. Embora o furfural seja mais tóxico do que o 5-HMF, ambos compostos

atuam sinergicamente para suprimir o crescimento da levedura. Neste sentido, para

atenuar os efeitos dos inibidores, tratamentos adicionais são requeridos, incluindo

detoxificação química, física ou bioquímica. No entanto, esses passos adicionais

adicionam custo e complexidade ao processo e geram resíduos. Portanto, o

desenvolvimento de linhagens engenheiradas geneticamente com maior tolerância a

inibidores, especialmente aos furfurais, é uma alternativa promissora à etapa de

detoxificação adicional (Liu et al., 2004).

2.4.3 Termotolerância

Uma das principais aplicações propostas para leveduras termotolerantes é o

processo de sacarificação e fermentação simultâneas da biomassa. Linhagens

termotolerantes têm sido isoladas de diversos ambientes, principalmente de regiões

tropicais. Por exemplo, isolados de S. cerevisiae que podem tolerar temperaturas

superiores a 44°C têm sido selecionados com sucesso , entretanto as taxas de

crescimento e de produção de etanol nestes casos são menores nestas temperaturas

(Sree et al., 2000).

Entre as espécies de leveduras conhecidas utilizadas em processos

fermentativos, K. marxianus tem o melhor desempenho em termos de crescimento e

fermentação em altas temperaturas (Singh et al., 1998; Abdel-Fattah et al., 2000;

Ballesteros et al., 2004; Hong et al., 2007; Nonklang et al., 2008; Suryawati et al.,

2008). No entanto, atualmente é difícil determinar qual dessas leveduras iria mostrar o

14

melhor desempenho em termos de fermentação em altas temperaturas, uma vez que

não existem estudos sobre esta comparação. A temperatura parece ser um fator físico

que determina o desempenho do micro-organismo, mas isso varia de acordo com os

biorreatores e incubadoras. Para comparar linhagens candidatas de uma forma mais

precisa condições experimentais controladas de crescimento são essenciais, tal como

o uso dos mesmos biorreatores ou incubadoras (Abdel-Banat et al., 2010).

2.4.4 Tolerância a etanol

O custo efetivo da produção de etanol depende, entre outros fatores, do alto

rendimento e da rápida conversão dos carboidratos a etanol. Entretanto, o etanol

acumulado no meio de cultura pode se tornar um fator de estresse significativo durante

a fermentação (Stanley et al., 2010).

Etanol é um inibidor do crescimento de leveduras em concentrações

relativamente baixas, inibe a divisão celular, diminuindo o volume celular e a

específica taxa de crescimento, enquanto em altas concentrações pode reduzir a

viabilidade celular e aumentar a morte (Birch e Walker, 2000).

Os principais sítios para os efeitos do etanol em leveduras são membranas

celulares, algumas proteínas hidrofóbicas e hidrofílicas e o retículo endoplasmático

(Walker, 1998). A exposição das leveduras ao etanol resulta em um aumento da

fluidez da membrana e conseqüente diminuição da sua integridade (Mishra e Prasad,

1989). A diminuição da disponibilidade de água, devido à presença do etanol causa a

inibição de enzimas chaves na via glicolítica e essas proteínas podem ser

desnaturadas (Hallsworth, 1998).

A pré-exposição das leveduras a uma quantidade subletal do agente causador

de estresse pode estimular uma resposta adaptativa, que resulta em resistência

passageira para níveis mais elevados do estresse em comparação com as células

sem pré-exposição. Esta aquisição de tolerância tem sido associada à ativação de

mecanismos de resposta específica de estresse durante a pré-exposição subletal. No

caso do estresse por temperatura, a aquisição de termotolerância tem sido observada

em leveduras expostas a temperaturas subletais momentaneamente, variando de

37°C a 45°C. Aumentar a magnitude do pré-estresse i nduzido por choque térmico não

somente aumenta a termotolerância da célula, como também leva a uma resposta

mais rápida (Plesset et al., 1982; Sanchez e Lindquist, 1990; Coote et al., 1991;

Stanley et al., 2010).

15

O pré-tratamento das leveduras com baixas concentrações de etanol tem sido

utilizado para aumentar a taxa de adaptação a concentrações mais altas de etanol

(Vriesekoop e Pamment, 2005). Neste contexto, estudos têm se concentrado na

investigação do estresse em etanol usando leveduras mutantes que alteraram sua

tolerância ao etanol devido à pré-exposição (Stanley et al., 2010).

2.4.5 Levedura: Saccharomyces cerevisiae

Devido a sua tradicional importância biotecnológica, como panificação, produção

de cerveja e vinho, as pesquisas historicamente tem se focado em S. cerevisiae

(Barnett, 2003). Desta forma, acumulou-se um profundo conhecimento sobre a

genética, fisiologia, bioquímica, engenharia genética e tecnologia fermentativa desta

levedura (Nevoigt, 2008). A popularidade da pesquisa básica e aplicada em S.

cerevisiae deve-se ao fato de algumas linhagens possuírem um staus GRAS

(generally regarded as safe) de segurança concedido pelo órgão de segurança

alimentar americano U.S. Food and Drug Administration (FDA).

Saccharomyces cerevisiae foi o primeiro organismo eucariótico cuja seqüência

genômica completa foi determinada (Goffeau et al., 1996). Vários bancos de dados

como o Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/) e o

Comprehensive Yeast Genome Database (http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast/) contêm

uma enorme quantidade de informação sobre seus genes, janelas de leituras (open

reading frames – ORFs) e produtos gênicos.

A maioria das linhagens de S. cerevisiae é tolerante a baixos valores de pH,

altas concentrações de açúcares e de etanol, propriedade que contribui para a

diminuição do risco de contaminação durante a fermentação industrial (Nevoigt, 2008).

Linhagens selecionadas de S. cerevisiae são amplamente utilizadas pelo setor

sucro-energético brasileiro, por possuírem uma combinação de alta eficiência

fermentativa com prolongada persistência na safra. Algumas destas linhagens

tornaram-se disponíveis comercialmente no final da década de 1990, e, atualmente,

mais da metade das destilarias brasileiras usam uma, ou mais comumente uma

mistura de duas ou mais, destas linhagens selecionadas para iniciar o processo

fermentativo, produzindo bilhões de galões de etanol por ano. As linhagens mais

amplamente utilizadas pelas usinas brasileiras são PE-2, CAT-1 e BG-1 por

apresentarem uma notável capacidade de competir com linhagens nativas,

sobrevivência e dominância durante o processo fermentativo industrial. Na safra de

16

2007/2008, as linhagens PE-2 e CAT-1 foram usadas em cerca de 150 destilarias,

representando cerca de 60% do etanol combustível produzido no Brasil (Basso et al.,

2008).

Buscando obter importantes informações sobre o micro-organismo adequado ao

processo SSF, foi feito neste trabalho um estudo comparativo entre os dois isolados

mais amplamente utilizados pelas usinas nacionais, PE-2 e CAT-1, e um isolado

obtido de uma destilaria de cachaça pelo Laboratório de Biotecnologia Molecular e

denominado LBM-1. Deve-se ressaltar que as linhagens comerciais PE-2 e CAT-1

utilizadas neste trabalho foram adquiridas junto à empresa Fermentec

(www.fermentec.com.br).

2.4.6 Levedura: Kluyveromyces marxianus

Linhagens pertencentes à espécie K. marxianus têm sido isoladas de uma

grande variedade de habitats, o que resulta em uma alta diversidade metabólica e um

substancial grau de polimorfismo intra-específico. Como conseqüência, diversas

aplicações biotecnológicas têm sido investigadas com esta levedura: produção de

enzimas (β-galactosidase, β-glicosidase, e poligalacturonases, entre outros), de

proteína para alimentação animal ou humana, de compostos de aroma, e de etanol

(incluindo processos SSF a temperaturas superiores a 37°C); redução do teor de

lactose em alimentos; produção de bioingredientes de soro de queijo; biorremediação;

como um agente anticolesterolêmico; e como um vetor para produção de proteína

heteróloga (Fonseca et al., 2008).

Comparando-se K. marxianus e K. lactis, organismo modelo, o conhecimento

acumulado sobre a primeira é muito menor e, aquele existente, se distribui por um

amplo número de diferentes linhagens. Sabe-se que K. marxianus e K. lactis

pertencem à mesma família, Saccharomycetacea, de S. cerevisiae (Llorente et al.,

2000). Uma importante característica de K. marxianus, compartilhada com K. lactis, é

a capacidade de assimilar lactose e usar este açúcar como fonte de carbono. Esta

característica leva à freqüentes isolamentos destas leveduras a partir de fontes de

leite; por exemplo leites fermentados, iogurte e queijos (Fonseca et al., 2008). Neste

contexto, uma linhagem de K. marxianus denominada UFV-3 foi isolada da indústria

de laticínios em Minas Gerais (Silveira et al., 2005).

Muitas vezes, linhagens de K. marxianus, assim como de outras leveduras estão

preservadas e distribuídas em coleções biológicas de leveduras. Estas coleções

17

conservam as linhagens e identificam por meio de métodos moleculares. A fim de

complementar o estudo comparativo realizado no presente trabalho, foram adquiridas

duas linhagens de K. marxianus pertencentes à coleções biológicas, ATCC 8554 e

CCT 4086. Desta forma, foi feita a caracterização de leveduras termotolerantes de S.

cerevisiae (LBM-1, PE-2 e CAT-1) e K. marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086)

em processo SSF para a obtenção de etanol a partir do bagaço de cana de açúcar.

18

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Caracterizar linhagens de leveduras termotolerantes pertencentes às espécies S.

cerevisiae e K. marxianus para produção de etanol celulósico por meio da

sacarificação e fermentação simultâneas.

3.2 Objetivos específicos

• Identificar molecularmente um isolado de S. cerevisiae LBM-1 obtido pelo

Laboratório de Biotecnologia Molecular (Universidade Federal de Viçosa);

• Caracterizar fisiologicamente linhagens das espécies S. cerevisiae (LBM-1,

CAT-1 e PE-2) e de K. marxianus (UFV-3 , ATCC 8554 e CCT 4086), quanto à

utilização de fonte de carbono, termotolerância e tolerância a etanol;

• Comparar as velocidades específicas de crescimento e a capacidade

fermentativa das linhagens testadas em meio com fonte de carbono definida;

• Analisar a capacidade fermentativa de todas as linhagens no processo SSF

utilizando bagaço de cana de açúcar.

19

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Linhagens e meios de cultura

As linhagens de leveduras que foram utilizadas neste experimento estão listadas

na Tabela 1. O meio de cultura para manutenção e ativação foi YPD (2% extrato de

levedura, 1% peptona e 2% glicose (p/v)), se sólido foi acrescentado 2 % ágar (p/v).

Todas as linhagens foram estocadas e mantidas em glicerol 20% a -80°C.

Tabela 1 – Linhagens de leveduras utilizadas.

Linhagem Genótipo Fonte

Saccharomyces cerevisiae LBM-1 Selvagem Laboratório Biotecnologia Molecular - DBB/UFV

Saccharomyces cerevisiae CAT-1 Industrial Fermentec

Saccharomyces cerevisiae PE-2 Industrial Fermentec

Kluyveromyces marxianus UFV-3 Selvagem Laboratório de Fisiologia de Micro-organismos -

BIOAGRO/UFV

Kluyveromyces marxianus ATCC 8554 Selvagem American Type Culture Collection

Kluyveromyces marxianus CCT 4086 Selvagem Coleção de Culturas Tropicais -

André Tosello Tropical Culture

4.2 Identificação molecular da levedura

O grupo de pesquisa do Laboratório de Biotecnologia Molecular (Departamento

de Bioquímica e Biologia Molecular, UFV), sob orientação do Prof. Dr. Luciano Gomes

Fietto, isolou uma linhagem de levedura termotolerante de uma dorna de fermentação

de cachaça de Minas Gerais. Esta levedura foi isolada pelo método descrito por

Oliveira et al. (2008) e denominada S. cerevisiae LBM-1.

Saccharomyces cerevisiae LBM-1 por ter apresentado um perfil termotolerante

foi submetida à análise molecular para identificação por técnica de seqüenciamento da

região D1/D2 da subunidade maior do gene do rRNA (Rosa e Lachance, 1998). Este

experimento foi realizado no Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras

20

(Departamento de Microbiologia, UFMG), sob coordenação do Prof. Dr. Carlos

Augusto Rosa, e o seqüenciamento foi realizado no Laboratório de Biodiversidade e

Evolução Molecular (Departamento de Microbiologia, UFMG).

4.2.1 Extração do DNA total

Para extração do DNA total, uma alçada de levedura foi incubada em tampão de

lise (50 mL de Tris-HCl 1M, pH 8,0; 10 mL de EDTA 0,5M, pH 8,0; 20 mL de NaCl 5M;

50 mL de SDS a 10% (p/v)) a 65°C por um tempo mínimo de 30 minutos. Após este

período foi adicionado 100 µl de fenol:clorofórmio:isopropílico na proporção 25:24:1, a

amostra foi agitada vigorosamente por 3 minutos e submetida à centrifugação a 6.000

g por 15 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi transferido para outro tubo e foi

adicionado um volume de 100 µl de etanol 70% gelado. A amostra foi homogeneizada

por inversão e novamente submetida a centrifugação a 6.000 g por 3 minutos. O

sobrenadante foi descartado e o tubo contendo o DNA genômico foi deixado a

temperatura ambiente secando por 16 horas. A amostra foi ressuspendida em 100 µl

de tampão TE pH 8,0 (10 mL de Tris-HCL1M, pH 8,0; 2 mL de EDTA 0,5M, pH8,0).

A integridade do DNA genômico foi avaliada em gel de agarose 1% (p/v) em

tampão TBE (54 g de tris-base; 27,5 g de ácido bórico; 20 mL de EDTA 0,5M, pH 8,0).

O gel foi corado com solução de brometo de etídio e visualizado sob luz ultravioleta. O

DNA genômico total foi quantificado em NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Technologies).

4.2.2 Amplificação utilizando os iniciadores NL1 e NL4

A reação de PCR (reação em cadeia da polimerase) foi realizada em um

volume final de 50 µl, utilizando a Taq DNA Polymerase Fermentas e 10 pmoles dos

iniciadores NL1 (5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e NL4 (5’-

GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) (MWG Biotech), segundo (Rosa e Lachance, 1998).

A reação de amplificação foi realizada utilizando-se o termociclador PCR Express

(Thermo Hybaid). Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose 1% (p/v),

conforme descrito anteriormente.

21

4.2.3 Purificação dos produtos de PCR e reação de s eqüenciamento

Os amplicons gerados pela reação de PCR com os iniciadores NL1 e NL4

foram purificados por meio da técnica com Polietilenoglicol (PEG), descrita por Santos

(2010). O produto purificado foi quantificado em NanoDrop ND 1000 (NanoDrop

Technologies).

As reações de seqüenciamento foram realizadas utilizando-se o DYEnamicTM

(Amershan Biosciences, USA) em combinação com o sistema de seqüenciamento

automatizado MegaBACETM 1000.

4.2.4 Análise das seqüências

As seqüências de DNA foram analisadas utilizando o programa BLASTn (Basic

Local Alignment Search Tool- versão 2.2.24 do BLAST 2.0) disponível no portal NCBI

desenvolvido pelo National Center for Biotechnology (Altschul et al., 1997). As

seqüências obtidas foram comparadas com as seqüências já depositadas no

GenBank. O alinhamento das seqüências foi realizado por meio do programa CLC

Main Workbench 5.7.1.

4.3 Fotomicrografias das leveduras

As linhagens de S. cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE-2) e K. marxianus (UFV-3,

ATCC 8554 e CCT 4086) foram previamente crescidas em meio YPD2%, sob agitação

de 180 rpm a 28°C. Alíquotas de 20 µL das culturas foram aplicadas em lâminas de

vidro e fotografadas utilizando o microscópio óptico Nikon Eclipse Ti-S com objetiva de

100X e abertura numérica de 1.4. Este experimento foi conduzido no Laboratório de

Física Biológica (Departamento de Física, UFV) sob orientação do Prof. Dr. Márcio

Santos Rocha.

22

4.4 Caracterização fisiológica

4.4.1 Crescimento em placas

O crescimento em placas foi utilizado para fazer testes de tolerância à

temperatura, ao etanol e às concentrações de fonte de carbono. As linhagens de S.

cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE-2) e K. marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086)

foram previamente crescidas em meio YPD2%, sob agitação de 180 rpm a 28°C.

Diluições seriadas (1:1, 1:10 e 1:100) foram preparadas, em solução salina (0,85%

NaCl), a partir de culturas com densidade ótica (D.O.) a 600 nm correspondente a 0,5.

Um volume de 5µl de cultura de cada diluição (1:1, 1:10 e 1:100) foi aplicado em

placas YPD sólido, como mostrado na Figura 6. Os testes foram realizados em placas

com diferentes concentrações de fonte de carbono (glicose 2, 4, 8 e 16%) e na

presença ou ausência de etanol (etanol 2, 4, 6 e 8% em YPD4%). As placas foram

vedadas com parafilme e incubadas nas seguintes temperaturas: 28°C, 37°C, 42°C e

45°C por 3 dias.

Figura 6 – Desenho experimental do crescimento em placas.

4.4.2 Crescimento em microplacas

Ensaios de tolerância à temperatura, ao etanol e às concentrações de fonte de

carbono foram realizados em microplacas de 96 poços, como mostra a Figura 7,

incubadas sob agitação. As linhagens de S. cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE-2) e K.

23

marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086) foram previamente crescidas em meio

YPD2%, sob agitação de 180 rpm a 28°C. A partir do pré-inóculo foram feitas diluições

em solução salina para que a D.O(600nm) inicial de todas as linhagens fosse 0,1. Cada

linhagem foi inoculada em condições específicas na microplaca, sendo que o volume

final do meio foi 200 µl e cada ensaio foi feito em triplicata. Os testes foram feitos

variando as concentrações de fonte de carbono (glicose 2, 4, 8 e 16%) e na presença

ou ausência de etanol (etanol 2, 4, 6 e 8% em YPD4%). As placas foram vedadas

usando plástico (Platemax- axysel sealing film, Axygen) e incubadas na leitora

Versamax (microplate reader, Molecular Devices) nas temperaturas de 28°C, 37°C,

42°C e 45°C, por 16 horas.

O programa SoftMax Pro 5.3 utilizado pelo computador acoplado à leitora

Versamax foi o seguinte:

• Comprimento de onda para as leituras de densidade ótica: 600nm;

• Pré-leitura da placa vazia na D.O(600nm);

• Tempo da curva de crescimento: 16 horas;

• Temperatura de incubação definida: 28°C, 37°C, 42° C ou 45°C;

• Leituras da D.O(600nm): a intervalos de 15 minutos;

• Agitação da placa: 5 segundos antes da leitura e 5 segundos entre as

leituras.

A velocidade específica de crescimento da cultura, em cada substrato, foi

determinada pela regressão linear dos valores obtidos pelo logaritmo neperiano da

D.O.(600) na fase exponencial de crescimento, usando pelo menos cinco pontos de um

gráfico D.O.(600) versus tempo; a velocidade específica de crescimento (µ) é o

coeficiente angular da reta obtida pela regressão.

24

Figura 7 – Representações esquemáticas das microplacas geradas pelo programa SoftMax Pro 5.3. A)

Microplaca com as linhagens de S. cerevisiae, e B) Microplaca com as linhagens de K. marxianus.

4.5 Ensaios de fermentação

As linhagens de leveduras utilizadas no presente trabalho foram submetidas a

ensaios de fermentação utilizando como substrato glicose e bagaço de cana de açúcar

pré-tratado, em duas temperaturas diferentes 37°C e 42°C. As linhagens de S.

cerevisiae (LBM-1, CAT-1 e PE-2) e K. marxianus (UFV-3, ATCC 8554 e CCT 4086)

foram pré-ativadas pelo crescimento em frascos erlenmeyers de 50 mL contendo 20

mL de meio mínimo de fermentação sob agitação a 180 rpm por 16 horas a 28°C. O

meio mínimo de fermentação é composto por: tampão citrato 50 mM pH 4,8; extrato

levedura (2,5 g L-1); peptona (2,5 g L-1); NH4Cl (2 g L-1); KH2PO4 (1 g L-1); MgSO4.7H2O

(0,3 g L-1) e glicose (20 g L-1). Os ensaios de fermentação foram conduzidos em

agitador horizontal (modelo TE 420, TECNAL) a 180 rpm, a 37°C e 42°C por 12 horas.

25

4.5.1 Ensaios de fermentação com glicose

As leveduras foram testadas quanto à concentração inicial de inóculo, com

D.O.(600) inicial correspondente a 0,1 e a 2, em duas temperaturas diferentes, 37°C e

42°C, utilizando como substrato 4% (p/v) de glicose . As leveduras foram inoculadas

em 50 mL de meio mínimo de fermentação, descrito anteriormente, em frascos

erlenmeyers de 125 mL. Amostras foram retiradas a intervalos de 2 horas, para

posteriores dosagens de glicose e etanol por cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE).

4.5.2 Ensaios SSF com bagaço de cana de açúcar

4.5.2.1 Pré-tratamento ácido-básico

O bagaço de cana de açúcar (Saccharum spp.) foi cedido pelo Prof. Dr. Márcio

Henrique Pereira Barbosa (Departamento de Fitotecnia, UFV). O bagaço de cana de

açúcar triturado na concentração 10% (p/v) foi submetido a um pré-tratamento em

solução de ácido sulfúrico 0,5% a 121ºC em autoclave por 30 minutos. Em seguida, o

líquido foi coletado por filtração a vácuo e o resíduo sólido foi submetido ao pré-

tratamento básico em solução de NaOH 4% (p/v) por 30 minutos a 121ºC em

autoclave. Posteriormente o bagaço foi lavado com 500 mL de água deionizada

quente seguido de secagem a 50ºC por 24 horas. O sólido obtido foi denominado

celulose.

4.5.2.2 Sacarificação e fermentação simultânea a 37 °C e a 42°C

Experimentos de SSF foram realizados em frascos erlenmeyers de 125 mL,

cada um contendo 50 mL de meio mínimo de fermentação (sem glicose). A fração

sólida obtida do pré-tratamento ácido/básico foi utilizada como substrato na

concentração 8% (p/v). Inicialmente foi feito uma pré-hidrólise a 50°C por 72 horas,

utilizando enzima comercial (Celluclast 1.5 L) na concentração 15 FPU por grama de

substrato. Após a pré-hidrólise as leveduras foram inoculadas de forma que a D.O.(600)

inicial fosse correspondente a 2. Ensaios SSF foram realizados sob condições estéreis

e a fermentação foi realizada a 37°C e 42°C por 12 horas. Amostras foram retiradas a

26

intervalos de 2 horas, para posteriores dosagens de glicose e etanol por cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE).

4.6 Parâmetros fermentativos

O rendimento de etanol por celulose consumida (Y E/C) foi calculado ao final de

12 horas de fermentação dividindo-se a diferença da massa final e inicial de etanol

pela massa inicial de celulose, ambas expressas em gramas (g).

Y E/C= (massa final de etanol (g) – massa inicial de etanol(g))/

massa inicial de celulose (g))

O rendimento de etanol por glicose consumida (Y E/G) foi calculado ao final de

12 horas de fermentação dividindo-se a diferença da massa final e inicial de etanol

pela massa inicial e final de glicose, ambas expressas em gramas (g).

Y E/G= (massa final de etanol (g) – massa inicial de etanol(g))/

massa inicial de glicose (g) – massa final de glicose (g))

4.7 Métodos analíticos – Concentrações de Glicose e Etanol

A quantificação de glicose e etanol foi realizada por cromatografia líquida de alta

eficiência (HPLC), utilizando uma coluna de troca iônica Aminex HPX-87H (Bio-Rad),

mantido a 60°C. O eluente para a separação foi ácid o sulfúrico 5 mM, aplicado a uma

taxa de eluição 0,7 mL min-1. A coluna foi acoplada ao detector de índice de refração

HP 1047 A.

Na montagem dos métodos foram preparados padrões de 5, 6,25, 10, 12,5 e 20

mM para glicose e 10, 12,5, 20 e 40 mM para etanol (Anexos 1 e 2). As amostras,

quando necessário, foram diluídas. As concentrações determinadas permitiram

calcular o consumo de glicose e produção de etanol ao longo do tempo de

fermentação. As dosagens foram realizadas no Laboratório de Fisiologia de Micro-

organismos (Departamento de Microbiologia Agrícola, UFV), sob coordenação da Prof.

Dra. Flávia Maria Lopes Passos, e no Laboratório de Microbiologia de Anaeróbios

27

(Departamento de Microbiologia Agrícola, UFV), sob coordenação do Prof. Dr. Hilário

Cuquetto Mantovani.

28

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Identificação molecular da levedura

Tradicionalmente, a classificação e identificação de linhagens e espécies de

leveduras têm sido baseadas em características morfológicas e habilidades

fisiológicas, sendo um processo laborioso e que consome tempo. Dadas as

dificuldades deste processo, técnicas moleculares utilizando a amplificação de

fragmentos específicos de DNAs têm sido utilizadas como métodos alternativos para

identificação de leveduras (Kurtzman e Robnett, 1998).

Atualmente, o método molecular mais utilizado para estudos em taxonomia e

identificação de leveduras baseia-se na comparação de seqüências da região D1/D2

do gene rDNA 26S e/ou do gene rDNA 18S. Organismos que exibem 99% ou mais de

identidade nesta região são considerados como pertencentes à espécie conhecida e

depositada no GenBank (Kurtzman e Robnett, 1998; Kawahata et al., 2007).

Neste sentido, foi feito o sequenciamento da região D1/D2 da subunidade 26S do

DNA ribossomal do novo isolado LBM-1. O resultado do seqüenciamento foi

submetido à comparação com seqüências do banco de dados GenBank utilizando o

programa BLASTn. A análise confirmou o novo isolado como pertencente à espécie S.

cerevisiae. Outras técnicas para melhor caracterizar o isolado estão em andamento no

Laboratório de Biotecnologia Molecular, como por exemplo, a determinação do

cariótipo.

5.2 Fotomicrografia das leveduras

Buscando conhecer melhor o isolado S. cerevisiae LBM-1 foi feita uma

fotomicrografia das leveduras. Na Figura 9 podem-se observar algumas características

comuns dentro da mesma espécie. As linhagens de S. cerevisiae mostraram-se

agrupadas em cachos, são maiores que as linhagens de K. marxianus e apresentam

morfologia esférica. As células de K. marxianus, apresentaram-se isoladas umas das

outras e com aspecto elíptico.

29

Figura 8 – Fotomicrografias utilizando o microscópio óptico Nikon Eclipse Ti-S com objetiva de 100X e abertura numérica de 1.4. A) LBM-1, B) CAT-1, C) PE-2, D) UFV-3, E) ATCC 8554 e F) CCT 4086.

5.3 Avaliação do crescimento das leveduras em meio sólido

De uma forma geral, a seleção de leveduras é feita por meio da avaliação do

crescimento em diferentes condições utilizando placas contendo meio sólido. Neste

sentido, a caracterização do perfil de crescimento de linhagens selvagens faz-se

necessária para posterior utilização destes parâmetros em experimentos de

melhoramento genético. Sabendo-se das condições limites para desenvolvimento das

leveduras pode-se fazer o melhoramento, realizando os experimentos em placas com

meio sólido para seleção dos mutantes. Além disto, a utilização de meio sólido é bem

mais prática para uma análise inicial e direcionar os parâmetros que serão utilizados

nos experimentos em meio líquido. Geralmente as fermentações industriais de etanol

são realizadas em meios contendo açúcares em concentrações acima de 10% (p/v).

Com o intuito de analisar os efeitos da temperatura e de concentrações de açúcares

no crescimento das leveduras foi realizada uma série de experimentos de crescimento

em meio sólido. Para tanto as leveduras foram plaqueadas em diferentes diluições no

meio contendo diferentes concentrações de glicose e incubadas nas seguintes

temperaturas: 30, 37, 42 e 45°C. Os resultados dest es testes estão apresentados no

Quadro 1.

30

Quadro 1 – Avaliação do crescimento de linhagens de leveduras em meio YP contendo diferentes concentrações de glicose e em diferentes temperaturas *.

Linhagens de

Leveduras

Temperatura 30°C Temperatura 37°C Temperatura 42°C Temperatura 45°C Concentrações de glicose

(p/v) Concentrações de glicose



(p/v) 2% 4% 8% 16% 2% 4% 8% 16% 2% 4% 8% 16% 2% 4% 8% 16%

S. cerevisiae LBM-1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - + +++ +++ S. cerevisiae CAT-1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - ++ +++ S. cerevisiae PE-2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - ++ +++

K. marxianus UFV-3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ K. marxianus ATCC 8554 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ K. marxianus CCT 4086 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Quadro 2 - Avaliação do crescimento de linhagens de leveduras em meio YPD 4% contendo diferentes concentrações de etanol e em diferentes temperaturas *.

Linhagens de

Leveduras

Temperatura 30°C Temperatura 37°C Temperatura 42°C Temperatura 45°C Concentrações de etanol (v/v) Concentrações de etanol (v/v) Concentrações de etanol (v/v) Concentrações de etanol (v/v) 2% 4% 6% 8% 10% 2% 4% 6% 8% 10% 2% 4% 6% 8% 10% 2% 4% 6% 8% 10%

S. cerevisiae LBM-1 +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ ++ - +++ +++ - - - +++ - - - - S. cerevisiae CAT-1 +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +++ - +++ +++ - - - +++ - - - - S. cerevisiae PE-2 +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ ++ - +++ +++ - - - +++ - - - -

K. marxianus UFV-3 +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - +++ + - - - +++ - - - - K. marxianus ATCC 8554 +++ +++ +++ + - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - K. marxianus CCT 4086 +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - -

31

Pode-se observar que as linhagens testadas cresceram em todas as diluições e

em todas as concentrações de glicose até 42°C. No e ntanto, a 45°C observa-se que

as linhagens de S. cerevisiae somente foram capazes de crescer em meios com

maiores concentrações de glicose, 8 e 16% (p/v), enquanto as K. marxianus

cresceram nas quatro concentrações de glicose testadas, evidenciando a maior

termotolerância desta espécie (Singh et al., 1998; Abdel-Fattah et al., 2000;

Ballesteros et al., 2004; Hong et al., 2007; Nonklang et al., 2008; Suryawati et al.,

2008).

O fato das linhagens de S. cerevisiae crescerem em meio sólido até 45°C em

altas concentrações de glicose, fato este não relatado ainda para leveduras desta

espécie, nos levou a testar o crescimento destas linhagens em meio líquido com

agitação, uma vez que a agitação provoca um maior estresse nas células, pelo maior

contato delas com o meio e, portanto o efeito osmótico poderia ser mais pronunciado.

Concomitantemente, esta observação foi instigante, uma vez que o aumento da

concentração de açúcares leva a um estresse osmótico das leveduras (Lima et. al.,

2001), apesar de que para as condições testadas este estresse não exerceu um efeito

de inibir o crescimento das leveduras como pode ser observado no Quadro 1.

Curiosamente, quando o experimento foi realizado a 45 °C, foi observado que as

linhagens de S. cerevisiae somente cresciam em concentrações de 8 e 16% (p/v) de

glicose. Este fato pode ter ocorrido devido a um mecanismo chamado de “tolerância

cruzada” (cross-tolerance), no qual um tipo de estresse como o estresse por

temperatura dá uma proteção parcial contra outros estresses como o osmótico ou

salino (Koedrith et al., 2008). Como um dos principais efeitos da temperatura é o

aumento da fluidez da membrana plasmática pode se especular que um meio

hipertônico impeça a entrada de água evitando a lise das leveduras em temperaturas

mais altas, mas este possível mecanismo de tolerância cruzada sugerido pelos

experimentos está sendo investigado.

Assim como descrito anteriormente, foram feitas análises do estresse provocado

pelo etanol nas leveduras em diferentes temperaturas. No Quadro 2 pode-se observar

que o estresse provocado pelo etanol nas leveduras é mais drástico do que o estresse

provocado pela variação na concentração de glicose.

A uma temperatura de 30°C, linhagens de S. cerevisiae apresentaram bom

crescimento até 8% (v/v) de etanol e um fraco crescimento em 10% (v/v) de etanol.

Nesta mesma temperatura, as linhagens de K. marxianus somente cresceram até uma

concentração de 6% (v/v) de etanol, confirmando a maior tolerância de S. cerevisiae

ao etanol em comparação com outras leveduras (Abdel-Banat et al., 2010).

32

No entanto, a combinação do estresse do etanol com a temperatura foi mais

relevante para S. cerevisiae, que teve um decréscimo na tolerância de 10% (v/v) de

etanol a 30°C para 4% (v/v) a 42°C, enquanto que pa ra as linhagens de K. marxianus

foi observado um decréscimo bem menor, de 6% (v/v) de etanol a 30°C para 4% (v/v)

a 42°C. Supõe-se que a combinação dos estresses ten ha um efeito maior para S.

cerevisiae, uma vez que as linhagens de K. marxianus são mais termotolerantes que

as linhagens selvagens de S. cerevisiae, embora a concentração máxima de etanol

suportada pelas linhagens não tenham sido diferentes.

5.4 Avaliação do crescimento das leveduras em meio líquido

Para melhor caracterizar o crescimento destas linhagens em diferentes

condições, foram feitos experimentos em microplacas contendo meio líquido e por

meio destes foram traçadas curvas de crescimento, utilizando o programa SigmaPlot

(versão 11.0). A curva de crescimento permitiu que fosse observado o

desenvolvimento dos micro-organismos em diferentes condições, sob temperatura

controlada e agitação adequada (Hiss, 2001).

A 30°C (Anexo 3) e a 37 °C (Figura 9) todas as linh agens apresentaram um bom

crescimento em todas as concentrações de glicose. Foi considerado bom crescimento,

possuir uma fase lag (fase de adaptação) com um período curto de duração, cerca de

2 horas, seguida de uma fase exponencial com D.O.(600) variando entre 1,0 e 1,5. Era

esperado que todas as linhagens crescessem nestas condições, uma vez que a

maioria dos micro-organismos fermentativos cresce numa temperatura ótima entre

30°C e 37°C (Olsson et al., 2006). Pode-se observar que as linhagens de K. marxianus

crescidas em glicose 16% (p/v) são ligeiramente menos tolerantes ao estresse

osmótico do que as linhagens de S. cerevisiae nestas mesmas condições (Figura 9- D,

E e F). Este efeito foi mais marcante para a linhagem CCT 4086, no qual se pode

observar na Figura 9-F um aumento na fase lag de 3 a 4 horas e uma D.O.(600) máxima

de 0,78 ± 0,038.

33

Figura 9 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de glicose a 37°C. Painéis A, B e C correspondem às linhagens de S. cerevisiae. Painéis D, E e F correspondem às linhagens de K. marxianus.

34

A 42°C (Figura 10) as linhagens de K. marxianus apresentaram um melhor

crescimento em relação as linhagens de S. cerevisiae comprovando a sua já descrita

termotolerância. As linhagens LBM-1 (Figura 10-A) e CAT-1 (Figura 10-B) não

conseguiram crescer a 42°C em 2% (p/v), de glicose, entretanto, em concentrações de

glicose mais altas, 4, 8 e 16% (p/v), cresceram normalmente. A linhagem PE-2 teve

um crescimento menor quando comparada à LBM-1 e CAT-1, nas mesmas condições

(Figura 10-C). Normalmente, linhagens de S. cerevisiae não são capazes de crescer

em temperaturas maiores que 40°C (Sree et al., 2000), isto faz com que LBM-1, assim

como as linhagens CAT-1 e PE-2, sejam boas candidatas ao processo SSF.

Na Figura 11 pode-se observar que as linhagens de K. marxianus cresceram em

diferentes concentrações de glicose a 45°C, enquant o que as linhagens de S.

cerevisiae não foram capazes de crescer em qualquer concentração de glicose com

exceção de LBM-1 que apresentou um crescimento residual em 4, 8 e 16% de glicose

(Figura 11-A). Para a linhagem UFV-3 (Figura 11-D) foi observado o mesmo fenômeno

descrito para LBM-1 (Figura 11-A) e CAT-1 (Figura 11-B), ou seja, quando há um

estresse por altas temperaturas, as linhagens necessitaram de maiores concentrações

de açúcar para crescer.

A capacidade das linhagens crescerem em altas concentrações de açúcares, até

16% (p/v) de glicose, é uma característica muito desejada em processos industriais,

uma vez que maiores concentrações de açúcares no mosto a ser fermentado

permitem uma elevada taxa de conversão em etanol, aumentando o rendimento da

fermentação por reator e facilitando o processo de destilação.

35


36


37

Para verificar a capacidade termotolerante das linhagens, foi feita uma

comparação das velocidades específicas de crescimento (µ h-1) em diferentes

temperaturas. Desta forma, foi escolhida uma concentração de glicose (4% (p/v)) na

qual as linhagens cresceram melhor em diferentes temperaturas para os cálculos dos

valores de µ.

Na Tabela 2 pode-se observar que a velocidade específica de crescimento das

linhagens de S. cerevisiae foi similar a 30°C. À temperatura de 37°C as linha gens

CAT-1 e PE-2 apresentaram o maior valor de µ, 0,368 e 0,318 respectivamente,

quando comparadas a LBM-1. A 42°C as três linhagens de S. cerevisiae apresentaram

comportamento semelhante, com alta velocidade específica de crescimento. A 45°C o

crescimento das linhagens de S. cerevisiae cai substancialmente, sendo que a única

linhagem que ainda apresentou um crescimento foi LBM-1. Com isto, pode-se concluir

que a temperatura máxima tolerada por estas linhagens de S. cerevisiae é 42°C. Outro

fato a ser destacado, é o comportamento termotolerante da linhagem LBM-1. Isto

porque, esta linhagem é um isolado novo, diferentemente das linhagens, CAT-1 e PE-

2, que estão passando por pressão seletiva há muitos anos nos processos

fermentativos industriais.

As linhagens de K. marxianus apresentaram valores de velocidade de

crescimento bem superiores aos das linhagens de S. cerevisiae. A linhagem UFV-3

apresentou valores similares de µ para temperaturas de 30°C, 37°C e 42°C, sendo

que a 45°C apresentou uma diminuição na velocidade de crescimento. Por outro lado,

as linhagens de coleções biológicas ATCC 8554 e CCT 4086 apresentaram valores

similares de velocidade de crescimento independente das temperaturas. Estes dados

de termotolerância estão consistentes com a literatura, uma vez que já foi

demonstrado que K. marxianus cresce rapidamente mesmo em temperaturas acima

de 40°C (Fonseca et al., 2008).

A termotolerância observada nas linhagens testadas é de extrema importância

para viabilizar o processo SSF a partir do bagaço de cana de açúcar. Dessa forma,

decidimos selecionar duas temperaturas, 37°C e 42°C , nas quais todas as linhagens

testadas foram capazes de crescer para realizar os ensaios de fermentação e de SSF.

38

Tabela 2 - Velocidade específica de crescimento (µ) e D.O.(600) máxima em microplacas contendo meio YPD 4% em diferentes temperaturas.

Linhagens Velocidade de

Crescimento µ h-1

D.O.(600)

Temperaturas Temperaturas

30°C 37°C 42°C 45°C 30°C 37°C 42°C 45°C

LBM-1 0,126 0,218 0,274 0,114 1,18 1,08 0,61 0,15

CAT-1 0,181 0,368 0,230 0,033 1,28 1,24 0,86 0,15

PE-2 0,151 0,318 0,195 0,055 1,27 1,10 0,34 0,13

UFV-3 0,456 0,401 0,384 0,174 0,79 1,05 0,87 0,34

ATCC 8554 0,407 0,386 0,375 0,317 0,56 0,72 0,75 0,63

CCT 4086 0,358 0,353 0,377 0,332 0,73 0,89 1,17 0,68

Processos fermentativos requerem micro-organismos que possuam boa

capacidade fermentativa e que sejam tolerantes a altas concentrações de etanol.

Dessa forma, experimentos de caracterização quanto a tolerância ao etanol foram

realizados em microplacas e por meio destes foram feitas curvas de crescimento,

utilizando o programa SigmaPlot (versão 11.0).

A Figura 12 mostra a variação do crescimento em diferentes concentrações de

etanol em função da temperatura 30°C. As linhagens de S. cerevisiae apresentaram

um perfil de tolerância até 8% (v/v), de etanol sendo que o novo isolado LBM-1 (Figura

12-A) mostrou-se tão tolerante ao etanol quando as linhagens industriais CAT-1

(Figura 12-B) e PE-2 (Figura 12-C). Por outro lado, as linhagens de K. marxianus

apresentaram uma menor tolerância ao etanol, sendo que as linhagens de coleções

biológicas ATCC 8554 (Figura 12-E) e CCT 4086 (Figura 12-F) toleraram

concentrações mais altas de etanol, até 6% (v/v), do que a linhagem UFV-3 (Figura

12- D), crescendo somente até 4% (v/v) de etanol.

Na Figura 13 pode-se verificar que o aumento da temperatura para 37°C não

alterou significativamente o crescimento das linhagens de S. cerevisiae (Figura 13-A,

B, C), entretanto quando o crescimento foi avaliado em temperaturas mais elevadas,

42°C (Figura 14- A, B, C) e 45°C (Figura 15-A, B, C ), pode-se observar uma grande

redução no crescimento das mesmas, sendo que a 42°C nenhuma linhagem

conseguiu crescer nas concentrações mais altas de etanol, 6 e 8% (v/v). Portanto, a

45°C o ensaio não foi realizado nestas condições (F igura 15-A, B, C). As linhagens de

K. marxianus mostraram-se menos tolerantes ao etanol em comparação com as

39

linhagens de S. cerevisiae, (Figuras 12 a 15). Estes dados corroboram com a

literatura, que demonstram que S. cerevisiae tolera maiores concentrações de etanol,

enquanto K. marxianus toleram temperaturas mais altas (Fonseca et al., 2008).

40

Figura 12 - Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de etanol a 30°C. Painéis A, B e C correspondem às linhagens de S. cerevisiae. Painéis D, E e F correspondem às linhagens de K. marxianus.

41


42


43


44

5.5 Ensaios de fermentação em glicose

Diversos fatores afetam o rendimento da fermentação, tais como a temperatura,

a concentração de nutrientes, a presença de inibidores e o micro-organismo

fermentador. As leveduras afetam diretamente o desempenho do processo

fermentativo, seja pela concentração a ser inoculada, pela espécie, linhagem e até

mesmo por sofrer contaminação bacteriana. Maiores concentrações de levedura na

dorna permitem fermentações mais rápidas, com maior produtividade e maior controle

sobre as bactérias contaminantes, além de restringir o crescimento da própria

levedura, favorecendo a fermentação (Lima et. al., 2001).

A fim de estabelecer a quantidade ideal de inóculo a ser utilizada e o micro-

organismo adequado ao processo fermentativo foi feita a comparação de linhagens de

S. cerevisiae e K. marxianus, em diferentes concentrações de inóculo, D.O.(600)= 0,1 e

D.O.(600)= 2, em 50 mL de meio mínimo de fermentação, contendo 4% (v/v) de glicose,

e em condições controladas durante 12 horas de fermentação.As tabelas 3 e 4

mostram as concentrações final e inicial de glicose e etanol e os rendimentos obtidos,

após 12 horas de fermentação começando com D.O.(600) inicial correspondente a 0,1.

Nas duas temperaturas testadas, 37°C (Tabela 3) e 4 2°C (Tabela 4), foram verificadas

uma grande quantidade de glicose residual, mostrando que nestas condições a

fermentação tem que ser conduzida por um período superior a 12 horas para obtermos

o máximo de conversão. Além disto, parece que uma menor quantidade de leveduras

no meio desvia parte dos carbonos para produção de biomassa o que é sugerido pelo

baixo rendimento em etanol comparado com o valor teórico 0,51.

Tabela 3 – Fermentação a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 0,1, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (p/v).

Linhagem

de levedura

Glicose

inicial

(g L -1)

Glicose

final

(g L -1)

Etanol

inicial

(g L -1)

Etanol

final

(g L -1)

Y E/G

(g etanol/

g glicose)

LBM-1 47,81 26,52 0 4,54 0,21

CAT-1 47,81 27,08 0 4,46 0,22

PE-2 47,81 30,27 0 4,34 0,25

UFV-3 47,81 30,41 0 2,96 0,17

ATCC 8554 47,81 29,66 0 2,74 0,15

CCT 4086 47,81 30,13 0 2,34 0,13

45

Tabela 4 - Fermentação a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 0,1, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (p/v).

Linhagem

de levedura

Glicose

inicial

(g L -1)

Glicose

final

(g L -1)

Etanol

inicial

(g L -1)

Etanol

final

(g L -1)

Y E/G

(g etanol/

g glicose)

LBM-1 43,17 28,21 0 5,27 0,35

CAT-1 43,17 31,58 0 4,40 0,38

PE-2 43,17 29,13 0 3,81 0,27

UFV-3 43,17 24,69 0 4,11 0,21

ATCC 8554 43,17 19,25 0 6,20 0,26

CCT 4086 43,17 28,86 0 3,71 0,26

As figuras 16 e 17 representam o perfil fermentativo das linhagens em 50 mL de

meio de fermentação acrescido de glicose 4% em D.O.(600) correspondente a 2, a 37°C

e 42°C respectivamente. A 37°C pode-se observar que tanto as linhagens de S.

cerevisiae quanto as linhagens de K. marxianus consumiram toda a glicose presente

no meio, produzindo em média 20 (g L-1) de etanol, fazendo com que o rendimento

fermentativo das linhagens fosse muito parecido nesta temperatura (Figura 16 e

Tabela 5).

A 42°C as linhagens apresentaram entre si um compor tamento similar,

entretanto ocorreu um aumento da glicose residual para as linhagens LBM-1, CAT-1,

PE-2 e UFV-3, enquanto ATCC 8554 e CCT 4086 consumiram toda a glicose do meio

(Figura 17). A produção final de etanol foi muito similar para todas as linhagens, com

valores maiores para ATCC 8554 e CCT 4086, 12,11 (g L-1) e 12,06 (g L-1) de etanol

respectivamente (Tabela 6). Entretanto, o rendimento final da fermentação não foi

substancialmente maior para estas linhagens, assim ATCC 8554 e CCT 4086

utilizaram a glicose para produzir biomassa, enquanto que as outras linhagens

favoreceram a fermentação, produzindo mais etanol. As K. marxianus são

conhecidamente leveduras crabtree negativas tendo um metabolismo respiro-

fermentativo o que leva a um menor rendimento de etanol em aerobiose quando

comparado a linhagens de S. cerevisiae.

Desta forma, estes ensaios mostraram que iniciar a fermentação com uma

D.O.(600) mais alta, correspondente a 2, favorece um aumento no rendimento do

processo. A elevada concentração de leveduras na cultura diminui substancialmente a

46

fase inicial, caracterizada por intensa multiplicação celular, o que permite que se entre

rapidamente na fase fermentativa (Lima et. al., 2001).

Figura 16 - Fermentação a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v).

47

Figura 17 - Fermentação a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (v/v).

48

Tabela 5 - Fermentação a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (p/v).

Linhagem

de levedura

Glicose

inicial

(g L -1)

Glicose

final

(g L -1)

Etanol

inicial

(g L -1)

Etanol

final

(g L -1)

Y E/G

(g etanol/

g glicose)

LBM-1 47 0,041 0 21,7 0,46

CAT-1 47 0 0 22,77 0,48

PE-2 47 1,20 0 22,24 0,49

UFV-3 47 1,93 0 18,53 0,41

ATCC 8554 47 0 0 19,66 0,42

CCT 4086 47 0 0 18,1 0,39

Tabela 6 - Fermentação a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de glicose 4% (p/v).

Linhagem

de levedura

Glicose

inicial

(g L -1)

Glicose

final

(g L -1)

Etanol

inicial

(g L -1)

Etanol

final

(g L -1)

Y E/G

(g etanol/

g glicose)

LBM-1 47 10,35 0 10,64 0,29

CAT-1 47 9,82 0 9,92 0,27

PE-2 47 17,19 0 8,47 0,28

UFV-3 47 16,11 0 7,24 0,23

ATCC 8554 47 0,33 0 12,11 0,26

CCT 4086 47 0,05 0 12,06 0,26

5.6 Ensaios de SSF com bagaço de cana de açúcar

A fim de analisar a capacidade fermentativa das linhagens termotolerantes em

processo SSF, foram feitos ensaios com bagaço de cana de açúcar utilizando

parâmetros definidos na caracterização fisiológica e nos ensaios de fermentação.

Por meio de uma comunicação pessoal (Carlos Joulbert Alves de Souza,

mestrando do Laboratório Biotecnologia Molecular/UFV), foram estabelecidas as

condições de realização do processo SSF. Neste sentido, os experimentos de SSF

foram realizados em duas temperaturas, 37°C e 42°C, e utilizando uma concentração

inicial de inóculo correspondente a D.O.(600) igual a 2. Inicialmente, o bagaço, 8% (p/v),

foi submetido a uma pré-hidrólise por 72 horas a 50°C utilizando 15 FPU por grama de

49

substrato de celulases comerciais. Após a pré-hidrólise, as leveduras foram inoculadas

e a fermentação seguiu-se por 12 horas. A função da pré-hidrólise é fornecer uma

fonte inicial de carbono para a levedura, uma vez que a celulose não é uma fonte de

carbono diretamente fermentável.

Nas tabelas 7 e 8 estão descritas as concentrações e os rendimentos obtidos

pelo processo SSF em difrentes temperaturas para as linhagens analisadas. Em

ambas as temperaturas, foram calculados de duas formas diferentes o rendimento do

processo.

O rendimento (Y E/G) em função da concentração de glicose incial foi

considerado a partir da concentração de glicose existente no meio no momento do

inóculo da levedura. No entanto, para processo SSF esta não é uma forma correta de

se calcular o rendimento, uma vez que a hidrólise acontece simultânea à fermentação.

Portanto, a liberação de glicose continua ocorrendo no meio enquanto a levedura está

utilizando-a para crescer e/ou fermentar.

O rendimento (Y E/C) em função da concentração de celulose foi considerado a

partir da biomassa, ou seja, do bagaço de cana pré-tratado utilizado na concentração

de 8% (p/v). Neste sentido, o cálculo do rendimento a partir do bagaço é mais correto.

Entretanto, como alguns artigos ainda calculam o rendimento do SSF a partir da

glicose inicial decidiu-se estabelecer esta comparação.

De acordo com os dados obtidos nas tabelas 7 e 8, Y E/G é muito superior a Y

E/C nas linhagens avaliadas, entretanto esta forma de calcular Y E/G faz com que o

rendimento seja até maior que o rendimento teórico do processo, que corresponde a

0,51.

Trabalhos anteriores realizados por Carlos Joulbert Alves de Souza analisaram a

influência do tempo de pré-hidrolise no rendimento em etanol pelas linhagens LBM-1 e

UFV-3 (dados não publicados). Em seus experimentos, o pesquisador concluiu que

72 horas seria o tempo ideal de pré-hidrólise para início da fermentação. No entanto,

não foi possível concluir se com 72 horas as celulases perdiam a atividade enzimática

ou se neste momento as enzimas passavam a sofrer inibição pelo produto. As tabelas

5, 6, 7 e 8 mostram que iniciando ambos os processos com cerca de 40 g L-1, obtém-

se uma concentração maior de etanol no processo SSF, demonstrando após as 72

horas iniciais de pré-hidrólise, as celulases pararam de agir por inibição pelo produto.

50

Tabela 7 – SSF a 37°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de bagaço de cana de açúcar 8% (p/v).

Linhagem

de levedura

Celulose

inicial

(g L -1)

Glicose

inicial

(g L -1)

Etanol final

(g L -1)

Y E/C

(g etanol/

g celulose)

Y E/G

(g etanol/

g glicose)

LBM-1 80 32,56 22,24 0,28 0,68

CAT-1 80 33,36 21,08 0,26 0,63

PE-2 80 32,93 19,43 0,24 0,59

UFV-3 80 36,64 22,62 0,28 0,62

ATCC 8554 80 35,38 22,32 0,28 0,63

CCT 4086 80 35 21,48 0,27 0,61

Tabela 8 - SSF a 42°C com D.O. (600) inicial correspondente a 2, em 50 mL de meio de fermentação acrescido de bagaço de cana de açúcar 8% (p/v).

Linhagem

de

levedura

Celulose

inicial

(g L -1)

Glicose

inicial

(g L -1)

Etanol final

(g L -1)

Y E/C

(g etanol/

g celulose)

Y E/G

(g etanol/

g glicose)

LBM-1 80 37,11 16,63 0,21 0,47

CAT-1 80 38,99 22,84 0,29 0,59

PE-2 80 37,3 20,31 0,25 0,54

UFV-3 80 32,6 16,12 0,20 0,51

ATCC 8554 80 41,03 16,95 0,21 0,43

CCT 4086 80 35,1 13,30 0,17 0,41

Nos últimos anos têm-se isolado e caracterizado leveduras termotolerantes,

visando sua utilização em processos SSF. A tabela 9 mostra o rendimento de etanol,

obtido com a utilização de linhagens termotolerantes, em relação a diferentes

biomassas pré-tratadas. Nota-se que algumas dessas linhagens são capazes de

fermentar na temperatura de 45°C. Entretanto, rendi mentos maiores em etanol são

obtidos quando o processo é realizado a 37° e 42°C. Acima de 40°C, a viabilidade das

culturas de leveduras diminui consideravelmente, o que afeta a produção de etanol

(Suryawati et al., 2008).

Analisando os valores de rendimento em etanol obtidos neste experimento

(Tabelas 7 e 8), nota-se que os valores foram próximos aos isolados de S. cerevisiae e

51

K. marxianus já descritos na literatura. Os elevados rendimentos observados nos

experimentos de Rudolf et al. (2007), 0,35 e 0,36 (Tabela 9) devem-se ao uso de uma

maior carga enzimática na hidrólise, principalmente de β-glicosidase, visando diminuir

a inibição das celulases pelo acúmulo de celobiose. A quantidade e custo das enzimas

impactam significativamente o processo.

Comparando-se o rendimento obtido por Santos e colaboradores (2010), com os

rendimentos obtidos pelo presente trabalho, nota-se a importância do uso de

leveduras termotolerantes para o processo SSF (Tabela 9). Por utilizar uma linhagem

de S. cerevisiae não termotolerante, os autores observaram que foi necessário

aumentar a carga enzimática da pré-hidrólise e resultando num rendimento final de

0,15, rendimento muito inferior ao obtido pelo presente trabalho (Tabelas 7 e 8).

Os ensaios de SSF tanto a 37°C, quanto a 42°C, most raram valores de Y E/C

muito similares. Por outro lado, os ensaios a 37°C apresentaram uma produção maior

de etanol que a 42°C, fato que pode ser relacionado à maior capacidade fermentativa

das linhagens nesta temperatura. Com isto pode-se concluir que todas as linhagens

utilizadas podem ser utilizadas para viabilizarem o processo SSF.

52

Biomassa Cepa de levedura

Temperatura (°C) Carga enzimática

Concentração de etanol

(g L -1)

YE/B Tempo de fermentação

(horas)

Fonte

80 g L-1 Bagaço de cana

S. cerevisiae 32 30 FPU/g celulases 20 CBU/g β-glicosidase

12 0,15 72 Santos et al., 2010

75 g L-1 Panicum virgatum

K. marxianus IMB3 45 15 FPU/g celulases 19,43 0,26 168 Faga et al., 2010

72,44 g L-1 Panicum virgatum

K. marxianus IMB4 37 15 FPU/g celulases 12,3 0,17 72 Suryawati et al., 2008


S. cerevisiae D5A 37 15 FPU/g celulases 14 0,19 72 Suryawati et al., 2008


K. marxianus IMB4 41 15 FPU/g celulases 14,8 0,2 72 Suryawati et al., 2008


S. cerevisiae TMB3400

37 12 FPU celulases 12 IU β-glicosidase

18,2 0,36 90 Rudolf et al., 2007


S. cerevisiae TMB3400

37 12 FPU celulases 12 IU β-glicosidase

26 0,35 90 Rudolf et al., 2007

75 g L-1 Celulose cristalina

K. marxianus CECT 10875

42 15 FPU/g celulases 26,1 0,35 72 Tomás-Pejó et al., 2008


S. cerevisiae NRRL-Y-132

40 40 FPU/g celulases 25 0,25 72 Hari et al., 2001


S. cerevisiae LBM-1 37 15 FPU/g de celulases 13,78 0,15 80 Este trabalho


K. marxianus UFV-3

42 15 FPU/g de celulases 15,98 0,18 80 Este trabalho

Tabela 9 - Rendimento em etanol obtido com a utilização de linhagens termotolerantes de K. marxianus e S. cerevisiae, em relação a diferentes biomassas pré-tratadas.

53

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABDEL-BANAT, B. M.; HOSHIDA, H.; ANO, A.; NONKLANG, S.; AKADA, R. High-temperature fermentation: how can processes for ethanol production at high temperatures become superior to the traditional process using mesophilic yeast? Appl Microbiol Biotechnol [S.I.], v. 85, n. 4, p. 861-7, Jan 2010. ABDEL-FATTAH, W. R.; FADIL, M.; NIGAM, P.; BANAT, I. M. Isolation of thermotolerant ethanologenic yeasts and use of selected strains in industrial scale fermentation in an Egyptian distillery. Biotechnol Bioeng [S.I.], v. 68, n. 5, p. 531-5, Jun 5 2000. ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHAFFER, A. A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.; MILLER, W.; LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res [S.I.], v. 25, n. 17, p. 3389-402, Sep 1 1997. ALVIRA, P.; TOMAS-PEJO, E.; BALLESTEROS, M.; NEGRO, M. J. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresour Technol [S.I.], v. 101, n. 13, p. 4851-61, Jul 2010. ARGUESO, J. L.; CARAZZOLLE, M. F.; MIECZKOWSKI, P. A.; DUARTE, F. M.; NETTO, O. V.; MISSAWA, S. K.; GALZERANI, F.; COSTA, G. G.; VIDAL, R. O.; NORONHA, M. F.; DOMINSKA, M.; ANDRIETTA, M. G.; ANDRIETTA, S. R.; CUNHA, A. F.; GOMES, L. H.; TAVARES, F. C.; ALCARDE, A. R.; DIETRICH, F. S.; MCCUSKER, J. H.; PETES, T. D.; PEREIRA, G. A. Genome structure of a Saccharomyces cerevisiae strain widely used in bioethanol production. Genome Res [S.I.], v. 19, n. 12, p. 2258-70, Dec 2009. BAKKER, B. M.; BRO, C.; KOTTER, P.; LUTTIK, M. A.; VAN DIJKEN, J. P.; PRONK, J. T. The mitochondrial alcohol dehydrogenase Adh3p is involved in a redox shuttle in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol [S.I.], v. 182, n. 17, p. 4730-7, Sep 2000. BALLESTEROS, M.; OLIVA, J. M.; NEGRO, M. J.; MANZANARES, P.; BALLESTEROS, I. Ethanol from lignocellulosic materials by a simultaneous saccharification and fermentation process (SFS) with Kluyveromyces marxianus CECT 10875. Process Biochemistry [S.I.], v. 39, n. 12, p. 1843-1848, Oct 29 2004. BARNETT, J. A. Beginnings of microbiology and biochemistry: the contribution of yeast research. Microbiology [S.I.], v. 149, n. Pt 3, p. 557-67, Mar 2003. BASSO, L. C.; DE AMORIM, H. V.; DE OLIVEIRA, A. J.; LOPES, M. L. Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil. FEMS Yeast Res [S.I.], v. 8, n. 7, p. 1155-63, Nov 2008. BIRCH, R. M.; WALKER, G. M. Influence of magnesium ions on heat shock and ethanol stress responses of Saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microb Technol [S.I.], v. 26, n. 9-10, p. 678-687, Jun 1 2000. CADETE, R.M.; SANTOS, R.O.; MELO, M.A.; MOURO, A.; GONÇALVES, D.L.; STANBUK, B.U.; LACANCHE, M.A.; ROSA, C.A. Spathaspora arboriae sp. nov., a D-

54

xylose-ferenting yeast species isolated from rotting wood in Brazil. FEMS Yeast Res. [S.I.], v. 9, p. 1338-1342, 2009. CANILHA, L.; MILAGRES, A.M.F.; SILVA, S.S.; SILVA, J.B.A.; FELIPE, M.G.A.; ROCHA, G.J.M.; FERRAZ, A.; CARVALHO, W. Sacarificação da biomassa lignocelulósica através de pré-hidrólise ácida seguida por hidrólise enzimática: uma estratégia de “desconstrução” da fibra vegetal. Revista Analytica [S.I.], n. 44, p. 48-54, 2010. CANILHA, L.; SANTOS, V. T.; ROCHA, G. J.; ALMEIDA, E. S. J. B.; GIULIETTI, M.; SILVA, S. S.; FELIPE, M. G.; FERRAZ, A.; MILAGRES, A. M.; CARVALHO, W. A study on the pretreatment of a sugarcane bagasse sample with dilute sulfuric acid. J Ind Microbiol Biotechnol [S.I.], Jan 6 2011. CARDONA, C. A.; SANCHEZ, O. J. Fuel ethanol production: process design trends and integration opportunities. Bioresour Technol [S.I.], v. 98, n. 12, p. 2415-57, Sep 2007. CLAASSEN, P. A. M.; VAN LIER, J. B.; CONTRERAS, A. M. L.; VAN NIEL, E. W. J.; SIJTSMA, L.; STAMS, A. J. M.; DE VRIES, S. S.; WEUSTHUIS, R. A. Utilisation of biomass for the supply of energy carriers. Applied Microbiology and Biotechnology [S.I.], v. 52, n. 6, p. 741-755, Nov 1999. COOTE, P. J.; COLE, M. B.; JONES, M. V. Induction of increased thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae may be triggered by a mechanism involving intracellular pH. J Gen Microbiol [S.I.], v. 137, n. 7, p. 1701-8, Jul 1991. CORTEZ, L.A.B.; LORA, E.E.S.; GÓMEZ, E.O. Biomassa para Bioenergia. UNICAMP [S.I.], 2008. CYSEWSKI, G.R.; WILKE, C.R. Process design and economic studies of alternative fermentation methods for the production of ethanol. Biotechnol Bioeng [S.I.], v. 20,p. 1421–1427, 1978.

DING, S. Y.; HIMMEL, M. E. The maize primary cell wall microfibril: a new model derived from direct visualization. J Agric Food Chem [S.I.], v. 54, n. 3, p. 597-606, Feb 8 2006. ERIKSSON, T.; KARLSSON, J.; TJERNELD, F. A model explaining declining rate in hydrolysis of lignocellulose substrates with cellobiohydrolase I (Cel7A) and endoglucanase I (Cel7B) of Trichoderma reesei. Applied Biochemistry and Biotechnology [S.I.]. v. 101, p. 41–60, 2002. FONSECA, G. G.; HEINZLE, E.; WITTMANN, C.; GOMBERT, A. K. The yeast Kluyveromyces marxianus and its biotechnological potential. Appl Microbiol Biotechnol [S.I.], v. 79, n. 3, p. 339-54, Jun 2008. GALBE, M.; ZACCHI, G. A review of the production of ethanol from softwood. Applied Microbiology and Biotechnology [S.I.], v. 59, n. 6, p. 618-628, Sep 2002. GOFFEAU, A.; BARRELL, B. G.; BUSSEY, H.; DAVIS, R. W.; DUJON, B.; FELDMANN, H.; GALIBERT, F.; HOHEISEL, J. D.; JACQ, C.; JOHNSTON, M.; LOUIS, E. J.; MEWES, H. W.; MURAKAMI, Y.; PHILIPPSEN, P.; TETTELIN, H.; OLIVER, S. G. Life with 6000 genes. Science [S.I.], v. 274, n. 5287, p. 546, 563-7, Oct 25 1996.

55

GONG, C. S.; CHEN, L. F.; FLICKINGER, M. C.; CHIANG, L. C.; TSAO, G. T. Production of Ethanol from d-Xylose by Using d-Xylose Isomerase and Yeasts. Appl Environ Microbiol [S.I.], v. 41, n. 2, p. 430-6, Feb 1981. HAHN-HAGERDAL, B.; GALBE, M.; GORWA-GRAUSLUND, M. F.; LIDEN, G.; ZACCHI, G. Bio-ethanol--the fuel of tomorrow from the residues of today. Trends Biotechnol [S.I.], v. 24, n. 12, p. 549-56, Dec 2006. HALL, C. W. Energy sources and conversions relating foods. Food and energy resources [S.I], Edited by PIMENTEL, D. E HALL, C. W, Academy press, INC., p. 25-42, 1984.

HALLSWORTH, J. E. Ethanol-induced water stress in yeast. Journal of Fermentation and Bioengineering [S.I.], v. 85, n. 2, p. 125-137, 1998. HARI KRISHNA, S.; JANARDHAN REDDY, T.; CHOWDARY, G. V. Simultaneous saccharification and fermentation of lignocellulosic wastes to ethanol using a thermotolerant yeast. Bioresour Technol [S.I.], v. 77, n. 2, p. 193-6, Apr 2001. HISS, H. Biotecnologia Industrial. Edgard Blucher [S.I], v.3, 2001. HONG, J.; WANG, Y.; KUMAGAI, H.; TAMAKI, H. Construction of thermotolerant yeast expressing thermostable cellulase genes. J Biotechnol [S.I.], v. 130, n. 2, p. 114-23, Jun 15 2007. INGRAM, L. O.; ALDRICH, H. C.; BORGES, A. C.; CAUSEY, T. B.; MARTINEZ, A.; MORALES, F.; SALEH, A.; UNDERWOOD, S. A.; YOMANO, L. P.; YORK, S. W.; ZALDIVAR, J.; ZHOU, S. Enteric bacterial catalysts for fuel ethanol production. Biotechnol Prog [S.I.], v. 15, n. 5, p. 855-66, Sep-Oct 1999. JEFFRIES, T. W.; JIN, Y. S. Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts. Appl Microbiol Biotechnol [S.I.], v. 63, n. 5, p. 495-509, Feb 2004. JEFFRIES, T. W.; SHI, N. Q. Genetic engineering for improved xylose fermentation by yeasts. Adv Biochem Eng Biotechnol [S.I.], v. 65, p. 117-61, 1999. KAWAHATA, M.; FUJII, T.; IEFUJI, H. Intraspecies diversity of the industrial yeast strains Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces pastorianus based on analysis of the sequences of the internal transcribed spacer (ITS) regions and the D1/D2 region of 26S rDNA. Biosci Biotechnol Biochem [S.I.], v. 71, n. 7, p. 1616-20, Jul 2007. KOEDRITH, P.; DUBOIS, E.; SCHERENS, B.; JACOBS, E.; BOONCHIRD, C.; MESSENGUY, F. Identification and characterization of a thermotolerant yeast strain isolated from banana leaves. Scienceasia [S.I.], v. 34, n. 2, p. 147-152, Jun 2008. KURTZMAN, C. P.; ROBNETT, C. J. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie Van Leeuwenhoek [S.I.], v. 73, n. 4, p. 331-71, May 1998. LEE, J. Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol. J Biotechnol [S.I.], v. 56, n. 1, p. 1-24, Jul 23 1997.

56

LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial. Edgard Blucher [S.I], v.3, 2001. LIU, Z. L.; MA, M.; SONG, M. Evolutionarily engineered ethanologenic yeast detoxifies lignocellulosic biomass conversion inhibitors by reprogrammed pathways. Mol Genet Genomics [S.I.], v. 282, n. 3, p. 233-44, Sep 2009. LIU, Z. L.; SLININGER, P. J.; DIEN, B. S.; BERHOW, M. A.; KURTZMAN, C. P.; GORSICH, S. W. Adaptive response of yeasts to furfural and 5-hydroxymethylfurfural and new chemical evidence for HMF conversion to 2,5-bis-hydroxymethlfuran. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology [S.I.], v. 31, n. 8, p. 345-352, Sep 2004. LLORENTE, B.; MALPERTUY, A.; BLANDIN, G.; ARTIGUENAVE, F.; WINCKER, P.; DUJON, B. Genomic exploration of the hemiascomycetous yeasts: 12. Kluyveromyces marxianus var. marxianus. FEBS Lett [S.I.], v. 487, n. 1, p. 71-5, Dec 22 2000. LYND, L. R.; WEIMER, P. J.; VAN ZYL, W. H.; PRETORIUS, I. S. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiol Mol Biol Rev [S.I.], v. 66, n. 3, p. 506-77, table of contents, Sep 2002. MATTHEWS, J. F.; SKOPEC, C. E.; MASON, P. E.; ZUCCATO, P.; TORGET, R. W.; SUGIYAMA, J.; HIMMEL, M. E.; BRADY, J. W. Computer simulation studies of microcrystalline cellulose Ibeta. Carbohydr Res [S.I.], v. 341, n. 1, p. 138-52, Jan 16 2006. MISHRA, P.; PRASAD, R. Relationship between ethanol tolerance and fatty acyl composition of Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol [S.I.], v. 30, p. 294–298, 1989.

MORAIS, S.A.L.; NASCIMENTO, E.A.; MELO, D.C. Chemical analysis of Pinus oocarpa wood PARTE I – quantification of macromolecular components and volatile extractives. Revista Árvore [S.I.], v. 29, n. 3, p. 461-470, 2005.

MOSIER, N.; WYMAN, C.; DALE, B.; ELANDER, R.; LEE, Y. Y.; HOLTZAPPLE, M.; LADISCH, M. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology [S.I.], v. 96, n. 6, p. 673-686, Apr 2005. NEVOIGT, E. Progress in metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev [S.I.], v. 72, n. 3, p. 379-412, Sep 2008. NONKLANG, S.; ABDEL-BANAT, B. M.; CHA-AIM, K.; MOONJAI, N.; HOSHIDA, H.; LIMTONG, S.; YAMADA, M.; AKADA, R. High-temperature ethanol fermentation and transformation with linear DNA in the thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042. Appl Environ Microbiol [S.I.], v. 74, n. 24, p. 7514-21, Dec 2008. OHGREN, K.; RUDOLF, A.; GALBE, M.; ZACCHI, G. Fuel ethanol production from steam-pretreated corn stover using SSF at higher dry matter content. Biomass & Bioenergy [S.I.], v. 30, n. 10, p. 863-869, Oct 2006. OLIVEIRA, V. A.; VICENTE, M. A.; FIETTO, L. G.; CASTRO, I. M.; COUTRIM, M. X.; SCHULLER, D.; ALVES, H.; CASAL, M.; SANTOS, J. O.; ARAUJO, L. D.; DA SILVA, P. H.; BRANDAO, R. L. Biochemical and molecular characterization of Saccharomyces cerevisiae strains obtained from sugar-cane juice fermentations and their impact in cachaca production. Appl Environ Microbiol [S.I.], v. 74, n. 3, p. 693-701, Feb 2008.

57

OLSSON, L.; SOERENSEN, H. R.; DAM, B. P.; CHRISTENSEN, H.; KROGH, K. M.; MEYER, A. S. Separate and simultaneous enzymatic hydrolysis and fermentation of wheat hemicellulose with recombinant xylose utilizing Saccharomyces cerevisiae. Appl Biochem Biotechnol [S.I.], v. 129-132, p. 117-29, Spring 2006. PEREIRA Jr., N.; COUTO, M.A.P.G.; SANTA ANNA, L.M.M. Biomass of lignocellulosic composition for fuel ethanol production and the context of biorefinery. Series on Biotechnology [S.I.], Ed. Amiga Digital UFRJ, v.2, p. 45, 2008.

PHILIPPIDIS, G.P.; SMITH, T.K. Limiting factors in the Simultaneous Saccharification and Fermentation process for conversion of cellulosic biomass to fuel ethanol. Applied Biochemistry and Biotechnology [S.I], v. 51/52, p. 117-124,1995.

PLESSET, J.; PALM, C.; MCLAUGHLIN, C. S. Induction of heat shock proteins and thermotolerance by ethanol in Saccharomyces cerevisiae. Biochem Biophys Res Commun [S.I.], v. 108, n. 3, p. 1340-5, Oct 15 1982. ROCHA, J.; BUCKERIDGE, M. Biofuelling the future. New Scientist [S.I.], v. 202, n. 2709, p. 26-26, May 23 2009. ROSA, C. A.; LACHANCE, M. A. The yeast genus Starmerella gen. nov. and Starmerella bombicola sp. nov., the teleomorph of Candida bombicola (Spencer, Gorin & Tullock) Meyer & Yarrow. International Journal of Systematic Bacteriology [S.I.], v. 48, p. 1413-1417, Oct 1998. SANCHEZ, O. J.; CARDONA, C. A. Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks. Bioresour Technol [S.I.], v. 99, n. 13, p. 5270-95, Sep 2008. SANCHEZ, Y.; LINDQUIST, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science [S.I.], v. 248, n. 4959, p. 1112-5, Jun 1 1990. SANTOS, R.O. Leveduras fermentadoras de pentoses e produtoras de xilanases e celulases associadas ao bagaço de cana-de-açúcar em decomposição. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Minas Gerais, 2010.

SEDLAK, M.; HO, N. W. Y. Production of ethanol from cellulosic biomass hydrolysates using genetically engineered Saccharomyces yeast capable of cofermenting glucose and xylose. Applied Biochemistry and Biotechnology [S.I.], v. 113-16, p. 403-416, Spr 2004. SILVA, N.L.C. Produção de bioetanol de segunda geração a partir de biomassa residual da indústria de celulose. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2010. SILVEIRA, W. B.; PASSOS, F.; MANTOVANI, H. C.; PASSOS, F. M. L. Ethanol production from cheese whey permeate by Kluyveromyces marxianus UFV-3: A flux analysis of oxido-reductive metabolism as a function of lactose concentration and oxygen levels. Enzyme and Microbial Technology [S.I.], v. 36, n. 7, p. 930-936, May 16 2005.

58

SINGH, D.; BANAT, I. M.; NIGAM, P.; MARCHANT, R. Industrial scale ethanol production using the thermotolerant yeast Kluyveromyces marxianus IMB3 in an Indian distillery. Biotechnology Letters [S.I.], v. 20, n. 8, p. 753-755, Aug 1998. SIQUEIRA, P. F.; KARP, S. G.; CARVALHO, J. C.; STURM, W.; RODRIGUEZ-LEON, J. A.; THOLOZAN, J. L.; SINGHANIA, R. R.; PANDEY, A.; SOCCOL, C. R. Production of bio-ethanol from soybean molasses by Saccharomyces cerevisiae at laboratory, pilot and industrial scales. Bioresour Technol [S.I.], v. 99, n. 17, p. 8156-63, Nov 2008. SLININGER, P. J.; BOTHAST, R. J.; VAN CAUWENBERGE, J. E.; KURTZMAN, C. P. Conversion of D-xylose to ethanol by the yeast Pachysolen tannophilus. Biotechnol Bioeng [S.I.], v. 24, n. 2, p. 371-84, Feb 1982. SOCCOL, C. R.; VANDENBERGHE, L. P. D.; MEDEIROS, A. B. P.; KARP, S. G.; BUCKERIDGE, M.; RAMOS, L. P.; PITARELO, A. P.; FERREIRA-LEITAO, V.; GOTTSCHALK, L. M. F.; FERRARA, M. A.; BON, E. P. D.; DE MORAES, L. M. P.; ARAUJO, J. D.; TORRES, F. A. G. Bioethanol from lignocelluloses: Status and perspectives in Brazil. Bioresource Technology [S.I.], v. 101, n. 13, p. 4820-4825, Jul 2010. SREE, N. K.; SRIDHAR, M.; SURESH, K.; BANAT, I. M.; RAO, L. V. Isolation of thermotolerant, osmotolerant, flocculating Saccharomyces cerevisiae for ethanol production. Bioresource Technology [S.I.], v. 72, n. 1, p. 43-46, Mar 2000. STANLEY, D.; BANDARA, A.; FRASER, S.; CHAMBERS, P. J.; STANLEY, G. A. The ethanol stress response and ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae. J Appl Microbiol [S.I.], v. 109, n. 1, p. 13-24, Jul 2010. SUN, Y.; CHENG, J. J. Dilute acid pretreatment of rye straw and bermudagrass for ethanol production. Bioresour Technol [S.I.], v. 96, n. 14, p. 1599-606, Sep 2005. SUN, Y.; CHENG, J. Y. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource Technology [S.I.], v. 83, n. 1, p. 1-11, May 2002. SURYAWATI, L.; WILKINS, M. R.; BELLMER, D. D.; HUHNKE, R. L.; MANESS, N. O.; BANAT, I. M. Simultaneous saccharification and fermentation of Kanlow switchgrass pretreated by hydrothermolysis using Kluyveromyces marxianus IMB4. Biotechnol Bioeng [S.I.], v. 101, n. 5, p. 894-902, Dec 1 2008. TAHERZADEH, M.J.; KARIMI, K. Enzyme-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: a review. Bioresources [S.I.], v. 2, n. 4, p. 707-738, 2007.

TOMAS-PEJO, E.; GARCIA-APARICIO, M.; NEGRO, M. J.; OLIVA, J. M.; BALLESTEROS, M. Effect of different cellulase dosages on cell viability and ethanol production by Kluyveromyces marxianus in SSF processes. Bioresour Technol [S.I.], v. 100, n. 2, p. 890-5, Jan 2009. VAN MARIS, A. J.; ABBOTT, D. A.; BELLISSIMI, E.; VAN DEN BRINK, J.; KUYPER, M.; LUTTIK, M. A.; WISSELINK, H. W.; SCHEFFERS, W. A.; VAN DIJKEN, J. P.; PRONK, J. T. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie Van Leeuwenhoek [S.I.], v. 90, n. 4, p. 391-418, Nov 2006.

59

VASQUEZ, M. P.; DA SILVA, J. N.; DE SOUZA, M. B., JR.; PEREIRA, N., JR. Enzymatic hydrolysis optimization to ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation. Appl Biochem Biotechnol [S.I.], v. 137-140, n. 1-12, p. 141-53, Apr 2007. VIALJAMAE, P.; KIPPER, K.; PETTERSSON, G.; JOHANSSON, G. Synergistic cellulose hydrolysis can be described in terms of fractal–like kinetics. Biotechnology and Bioengineering [S.I], v. 84, p. 254–257, 2003. VRIESEKOOP, F.; PAMMENT, N. B. Acetaldehyde addition and pre-adaptation to the stressor together virtually eliminate the ethanol-induced lag phase in Saccharomyces cerevisiae. Lett Appl Microbiol [S.I.], v. 41, n. 5, p. 424-7, 2005. WALKER, G.M. Yeast Physiology and Biotechnology. England: John Wiley & Sons Ltd. [S.I.], 1998. WILKINS, M. R.; MUELLER, M.; EICHLING, S.; BANAT, I. M. Fermentation of xylose by the thermotolerant yeast strains Kluyveromyces marxianus IMB2, IMB4, and IMB5 under anaerobic conditions. Process Biochemistry [S.I.], v. 43, n. 4, p. 346-350, Apr 2008. WINGREN, A.; GALBE, M.; ROSLANDER, C.; RUDOLF, A.; ZACCHI, G. Effect of reduction in yeast and enzyme concentrations in a simultaneous-saccharification-and-fermentation-based bioethanol process - Technical and economic evaluation. Applied Biochemistry and Biotechnology [S.I.], v. 121, p. 485-499, Spr 2005. YABLOCHKOVA, E. N.; BOLOTNIKOVA, O. I.; MIKHAILOVA, N. P.; NEMOVA, N. N.; GINAK, A. I. Specific features of fermentation of D-xylose and D-glucose by xylose-assimilating yeasts. Applied Biochemistry and Microbiology [S.I.], v. 39, n. 3, p. 265-269, May-Jun 2003. ______. The activity of key enzymes in xylose-assimilating yeasts at different rates of oxygen transfer to the fermentation medium. Microbiology [S.I.], v. 73, n. 2, p. 129-133, Mar-Apr 2004. ZHANG, Y. H.; LYND, L. R. Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose: noncomplexed cellulase systems. Biotechnol Bioeng [S.I.], v. 88, n. 7, p. 797-824, Dec 30 2004. ZHANG, Y. H. P.; HIMMEL, M. E.; MIELENZ, J. R. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances [S.I.], v. 24, n. 5, p. 452-481, Sep-Oct 2006. ZHAO, X. Q.; BAI, F. W. Mechanisms of yeast stress tolerance and its manipulation for efficient fuel ethanol production. J Biotechnol [S.I.], v. 144, n. 1, p. 23-30, Oct 12 2009.

60

7. ANEXO

y = 24204x + 3100,3R2 = 0,9993

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

0 5 10 15 20 25

Concentração mM

Áre

a

Anexo 1 - Curva-padrão de glicose: concentração de glicose x área.

Anexo 2 - Curva-padrão de etanol: concentração de etanol x área.

61

Anexo 3 – Curvas de crescimento das leveduras em função de diferentes concentrações de glicose a 30°C. Painéis A, B e C correspondem às linhagens de S. cerevisiae. Painéis D, E e F correspondem às linhagens de K. marxianus.

CARACTERIZAÇÃO DE LEVEDURAS TERMOTOLERANTES …‡ÃO... · pela amizade e conselhos para o...

Documents

Transcript of CARACTERIZAÇÃO DE LEVEDURAS TERMOTOLERANTES …‡ÃO... · pela amizade e conselhos para o...