Caracterização de populações microbianas em células de ... · o conhecimento da natureza e...

Caracterização de populações microbianas em células de combustível para a produção de bioeletricidade

Ana Mafalda Marques Cardoso

Dissertação para a obtenção do grau de Mestre em

Bioengenharia e Nanossistemas

Orientador: Prof. Doutor Jorge Humberto Gomes Leitão

Júri

Presidente: Prof. Doutor Luís Joaquim Pina da Fonseca

Orientador: Prof. Doutor Jorge Humberto Gomes Leitão

Vogal: Prof. Doutor Gabriel António Amaro Monteiro

Novembro 2014

i

Agradecimentos

Em primeiro lugar, gostaria de agradecer ao Instituto Superior Técnico da Universidade

de Lisboa que facultou o espaço e todas as condições para que a minha formação académica

e científica fosse possível, bem como a todos os docentes que contribuíram para o mesmo.

Ao coordenador do Mestrado em Bioengenharia e Nanossistemas, Professor Doutor

Luís Joaquim Pina da Fonseca, agradeço a oportunidade em frequentar este curso de

Mestrado que contribuiu imenso para o enriquecimento da minha formação académica.

Ao meu orientador, Professor Doutor Jorge Humberto Gomes Leitão, expresso o meu

profundo agradecimento pela orientação, competência científica e disponibilidade, assim como

pelas críticas, correções e pela revisão desta tese de Mestrado. Agradeço também por me ter

recebido no seu grupo de investigação e pela confiança que depositou em mim em todas as

fases do projeto.

Ao doutorando e amigo, André Grilo, agradeço toda a orientação, permanente

disponibilidade e tempo dispensado em ajudar-me passo a passo todas as técnicas

laboratoriais e rotinas do laboratório. O teu acompanhamento e generosidade foram muito

importantes no desenvolvimento deste trabalho.

A todos os meus amigos que me acompanharam neste percurso, não pretendendo

individualizar, um enorme agradecimento por todo o apoio, amizade e partilha dos bons e maus

momentos.

Ao Alexandre, um agradecimento especial pelo apoio incondicional, pelas palavras

certas, por todo o carinho e amizade e especialmente pela paciência e compreensão. Por tudo,

a minha enorme gratidão.

À minha família, um enorme e especial agradecimento, sobretudo aos meus pais e à

minha “mana”. Obrigado por terem acreditado em mim, pelo apoio incondicional, amizade e

motivações diárias. Sem vocês nada disto seria possível e por isso este trabalho é dedicado a

vocês.

iii

Resumo

O crescimento da população mundial e o consequente aumento de resíduos urbanos e

industriais tem suscitado um grande problema ambiental. Os combustíveis fósseis também têm

levantado grandes preocupações uma vez que estes recursos naturais não são renováveis e o

seu uso excessivo levará a um previsível esgotamento das jazidas. Desta forma, procuram-se

desenvolver alternativas que atenuem estes impactos e ainda fazer um aproveitamento das

águas residuais.

As células de combustível microbianas (Microbial Fuel Cells- MFC) constituem uma

nova tecnologia que permite a produção de bioeletricidade de forma sustentável e a partir de

compostos biodegradáveis. Os substratos podem ser hidratos de carbono simples ou, como no

caso em estudo, substratos mais complexos, presentes em águas residuais. De forma a

otimizar e desenvolver a capacidade de produção de bioeletricidade pelas MFCs é fundamental

o conhecimento da natureza e metabolismo dos microrganismos capazes de usar um ânodo

como aceitador de eletrões. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização das

populações microbianas presentes em dois reatores anaeróbios distintos, produzindo

eletricidade a partir de acetato como fonte de carbono.

Para tal, recorreu-se a uma metodologia que combina técnicas de biologia molecular, a

análise dos perfis de restrição obtidos após hidrólise com a enzima de restrição Hae III e o uso

de bases de dados contendo genomas microbianos total ou parcialmente sequenciados.

A metodologia utilizada demostrou ser eficaz e identificaram-se 960 clones

correspondentes a um total de 142 perfis de restrição diferentes, resultando na identificação de

58 espécies diferentes. As espécies de bactérias mais abundantes nos reatores pertenciam às

ordens Burkholderiales, Pseudomonadales, Rhodocyclales e Xanthomonadales, pertencentes

ao filo Proteobacterias. No caso dos organismos do domínio Archaea, as espécies mais

abundantes pertenciam à ordem Methanomicrobiales do filo Euryarchaeota.

Palavras-chave: Células de combustível microbianas, bioeletricidade, reatores anaeróbios,

caracterização microbiana, técnicas de biologia molecular.

v

Abstract

World population growth leads to a rapid increase in urban and industrial waste which

renders waste management as a significant environment threat. There’s also a big concern

about the use of fossil fuels because they’re not renewable and its abusive use will end up with

their extinction. Many of the environmental problems our country faces today result from our

fossil fuel dependence. The development of new methods of sustainable energy production

combining wastewater treatment are therefore urgently required.

Microbial fuel cells (MFC) represent a new technology for the production of renewable

energy by direct conversion of organic matter to electricity using bacteria. MFC’s can convert

practically any organic material like simple carbohydrates or, as is the case of the present work,

complex substrates into fuel. For MFC optimization, a complete characterization of the microbial

communities that thrive in the anode compartment is required. The aim of this work is to

characterize the microbial populations of two distinct MFC using acetate as the carbon source

for electricity production.

The methodology used in this study combines molecular biology techniques to obtain of

the 16S rRNA genes and restriction profiles analyses after hydrolysis with the restriction

enzyme Hae III. Databases searches for sequences homologous to the nucleotide sequences

of 16S rRNA encoding genes cloned were subsequently performed.

This methodology has led to the identification of 960 clones belonging to the Bacteria or

Archaea domains, corresponding to a total of 142 distinct restriction profiles, and 58 different

species. The estimative of the species relative abundances showed a large number of bacteria

belonging to Burkolderiales, Pseudomonadales, Rhodocyclales e Xanthomonadales, all of them

orders of Proteobacteria. Archaea exhibiting a high relative abundance belonged to the

Methanomicrobiales, order of the Euryarchaeota.

Keywords: Microbial fuel cells, bioelectricity, anaerobic reactors, microbial characterization,

molecular biology techniques.

vii

Índice

Resumo ................................................................................................................................... iii

Abstract .................................................................................................................................... v

Índice de figuras ...................................................................................................................... ix

Índice de tabelas ..................................................................................................................... xi

Lista de abreviações .............................................................................................................. xiii

1-Introdução............................................................................................................................. 1

1.1. As MFCs (Microbial Fuel Cells) ................................................................................... 1

1.2. Princípio de funcionamento e configuração das MFCs ............................................... 2

1.3. Aplicação das MFCs ................................................................................................... 4

1.4. Transferência eletrónica ............................................................................................ 5

1.5. Processos metabólicos nas MFC................................................................................. 6

1.6. Formação de biofilmes .............................................................................................. 7

1.7. Bactérias electroquimicamente ativas ....................................................................... 8

1.8. Análise da comunidade microbiana ........................................................................... 9

1.9. Aplicação das técnicas de biologia molecular em estudos de biodiversidade. ........... 12

1.10. Metodologias de biologia molecular .................................................................... 13

1.11. Objetivos do trabalho .......................................................................................... 15

2. Material e Métodos............................................................................................................ 17

2.1. Modo de operação e controlo dos bioreatores ............................................................. 17

2.2. Recolha das amostras ................................................................................................. 18

2.3. Avaliação da diversidade das comunidades bacterianas................................................ 19

2.4. Extracção e Purificação de DNA cromossómico ............................................................. 20

2.5. Electroforese em gel de agarose ................................................................................... 20

2.6. Amplificação dos genes rRNA 16S ................................................................................. 20

2.7. Purificação dos produtos de PCR .................................................................................. 22

2.8. Clonagem ..................................................................................................................... 22

2.9. Transformação ............................................................................................................. 23

2.10. Extração de DNA plasmídico ....................................................................................... 24

2.11. Análise dos perfis de restrição .................................................................................... 25

2.12. Análise das sequências dos genes de rRNA 16S ........................................................... 26

3. Resultados e discussão ....................................................................................................... 27

3.1. Recolha das amostras e identificação ........................................................................... 27

viii

3.2. Análise das electroforeses em gel de agarose ............................................................... 27

3.3. Análise dos perfis de restrição dos clones obtidos ........................................................ 30

3.4. Composição das populações microbianas ..................................................................... 32

3.5. Discussão de resultados................................................................................................ 40

3.5.1. Reactor 1 ............................................................................................................... 40

3.5.2. Reactor 2 ............................................................................................................... 43

4. Conclusões ......................................................................................................................... 47

5. Perspectivas futuras ........................................................................................................... 49

6. Bibliografia ......................................................................................................................... 51

Anexo I ................................................................................................................................... 63

ix

Índice de figuras

1. Introdução

Figura 1- Esquematização esquemática dos componentes básicos de uma MFC. 2

Figura 2- Representação esquemática da transferência eletrónica direta. 9

Figura 3: Árvore filogenética universal determinada pela comparação das

sequências rRNA. 14

2. Materiais e Métodos

Figura 4: Fotografia dos bioreatores MFCs donde foram recolhidas as amostras

de biomassa analisados neste trabalho . 17

Figura 5: Representação esquemática dos dois compartimentos dos reatores

MFC, reator 1 e reator 2, com condições de operacionalidade diferentes no

cátodo. 17

Figura 6- Representação esquemática da metodologia usada neste trabalho

para a identificação dos microrganismos presentes nas células microbianas. 18

Figura 7- Representação gráfica, marcas de resistência gene LacZα e

representação esquemática do príncipio para clonagem do fragmento no

vetor PCR2.1 21

3. Resultados e Discussão

Figura 8 – Electroforese em gel de agarose dos amplificados obtidos após reação

de PCR usando DNA total extraído do cátodo e ânodo do reator 1 para o R1 na

fase de menor produção de bioelectricidade. 27

Figura 9 - Electroforese em gel de agarose dos amplificados obtidos após reação

por PCR do DNA total extraído do anôdo do R2 nas duas fases de produção

de bioelectrocidade. 27

Figura 10 – Electroforese em gel de agarose dos amplificados obtidos após

reação por PCR do DNA total extraído do cátodo do reator 2 nas duas fases

de produção de bioelectrocidade. 28

Figura 11: Exemplos de alguns perfis obtidos usando primers para bactérias. 31

Figura 12: Exemplos de alguns perfis obtidos usando primers para archaeas. 31

Figura 13: Comparação da abundância relativa das espécies identificadas no

compartimento anódico do reator 1 no compartimento anódico nas fases de

maior e menor produção de bioeletricidade. 37


compartimento catódico do reator 1 no compartimento anódico nas fases de

maior e menor produção de bioeletricidade. 37



x

maior e menor produção de bioeletricidade 38



maior e menor produção de bioeletricidade 39

Figura 17- Heat map para bactérias e archaea cujas sequências de genes para o

rRNA 16S são mais próximas das sequências obtidas para os dois reatores, nas

duas fases, em ambos os compartimentos. 40

Anexo I

Figura 18: Árvore filogenética correspondente às espécies de bactérias identificadas

no compartimento anódico no reator 1 na fase de maior produção de energia

(R1A_B1). 63


no compartimento catódico do reator 1 na fase de menor produção de energia

(R1C_B2). 63

Figura 20: Árvore filogenética correspondente às espécies de archaeas identificadas

no compartimento anódico do reator 1 na fase de maior produção de energia

(R1A_A1). 64


no compartimento catódico do reator 1 na fase de maior produção de energia

(R1C_B1). 65



(R1C_B2). 66

Figura 23: Árvore filogenética correspondente às espécies bacterianas identificadas


(R2A_B1). 67

Figura 24: Árvore filogenética correspondente às espécies de Archaea identificadas


(R2A_A1). 68


no compartimento anódico do reator 2 na fase de menor produção de energia

(R2A_B2). 69


no compartimento catódico do reator 2 na fase de maior produção de energia

(R2C_B1). 70



(R2C_B2). 71

xi

Índice de tabelas

1. Introdução

Tabela 1: Microrganismos capazes de produção de corrente elétrica em cultura

pura numa MFC. 11

2. Materiais e Métodos

Tabela 2 – Sequência e características dos oligonucleótidos iniciadores usados

neste trabalho. 20

Tabela 3- Sumário do programa do PCR (30 ciclos) 20

3. Resultados e Discussão

Tabela 4 - Nomenclatura adotada para designar as amostras de cada reator e

distingui-las quanto ao tipo de organismo, compartimento do reator e fase de

produção de bioeletricidade. 26

Tabela 5: Comparação entre o número total de clones obtido, o número inicial de

perfis diferentes que correspondeu a diferentes clones para sequenciar e o número

efetivo de perfis diferentes. 30

Tabela 6: Espécies microbianas identificadas como as mais próximas das

sequências obtidas por PCR no compartimento anódico do reator 1, na fase de

maior produção de energia. 32



menor produção de energia. 33


sequências obtidas por PCR no compartimento catódico do reator 1, na fase de














xii




xiii

Lista de abreviações

APS - Persulfato de amónia (Ammonium persulfate)

DNA - Ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic acid)

DNTP- Desoxirribonucleotídeos fosfatados (Deoxyribonucleotides)

E. Coli - Escherichia coli

LB - Luria broth

MFC- Células de combustível microbianas (Microbial Fuel Cells)

PCR- Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction)

RFLP – Polimorfismo dos fragmentos de restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism)

RNA - Ácido ribonucleico (Ribonucleic acid)

TEMED- Tetrametiletilenodiamina (Tetramethylethylenediamine)

TBE- Tris-Borato-EDTA (Tris-borate-EDTA)

TAE- Tris-Acetato-EDTA (Tris-acetate-EDTA)

1

1-Introdução

Com o aumento da população mundial, a quantidade de resíduos industriais e

domésticos tem aumentando cada vez mais e, embora a população dos países mais

desenvolvidos apresente taxas de crescimento mais baixas, a produção de resíduos nestes

países é extremamente alta. Também os combustíveis fósseis, que têm sustentado o

crescimento industrial e comercial dos países desenvolvidos nos últimos dois séculos, têm

suscitado uma grande preocupação ambiental. Como é evidente, os combustíveis fósseis não

irão conseguir suportar indefinidamente a economia global, além da sua combustão acarretar

vários problemas ambientais, essencialmente devido à emissão de dióxido de carbono.

A exploração de fontes renováveis de energia nos últimos anos tem sido tema de

várias discussões, sendo favorecida face aos combustíveis fósseis, responsáveis em grande

parte pelo aquecimento global e alterações climáticas. A grande preocupação sobre as

recentes alterações climáticas, o aumento da procura pelo petróleo e reservas de gás natural

estão a intensificar a procura de alternativas aos combustíveis fósseis. Atendendo a estes

problemas, o interesse por alternativas energéticas aumentou em todo o mundo.

Recentemente, os investigadores foram também consideravelmente atraídos pelas

características das células combustíveis microbianas ou Microbial Fuel Cells (MFC) que têm a

capacidade de gerar bioeletricidade a partir do metabolismo de compostos orgânicos por

populações microbianas. Esta tecnologia apresenta várias vantagens pois são sistemas limpos,

altamente eficientes, renováveis e com baixa emissão de poluentes. No entanto, a produção de

bioeletricidade a partir de fermentações anaeróbias apresenta ainda várias limitações no que

diz respeito ao seu armazenamento e baixas taxas de produtividade (Logan, 2004).

Atualmente, as MFCs são a melhor opção para a recuperação e conversão de energia

(bioeletricidade), constituindo uma tecnologia futurista capaz de transformar diretamente

energia química em energia elétrica através de reações químicas catalisadas por

microrganismos (Bullen et al., 2006) (Logan, et al., 2006).

1.1. As MFCs (Microbial Fuel Cells)

O primeiro registo de trabalhos relacionados com as MFCs data do ano de 1911,

quando Potter descreveu a produção de energia elétrica a partir de uma cultura mista de

Escherichia coli e Saccharomyces. Só no ano de 1931, é que Cohen foi capaz de produzir uma

voltagem superior a 35V a partir de uma MFC em série. No entanto, existiam ainda muitas

dúvidas em relação ao funcionamento das MFCs e à produção de eletricidade a partir delas.

Em 1980, Allen e Bennetto descobriram que a densidade de corrente e a potência gerada

podiam ser melhoradas usando microrganismos na superfície do ânodo e mediadores de

2

eletrões. A maioria das membranas bacterianas são compostas por lípidos, peptidoglicanos e

lipopolissacáridos, não-condutores, que impedem a transferência de eletrões diretamente para

o ânodo. No entanto, uns anos mais tarde, descobriu-se que certos organismos tinham a

capacidade de fazer a transferência eletrónica diretamente para o ânodo sem a necessidade

de mediadores (Kim, et al., 1999) (Chaudhuri & Lovley, 2003). A partir daí, as MFC foram

consideradas como uma tecnologia viável para gerar energia elétrica e o número de

publicações relacionadas com as MFCs aumentou exponencialmente. Atualmente sabe-se que

a eletricidade gerada é produzida diretamente pela degradação de matéria orgânica (Rabaey &

Verstraete, 2005).

1.2. Princípio de funcionamento e configuração das MFCs

Tal como uma célula electroquímica comum, as MFCs apresentam dois

compartimentos, um contendo o ânodo e outro contendo o cátodo. Nas MFCs, os

microrganismos oxidam compostos orgânicos e transferem os eletrões para o ânodo que

funciona como aceitador de eletrões da cadeia respiratória (Rabaey & Verstraete, 2005). Na

Figura 1 está esquematizada uma célula combustível microbiana constituída pelos

compartimentos anódico e catódico, separados por uma membrana de permuta de protões.

Figura 1- Esquematização esquemática dos componentes básicos de uma MFC (adaptado de Vinay Sharma e Kundu,

2010)

3

Os compostos orgânicos mais utilizados como substratos da reação são glucose,

acetato ou águas residuais. O tipo de compostos utilizados no ânodo é de extrema importância

uma vez que este deve privilegiar o crescimento e fixação de bactérias e ainda manter um

ambiente propício para que estas mantenham a sua atividade eletroquímica adequada à

produção de energia (Liu et al., 2012). Toda a viabilidade dos sistemas MFC prende-se com a

existência de um meio de anaerobiose no ânodo (Kim et al., 2008). Desta forma, os

microrganismos metabolizam a matéria orgânica produzindo eletrões que, por um processo

enzimático, vão resultar em energia para a célula sob a forma de adenosina trifosfato (ATP).

Os eletrões são então libertados para um aceitador de eletrões que pode ser oxigénio, nitrato,

sulfato, entre outros, e os produtos desta reação rapidamente se difundem no meio (Logan,

2008). No entanto sabe-se agora que algumas bactérias são capazes de fazer a transferência

eletrónica de forma exógena à célula, transferindo os eletrões diretamente a um aceitador de

eletrões como um óxido de metal. As bactérias crescem no compartimento anódico e oxidam a

matéria orgânica, libertando eletrões para o ânodo e protões para o meio. A equação (1) é um

exemplo referente a este processo, utilizando acetato como substrato/fonte de carbono.

CH3COO- + 2H2O → 2CO2 + 7H+ +8e- (1)

De seguida os protões resultantes migram para o compartimento catódico através de

uma membrana que permite a troca de protões de forma a igualar a carga transferida pelos

eletrões garantindo a eletroneutralidade de todo o processo. A membrana presente no circuito

é seletiva para protões, impedindo assim a passagem dos eletrões evitando a ocorrência de

um curto-circuito e também impede a passagem de gases intervenientes, um problema

designado por permeabilidade de gás. Esta deve ser ainda resistente às condições geradas

pela redução no cátodo e pela oxidação do ânodo. Por outro lado os eletrões produzidos são

transferidos para o cátodo por um circuito externo. No cátodo, os protões vão reagir com

oxigénio e com os eletrões transferidos pelo circuito externo, formando água – equação (2)

abaixo (Rabaey et al., 2005):

4 H+ + O2 + 4 e- → 2 H2O (2)

O percurso realizado pelos eletrões através do circuito externo vai gerar uma corrente

elétrica que pode ser posteriormente quantificada (Bockris & Srinivasan, 1969).

Resumidamente, o processo global baseia-se na conversão do material orgânico biodegradável

a dióxido de carbono e água, gerando eletricidade. Nestas células as reações ocorrem

controladamente de forma a minimizar ou mesmo eliminar, a presença de subprodutos

indesejáveis.

A transferência direta dos eletrões para o ânodo é muitas vezes dificultada por

sobretensões que causam uma perda da corrente elétrica total obtida pelas MFCs. As

sobretensões são perdas de potencial devido a resistências à transferência de eletrões e a

resistências internas. Segundo Rabaey e Verstraete (2005), este parece ser atualmente o

principal fator limitante da baixa produtividade nas MFCs, sendo provocado pela energia de

4

ativação que as bactérias necessitam para oxidarem os compostos à superfície do ânodo. A

sobretensão pode ser atenuada adicionando, por exemplo, um catalisador (Park & Zeikus,

2003). Também o cátodo pode ser afetado por sobretensões que levam a uma perda

significativa de potencial. Este efeito pode ser atenuado pela adição de soluções de

hexacianoferrato. De forma a tornar o sistema MFC o mais sustentável possível, o cátodo deve

ser exposto ao ar (Rabaey & Verstraete, 2005).

As MFCs destacam-se da maioria dos processos bioenergéticos uma vez que operam

de uma forma eficaz tanto à temperatura ambiente como a baixas temperaturas e também não

é necessário qualquer tratamento dos gases emitidos. Apesar de este ser um processo

altamente eficiente, a grande desvantagem das MFCs continua a ser a sua baixa produção de

energia. Ainda assim, a alta eficiência de produção de eletrões e baixa produção de energia

das MFCs pode ser vista como uma vantagem na alimentação de sistemas de telemetria e

sensores sem fio, que não requerem grandes consumos de energia para transmitir sinais para

recetores situados em locais remotos (Shantaram et al., 2005)

1.3. Aplicação das MFCs

O tratamento de águas residuais é, muito provavelmente, a aplicação mais importante

das MFCs. As águas residuais contêm uma grande quantidade de energia sob a forma de

matéria orgânica biodegradável que pode ser reutilizada para a produção de energia elétrica.

Pelo contrário, as estações de tratamento gastam imensa energia para remover a matéria

orgânica em vez de tentar recuperá-la. Dependendo do conteúdo orgânico das águas

residuais, podem ser aplicados diversos bioprocessos para tratar e reutilizar as águas residuais

de indústrias, agricultura ou resíduos urbanos. A utilização de um sistema MFC teria a

capacidade de tratar as águas residuais através da redução do nível de matéria orgânica.

Moléculas orgânicas como acetato, propionato ou butirato, facilmente seriam quebradas com a

formação de CO2 e H2O. A utilização de certos organismos seria outro benefício das MFCs, por

exemplo a inclusão de microrganismos que apresentam a capacidade de remoção de sulfitos

tal como acontece em estações de tratamento e que poderiam ser incorporados nas MFCs

(Rabaey, 2006). A recuperação de energia das águas residuais iria amortizar o custo do seu

tratamento e reduzir a atual dependência dos combustíveis fósseis, tornando as estações de

tratamento de águas residuais autossustentáveis (Logan, 2008). As MFCs já demonstraram ser

eficazes no tratamento de quase todos os tipos de resíduos gerados, incluindo águas residuais

domésticas, agrícolas, de indústrias como as cervejeiras, refinarias, reciclagem de papel e até

de lixiviados de aterros (Pant D et al., 2010). De forma a atingir este objetivo, as MFCs teriam

que ser otimizadas e dimensionadas à escala industrial e doméstica. Para isso é ainda

necessário compreender a importância de vários fatores que afetam o desempenho das MFCs

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pant%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19892549

5

como a área superficial dos elétrodos, a sua condutividade, concentração de substratos e

ainda, o papel das comunidades microbianas. Idealmente, as MFCs em conjunto com as

energias eólica, solar, geotérmica e das marés, podem contribuir para o cessar do uso de

combustíveis fósseis.

1.4. Transferência eletrónica

De forma a criar condições para que a respiração celular ocorra numa MFC com a

conversão do substrato a CO2, os eletrões têm que ser transferidos extracelularmente para o

elétrodo. As vias metabólicas envolvidas e os mecanismos bioelectroquímicos de conversão de

energia são determinantes na quantidade de energia gerada. A transferência eletrónica que

ocorre no ânodo é apenas devido à necessidade que as bactérias têm de eliminar os eletrões

libertados durante a oxidação do substrato (Schröder, 2007). Certas bactérias conseguem fazer

este processo diretamente mas em certos casos a utilização de mediadores para a

transferência eletrónica é necessária (Schröder, 2007). Diversos trabalhos recentes revelaram

a existência de um terceiro mecanismo de transferência eletrónica, fornecendo evidências de

que as bactérias sintetizam apêndices designados por nanofios (Reguera et al, 2005). Dois

géneros bacterianos capazes de fazer a transferência eletrónica recorrendo a nanofios são

Shewanella e Geobacter (Gorby e Beveridge, 2005). No geral, a maioria das células

bacterianas mantêm-se electroquimicamente inativas devido à estrutura da parede celular

essencialmente composta por material não condutor, tal como lípidos e peptidoglicanos.

Embora a parede celular das bactérias gram-negativas tenha uma superfície eletricamente

carregada sobretudo devido aos lipopolissacáridos presentes na membrana exterior, a

capacidade de permeação para transferência dos eletrões é reduzida. Desta forma, para que a

transferência eletrónica ocorra é necessário a utilização de moléculas mediadoras.

As moléculas mediadoras são intermediários capazes de aceitar eletrões da cadeia

transportadora de eletrões do microrganismo, atravessar a parede e transportar os eletrões até

ao ânodo, onde se oxidam. Os mediadores mais utilizados são a tionina, benzilviologenio, 2.6-

diclorofenolindofenol, 2-hidroxi-1,4-naftoquinona e diversas fenazinas, fenotiazinas,

fenoxoazinas, vermelho neutro, entre outros (Reddy et al., 2010). As principais desvantagens

da utilização de certos tipos de mediadores são a necessidade de reposição constante, o

elevado custo e a formação de resíduos tóxicos para os microrganismos. De entre as bactérias

que requerem mediadores para a transferência eletrónica para o ânodo, encontra-se

Escherichia coli, Actinobacillus succinogenes e Proteus vulgaris (Park & Zeikus, 2000; Kim, et

al., 2000). Por outro lado, as espécies Shewanella putrefaciens, Geobacteraceae

sulfurreducens, Geobacter metallireducens e Rhodoferax ferrireducens são

bioelectroquimicamente ativas e conseguem formar um biofilme na superfície do ânodo e fazer

6

a transferência eletrónica diretamente através da condutância da membrana (Du et al., 2007).

Neste caso o ânodo serve como aceitador final de eletrões da cadeia respiratória dos

microrganismos que compõem o biofilme. Devido a todas as desvantagens económicas e

ambientais do uso de mediadores, a transferência direta de eletrões da cadeia respiratória para

o elétrodo tem sido a opção mais viável (Kim et al., 1999).

O metabolismo energético dos microrganismos do ânodo varia desde anaerobiose a

anaerobiose facultativa (Rabaey e Verstraete, 2005). Os biofilmes também se podem formar na

superfície do cátodo e também podem desempenhar um papel importante na transferência

eletrónica entre os microrganismos. Neste caso, certas espécies como G. metallireducens e G.

sulfurreducens, podem funcionar como aceitadores finais de eletrões, pois recebem os eletrões

do cátodo que funciona como dador de eletrões (Gregory et al, 2004). No cátodo a redução do

oxigénio pode ser catalisada pelos microrganismos, permitindo o seu crescimento usando os

eletrões provenientes do ânodo. As bactérias do cátodo podem obter energia a partir desta

reação porque recebem os eletrões com um potencial superior ao necessário para a redução

do oxigênio (Logan, 2009). Outros mecanismos de redução podem ocorrer no cátodo:

desnitrificação, redução de água (H2O) a peróxido de hidrogénio (H2O2), desidroalogenação,

redução de metais, produção de hidrogénio, produção de metano, redução de perclorato, entre

outros. O facto de os eletrões poderem ser tanto libertados como aceites pelas bactérias,

sugere que a transferência eletrónica entre células é um fenómeno que ocorre naturalmente

em comunidades microbianas (Logan, 2009). Os organismos que populam o cátodo, que

atuam como biocatalisadores, são autotróficos e consomem parte da voltagem para o

crescimento e manutenção celular (Clauwaert et al. 2007).

1.5. Processos metabólicos nas MFC

Rabaey e Verstraete (2005) relacionaram o potencial anódico com as vias metabólicas

utilizadas pelos organismos. De facto, a par dos substratos, o potencial do ânodo vai

determinar o metabolismo bacteriano. Se a corrente da MFC aumenta, o potencial no ânodo

diminui, obrigando as bactérias a entregar os eletrões através de complexos mais reduzidos. O

potencial do ânodo irá influenciar o potencial redox do transportador de eletrões final e assim,

influenciar o metabolismo. Os vários tipos de vias que podem ser distinguidas com base no

potencial do ânodo são: mecanismo oxidativo de elevado potencial redox; mecanismo oxidativo

de potencial redox médio a baixo; e fermentação.

Para potenciais anódicos elevados, as bactérias podem usar a cadeia respiratória do

metabolismo oxidativo. Neste caso os eletrões são transportados através de NADH

desidrogenase, ubiquinona, coenzima Q ou citocromo (Kim et al., 2004). Este processo é

regularmente usado nas MFCs usando culturas mistas com Pseudomonas aeruginosa,

7

Enterococcus faecium e Rhodoferax ferrireducens com uma eficiência estimada de até 65%

(Rabaey et al., 2003). Se a MFC estiver a ser operada com uma resistência externa baixa, a

corrente elétrica durante a formação da biomassa vai ser baixa e por essa razão o potencial da

MFC vai ser também baixo. Por outro lado, o potencial do ânodo vai ser elevado o que resulta

na seleção de organismos aeróbios facultativos e anaeróbios. À medida que a cultura vai

crescendo, a atividade metabólica vai aumentar e portanto, a corrente aumenta, favorecendo o

crescimento de organismos anaeróbios facultativos de baixo potencial redox, devido à

moderação do potencial do ânodo (Rabaey e Verstraete, 2005).

Quando o ânodo apresenta valores mais baixos de potencial mas existem em solução

aceitadores de eletrões como sulfato, os eletrões vão ser entregues preferencialmente a esses

aceitadores. A produção de metano pode ser um indicador de que as bactérias não estão a

usar o ânodo como aceitador de eletrões (Kim, et al., 2004). Por outro lado, se não existirem

aceitadores alternativos de eletrões e no caso de o potencial anódico ser baixo, o processo

usado preferencialmente pelas bactérias é a fermentação. Vários microrganismos dos géneros

Clostridium, Alcaligenes e Enterococcus foram isolados de MFCs e identificados com este tipo

de metabolismo (Rabaey, et al., 2004) (Park, et al., 2001). A fermentação pode resultar numa

produção de acetato ou butirato (Rabaey e Verstraete, 2005). Estes produtos da fermentação

podem ser oxidados por outro tipo de bactérias anaeróbias, como espécies do género

Geobacter, que conseguem produzir eletrões a partir do acetato ou butirato (Vandevivere e

Verstraete, 2001). Se o sistema MFC for operado a uma resistência elevada, o potencial do

ânodo vai também ser baixo mesmo para baixos valores de corrente, levando à seleção de

anaeróbios facultativos de baixo potencial redox e anaeróbios obrigatórios (Rabaey e

Verstraete, 2005).

1.6. Formação de biofilmes

A formação de um biofilme na superfície dos elétrodos é essencial para que a

transferência de eletrões numa MFC seja bem-sucedida. O material dos elétrodos tem ainda

um efeito no tipo de bactérias que aderem e por isso, consoante o tipo de material, a estrutura

microscópica da superfície dos elétrodos vai ser diferente, influenciando as espécies

microbianas aderentes. As bactérias que constituem os biofilmes crescem, reproduzem-se e

produzem substâncias poliméricas extracelulares. Estas substâncias ocupam um volume para

além do volume ocupado pela superfície das células. As células microbianas facilmente se

aderem a superfícies imersas em solução aquosa e a esta estrutura, composta de polímeros e

biomassa aderida, dá-se o nome de biofilme (Liu e Tay, 2000). Biofilmes electroquimicamente

ativos têm uma grande importância, principalmente na oxidação/redução de metais, mas

também na dissolução de minerais, no ciclo do carbono, entre outros (Logan, 2008). Os

8

biofilmes não são estruturas regulares e uniformes, e a maior parte das vezes são constituídos

por mais do que uma espécie de microrganismos. Fatores como a disponibilidade de

nutrientes, caudal, pH, temperatura, entre outros, têm uma grande influência na formação e

estrutura dos biofilmes (Zhang et al., 2011). A resistência externa pode até influenciar a

estrutura dos biofilmes formados nos elétrodos. Como foi dito anteriormente, a resistência

externa, tal como o potencial do ânodo, têm uma grande influência na produção de energia,

controlando as condições de crescimento dos microrganismos bioeletroquimicamente ativos.

De facto, esta é uma questão que tem despertado imenso interesse entre os investigadores e é

possível afirmar que o desempenho de um sistema MFC melhora para valores menores de

resistência externa aplicada (Zhang et al., 2011). Lyon et al. (2010) verificaram grandes

diferenças tanto na energia gerada como na estrutura da comunidade microbiana para

diferentes valores de resistência externa. De facto, se for usada matéria orgânica como

substrato numa MFC com valores de resistência externa baixos, vai haver a formação de mais

eletrões por unidade de tempo a movimentarem-se do biofilme para o elétrodo e por isso, mais

protões a serem produzidos no interior do biofilme. A grande produção de protões leva a uma

diminuição do pH no biofilme, criando um ambiente desfavorável a grande parte dos

microrganismos electroquimicamente ativos. Por outro lado, também se sabe que a estrutura

dos biofilmes facilmente se adapta a alterações do meio em que estão inseridos e por essa

razão, é possível afirmar que a morfologia dos biofilmes é diferente para diferentes valores de

resistência externos (Zhang et al., 2011).

1.7. Bactérias electroquimicamente ativas

A descoberta da existência de bactérias capazes de reduzir ferro para a produção de

energia numa MFC, sem a necessidade de usar mediadores, sugere que esta é uma

característica rara e limitada a um certo número de organismos. No entanto já se verificou que

quatro das cinco classes de Proteobacteria e também alguns organismos dos filos

Acidobacteria e Firmicutes têm a capacidade de gerar energia elétrica sem a utilização de

mediadores (Logan, 2009). Estes microrganismos que são capazes de fazer a transferência

eletrónica extracelularmente são chamados de bactérias exoeletrogénicas ou, mais comumente

designadas, bactérias electroquimicamente ativas. Os eletrões são libertados com a produção

de ATP na cadeia respiratória durante a fosforilação oxidativa. Normalmente, o aceitador final

de eletrões é o oxigénio (respiração aeróbia) mas neste caso as células vão usar outros

compostos como aceitadores finais de eletrões, como por exemplo citocromos, num processo

designado por respiração anaeróbia (Figura 2, A).

Existem pelo menos três mecanismos através dos quais os microrganismos fazem a

transferência eletrónica extracelularmente. O primeiro tipo de mecanismo envolve compostos

9

de ferro, mais especificamente óxidos de Fe (III) que são os aceitadores de eletrões mais

conhecidos. Muitas estirpes de bactérias conseguem libertar os eletrões provenientes da

cadeia respiratória para um óxido de Fe (III) fora da célula, produzindo Fe (II) solúvel (Logan,

2009). Outro mecanismo envolve a transferência eletrónica diretamente de uma célula

microbiana para outra, ou seja, sem a utilização de qualquer intermediário. A espécie

fermentativa Pelotomaculum thermopropionicum liga-se com recurso a filamentos eletricamente

condutores, os nanofios, a células da espécie Methanothermobacter thermautotrophicus

constituindo a primeira evidência de transferência elétrica direta entre diferentes espécies

(Gorby et al., 2006) (Figura 2, B). Várias bactérias utilizam nanofios para a transferência

eletrónica, no entanto apenas foram estudadas com mais detalhe as bactérias Shewanella

oneidensis e Geobacter sulfurreducens. (Malvankar e Lovley, 2014). Malvankar e Lovley (2014)

sugeriram a manipulação genética para aumentar a produção de nanofios e melhorar a sua

condutividade de forma a aumentar a produção de energia elétrica nas MFCs. Uma hipótese

que foi colocada é que a transferência eletrónica entre espécies possa ser uma via de

comunicação entre elas, facto que ainda não foi estudado experimentalmente (Logan, 2009).

Figura 2: Representação esquemática da transferência eletrónica direta via: (A) citocromos, (B) nanofios. (Adaptado de

Arora, 2012).

1.8. Análise da comunidade microbiana

Como foi referido anteriormente, as bactérias redutoras do compartimento anódico

utilizam o ânodo como aceitador final de eletrões. Os mais recentes estudos nas MFC estão

muito centralizados em melhorar a potência gerada de forma a desenvolver sistemas

economicamente fiáveis. O conhecimento das comunidades microbianas que constituem os

biofilmes é muito importante para uma melhor compreensão dos mecanismos de transferência

eletrónica que ocorrem nas MFCs (Rabaey et al., 2005). Como também já foi referido, as MFCs

10

podem ser operadas com culturas puras ou culturas mistas. O estudo de MFCs com culturas

puras é bastante importante para determinar a capacidade de gerar energia e mecanismos de

transferência eletrónica de uma dada estirpe. Existem diversas publicações com a identificação

de muitas espécies com a capacidade de produzir corrente elétrica numa cultura pura,

espécies pertencentes a todas as classes de Proteobacterias. A espécie Geobacter

sulfurreducens tem servido como modelo para clarificar os processos moleculares de

transferência eletrónica. Foi um organismo utilizado em vários estudos e foi até hoje o

organismo que mais eletricidade produziu em cultura pura (Nevin, et al., 2008). A Tabela 1

reúne os organismos capazes de produzir energia elétrica numa MFC a partir de uma cultura

pura.

11

Tabela 1: Microrganismos capazes de produção de corrente elétrica em cultura pura numa MFC.

Microrganismo Grupo taxonómico Referência

Shewanella putrefaciens IR-1 γ-proteobacteria (Kim, et al., 1999)

Proteus vulgaris γ-proteobacteria (Kim, et al., 2000)

Clostridium butyricum Firmicutes (Park, et al., 2001)

Desulfuromonas acetoxidans δ-proteobacteria (Bond, et al., 2002)

Geobacter metallireducens δ-proteobacteria (Bond, et al., 2002)

Rhodoferax ferrireducens β-Proteobacteria (Chaudhuri & Lovley, 2003)

Aeromonas hydrophila A3 δ-proteobacteria (Pham, et al., 2003)

Geobacter sulfurreducens δ-proteobacteria (Bond & Lovley, 2003)

Desulfobulubs propionicus δ-proteobacteria (Holmes, et al., 2004)

Pseudomonas aeruginosa γ-proteobacteria (Rabaey, et al., 2004)

Geopsychrobacter electrodiphilus δ-proteobacteria (Holmes, et al., 2004)

Geothrix fermentans Acidobacteria (Bond & Lovley, 2005)

Saccharomyces cerevisiae Fungi (Walker & Walker, 2006)

Escherichia coli γ-proteobacteria (Zhang, et al., 2006)

Shewanella oneidensis DSP10 γ-proteobacteria (Ringeisen, et al., 2007)

Shewanella oneidensis MR-1 γ-proteobacteria (Bretschger, et al., 2007)

Desulfitobacterium hafniense Firmicutes (Milliken & May, 2007)

Hansenula anómala Fungi (Prasad, et al., 2007)

Acidiphilium sp. 3.2Sup5 α-Proteobacteria (Borole, et al., 2008)

Ochrobactrum antrophi YZ-1 α-Proteobacteria (Zuo, et al., 2008)

Rhodopseudomonas palustris DX-1 α-Proteobacteria (Xing, et al., 2008)

Desulfovibrio desulfuricans δ-proteobacteria (Zhao, et al., 2008)

Therminicola sp. Strain JR Firmicutes (Wrighton, et al., 2008)

Klebsiella pneumoniae L17 γ-proteobacteria (Zhang, et al., 2008)

Arcobacter butzleri ε-proteobacteria (Fedorovich, et al., 2009)

Bacillus subtilis Firmicutes (Nimje, et al., 2009)

Thermincola ferriacetica Z-0001 Firmicutes (Marshall & May, 2009)

Enterobacter cloacae γ-proteobacteria (Rezaei, et al., 2009)

Serratia marcescens γ-proteobacteria (Ghanapriya, et al., 2010)

Corynebacterium sp. strain MFC03 Firmicutes (Liu, et al., 2010)

Nocardiopsis sp. KNU (S strain) Actinobacteria (Hassan, et al., 2012)

Streptomyces enissocaesilis KNU (K

strain) Actinobacteria (Hassan, et al., 2012)

Calditerrivibrio nitroreducens Deferribacteres (Fu, et al., 2013)

Tolumonas osonensis γ-proteobacteria (Luo, et al., 2013)

Cupriavidus basilensis β-Proteobacteria (Friman et al., 2013)

12

No entanto, numa perspetiva mais realista para a aplicação das MFCs ao nível do

tratamento de águas residuais, a utilização de uma cultura mista é mais adequada uma vez

que as culturas puras metabolizam um número limitado de compostos orgânicos. Além disso,

Logan e seus colaboradores (2006) fizeram uma revisão onde se concluiu que as MFCs que

utilizam consórcios de bactérias conseguem produzir substancialmente mais eletricidade do

que culturas puras. Também Ishii et al. (2008) mostrou a partir de uma MFC com apenas uma

câmara (cátodo exposto ao ar), que uma cultura mista produziu 22% mais eletricidade que uma

cultura pura de Geobacter sulfurreducens. Isto pode ser explicado porque geralmente culturas

mistas apresentam maior resistência sob condições de stress, maior taxa de consumo de

substratos e menor especificidade nos substratos (Rabaey et al., 2004). De facto, a utilização

de uma cultura mista de bactérias faz um melhor aproveitamento de toda a matéria orgânica

existente.

Nestes últimos anos foram feitas várias análises ao conteúdo microbiano de biofilmes

de várias MFCs, e verificou-se que não existe nenhuma comunidade bacteriana típica, ou seja,

todas as comunidades analisadas foram diferentes e não existe um organismo mais

proeminente (Aelterman, 2009). Possivelmente também existem ainda bastantes espécies de

bactérias que ainda não foram identificadas como aptas para fazer transferência eletrónica

para um ânodo (Logan et al. 2006). A composição da comunidade microbiana vai depender de

vários fatores como o tipo de inóculo, a configuração da MFC, substratos adicionados e

condições de operacionalidade. Por este motivo torna-se muito importante conhecer as

espécies bacterianas uma vez que, dependendo destes fatores, as bactérias vão usar

diferentes vias metabólicas, sendo por isso um método seletivo e determinante da composição

das populações microbianas. Dado que na MFC os microrganismos vão servir de catalisadores

na transferência de eletrões do substrato para o ânodo, a seleção de bactérias com grande

desempenho é crítica.

1.9. Aplicação das técnicas de biologia molecular em estudos de

biodiversidade

Outrora, a caracterização de populações microbianas baseava-se fundamentalmente

na observação microscópica, nas suas necessidades nutricionais e utilização de diferentes

substratos para a aquisição de carbono e energia e meio de cultivo para o seu crescimento

(métodos ex-situ) (Kennedy, 1999). No entanto, os resultados destas técnicas tornam-se

bastante limitados quando o objetivo é estudar a diversidade de microrganismos que está

associada a um determinado meio ambiente. Os meios de cultivo são seletivos para grupos

específicos o que na maior parte dos casos é extremamente difícil ou mesmo impossível, uma

vez que a maioria dos microrganismos não é sequer cultivável. Por outro lado, muitas vezes

13

não é possível criar as condições para o cultivo de certas espécies cultiváveis, principalmente

devido à falta de informação sobre as necessidades metabólicas e nutricionais de grande parte

dos microrganismos. Com a introdução de técnicas de biologia molecular, houve uma

revolução nas metodologias tradicionais pois não é necessário o cultivo nem o isolamento dos

microrganismos, tornando possível a identificação de microrganismos não cultiváveis,

desconhecidos ou não identificados, e que muitas vezes são determinantes e responsáveis

pelo bom funcionamento de uma cultura. Com base na composição da comunidade microbiana

é ainda possível fazer uma antevisão das funcionalidades de cada espécie, interações

biológicas com o meio e com outros microrganismos e por isso estimar a estabilidade do

processo de tratamento anaeróbio. Normalmente a cooperação entre diferentes

microrganismos oferece um ambiente propício que permite a otimização do processo global

(Wagner & Loy, 2002). Com este conhecimento é possível fazer uma previsão das espécies

que mais contribuem para a produção de bioeletricidade e caracterizar e determinar a

capacidade degradativa da população, indispensável a qualquer biotratamento. O

conhecimento da dinâmica das populações permite ainda o conhecimento das espécies

indesejáveis ou das variações em termos de composição, da estrutura da população ao longo

do processo ou como resultado de variações nas condições ambientais, permitindo ainda o

processo de biotratamento e produção de bioelectricidade.

1.10. Metodologias de biologia molecular

A introdução dos métodos de biologia molecular veio dar suporte às técnicas tradicionais e

embora a atual classificação taxonómica ainda esteja parcialmente baseada nas propriedades

morfológicas e fisiológicas microbianas, cada vez mais se verifica que um grande número de

microrganismos se encontra incorretamente classificado. O método mais utilizado para a

identificação de populações microbianas foi proposto por Pace et al. (1986), que sugeriram o

uso do gene rRNA 16S como marcador molecular ideal para o estudo de populações

microbianas em amostras ambientais. Foi a partir deste método que um ano depois, Carl

Woese e seus colaboradores propuseram uma nova árvore filogenética universal, criada com o

recurso aos métodos moleculares e em particular por recurso à comparação das sequências

nucleotídicas dos genes que codificam o RNA da subunidade menor dos ribossomas, o RNA

16S em procariontes (Figura 3).

14

Figura 3: Árvore filogenética universal determinada pela comparação das sequências rRNA. Uma matriz de

distâncias evolutivas foi calculada a partir dos alinhamentos das sequências de rRNA 16S representativas de cada um

dos três reinos (Carl Woese, 1987).

Com esta proposta, houve um grande incentivo a procurar novas estratégias para

caracterizar o papel dos microrganismos num dado meio e ainda estudar as alterações na

dinâmica das populações. A partir daí, os métodos baseados na análise e sequenciação do

gene rRNA 16S tornaram-se nos mais usados para a análise das comunidades bacterianas

(Dahllöf 2002). Estes métodos foram também bastante bem sucedidos no que diz respeito ao

estudo de comunidades microbianas do solo, mar, rios, lagos, trato gastrointestinal, diversas

amostras clínicas e ainda de reatores anaeróbios para o tratamento de águas residuais (Theron

and Cloete 2000; Narihiro and Sekiguchi 2007).

O conhecimento da composição da comunidade microbiana torna possível antever as

funções de cada espécie, interações biológicas com o meio e com outros microrganismos. A

aquisição de todas estas informações é bastante vantajosa na determinação da estabilidade de

um processo de biotratamento. Normalmente a cooperação entre diferentes microrganismos

oferece um ambiente propício que permite a otimização do processo global (Wagner & Loy,

2002).

Nos últimos anos várias metodologias têm sido desenvolvidas e aperfeiçoadas contribuindo

para o avanço do conhecimento da diversidade genética dos microrganismos, tais como as

análises metagenómicas em que se determinam e analisam as sequências dos genes

codificantes para o rRNA 16S, ou determinando a totalidade das sequências de DNA existentes

na amostra recolhida.

15

1.11. Objetivos do trabalho

A diversidade microbiana em reatores anaeróbios tem sido largamente estudada nos

últimos anos e por isso têm sido obtidas informações muito importantes para a compreensão

da produção de energia nas MFCs. No entanto, existem ainda várias questões que requerem

uma melhor compreensão para compreender a influência da diversidade microbiana na

eficiência das MFCs. Neste contexto, os principais objetivos deste trabalho foram:

i) Caracterizar as populações microbianas existentes em dois reatores anaeróbios

com cátodos distintos (abiótico e biocátodo) com base no conhecimento das

sequências codificantes para o 16S rRNA;

ii) Investigar a diversidade microbiana nos reatores a partir da análise dos perfis dos

fragmentos de restrição dos clones obtidos;

iii) Construção de árvores filogenéticas e comparação da comunidade bacteriana

entre os dois reatores;

iv) Identificação das espécies bioelectroquimicamente ativas por comparação com

literatura disponível;

v) Correlacionar a diversidade microbiana com as respetivas condições de

operacionalidade dos reatores.

17

2. Material e Métodos

2.1. Modo de operação e controlo dos bioreatores

As amostras analisadas no presente trabalho foram provenientes de dois bioreatores

MFCs (R1 e R2) com condições de operacionalidade distintas (Figura 4A), operados pelo Dr.

Ramana S. Venkata sob orientação do Prof. Luís Fonseca do Grupo de Bioengenharia do IST.

Os reatores foram inoculados com lamas de uma cultura mista aeróbia, coletadas numa

estação de tratamento de águas residuais (Chelas, Lisboa). O reator 1 foi inoculado com as

lamas apenas no compartimento anódico enquanto o reator 2 foi inoculado nos dois

compartimentos. A alimentação dos reatores foi feita a partir de águas residuais sintéticas.

Como principais fontes de carbono, o ânodo do reator 1 foi enriquecido com acetato de sódio

(10mM) e o ânodo do reator 2 com acetato de sódio (10mM) e carbonato de sódio (3mM).

Foram ainda fornecidas uma solução tampão de fosfato (50mM) e uma solução vitaminada

respetivamente, para o ânodo do reator 1 e para o cátodo do reator 2. No compartimento

catódico do reator 1 o católito usado foi apenas a solução tampão de fosfato (50mM). O pH dos

reatores foi mantido a 7 nos dois compartimentos de ambos os reatores. Os dois

compartimentos apresentavam o mesmo volume e eram separados por uma membrana de

Nafion de condutividade 9.0 ± 5 mS/ cm-1

. Os dois compartimentos catódicos foram

continuamente providos de oxigénio através de uma bomba de ar de forma a manter constante

a quantidade de oxigénio dissolvido (4 ± 0.2 mg/l). Por cada ciclo em modo batch e após a

alimentação e colheita de amostras, os compartimento anódicos foram borbulhados com azoto

gasoso durante 20 minutos, de forma a remover oxigénio dissolvido e a garantir que o meio se

mantinha anaeróbio. Para melhorar a transferência de massa, os compartimentos foram

continuamente agitados com recurso a um agitador magnético. Os meios foram renovados

sempre que a voltagem diminuía até aos 50mV e era nessa altura que a biomassa suspensa

era recolhida, completando assim, um ciclo do reator. Os reatores foram operados durante 28

ciclos à temperatura ambiente (aproximadamente 25°C), correspondendo a 220 dias, enquanto

os valores máximos reprodutíveis de tensão fossem mantidos. Os elétrodos estavam

conectados através de um fio de cobre a uma resistência externa de 1000Ω. A Figura 4B

apresenta uma representação esquemática do modo de operação dos dois reatores.

18

Figura 4: (A) Fotografia dos bioreatores MFCs donde foram recolhidas as amostras de biomassa analisados neste

trabalho, reator 1 à esquerda e reator 2 à direita, com condições de operacionalidade distintas; (B) Representação

esquemática dos dois compartimentos dos reatores MFC, reator 1 e reator 2, com condições de operacionalidade

diferentes no cátodo. (A) cátodo abiótico no R1 e (B) biocátodo no R2. R representa a resistência externa.

2.2. Recolha das amostras

Após o final de um ciclo do reator, as amostras das lamas foram recolhidas por raspagem

dos biofilmes existentes na região dos elétrodos e o material recolhido foi imediatamente

congelado a -80°C. De cada compartimento, de cada reator, foram retiradas amostras de dois

períodos distintos, no período de maior produção de energia e após os 150 e 165 dias para o

reator 2 e reator 1, respetivamente, onde a produção de bioeletricidade era mais baixa (figura

5). A análise da biodiversidade foi investigada para os dois períodos.

(A)

(B)

19

Figura 5: Variação da voltagem (mV) para o reator 1 e reator 2 ao longo do tempo.

2.3. Avaliação da diversidade das comunidades bacterianas

Todo o procedimento experimental para a elaboração deste trabalho foi baseado na

metodologia proposta por Ramos et al. (2008), seguindo uma estratégia que combina a

extração de DNA cromossómico total das amostras dos biofilmes, amplificação dos genes que

codificam para o rRNA 16S por PCR, clonagem e sequenciação dos clones previamente

selecionados a partir de análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição (RFLP) obtidos

após hidrólise dos fragmentos de DNA das sequências clonadas. O procedimento está

esquematizado na Figura 6 e é desenvolvido detalhadamente em seguida.

Figura 6- Representação esquemática da metodologia usada neste trabalho para a identificação dos

microrganismos presentes nas células microbianas.

Extração e purificação de DNA cromossómico

Amplificação por PCR

Clonagem

Estabelecimento de perfis de restrição

Sequenciação

Análise bioinformática

Identificação das sequências do rRNA 16S mais próximas

20

2.4. Extração e purificação de DNA cromossómico

A extração e purificação de DNA cromossómico é um processo que se baseia na

utilização de soluções de lise para romper a membrana da célula pela adição de detergentes

para remover lípidos de membrana e ainda promover a lise por adição de proteases e RNAses

para remoção de proteínas e RNA, respetivamente. Após este processo é promovida a

precipitação do DNA pela adição de etanol e acetato de sódio. Devido à insolubilidade do DNA

no etanol, este vai agregar-se e precipitar após centrifugação, facilitando o seu isolamento.

Neste trabalho a extração de DNA cromossómico foi realizada usando o kit comercial “High

Pure PCR Template Preparation Kit” (Roche) segundo as instruções do fabricante, o que

permitiu a purificação de ácidos nucleicos de culturas para posterior processamento.

De modo a analisar o grau de pureza do DNA genómico extraído, este foi analisado

num espectrofotómetro (NanoDrop ® ND-1000 Technologies) por UV/Vis. Através do cálculo

das razões Abs260/Abs280 e Abs260/Abs230 obteve-se uma estimativa do estado de pureza do

DNA (Holler, Skoog, & Crouch).

2.5. Electroforese em gel de agarose

A integridade do DNA genómico purificado foi analisada após electroforese em gel de

agarose (0,8%) em tampão TAE 1x (TAE 50x: 242 g/l Tris Base, 57,1 ml/L acido acético, 100

ml/L de 0.5 EDTA, pH 8) (Sambrook e Russel, 2001). As amostras a analisar foram preparadas

adicionando 10% do volume de corante de aplicação (1% SDS, 50% de Glicerol e 0,05% de

Azul de Bromofenol, 10x concentrado) e submetidas a uma voltagem de 90V durante

aproximadamente 1 hora. Por fim, os géis foram corados por imersão em tampão contendo Gel

Red e visualizados num sistema Gel Doc XR (BioRad, Universal Hood II).

2.6. Amplificação dos genes rRNA 16S

De modo a amplificar os segmentos de DNA dos genes que codificam para o RNA da

subunidade ribossómica 16S, recorreu-se ao PCR usando os oligonucleótidos iniciadores

descritos na Tabela 2. A técnica de PCR permite amplificar pequenos fragmentos do genoma

obtendo-se grandes quantidades de determinada região de DNA. São necessários

oligonucleótidos iniciadores universais ou específicos (sequências iniciadoras),

complementares às sequências localizadas em locais específicos do genoma.

21

Tabela 2 – Sequência e características dos oligonucleótidos iniciadores usados neste trabalho.

Domínio Temperatura

de annealing

(°C)

Forward primer

(5’-3’)

Reverse primer

(3’-5’)

Tamanho

esperado

(bp)

Referências

Bactéria 70 CCAGATCCTACGGGAGGCAG

C

CTTGCTCGGGCCCCGTCAATT

C

605 Rudi et al.,

1997

Archaea 56 ACTGCTCAGTAACACGT CTCCCCCGCCAATTCTTTA 803 Lueders e

Friedrich,

2000

As reações de PCR continham, num volume total de 20 μl, 0,4 μl de cada

oligonucleótido iniciador, 1,5 μl de MgCl2 (1,5 mM), 0,4 μl de DNTPs (0,1 mM), 5 μl de DNA

molde (concentração aproximada de 200 ng), 0,2 μl de Taqmed DNA polimerase (1 U) e 2 μl do

respetivo tampão de reação (10x concentrado) fornecido pelo fabricante da polimerase

(Citomed).

Normalmente a temperatura de annealing é cerca de 5°C abaixo da menor temperatura

de melting do par de oligonucleótidos iniciadores utilizado. Assim, pela fórmula para a

temperatura de melting proposta por Wallace e os seus colaboradores (1979) (Tm (°C) = 2 ( A

+ T ) + 4 ( G + C ) ), tem-se que a temperatura ótima de annealing para qualquer par de primers

pode ser calculada pela seguinte fórmula empírica:

Ta (°C) = 2 ( A + T ) + 4 ( G + C ) - 5°C

em que A, T, C e G da fórmula referem-se ao número de vezes que cada base está presente

na sequência iniciadora. No caso específico deste trabalho, a temperatura ótima de annealing é

de 58,2°C.

A tabela seguinte faz um sumário do programa de PCR que foi usado no trabalho.

Tabela 3- Sumário do programa do PCR (30 ciclos)

Temperatura (°C) Duração (min)

Desnaturação 95 5:00

Annealing

(30 ciclos)

95 0:45

58,2 1:00

72 0:45

Extensão 72 7:00

Fim 4 ∞

22

A obtenção dos produtos de amplificação após a reação de PCR foi confirmada por

electroforese em gel de agarose. Para confirmar o tamanho dos fragmentos amplificados foi

necessário utilizar um marcador de pesos moleculares, neste caso o marcador de origem

comercial 1 Kb Plus (Fermentas). Os géis foram corados e as bandas visualizadas num

transiluminador UV Gel Doc XR (BioRad, Universal Hood II).

2.7. Purificação dos produtos de PCR

Após as reações de amplificação de DNA por PCR, procedeu-se à purificação dos

amplificados de forma a garantir que o DNA se mantinha estável durante os períodos de tempo

de armazenamento. A purificação pode ser feita diretamente a partir dos produtos de PCR mas

também é possível recuperar e purificar DNA contido nos géis de agarose. A recuperação das

amostras em gel foi efetuada no presente trabalho recorrendo ao kit Gel Pure (NZYTech). Este

kit é utilizado para a purificação de fragmentos de DNA entre 100 bp a 10kb, retidos em géis de

agarose. Este método baseia-se na utilização de membranas de sílica-gel que absorvem

seletivamente até 10 μg de fragmentos de DNA na presença de tampões de ligação

específicos. O tampão de ligação vem incluído no kit e contém um pH adequado à ligação do

DNA sem que este interfira com a ligação (ver protocolo do kit) A grande desvantagem é que

neste passo existe o risco de se perderem as extremidades de adenosina dos fragmentos de

DNA e por esta razão, o rendimento do processo poderá ser inferior uma vez que estas

extremidades são indispensáveis para que os produtos de PCR se liguem ao vetor de

clonagem usado.

2.8. Clonagem

Na clonagem, os produtos de PCR purificados são ligados a um vetor de DNA que

passa a ser replicado quando introduzido numa célula hospedeira. A clonagem foi feita

recorrendo ao kit comercial TA Cloning (Invitrogen), que de uma forma rápida e num passo

apenas, permite fazer a inserção dos produtos de PCR no vector. O kit inclui os seguintes

componentes: vector linearizado pCR®2.1, T4 DNA Ligase e respetivo tampão. Este método

baseia-se no facto da Taq polimerase ter uma atividade que adiciona uma única adenosina (A)

ao terminal 3’ dos produtos de PCR (Figura 7). Por outro lado, o vector linearizado fornecido

com o kit apresenta resíduos de timina (T) no terminal 3’, o que vai permitir a ligação eficaz dos

produtos de PCR ao vector linearizado uma vez que as extremidades são coesivas (protocolo

do TA Cloning Kit da Invitrogen). Após as reações de ligação, é promovida a precipitação do

DNA por forma a remover a ligase, bem como o excesso de sais presente no tampão de

ligação, pois estes podem interferir negativamente no processo de eletroporação. A

precipitação foi feita adicionando-se acetato de sódio a 3M (10% do volume total da reação) e

23

etanol (2,5x o volume final da reação), seguido de uma centrifugação de 30 min, 15000 rpm, a

4ºC (Sambrook e Russel, 2001). Após centrifugação, o DNA foi lavado com etanol a 70% e

seco. Por fim, adicionou-se água destilada para ressuspender o DNA das amostras e em

seguida procedeu-se à transformação de células de Escherichia coli.

Figura 7- Representação gráfica, marcas de resistência gene LacZα (esquerda) e representação esquemática do

príncipio para clonagem do fragmento no vetor PCR2.1 (TA Cloning Kit, Invitrogen).

2.9. Transformação

A transformação foi efetuada por dois métodos diferentes, eletroporação ou

transformação clássica, dependendo da disponibilidade do equipamento e das células

disponíveis para o efeito.

No caso da transformação clássica, a suspensão contendo o plasmídeo e as células foi

colocada em gelo durante aproximadamente 30 minutos. De seguida, esta foi colocada

durante 3 minutos num banho a 43°C causando um choque térmico para as células

competentes captarem o DNA e por fim, 5 minutos em gelo. De seguida as amostras

foram colocadas num tubo contendo meio LB líquido e incubado a 37ºC, a 250

rotações num agitador orbital durante 1 hora. As células competentes foram

preparadas a partir de uma colónia de Escherichia coli αDH5 e colocada em 10 ml de

meio LB líquido a 37°C durante a noite de forma a favorecer o seu crescimento.

Seguidamente 4 ml da cultura foram adicionadas a meio LB líquido, durante

aproximadamente 1 hora, até que a densidade ótica inicial (640 nm) de 0,1 aumentasse

até atingir um valor de 0,5. As células foram recolhidas por centrifugação durante 5 min

a 5600 rpm e a 4°C e no final o sobrenadante foi removido. Adicionou-se 100 ml de

MgCl2 0,1M para ressuspender delicadamente o sedimento e centrifugou-se uma vez

mais. De seguida, ressuspenderam-se as células em 100 ml de CaCl2 0,1M e durante

30 minutos foram mantidas em gelo. No final, as células foram recolhidas por

centrifugação e ressuspensas em 22 ml de CaCl2 0,1 M, adicionou-se 3,5 ml de glicerol

24

a 86% e distribuiu-se a suspensão resultante em alíquotas de 300 µl por tubos

eppendorfs. Todo o processo foi realizado em condições de esterilidade e em gelo.

No caso da transformação por electroporação, depois da mistura de ligação de

interesse ter sido incorporada num eppendorf com as células electrocompetentes, a suspensão

resultante foi colocada num sistema de electroporação da BioRad com os seguintes

parâmetros: 2,5 V de tensão e 400 Ω de resistência. Estes valores foram usados para as

células de E. coli. Após a electroporação, as células foram imediatamente colocadas num tubo

com 1 ml de meio LB líquido e incubadas durante aproximadamente 1 hora a 37ºC sob

agitação (250 rpm).

As células electrocompetentes foram preparadas a partir de uma colónia de

Escherichia coli αDH5, colocadas em 10 ml de meio LB líquido e incubados a 37°C durante a

noite. De seguida, um volume adequado da cultura foi transferido para um novo erlenmeyer de

100 ml com LB líquido de modo a obter-se uma densidade óptica (DO) inicial de 0,1 a 640 nm.

A cultura foi incubada até atingir uma DO de 0,8. As células foram depois recolhidas por

centrifugação a 10000 rpm durante 15 minutos a 4°C e o sedimento resultante foi lavado com

água destilada estéril e fria. Foi efetuada novamente uma lavagem mas com 4 ml de glicerol

frio a 10% e por fim ressuspendeu-se em 2 ml de glicerol frio a 10%. No final a suspensão foi

aliquotada em volumes de 110 μl em eppendorfs e conservados a -70°C. Todo o processo foi

efetuado em condições rigorosas de esterilidade e gelo.

Após a transformação espalhou-se a suspensão em meio sólido seletivo para posterior

seleção de clones. A suspensão foi então espalhada em placas de LB sólido com o antibiótico

canamicina, previamente tratadas com X-gal e colocadas na estufa a 37°C durante a noite. O

uso de canamicina em detrimento da ampicilina tem a vantagem de garantir que não se

desenvolvem colónias satélite. As bactérias, ao receberem este DNA, adquirem a capacidade

de crescer em meio de cultura contendo antibiótico assegurando que apenas as células que

expressam o gene de resistência ao antibiótico conseguem crescer na placa. Dado que o

plasmídeo usado com o vetor de clonagem contém o gene lacZ’ que codifica a enzima β-

galactosidase responsável pela clivagem da galactose, a presença de X-gal faz com que as

colónias das bactérias que contenham estes plasmídeos se tornem azuis. A cor azul deve-se à

hidrólise do X-gal pela enzima β-galactosidase formando um produto azul. No entanto, caso

ocorra inserção de DNA no plasmídeo, o gene lacZ’ é interrompido e as colónias que contêm o

DNA exógeno ficam brancas uma vez a enzima β-galactosidase não é produzida. A estirpe

utilizada no trabalho é E.coli αDH5. (Sambrook & Russel, 2001).

2.10. Extração de DNA plasmídico

Os plasmídeos de interesse foram extraídos segundo a técnica de lise alcalina

proposto originalmente por Birnboim e Doly (1979). Este método baseia-se na diferença na

desnaturação, em condições alcalinas (pH ~12), entre o DNA plasmídico e o DNA

cromossómico de alto peso molecular. Plasmídeos de grandes dimensões apresentam

25

propriedades semelhantes ao DNA cromossómico e por essa razão a sua separação é

dificultada. Primeiramente foi efetuada a lise das células com a adição da solução I composta

por Tris-HCl, EDTA (pH=8) e glucose. De seguida adicionou-se uma outra solução de lise,

solução II, que contém SDS para lisar a membrana das células e desnaturar proteínas e NaOH

que eleva o pH para valores alcalinos (pH~12). Nestas condições, ocorre a desnaturação do

DNA cromossómico mas não do DNA plasmídico de menores dimensões. Posteriormente foi

adicionada a solução III, composta por acetato de potássio e ácido acético. A adição de acetato

de potássio tem como objetivo neutralizar a solução devido à elevada concentração de iões H+,

provocando a precipitação do DNA cromossómico. A adição da solução III provoca ainda a

precipitação de proteínas complexadas com SDS, agregadas pela adição da solução II. Após a

adição das três soluções foi efetuada uma centrifugação durante 10 minutos a velocidade

elevada, em que o sobrenadante contendo o DNA plasmídico foi transferido para um novo

tubo. O DNA plasmídico foi então precipitado com a adição de etanol e, no final, a amostra foi

seca sob vácuo. A integridade do DNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose e a

concentração estimada pela absorvância a 260 nm recorrendo ao espectrofotómetro NanoDrop

® (ND-1000 Technologies) (Sambrook & Russel, 2001).

2.11. Análise dos perfis de restrição

A técnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) baseia-se na

comparação dos perfis de restrição obtidos após hidrólise do DNA com enzimas de restrição e

separação em gel de agarose ou poliacrilamida. O procedimento para obter os perfis de

restrição baseia-se em digestões recorrendo a enzimas de restrição. No presente trabalho

usou-se a enzima Hae III para clivar as ligações fosfodiéster entre G e C nas posições onde a

sequência GGCC é encontrada, originando um grande número de fragmentos de diversos

tamanhos.

Como os fragmentos gerados apresentaram tamanhos muito reduzidos, para uma

melhor resolução foram separados em gel de poliacrilamida (10%) num sistema vertical Mighty

Small (Hoefer). O gel era composto por acrilamida a 30%, tampão TBE (10x) (TBE 10x: 108 g/L

Tris Base, Ácido bórico 55 g/L, 7,44g Na2EDTA•2H2O), água desionizada, persulfato de

amónia (APS) (10%) e tetrametiletilenodiamina (TEMED). Após a polimerização do gel, as

amostras foram adicionadas aos poços do gel e o sistema foi submetido a uma voltagem de

110V. Os géis foram corados por imersão em tampão TAE contendo GelRed e visualizados no

sistema UV Gel Doc XR (BioRad, Universal Hood II). A partir das imagens obtidas, as amostras

foram agrupadas de acordo com o seu perfil de restrição, de maneira a evitar a posterior

sequenciação dos mesmos clones.

Os plamídeos foram sequenciados pela firma Operon MWG Eurofins, usando o primer

universal de sequenciação M13 (5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′).

26

2.12. Análise das sequências dos genes de rRNA 16S

As sequências de DNA obtidas pela sequenciação dos plasmídeos correspondentes

aos diferentes clones de rRNA 16S foram analisadas segundo o programa bioinformático

VecScreen, disponível no portal do NCBI (National Center for Biotecnology Information)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). As sequências ao serem analisadas por este programa são

submetidas a um alinhamento local contra o banco de dados de vetores, o Univec. Desta

forma, o programa forneceu diversas informações entre as quais a localização das sequências

contaminantes e os fragmentos suspeitos. Após a remoção das sequências referentes ao vetor,

as sequências restantes foram submetidas à pesquisa de similaridade de nucleótidos através

da ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Esta ferramenta permitiu a

comparação entre as sequências de nucleótidos resultantes da sequenciação com sequências

da base de dados. Como resultado, foi possível inferir as relações funcionais e evolucionárias

entre sequências e a identificação dos microrganismos mais similares geneticamente.

2.13. Análise filogenética dos segmentos de rRNA 16S

A construção de árvores filogenéticas é importante de forma a avaliar a comunidade

microbiana presente nos reatores em questão. De forma a obter as árvores filogenéticas, as

sequências dos segmentos de rRNA 16S, clonados e identificados nas bases de dados foram

alinhadas através do software MEGA4. A partir dos alinhamentos foi possível construir árvores

filogenéticas que estimam as divergências temporais, evoluções moleculares e sequências

ancestrais e ainda testar hipóteses evolucionárias. O algoritmo utilizado no MEGA4 foi o

ClustalW, indicado para alinhamentos de várias sequências. Desta forma, as sequências mais

similares, isto é, as que apresentam um melhor score no alinhamento, são as primeiras a ser

alinhadas. Geralmente, as árvores resultantes são próximas do ideal, especialmente quando o

conjunto de dados contém sequências com diferentes graus de divergência (Thompson et al.,

1994).

27

3. Resultados e discussão

3.1. Recolha das amostras e identificação

De forma a facilitar a identificação das amostras obtidas após as reações de PCR

efetuadas sobre o DNA obtido dos reatores, adotou-se uma nomenclatura que reflete o reator,

o compartimento (ânodo ou cátodo), a fase de produção de bioeletricidade e se foram usados

os oligonucleótidos iniciadores para Archaea ou Bacteria. A Tabela 4 sumariza a nomenclatura

adotada.

Tabela 4: Nomenclatura adotada para designar as amostras de cada reator e distingui-las quanto ao tipo de organismo,

compartimento do reator e fase de produção de bioeletricidade. As amostras marcadas com asterisco foram analisadas

por Andreia Fernandes, durante um estágio realizado sob orientação dos professores Luís Fonseca e Jorge Leitão, e

foram incluídos para uma melhor compreensão do trabalho.

Fase de maior produção

de bioeletricidade

Fase de menor produção

de bioeletricidade

Ânodo Cátodo Ânodo Cátodo

Reator 1 Bactérias R1A_B1* R1C_B1 R1A_B2 R1C_B2

Archaeas R1A_A1* R1C_A1 R1A_A2 R1C_A2

Reator 2 Bactérias R2A_B1 R2C_B1 R2A_B2 R2C_B2

Archaeas R2A_A1 R2C_A1 R2A_A2 R2C_A2

3.2. Análise das electroforeses em gel de agarose

Após a extração e purificação do DNA genómico, procedeu-se à eletroforese em gel de

agarose o que permitiu verificar a existência e a integridade do DNA genómico purificado

(resultados não mostrados).

A Figura 8 mostra o resultado da electroforese para o R1 na fase de menor produção

de bioelectricidade, nos dois compartimentos, usando os oligonucleóticos iniciadores para

archaeas e para bactérias. A ausência de bandas para Archaea no R1A (poço 2) foi o

resultado mais relevante e que sugeriu a inexistência de Archaea no compartimento anódico do

R1. Este resultado foi obtido independentemente da confirmação da existência de DNA

extraído do compartimento anódico do reator 1, que não apresentava quaiquer sinais de

degradação quando visualizado após electroforese em gel de agarose.

28

(1) (2) (M) (3) (4)

Figura 8 – Electroforese em gel de agarose dos amplificados obtidos após reação de PCR usando DNA total extraído

do cátodo e ânodo do reator 1 para o R1 na fase de menor produção de bioelectricidade. Pistas: (1)-R1C_A2- Archaea

no compartimento catódico; (2)-R1A_A2- Archaea no compartimento anódico; (M)-marcador de pesos moleculares; (3)-

R1A_B2- bactérias no compartimento anódico; (4) R1C_B2- bactérias no compartimento catódico.

As Figuras 9 e 10 ilustram os resultados da electroforese para o reator 2 nas duas fases de

produção de bioelectricidade para o anôdo, para o anôdo e para o cátodo, respectivamente.

(1) (2) (M) (3) (4)

Figura 9 – Electroforese em gel de agarose dos amplificados obtidos após reação por PCR do DNA total extraído do

anôdo do R2 nas duas fases de produção de bioelectrocidade. Pistas: (1)-R2A_A1- Archaea na fase de maior produção

de bioelectricidade; (2)-R2A-A2- Archaea na fase de menor produção de bioelectricidade; (M)- marcador de pesos

moleculares; (3)-R2A_B1- bactérias na fase de maior produção de bioelectricidade; (4)- R2A_B2- bactérias na fase de

menor produção de bioelectricidade.

No ânodo do reator 2, a ausência de bandas quando se usaram os primers para

Archaea nas reacções de PCR com DNA obtido na fase de menor produção de energia (poço

29

2) sugere a inexistência de Archaea. Apesar da fraca intensidade da banda no poço 1,

correspondente a Archaea no período de maior produção de energia no compartimento

anódico, a quantidade de DNA genómico total foi considerável. Por outro lado, a intensidade

das bandas para bactérias (poço 3 e 4) é maior, o que indica uma boa concentração de DNA

genómico.

(1) (2) (M) (3) (4)

Figura 10 – Electroforese em gel de agarose dos amplificados obtidos após reação por PCR do DNA total extraído do

cátodo do reator 2 nas duas fases de produção de bioelectrocidade. (1)-R2C_A1- Archaea na fase de maior produção

de bioelectricidade; (2)-R2C-A2- Archaea na fase de menor produção de bioelectricidade; (M)- marcador de pesos

moleculares; (3)-R2C_B1- bactérias na fase de maior produção de bioelectricidade; (4)- R2C_B2- bactérias na fase de

menor produção de bioelectricidade.

No cátodo do reator 2 verificou-se a ausência de bandas no poço 2, o que implica a

inexistência de Archaea na fase de menor produção de bioelectricidade. Apesar da banda que

é visivel no poço 1, e que corresponde a Archaea na fase de maior produção de energia, não

foi possível obter o seu DNA genómico, pelo que se considerou a ausência de Archaea no

compartimento catódico do R2. Já com os primers para bactérias, tanto para a fase de maior

produção de bioelectricidade (poço 3) como para a de menor produção (poço 4), obteve-se

uma grande intensidade de bandas. Os resultados descritos foram confirmados pela repetição

das extrações de DNA e das electroforeses e comprovados pela análise estimativa do estado

de pureza do DNA genómico no espectrofotómetro.

30

3.3. Análise dos perfis de restrição dos clones obtidos

Depois de se obter os amplificados por PCR, estes foram sujeitos a purificação para

garantir que eram obtidos apenas os fragmentos amplificados. Posteriormente procedeu-se à

clonagem no vector de clonagem pCR2.1 e de seguida à transformação em células de E. coli

αDH5. Os transformantes foram espalhados na superfície de uma placa contendo meio LB

sólido e com os antibióticos apropriados (descrito na secção Materiais e Métodos). A

transformação resultou numa série de colónias em que os transformantes contendo os

fragmentos de interesse originaram colónias brancas, que foram selecionadas. Foram obtidos

um total de 960 plasmídeos recombinantes a partir do DNA extraído dos dois compartimentos

dos dois reatores, tanto na fase de maior como de menor produção de bioelectricidade (cátodo

e ânodo). De forma a minimizar o número de reações de sequenciação, o DNA foi hidrolisado

com a enzima de restrição Hae III de forma a obter o perfil de restrição para cada um dos

plasmídeos obtidos. Os perfis de restrição obtidos podem ser característicos ao nível das

sequências específicas de cada fragmento. A técnica aproveita-se da possibilidade dessas

diferenças se encontrarem na sequência de reconhecimento da(s) enzima(s) de restrição

utilizada(s) e a sua comparação permite distinguir essas diferenças como diferentes

sequências. A maior vantagem da utilização desta técnica é que minimiza o número de

sequenciações necessárias, uma vez que apenas se sequenciam os clones com perfis de

restrição diferentes, minimizando tempo e recursos. Desta forma, a partir da comparação dos

perfis de restrição, os clones foram agrupados pelo seu perfil. A Tabela 5 resume o número de

clones obtidos em cada ensaio com o número de perfis diferentes obtidos.

31

Tabela 5: Comparação entre o número total de clones obtido, o número inicial de perfis diferentes que correspondeu a

diferentes clones para sequenciar e o número efetivo de perfis diferentes.

Nº total de clones

obtidos

Nº efetivo de perfis

diferentes

R2A_B1 96 8

R2A_A1 119 9

R2C_B1 120 6

R1A_B1 87 8

R1C_B1 126 8

R1A_A1 68 7

R2C_B2 135 20

R2A_B2 41 7

R1C_A2 72 0

R1C_B2 48 8

R1A_B2 48 4

Total 960 85

De facto, no total, o número de reações de sequenciação ficou reduzido de 960 a 142,

o que equivaleu a uma redução de 85% em tempo e recursos. Após a sequenciação verificou-

se que dos 142 perfis iniciais, 85 corresponderam a clones diferentes. As figuras seguintes

ilustram exemplos de perfis de restrição obtidos nos dois reatores, usando primers para o rRNA

16S de bactérias (Figura 11) ou de Archaea (Figura 12). Os perfis aqui ilustrados serviram

como base para agrupar os diferentes clones obtidos.

32

Figura 11: Exemplos de alguns perfis obtidos usando primers para bactérias e sua distribuição pelas ordens. (A)-

Burkholderiales; (B)-Rhodocyclales; (C)-Xanthomonadales; (D)-Rhizobiales; (E)-Nitrosomonadales; (F)-

Enterobacteriales; (G)-Desulfuromonadales; (H)-Sphingomonadales; (I)-Pseudomonadales; (J)-Caulobacterales; (K)-

Flavobacteriales; (L)-Sphingobacteriales.

Figura 12: Exemplos de alguns perfis obtidos usando primers para Archaea. (A)-Methanosarcinales; (B)-

Methanobacteriales; (C)-Methanomicrobiales; (D)-Methanomassiliicoccus; (E)-Nitrososphaerales;

3.4. Composição das populações microbianas

Após a sequenciação, procedeu-se à análise das sequências de DNA obtidas e à

análise filogenética. Para cada uma das sequências obtidas identificou-se o organismo cuja

sequência de rRNA 16S depositada no GenBank é mais próxima e construíram-se as

respetivas árvores filogenéticas de forma a identificar as relações filogenéticas entre os

organismos identificados. As tabelas seguintes (6 a 13) reúnem as espécies de organismos

que foram obtidas nos vários compartimentos e nas diferentes fases de produção de

bioelectricidade dos reatores. As relações filogenéticas foram construídas a partir das

sequências dos clones obtidos e as árvores filogenéticas encontram-se representadas no

Anexo I.

33

Tabela 6: Espécies microbianas identificadas como as mais próximas das sequências obtidas por PCR no

compartimento anódico do reator 1, na fase de maior produção de energia. Para cada sequência obtida são indicadas a

espécie mais próxima bem como os parâmetros max score, total score, query cover, e-value e identidade.


compartimento anódico do reator 1, na fase de menor produção de energia. Para cada sequência obtida são indicadas

a espécie mais próxima bem como os parâmetros max score, total score, query cover, e-value e identidade.

34


compartimento catódico do reator 1, na fase de maior produção de energia. Para cada sequência obtida são indicadas



compartimento catódico do reator 1, na fase de menor produção de energia. Para cada sequência obtida são indicadas


35







36


compartimento catódico do reator 2, na fase de maior produção de energia. Para cada sequência obtida são indicadas



compartimento catódico do reator 2, na fase de menor produção de energia. Para cada sequência obtida são indicadas


Com a identificação dos organismos em cada reator e tendo em conta o número de

clones que correspondeu a cada perfil de restrição, foi possível fazer uma análise gráfica que

compara as abundâncias relativas dos organismos nos dois reatores nas duas fases de

produção de bioelectricidade. No entanto, estes resultados poderão ter erros associados

decorrentes de problemas de especificidade das reações de PCR uma vez que, a

especificidade é dada pelos primers e estes podem ter mais afinidade para determinadas

sequências presentes nalguns organismos. As figuras seguintes comparam as abundâncias

relativas dos organismos nas duas fases de produção de bioelectricidade.

37

Figura 11: Comparação da abundância relativa das espécies identificadas no compartimento anódico do reator 1 no

compartimento anódico nas fases de maior e menor produção de bioeletricidade.

Figura 12: Comparação da abundância relativa das espécies identificadas no compartimento catódico do reator 1 no


0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

R1A

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

R1C

Bacteria Archaea

Bacteria Archaea

38

Figura 14: Comparação da abundância relativa das espécies identificadas no compartimento catódico do reator 2 no


Figura 13: Comparação da abundância relativa das espécies identificadas no compartimento anódico do reator 2 no


0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

R2C

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

R2A

Bacteria

Bacteria Archaea

39

O esquema da Figura 17 representa um heat map com a distribuição das bactérias e

archaeas obtidos nas duas fases, para os dois reatores nos dois compartimentos. Os

resultados são apresentados ao nível do filo (coluna esquerda) e ao nível da ordem (coluna

direita) com a identificação do número de espécies obtidas em cada ordem (entre parêntesis).

up down Bacteria

R1C R1A R2C R2A R1C R1A R2C R2A

Bac

teri

a

Proteobacteria

60 1 48 1 1 1 2 4 Burkholderiales (8)

1

Rhodospirillales (1)

7 21 5 11

7 1 9 Rhodocyclales (4)

1

23

9

9

Xanthomonadales (3)

7 1 4

6

4

Rhizobiales (10)

4

Nitrosomonadales (1)

26

4

Enterobacteriales (3)

2

2 Desulfuromonadales (1)

1

Sphingomonadales (1)

20 47

62 17

Pseudomonadales (2)

1

Caulobacterales (1)

Firmicutes 1

Bacillales (1)

1 Selenomonadales (1)

Bacteroidetes

1

Cytophagales (1)

4

2

3

Flavobacteriales (3)

1 2

Sphingobacteriales (2)

Chloroflexi

1

unclassified Chloroflexi (1)

Acidobacteria

1

unclassified Acidobacteria (1)

Euryarchaeota

30

3 5

Methanosarcinales (4)

A

rch

aea

8

Methanobacteriales (3)

6

71 53

Methanomicrobiales (4)

3

Methanomassiliicoccus (1)

Thaumarchaeota

1

Nitrososphaerales (1)

Figura 17- Heat map para bactérias e archaea cujas sequências de genes para o rRNA 16S são mais próximas das

sequências obtidas para os dois reatores (R1 e R2), nas duas fases, em ambos os compartimentos (anódico e

catódico). Os organismos são apresentados segundo o filo (coluna da esquerda) e segundo a ordem com a

identificação do número de espécies em cada ordem entre parêntesis (coluna da direita).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=1224&lvl=3&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlock




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=135614&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock
















http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=206389&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock

40

Com base nas bibliotecas de clones obtidos e na abundância de cada clone avaliado

pelas análises dos perfis de restrição, o filo Proteobacteria aparece como o mais abundante

entre as bactérias, representando mais de 95% dos 250 clones obtidos para as bactérias. De

entre Proteobacterias, Pseudomonadales e Burkholderiales são as ordens mais abundantes,

correspondendo respectivamente a 33% e a 23% do total de Proteobacterias identificadas. No

caso de Archaea, a ordem Methanomicrobiales do filo Euryarchaeota (estritamente redutoras

de dióxido de carbono), é o mais abundante, correspondendo a 90% do total de clones de

Archaea. No total identificaram-se 45 espécies diferentes de bactérias entre as 18 ordens

obtidas e 13 espécies diferentes entre as 5 ordens de Archaea.

3.5. Discussão de resultados

3.5.1. Reator 1

Do compartimento anódico do reator 1 foram obtidos 87 clones contendo sequências

de genes para o rRNA 16S de bactérias e 68 clones para Archaea para a fase de maior

produção de bioelectricidade. Na fase de menor produção de bioelectricidade obtiveram-se 48

clones de bactérias no ânodo (R1A_B2). Por outro lado, no compartimento catódico (R1C_B1)

foram obtidos 126 clones de bactérias para a fase de maior produção de bioelectricidade, 72

clones de Archaea e 48 clones de bactérias para a fase de menor produção de energia.

A Figura 13 mostra que no reator 1, na fase de maior produção de bioelectricidade,

Pseudomanodales e Rhodocyclales são as ordens bacterianas a que pertecem a maior parte

das sequências identificadas no ânodo. Por outro lado, na fase de menor produção de

bioelectricidade, verificou-se a total inexistência de sequências pertencentes a estas classes,

aparecendo espécies pertencentes às ordens das Burkholderiales e Rhodospirillales. Este facto

sugere que embora Burkholderiales e Rhodospirillales sejam vulgarmente identificadas em

MFCs, o seu papel poderá não ter grande relevância na produção de bioelectricidade ou ainda

que, o seu papel na produção de bioelectricidade poderá estar dependende de outras espécies

como por exemplo de Pseudomonadales. As sequências obtidas no cátodo do reator 1 foram

obtidas com uma elevada percentagem para as ordens Burkholderiales, Pseudomonadales e

Enterobacteriales aquando da fase de maior produção de energia (Figura 14). Já na fase de

menor produção de bioeletricidade houve uma clara diminuição de Burkholderiales e total

desaparecimento de Enterobacteriales. Sequências pertencentes à ordem Pseudomonadales

foram também identificadas nesta fase, representando a ordem mais identificada.

Pseudomonadales, Xanthomonadales e Rhizobiales foram as ordens mais representadas no

cátodo na fase de menor produção de energia.

O reator 1 caracterizou-se por uma grande abundância de β-Proteobacterias,

principalmente espécies da ordem Burkholderiales, que foram encontradas em todos

compartimentos nas duas fases de produção de bioelectricidade. Só no compartimento

41

catódico para a fase de maior produção de bioelectricidade (R1C_B1), as sequências

pertencentes à ordem Burkholderiales representaram cerca de 73% dos 126 clones obtidos,

representando apenas 1% dos clones obtidos no compartimento anódico na fase de maior

produção de bioelectricidade (R1A_B1) e 3% e 11%, respetivamente, dos clones obtidos para

o cátodo (R1C_B2) e para o ânodo (R1A_B2) na fase de menor produção de bioelectricidade.

Espécies dos géneros Diaphorobacter e Acidovorax da família Comamonadaceae (ordem

Burkholderiales) foram já identificadas em MFCs enriquecidas com resíduos domésticos

(Lefebvre et al., 2010). Acidovorax poderá estar relacionada com a produção de energia em

MFCs (Sun et al, 2012).

Os membros da família Rhodocyclaceae, pertencentes à ordem das Rhodocyclale, são

também bactérias gram-negativas pertencentes às β-Proteobacterias. Estas só não foram

identificadas no cátodo para a fase de menor produção de energia (R1C_B2). Rhodocyclaceae

representa cerca de 9% dos clones obtidos no cátodo na fase de maior produção de

bioelectricidade (R1C_B1), 30% dos clones obtidos no ânodo na fase de maior produção de

bioelectricidade (R1A_B1) e 78% dos clones obtidos no ânodo na fase de menor produção de

bioelectricidade (R1A_B2). Alguns membros desta família são redutoras de sulfato e clorato,

redutoras de ferro e caracterizam-se pela sua alta tolerância ao oxigénio (Quan et al., 2012).

Pseudomonas é um dos géneros mais representado no reator 1 e tem sido muito

utilizado para abastecer os ânodos das MFCs de forma a otimizar a produção de

bioelectricidade (Yong et al, 2011). Em 2004, Rabaey et al. a partir de uma cultura pura de

Pseudomonas avaliou o potencial eletroquímico de espécies anaeróbias facultativas fazerem a

transferência eletrónica diretamente no ânodo. No presente trabalho 24% dos clones obtidos

no cátodo na fase de maior produção de bioelectricidade (R1C_B1) pertencia ao género

Pseudomonas, representado 60% dos clones obtidos no ânodo na fase de maior produção de

bioelectricidade (R1A_B1) e 50% dos clones obtidos no cátodo na fase de menor produção de

bioelectricidade (R1C_B2). Pseudomonas e Burkholderia são géneros aeróbios podendo

utilizar O2 ou outro aceitador final e, utilizando tanto o oxigénio como o elétrodo do ânodo como

aceitadores de eletrões o que poderá justificar a elevada abundância nos dois compartimentos

do reator.

Outras ordens pertencentes ao filo das Proteobacterias foram identificadas no reator 1.

Várias espécies de Enterobacteriales foram identificadas no cátodo para a fase de maior

produção de energia (R1C_B1). Por exemplo, Serratia é um género que compreende espécies

anaeróbias facultativas, caracterizadas como electroquimicamente ativas pela produção de

bioelectricidade mesmo em culturas puras (Ghanapriya et al., 2010). Shigella boydii foi outro

organismo da ordem das Enterobacteriales identificado no cátodo para a fase de maior

produção (R1C_B1), no entanto, ainda não há informações do seu papel na produção de

bioeletricidade. Dos 126 clones obtidos no cátodo para a fase maior produção de

bioelectricidade (R1C_B1), cerca de 32% corresponderam a sequências homólogas às de

Enterobacteriales.

42

Bacterioidetes é um filo que também está bem representado no reator 1. Foram

identificados vários organismos pertencentes às ordens das Flavobacteriales

(Chryseobacterium) e Cytophagales (Leadbetterella byssophila). Organismos pertencentes ao

filo Bacteroitedes são dos mais importantes no cátodo (Rabaey et al., 2008) e a par das

Proteobacterias são fundamentais para a redução de oxigénio e nitrato no cátodo (Timmers et

al., 2012). Estas representaram cerca de 2% e 6% para o cátodo e ânodo, respectivamente, na

fase de maior produção de bioelectricidade.

No ânodo na fase de maior produção de bioelectricidade (R1A_B1) foi ainda

identificada uma sequência homóloga a Magnetospira, pertencente às Rhodospirillales que são

bactérias fotosintéticas pertencentes às α-Proteobacterias no entanto a sua importância é

desconhecida.

A ordem Rhizobiales foi também bem representada por várias espécies em todos

compartimentos com a exceção do ânodo na fase de menor produção de bioelectricidade.

Rhizobiales representou cerca de 9% de clones obtidos para o cátodo na fase de maior

produção de bioelectricidade (R1C_B1) tendo esta percentagem duplicado (18%) na fase de

menor produção de bioelectricidade (R1C_B2). No ânodo e fase de maior produção de energia

(R1A_B1) foi apenas obtido um clone que correspondia à ordem das Rhizobiales. As espécies

do género Rhizobiales são reconhecidas como aeróbias electroquimicamente ativas (Wang et

al., 2013). As espécies de Rhizobiales obtidas foram Nitrobacter, Mesorhizorbium e

Methylobacterium organo.

Relativamente a Archaea, obtiveram-se organismos deste domínio para o ânodo na

maior fase de produção de bioelectricidade (R1A_A1) e para o cátodo na fase de menor

produção de energia (R1A_A2). No primeiro caso, obtiveram-se duas espécies de

Methanomicrobiales, Methanosphaerula palustris e Methanolinea, e uma pertencente à ordem

das Methanosarcinales, Methanosaeta concilii. Estas são anaeróbias metanogénicas e são

caracterizadas pelo consumo de acetato e produção de metano. No cátodo, para a fase de

menor produção de energia (R1C_A2), identificou-se também Methanosaeta concilii,

Methanolinea mas também Methanosaeta, que faz parte das Archaea da ordem das

Methanosarcinales. Apesar de raramente serem estudadas Archaea em MFCs, é muito comum

encontrá-las, sobretudo espécies metanogénicas (Shehab et al., 2013). Também é comum

encontrá-las em ânodos onde utilizam eletrões para reduzir dióxido de carbono a metano

(Logan, 2012). No cátodo, a existência de Archaea é muito reduzida devido à exposição ao O2

a que este está sujeito e à competição pelo substrato orgânico pelos organismos anaeróbios

facultativos (Park, et al., 2014).

Resumidamente obteve-se uma grande diversidade bacteriana principalmente de

Proteobacterias. Foram identificadas ainda algumas Bacteroidetes no cátodo para a fase de

maior produção de energia (R1C_B1). Em relação às archaeas, foram apenas obtidas

archaeas metanogénicas.

43

3.5.2. Reator 2

No compartimento anódico do reator 2 foram obtidos 96 clones de bactérias e 119

clones de Archaea para a fase de maior produção de bioelectricidade. Na fase de menor

produção de bioelectricidade obtiveram-se 41 clones de bactérias no ânodo (R2A_B2). Por

outro lado, no compartimento catódico foram obtidos 120 clones de bactérias para a fase de

maior produção de bioelectricidade e 135 clones de bactérias para a fase de menor produção

de energia.

Os organismos cuja abundância relativa era mais elevada no ânodo na fase de maior

produção de energia pertenciam, tal como no caso do reator 1, à ordem Pseudomonadales. A

ordem Rhodocyclales representou também uma percentagem elevada. Já na fase de menor

produção de energia, os microrganismos da ordem Pseudomonadales não foram detetados,

tendo-se verificado um aumento bastante significativo na abundância relativa de

Burkholderiales, Rhodocyclales e Desulfuromonadales. Estes resultados sugerem que os

microrganismos da ordem Pseudomonadales serão os organismos que contribuem

significativamente para a produção de bioelectricidade no ânodo. Relativamente ao cátodo

(Figura 15) é possível verificar uma grande abundância de organismos pertencentes às ordens

Burkholderiales e Xanthomonadales na fase de maior produção de bioelectricidade. Na fase de

menor produção de bioeletricidade detetou-se uma grande diversidade de organismos,

praticamente de todas as ordens, sendo as pertencentes à ordem Xanthomonadales as mais

representadas.

Em geral, no reator 2 existia uma grande diversidade de organismos dos filos

Proteobacteria, Firmicutes e Bacteroidetes. Na fase de maior produção de bioelectricidade,

identificou-se para o ânodo uma grande abundância de Pseudomonas que, como já referido, é

das espécies mais utilizadas para aumentar a performance energética de uma MFC. De facto,

estas representaram cerca de 78% dos 96 clones obtidos. Rabaey et al. (2004) referiu que

apesar das condições redox a que os organismos aeróbios, como Pseudomonas, estão

sujeitos, estas tendem a ser os organismos dominantes. Em menor quantidade (14% dos

clones obtidos para esta fase), foram obtidas espécies de Azospira da ordem Rhodocyclacles,

já identificadas em MFCs (Michaelidou et al., 2011). Nesta fase foram ainda identificadas as

espécies Kaisella Koreensis (Flavobacteriales), correspondendo a cerca de 3%, e

Brevundimonas (Caulobacterales), correspondendo a apenas 1% dos clones obtidos.

Foram ainda obtidas no compartimento anódico para as duas fases de produção de

bioeletricidade, sequências para o rRNA 16S semelhantes às das espécies do género

Geobacter, cerca de 3% na fase de maior produção e cerca de 13% na fase de menor

produção. Pertencentes à ordem Desulfuromodales, as espécies do género Geobacter são

consideradas de elevada eficiência na transferência eletrónica para o elétrodo, capazes de

transferir a maioria dos eletrões obtidos a partir do consumo de acetato diretamente para o

elétrodo (Bond e Lovley, 2003).

44

Na fase de menor produção de bioeletricidade, a espécie Propioniovibrio militaris,

pertencente à ordem das Rhodocyclacles, foi a mais abundante no ânodo, representando 56%

do total de clones. No entanto, não foi possível encontrar na literatura nenhuma referência à

espécie e o seu papel em MFCs. Esta espécie é anaeróbia facultativa, não fermentativa e tem

a habilidade de degradar perclorato (Thrash et al., 2009). Desta forma, poderá eventualmente

desempenhar um papel muito importante em MFCs para o tratamento de águas residuais

contaminadas com perclorato, que é um contaminante muito comum em fertilizantes e na água

potável, sendo tóxico para os seres humanos (Butler et al, 2010).

Várias sequências de rRNA 16S semelhantes às dos organismos da ordem

Burkholderiales foram obtidas no ânodo na fase de menor produção (R2A_B2), em particular

com elevada homologia com as das espécies Ottowia, Pelomonas e Cupriavidus. Estas

representaram 25% dos 41 clones obtidos.

Foi ainda obtida uma sequência com homologia com um organismo da família

Veillonellaceae, pertencente à ordem Selenomodales do filo Firmicutes. As bactérias do filo

Firmicutes, gram-positivas, são capazes de fazer a transferência eletrónica diretamente no

ânodo e desempenham um papel importante na geração de bioeletricidade em MFCs

alimentadas a acetato (Wrighton et al, 2008).

Relativamente ao cátodo, na fase de maior produção de energia (R2C_B1) apenas

foram identificados organismos pertencentes ao filo Proteobacteria, sendo 60% pertencentes à

ordem das Burkholderiales. Dos 120 dos clones obtidos, 29% corresponderam a sequências da

ordem Xanthomonadales, representada por Dokdonellas e por Rhodanobacter, géneros que

têm sido encontrados em vários reatores anaeróbios (Quan et al., 2012). Foram ainda

encontradas sequências com homologia para as classes Rhodocyclales (6% dos clones) e

Rhizobiales (5%).

Para a fase de menor produção de bioeletricidade do cátodo (R1C_B2) obteve-se a

mais elevada biodiversidade. Foram encontradas espécies dos filos Proteobacteria, Firmicutes,

Bacteroidetes, Chloroflexi e ainda Acidobacteria. As sequências homólogas ao género

Stenotrophomonas, pertencentes à ordem Xhantomonadales foram as mais abundantes

representando cerca de 28% do total.

Aminobacter sp., Nitrobacter sp., Devosia ginsengisoli e Ochrobactrum sp. foram as

espécies pertencentes à ordem Rhizobiales com maior homologia com as sequências

identificadas (cerca de 13%). Aminobacter tem sido reconhecida em MFCs pelo seu poder

degradativo do ácido nitrilotriacético, um agente quelante industrial muito comum que está a

causar grandes preocupações ambientais (Jang et al, 2006). A presença de Nitrobacter nas

MFCs é também muito importante, uma vez que os membros deste género desempenham um

papel muito importante no processo de nitrificação (Bock e Koops, 1992). A espécie

Ochrobactrum tem sido também identificada em comunidades microbianas do ânodo de MFCs

alimentadas a acetato ou glucose e têm revelado um grande potencial para a produção de

bioelectricidade (Zuo et al., 2008). Tal como outras Rhizobiales, que são α-Proteobacterias,

estas têm a capacidade de fazer a desnitrificação quando sujeitas a condições anaeróbias.

45

Por outro lado, relativamente à ordem Nitrosomonadales, 13% dos clones possuíam

sequências homólogas à espécie Nitrosomonas que é uma proteobactéria nitrificante e que

oxida amónia em nitrito. A presença destas espécies em MFCs é muito útil para o tratamento

de resíduos industriais ou águas residuais e no processo de biorremediação (Kim et al., 2008).

Enterobacteriales foram também identificadas no cátodo com uma abundância relativa

de 13%, como é o caso de Citrobacter freundii. As espécies de Citrobacter, são bactérias

anaeróbias facultativas que conseguem crescer a partir de uma variedade de aceitadores de

eletrões, como o Fe (III), na ausência de oxigénio (George, 2005). Têm sido muito estudadas

nos últimos anos graças à sua capacidade de remoção de metais pesados, redução de

sulfatos, degradação de fenol e degradação de clorofenol (Xu e Liu, 2011). Por estas razões, a

incorporação de Citrobacter em MFCs para o tratamento de águas residuais pode ser bastante

benéfica.

Do filo Proteobacteria foram ainda identificadas Acidovorax e Propiniovibrio militaris,

pertencentes às ordens Burkholderiales (6%) e Rhodocyclacles (3%), respectivamente.

Do filo Firmicutes, foi apenas obtido um clone correspondente a Virgibacillus,

pertencente à ordem Bacillales. Apesar de não haver informações acerca do potencial

electroquímico de Virgibacillus, outras espécies da ordem Bacillales têm sido incluídos em

MFCs com o objectivo de aumentar a sua performance energética (Zhang et al., 2012).

Do filo Bacteroidetes foram identificadas da ordem Flavobacteria as espécies Fluviicola

taffensis e Wandonia haliotis, das quais não há informação de terem sido identificadas em

MFCs nem do seu potencial electroquímico. Do total de clones obtidos, as Flavobacterias

representaram cerca de 9% dos clones. Por outro lado, cerca de 6% correspondeu à ordem

Sphingobacteriales, onde se identificaram sequências homólogas às do género Terrimonas.

Estas são bactérias acidogénicas fermentativas que utilizam vários açúcares e aminas para

produzir ácidos orgânicos que por sua vez são metabolizados pelas bactérias

bioelectroquimicamente ativas para a produção de bioelectricidade (Lu, et al., 2012).

Por fim, obtiveram-se ainda duas sequências com homologia para as espécies não

identificadas dos filos Chloroflexi e Acidobacteria. As Chloroflexi são bactérias verdes não

sulfurosas que obtém energia mediante fotossíntese e as Acidobacteria são bactérias

acidofílicas mas o seu metabolismo ainda não é ainda bem compreendido. São dois filos que

frequentemente têm sido descritos em MFCs mas cuja importância é ainda desconhecida.

Relativamente ao domínio Archaea, apenas foram obtidas sequências homólogas no

ânodo na fase de maior produção de bioelectricidade (R2A_A1). A maioria das espécies

obtidas era do género Methanolinea, pertencentes à ordem Methanomicrobiales com uma

abundancia relativa de 82% (Figura 16). Cerca de 9% dos clones obtidos correspondiam a

algumas espécies da ordem Methanobacteriales como Methanobrevibacter arboriphilus,

Methanobrevibacter smithii e Methanobrevibacter acididurans. Da ordem

Methanomassiliicoccus foi identificada uma espécie denominada por Methanomassiliicoccus

luminyensis. Esta espécie representou cerca de 3% do total de 119 clones obtidos. Todos

estes organismos são metanogénicos, pertencentes ao filo das Euryarchaeotas, caracterizadas

46

pela produção de metano no reator. Por fim, obteve-se uma sequência com homologia com

Candidatus Nitrososphaera gargensis que faz parte do conjunto das Nitrososphaerales do filo

Thaumarchaeota. Organismos deste filo são quimiolitotróficos, oxidam amónia e desempenham

um papel muito importante nos ciclos do azoto e do carbono. O papel das Archaeas em

sistemas MFCs ainda não foi estudado com rigor, no entanto, estão frequentemente presentes

sobretudo archaeas metanogénicas.

Em suma, no ânodo as sequências obtidas mais abundantes apresentaram homologia

com as espécies de Burkholderiales, Rhodocyclacles, Desulfuromodales e Pseudomonadales.

No entanto, para a fase de menor produção de energia as sequências com homologia com

Pseudomodales estão ausentes, o que pode explicar a queda na produção de bioelectricidade

pois, como é conhecido, estas são das espécies mais utilizadas para abastecer as MFCs de

forma a melhorar a produção de bioelectricidade (Pham et al., 2007). No cátodo, apesar da

grande diversidade na fase de menor produção de energia, Burkholderiales e

Xanthomonadales têm uma menor abundância do que tinham na fase de maior produção. As

archaeas apenas foram identificadas no ânodo para a fase de maior produção energética e

eram praticamente todas metanogénicas.

47

4. Conclusões

Neste trabalho, foram analisadas amostras provenientes de dois reatores MFC que

diferiam no facto de um deles possuir um cátodo abiótico e outro um biocátodo. Ambos foram

abastecidos com águas residuais para a produção de bioelectricidade. O objetivo principal foi

caracterizar as comunidades bacterianas combinando metodologias de biologia molecular

(extração de DNA, clonagem e sequenciação) com a análise dos perfis de restrição obtidos

após a hidrólise do DNA pela Hae III seguida da comparação das sequências obtidas com

sequências depositadas em bases de dados. Este tipo de metodologia pode ser adotado para

caracterizar outras comunidades microbianas de qualquer outra natureza.

A diversidade microbiana foi determinada para os dois reatores e houve claramente

uma grande diferença na composição das populações o que sugere que a composição das

comunidades bacterianas em MFCs é muito imprevisível. O método adotado neste trabalho

para a caracterização microbiana (Ramos et al., 2010) demostrou ser eficaz e obteve-se um

número considerável de sequências distintas. Além disso, foi possível obter uma redução de

85% do número de clones a sequenciar para a caracterização microbiana nos dois reatores.

Este tipo de metodologias está sempre sujeito a algum tipo de erros, nomeadamente

durante as reações de PCR ou na distinção dos perfis de restrição. A utilização de mais do que

uma enzima de restrição deve ser considerada, de forma a discriminar clones com perfis de

restrição semelhantes. Por outro lado, é uma técnica que apresenta bastantes vantagens,

como a minimização do número de sequenciações e por ser facilmente reprodutível para outras

caracterizações de populações microbianas.

Dos 960 clones obtidos, identificaram-se 142 perfis diferentes o que resultou na

identificação de 58 espécies diferentes entre bactérias e archaeas. Burkholderiales,

Pseudomonadales, Rhodocyclales e Xanthomonadales, foram as ordens mais abundantes

entre os reatores, todas pertencentes ao filo das Proteobacterias. De entre as Burkholderiales

identificaram-se 8 espécies diferentes, sendo Piscinibacter a mais abundante; das

Pseudomonadales identificaram-se apenas Pseudomonas aeruginosa; das Rhodocyclales

identificaram-se 4 espécies diferentes, sendo Rhodocyclaceae a mais abundante e finalmente

da ordem das Xanthomonadales, onde se identificaram 3 espécies diferentes, a espécie que foi

mais vezes identificada foi a Rhodanobacter. O género Methanolinea, pertencente à ordem das

Methanomicrobiales e ao filo das Euryarchaeota (Archaea) foi o mais representado neste

trabalho.

Existe uma série de fatores que podem influenciar a comunidade bacteriana, como por

exemplo a natureza e composição dos substratos, condições de operacionalidade do reator, o

meio e o tipo de material usado nos elétrodos. Não foi possível estabelecer uma relação entre

a diversidade microbiana com os reatores, nem nas diferentes fases de produção de

bioelectricidade. Como era esperado, a maior parte das espécies identificadas no ânodo eram

facultativas ou anaeróbias. Foram identificadas várias espécies, a maioria já reconhecida como

48

electroquimicamente ativa e outras que desempenham um papel muito relevante no tratamento

de águas residuais. As espécies identificadas e que ainda não foram analisadas no contexto

das MFCs, como era o caso da espécie Propioniovibrio militaris, merecem um estudo mais

aprofundado de forma a compreender o seu papel na comunidade da MFC.

A grande diversidade de espécies que se identificaram neste trabalho, incluindo de

vários filos reflete, por um lado a natureza do inóculo usado (lamas de uma estação de

tratamento de águas residuais), sugerindo que o meio das MFCs passa por um processo de

“auto-optimização” para um melhor desempenho funcional do sistema. Este processo deve

fazer uma seleção das espécies, consoante as interações entre si, quantidade e tipo de

substratos disponíveis, etc. Numa perspetiva a longo prazo, é importante conhecer este tipo de

processos, que demostra a utilidade de sistemas MFCs para o enriquecimento de populações

funcionalmente estáveis, capazes de degradar os compostos orgânicos e ao mesmo tempo

fazerem a transferência de eletrões extracelularmente.

Apesar de não haver comunidades microbianas em MFCs idênticas, estes resultados

contribuem com conhecimentos significativos para a aplicação prática de sistemas MFC em

sistemas de tratamento de águas residuais. O sucesso de uma MFC para o tratamento de

águas residuais depende da concentração e da degradabilidade da matéria orgânica,

temperatura e ausência de substâncias tóxicas entre outras (Logan, 2006).

Embora as MFCs altamente eficazes e em grande escala ainda estejam fora do nosso

alcance, esta é uma tecnologia promissora no qual investigadores e engenheiros estão a

esforçar-se para ultrapassar os vários obstáculos ainda subjacentes. A pressão crescente

sobre o meio ambiente e energias renováveis irão certamente contribuir para o

desenvolvimento desta tecnologia.

49

5. Perspectivas futuras

O estudo da diversidade microbiana e a sua função nas MFCs é um passo muito

importante na compreensão da composição dos biofilmes e na produção de bioelectricidade.

Desta forma, deve ser feito um incentivo a um estudo mais aprofundado de forma a identificar

as espécies que potenciam uma maior produção de bioelectricidade. Um ponto importante é o

estudo da interação (ou competição) entre as diferentes espécies de bactérias e archaeas que

compõe o ânodo. As archaeas também devem ser estudadas com mais rigor de forma a

compreender melhor a sua contribuição nas MFCs.

Para que no futuro as MFCs sejam aplicáveis à larga escala, tem de haver um esforço

no sentido de melhorar o modelo e as condições de operacionalidade das MFCs para que o

custo/eficiência à larga-escala seja compensatório. Eficiência e custo de materiais, arquitetura

física e limitações químicas como a condutividade da solução e o pH, são alguns exemplos de

limitações que as MFCs apresentam (Logan, 2009).

Um maior conhecimento ao nível da transferência eletrónica para a superfície dos

elétrodos seria muito importante de forma a melhorar essa transferência por parte das

bactérias electroquimicamente ativas. Também o potencial das bactérias electroquimicamente

ativas poderia ser potenciado por modificações genéticas sugerido por Arora (2012):

(i) Mutações genéticas nos organismos de forma a formarem pilis mais condutivos

(Yoon et al., 2002);

(ii) Mutações genéticas que melhorem a capacidade dos organismos na formação de

biofilmes;

(iii) Restringir a respiração anaeróbia pelas bactérias desnitrificantes para que os

eletrões fluam apenas para o elétrodo do ânodo e não para outros aceitadores de

eletrões como nitrato ou sulfato em solução;

(iv) Controlar a divisão celular;

(v) Aumentar a habilidade de certos organismos gerarem mediadores.

No futuro, será importante um conhecimento do metagenoma e do transcriptoma dos

biofilmes dos elétrodos, de forma a descrever a expressão genética associada ao seu

metabolismo central e à transferência eletrónica durante a degradação de substratos orgânicos

complexos. A expressão genética vai também elucidar as vias metabólicas e a transdução de

energia em comunidades bacterianas complexas (Ishii et al, 2012).

Para além do tratamento de águas residuais e da produção de bioelectricidade, as

MFCs podem no futuro, ser aplicadas para outros fins. Com a colocação de um elétrodo

anódico em sedimentos marinhos e o elétrodo catódico em água, vai ser possível gerar

bioelectricidade da decomposição bacteriana da matéria orgânica presente nos sedimentos.

Também a energia que atualmente é gerada pelas MFCs, apesar de ser insuficiente para ser

considerada uma fonte de energia renovável praticável, pode ser suficiente para alimentar

50

pequenos dispositivos em locais remotos. As MFCs podem também ser modificadas para

serem usadas como processo de bioremediação ou ainda para a remoção de nitrato

(conversão para nitrito) da água (Logan, 2008)

51

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63

Anexo I

Figura 18: Árvore filogenética correspondente às espécies de bactérias identificadas no compartimento anódico na

fase de maior produção de energia (R1A_B1).

Figura 19: Árvore filogenética correspondente às espécies de bactérias identificadas no compartimento anódico na

fase de menor produção de energia (R1C_B2).

R1A 69

Pseudoxanthobacter

Acinetobacter baylyi

Proteobacterium symbiont of Nilaparva...

R1A 12

Rhodocyclaceae bacterium

Diaphorobacter

Chryseobacterium

Flavobacteriaceae bacterium

R1A 28

R1A 75

R1A 85

R1A 65

R1A 9

0.2

64

Figura 20: Árvore filogenética correspondente às espécies de archaeas identificadas no compartimento anódico na

fase de maior produção de energia (R1A_A1).

A53

A54

A20

A16

Methanolinea sp.

A33

Methanolinea sp.(2)

Methanosphaerula palustris

A12

A17

Methanosaeta concilii

A9

A147

A35

0.02

65

Figura 21: Árvore filogenética correspondente às espécies de bactérias com maior identidade para com as

sequências de RNA 16S obtidas por PCR a partir do DNA total extraído do compartimento catódico do reator 1 na

fase de maior produção de energia (R1C_B1).

R1C 36

R1C 40

R1C 19

R1C 14

R1C 126

R1C 6

R1C 98

Burkholderia

Burkholderia metallica

R1C 57

Rhodocyclaceae bacterium

R1C 22

Acidovorax citrulli

R1C 18

R1C 45

R1C 32

Stenotrophomonas

Pseudomonas 1

Pseudomonas geniculata

Pseudomonas 2

Carbophilus carboxidus

Methylotrophic proteobacterium

Aminobacter

R1C 60

R1C 20

R1C 73

R1C 64

Shigella boydii

Escherichia coli

R1C 104

Serratia

Pseudomonas

R1C 31

R1C 17

Leadbetterella byssophila

0.02

66

Figura 22: Árvore filogenética correspondente às espécies de bactérias com maior identidade para com as

sequências de RNA 16S obtidas por PCR a partir do DNA total extraído no compartimento catódico do reator 1 na

fase de menor produção de energia (R1C_B2).

67

Figura 23: Árvore filogenética correspondente às espécies bacterianas mais próximas das sequências obtidas por

PCR após extração de DNA total do compartimento anódico do reator 2 na fase de maior produção de energia

(R2A_B1).

R2A 31B

R2A 48B

Pseudomonas sp. G1-10

R2A 21B

Pseudomonas sp. X-b2

R2A 1B

Pseudomonas sp. UA-JF2901

R2A 15B

R2A 23B

R2A 22B

Geobacter sulfurreducens

R2A 25B

Brevundimonas sp.

R2A 45B

Rhodocyclaceae sp.

Azospira sp.

Dechlorosoma suillum

R2A 32B

R2A 34B

R2A 12B

Diaphorobacter sp.

R2A 24B

Chryseobacterium koreense

Kaistella koreensis

R2A 62B

0.05

68

Figura 24: Árvore filogenética correspondente às espécies de Archaea cujas sequências de rRNA 16S são mais

próximas das sequências obtidas por PCR após extração de DNA total do compartimento anódico do reator 2 na

fase de maior produção de energia (R2A_A1).

R2A 31A

R2A 71A

Methanolinea sp.

R2A 42A

Methanolinea mesophila

R2A 36A

Methanolinea tarda

R2A 15A

R2A 68A

R2A 35A

Methanomassiliicoccus luminyensis

Methanobrevibacter smithii

R2A 21A

R2A 18A

R2A 46A

R2A 48A

Methanobrevibacter acididurans

Methanobrevibacter arboriphilus

R2A 16A

R2A 17A

R2A 50A

R2A 63A

Candidatus Nitrososphaera gargensis

0.05

69

Figura 25: Árvore filogenética correspondente às espécies de bactérias cujas sequências de rRNA 16S são mais

próximas das sequências obtidas por PCR após extração de DNA total do compartimento anódico do reator 2 na

fase de menor produção de energia (R2A_B2).

R2A B2 10

Ottowia sp.

R2A B2 12

Pelomonas sp.

R2A B2 13

Cupriavidus sp.

R2A B2 29

R2A B2 26

R2A B2 8

Propionivibrio militaris

R2A B2 24

R2A B2 16

R2A B2 11

Veillonellaceae bacterium

Geobacter sp.

R2A B2 30

0.02

70

Figura 26: Árvore filogenética correspondente às espécies de bactérias mais próximas das sequências obtidas por

PCR após extração de DNA total do compartimento catódico do reator 2 na fase de maior produção de energia

(R2C_B1).

R2C 7B

R2C 5B

R2C 32B

Ultramicrobacter hongkongensis

Methyloversatilis universalis

R2C 26B

R2C 29B

Rhizobacter sp.

R2C 21B

Piscinibacter sp.

R2C 44B

R2C 28B

Dokdonella soli

R2C 33B

Rhodanobacter sp.

R2C 8B

R2C 39B

Afipia sp.

R2C 41B

Mesorhizobium sp.

Rhizobium sp.

0.02

71

Figura 27: Árvore filogenética correspondente às espécies de bactérias mais próximas das sequências obtidas por

PCR após extração de DNA total do compartimento catódico do reator 2 na fase de menor produção de energia

(R2C_B2).

R2C B2 75

Nitrobacter sp.

Bradyrhizobium sp.

R2C B2 53

Devosia ginsengisoli

Aminobacter sp.

Ochrobactrum cytisi

Virgibacillus sp.

Chloroflexi

Terrimonas sp.

R2C B2 67

R2C B2 66

Fluviicola taffensis

Wandonia haliotis

Acidobacteria bacterium

R2C B2 44

Stenotrophomonas acidaminiphila

R2C B2 59

Nitrosomonas sp.

R2C B2 74

R2C B2 77

Beta proteobacterium

Propionivibrio militaris

Aquincola sp.

R2C B2 49

R2C B2 45

Acidovorax sp.

Citrobacter freundii

Pseudomonas aeruginosa

R2C B2 55

R2C B2 48

R2C B2 57

R2C B2 8

R2C B2 40

R2C B2 83

R2C B2 47

R2C B2 117

0.2

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