Caracterização de Proteínas Alergênicas de Ricinus Communis

(mamona) Identificação de Epitopos Alergênicos

Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos

LQFPP/CBB/UENF

Alérgenos de MamonaAlérgenos de Mamona Podem ser encontrados no Pólen e nas sementesPodem ser encontrados no Pólen e nas sementes As plantas apresentam um período de floração longo; logo os alérgenos As plantas apresentam um período de floração longo; logo os alérgenos

podem estar espalhados no ar por diversas épocas do anopodem estar espalhados no ar por diversas épocas do ano Cultivo não controlado (dificilmente o plantio ficaria restrito a uma uma Cultivo não controlado (dificilmente o plantio ficaria restrito a uma uma

pequena área)pequena área) CB-1A ou Albuminas 2S CB-1A ou Albuminas 2S Proteínas de massa molecular ~12 kDaProteínas de massa molecular ~12 kDa pI ~ 4,0 a 9,5pI ~ 4,0 a 9,5

Hipersensibilidade imediata ou anafiláticaHipersensibilidade imediata ou anafilática A reação pode envolver a pele (urticária e eczema), olhos A reação pode envolver a pele (urticária e eczema), olhos

(conjuntivite), alergia respiratória, edema de glote(conjuntivite), alergia respiratória, edema de glote A reação alérgica pode causar vários sintomas de menor A reação alérgica pode causar vários sintomas de menor

inconveniência até a morteinconveniência até a morte A reação normalmente ocorre 15 - 30 minutes após a A reação normalmente ocorre 15 - 30 minutes após a

exposição ao antígeno, podendo ocorrer até 10 - 12 horas exposição ao antígeno, podendo ocorrer até 10 - 12 horas após.após.

Alergia provocada por Alergia provocada por mamona – Hipersensibilidade mamona – Hipersensibilidade

do Tipo Ido Tipo I

Monitoramento do estado de saúde Monitoramento do estado de saúde (presença de IgE anti albuminas 2S) dos (presença de IgE anti albuminas 2S) dos trabalhadores rurais e das populações trabalhadores rurais e das populações

vizinhas às áreas de plantio e vizinhas às áreas de plantio e manipulação da tortamanipulação da torta

Brasil “ Causos” ??????Brasil “ Causos” ?????? Artigos Científicos abordando alérgenos de mamona- 25 Artigos Científicos abordando alérgenos de mamona- 25

artigos nos últimos 50 anos (Web of science, maio 2005). artigos nos últimos 50 anos (Web of science, maio 2005). Marcelle, França - Thorpe e col., 1988Marcelle, França - Thorpe e col., 1988 Índia - 9 a 43% - diferenças devido ao critério de escolha Índia - 9 a 43% - diferenças devido ao critério de escolha

dos pacientes e tipo de teste realizado Singh dos pacientes e tipo de teste realizado Singh et alet al. , 1989 . , 1989 Em Málaga, Espanha - Em Málaga, Espanha - 7.7% pacientes mostraram “prick

test” positivo para alérgenos de mamona (pacientes com rinite, outros com rinite e asma e outros só com asma). García-González e col, 1999García-González e col, 1999

Alérgenos de Alérgenos de Ricinus Ricinus communiscommunis

Conjunto de alérgenos - CB1-A-Conjunto de alérgenos - CB1-A- Spies & Coulson, 1943 Spies & Coulson, 1943 Albuminas 2S - Youle e Yang, 1978 - Youle e Yang, 1978 Ric c 1 Li e colaboradores,1977 eLi e colaboradores,1977 e Sharief & Li, 1982Sharief & Li, 1982 RC-13 Trugo e col., 1984Trugo e col., 1984 albumina 2S - Ric c 2 - cristalóide 11S Thorpe e col., Thorpe e col.,

19881988 Antígeno 5.1Antígeno 5.1 - Costa- Silva e col.,1991 - Costa- Silva e col.,1991 Ric c 3 - Machado e Silva Jr, 1992 e Silva júnior et al, Machado e Silva Jr, 1992 e Silva júnior et al,

19961996 Ric c 3 i Marcondes, J A, 1997Marcondes, J A, 1997

Processamento do Precursor Processamento do Precursor das Albuminas 2S das Albuminas 2S

Massa Molecular das Isoformas Massa Molecular das Isoformas de Albuminas 2Sde Albuminas 2S

Por SDS-PAGE 12.000 e Por SDS-PAGE 12.000 e Pela composição em AA Pela composição em AA 11.23511.235

SDS-PAGE SDS

14

29

66

kDa

Separação das isoformas de Separação das isoformas de albuminas 2Salbuminas 2S

PAGE-disc das frações de albumina 2S obtidas por PAGE-preparativa

Grupos de isoformas de albuminas 2S Grupos de isoformas de albuminas 2S de mamonade mamona

 Fraction

 R (relative

mobility under native PAGE) 

 Retention Time - C4-RP (min)

 Partial N-terminal Sequence

II 0,68 many fractions

N.D. (fraction not purified)

III 0,520,540,56

109

15

- DSKEEREGQQ-

IV 0,52 10 ESKGEREGSSSQQCR

V 0,40 10 and 12 ESKGEREGQQQQQCR

VI 0,39 10 GEREGSSSQQCR

VII 0,27 10 and 22 1SKEESEGGQQXQQQQERQSQ17

18GEREGSSSQQCRQEVQRK35

VIII 0,26 15 N.D. (probably blocked)

IX 0.14 0,26

515

N.D. (fraction not purified) 

X 0,14 5 PSSQQGCRGQIQEQQNLR

Machado e col. Machado e col. 20032003

A hipersensibilidade imediata é mediada porA hipersensibilidade imediata é mediada por IgE IgE. . Os componentes celulares principais na hipersensibilidade são Os componentes celulares principais na hipersensibilidade são

os mastócitos ou os basófilos.os mastócitos ou os basófilos.

Indução e Mecanismos efetores de Hipersensibilidade do Tipo I

Epitopos: contínuo e Epitopos: contínuo e descontínuodescontínuo

Anticorpo A

Epitopo descontínuo

Epitopo contínuo

Anticorpo B

Verificação da presença de Epitos lineares

Separação das cadeias de Albuminas 2s de Ric c1 e de Ric C-3

Cromatografia de fase reversa C18 – HPLC : A- Separação das cadeias de Ric c 1 eB - Separação das cadeias de Ric c 3

A B

A B

C D

Mastócitos desgranulados

Mastócitos íntegros.

Verificação da alergenicidade por Verificação da alergenicidade por desgranulação de mastócitosdesgranulação de mastócitos

Análise de frações que Análise de frações que desgranulam mastócitosdesgranulam mastócitos

FraçãoFração % % desgranulaçãodesgranulação

FraçãoFração % % desgranulaçdesgranulaç

ãoão

AlbuminasAlbuminas 7474 Ric c 1 Ric c 1 Cadeia leveCadeia leve

7777

Ric c 1 cadeia Ric c 1 cadeia pesadapesada

6767

Ric c 1Ric c 1 7777 Ric c 3 Ric c 3 Cadeia leveCadeia leve

7373

Ric c 3Ric c 3 8080 Ric c 3 cadeia Ric c 3 cadeia pesadapesada

6868

2S albumin Precursor2S albumin Precursor

Ric c 3

cadeia leve resíduos 18 a 50

Cadeia pesada resíduos 66 a 131

Ric c 1

cadeia leve resíduos 136 a 169

Cadeia pesada resíduos 173 a 237

Peptideos sintéticos % de Peptideos sintéticos % de desgranulaçãodesgranulação

P1P1 - Resíduos 1 a 15 - Resíduos 1 a 15

Ric c 3 leveRic c 3 leve6868

P2 - P2 - Resíduos 16 a 31.Resíduos 16 a 31.

Ric c 3 leveRic c 3 leve7070

P5 - P5 - Resíduos 40 Resíduos 40 a 54.a 54.

Ric c 3 pesadaRic c 3 pesada6969

P4 P4 - Resíduos 20 a 39 - Resíduos 20 a 39

Ric c 3 pesadaRic c 3 pesada6969

P3 P3 - Resíduos 11 a 24.- Resíduos 11 a 24.

Ric c 1 leveRic c 1 leve7070

P0 - Resíduos 22 a 40.

Ric c 1 pesadaRic c 1 pesada

7070

Avaliação da resposta Avaliação da resposta cruzada entre Alérgenoscruzada entre Alérgenos

Alérgenos alimentares Alérgenos alimentares Alérgenos InalantesAlérgenos Inalantes

AlimentAlimentoo

% % DesranulaçãDesranulaçã

oo

AlimentoAlimento % % DesranulaçãoDesranulação

AvesAves 38.538.5 MorangoMorango 40.7 40.7

CamarãoCamarão 53.853.8 TrigoTrigo 46.7 46.7

Carne Carne bovinabovina

31.531.5 SojaSoja 62.5 62.5

Carne Carne suínasuína

40.340.3 PimentaPimenta X X

ClaraClara 40.540.5 AbacaxiAbacaxi 36.5 36.5

TomateTomate 41.341.3 CacauCacau 46.0 46.0

GemaGema 38.038.0 CajúCajú 34.4 34.4

LeiteLeite 47.047.0 AmendoimAmendoim 51.4 51.4

PeixesPeixes 57.657.6 LaranjaLaranja 39.1 39.1

ArrozArroz 29.929.9 LimãoLimão 36.2 36.2

GlútenGlúten 43.743.7 MilhoMilho 46.0 46.0

Reações cruzadas entre substâncias alergênicas

InantesInantes % % DesranulaçDesranulaç

ãoão

InantesInantes % % DesranulaçãDesranulaçã

ooPoeira Poeira domiciliardomiciliar

51.4 51.4 Epitélio mixEpitélio mix 44.0 44.0

ÁcarosÁcaros 35.4 35.4 Penas mixPenas mix 33.8 33.8

Fungos do Fungos do arar

46.7 46.7 AlgodãoAlgodão 37.5 37.5

LãLã 41.3 41.3 CrinaCrina 40.2 40.2

GramíneaGramínea 47.1 47.1 CapimCapim 35.2 35.2

FloresFlores 44.0 44.0 LinhaLinha 41.6 41.6

TabacoTabaco 55.0 55.0 MacelaMacela 65.9 65.9

Epitélios de Epitélios de gatogato

41.0 41.0 BarataBarata 32.8 32.8

Epitélio de Epitélio de cãocão

44.3 44.3 PiretoPireto 36.3 36.3

Epitélio de Epitélio de eqüinoeqüino

34.8 34.8 SedaSeda 32.5 32.5

Epitélio Epitélio bovinobovino

44.0 44.0 TaboaTaboa 27.1 27.1

Perspectivas Recursos

FAPERJ

APQ1 E-26/170.970/2004

XEMBRAPA

MP1-Mamona-2005

Dr. José L. R. Ascheri

Identificação de Epitopos comuns em diversos alérgenos

Medida dos níveis de IgE sorológicos dirigidos contra cada componente

Seleção dos componentes “cross reactive” que possuem os principais IgE-epitopos para a terapia

-Edital CT-AGRO/MCT/CNPq nº 08/2005 \Tema 2 –

Utilização Econômica de Resíduos, Proc. No 551357/2005-3

-Determinação do perfil de IgE- dos trabalhadores que manipulam mamona

Desenvolvimento de vacinas – Hipossensibilização com peptídeos ??????

Monitoramento dos níveis de albuminas 2S em amostras diversas de pólen em diversos períodos do ano ????

02 Bolsas tecnorte

Viviane Veiga do NascimentoViviane Veiga do Nascimento Jucélia de Araújo GiuliJucélia de Araújo Giuli Alexandra Martins S. SoaresAlexandra Martins S. Soares Thiago Freitas de SouzaThiago Freitas de Souza Fábio MacielFábio Maciel Shayany Pinto FelixShayany Pinto Felix Camila Carriello GamaCamila Carriello Gama Natália de DeusNatália de Deus Hélio Hélio Rafaela MayerhofferRafaela Mayerhoffer Diego MedinaDiego Medina IgorIgor Dr. Renato A. DamattaDr. Renato A. Damatta

Obrigada !olga@uenf.br