Caracterização de rearranjos cromossômicos aparentemente ... · IV.4 Translocação...

ANA CAROLINA DOS SANTOS FONSECA

Caracterizao de rearranjos cromossmicos

aparentemente equilibrados associados a

quadros clnicos

Dissertao apresentada ao Instituto de

Biocincias da Universidade de So

Paulo, para a obteno de Ttulo de

Mestre em Cincias, na rea de

Biologia/Gentica

So Paulo

2011

Orientadora: Dra. Angela M. Vianna Morgante

FONSECA, ANA CAROLINA DOS SANTOS

Caracterizao de rearranjos cromossmicos aparentemente equilibrados

associados a quadros clnicos

Dissertao (Mestrado) - Instituto de Biocincias da Universidade de So

Paulo, Departamento de Gentica e Biologia Evolutiva

1. Rearranjos cromossmicos equilibrados 2. Alteraes cromossmicas

submicroscpicas 3. Hibridao in situ fluorescente 4. Hibridao

genmica em microarray

Universidade de So Paulo. Instituto de Biocincias. Departamento de

Gentica de Biologia Evolutiva

Comisso Julgadora

________________________________ ________________________________

Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

_________________________

Orientadora

Este trabalho foi realizado com auxlios financeiros da Fundao de Amparo Pesquisa

do Estado de So Paulo concedidos orientadora (FAPESP CEPID 1998/14254-2) e

aluna (FAPESP 2009/03480-8).

Deus

Aos meus amigos

Aos meus familiares

Agradecimentos

Agradeo:

Ao Departamento de Gentica e Biologia Evolutiva do Instituto de Biocincias da

Universidade de So Paulo, pela possibilidade de realizao deste trabalho.

Dra. Angela M. Vianna Morgante, pela orientao neste projeto, por todos os

ensinamentos, pela amizade e confiana depositada em mim.

Dra. Juliana F. Mazzeu, pelos primeiros ensinamentos, pela amizade e por toda ajuda

que me ofereceu durante esses anos.

s Dras. Ana Cristina Krepischi e Carla Rosenberg, pelos ensinamentos sobre a-CGH,

pelos auxlios e colaborao neste estudo.

Dra. Regina Clia Mingroni Netto, pelos auxlios e ajuda ao longo desses anos.

Ao Prof. Paulo Otto, pelos auxlios e ensinamentos clnicos.

s Dras. Simone Aparecida Siqueira da Fonseca e Sylvie Antonini, pela permisso da

continuidade de seus trabalhos.

Maraisa, por todo apoio, amizade e ajuda durante esses anos e pelo auxlio na edio

deste trabalho.

Aos tcnicos Ftima, Mara, Paulo e Lgia, pela ajuda e amizade.

Aos colegas do Laboratrio de Gentica Humana, Silvia, Sarita, Rafaella, Adriano,

Jos, Larissa, Jacar, Lilian, Teresa, Ana Carla, Rezinha, Karina, Daniela, Vitor e

Daniel pela ajuda, amizade e momentos de descontrao.

famlia dos pacientes, pela colaborao.

minha famlia, pelo apoio ao longo dos anos.

Aos meus amigos queridos pela compreenso, ateno e incentivo dado a todo o

momento.

Deus por ter me dado fora em todos os momentos da minha vida.

ndice

I. INTRODUO ........................................................................................................................ 2

I.1 Tcnicas de estudo cromossmico ........................................................................................... 2

I.2 Mecanismos de formao de rearranjos cromossmicos ......................................................... 5

I.3 Rearranjos cromossmicos equilibrados associados a sinais e sintomas clnicos ................... 9

Interrupo de genes pelas quebras cromossmicas .............................................................. 11

Formao de gene hbrido ...................................................................................................... 14

Efeito de posio ..................................................................................................................... 16

Dissomia uniparental .............................................................................................................. 18

Perdas e ganhos de segmentos submicroscpicos .................................................................. 19

II. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 24

III. PACIENTES E MTODOS ................................................................................................ 26

III.1 Pacientes ................................................................................................................................ 26

III.2 Mtodos ................................................................................................................................. 26

III.2.1 Estudo cromossmico ................................................................................................. 26

Preparaes cromossmicas....................................................................................... 26

Identificao dos rearranjos cromossmicos ............................................................. 27

Mapeamento dos pontos de quebra ............................................................................ 27

III.2.2 Busca de microdelees e duplicaes ...................................................................... 28

III.2.3 Padro de inativao do cromossomo X .................................................................... 30

Metilao do gene AR ............................................................................................... 30

Incorporao de 5-BrdU .......................................................................................... 31

IV. RESULTADOS E DISCUSSO .......................................................................................... 33

IV.1 Translocaes cromossmicas que provavelmente afetam a expresso do gene SOX9 ....... 33

IV.1.1 Translocao t(7;17)(p13;q24) .................................................................................. 33

Aspectos Clnicos ...................................................................................................... 33

Mapeamento dos pontos de quebra da t(7;17) por FISH .......................................... 34

Investigao de perdas e ganhos de segmentos submicroscpicos por a-CGH ...... 34

Genes mapeados no segmento dos pontos de quebra ................................................ 34

IV.1.2 Translocao t(17;20)(q24.3;q11.2) .......................................................................... 38

Aspectos Clnicos ...................................................................................................... 38

Mapeamento dos pontos de quebra da t(17;20) por FISH ........................................ 39

Investigao de perdas e ganhos de segmentos submicroscpicos por a-CGH ...... 39

Genes mapeados no segmento dos pontos de quebra ................................................ 39

IV.1.3 As translocaes t(17;20)(q24.3;q11.2) e t(7;17)(p13;q24.3) e o gene SOX9 .......... 43

O gene SOX9 no desenvolvimento ............................................................................. 43

O gene SOX9 e rearranjos cromossmicos ............................................................... 44

Identificao de elementos reguladores do gene SOX9 ............................................ 47

O espectro fenotpico PRS-ACD-CD e sua relao com a regio reguladora do

gene SOX9 .................................................................................................................

48

Busca de elementos conservados no codificadores nas unidades de regulao

de PRS, ACD e de enhancers para o desenvolvimento testicular .............................

54

Influncia, na expresso do SOX9, de sequncias de outros cromossomos

participantes de translocaes com o cromossomo 17 .............................................

58

IV.2 Translocao cromossmica associada a microdelees em cis a ponto de quebra:

t(10;21)(p13;q22) ..................................................................................................................

60

Aspectos Clnicos .................................................................................................................. 60

Mapeamento dos pontos de quebra translocao por FISH ................................................ 61

Investigao de perdas e ganhos de segmentos submicroscpicos por a-CGH ................ 63

Genes mapeados no segmento dos pontos de quebra ......................................................... 69

Genes mapeados nos segmentos das delees do cromossomo 10 ..................................... 70

Genes candidatos ................................................................................................................. 71

Mecanismo de formao da t(10;21) ................................................................................... 77

IV.3 Translocao t(X;22)(q22;q13) associada a duplicao do gene PLP1 e doena de

Pelizaeus-Merzbacher em menina ........................................................................................

80


Mapeamento dos pontos de quebra translocao por FISH ................................................ 81

Investigao de perdas e ganhos de segmentos submicroscpicos por a-CGH .................. 84

Genes mapeados nos segmentos da duplicao ................................................................... 87

Padro de inativao do cromossomo X .............................................................................. 87

Genes candidatos ................................................................................................................... 90

O gene PLP1 .......................................................................................................................... 91

a)O gene PLP1 e a doena de Pelizaeus-Merzbacher .......................................................... 91

b)Mulheres sintomticas portadoras de duplicaes que incluem o PLP1 .......................... 93

Mecanismo de formao da t(X;22) ...................................................................................... 95

IV.4 Translocao cromossmica familial associada a duplicao e delees

submicroscpicas ...................................................................................................................

99


Mapeamento dos pontos de quebra da translocao por FISH ........................................... 101

Investigao de perdas e ganhos de segmentos submicroscpicos por a-CGH e

validao por FISH ..............................................................................................................

101

Mecanismo de formao da t(2;5;22) .................................................................................. 105

A importncia da combinao de a-CGH e de FISH na caracterizao do rearranjo

cromossmico .......................................................................................................................

105

O efeito clnico do rearranjo cromossmico ......................................................................... 118

a ) A duplicao do brao longo do cromossomo 5 ........................................................ 118

b) A interrupo do gene SLC1A4 e a deleo em 2p14 ................................................. 121

c) A deleo em 5p15.1 .................................................................................................... 123

Aconselhamento Gentico ..................................................................................................... 124

IV.5 Translocao cromossmica que provavelmente afeta a expresso do gene IHH:

t(2;16)(q35;q24.1) .................................................................................................................

125

Aspectos Clnicos 125

Mapeamento dos pontos de quebra da translocao por FISH ............................................ 126

Investigao de perdas e ganhos de segmentos submicroscpicos por a-CGH ................... 126

Genes mapeados no segmento dos pontos de quebra ............................................................ 126

Genes candidatos ................................................................................................................... 128

O gene IHH ............................................................................................................................ 130

a) O gene IHH e rearranjos cromossmicos .................................................................... 130

b) Busca de elementos conservados no codificadores candidatos a serem regula-

dores do gene IHH na regio prxima ao ponto de quebra do cromossomo 2 ...........

133

V. SUMRIO E CONCLUSES ............................................................................................... 136

VI. SUMMARY AND CONCLUSIONS ................................................................................... 141

VII. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................................. 145

I. INTRODUO

2

I. INTRODUO

As anomalias cromossmicas ocorrem em cerca de seis a cada mil recm-

nascidos. As mais comuns so as aneuploidias, porm as alteraes cromossmicas

estruturais representam cerca de 40% das alteraes cromossmicas em recm-nascidos

(Jacobs e Hassold, 1986).

As alteraes cromossmicas, em sua maioria, constituem eventos espordicos

e, devido aos desequilbrios de dose, o efeito fenotpico impede sua transmisso para a

gerao seguinte. Os rearranjos estruturais, entretanto, so predominantemente

equilibrados e seus portadores geralmente no apresentam sinais ou sintomas clnicos.

Esses rearranjos equilibrados podem, assim, ser transmitidos por seus portadores que,

no entanto, possuem riscos reprodutivos aumentados; a segregao meitica dos

cromossomos participantes dos rearranjos e de seus homlogos normais pode levar

produo de gametas com o rearranjo estrutural em estado no equilibrado, resultando

em abortos espontneos ou prognie com quadros clnicos. Estudos em casais com

histrico de abortamento de repetio mostram que, em 3 a 6% daqueles que tiveram

dois ou mais abortos consecutivos, um dos membros era portador de rearranjo

equilibrado (Franssen et al., 2006).

I.1 Tcnicas de estudo cromossmico

Em 1956, Tjio e Levan mostraram que o nmero de cromossomos da espcie

humana 46. A partir desse momento foi possvel associar anomalias cromossmicas

especficas a doenas. Nos anos 70, foram desenvolvidos protocolos de colorao que

produziam um padro de bandas claras e escuras ao longo dos cromossomos

(Caspersson et al., 1970; Drets e Shaw, 1971; Dutrillaux e Lejeune, 1971), totalmente

reprodutvel, permitindo a identificao de todos os pares de cromossomos, que eram

anteriormente classificados apenas de acordo com o tamanho e a posio dos

centrmeros. Alteraes estruturais, como translocaes, inverses, delees e

duplicaes, passaram a ser identificadas com maior preciso.

Apesar dos avanos trazidos para a identificao dos cromossomos, as tcnicas

de bandamento aplicada a cromossomo metafsicos/prometafsicos permitem a

deteco de alteraes cromossmicas que afetem no mnimo 5 a 10 Mb. Mas o nvel de

resoluo pode ser menor, dependendo do padro de bandas do segmento afetado. O

3

desenvolvimento de tcnicas moleculares aplicadas citogentica trouxe maior preciso

na caracterizao dos rearranjos cromossmicos do que a que permite o bandamento.

Essas tcnicas permitem a anlise do genoma de forma global (genome-wide) ou

alvo-dirigida, com diferentes graus de resoluo (reviso em Speicher e Carter 2005;

reviso em Feuk et al., 2006; Miller et al., 2010).

A tcnica de hibridao in situ fluorescente (FISH), baseada na deteco de

sondas de DNA hibridadas a sequncias complementares em cromossomos, foi um

avano importante para os estudos citogenticos. Nesse mtodo, a sonda e o DNA alvo

na lmina so desnaturados, seguindo-se a hibridao das sequncias complementares.

Para visualizao em microscpio de fluorescncia, as sondas so ligadas diretamente a

um fluorocromo ou so marcadas com um heptano (biotina ou digoxigenina), j

conjugado a um fluorocromo ou reconhecido por um anti-heptano ligado a um

fluorocromo. As sondas de DNA podem ser clonadas a partir de um cromossomo

inteiro, no caso das bibliotecas cromossmicas ou a partir de um segmento especfico,

podendo ser sondas para sequncias nicas ou repetitivas, como as centromricas. No

estudo de rearranjos cromossmicos equilibrados, a hibridao in situ fluorescente

permite refinar a localizao de pontos de quebra e identificar microdelees ou

duplicaes nos cromossomos rearranjados.

Nas tcnicas de spectral karyotyping (SKY) e multicolor FISH (m-FISH), a

marcao especfica de cada cromossomo feita utilizando combinaes de

fluorocromos. Em um nico experimento pode-se analisar todos os cromossomos

humanos, o que particularmente vantajoso na identificao de material cromossmico

de origem desconhecida, como no caso de cromossomos marcadores supranumerrios e

rearranjos cromossmicos complexos, como aqueles que ocorrem nos cnceres.

O nvel mais alto de resoluo para anlise cromossmica baseada na tcnica de

FISH atingido quando so usadas fibras de cromatina, como alvos para a hibridao.

Nesse mtodo (fibre-FISH), as protenas e histonas so removidas da cromatina que,

assim, fica altamente distendida (Speicher e Carter, 2005). Constitui ferramenta

especialmente til para mapear sequncias em regies especficas do genoma, j que

permite medir os espaos e sobreposies entre as sondas. Assim a resoluo da tcnica

de FISH vai daquela na sua aplicao em preparaes metafsicas/prometafsicas

(resoluo de 100 kb - 5 Mb), passando pela utilizao em ncleos interfsicos (50 kb -

2 Mb) at o nvel de fibras de cromatina (1 kb - 500 kb) (Speicher e Carter 2005).

4

Nos ltimos anos, a hibridao genmica em microarrays tornou-se uma

ferramenta efetiva para a deteco de perdas e ganhos de segmentos cromossmicos

submicroscpicos (Miller et al., 2010). A resoluo do microarray determinada pelo

tamanho e pela distncia entre as sondas, em sua cobertura parcial ou total do genoma.

Na tcnica de hibridao genmica comparativa baseada em microarray de DNA (a-

CGH), o DNA controle e o DNA teste, marcados com fluorocromos diferentes,

competem pela hibridao a sondas fixadas e organizadas na superfcie de uma lmina;

perdas e ganhos de segmentos so indicadas pela diferena na intensidade da

fluorescncia dos fluorocromos. Os primeiros arrays utilizavam sondas clonadas em

BACs (cromossomos artificiais de bactrias), porm plataformas mais recentes tm

oligonucleotdeos como alvos de hibridao. Esses oligoarrays permitem maior

flexibilidade na confeco de sondas, maior cobertura genmica e resoluo superior

aos arrays de BAC.

Outro tipo de microarray tem sondas de SNP, que permitem no somente a

avaliao de desequilbrios cromossmicos, mas a genotipagem. Nessa abordagem, a

amostra de um nico paciente hibridizada ao array e alteraes no nmero de cpias

so detectadas pela comparao com hibridaes de controles realizados separadamente

(Speicher e Carter, 2005). Alm de perdas e ganhos de segmentos, os arrays de SNP

tm a vantagem de detectar perdas de heterozigose e permitir a determinao da origem

parental de rearranjos espordicos (Miller et al., 2010).

A hibridao em microarrays aumentou o poder de resoluo da anlise

cromossmica global do nvel de megabase para kilobase; consequentemente

desequilbrios cromossmicos no detectveis pelas tcnicas de bandamento passaram a

ser descritos. Por exemplo, a aplicao de a-CGH no estudo de pacientes com

deficincia mental ou malformaes congnitas mostra que desequilbrios

submicroscpicos esto presentes em 15 a 20% dos casos (Rosenberg et al., 2006;

Miller et al., 2010). Recentemente, com base em uma extensa reviso na literatura, o

International Standard Cytogenomic Array (ISCA) Consortium recomendou a aplicao

inicial do microarray no estudo de pacientes com malformaes congnitas mltiplas,

autismo, atraso de desenvolvimento ou deficincia mental de causas genticas

desconhecidas (Miller et al., 2010). O custo da tcnica seria compensado pela elevada

taxa de deteco de desequilbrios submicroscpicos (entre 15 a 20% em comparao

aos 3% detectados com o bandamento G). O estudo preconizou que o uso do

5

bandamento G deve limitar-se ao estudo de pacientes com sndromes cromossmicas

conhecidas, histrico de rearranjos cromossmico na famlia ou de abortos de repetio.

Na anlise de rearranjos cromossmicos equilibrados, a aplicao de a-CGH tem

permitido no somente detectar alteraes submicroscpicas nos pontos de quebra, mas

tambm alteraes distantes a ele inclusive em cromossomos que no participam

diretamente do rearranjo (Gribble et al., 2005; Sismani et al., 2008), essa uma vantagem

em relao tcnica alvo-especfica de FISH. Entretanto, deve-se considerar que a

hibridao genmica em array no revela, na maioria das vezes, o tipo do rearranjo

cromossmico que deu origem perda ou ao ganho de segmentos.

Uma modificao no protocolo de a-CGH permite estudar especificamente os

pontos de quebra dos rearranjos cromossmicos (Fiegler et al., 2003). A tcnica de

array painting utiliza flow sorting para isolar os cromossomos derivativos e

posteriormente esse material hibridado ao array. No caso de translocaes

equilibradas, ao marcar os cromossomos derivativos com fluorocromos diferentes,

sequncias proximais e distais ao ponto de quebra de cada cromossomo sero marcadas

com cores diferentes. Essa estratgia permite identificar os segmentos que contm os

pontos de quebra, com base na razo entre as intensidades dos sinais dos fluorocromos.

Recentemente, o sequenciamento de prxima gerao foi aplicado ao estudo de

rearranjos equilibrados (Kloosterman et al., 2011; Talkowski et al., 2011). O uso das

novas tecnologias permite identificar e sequenciar mltiplos pontos de quebra

simultaneamente. As anlises revelaram grande complexidade com a identificao de

novos pontos de quebra e de perdas e ganhos de segmentos. Talkowski et al. (2011)

admitem que, futuramente, com uma melhor relao custo-benefcio, os rearranjos

cromossmicos e as variaes estruturais sero mapeados e sequenciados, em larga

escala, no nvel de resoluo de pares de base.

I.2 Mecanismos de formao de rearranjos cromossmicos

A recombinao homloga no allica (Non Allelic Homologous Recombination

- NAHR) e a juno de extremidades no homlogas (Non-Homologous End Joining -

NHEJ) so os mecanismos classicamente considerados na formao de rearranjos

cromossmicos. Nos ltimos anos, o uso de novas ferramentas para a caracterizao

molecular dos pontos de quebra e juno dos rearranjos cromossmicos vem revelando

sua complexidade e vrios mecanismos tm sido propostos para explicar a formao

6

desses rearranjos, baseados em erros na duplicao do DNA, como o Fork Stalling and

Template Switching - FoSTeS (Lee et al., 2007) .

Ocorrendo mais de uma quebra de dupla fita de DNA em uma clula, o reparo

por NHEJ pode unir extremidades que no estavam contguas, originando rearranjos

estruturais. Inicialmente as extremidades quebradas emparelham com base na

homologia de alguns poucos pares bases e sua juno ocorre aps adio ou perda de

alguns pares de base, tornando as fitas compatveis (Figura 1; reviso em Gu et al.,

2008).

FIGURA 1. Formao de rearranjos cromossmicos por juno de extremidades no

homlogas (NHEJ): Aps deteco da quebra pelo mecanismo de reparo (1), as extremidades quebradas

das duplas fitas de DNA emparelham por homologia de alguns poucos pares de base (2). A adio ou

perda de poucos pares de base (3) tornam as fitas compatveis, ocorrendo a juno (4), que deixa

"cicatriz" indicativa de NHEJ como o mecanismo gerador do rearranjo. (Adaptada de Gu et al., 2008.)

Os rearranjos estruturais podem ainda se originar por recombinao homloga,

quando so utilizadas sequncias homlogas no allicas, como substrato para a

recombinao (NAHR; Figura 2). Esse o mecanismo que origina a maioria dos

rearranjos cromossmicos estruturais recorrentes, como a duplicao do cromossomo

17, que causa a doena de Charcot-Marie-Tooth do tipo 1A (CMT1A; MIM 601097), e

a deleo do cromossomo 7, que resulta na sndrome Williams-Beuren (WBS; MIM

194050). Em geral, a recombinao ocorre entre repeties de poucas cpias (Low Copy

7

Repeats - LCR), que tm entre 10 e 500 kb de extenso e compartilham mais de 95% de

identidade; representam de 5% a 10% do genoma humano. Apesar de mais raramente,

elementos repetitivos (Short Interspersed Nuclear Elements, SINE; Long Interspersed

Nuclear Elements, LINE) tambm podem ser substratos para a recombinao homloga

no allica (reviso em Shaw e Lupski, 2004).

FIGURA 2. Formao de rearranjos cromossmicos por recombinao homloga no

allica (NAHR): Emparelhamento seguido de recombinao entre Low Copy Repeats (LCR; setas

laranjas e roxas), que esto orientadas na mesma direo e compartilham alta homologia, resultando em

cromossomos com duplicao e deleo. As linhas escuras representam a dupla fita do DNA. (Adaptada

de Bailey e Eichler et al., 2006).

O estudo dos pontos de quebra de rearranjos cromossmicos pode fornecer

informaes sobre o mecanismo de reparo que contribuiu para sua formao. Como a

maioria dos trabalhos focaram rearranjos cromossmicos recorrentes, grande parte do

conhecimento nessa rea baseia-se no estudo dos mecanismos associados a esse tipo de

rearranjo.

No caso das translocaes Robertsonianas, o emparelhamento de sequncias

repetitivas pericentromricas, que teriam homologia em cromossomos acrocntricos,

facilitariam a transferncia de braos cromossmicos pela troca entre sequncias

emparelhadas em disposio invertida ou por recombinao em U. Os braos curtos dos

cromossomos acrocntricos contm mltiplas cpias de DNA satlite e genes de RNA

ribossmico 18S e 28S, sendo algumas sequncias nicas para cada cromossomo e

outras, compartilhadas entre acrocntricos. O clustering de pontos de quebra das

translocaes Robertsonianas recorrentes rob(13q14q) e rob(14q21q) sugere um

mecanismo especfico de formao desse tipo rearranjo. Em 97% dessas translocaes o

ponto de quebra no cromossomo 14 ocorre nas mesmas sequncias satlites. Nos

cromossomos 13 e 21, o ponto de quebra ocorre em sequncias satlites e em genes de

8

RNA ribossmico. Sequncias compartilhadas pelos cromossomos 13, 14 e 21, estando

no cromossomo 14 em orientao oposta s sequncias nos cromossomo 13 e 21,

facilitariam a ocorrncia de translocaes rob(13q14q) e rob(14q21q) em relao

rob(13q21q) (reviso em Shaffer e Lupski, 2000).

O mecanismo de recombinao homloga no allica tambm foi proposto para

a formao da translocao recproca recorrente t(4;8)(p16;p23). Ambos os pontos

quebra ocorrem em clusters de genes receptores olfativos, sugerindo que a

recombinao entre esses lcus em 4p16 e 8p23 seja responsvel pela formao do

rearranjo (Giglio et al., 2001). Assim como as translocaes Robertsonianas recorrentes,

a t(4;8)(p16;p23) forma-se preferencialmente na gametognese materna (Page et al.,

1997; Giglio et al., 2002).

J a translocao recproca recorrente mais frequente, a t(11;22)(q23;q11), um

exemplo de rearranjo associado formao de estruturas secundarias do DNA que criariam

instabilidade genmica em loco especfico (reviso em Kurahashi et al., 2010). Os pontos de

quebra em 11q23 e 22q11 localizam-se em regies ricas em AT, que formam estruturas

palindrmicas denominadas, respectivamente, de PATRR11 e PATRR22 (Palindromic AT-rich

Repeats, PATRR) (Kurahashi et al., 2000; Kurahashi et al., 2001a; Kurahashi et al., 2007). O

estudo dos fragmentos de juno em t(11;22) localizou os pontos de quebras em ambos os

cromossomos no centro das PATRR (Kurahashi et al., 2000). Pequenas regies palindrmicas

de DNA, como as PATRR, podem formar estruturas cruciformes de fita dupla que induziriam a

instabilidade genmica, levando quebra na dupla fita e formao das translocaes (Kurahashi

et al., 2004). A ausncia de homologia e a presena de pequenas delees nos pontos de quebra

da t(11;22) sugerem que, aps a quebra na dupla fita do DNA, o reparo realizado via NHEJ

(reviso em Shaffer e Lupski, 2000). A frequncia relativamente alta da t(11;22) em

espermatozides de homens normais (Kurahashi et al., 2001b) e a origem paterna de t(11;22)

espordicas (Ohye et al., 2010) indicam que esse rearranjo se origina na espermatognese.

Em geral, so desconhecidos os mecanismos de formao e as sequncias participantes

da maior parte dos rearranjos cromossmicos equilibrados no recorrentes. O aprimoramento

das tcnicas citogenticas, em associao com a anlise do DNA e o crescente conhecimento da

sequncia e da arquitetura do genoma humano tornaram factvel a elucidao dos mecanismos

de formao desses rearranjos cromossmicos.

Com o objetivo de caracterizar os rearranjos cromossmicos equilibrados assim

como seus mecanismos geradores, Higgins et al. (2008) clonaram e sequenciaram 18

pontos de quebra de rearranjos cromossmicos aparentemente equilibrados, presentes

em indivduos com malformaes congnitas graves. Em apenas um caso foram

9

encontradas, em ambos os pontos de quebra, sequncias que, pela similaridade

compartilhada, poderiam ter mediado a formao do rearranjo por NAHR. Nos pontos

de quebra da maioria dos rearranjos foram detectadas duplicaes, inseres e delees

de poucos pares de base, uma indicao de NHEJ como mecanismo gerador do

rearranjo. O mecanismo de NHEJ tambm foi proposto no caso de translocaes entre o

cromossomo X e um autossomo, em que no havia homologia extensa entre os

segmentos envolvidos e se detectaram pequenas delees, duplicaes e inseres nos

pontos de quebra e juno (van Bakel et al., 1995; Vianna-Morgante et al., 2004).

Recentemente um novo mecanismo foi proposto para a formao de rearranjos

cromossmicos. Lee et al. (2007) aplicaram oligoarrays e sequenciamento dos pontos

de quebra para analisar duplicaes no recorrentes, que incluam o gene PLP1

(proteolipid protein 1), associadas doena de Pelizaeus-Merzbacher, (PMD; MIM

312080). Apesar de terem identificado duplicaes em tandem em 65% dos casos, os

rearranjos eram mais complexos com segmentos duplicados interrompidos por

segmentos intactos, triplicados ou deletados. O mecanismo de Fork Stalling and

Template Switching (FoSTeS) foi proposto para explicar a complexidade desses

rearranjos. Baseia-se na correo da duplicao do DNA, interrompida por leses ou

formao de estruturas secundrias; diante da interrupo da forquilha de duplicao, a

fita lagging invade outras forquilhas prximas, at completar a duplicao da fita

lagging na forquilha original. A mudana de forquilha exige a presena de micro-

homologias com os stios invadidos para o priming da extremidade 3' reiniciar a

replicao (Figura 3). FoSTeS aparece como explicao para outros rearranjos

complexos, como delees no cromossomo 17 associadas sndrome de Smith-Magenis

(MIM, 182290) (Gu et al., 2008) e duplicaes que incluem o gene MECP2 (Carvalho

et al., 2009), podendo ser um mecanismo frequente na origem de rearranjos estruturais.

I.3 Rearranjos cromossmicos equilibrados associados a sinais e sintomas clnicos

Apesar de a maioria dos portadores de rearranjos cromossmicos aparentemente

equilibrados serem clinicamente normais, cerca de 7% dos rearranjos equilibrados

espordicos esto associados a alteraes fenotpicas (Warburton, 1991). Estudos de

indivduos com deficincia mental e malformaes congnitas evidenciaram que as

translocaes aparentemente equilibradas so mais freqentes nesse grupo do que na

populao geral (Tharapel et al.,1977; Fryns e van den Berghe,1979).

10

FIGURA 3. Formao de rearranjo cromossmico por Fork Stalling and Template

Switching (FoSTeS): (1) Aps o incio da duplicao do DNA (linhas azul escuro e vermelho), leses ou

estruturas secundrias podem levar parada da duplicao; a fita lagging (linha vermelha pontilhada)

invade uma segunda forquilha de duplicao prxima (linhas slidas, roxa e verde) via micro-homologia,

(2) reiniciando-se a sntese de DNA (linha pontilhada verde). (3) Uma terceira forquilha (linhas slidas,

cinza e preta) pode ser invadida por essa fita lagging, continuando a duplicao (linha preta pontilhada).

Uma srie de eventos FoSTeS pode ocorrer at (4) a fita lagging original completar a duplicao.

(Adaptada de Lee et al., 2007).

Diferentes mecanismos tm sido identificados ou sugeridos para explicar a

associao entre rearranjos cromossmicos aparentemente equilibrados e quadros

clnicos. Uma das explicaes mais bvias a interrupo de genes pelas quebras

cromossmicas (Zatz et al., 1981; Bonaglia et al., 2001). Elementos reguladores

tambm podem ser danificados pelas quebras (Leipoldt et al., 2007). A expresso de

genes situados prximos aos pontos de quebra pode ser alterada devido a efeito de

posio; nesse caso, o rearranjo no altera diretamente o gene ou sua regio promotora,

mas a mudana de posio pode separar o gene de um elemento regulador ou pode

aproxim-lo da regio reguladora de outro gene (Kleinjan e Heyningen, 1998).

Recentemente a aplicao de microarrays de DNA ao estudo de rearranjos

aparentemente equilibrados tem revelado a complexidade de muitos deles, que incluem

microdelees e duplicaes prximas aos pontos de quebra ou neles prprios e que

podem explicar os fentipos alterados (Gribble et al., 2005; De Gregori et al., 2007;

Sismani et al., 2008).

Assim, a caracterizao dos pontos de quebra de rearranjos cromossmicos

equilibrados pode levar identificao de genes candidatos a serem responsveis pelos

11

quadros clnicos a eles associados. No entanto, importante ressaltar que a associao

entre fentipo alterado e rearranjos equilibrados pode ser ao acaso e indivduos

clinicamente normais portadores de rearranjos aparentemente equilibrados podem ter

genes interrompidos pelos pontos de quebra (Baptista et al., 2008).

Interrupo de genes pelas quebras cromossmicas

As quebras cromossmicas podem interromper a estrutura de genes. A

identificao do gene da distrofina foi um dos primeiros casos de mapeamento de um

gene a partir de uma translocao. No incio da dcada de 80 foram publicados vrios

trabalhos que descreveram mulheres afetadas por distrofia muscular do tipo Duchenne

(DMD), que eram portadoras de translocaes recprocas entre o cromossomo X e um

autossomo (Zatz et al., 1981, Boyd et al.,1986). Em todos esses casos, o ponto de

quebra no cromossomo X ocorreu na banda Xp21, o que sugeria que o gene mutado na

DMD estava localizado nesse segmento e que tinha sido interrompido pelas quebras que

originaram as translocaes. Esses resultados juntamente com a deteco de delees

em afetados permitiram a clonagem do gene da distrofina (Koenig et al., 1987). A

manifestao da DMD, que tem herana recessiva, nas mulheres foi resultado da

inativao do cromossomo X normal. Em geral, esse padro de inativao observado

em portadoras de translocaes X- autossomo; o desvio da inativao casual decorre da

seleo contrria s clulas que inativam o cromossomo X translocado, que no so

equilibradas do ponto de vista funcional, pois apresentam dissomia parcial do

cromossomo X e monossomia parcial do autossomo. O estudo de translocaes X-

autossomo levou identificao de muitos outros genes no cromossomo X,

relacionados a doenas.

O estudo de rearranjos equilibrados tem sido importante na identificao de

genes candidatos a quadros de deficincia mental com herana ligada ao X,

especialmente nos casos no sindrmicos, em que os estudos de ligao so dificultados

(reviso em Vandeweyer et al., 2009). Zemni et al. (2000), por exemplo, verificaram

que o gene TM4SF2 (Transmembrane 4 Superfamily, Member 2), mapeado em Xp11.4,

tinha sido interrompido pela translocao t(X;2)(p11.4;p21.3) em uma paciente com

deficincia mental no sindrmica. A expresso do fentipo foi resultado da inativao

do cromossomo X normal. O gene TM4SF2 altamente expresso no sistema nervoso

central, incluindo o crtex cerebral e o hipocampo, sendo indicado candidato ao quadro

clnico. Isso foi confirmado com a deteco de mutaes no gene TM4SF2 em trs

12

famlias em que a deficincia mental no sindrmica tinha sido mapeada no segmento

Xp11.4. Posteriormente mutaes nesse gene foram descritas em outros homens

afetados (Abidi et al., 2002; Maranduba et al., 2004). Alm do gene TM4SF2, 13 genes

candidatos a deficincia mental sindrmica e no sindrmica foram identificados no

cromossomo X em estudos de translocaes equilibradas. A associao causal est

confirmada para 10 deles, pela identificao de mutaes em outros pacientes com

deficincia mental (reviso em Vandeweyer et al., 2009).

Genes localizados em cromossomos autossmicos tambm foram identificados

em estudos de rearranjos equilibrados associados a quadros clnicos. Esses genes so

sensveis a dosagem e os quadros clnicos esto associados a haploinsuficincia dos

genes interrompidos pelas quebras cromossmicas.

Um dos exemplos mais conhecidos o do gene da neurofibromatose tipo 1

(NF1; MIM 162200). O estudo de duas translocaes com pontos de quebra em 17q11.2

levou identificao do gene da doena nesse segmento. Schmidt et al. (1987)

descreveram uma famlia com afetados por NF1 associada a uma translocao

t(1;17)(p34;q11.2) e Ledbetter et al. (1989) descreveram uma translocao

t(17;22)(q11.2;q11.2) em uma afetada por NF1. Wallace et al. (1990) verificaram que o

gene NF1 (neurofibromin 1) tinha sido interrompido pelas quebras dessas translocaes

no cromossomo 17 e descreveram uma mutao no gene NF1 em outro afetado pela

doena.

Um exemplo mais recente a sndrome de Cornelia de Lange (CDLS1; MIM

122470). Tonkin et al. (2004) descreveram uma criana com CDLS1, portadora de

translocao equilibrada t(5;13)(p13.1;q12.1). A caracterizao do ponto de quebra no

cromossomo 5 mostrou que o gene NIPBL (Nipped-B-like) tinha sido interrompido. A

funo desse gene em clulas de mamferos no era conhecida, mas o padro de

expresso era compatvel com o fentipo da sndrome. Considerando o gene como

candidato, os autores estudaram outros afetados pela sndrome e identificaram nove

mutaes de ponto no gene NIPBL.

O estudo de rearranjos equilibrados tem sido importante tambm na

identificao de genes candidatos a deficincia mental no ligada ao X. Vandeweyer et

al. (2009), em sua reviso sobre rearranjos equilibrados entre autossomos, associados a

deficincia mental, realacionam 15 genes candidatos, mas apenas GLI3 (GLI family zinc

finger 3) foi validado, pela presena de mutaes em outros indivduos com deficincia

mental (Johnston et al., 2005). Cacciagli et al. (2010) descreveram uma paciente com

13

deficincia mental moderada a grave e hipotonia, portadora de translocao t(10;13)

(p12.1;q12.13). A caracterizao do rearranjo mostrou que o gene ATP8A2 (ATPase,

aminophospholipid transporter, class I, type 8A, member 2), mapeado em 13q12.13, foi

interrompido pelo ponto de quebra. Esse foi o nico gene alterado pelo rearranjo e a

anlise por a-CGH no identificou desequilbrios submicroscpicos. O gene ATP8A2,

que codifica uma ATPase, altamente expresso no crebro humano e de camundongo.

Os autores no detectaram mutaes nesse gene em uma amostra pequena de 38

pacientes com quadros similares ao da portadora da translocao, isso significando que

mutaes no gene ATP8A2 no causa frequente de deficincia mental, o que tambm

acontece com a maioria dos genes j relacionados a deficincia mental.

A sndrome da deleo terminal 22q13.3 caracterizada por grave atraso de

linguagem, deficincia mental moderada, hipotonia e dismorfismos faciais (MIM

606232). Bonaglia et al. (2001) identificaram uma criana com quadro tpico da

sndrome, portadora de translocao equilibrada t(12;22)(q24.1;q13.3). O ponto de

quebra no cromossomo 22 interrompia o gene SHANK3 (SH3 and multiple ankyrin

repeat domains 3), que altamente expresso no crtex cerebral e cerebelo. Os autores

sugeriram que a haploinsuficincia desse gene seria responsvel pela sndrome da

deleo terminal em 22q13.3. Posteriormente, Wilson et al. (2003) identificaram uma

regio crtica de 130 kb comum a 46 pacientes, que inclua o gene SHANK3.

Alm da identificao de genes candidatos para doenas monognicas, o estudo

de rearranjos equilibrados tambm pode contribuir para elucidar os mecanismos

genticos responsveis por doenas complexas. Bache et al. (2006) avaliaram o

potencial da associao entre translocaes equilibradas e essas doenas. Para isso,

investigaram a presena de vrias doenas complexas em portadores de translocaes

equilibradas sem histrico de doena de manifestao precoce. Foram considerados

como potencialmente associados a doenas complexas, as translocaes que

cossegregavam com o quadro clnico com um lod score significativo ou aquelas

translocaes cujos pontos de quebra estavam localizados em regies que j haviam

sido associadas s doenas. Os autores identificaram 42 pontos de quebra

potencialmente associados a doenas complexas. A associao mais consistente ocorreu

entre um ponto de quebra em 1p36 em uma translocao t(1;18)(p36.1;q21) familial que

segregava com dislexia. O loco DYX8, tambm mapeado em 1p36, j havido sido

associado dislexia em estudo de ligao (Tzenova et al., 2004). Outra associao

muito provvel ocorreu entre uma translocao t(9;17)(q33;q25.3) e distrbio bipolar

14

famlial. A associao entre o segmento 17q25.3 e o distrbio bipolar foi apoiada pela

identificao, no mesmo trabalho, de dois pacientes com depresso e pontos de quebra

de translocao nesse segmento.

Formao de gene hbrido

Os rearranjos cromossmicos podem formar genes hbridos, cujos produtos

esto associados geralmente ao desenvolvimento de tumores. Para que ocorra a

formao de transcrito hibrido, ambos os genes precisam estar orientados na mesma

direo e o quadro de leitura deve ser preservado. O exemplo mais conhecido o da

leucemia mielide crnica (MIM 608232), caracterizada pela presena da translocao

t(9;22)(q34;q11) na linhagem tumoral. No ponto de quebra do cromossomo 9, o gene

ABL (Abelson tyrosine kinase) est interrompido. O gene codifica uma tirosina quinase

que atua na regulao do ciclo celular. O gene BCR (Breakpoint Cluster Region), cuja

funo no conhecida, interrompido pelo ponto de quebra no cromossomo 22. No

cromossomo 22 derivativo, o cromossomo Filadlfia, ocorre a justaposio dos genes

ABL e BCR, formando um gene hbrido que codifica um polipeptdio similar ao produto

do ABL. No entanto, a substituio da poro N-terminal de ABL pela poro N-

terminal de BCR faz com que o produto hbrido tenha atividade desregulada e

constitutiva de tirosina quinase. Essa protena estimula a proliferao de clulas

precursoras hematopoiticas e impede que sofram apoptose.

Apesar de raros, existem relatos de formao de transcritos hbridos associados a

translocaes em afetados por deficincia mental e malformaes congnitas

(Nothwang et al., 2001, Ramocki et al., 2003, Backx et al., 2011). Nothwang et al.

(2001) descreveram o primeiro caso de formao de gene quimrico no associado a

cncer. Uma translocao (1;19)(q21.3;q13.2) de novo foi detectada em uma criana

com deficincia mental, ataxia e atrofia do crebro. O rearranjo interrompeu nos

cromossomos 1 e 19, respectivamente, os genes CLK2 (cdc-like kinase 2) e PAFAH1B3

(platelet-activating factor acetylhydrolase 1b, catalytic subunit 3). No cromossomo

derivativo 1 formou-se um gene hbrido composto pelos exons 2 a 13 do CLK2 e pelos

exons 1 a 4 do PAFAH1B3, que codifica uma protena formada pelos 136 aminocidos

iniciais de PAFAH1B3 e pelo polipeptdio completo e no modificado codificado pelo

CLK2, j que o exon 1 desse gene no transcrito. Os autores avaliaram se as funes

dos polipeptdios ficaram conservadas no hbrido. O CLK2 codifica uma quinase que

atua na regulao da atividade de fatores de splicing ricos em serina e arginina, funo

15

que ficou conservada no polipeptdeo hbrido. J o PAFAH1B3 codifica um polipeptdio

que se liga a LIS1, formando um complexo com atividade de protena G

heterotrimrica. No polipeptdeo hbrido houve perda de capacidade de ligao a LIS1 e

perda da atividade hidroltica de PAFAH1B3. Os autores sugerem que o fentipo do

paciente est relacionado a haploinsuficincia de PAFAH1B3.

Em uma paciente com manifestaes neurolgicas, incluindo agenesia do corpo

caloso, foi identificada uma translocao t(2;9)(p24;q32) (Ramocki et al., 2003). O

estudo por FISH e a anlise por PCR revelou que dois genes Zn-finger (KIAA1803 e

ASXL2), expressos em todos os tecidos, tinham sido interrompidos. Consequentemente,

o rearranjo originou um transcrito hbrido em cada cromossomo derivativo. Apesar de

os genes KIAA1803 e ASXL2 serem candidatos a atuarem no desenvolvimento do

sistema nervoso, o mecanismo associado ao fentipo pode ser a haploinsuficincia de

um ou ambos os genes ou de ganho de funo dos polipeptdeos hbridos.

Recentemente, Backx et al. (2011) estudaram um paciente com deficincia

mental e agenesia do corpo caloso, portador de uma translocao recproca espordica

t(6;14)(q25.3;q13.2). A caracterizao molecular do rearranjo revelou um gentipo

complexo com a interrupo dos genes ARID1B (AT rich interactive domain 1B (SWI1-

like)) e MRPP3 (mitochondrial RNase P protein 3) e consequente formao de genes

hbridos nos cromossomos derivativos. A presena dos transcritos hbridos foi detectada

por RT-PCR e confirmada por sequenciamento. O mecanismo patognico mais provvel

seria a haploinsuficincia de um ou de ambos os genes alterados. O gene ARIRID1B,

que atua na remodelagem da cromatina, constitu um bom candidato devido a seu

padro de expresso; alm disso, mutaes em outro gene da mesma famlia, KDM5C

(lysine (K)-specific demethylase 5C), causa deficincia mental sindrmica e no

sindrmica (Jensen et al., 2005). Adicionalmente, um paciente includo no DECIPHER

(registro 4662), portador de uma microdeleo que inclui apenas o ARIRID1B. O

paciente tem atraso de fala, retardo mental e comportamento autstico. No entanto, o

ganho de funo ou efeito dominante negativo dos transcritos hbridos no pode ser

descartado.

Assim, nessas translocaes constitutivas, mesmo diante da formao de

produtos hbridos, a haploinsuficincia de genes interrompidos pelas quebras

cromossmicas parece ser a causa dos quadros clnicos.

16

Efeito de posio

O efeito de posio definido como uma alterao da expresso gnica devida a

mudana de posio do gene do seu ambiente cromossmico, no estando associado a

mutao ou deleo intragnica, mantendo-se portanto, a unidade transcricional e o

promotor intactos (Kleinjan e Heyningen, 1998). O efeito de posio pode estar

associado a alteraes fenotpicas por dois mecanismos principais: heterocromatizao

ou alterao da relao espacial do gene com elementos reguladores em cis. No ltimo

caso, o rearranjo pode afastar um gene de elementos reguladores prprios ou de um

elemento de fronteira ou ainda pode aproxim-lo de elementos reguladores de outro

gene. Com raras excees, os genes j associados ao efeito de posio codificam fatores

de transcrio que atuam no desenvolvimento, refletindo a importncia do controle

temporal e espacial da expresso desses genes. O estudo de rearranjos com pontos de

quebra 3 ou 5 a esses genes tem contribudo para elucidar a complexidade das regies

reguladoras de genes que atuam no desenvolvimento em mamferos (reviso em

Kleinjan e Lettice, 2008).

Recentemente, Kleinjan e Coutinho (2009) propuseram que doenas causadas

por interrupo da arquitetura em cis da regio reguladora de um loco gnico sejam

chamadas de cis-ruption disorders. Um exemplo a displasia campomlica (CD,

MIM 114290), doena rara e frequentemente letal, caracterizada por alteraes

esquelticas, entre as quais se destacam o encurvamento e a diminuio do

comprimento dos ossos longos. A maioria dos afetados so portadores de mutaes na

regio codificadora do gene SOX9 (Sry-related hmg-box gene 9), mapeado no brao

longo do cromossomo 17. Todavia existem relatos de afetados que no possuem essas

mutaes, mas so portadores de rearranjos equilibrados cujos pontos de quebra se

localizam upstream ao SOX9. Leipoldt et al. (2007) classificou os pontos de quebra

desses rearranjos em clusters proximais e distais, localizados, respectivamente, a 50-375

kb e 789-932 kb upstream ao gene SOX9. A curvatura anormal dos ossos longos,

caracterstica principal da CD, est ausente nos portadores de rearranjos cujos pontos de

quebra se localizam no cluster distal. Nesses casos, a doena chamada de displasia

campomlica acampomlica (ACD). Mais recentemente, Benko et al. (2009),

descreveram pontos de quebra localizados a mais de 1Mb upstream ao SOX9 em

afetados pela sequncia de Pierre Robin (PRS; MIM 261800), caracterizada por fissura

de palato, micrognatia e glossoptose. A sequncia de PRS est frequentemente presente

em algumas sndromes mendelianas, incluindo a CD e a ACD. Diante desse cenrio,

17

Gordon et al. (2009) propem que a regio reguladora do SOX9 se estenda alm de 1,23

Mb upstream ao gene. Os rearranjos cromossmicos removeriam um ou mais elementos

reguladores em cis, levando a alterao da expresso do SOX9 e aos quadros clnicos.

Outro gene para o qual o efeito de posio j foi proposto o PAX6 (paired box

6), mapeado em 11p13, cuja haploinsuficincia est associada a aniridia (NA, MIM

106210). J foram descritos indivduos afetados que eram portadores de rearranjos

cromossmicos com pontos de quebra downstream ao gene, o mais distal localizando-se

a 125 kb do ltimo exon do PAX6 (Fantes et al., 1995; Lauderdale et al., 2000; Crolla e

van Heyningen, 2002). Todos os pontos de quebra se localizam no ltimo intron do

gene ELP4 [elongation protein 4 homolog (S. cerevisiae)], que expresso em todos os

tecidos. Estudos em camundongos indicam que a interrupo do ELP4 no contribui

para o fentipo.

O rearranjo pode tambm aproximar o gene de elementos reguladores de outro

gene. Um exemplo clssico o linfoma de Burkitt (BL; MIM 113970), caracterizado

pela proliferao monoclonal de linfcitos-B5; em 80% dos casos a translocao

t(8:14)(q24:q32) est presente na linhagem tumoral. No cromossomo derivativo 14 o

gene c-myc [v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)], translocado do

cromossomo 8, est justaposto aos de imunoglobulina e passa a estar sob o controle de

seus reguladores, tendo sua expresso exacerbada. O gene c-myc atua em vrios

aspectos da biologia celular incluindo proliferao, diferenciao, metabolismo e

apoptose. A superexpresso do gene c-myc no cromossomo derivativo (14) altera essas

funes e, consequentemente, desenvolve-se o tumor.

Alm da alterao de elementos reguladores em cis, o rearranjo cromossmico

pode influenciar a expresso de gene(s) prximo(s) ao ponto de quebra devido a

alterao da estrutura da cromatina. A heterocromatizao pode ocorrer quando o

rearranjo aproxima uma regio de eucromatina a uma regio de heterocromatina; o

estado mais condensado do DNA da heterocromatina pode avanar para a regio

eucromtica justaposta, silenciando genes, de forma aleatria, mas estvel. Rees et al.,

(1994) descreveram uma translocao em mosaico, associada a -talassemia, na qual o

gene da cadeia da hemoglobina foi translocado intacto do cromossomo 11 para o

cromossomo 22, junto ao centrmero. Os autores sugerem que o gene estaria silenciado

devido proximidade com a regio pericentromrica, de cromatina constitutiva.

18

Dissomia uniparental (UPD)

A dissomia uniparental (UPD) definida pela presena no caritipo de um par

de cromossomos homlogos ou de segmentos cromossmicos homlogos com mesma

origem parental. classificada como isodissomia uniparental quando o mesmo

cromossomo ou segmento cromossmico est presente em duplicata. Quando so

herdados dois cromossomos homlogos diferentes ou parte deles de um mesmo genitor,

tem-se uma heterodissomia uniparental.

Cerca de 30% dos casos de UPD esto associados a caritipos anormais, sendo

8% rearranjos equilibrados (Liehr, 2010). No caso de um portador de translocao

equilibrada, uma no disjuno meitica pode originar um gameta dissmico, com os

dois cromossomos derivativos e um dos normais que, ao se juntar a um gameta normal,

formar um zigoto trissmico. A trissomia poder ser corrigida pela perda do

cromossomo homlogo normal do outro genitor, e nesse caso, o embrio ter uma

heterodissomia uniparental. Outra possibilidade de heterodissomia ocorrer a

fertilizao entre o gameta dissmico do portador da translocao e o do outro genitor,

com a nulissomia correspondente. Caso o gameta do portador da translocao seja

nulissmico, com apenas um dos cromossomos normais da translocao, a unio com

um gameta normal originar um embrio monossmico. O resgate da monossomia pode

ocorrer por duplicao do cromossomo homlogo do genitor no portador da

translocao. Essa pode ser tambm a origem de UPD em associao com rearranjos

equilibrados espordicos, que se originem na formao dos gametas (Robinson, 2000).

A relao entre dissomia uniparental e fentipo alterado pode decorrer da

homozigose quanto a alelos recessivos detrimentais ou de imprinting genmico, ou seja,

da expresso gnica dependente da origem parental (Wilkins et al., 2003).

Entre as doenas relacionadas ao mecanismo de imprinting genmico j foram

descritos vrios casos de UPD associada a rearranjos equilibrados. Dupont et al. (2002),

por exemplo, descreveram uma menina afetada pela sndrome de Silver-Russell (SRS;

MIM 180860), que herdou uma translocao equilibrada t(7;16)(q21;q24) de sua me

fenotipicamente normal; na criana foi detectada uma UPD materna do cromossomo 7,

como causa da sndrome. Explica-se a UPD como decorrncia de no disjuno, o

gameta materno que originou o zigoto possuindo os cromossomos 7 normal e derivativo

e determinando uma trissomia do cromossomo 7; o resgate dessa trissomia no embrio,

com perda do cromossomo 7 paterno, levou UPD7 materna e SRS.

19

Entre as ocorrncias espordicas, existem vrios exemplos de isocromossomos

de brao longo ou translocaes entre homlogos dos acrocntricos 14 e 15, associados

a sndromes bem caracterizadas de imprinting paterno e materno do cromossomo 14 e

do cromossomo 15 (sndromes de Prader-Willi e de Angelman) (Robinson, 2000).

Perdas e ganhos de segmentos submicroscpicos

Os rearranjos cromossmicos equilibrados so detectados por tcnicas de

citogentica clssica, dessa forma so considerados equilibrados aqueles rearranjos nos

quais no so identificadas alteraes maiores que 5 Mb, que podem ser visualizadas ao

microscpico ptico. A partir de 2005, foram publicados vrios trabalhos que aplicam

array-CGH no estudo de rearranjos equilibrados associados a quadros clnicos (Gribble

et al., 2005, De Gregori et al., 2007, Baptista et al., 2008; Fantes et al., 2008; Higgins et

al., 2008; Sismani et al., 2008; Schluth-Bolard et al., 2009). Esses estudos tm mostrado

que microdelees e microduplicaes de segmentos genmicos podem ser

responsveis por parte significativa dos fentipos alterados associados a esses rearranjos

(Tabela 1). Estima-se que 33,5% dos pacientes estudados eram portadores de

desequilbrios submicroscpicos.

Apesar de a maioria dos desequilbrios submicroscpicos estarem localizados

nos pontos de quebra que originam os rearranjos (15,5%), 9% estavam fora deles, mas

localizados nos cromossomos rearranjados. As alteraes nos pontos de quebras podem

ter ocorrido durante a formao dos rearranjos, enquanto que aquelas distantes aos

pontos de quebra podem no estar associadas aos rearranjos ou refletir um mecanismo

mais complexo em sua formao (Higgins et al., 2008). Surpreendentemente, em 9%

dos rearranjos equilibrados estudados foram detectadas alteraes submicroscpicas em

cromossomos que no participavam dos rearranjos (Tabela 1).

Como mostra a Tabela 1, houve diferenas nas frequncias de alteraes

submicroscpicas entre os vrios estudos que, pelo menos em parte, so atribuveis s

diferentes metodologias utilizadas. As menores frequncias de alteraes foram

observadas nos trabalhos que utilizaram arrays de 1 Mb (Fantes et al., 2008; Sismani et

al., 2008). Interessantemente, apenas um estudo (Fantes et al., 2008) detectou ganho de

segmentos, todos os outros desequilbrios sendo delees. Isso pode ser resultado do

mecanismo de formao dos rearranjos, levando preferencialmente perda de material.

Por outro lado, esse resultado pode refletir a menor patogenicidade das duplicaes, que

assim no estariam presentes nos indivduos selecionados para os estudos (Schluth-

Bolard et al., 2009).

20

O grande desafio, no entanto, consiste em determinar quais desequilbrios, de

fato, esto associados aos quadros clnicos, j que variaes no nmero de cpias

(CNV) tambm so encontradas em indivduos da populao geral (Redon et al., 2006).

Tabela 1. Perdas e ganhos de segmentos submicroscpicos em portadores de rearranjos

cromossmicos equilibrados.

Estudo a-CGH

(plataforma)

Portadores de

desequilbrios

submicroscpicos

Desequilbrio no

ponto de quebra

Desequilbrio em

cis ao ponto de

quebra

Desequilbrio

no associados

ao rearranjo

1 BAC PAC 3500

clones/array

painting

5/10 1/10 1/10

3/10

2 Oligo 44B/244K

(Agilent)

11/27

7/27

1/27

3/27

3

Sanger 30K

Whole Genome

TilePath

4/14

3/14

1/14 (*)

1/14

4 1Mb CytoChip

BlueGnome

6/46 3/46

3/46

0/46

5 2600 BAC

arrays/244K

(Agilent)

6/11 2/11

3/11

1/11

6 Cytochip 1-Mb

BlueGnome

3/12

1/12

1/12

1/12

7 Oligo

44K/244K

(Agilent)

16/33

7/16

4/33

5/33

Estudo: (1) Gribble et al. (2005); (2) De Gregori et al. (2007); (3) Baptista et al. (2008); (4) Fantes et al.

(2008); (5) Higgins et al. (2008); (6) Sismani et al.(2008); (7) Schluth-Bolard et al. (2009)

(*)Paciente portador de desequilbrios no ponto de quebra e em cis ao rearranjo

A caracterizao de rearranjos aparentemente equilibrados no associados a

quadros clnicos, evidenciando no que diferem daqueles associados com quadros

clnicos, pode contribuir para a compreenso dessas associaes. Baptista et al. (2008) e

Fantes et al. (2008) analisaram translocaes cromossmicas equilibradas presentes

tanto em indivduos normais quanto em portadores de sinais e sintomas clnicos.

Mostraram que indivduos fenotipicamente normais podem ter genes interrompidos

pelos rearranjos, que no seriam sensveis a dosagem ou que se localizam em regies de

variaes no nmero de cpias (CNV). Entretanto, somente em rearranjos equilibrados

associados a anormalidades clnicas foram detectados desequilbrios submicroscpicos

21

nos pontos de quebra ou em cis a eles nos cromossomos rearranjados. Dessa forma os

desequilbrios submicroscpicos em cis podem ser responsveis por grande parte dos

fentipos clnicos observados em pacientes com rearranjos equilibrados. Estabelecer a

relao causal dessas perdas e ganhos de segmentos cromossmicos com os fentipos

dos portadores e entender sua relao com os rearranjos equilibrados associados a eles

so desafios atuais.

Cox et al. (2003) estudaram uma criana com deficincia mental no sindrmica

portadora de translocao t(X;8)(q28;q12). No ponto de quebra do cromossomo X foi

detectada uma duplicao de 650 kb. Nessa regio esto mapeados 11 genes, sendo

nove expressos no crebro. Os autores atribuem o quadro clnico a dosagem alterada de

gene(s) mapeado(s) na regio duplicada do cromossomo X.

Mademont-Soler et al. (2010) estudaram uma paciente com alteraes faciais,

malformaes de Dandy-Walker, perda auditiva e hiperlaxia de pele, que tambm era

portadora da translocao t(6;13)(q23;q32). O a-CGH revelou uma deleo de 2,5 Mb

no ponto de quebra do cromossomo 13. O quadro clnico da paciente sobrepe-se

queles j descritos em portadores de delees em 13q32, indicando que a perda desse

segmento contribui para o fentipo. Os autores sugerem que os genes ZIC2 (Zic family

member 2) e ZIC5 (Zic family member), mapeados nesse segmento, so os principais

candidatos ao quadro clinico.

Assim como em rearranjos cromossmicos de novo, a anlise por a-CGH mostra

que rearranjos cromossmicos herdados tambm podem estar associados a

desequilbrios submicroscpicos nos cromossomos derivativos distantes aos pontos de

quebra. Lybaek et al. (2008) utilizaram array-CGH e FISH para investigar uma inverso

no brao longo do cromossomo 14 associada, em uma famlia, ao quadro de

esferocitose, dificuldades de aprendizagem/deficincia mental. Foi identificada, em um

dos afetados, uma deleo de 2,1 Mb mapeada a 1,6 Mb do ponto de quebra telomrico

da inverso. A me e o tio materno tambm eram portadores da deleo. Nessa regio

esto mapeados 16 genes, dentre os quais, o gene SPTB (beta-spectrin), em que

mutaes de perda de funo j foram identificadas em pacientes com esferocitose. Os

autores atribuem a dificuldades de aprendizagem/deficincia mental observada na

famlia haploinsuficincia de outro(s) gene(s) mapeado(s) na regio da deleo no

cromossomo 14, sendo os genes PLEKHG3 [pleckstrin homology domain containing,

family G (with RhoGef domain) member] e MAX (MYC associated factor X) os

principais candidatos, devido alta expresso no sistema nervoso. Como a av do

22

probando e outros provveis portadores da inverso haviam falecido, os autores no

puderam determinar se a deleo e a inverso originaram-se ou no independentemente.

Papadopoulou et al. (2010) investigaram um paciente com deficincia mental e

malformaes congnitas mltiplas, que era portador de translocao equilibrada

t(9;15)(q31;q26). Aplicando a-CGH, foi identificada uma duplicao de 5-6 Mb, em

9q34 e trs delees de 8,1 a 12,2 Mb, no cromossomo 15. A validao desse resultado

por FISH mostrou que o segmento duplicado do cromossomo 9 estava inserido no

cromossomo derivativo 15 e que as delees estavam no cromossomo 15 derivativo,

portanto em cis ao ponto de quebra da translocao. Tanto a duplicao de gene(s)

mapeado(s) no segmento duplicado do cromossomo 9, quanto a haploinsuficincia de

gene(s) localizados(s) nos segmentos deletados do cromossomo 15 podem contribuir

para o fentipo.

Como a anlise por microarrays permite a investigao global do genoma, pode

detectar, em portadores de rearranjos equilibrados, alteraes em cromossomos que no

participam desses rearranjos. Em determinados casos, os rearranjos cromossmicos e as

alteraes detectadas em outros cromossomos podem contribuir para o fentipo.

Hayashi et al. (2007) descreveram uma translocao equilibrada t(5;13)(p13.1;q12.1)

em uma criana portadora de sndrome de Cornelia de Lange, associada a outros sinais.

O gene NIPBL, cuja haploinsuficincia causa a sndrome, foi interrompido pela

translocao. Aplicando a-CGH, os autores identificaram uma deleo de 1 Mb no

brao longo do cromossomo 1, incluindo seis genes (FIBL-6, PRG4, TPR, OCLM, PDC

e PTGS2) e atriburam as caractersticas no tpicas de CDLS haploinsuficincia de

gene(s) mapeado(s) nesse segmento.

Entretanto, o rearranjo pode estar de fato equilibrado e o fentipo ser causado

por perda ou ganho de segmentos de cromossomos que no participam dele. Morales et

al. (2009) descreveram uma paciente com atraso de desenvolvimento neuropsicomotor,

retardo de crescimento, dismorfismos faciais, clinodactilia e miopia. A criana era

portadora de inverso de novo no brao longo do cromossomo 7, inv(7)(q21.12q34).

Genes prximos aos pontos de quebra no puderam ser associados aos sinais clnicos.

Por meio de a-CGH foi identificada uma deleo no brao curto do cromossomo 3 -

del(3)(p12.3p13). As manifestaes clnicas da paciente sobrepunham-se s de outros

portadores de delees nesse segmento cromossmico, apontando para a

haploinsuficincia de gene(s) mapeado(s) no segmento deletado do cromossomo 3

como causa do quadro clnico.

23

II. OBJETIVOS

24

II. OBJETIVOS

Com este estudo, nosso objetivo foi identificar mecanismos pelos quais

rearranjos cromossmicos aparentemente equilibrados possam estar associados de

maneira causal a determinados quadros clnicos. Para isso estudamos rearranjos

cromossmicos aparentemente equilibrados detectados em pacientes com malformaes

congnitas, atraso de desenvolvimento neuropsicotomor ou comprometimento

intelectual. Os pontos de quebra foram mapeados por FISH de segmentos mapeados nos

pontos de quebra identificados por bandamento G. Microdelees e microduplicaes

foram investigadas por array-CGH. As informaes obtidas foram relacionadas aos

mapas fsicos do genoma humano e s caractersticas clnicas dos pacientes na busca de

genes candidatos.

25

III. PACIENTES E MTODOS

26

III. PACIENTES E MTODOS

III.1 Pacientes

Os indivduos selecionados para este estudo foram identificados como

portadores de rearranjos aparentemente equilibrados no Servio de Aconselhamento

Gentico do Laboratrio de Gentica Humana do Instituto de Biocincias da

Universidade de So Paulo (LGH-IB-USP), para onde foram encaminhados por

diferentes servios mdicos, para diagnstico e aconselhamento gentico. Para incluso

no estudo, os pacientes ou seus responsveis legais, foram informados sobre a pesquisa

e assinaram termo de consentimento livre e esclarecido. O projeto foi aprovado pelo

Comit de tica em Pesquisa em Seres Humanos do Instituto de Biocincias da

Universidade de So Paulo (Protocolo no 096/2009).

A amostra foi constituda de seis translocaes equilibradas, cinco delas no

herdadas e uma, segregando na famlia com o quadro clnico.

III.2 Mtodos

III.2.1 Estudo cromossmico

Preparaes cromossmicas

Para o estudo cromossmico, as preparaes foram obtidas a partir de culturas

temporrias de linfcitos de sangue perifrico, seguindo as tcnicas de rotina do

laboratrio. Os linfcitos contidos em 0,5 mL de plasma sanguneo foram cultivados

por 72 h, a 37oC em 4,5 mL de meio de cultura TC 199 (Invitrogen, Carlsbad, EUA),

complementado com soro fetal bovino 15% (Invitrogen), L-glutamina 1% (Sigma, Saint

Louis, EUA) e fitohemaglutinina 1% (Invitrogen). O tratamento com colchicina

(Sigma) na concentrao final de 0,0016% foi realizado nos 40 min finais do cultivo.

Para a hipotonizao, utilizou-se uma soluo de KCl (0,075 M) por 12 min a 37oC e

para a fixao, metanol:cido actico, 3:1. Parte do material foi conservada a 20C no

fixador e parte foi utilizada na preparao de lminas, que foram mantidas em estufa a

37oC, por sete a quinze dias e, ento, utilizadas para a aplicao da tcnica de

bandamento cromossmico GTG ou congeladas a 20C, para utilizao posterior em

experimentos de hibridao in situ.

27

Identificao dos rearranjos cromossmicos

Para a identificao dos rearranjos cromossmicos foi utilizada a tcnica de

bandamento GTG descrita por Seabright (1971), com modificaes. As lminas foram

tratadas com 2xSSC (cloreto de sdio 0,03 M e citrato trissdico 0,03 M, pH 7,0) por 15

minutos, a 60C. Em seguida foram lavadas em gua destilada e tratadas com soluo

de tripsina (1:250; Invitrogen) 0,025% em tampo fosfato Srensen (fosfato dissdico

0,03 M e fosfato monopotssico 0,03 M), pH 6,8, a 37C por tempo varivel de 10 s a

60 s, dependendo da idade da lmina. A seguir as lminas foram lavadas em gua

destilada e coradas por 3 a 6 min com soluo a 2% do corante de Giemsa (Merck), em

tampo fosfato, pH 6,8. As lminas foram lavadas em gua destilada e secas ao ar.

Mapeamento dos pontos de quebra

Para refinar o mapeamento dos pontos de quebra dos rearranjos cromossmicos

foi empregada a tcnica de hibridao in situ fluorescente (FISH). Foram utilizados

como sondas segmentos cromossmicos clonados em cromossomos artificiais de

bactrias (BAC). O laboratrio possui um conjunto de sondas de todos os cromossomos

humanos. Uma parte foi obtida do CHORI (BACPAC Resourses, CHORI - Childrens

Hospital Oakland Research Institute). Outras sondas clonadas em BAC fazem parte do

conjunto utilizado para a confeco de um 1Mb-array produzido pela Dra. Carla

Rosenberg, no Leiden University Medical Centre; esses clones foram cedidos pelo

Wellcome Trust Sanger Institute, UK; informaes sobre esse conjunto de clones esto

disponveis no Ensembl. Algumas sondas clonadas em BAC foram obtidas da

Invitrogen. De acordo com os pontos de quebra mapeados por bandamento G, as sondas

foram selecionadas para os experimentos de FISH com base nos mapas obtidos nos

bancos de dados Ensembl, National Center for Biotechnology Information (NCBI) e

University of California, Santa Cruz - Genome Browser (UCSC).

As bactrias com os clones de interesse foram cultivadas em meio LB (1%

bactotriptona; 0,5% extrato de levedura; 1% NaCl; pH 7,5), contendo o antibitico para

seleo de bactrias resistentes com os segmentos de interesse. Para a extrao dos

clones, utilizou-se o kit IllustraTM

PlasmidPrep Mini Spin (GE Healthcare, New Jersey,

EUA). As sondas foram marcadas por nick translation com biotina ou digoxigenina por

meio, respectivamente, da incorporao dos nucleotdeos Bio-16-dUTP ou Dig-11-

dUTP, utilizando os kits de marcao Biotin-Nick Translation Mix ou Dig-Nick

Translation (ambos da Roche Applied Science, Manheim, Alemanha), conforme

28

instrues do fabricante. As sondas foram desnaturadas a 95oC em meio de hibridao

(50% formamida, e 10% dextran sulfato, em 2xSSC). A supresso de sequncias

repetitivas foi feita com DNA humano Cot-1 (Invitrogen). O DNA dos cromossomos foi

desnaturado em 70% formamida/2xSSC a 72C. A hibridao foi realizada em cmara

mida por 48 a 72 horas a 37oC. Para a deteco das sondas marcadas com biotina,

utilizamos avidina conjugada a FITC e para a deteco de sondas marcadas com

digoxigenina, utilizamos anti-digoxigenina conjugada a rodamina. As lminas foram

montadas em Vectashield Mouting Medium (Vector Laboratories, Califrnia, EUA)

contendo o corante DAPI (0,8 g/mL) (Sigma, Saint Louis, EUA). A anlise foi

realizada em microscpio de fluorescncia Axiophot 2 (Carl Zeiss, Alemanha). Para a

documentao, as imagens foram capturadas por cmara de CCD e processadas,

utilizando-se o software ISIS (MetaSystem, Alemanha).

III.2.2 Busca de microdelees e duplicaes

A presena de desequilbrios genmicos submicroscpicos foi investigada pela

tcnica de array-CGH. Utilizamos nesse estudo a plataforma Human Genome CGH

Microarray Kit 2x105A (Agilent Technologies, Califrnia, EUA). No estudo de dois

pacientes foi utilizado o SurePrint G3 Human CGH 8x60K (Agilent Technologies,

Califrnia, EUA). O primeiro desses oligoarrays contm duas reas com

aproximadamente 105.000 oligonucleotdeos de 60 pb e o segundo contm oito reas

com aproximadamente 60.000 oligonucleotdeos de 60 pb. Os procedimentos de

purificao das amostras, hibridao e lavagem foram realizados conforme descrito pelo

fabricante (Agilent Technologies), com modificaes. Na etapa de digesto do DNA

genmico, para a plataforma de 105A, foram utilizados 800 ng de DNA, em volume

final de 22 L de reao contendo 5 U de cada uma das enzimas Alu I e Rsa I, 1,7 g de

BSA (albumina de sangue bovino) e Buffer C 10X (10% do volume final). Para a

plataforma 60K, foram utilizados 500 ng de DNA genmico, em volume final de 13 L

de reao, contendo 5 U de cada uma das enzimas Alu I e Rsa I, 1,0 g de BSA e Buffer

C 10X (10% do volume final). As amostras foram digeridas por duas horas a 37C em

estufa, seguida da inativao das enzimas por 20 min a 65C. Para a marcao das

amostras foram utilizados os kits Fluorescent Labelling System (BlueGnome,

Cambridge, UK), para a plataforma de 105A e Agilent Labelling mix (Agilent

Technologies), para a plataforma 60K. Os procedimentos e quantidades de cada

29

reagente seguiram as instrues dos fabricantes dos kits. Em resumo, foram adicionados

random primers reao da digesto, seguindo-se desnaturao do DNA por cinco

minutos a 95C e incubao em gelo por cinco minutos. Para a marcao, foi adicionada

uma mistura contendo tampo, dNTP, Cy3-dCTP (para a amostra teste) ou Cy5-dCTP

(para a amostra referncia) e enzima Klenow. As amostras foram mantidas por duas

horas a 37C em estufa, procedendo-se em seguida inativao da enzima por 10 min a

65C. As amostras marcadas foram purificadas, utilizando-se o kit IllustraTM

ProbeQuantTM

G-50 Micro Columns (GE Healthcare), de acordo com o protocolo do

fabricante. Nas amostras analisadas na plataforma 60K, foram adicionados 25 L de

TE, antes da etapa de purificao. A quantificao do DNA genmico marcado e a

atividade especfica dos fluorocromos Cy3-dCTP e Cy5-dCTP foi determinada no

espectrofotmetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies). Para a etapa de

precipitao 50 L do DNA teste (marcado com Cy3) e 50 L do DNA referncia

(marcado com Cy5) foram adicionados a 5 g (plataforma de 60K) ou 25 g

(plataforma 105A) de Human Cot-1 DNA (Invitrogen), para o volume final de 105 L

(plataforma 60K) ou 125 L (plataforma 105A). Em seguida, foram adicionados NaAc

(3 M, pH 5,0; 10% do volume final) e etanol 100% gelado (2,5X o volume final). As

amostras foram precipitadas por 15 min a -80C ou por duas horas a -20C. Aps

centrifugao a 13.200 rpm, por 15 min a 4C, adicionou-se etanol 70% gelado s

amostras e procedeu-se a centrifugao por mais cinco minutos a 13.200 rpm,

descartando-se o sobrenadante. Seguiu-se nova centrifugao por um minuto,

descartando-se o sobrenadante. O DNA marcado foi ento ressuspendido em TE

previamente aquecido a 72C e mantido por cinco minutos a 72C, seguindo-se nova

ressuspenso em vrtex. Foram adicionadas as solues blocking solution 10X e

hybridization buffer 2X e procedeu-se desnaturao por trs minutos a 95C e 30 min

a 37C, em banho-maria. Adicionou-se todo o volume das amostras s lamelas da

lmina de suporte do microarray e colocou-se a lmina de microarray sobre ela. As

amostras foram ento hibridadas a 65C por 16-48 h. A lmina de microarray foi

mergulhada em Buffer 1 por cinco minutos, depois em Buffer 2 (previamente aquecido a

37C) por um minuto, seguindo 10 s em acetonitrila (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) e

30 s em Stabilization Drying Solution. As imagens do array obtidas com o Agilent

High-Resolution Microarray scanner, foram processadas e analisadas, utilizando o

pacote de programas Feature Extraction e Agilent Genomic Workbench (ambos da

30

Agilent Technologies), usando o algoritmo estatstico ADM-2 e limiar de sensibilidade

6,7. Apenas as alteraes abrangendo no mnimo trs oligonucleotdeos consecutivos

com razo log2 alterada foram consideradas pelo programa como possvel alterao no

nmero de cpias de determinado segmento genmico. Usando esses critrios, os

tamanhos mnimos das CNV detectadas pelas plataformas 60K e 105A so de,

respectivamente, 100-160 Kb e 60-90 Kb.

As alteraes de nmero de cpias identificadas nos pacientes foram

comparadas s variaes documentadas no banco de dados Database of Genomic

Variants (DGV), que compila as CNV presentes em amostras de indivduos normais.

Foram comparadas tambm s informaes do Database of Chromosomal Imbalances

and Phenotype in Humans using Ensembl Resources (DECIPHER), que documenta

desequilbrios genmicos identificados em indivduos afetados por diferentes

patologias. No caso de deteco de variantes consideradas nicas ou raras, a validao

do resultado foi feita por FISH. Uma vez confirmada, a alterao foi investigada em

outros membros da famlia, normais ou afetados.

III.2.3 Padro de inativao do cromossomo X

Determinamos o padro de inativao do cromossomo X em linfcitos de sangue

perifrico da paciente portadora de translocao t(X;22), com base na metilao do gene

AR e tambm citologicamente em metfases, aps incorporao de 5-BrdU.

Metilao do gene AR

O estudo do padro de inativao foi realizado, analisando-se a metilao da

repetio polimrfica CAG do gene AR (Androgen Receptor Gene; Xq11-12), conforme

descrito por Allen et al. (1992), com modificaes. Prximo repetio CAG existe um

stio de restrio da enzima Hpall, que se encontra metilado apenas no X inativo. A

anlise do padro de inativao do cromossomo X realizada amplificando-se a

repetio CAG a partir de DNA genmico submetido ou no a digesto com a enzima

HpaII. Como a enzima HpaII apenas corta os stios de restrio desmetilados, ou seja

dos alelos do gene AR localizados no cromossomo X ativo, esses alelos no so

amplificados. Duas amostras de 1.000 ng de DNA foram tratadas simultaneamente: uma

amostra foi submetida digesto com 20 U da enzima Hpall (Invitrogen), em volume

final de 20 l de reao, por 16 h a 37C; aps a digesto, a enzima foi inativada,

incubando-se as amostras a 95C for cinco minutos; a outra amostra foi incubada, na

31

ausncia da enzima Hpall. A amplificao foi realizada em um volume de 30 l de

reao de PCR com quatro l do produto digerido ou no digerido, 1,5 U de Taq

polymerase, Buffer 1X, 250 M de cada deoxiribonucleotdeo, 2,5 mM MgCl2, 10%

DMSO e 15 pmoles de cada primer (forward-FAM: 5 gct gtg aag gtt gct gtt cct cat 3 e

reverse: 5 tcc aga atc tgt tcc aga gcg tgc 3). As condies de ciclagem foram um ciclo

de 95C (cinco min), 28 ciclos de 95C (45 s), 60C (30 s), 72C (30 s), extenso final a

72C (10 min). Os produtos da amplificao foram submetidos eletroforese no

aparelho ABI 310 DNA Analyzer e analisados com o software GeneMapper (Applied

Biosystems,Califrnia, EUA). A razo de inativao foi determinada utilizando-se os

valores dos picos de amplificao dos alelos digeridos e no digeridos:

(phd1/phu1)/(phd1/phu1)+(phd2/phu2), em que phd1 = alelo menor aps digesto,

phu1 = alelo menor no digerido, phd2 = alelo maior aps digesto e phu2 = maior alelo

no digerido (Bittel et al., 2008).

Incorporao de 5-BrdU

O padro de inativao do cromossomo X foi analisado em metfases de

linfcitos de sangue perifrico, aps incorporao de 5-bromodesoxiuridina (5-BrdU,

Sigma), seguida de colorao com acridina laranja. O tratamento com 5-BrdU, na

concentrao final de 200 g/mL, foi realizado nas sete horas finais de cultivo dos

linfcitos. Aps serem mantidas em estufa a 37C, por sete a quinze dias, as lminas

com o material foram submetidas a banhos de etanol (90%, 70% e 50%), lavadas com

gua destilada e secas ao ar. Em seguida foram cobertas por um filme de acridina

laranja (0,5 mg/mL em tampo fosfato) por 20 min. Aps serem lavadas com gua

destilada e secas ao ar, as lminas foram montadas em tampo fosfato, pH 6,8. A anlise

foi realizada em microscpio de fluorescncia Axiophot 2 (Carl Zeiss). Os

cromossomos X normal e translocado foram identificados com base em sua morfologia

e padro de bandas R. Para a documentao, as imagens foram capturadas por cmera

CCD e processadas utilizando-se o software ISIS (MetaSystem, Alemanha).

32

IV. RESULTADOS E DISCUSSO

33

IV. RESULTADOS E DISCUSSO

IV.1 Translocaes cromossmicas que provavelmente afetam a expresso do gene

SOX9

IV.1.1 Translocao t(7;17)(p13;q24)

Aspectos Clnicos

A paciente foi encaminhada ao Servio de Aconselhamento Gentico do LGH-

IB-USP, aos 12 anos de idade, por apresentar baixa estatura (136,5 cm; 3o percentil),

atraso na idade ssea e anormalidades esquelticas que incluam escoliose

toracolombar, 11 pares de vrtebras torcicas, deformidades do trax e da cintura

escapular consequentes a hipoplasia dos arcos costais superiores (principalmente dos

primeiros quatro pares). O desenvolvimento intelectual era normal para a idade. Seus

pais eram clinicamente normais. Nasceu a termo, aps cesariana, devido a apresentao

plvica. Nos primeiros seis anos de vida, teve bronquites recorrentes.

A anlise cromossmica, aps bandamento G, revelou uma translocao

recproca aparentemente equilibrada entre o brao curto do cromossomo 7 e o brao

longo do cromossomo 17 - t(7;17)(p13;q24) (Figura 4). O exame cromossmico de seus

pais revelou caritipos normais.

FIGURA 4. t(7;17)(p13;q24): Ideograma (ISCN 2009; caritipo com 550 bandas G) dos

cromossomos 7, 17 e dos derivativos der(7) e der(17). As setas indicam os pontos de quebra mapeados

aps bandamento G.

34

Mapeamento dos pontos de quebra da t(7;17) por FISH

Realizamos a hibridao in situ fluorescente de clones de BAC mapeados nas

regies dos pontos de quebra determinados pela anlise aps bandamento G (Tabelas 2

e 3). O ponto de quebra do cromossomo 7 foi mapeado entre os clones RP11-256F18

(chr7:42,933,463-43,097,151, Human GRCh36 Assembly, hg18) e RP5-1032B10

(chr7:43,150,215-43,272,694), um segmento de 53 kb (chr7:43,097,151-43,150,215)

(Figura 5). No cromossomo 17 o ponto de quebra foi localizado no clone RP11-261A13

(chr17:66,711,133-66,856,750), com sinais de hibridao nos cromossomos der(17) e

der(7), neste ligeiramente maior (Figura 6A). O clone RP11-1087C16

(chr17:66,654,574-66,827,652), que se sobrepe quase totalmente ao RP11-261A13,

tambm contm o ponto de quebra (Figura 6A). O clone RP11-433D1

(chr17:66,773,681-66,947,354), que se sobrepe mais distalmente ao clone RP11-

1087C16, mostrou sinal de hibridao apenas no cromossomo der(7) (Figura 6A). Esses

resultados permitiram delimitar o ponto de quebra no cromossomo 17 em um segmento

de 62 kb (chr17: 66,711,133-66,773,681, hg18) (Figura 6B).

Investigao de perdas e ganhos de segmentos submicroscpicos por a-CGH

A anlise por a-CGH, usando a plataforma 105A (Agilent), no detectou

desequilbrios submicroscpicos associados ou no aos pontos de quebra.

Genes mapeados nos segmentos dos pontos de quebra

No cromossomo 7, o gene HECW1 (HECT, C2 and WW domain containing E3

ubiquitin protein ligase 1) est no segmento delimitado para a quebra e pode ter sido

interrompido. O gene codifica uma ligase de ubiquitina E3 que detectada principalmente em

tecidos neurais. Miyazaki et al. (2004) mostraram que a protena HECW1 liga-se protena

mutante SOD1, que responsvel pela morte de neurnios motores caracterstica da esclerose

lateral amiotrfica (ALS; MIM 105400). Os autores sugerem que a protena atue no controle d

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