CARACTERIZAO DE SUBSTNCIAS FENLICAS DE

RESDUOS DE FRUTOS AMAZNICOS E AVALIAO

PARA O USO BIOTECNOLOGICO

KLENICY KAZUMY DE LIMA YAMAGUCHI

MANAUS 2015

UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

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KLENICY KAZUMY DE LIMA YAMAGUCHI

CARACTERIZAO DE SUBSTNCIAS FENLICAS DE

RESDUOS DE FRUTOS AMAZNICOS E AVALIAO

PARA O USO BIOTECNOLOGICO

Orientador: Prof. Dr Valdir Florncio da Veiga Junior

Co-orientador: Prof. Dr Emerson Silva Lima

MANAUS 2015

Tese apresentada Coordenao do

Programa de Ps-Graduao em

Qumica da Universidade Federal do

Amazonas, como requisito para a

obteno do ttulo de Doutora em

Qumica, rea de concentrao

Qumica Orgnica.

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iv

Ficha catalogrfica

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RESUMO

A utilizao de produtos naturais vem aumentando consideravelmente nos ltimos anos devido s atividades biolgicas relacionadas sua composio qumica. Porm, um entrave para as pesquisas a quantidade de matria prima disponvel para a produo em larga escala. Paralelo a isso, o consumo de frutas amaznicas vem conquistando espao nos mercados nacional e internacional e os resduos das indstrias de polpa esto crescendo proporcionalmente. Verifica-se que pouco conhecido sobre a composio qumica desses subprodutos gerados e das atividades biolgicas de seus extratos possam ter, sendo estes geralmente descartados em grandes quantidades, resultando em problemas ambientais e econmicos. No presente estudo analisou-se a composio dos extratos fenlicos de 19 frutos amaznicos, avaliando-se as atividades antioxidantes, bem como inibio enzimtica, e antimicrobiana visando o uso biotecnolgico. Os extratos mais promissores foram analisados de forma mais detalhada por meio da deteco e identificao das substncias em tcnicas cromatogrficas e espectromtricas. As amostras foram gentilmente cedidas em diferentes cidades da regio norte (Belm e Coari) e extradas em etanol e etanol:gua. As atividades antioxidante, citotxica, enzimtica, antimicrobiana e fotoprotetora foram analisadas por diferentes tcnicas qumicas e em clulas. Os extratos analisados neste estudo, obtidos como subprodutos da extrao das polpas demonstram-se fontes de substncias fenlicas e flavonodicas, alm de possurem significativas atividades biolgicas com baixa citotoxicidade, destacando-se os resduos de aa, bacuri e piqui. Os extratos de piqui apresentaram alta capacidade antioxidante, superior ao padro quercetina, tanto nos testes in vitro, com CS50 de 7,810,34 m.mL-1 para DPPH, e 3,930,12 m.mL-1 para ABTS, quanto em clula (70,69 2,77%, 79,89 6,50% e 79,48 8,6% paras cascas, polpas e sementes, respectivamente), bem como potencial para atividade antiinflamatoria. Os extratos de diferentes aas (Euterpe precatoria e Euterpe oleracea) e os extratos de bacuri (exocarpo e mesocarpo de Platonia insignis) foram otimizados quanto metodologia e o melhor solvente de extrao. Os extratos obtidos por macerao a frio e a quente com etanol apresentaram o melhor poder extrator das substncias fenlicas, comparados com os extrados em ultrasson. De forma geral, as metodologias testadas apresentaram diferentes propores das substncias, porm o mesmo perfil. A caracterizao dos extratos foi realizada por espectrometria de massas, utilizando tcnicas bidimensionais, com ionizao DESI e CLAE. O extrato das sementes de E. oleracea e E. precatria apresentaram perfis diferentes do que comumente relatado para a polpa, destacando a presena de procianidinas, flavonoides e fenlicos como crisoeirol, cido cafeico e cido cumrico. Foram detectados mais de 50 ons em cada um dos extratos. No extrato do mesocarpo de P. insignis foram 71, onde detectou-se a presena de ons de flavonoides, procianidinas e isoflavonoides. Nos extratos de cascas de Caryocar villosum foram detectados e quantificados a presena de cido elgico (1873,63 63,12 g.g-1) e cido glico (1712,62 56,79 g.g-1) como os constituintes majoritrios. Este estudo abre a perspectiva de agregar valor ao que considerado descarte, devido composio qumica e s atividades biolgicas encontradas, diminuindo assim a contaminao ambiental por resduos e contribuindo para a utilizao sustentvel de matrias primas amaznicas.

Palavras-chave: frutos amaznicos, resduos, fenlicos, DESI.

vi

ABSTRACT

The use of natural products has increased in recent years because the biological activities related to its chemical composition. However, an obstacle to research is the amount of raw material available for large-scale production. Parallel to this, the consumption of Amazonian fruits has gained space in national and international markets and waste from pulp industries are growing proportionally. It appears that little is known about the chemical composition of these products generated and the biological activity of its extracts may have, which are usually discarded in large quantities, resulting in environmental and economic problems. In the present study we analyzed the composition of phenolic extracts of 19 fruits Amazon, evaluating the antioxidant activity, antimicrobial and enzyme inhibition aiming to biotechnological use. The most promising extracts were analyzed by means of the detection and identification of substances in chromatographic and spectrometric techniques. The samples were kindly provided in different cities of the Amazon northern region (Belem and Coari). Extracts were obtained in ethanol and ethanol: water. The antioxidant, cytotoxic, enzyme, antimicrobial and photoprotective activities were analyzed by different techniques: chemistry and in cell. The extracts analyzed in this study, obtained as by-products of the extraction of the pulp showed up sources of phenolic substances and flavonoidics, besides having significant biological activity with low cytotoxicity, highlighting the acai, bacuri and piquia waste. Piquia shell extracts showed free radicals scavenger capacity of ABTS (CS50: 3.93 0.12 g.mL-1) and DPPH (CS50: 7.81 0.34 g.mL-1), in cellular assays, with percentages of 70.69 2.77%, 79.89 6.50% and 79.48 8.6% for shell, pulp and seed extracts, respectively, low cytotoxicity in human fibroblasts, but high at tumor strains, and also a high anti-inflammatory potential observed by the inhibition of nitric oxide production. Different extracts of the aa (Euterpe oleracea and Euterpe precatoria) and bacuri extracts (exocarp and mesocarp of the Platonia insignis) have been optimized on the methodology and the best solvent extraction. The extracts obtained by cold and hot maceration with ethanol showed most efficient than ultrasound method. Methodologies analysed showed different proportions of the substances, but the same profile. The characterization of the extracts was performed by mass spectrometry using two-dimensional techniques, DESI ionization and HPLC. The extract of E. oleracea and E. precatoria seeds presented different profiles than is commonly reported to the pulp, highlighting the presence of procyanidins, flavonoids and phenolic as crisoeirol, caffeic and coumaric acid. More than 50 ions were detected in each of the extracts. P. insignis mesocarp was 71, which detects the presence of ions flavonoids, isoflavones and procyanidins. In extracts of Caryocar villosum shells were detected and quantified the presence of ellagic acid (1873.63 63.12 g.g-1) and gallic acid (1712.62 56.79 g.g-1) as the compounds major. This study opens the possibility of value adding to what is considered waste due to the chemical composition and biological activities found, thereby reducing environmental pollution by waste and contributing to the sustainable use of Amazonian raw materials.

Keywords: Amazonian fruits, waste, phenolic, DESI.

vii

APOIO FINANCEIRO

Este trabalho foi realizado no Laboratrio de Qumica de Biomolculas do

Amazonas (Q-BIOMA) no Departamento de Qumica , Laboratrio de Extresse

Oxidativo na Faculdade de Cincias Farmacuticas e Laboratrio de Estatstica

(LABEST) na UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS (Manaus-AM) e no Mass

Spectrometry Laboratory (IFAs Lab) na York University em Toronto (Canad), com

apoio financeiro das seguintes Agncias de Fomento:

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES);

Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq);

Fundao de Amparo Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM).

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A vida, como a fizeres,

estar contigo em

qualquer parte.

Chico Xavier

Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes, Mas no esqueo de que minha vida a maior empresa do mundo E que posso evitar que ela v falncia. Ser feliz reconhecer que vale a pena viver Apesar de todos os desafios, incompreenses e perodos de crise. Ser feliz deixar de ser vtima dos problemas e Se tornar um autor da prpria histria atravessar desertos fora de si, mas ser capaz de encontrar um osis no recndito da sua alma agradecer a Deus a cada manh pelo milagre da vida. Ser feliz no ter medo dos prprios sentimentos. saber falar de si mesmo. ter coragem para ouvir um No!!! ter segurana para receber uma crtica, Mesmo que injusta

Pedras no caminho?

Guardo todas, um dia vou construir um castelo Fernando Pessoa

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Dedico esta tese minha amada

me, Auxiliadora Yamaguchi por

todo o exemplo, carinho e amor

destinados a mim. Ela que abriu mo

da minha companhia em prol da

minha educao, sempre esteve

presente em minha vida. Dedico-a

todas as vitrias conquistadas ao

longo dos anos.

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AGRADECIMENTOS

O doutorado um momento em que o tempo passa muito rpido, acompanhado de disciplinas, experimentos e prazos e o que acreditvamos que demorariam meses, na verdade no passam de alguns momentos que rapidamente chegam ao final. Devido a isso, acredito que a todo o momento devemos agradecer e dar valor s pessoas que esto ao nosso redor, pois no sabemos quanto tempo ficaro presentes na nossa vida. Os ensinamentos adquiridos durante todos esses 48 meses no podem ser mensurados nem expressos apenas nos resultados e discusso deste trabalho. Na tentativa de demonstra-los, eis meus agradecimentos:

A Deus por tantas bnos concedidas ao longo da minha vida. A todas as oportunidades que tive de crescer como pessoa e da fora nos momentos mais difceis, sempre demonstrando sinais de Seu infinito amor e de Suas orientaes, confortando meu corao e colocando na minha vida pessoas que fazem a diferena;

minha famlia, alicerce fundamental no decorrer dessa caminhada, em especial, a meus amados pais Katsuo e Auxiliadora Yamaguchi por terem me dado uma base de educao, carter e amor. Vocs so a rvore e eu, apenas um fruto que reflete a criao que vocs deram para a nossa famlia. Certamente no seria possvel sem a ajuda de vocs chegar at aqui! E olha que apenas o comeo...

Aos meus amados irmos, Kenne e Kendy Yamaguchi, que mesmo estando em Coari (assim como toda a famlia) sempre estiveram perto de mim me dando fora para continuar seguindo em frente e compartilhando os mais diversos momentos durante o doutorado. Aos manos Willian e Gssica, e meus cunhados David, Antnia e Miro Yamaguchi por me apoiarem e sempre terem palavras de conforto e incentivo;

A minha madrinha Mariza e tia Nely pelo carinho e cuidado recebido. Aos meus tios e primos por sempre torcerem por mim e pela energia positiva que vocs enviaram (e enviam) me dando fora em todas as situaes;

Aos meus amigos antigos, Enio, Daiana Ges e Leandro. Nessa correria que o doutorado, vocs sempre estiveram comigo. As ligaes, mensagens e visitas me fortaleceram e fizeram com que eu sempre me sentisse amada;

Ao querido Leonardo Florisbal pela fora, pacincia e compreenso nos momentos em esse trabalho ocupou a maior parte do meu tempo. Obrigada pelo companheirismo, incentivo e amor dedicado. Voc a sorte que a vida me deu.

s lindas Joelma Alcntara, Lidiam Maia e Priscilla Oliver, que mesmo no estando mais to perto, se fazem presente sempre! Vocs so o presente que Deus me deu. Eu no teria como selecionar to bem pessoas to especiais como vocs. Os conselhos, os incentivos, as brincadeiras e os momentos de descontrao foram situaes que guardarei para sempre. Obrigada pelos valorosos momentos;

Milena Campelo, pelo companheirismo e amizade nessa trajetria cheia de pedras, que nem sempre lembramos que fazem parte do castelo;

Ao parceiro de todas as coletas e de inmeras dificuldades... Victor Lamaro;

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Aos meninos Isadora Mota, Yasmin Cunha, Alanne, Larissa, Priscila, Leandro, Dbora Raquel e Felipe Ravazi, meus filhos de corao; A Olinda, Frederico, Rosiane, Rosilene, Alcilene, Marcos Tulio, Nilma, Jesika, Orlando pelo companheirismo e amizade nos momentos descontrados no laboratrio.

Ao professor Valdir Veiga pelo carinho, confiana e incentivo nos momentos em que to difcil conseguir ver os motivos que nos levam a trajetria de um caminho...principalmente quando pensamos que no termos mais fora para percorre-lo. Por ser muito mais que um orientador, por ser meu padrinho (literalmente!). Sempre com seu ombro amigo, seu abrao acolhedor e seus valorosos conselhos me acompanhando desde a iniciao cientfica. Realmente fazer cincia no fcil, mas um dia eu aprendo!

Ao grupo de pesquisa Q-Bioma como um todo, a todos os membros. Somos

uma famlia cientfica e mesmo com todas as diferenas, a unio e o respeito

sempre prevalecero.

Aos professores Afonso Duarte e Rita Nunomura pela amizade, carinho, valorosos conselhos e incentivos. Vocs moram no meu corao. Obrigada por estarem na minha vida. Aos professores Roberto Castilho, Genilson Santana e Marcos Batista

Ao laboratrio de Estatstica Labest, em especial ao prof. Max Lima e David Dias pela ateno e pacincia nas orientaes das anlises estatsticas.

Aos queridos Rodrigo, Lucileno, Arleilson e Patrcia por todo o acolhimento e pelo companheirismo na Faculdade de Farmcia; professora Marne Vasconcellos pelo incentivo dado a cada Bom dia e em cada vistoria que era feita no final da tarde da FCF;

Ao professor Emerson Silva que me tirou da zona de conforto e acreditou no meu trabalho. Muito obrigada por todo o incentivo no decorrer desses anos. Ser sua orientanda trouxe ensinamentos que vou levar comigo pra onde eu for;

Ao professor Demian Rocha Ifa pela grande oportunidade de aprendizado durante todo o doutorado sanduiche. Cada caf compartilhado foi sinnimo de muito aprendizado. Obrigada pelo exemplo de humildade e profissionalismo que recebi todo o tempo que estivesse ao seu lado.

Aos companheiros do doutorado sanduiche Paulo Yamasaki e Consuelo Perez pela amizade e recepo...

Em especial, querida Alessandra Tata e Michel Campos que fortaleceram a minha tese de que existem pessoas boas em qualquer lugar do mundo, dispostas a auxiliar sem intenses. Obrigada por todo o apoio e incentivo. Espero um dia poder ajudar algum assim como vocs me auxiliaram e passar esse ensinamento de bondade para frente.

Aos queridos primos Iara Ganzer e Marcelo Apolinario pelo companheirismo e amizade. No h como agradecer em algumas palavras todo o carinho que sinto. Somente Deus, com todo o seu amor, poderia me dar a oportunidade de convvio e aprendizado que tive durante o tempo que morei com vocs;

A caminhada longa, mas os passos j esto sendo dados...

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Sementes de (A) E. precatoria e (B) E. oleracea...............................................13

Figura 2: Estrutura qumica de substncias isoladas de cascas de bacuri.......................15

Figura 3: Substncias qumicas detectadas e/ou isoladas de piqui................................17

Figura 4: Padro de oxidao tpicos das vias metablicas. A: via do acetato e B) via do

cido chiqumico...............................................................................................................19

Figura 5: Exemplo da biossntese de fenlicos oriundos da via do acetato. ...................19

Figura 6: Formao do cido chiqumico..........................................................................20

Figura 7: Estrutura bsica dos flavonoides.......................................................................21

Figura 8: biossntese geral dos flavonoides......................................................................22

Figura 9: Estrutura qumica do cido hialurnico..............................................................26

Figura 10: Representao esquemtica do poder de penetrao da radiao solar nas

camadas da pele...............................................................................................................27

Figura 11: Exemplos de substncias qumicas utilizadas como filtros solares em (A) UVB,

(B) UVA e (C) amplo espectro. .......................................................................................28

Figura 12: ciclo oxidativo do ascorbato.............................................................................31

Figura 13: Estruturas qumicas de antioxidantes fenlicos...............................................32

Figura 14: Modelo de ionizao por electrospray.............................................................36

Figura 15: Esquema de seleo do on precursor e de sua formao..............................37

Figura 16: Fonte de ionizao do tipo DESI. A) Ilustrao do processo e B)

Espectrmetro de massa com DESI. ...............................................................................38

Figura 17: Reduo do radical livre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil a 1,1-difenil-2-

picrilhidrazila.....................................................................................................................45

Figura 18: Estabilizao do radical ABTS+ por um antioxidante.......................................46

Figura 19: Formao do formazan a partir do NBT...........................................................47

Figura 20: Frutos amaznicos...........................................................................................63

Figura 21: Microfotografia de extrato seco por asperso de Maytenus ilicifolia 500 e

2000x ...............................................................................................................................66

xiii

Figura 22: Extrato de carambola seco por asperso........................................................66

Figura 23: Atividade antimicrobiana pelo mtodo de difuso...........................................74

Figura 24: Ilustrao da anlise da CIM dos extratos......................................................76

Figura 25: Espectro de absoro dos extratos de resduos em concentrao de 1,00

mg.mL-1.............................................................................................................................92

Figura 26: Espectro de absoro dos extratos diludos em 1,00 mg.mL-1, 0,50 mg.mL-1 e

0,25 mg.mL-1.....................................................................................................................93

Figura 27: Espectro do perfil das extraes de BAE por espectrometria de

massas........................................................................................................................... 123

Figura 28: cido cafico..................................................................................................125

Figura 29: Espectro do perfil das extraes de BAM por espectrometria de

massas........................................................................................................................... 126

Figura 30: Estrutura das substncias correspondentes aos ons moleculares detectados

nos extratos de BAM.......................................................................................................128

Figura 31: Espectro do perfil das extraes de E. precatoria por espectrometria de

massas............................................................................................................................129

Figura 32: Estrutura das substncias com massas caractersticas de picos detectados

nas extraes de E. precatria.......................................................................................131

Figura 33: Espectros do perfil das extraes de E. oleracea por espectrometria de

massas............................................................................................................................132

Figura 34: Imagem ptica em em HPTLC-UV de compostos de extrato de E. precatoria

100 mg/mL. (A) Imagem aps a eluio com a mistura de solvente I para cima. (B)

Imagem aps a eluio utilizando a mistura de solventes I para cima seguido de eluio

usando mistura de solventes II para a direita. ......134

Figura 35: Ilustrao da localizao dos ions detectados por DESI-MS da placa de

HPTLC 2D. (A) modo positivo. (B) Modo negativo. .....135

Figura 36: ons detectados por DESI-EM de E. precatoria..136

xiv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Atividades biolgicas de espcies de Euterpe.................................................12

Tabela 2. Esqueleto bsico de alguns compostos fenlicos............................................18

Tabela 3: Nome cientfico, partes utilizadas e as datas da obteno do material...........42

Tabela 4: Rendimento dos extratos (%)...........................................................................64

Tabela 5: Inibio enzimtica dos extratos......................................................................68

Tabela 6: Percentagem de inibio das enzimas teciduais dos extratos.........................72

Tabela 7: Lista dos microorganismo testados..................................................................73

Tabela 8: Atividade antimicrobiana dos extratos..............................................................74

Tabela 9: Critrio de avaliao da atividade antimicrobiana............................................75

Tabela 10: Valores das concentraes inibitrias mnimas dos extratos........................76

Tabela 11: Resumo dos testes espectrofotomtricos dos extratos hidroalcoolicos (6:4

etanol:gua), na proporo 10% (m/v).............................................................................81

Tabela 12: Resumo dos testes espectrofotomtricos dos extratos em etanol, na

proporo 10% (m/v).......................................................................................................82

Tabela 13: Percentagem da atividade antioxidante em linhagem celular dos extratos em

concentrao de 20 g/mL...............................................................................................87

Tabela 14. Perfil de absoro de extratos hidroalcolicos e etanlicos na concentrao

1,00 mg.mL-1.....................................................................................................................91

Tabela 15: Resultados das anlises de otimizao das sementes de E. oleraceae......102

Tabela 16: Matriz de correlao dos erros referentes as variveis respostas das

extraes de sementes de E. oleraceae........................................................................103

Tabela 17: ANOVA para os valores dos rendimentos, fenlicos e flavonoides dos

extratos dos resduos de nos fatores mtodo de extrao e solvente. Efeitos com valor-p

< 0,05 so considerados significativos; gl = grau de liberdade; SQ = soma de quadrados;

QM = quadrado mdio....................................................................................................103

Tabela 18: Rendimento dos diferentes parmetros dos mtodos de extrao de E.

oleraceae. Interaes com letras iguais no diferem significativamente entre si...........108

xv

Tabela 19: Resultados da quantificao da capacidade antioxidante dos melhores

parmetros dos mtodos de extrao............................................................................108

Tabela 20: Resumo dos resultados das anlises de otimizao de E.

precatria........................................................................................................................110

Tabela 21: Matriz de correlao dos erros referentes a E. precatoria...........................110

Tabela 22: Resumo dos resultados das anlises de otimizao de mesocarpo de P.

insignis............................................................................................................................114

Tabela 23: Matriz de correlao dos erros referentes ao Bacuri amarelo

(mesocarpo)....................................................................................................................115

Tabela 24: Resumo dos resultados das anlises de otimizao do epicarpo de

bacuri..............................................................................................................................118

Tabela 25: Matriz de correlao dos erros referentes ao Bacuri amarelo

(endocarpo).....................................................................................................................118

Tabela 26: Intensidade dos picos majoritrios (m/z) das extraes de

BAE.................................................................................................................................124

Tabela 27: Percentual da intensidade dos picos majoritrios das extraes de BAM por

espectrometria de massas..............................................................................................127

Tabela 28: Percentual da intensidade dos picos majoritrios das extraes de E.

precatoria por espectrometria de massas.......................................................................130

Tabela 29: Percentual dos picos majoritrios das extraes de E. oleracea por

espectrometria de massas..............................................................................................133

Tabela 30: Sugesto das substncias presentes em Euterpe precatoria por

espectrometria de massas (DESI-EM)...........................................................................137

xvi

LISTA DE GRFICOS

Grfico 1: Brasil Variao do PIB e do mercado de cosmticos 2000 a 2011............8

Grfico 2: Espectro de absoro UV dos filtros (A) p-metoxicinamato de 2 etil-hexila e

(B) 1-(4-terc-butilfenil)-3-(4-metoxifenil)propano-1,2-dionaoxibenzona............................29

Grfico 3: Rendimento de extratos..................................................................................63

Grfico 4: Percentagem de inibio de -amilase em concentrao de 100 g.mL-1.....69

Grfico 5: Percentagem de inibio das enzimas digestivas em concentrao de 100

g.mL-1..............................................................................................................................71

Grfico 6: Percentual de fenlicos e flavonoides totais dos extratos..............................79

Grfico 7: Capacidade de varredura dos radicais ABTS dos extratos.............................83

Grfico 8: Capacidade de varredura dos radicais DPPH dos extratos............................84

Grfico 9: Atividade antioxidante pelo mtodo de -caroteno.........................................85

Grfico 10: Correlao da atividade antioxidante (DPPH) e fenois totais.......................86

Grfico 11: Percentagem da atividade antioxidante em linhagem celular dos extratos em

concentrao de 20 g/mL...............................................................................................88

Grfico 12: Percentual mdio de substncias extradas por cada resduo...................101

Grfico 13: Influencia do solvente nas metodologias para os resultados de A)

Rendimento; B) compostos fenlicos, C) antioxidante frente ao DPPH e D) em radical

ABTS de E. oleraceae....................................................................................................104

Grfico 14: Grfico de superficie de resposta para A) Rendimentos, B) fenlicos totais,

C) DPPH e ABTS de E. oleraceae..................................................................................105

Grfico 15: Interao solvente-mtodo no percentual dos rendimentos dos extratos

brutos das sementes de E. precatoria............................................................................111

Grfico 16: Grfico de interao solvente-mtodo dos extratos brutos das sementes de

E. precatria....................................................................................................................112

Grfico 17: Interao solvente-mtodo no percentual do rendimento dos extratos brutos

do mesocarpo de P. insignis...........................................................................................115

Grfico 18: Grfico de interao solvente-mtodo no percentual de fenis totais dos

extratos brutos do mesocarpo de P. insignis..................................................................116

Grfico 19: Grfico de interao solvente-mtodo no percentual de rendimento dos

extratos brutos do epicarpo de P. insignis......................................................................119

Grfico 20: Grfico de interao solvente-mtodo no percentual de fenis totais dos

extratos brutos do epicarpo de P. insignis......................................................................120

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LISTA DE SIGLAS

ABTS+ 2, 2-azinobis (3-etilfenil-tiazolina-6-sulfonato

Abs - Absorbncia

AcOEt - Acetato de etila

ANOVA Anlise de Varincia Univariada

BAE bacuri amarelo epicarpo

BAM bacuri amarelo mesocarpo

BIOPHAR I Laboratrio de Atividades Biolgicas e Farmacuticas I

CBM - Concentrao bactericida mnima

CC - Cromatografia em coluna

CCD - Cromatografia em camada delgada

CS50 - Concentrao do extrato necessria para decrescer a concentrao inicial em

50%

DPPH. 2,2-difenil-1-picrilhidrazila

CLAE-UV Cromatografia Lquida de Alta Eficincia com detector de Ultravioleta

CHCl3 - Clorofrmio

CIM - Concentrao inibitria mnima

CLAE Cromatografia lquida de alta eficincia

DMSO - Dimetilsulfxido

DPPH - 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

EM Espectrometria de massas

EtOH - Etanol

Hex Hexano

IV - Infravermelho

MeOH - Metanol

NP/PEG - Difenilaminoborato/polietileloglicol

MANOVA Anlise de varincia multivariada

MF macerao a frio

MQ macerao a quente

SON sonicao

UV - Radiao ultravioleta

UV-Vis - Ultravioleta-Visvel

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SUMRIO

1. INTRODUO.......................................................................................................01

2. OBJETIVOS...........................................................................................................04

2.1 OBJETIVO GERAL..............................................................................................05

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS................................................................................05

3. REFERENCIAL TERICO.....................................................................................06

3.1 FRUTOS AMAZNICOS E SEUS RESDUOS...................................................07

3.1.1 AA .................................................................................................................11

3.1.2 BACURI.............................................................................................................14

3.1.3 PIQUI..............................................................................................................16

3.2 FENOIS E FLAVONOIDES..................................................................................18

3.3 ATIVIDADES BIOLGICAS.................................................................................23

3.3.1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA........................................................................23

3.3.2 ATIVIDADE ENZIMTICA.................................................................................24

3.3.3 FOTOPROTEO............................................................................................27

3.3.4 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE............................................................................29

3.4 CARACTERIZAO QUMICA............................................................................34

3.4.1 ESPECTROMETRIA DE MASSAS DESI E ESI ............................................34

4. METODOLOGIAS.................................................................................................40

4.0 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL...................................................................40

4.1 MATERIAL VEGETAL E OBTENO DOS EXTRATOS....................................42

4.2 BIOENSAIOS.......................................................................................................44

4.2.1.1 AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE..............................................44

4.2.1.1 VARREDURA DO RADICAL 2,2-DIFENIL-1-PICRILHIDRAZIL (DPPH)......44

4.2.1.2 VARREDURA DO RADICAL ABTS+............................................................46

xix

4.2.1.3 SUPERXIDO................................................................................................46

4.2.1.4 SISTEMA CAROTENO / CIDO LINOLEICO................................................48

4.2.2 AVALIAO DO POTENCIAL FOTOPROTETOR...........................................48

4.2.3 ENSAIOS ENZIMTICOS...............................................................................49

4.2.3.1 ENZIMAS TECIDUAIS...................................................................................49

4.2.3.1.1 TIROSINASE...............................................................................................49

4.2.3.1.2 HIALURONIDASE.......................................................................................50

4.2.3.1.3 COLAGENASE............................................................................................50

4.2.3.2 ENZIMAS DISGESTIVAS...............................................................................50

4.2.3.2.1 -AMILASE.................................................................................................50

4.2.3.2.2 LIPASE........................................................................................................51

4.2.3.2.3 -GLICOSIDASE........................................................................................52

4.2.4 ENSAIOS EM CLULA.....................................................................................53

4.2.4.1 ANTIOXIDANTE EM CLULA........................................................................53

4.2.4.1.1 CULTURA DE CLULAS...........................................................................53

4.2.4.1.2 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE......................................................................53

4.2.4.2 CITOTOXICIDADE.........................................................................................54

4.2.4.2.1 ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR........................................................54

4.2.4.3 AVALIAO DO POTENCIAL HEMOLTICO................................................54

4.3 QUANTIFICAO DE MOLCULAS BIOATIVAS..............................................55

4.3.1 FENIS TOTAIS...............................................................................................55

4.3.2 FLAVONOIDES TOTAIS...................................................................................55

4.4 OTIMIZACAO DAS EXTRACOES DE FENOLICOS............................................57

4.4.1 SONICAO...................................................................................................57

4.4.2 MACERAO..................................................................................................58

4.5 ANLISE ESTATISTICA..................................................................................59

xx

4.6 CARACTERIZACAO QUIMICA............................................................................60

4.6.1 MTODOS ESPECTROMTRICOS.................................................................60

4.6.1.1 ESPECTROMETRIA DE MASSAS...............................................................60

4.6.1.2 IMAGEM DE PLACAS DE HPTLC.................................................................60

4.6.2 MTODOS CROMATOGRFICOS..................................................................61

4.6.2.1 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA...............................................61

4.6.2.2 CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (HPLC)......................61

5. RESULTADOS E DISCUSSO.............................................................................62

5.1 RESIDUOS AMAZONICOS E SUAS BIOATIVIDADES.......................................63

5.2 ENZIMAS DIGESTIVAS.......................................................................................67

5.3 TIROSINASE E COLGENASE...........................................................................71

5.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA...........................................................................73

5.5 QUANTIFICAO DE COMPOSTOS BIOATIVOS: FENLICOS E

FLAVONOIDES TOTAIS............................................................................................78

5.6 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO..............................................................84

5.7 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE EM CLULA..........................................................87

5.8 FOTOPROTEO...............................................................................................90

5.9 OTIMIZAO DA EXTRAO DE SUBSTNCIAS FENLICAS.......................97

5.9.1. AA DO PAR (E. oleraceae)......................................................................102

5.9.2 AA DO AM (E. precatoria)............................................................................110

5.9.3 BACURI (P. insignis) MESOCARPO............................................................114

5.9.4 BACURi (P. insignis) EPICARPo..................................................................117

5.10 CARACTERIZAO POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS.......................122

5.10.1 PERFIL DAS EXTRAES DE BAE POR ESPECTROMETRIA DE

MASSAS...................................................................................................................123

xxi

5.10.2 PERFIL DAS EXTRAES DE BAM POR ESPECTROMETRIA DE

MASSAS...................................................................................................................126

5.10.3 PERFIL DAS EXTRAES DE E. PRECATORIA POR ESPECTROMETRIA

DE MASSAS.............................................................................................................129

5.10.4 PERFIL DAS EXTRAES DE E. OLERACEA POR ESPECTROMETRIA DE

MASSAS...................................................................................................................132

5.11 CARACTERIZAO QUMICA POR DESI-EM EM HPTLC............................134

6. CONSIDERAES FINAIS ................................................................................166

7. REFERENCIAS ...................................................................................................142

8. ANEXOS.166

8.1 ANTIOXIDANT ACTIVITY OF AMAZON FRUITS (Capitulo de livro publicado no

Bioactive Phytochemicals: Perspectives for Modern Medicine - Vol 2)

8.2 AMAZON ACAI: CHEMISTRY AND BIOLOGICAL ACTIVITIES: A REVIEW

(Artigo I - publicado na revista FOOD CHEMISTRY)

8.3 QUMICA E FARMACOLOGIA DO BACURI (Platonia insignis).. (Artigo II -

publicado na revista SCIENTIA AMAZONIA)

8.4 AMAZONIAN BIOREFINARIES: FROM FRUIT WASTE TO ANTIOXIDANT

SUPPLEMENTS (Artigo III - submetido a revista FOOD RESEARCH)

8.5 HPLC-DAD PROLIFE OF PHENOIC COMPOUNDS AND ANTIOXIDANT,

CITOTOXICITY AND ANTI-INFLAMMATORY POTENTIAL OF THE AMAZON FRUIT

PIQUIA (Caryocar villosum) (Artigo VII - revista QUIMICA NOVA)

8.6 AVALIACAO IN VITRO DA ATIVIDADE FOTOPROTETORA DE RESDUOS DE

FRUTAS AMAZONICAS (Artigo IV - submetido a revista SCIENTIA AMAZONIA)128

8.7 APRESENTAES EM CONGRESSOS COM PUBLICAO DE RESUMOS

8.8 CAPTULOS DE LIVROS E ARTIGOS PUBLICADOS

8.9 ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAO E ARTIGOS EM ANDAMENTO /

SUBMETIDOS

1. INTRODUO

2

A tendncia de envelhecimento da populao e a busca por uma vida melhor e

mais saudvel reforam a valorizao do uso de produtos naturais como uma das

grandes alternativas para as pesquisas cientficas. O Brasil um dos pases mais

privilegiados em biodiversidade em todo o mundo, sendo um dos grandes

produtores mundiais de frutas. Nesse contexto, a regio Amaznica destaca-se pela

quantidade de frutas exticas consideradas ricas em substncias bioativas, como os

fenlicos e os flavonoides, que esto sendo associados a benefcios para a sade

(Paz et al., 2015, Rabelo, 2012; Barreto et al., 2009).

Espcies como aa (Euterpe oleraceae Mart), cupuau (Theobroma

grandiflorum L.), bacuri (Platonia insignis Mart), guaran (Paulinia cupana var.

sorbilis (Mart.) Ducke) e tucum (Astrocaryum aculeatum Meyer) esto em alta no

mercado da fruticultura e geram resduos que ultrapassam o percentual de matria

utilizada para o consumo (Barros et al., 2015, Canuto et al., 2010). Estudos vm

demonstrando que alguns nutrientes e substncias antioxidantes se concentram

majoritariamente nas cascas e nas sementes, que so os principais subprodutos

gerados no processamento e despolpamento de frutas (Berto et al., 2015; Melo et

al., 2008; Roesler et al., 2007)

Algumas sementes so utilizadas por pequenas indstrias na produo de

semijias, biodiesel, carvo e raes para peixe. Verifica-se, porm, que uma parte

considervel deste material, assim como os resduos oriundos das cascas, so

descartados sem nenhum estudo prvio sobre as propriedades de seus constituintes

e suas possveis atividades biolgicas, tornando-se fonte de contaminao de rios e

florestas (Sousa et al., 2011a e 2011b).

Uma das dificuldades encontradas para o desenvolvimento das indstrias de

biotecnologia a quantidade de matria prima disponvel para a produo em larga

2

3

escala. Os produtos naturais precisam ser obtidos sustentavelmente, de forma que a

industrializao no afete a natureza e prejudique o equilbrio ecolgico.

Calcula-se que do total de frutas processadas para a produo de sucos e

polpas, 30 a 40% sejam de resduos agroindustriais. Como a quantidade de resduos

pode chegar a muitas toneladas, agregar valor a esses produtos de interesse

econmico e ambiental, necessitando de investigao cientifica e tecnolgica que

possibilite seu uso (Schieber et al., 2001).

Nesse contexto, pesquisas relacionadas ao aproveitamento destes

subprodutos da fruticultura esto sendo conduzidas com o intuito de investigar a sua

composio qumica, valorizando-os e sugerindo novas alternativas de utilizao,

minimizando o desperdcio e possibilitando a gerao de produtos biotecnolgicos

(Berto et al., 2015). Prope-se ento um estudo dos extratos de 21 frutas (cascas

e/ou sementes), visando a caracterizao da composio de substncias fenlicas e

flavonodicas e bioensaios para avaliao das atividades antioxidante,

antimicrobiana, e enzimtica dos extratos e fraes.

Considerando as elevadas taxas de produo de resduos agroindustriais

gerados a partir das frutas e a importncia de substncias bioativas em aplicaes

biotecnolgicas para a sade da populao, seu estudo fitoqumico aliado a

bionsaios til para o aproveitamento em massa dessas matrias primas, com a

perspectiva de uma melhor utilizao das mesmas, agregando valor aos resduos e

aos seus possveis produtos.

4

2. OBJETIVOS

5

2.1 GERAL

Caracterizar a composio fenlica de subprodutos da indstria de fruticultura

da Amaznia para uso biotecnolgico.

2.2 ESPECFICO

2.2.1 Avaliar a quantidade de fenis e flavonoides totais e as atividades

antioxidantes in vitro e em clulas dos extratos etanlicos e hidroalcoolicos de

resduos de frutas;

2.2.2 Avaliar a atividade antimicrobiana em relao a 30 patgenos de interesse da

Amaznia e potencial fotoprotetor dos extratos;

2.2.3 Avaliar o potencial de inibio de enzimas de importncia cosmtica e/ou

econmica: tirosinase, colagenase, hialuronidase, -amilase, -glicosidase e

lipase;

2.2.4 Avaliar a citotoxicidade dos extratos em clulas normais e clulas

cancergenas;

2.2.5 Otimizar a extrao de substncias fenlicas e flavonodicas em diferentes

metodologias por anlise estatstica de superfcie de resposta;

2.2.6 Caracterizar quimicamente os extratos de aa (Euterpe oleracea e E.

precatoria), bacuri (Platonia insignis) e piqui (Caryocar villosum) por mtodos

espectromtricos e espectroscpicos;

6

3. REVISO BIBLIOGRFICA

7

3.1 FRUTAS AMAZNICAS E SEUS RESDUOS

No decorrer do tempo, o homem veio a descobrir que as frutas possuam no

s um grande valor nutritivo, mas tambm efeito medicinal e cosmtico, estando

atualmente entre os maiores agentes teraputicos obtidos da natureza (Iha et al.,

2008; Lima et al., 2007). A utilizao de frutas amaznicas devido s suas

propriedades teraputicas descrita na literatura desde longas dcadas, como o

consumo de guaran (Paullinia cupana) e de castanha-da-Amaznia (Bertholletia

excelsa) pelos ndios amaznicos por sculos (Rodrigues et al., 2007; Souza, 2006).

O sabor e as propriedades qumicas das substncias presentes nas polpas

desses frutos contm diferentes constituintes e tem despertado o interesse de

diversos grupos de pesquisas devido s propriedades biolgicas que podem estar

relacionadas com atividades benficas para o organismo humano como a preveno

e uma menor incidncia de doenas crnicas e degenerativas ( Berto et al., 2015;

Paz et al., 2015; Silva et al., 2012; Vieira et al., 2011; Melo et al., 2008 ).

Nos ltimos anos esto sendo associados aos cosmticos substncias que

visem o benefcio da sade humana. Esses produtos, identificados como

cosmticos, mas que tratam ou previnem doenas ou, ainda, que afetam a estrutura

ou funo da pele humana, so considerados como cosmecuticos (Kligman, 2005).

O Brasil apresenta a terceira posio em consumo de cosmticos em geral,

tornando-se um dos maiores do mundo. Em termos relativos, o mercado brasileiro

de cosmticos tem apresentado crescimento constante, superando a prpria

dinmica da economia nacional (grfico 1) (IBGE, 2013; ABIHPEC, 2013 apud

Herculano, 2013).

8

Essas atividades biolgicas esto sendo correlacionadas a substncias

bioativas, como os fenis e flavonoides, o que tem incentivado a pesquisas de

produtos naturais para a elaborao de novos produtos na rea de cosmticos.

Entre os ativos, podem ser destacados os agentes despigmentantes, retinides,

filtros solares, vitaminas, antioxidantes, minerais e hidratantes (Monteiro e Baumann,

2008).

Grfico 1: Brasil Variao do PIB e do mercado de cosmticos 2000 a 2011. Fonte: ABIHPEC (2013) apud Herculano, 2013.

As frutas amaznicas recebem destaque devido s atividades biolgicas que

esto sendo relatadas nas pesquisas, que aliados composio qumica estimulam

varreduras que possam selecionar os mais promissores para estudos mais

aprofundados em busca de produtos aplicveis biotecnologicamente. Verifica-se, no

entanto, que um dos entraves para a utilizao industrial dos produtos da Amaznia

a quantidade de matria prima disponvel para que possam ser produzidos em

larga escala. Na regio amaznica, diversas matrias primas foram utilizadas ao

longo dos anos, porm pelo fato destas no apresentarem sustentabilidade,

acabaram sofrendo reduo e algumas rvores entraram para a lista de espcies em

extino, como o caso de pau rosa, pau brasil, entre outros (Rizzini e Mors, 1995).

9

considervel a produo de resduos de origem vegetal na regio amaznica

provenientes do despolpamento de frutos. Segundo Demajorivic (1995), esses

resduos diferenciam-se do termo lixo, pois apresentam valor agregado por

possibilitarem o reaproveitamento no prprio processo produtivo. Esses subprodutos

podem proporcionar outra fonte de valor indstria de processamento uma vez que

so geralmente descartados em grandes quantidades, sendo potencialmente

causadores de prejuzos ao meio ambiente. Assim, agregar valor a estes

subprodutos de interesse econmico e ambiental, sendo necessrias

investigaes cientificas e tecnolgicas que possibilitem sua utilizao (Sena e

Nunes, 2006; Martins e Farias, 2002).

Os subprodutos da indstria de frutas da regio vm sendo testados com a

finalidade de verificar seu desempenho em alimentos de peixes, como por exemplo,

a semente do ara-boi (Psidium araa R.), o resduo do jenipapo (Genipa

americana L.), de camu-camu (Myrciaria dbia (HBK) McVaugh) e de acerola

(Malpighia glabra L.). Outras finalidades so adubo para vegetais e suplementos

alimentares, porm em baixa escala e sem estudos mais aprofundados sobre a

composio qumica (Oliveira et al., 2009b; Anselmo, 2008; Sena e Nunes; 2006;

Silva et al., 2000, Roubach, 1991).

Estudos recentes tm demonstrado que as frutas so ricas em muitos

nutrientes e substncias antioxidantes, e que esses constituintes se concentram

majoritariamente nas cascas e sementes, fraes normalmente desprezadas

durante o consumo in natura ou nas formulaes caseiras de compotas, sorvetes e

outras (Sousa et al., 2011a e 2011b; Roesler et al., 2007).

A casca de pequi (Caryocar brasilense) apresentou maior valor de substncias

fenlicas nos extratos etanlico e aquoso, em comparao com o da polpa,

10

possuindo excelente capacidade de seqestrar radicais livres (Roesler et al., 2007).

Na amndoa detectou-se elevada quantidade de leo comestvel, rico em vitamina

A, de interesse para a indstria cosmtica e de alimentos (Siqueira et al., 2012;

Batista et al., 2010; Soares Jnior et al., 2010; Perez, 2004).

No trabalho realizado por Sousa e colaboradores (2011), com resduos de seis

frutas, alguns extratos, como o de acerola (Malpighia emarginata) e goiaba (Psidium

guajava), apresentaram atividade antioxidante in vitro superiores de alimentos com

reconhecida atividade antioxidante. No artigo de reviso de Oliveira e colaboradores

(2009b) foram reunidos resultados de fontes naturais atrativas de antioxidantes a

partir de resduos da indstria alimentcia. Estes resduos, apesar de possurem em

sua composio vitaminas, minerais, fibras e compostos antioxidantes so

desperdiados na maioria das fbricas. Porm, poderiam ser utilizados como

antioxidantes, antimicrobianos e dermocosmticos, minimizando os efeitos

ambientais e gerando uma nova fonte de renda para os produtores rurais.

A diversidade de princpios ativos presentes nas espcies Amaznicas indica

grande potencial de aproveitamento industrial, sobretudo, das espcies nativas. Foi

realizado um levantamento das principais frutas Amaznicas e a atividade

antioxidante relacionada aos constituintes qumicos. Esse trabalho resultou na

publicao de um captulo de livro publicado pela editora DAYA PUBLISHING

HOUSE, NEW DELHI, 2014, como o primeiro resultado desta tese. O resumo desta

publicao, assim como os dados relacionados a esse captulo encontram-se no

ANEXO 1.

11

3.1.1 AA

O gnero Euterpe possui cerca de 28 espcies localizadas nas Amricas

Central e do Sul, estando distribudas por toda bacia Amaznica. As trs espcies

que ocorrem com maior frequncia so E. oleraceae, E. edulis e E. precatoria. No

entanto, s duas espcies so exploradas comercialmente, E. precatoria e E.

oleracea. Umas das principais diferenas entre os dois aas, est no hbito de

crescimento das plantas. E. precatoria uma espcie nativa do estado do

Amazonas, conhecida popularmente como aa do Amazonas e encontrada na

bacia do Solimes, em terreno de terra firme e rea de baixio (Almeida et al., 2004;

Cavalcante, 1996).

E. oleracea, conhecida popularmente como aa do Par, encontrada,

sobretudo, em terrenos de vrzea e igap. multicaule, diferentemente da E.

precatoria que unicaule. Espcie nativa da Amaznia, tem suas maiores

populaes concentradas nas florestas da Amaznia Oriental, principalmente, nos

Estados do Par, Amap e Maranho (Cavalcante, 1996; Muiz-Miret et al., 1996).

Estas espcies tem alto potencial econmico, principalmente pelo uso de seus

frutos na preparao do vinho de aa que so exportados para todo o mundo

como energticos. A polpa deste fruto tem sido objeto de estudos em funo do

valor nutritivo, sendo considerado um alimento nutracutico face ao elevado teor de

substncias bioativas (Costa et al., 2013; Menezes et al., 2011; Sabbe et al., 2009).

O aa demonstra benefcios sade associados composio qumica.

Devido a isso, uma quantidade considervel de atividades biolgicas descrita para

as espcies desse gnero, principalmente para E. oleracea (tabela 1). A atividade

antioxidante, vasodilatadora e antiinflamatria da polpa a mais avaliada por meio

12

de diferentes testes, desde a varredura de radicais in vitro at em modelos celulares

e plasma humano, sugerindo uma possibilidade do uso do aa como planta

medicinal (Costa et al., 2013; Pacheco-Palencia et al., 2008; Rocha et al., 2007).

Tabela 1: Atividades biolgicas de espcies de Euterpe.

Espcie Atividade biolgica Referncias

E. oleracea

Antioxidante Atividade antiproliferativa

Efeito vasodilatador Atividade anticociceptiva

Antiinflamatria Citotoxicidade em clulas

cancergenas

[1-14] [15-17]

[18] [19-20]

[14, 21-24] [25]

E. precatoria Antioxidante

Antiinflamatria

[14, 26] [14]

[1] Matheus et al., 2003; [2] Hassimitto, et al., 2005; [3] Schauss et al., 2006; [4] Lichtenthler et al.,

2005; [5] Mertens et al., 2006; [6] Rodrigues et al., 2006; [7] Chin et al., 2008; [8] Santos et al., 2008;

[9] Mertens-Talcott et al., 2008; [10] Spada et al., 2009; [11] Ribeiro et al., 2010; [12] Rojano et al.,

2011; [13] Rufino et al., 2011; [14] Kang et al., 2012; [15] Del Pozo-Insfra et al., 2006; [16] Pacheco-

Palencia et al., 2008; [17] Hogan et al., 2010; [18] Rocha et al., 2007; [19] Marinho et al., 2002; [20]

Favacho et al., 2011; [21] Schauss et al., 2006; [22] Xie et al., 2012; [23] Kang et al., 2011; [24]

Noratto et al., 2011; [25] Fragoso, et al., 2013; [26] Galotta et al., 2008 e 2005;

Na colheita, pode-se diferenciar as espcies por meio das caractersticas

botnicas, porm ao ser preparado para consumo, no possvel ter a certeza

sobre o tipo de aa que est sendo consumido. Sabe-se que as espcies de E.

oleracea so comumente encontradas na regio paraense, enquanto que na

amazonense prevalece as espcies de E. precatria, porm, no h distino para a

vendas da polpa, sendo vendidos apenas como aa.

H poucos estudos diferenciando as espcies. De forma geral, caracterizam-

se quimicamente por apresentarem substncias fenlicas como cidos fenlicos,

flavonoides e antocianinas (Kang et al. 2011; Pacheco-Palencia et al., 2008; Del

Pozo-Insfran et al. 2006; Kuskoski et al., 2006).

13

Figura 01: Sementes de (A) E. precatoria e (B) E. oleracea.

A polpa de corresponde a cerca de 10% do peso final, resultando em 85-95%

de resduos que so descartados (Yuyama et al., 2011; Pompeu et al., 2009).

Atualmente, este subproduto vem sendo utilizado como adubo para plantas e

biojias. Algumas pesquisas sugerem a utilizao como fonte de fibras para

alimentos e fonte de energia. Verifica-se, porm, que so escassos os estudos

qumicos e biolgicos com este material e que mesmo com essas finalidades, a

quantidade de material descartada superior que utilizada, tornando-se assim

um problema ambiental (Martins et al., 2009; Tinoco, 2005). Levando-se em

considerao que a polpa dessas espcies rica em substncias bioativas, o estudo

sobre a composio qumica das sementes torna-se uma oportunidade para o

aproveitamento em larga escala de uma matria prima que atualmente est sendo

descartada e que pode gerar produtos biotecnolgicos sustentveis.

Foi realizado uma extensa pesquisa bibliogrfica sobre os trabalhos cientficos

descritos para as duas espcies de aa (E. precatoria e E. oleracea), tanto da parte

qumica quanto biolgica. No ANEXO 2 pode-se encontrar o resumo e os dados do

artigo resultante desse trabalho, publicado pela revista Food Chemistry, em 2015.

A B

14

3.1.2 BACURI (Platonia insignis)

Nos ltimos anos, o bacurizeiro tem sido frequentemente citado como espcie

promissora, pelas amplas possibilidades que apresenta, com interesse na indstria

de alimentos e madeireira. Pelo sabor e aroma peculiar, os frutos so bastante

utilizados para elaborao de sucos, sorvetes, cremes, doces, compotas ou mesmo

consumidos in natura pela populao da Amaznia e parte do Nordeste do Brasil,

particularmente nos Estados do Maranho e Piau (Nascimento et al., 2007)

Mesmo apresentando cerca de 71% de casca e 15% de sementes (Souza et

al., 2001; Mouro et al., 1996), verifica-se que o aproveitamento integral do fruto do

bacurizeiro tm sido pouco estudado. Os trabalhos concentram-se em avaliaes da

polpa e poucas alternativas foram levantadas para os resduos que visem a

utilizao do fruto como um todo (Valena et al., 2008).

Villachica e colaboradores (1996) relataram a possibilidade da utilizao da

casca de bacuri para obteno de leo ou pelo uso na fabricao de doces.

Atualmente, as empresas descartam esse resduo que a maior parte do fruto, por

no apresentarem estudos qumicos e citotxicos que garantam a segurana

alimentar deste material. Segundo os produtores de bacuri, as cascas apresentam

uma resina de colorao forte e sabor amargo, dificultando a fabricao de doces e

compotas.

Em estudos referentes ao mesocarpo, verificou-se a alta quantidade de

pectina existente, cerca de 5,0% (Paula, 1945). Quimicamente, as pectinas

correspondem a uma cadeia linear de cido poligalacturnico, unida por ligaes

alfa-1,4 de cido galacturnico, com grau varivel de grupos carboxilas metil

esterificados (Chitarra e Chitarra, 2005).

15

Figura 02: Estrutura qumica de substncias isoladas de cascas de bacuri

Algumas frutas so descritas como fontes de pectinas, entre elas a ma,

goiaba e o pequi. A importncia da pectina em alimentos geralmente atribuda

formao de gis, sendo amplamente usada para produo de gomas, gelias,

produtos lcteos e fibra diettica solvel para reduo dos nveis de colesterol,

lipoprotenas, cidos biliares e glicose (Thakur et al., 1997; Anteri-Schemin et al.,

2005, Siqueira et al., 2012; Fietz e Salgado, 1999). A obteno de fraes de pectina

pode ser ,dessa forma, uma soluo para o aproveitamento da casca de bacuri.

Outros estudos referem-se quantificao de fenlicos e a identificao dos

constituintes volteis. Descrevem-se o isolamento de um biflavonoide,

morelloflavona, tipo flavanona-(38)-flavona (figura 01), isolado da frao

metanlica das cascas, extrao de pectina em alta concentrao (37,6%) em

oxalato de amnia, alm da identificao dos volteis linalol, 2-heptanona, 3-hexenil

e a substncia majoritria, o acetato de linalol como as substncias responsveis

pelo aroma pareceriam ser (Batista et al., 2011a ; Batista et al., 2011b; Brito et al.,

2011). (Souza e Chaves, 2007).

A reviso mais aprofundada desta tese sobre os estudos qumicos e biolgicos

de P. insignis foi realizada e encontra-se publicado no artigo de reviso da revista

Scientia Amaznia, 2015. No ANEXO 3 pode-se encontrar o resumo e os dados

desse trabalho.

OOH

OH O

OH

O

OH O

OH

OH

pectina

morelloflavona

16

3.1.3 PIQUI

Caryocar villosum (piqui) uma espcie nativa da regio amaznica,

pertencente famlia Caryocaceae. A polpa do seu fruto consumida pelos

habitantes locais na culinria amazonense para preparar pratos regionais com arroz

e o leo comestvel, o qual utilizado como substituto de manteiga (Clay et al.,

2000). Esse leo utilizado pelas famlias rurais do Nordeste do Brasil para o

tratamento de dermatofitoses, tais como micoses (Tinea capitis) e doenas fngicas

da pele (p de atleta) (Grenand et al, 2004).

Na Guiana Francesa tradicionalmente a polpa e a casca de piqui so

utilizadas pelos habitantes como veneno de peixe. No estudo realizado por Magid e

colaboradores (2006), associou-se tal propriedade presena de saponinas

isoladas.

O interesse nesse fruto est relacionado s substancias bioativas detectadas.

Quando comparado com outras 18 frutas tropicais (nove deles da regio

amaznica), o piqui apresentou os maiores valores de substancias fenlicas totais,

flavonoides e atividade antioxidante (Barreto et al., 2009).

Nos estudos realizados por Chist e Mercadante (2012) e Chist e

colaboradores (2012) foram detectadas as substncias fenolicas: cido glico, cido

elgico e cido elgico desoxihexosido rhamnosido (HDDP-Glicose), e os

carotenoides: lutena e zeaxantina como compostos majoritrios. Nas cascas do

caule foram encontrados fenlicos glicosilados, saponinas triterpenicas e

flavonoides. A partir do extrato metanlico foram isoladas cinco saponinas

triterpnicas (cido -D-glucurnico, -D-galactose, -L-ramnose, -D-14-glucose,

gallato (sal do cido glico)). Algumas dessas substncias podem ser observados

na Figura 3. Saponinas triterpnicas tambm foram isoladas da polpa, tendo como

17

seu componente acar: -D-glicose, -D-galactose, D-xilose e os flavonides

glicosdeos, -D-glicopiranose, 3', 4', 5' - trimetoxifenil, Galloil 1, galloil 2 ( Magid et

al, 2008; Magid et al, 2006a e 2006b).

Substncias fenlicas

Carotenoides

Figura 3: Substncias qumicas detectadas e/ou isoladas de piqui.

A polpa apresentou efeitos antigenotxicos, capacidade sequestrante das

espcies reativas de oxignio e nitrognio (Almeida et al, 2012; Chist et al, 2012),

propriedades antifngicas contra dermotofitoses (Grenand et al, 2004) e atividade

anti-inflamatria tpica in vivo (Xavier et al, 2011).

Mesmo tendo apresentando excelentes resultados para atividades

antioxidantes in vitro, os trabalhos cientficos envolvendo a espcie C. villosum esto

relacionados utilizao na indstria madeireira e na polpa, sendo reduzidas as

pesquisas sobre as partes no comestveis deste fruto.

OHO

OH

OH

OH

cido glico

O

O

O

O

OH

OH

OH

OH

cido elgico

OH

OHOH

OHOH

OHO

O

O

OH

OH

O

O

HDDP-Glicose

OH

OH

O

CH3 CH3

CH3

CH3 CH3

CH3 CH3

CH3

CH3CH3

anteraxantina

OH

OH

CH3 CH3

CH3

CH3 CH3

CH3 CH3

CH3

CH3CH3

zeaxantina

18

3.2 FENOIS E FLAVONOIDES

A) SUBSTNCIAS FENLICAS

Dentre os ativos utilizados em pesquisas de produtos naturais, esto os

polifenlicos, substncias cada vez mais correlacionadas com a capacidade de

diminuir os riscos para a sade relacionados ao estresse oxidativo (Campos e

Frasson, 2011; Hirata et al., 2004).

Consideram-se substancias fenlicas, numa definio genrica, estruturas que

possuem pelo menos um anel aromtico no qual, ao menos um hidrognio

substitudo por um grupamento hidroxila. Podem ser classificados de acordo com

seu esqueleto principal (tabela 2) ou segundo sua ocorrncia no reino vegetal

(amplamente distribudos ou de distribuio restrita) (Cunha et al., 2005).

Tabela 2. Esqueleto bsico de alguns compostos fenlicos.

Esqueleto bsico Classe de substancias fenlicas

C6 fenis simples, benzoquinonas

C6 - C1

C6 C1 - C6

cidos fenlicos

xantonas

C6 - C3 - C6 flavonoides e isoflavonoides

(C6 C3)2

(C6 C3)n

Lignanas, neolignanas

ligninas

(C6 C3 C6)2 biflavonides

(C6 C3 C6)n taninos condensados

Fonte: adaptado de Dewick, 2002 e Lobo e Loureno, 2007.

Podem ser formados atravs de duas rotas: via do cido chiqumico e pela via

do acetato. Por meio destas pode-se determinar o padro de substituio do

composto fenlico resultante, onde na via do cido chiqumico obtm-se substncias

com grupos hidroxilas em posio orto, que se formam a partir do cido cinmico e

na via do acetato originam-se substncias com grupos hidroxilas dispostos em meta

(Lobo e Loureno, 2007; Dewick, 2002; Geissman e Crout, 1969) (figura 4).

19

R

OH

OH

R

OH OH

OH

A B

Figura 4: Padro de oxidao tpicos das vias metablicas. A: via do acetato e B) via do cido

chiqumico

Na formao de compostos fenlicos pela via do acetato (figura 5), o bloco

constituinte fundamental o cido actico sob a forma de acetil-CoA (acetil

coenzima A) que o iniciador direto de todo o processo. O aumento subseqente da

cadeia realiza-se atravs de um derivado, o malonil-CoA, numa reao anloga

condensao de Claisen. Posteriormente, ocorre a ciclizao, uma desidratao e a

aromatizao (Lobo e Loureno, 2007; Dewick, 2002).

CH3 SCoA

O

SCoA

O

HO2C

3x+

malonil-CoAacetil-CoA

SEnz

O CH3

O

O O

H+ reao tipo aldol

ciclizao

desidratao

enolizao

hidrlise

aromatizao

cido orselnico

SEnz

CH3O

O O

CH3

O

OH

OH

OH

SEnz

CH3

OHO

O OH

Figura 5. Exemplo da biossntese de fenlicos oriundos da via do acetato. Fonte: Dewick, 2002.

(A) (B)

20

O esquema biossinttico para a formao do cido chiqumico (figura 6)

envolve a adio de uma molcula de fosfoenol piruvato (PEP) a um acar, a

eritrose-4-fosfato, originando um derivado cido com sete carbonos, o desoxi-

arabino-heptulosonato-fosfato. Essa reao tipo aldol, seguida de uma eliminao

do grupo fosfato e adio carbonila, originam o cido 3-desidroqunico. Em

seguida forma-se o cido 3-desidrochiqumico atravs da eliminao cis de uma

molcula de gua. H ento a reduo da carbonila a lcool, por meio de NADPH,

produzindo o cido chiqumico (Lobo e Loureno, 2007).

PO

CH2

CO2-

PO

OH O

OH

fosfoenolpiruvato (PEP)

eritrose-4-fosfato

DAHP sintetase

DAHP(desoxi-arabino-heptulosonato-fosfato)

OH

OH

OH

PO

CO2-

O

O

OH

OH

CO2-

O

H

CH2

O

OH

OH

CO2-

OH

H+

cido 3-desidroqunico

-HOP

NAD+

reao tipo

aldol

eliminao cis (syn)

-H2O

O

OH

OH

CO2-

NADPH

OH

OHOH

CO2-

cido chiqumico cido 3-desidrochiqumico

+

Figura 6: Formao do cido chiqumico. Fonte: Adaptado de Dewick, 2002.

Verifica-se nas pesquisas uma correlao positiva entre a atividade

antioxidante e a quantidade de compostos fenlicos. Esta atividade deve-se

principalmente s propriedades redutoras e estrutura qumica dos fenlicos,

que permitem a neutralizao ou sequestro de radicais livres e/ou quelao de

metais de transio. A ressonncia do anel aromtico presente nestes compostos

a principal responsvel pela formao de intermedirios estveis que aps o

21

processo de reduo dos radicais livres, bloqueia reaes em cadeia (Barreiros et

al., 2006; Cerqueira et al., 2007a).

B) FLAVONOIDES

Os flavonoides so subdivididos nas principais classes: flavonas, flavonis,

chalconas, auronas, flavanonas, flavanas, antocianidinas, leucoantocianidinas,

proantocianidinas, isoflavonas e neoflavonoides (Dornas et al., 2007). Representam

um dos grupos fenlicos mais importantes e diversificados entre os produtos de

origem vegetal. De forma geral, so molculas de baixo peso molecular

caracterizados por apresentarem dois ncleos fenlicos ligados por uma cadeia de

trs carbonos. A estrutura bsica dos flavonoides consiste num ncleo flavano,

constitudo de quinze tomos de carbono arranjados em trs anis (C6-C3-C6),

sendo dois anis fenlicos substitudos (A e B) e um pirano (cadeia heterocclica C)

acoplado ao anel A (Figura 7) (Cunha et al., 2005).

O

O

B .

C .A .1'

2'3'

4'

5'6'

12

3

410

5

6

7

89

Figura 7: Estrutura bsica dos flavonoides

Os flavonoides possuem biossntese mista, resultado da via do cido

chiqumico e a do acetato, via cido malnico. A primeira origina fenilalanina, o

precursor do cido cinmico, que por sua vez, origina o cido cumrico, responsvel

por um dos anis aromticos (anel B) e a ponte de trs carbonos. A segunda resulta

no outro anel aromtico (anel A) do esqueleto bsico dos flavonides (Dewick, 2002)

(Figura 8).

22

Figura 8: biossntese geral dos flavonoides

23

3.3 ATIVIDADES BIOLGICAS

O uso tradicional das plantas em tratamentos de pele, especialmente para fins

cosmticos, uma prtica comum na medicina popular de muitas culturas. A busca

por agentes antimicrobianos, inibidores enzimticos antioxidantes e fotoprotetores

torna-se cada vez mais frequentes e pode fornecer indcios que estimulem estudos

para a descoberta de potenciais agentes teraputicos.

3.3.1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

A pesquisa por antimicrobianos de origem natural (animal e vegetal) tm sido

uma alternativa para a utilizao desses conservantes de origem sintticas. As

expectativas do mercado de cosmticos buscam diminuir a incidncia de reaes de

hipersensibilidade ao usurio, como irritao e alergia, e uma menor toxicidade,

incentivando assim, a busca de substncias com potencial antimicrobiano (Lundov et

al., 2009; Ostrosky et al., 2008).

Os cosmticos necessitam de conservantes em suas formulaes que sejam

capazes de inibir o crescimento de microorganismos durante sua fabricao e

estocagem e/ou para proteger os produtos da contaminao inadvertida durante o

uso. Assim, os conservantes devem apresentar atividade antimicrobiana efetiva,

sendo seletivamente txicos e eficazes contra bactrias, bolores e leveduras

(ANVISA, 2013; Pinto et al., 2010; Kabara e Orth, 1997).

Nas varreduras, geralmente so includas os microorganismos: Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,

Mycobacterium smegmatis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans e alguns

fungos filamentosos. Os mecanismos de ao envolvem processos de destruio da

24

estrutura proteica da parede celular; alterao da permeabilidade da membrana;

inibio de sistemas enzimticos da clula e oxidao de componentes celulares

(Barbosa e Torres, 2005; Rang et al., 2004; Calixto, 2001; Trabulsi et al., 1999).

As pesquisas de substncias antimicrobianas nos vegetais desenvolveu-se

aps a descoberta de penicilina, e os metablitos secundrios como as substncias

fenlicas, terpenos e flavonoides esto sendo classes muito promissoras. Segundo

Rocha Filho (1994), cosmticos contendo flavonoides apresentam atividade

microbicida e, alm disso, so hidrossolveis e no causam irritao cutnea, o que

facilita sua aplicao cosmtica.

Na regio amaznica verifica-se que os leos de andiroba e copaba esto

sendo inseridos no mercado de cosmticos e apresentam atividade antimicrobiana,

antifngica, e antissptica. Outros destaques so os frutos goiaba (Psidium

guajava), buriti (Mauritia flexuosa) e guaran (Paullinia cupana Kunth) que

apresentaram atividade contra bactrias gram positivas e negativas e atividade

antifngica (Koolen et al., 2013; Leandro et al., 2012; Ribeiro, 2008; Majheni et al.,

2007).

3.3.2 ATIVIDADE ENZIMTICA

A maioria das enzimas pode ser inibida por certas substncias qumicas. Essa

inibio por pequenas molculas e ons especficos importante nos mecanismos

de controle em sistemas biolgicos. O estudo de inibidores de enzimas, tambm se

constitui em uma fonte valiosa de informaes sobre os mecanismos da ao

enzimtica (Chang et al., 2009; Champe et al., 2005).

3.3.2.1 TIROSINASE

25

Com o intuito de se tratar problemas dermatolgicos de hiperpigmentao, h

uma tendncia mundial no desenvolvimento de cosmticos que possuam

propriedades despigmentantes, os quais agem inibindo a biossntese de melanina

(Teixeira et al., 2012). Esta desempenha um papel importante na proteo da pele

humana contra os feitos nocivos da radiao ultravioleta (raios UV) do sol. Verifica-

se, porm, que o acmulo de uma quantidade anormal de melanina em diferentes

partes especficas da pele pode ocorrer, resultando em manchas mais pigmentadas,

tornando-se um problema esttico (Chang, 2009; Adhikari et al., 2008).

Para o tratamento desses problemas de pigmentao vrios produtos

cosmticos e farmacuticos so utilizados, porm, no so totalmente eficazes ou

seguros, o que justifica a intensa pesquisa na busca de novos agentes ativos,

principalmente aqueles envolvidos na melanognese, como a tirosinase (Silvrio et

al, 2013; Okombi et al, 2006; Grimes, 1999). A inibio da tirosinase o principal

mecanismo de ao de agentes despigmentantes. Dentre as substncias qumicas

despigmentantes mais utilizadas destacam-se a hidroquinona, o arbutina, o cido

kjico e o cido ascrbico e seus derivados (Masuda et al., 1996; Su, 1999; Zhai e

Maibach, 2001; Sato et al., 2007).

H relatos de que compostos fenlicos so potenciais agentes

despigmentantes, por possurem uma estrutura qumica semelhante da tirosina, o

substrato da tirosinase (Boissy e Manga, 2004). Devido grande necessidade de

novas substncias despigmentantes, que realmente sejam eficazes e no tragam

tantos efeitos nocivos sade, torna-se interessante avaliar a atividade de produtos

naturais, fontes de fenlicos, que possam substituir efetivamente os compostos

sintticos encontrados no mercado.

26

3.3.2.2 HIALURONIDASE

A hialuronidase uma enzima que despolimeriza o cido hialurnico (figura 9),

reduzindo a viscosidade do meio intercelular, aumentando a permeabilidade das

membranas celulares e vasos sanguneos, tornando o tecido mais permevel

disperso de outras substncias e promovendo a reabsoro do excesso de fluidos,

mobilizando os edemas e infiltraes (El-Safory et al., 2010; Hynes et al., 2000;).

Figura 9: Estrutura qumica do cido hialurnico

Os resultados dos estudos sugerem que o nvel de cido hialurnico pode estar

correlacionado com a agressividade de clulas tumorais, de forma que quanto maior

a quantidade de cido hialurnico encontrado nestes tecidos, mais agressivo o

tumor. O que indica um passo importante no avano do processo cancergeno, uma

vez que a inibio desta enzima pode estar relacionada diminuio desse

processo patolgico (Menzel e Farr, 1998; Matousek et al., 2004; Zhang et al.,

2004).

Alguns autores descrevem que a atividade da hialuronidase tambm pode estar

relacionada com outros processos nos tecidos animais como a inflamao e

envelhecimento cutneo. Dessa forma, um estudo sobre a inibio da enzima pode

caracterizar possveis atividades biolgicas dos extratos e assim a possvel

utilizao para formulaes cosmticas (Park et al., 1998).

27

3.3.3 ATIVIDADE FOTOPROTETORA

A luz solar composta por espectro contnuo de radiao eletromagntica que

apresenta diviso e denominao em concordncia com o intervalo de comprimento

de onda (). Os raios UV subdividem-se em: ultravioleta A (UVA) entre 320 e 400

nm, ultravioleta B (UVB) entre 290 e 320 nm e ultravioleta C (UVC) entre 100 e 290

nm. A incidncia dos raios UV pode ser ilustrado na figura 10 (Gonzlez et al., 2008;

Palm e O`Donoghue, 2007).

Figura 10: Representao esquemtica do poder de penetrao da radiao solar nas camadas da pele. Fonte: adaptao de

A radiao UVC no chega superfcie terrestre, uma vez que amplamente

absorvida pela camada de oznio. Entretanto, as radiaes UVA e UVB atingem a

Terra e podem ser absorvidas por diferentes cromforos da pele, como melanina,

DNA, RNA, protenas e lipdeos. A exposio solar prolongada crnica leva uma

variedade de efeitos adversos que contribuem para formao de espcies reativas

de oxignio e alteraes histoqumicas, incluindo fotoenvelhecimento (enrugamento,

elastose e irregularidade da pigmentao), fotocarcinognese (carcinoma de clulas

basais e escamosas e melanoma maligno) e a diminuio da imunidade do indivduo

(Balogh et al., 2011; Mansur, 2011; Dal`Belo, 2008; Gonzlez et al, 2008).

28

Os danos causados pela radiao UV podem ser amenizados com o uso de

substncias denominadas filtros solares que so molculas ou complexos

moleculares que podem absorver, refletir ou dispersar a radiao UV (Balogh et al.,

2011). Os filtros solares orgnicos so formados por molculas capazes de absorver

a radiao UV (alta energia) e transform-la em radiaes com energias menores e

inofensivas ao ser humano. Estas molculas so, essencialmente, compostos

aromticos com grupos carboxlicos ou conjugados. No geral, apresentam um grupo

doador de eltrons, como uma amina ou um grupo metoxila, na posio orto ou para

do anel aromtico. Existem trs categorias em que se enquadram, sendo elas: filtros

UVB, UVA e de amplo espectro (figura 11) (Flor et al., 2007).

OCH3

O CH3

O

CH3

metoxicinamato de oxila

OCH3

CH3

CH3

CH3

OH OH

avobenzona

OOH

OCH3

oxibenzona

(A)

(B) (C)

Figura 11: Exemplos de substncias qumicas utilizadas como filtros solares em (A) UVB, (B) UVA e (C) amplo espectro. Fonte: Adaptao de Silva, 2012.

O mecanismo de ao dos filtros orgnicos envolve a absoro da radiao

UV e, em seguida, a excitao, onde os eltrons situados no orbital HOMO (orbital

molecular preenchido de mais alta energia) so excitados para orbital * LUMO

(orbital molecular vazio de mais baixa energia) e, ao retornarem para o estado

inicial, o excesso de energia liberado em forma de calor (Flor et al., 2007). O

espectros de absoro nas regies UVA e UVB esto apresentados no grfico 2.

metoxicinamato de 2-etilhexila

29

Grfico 2: Espectro de absoro UV dos filtros (A) p-metoxicinamato de 2 etil-hexila e (B) 1-(4-terc-butilfenil)-3-(4-metoxifenil)propano-1,2-dionaoxibenzona. Fonte: Adaptao de Flor et al. (2007).

As pesquisas sobre fotoproteo da pele tm mostrado que a incorporao de

antioxidantes tpicos nas formulaes antissolares constituem-se numa estratgia

importante para o aumento do efeito fotoprotetor suplementar dos filtros solares

sintticos permitidos pela lei. Aliado a isso, os entraves dos atuais protetores solares

como a baixa resistncia a gua, pouca estabilidade, potencial alrgico e dermatites

fotoalrgicas de contato estimulam a busca de substncias com potencial ao

fotoprotetora (Souza, et al., 2013; Violante et al., 2009).

3.3.4 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

A pele possui a maior rea de superfcie do corpo humano, sendo o principal

alvo dos radicais livres. Estudos sugerem uma correlao entre o envelhecimento e

a reduo de agentes enzimticos e no-enzimticos, com consequente aumento na

formao de espcies reativas de oxignio e nitrognio (ERO e ERN) (Guaratini et

al., 2007; Kede e Sabatovich, 2004).

Os radicais livres so espcies qumicas que apresentam como caracterstica a

presena de um nico eltron no-pareado em uma rbita externa. Espcies

reativas incluem no s os radicais (O2-, OH, NO), mas tambm intermedirios

30

neutros ou carregados (H2O2, ROOH e ONOO-) e outras espcies capazes de formar

radicais livres no organismo humano (1O2, O3) (Halliwell, 1996; Halliwell, 1994).

Desempenham um papel fundamental no metabolismo celular, porm, quando

em excesso, esto envolvidos em danos moleculares s estruturas celulares, com

consequente alterao funcional e prejuzos das funes vitais em diversos tecidos e

rgos (Nordberg e Arnr, 2001, Rover Junior et al., 2001; Halliwell, 1996).

As etapas de reao de radicais de forma geral podem ser divididas em

iniciao, propagao e terminao. Na etapa de iniciao os radicais so gerados.

Em seguida, ocorre a propagao, onde um radical reage para produzir outros

radicais, formando reaes em cadeia. Quando os radicais se combinam produzindo

uma molcula na qual os dois eltrons esto emparelhados ou uma molcula

estabiliza o radical, ocorre a etapa de terminao (Bruice, 2006).

O equilbrio entre a formao e a remoo das espcies reativas de radicais

livres pode ser reestabelecido pelos sistemas antioxidantes, onde substncias

presentes em baixas concentraes comparadas do substrato oxidvel, regeneram

ou previnem significativamente a oxidao do mesmo (Barreiros et al., 2006;

Halliwell et al., 2000).

Verifica-se que a estabilidade dos radicais ocorre devido principalmente s

propriedades estruturais das molculas antioxidantes. Sendo assim, substncias

com a capacidade de produzir radicais pouco reativos e que estabilizam-se ou

sofrem desproporcionamento so antioxidantes em potenciais. O mecanismo

envolvendo a estabilizao de um antioxidante pode ser ilustrado na figura 12

(Barreiros et al., 2006).

31

O ascorbato (forma que comumente encontrado do cido ascbico no

organismo) um bom agente redutor que produz derivados pouco reativos. Por

isso, pode ser oxidado pela maioria das ERO e ERN que chegam ou so formadas

nos compartimentos aquosos dos tecidos orgnicos. O mecanismo envolve uma

reao de oxidao e produz o radical semidesidroascorbato. Posteriormente, o

radical formado convertido em ascorbato atravs de um sistema enzimtico ou

oxidado irreversivelmente gerando oxalato e treonato (Barreiros et al., 2006).

O

OH

O

OH O-

OH

ascorbato

O

OH

O

O-

OH

O

O

OH

O

OH O-

OH

O

OH

O

O

OH

O

O

O-

O-

O

OH

OH

OH

O

OH

semidesidroascorbato

ascorbatodesidroascorbato

oxalato

treonato

+ oxidao irreversvel

sistema de regenerao pela GSH

desproporcionamento

+ H+

ERO ou ERN

NADPH semideidroascorbato

redutase

Figura 12: ciclo oxidativo do ascorbato

Fonte: Adaptao de Barreiros et al. (2006).

Entre os antioxidantes mais conhecidos esto as vitaminas C e E, carotenoides

e as substancias fenlicas. Estas apresentam propriedades redutoras e capacidade

de estabilizao dos radicais formados devido ressonncia do anel aromtico,

entre os quais pode-se citar a quercetina, rutina, hesperidina, naringina, naringenina,

e sakuranetina (figura 13) (Couto e Canniatti-Brazaca, 2010; Bruice, 2006; Melo e

Guerra, 2002, Bianchi e Antunes, 1999).

32

Figura 13: Estruturas qumicas de antioxidantes fenlicos.

Presume-se dessa forma que mecanismos antioxidantes capazes de

neutralizar os radicais livres pela administrao oral ou tpica, protegem a pele dos

danos oxidativos e podem ter um papel importante na preveno de doenas e no

processo de envelhecimento cutneo (Campos e Frasson, 2011; Vieira et al., 2011;

Kang et al., 2012).

Segundo Roesler (2009), possvel classificar em quatro categorias os

mtodos mais empregados na avaliao da atividade antioxidante proporcionada por

extratos vegetais, sendo necessria a combinao destes para uma anlise

completa do potencial antioxidante.

1. Mtodos que empregam modelos de radicais relativamente estveis como o

DPPH, ABTS, 2-desoxi-D-ribose, nos quais avaliada a capacidade do

extrato vegetal em doar hidrognio a fim de formar no radicais, ou seja,

seqestrar os radicais livres (OH) formados durante a oxidao. Esses

mtodos costumam ser rpidos, simples e muito convenientes para a

varredura um de grande nmero de amostras.

O

OH

OH OH

O

OH

cido ascrbico (vitamina C)

O CH3

CH3 CH3 CH3CH3

R

OH

R

CH3 tocoferol (vitamina E)

OOH

OH O

OH

OH

OH

quercetina

O

OH

OH

O

OOH

OH

R

rutina

O

OH

OOH

O

RO

CH3

hesperidina

O

OOH

OH

OH

naringenina

CH3CH3

CH3 CH3

CH3

CH3CH3 CH3

CH3 CH3caroteno

33

2. Modelos contendo lipdios ou emulses lipdicas como -caroteno, muito

utilizado para avaliar amostras menos polares uma vez que o substrato

empregado uma emulso lipdica.

3. Testes in vitro utilizando como substratos sistemas biolgicos como clulas

de crtex cerebral de rato/boi, lipoprotena de baixa densidade humana

(LDL), cultura de cl