Caracterización Molecular de Enterococcus faecium ...

Caracterización Molecular de Enterococcus faecium

multirresistentes causantes de infecciones en sangre en un

Hospital Universitario del norte de España

Máster Oficial Interuniversitario en Biología Molecular y Biomedicina

Jorge Eduardo Coba Cárdenas

Directora:

María Victoria Francia

Servicio de Microbiología

Hospital Universitario Marqués de Valdecilla e Instituto de Investigación Marqués de

Valdecilla

2017

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Contenido

Abstract ......................................................................................................................................... 3

Antecedentes ................................................................................................................................. 4

Enterococci ................................................................................................................................ 4

Colonización e infección ........................................................................................................... 4

Resistencia a antibióticos en Enterococci ................................................................................. 5

Factores de Virulencia en Enterococci .................................................................................... 10

Epidemiología ......................................................................................................................... 12

Objetivos e Hipótesis .................................................................................................................. 14

Metodología ................................................................................................................................ 16

Hospital ................................................................................................................................... 16

Muestras, identificación bacteriana y ensayos de sensibilidad a antibióticos ......................... 16

Detección de genes de resistencia ........................................................................................... 17

Detección de factores de virulencia ........................................................................................ 18

Electroforesis en campo pulsado ............................................................................................. 19

MLST (Multilocus sequence typing) ...................................................................................... 19

Resultados ................................................................................................................................... 20

Perfil de resistencia a antibióticos y caracterización de los mecanismos de resistencia ......... 20

Detección de factores de virulencia ........................................................................................ 22

Relación clonal de los aislamientos de E. faecium productores de bacteriemias .................... 23

Discusión ..................................................................................................................................... 31

Conclusiones ............................................................................................................................... 33

Importancia y aplicaciones del trabajo .................................................................................... 33

Direcciones futuras .................................................................................................................. 34

Bibliografía ................................................................................................................................. 34

3

Abstract

Molecular characterization of multi-resistant Enterococcus faecium causing bloodstream

infections in a northern Spain University Hospital.

Jorge Eduardo Coba Cárdenas

Hospital Universitario Marqués de Valdecilla

Maria Victoria Francia

Introduction

Multi-resistant CC17 Enterococcus faecium represent an important cause of nosocomial

infections. Our main objective is the analysis of the multi-resistant E. faecium local epidemiology

in the Hospital Universitario Marqués de Valdecilla. To do this, the isolates clonal relationship,

the profile of antibiotic resistance and the presence of virulence determinants will be determined.

Methods

157 E. faecium were isolated from blood cultures between 2009, January and 2016, August. The

identification and antimicrobial resistance profile were determined by “VITEK 2” system. The

resistance and virulence genes determination was performed by PCR and sequencing. The clonal

relationship between the strains was analyzed by PFGE and MLST.

Results

96% of the studied strains showed high level resistance to β-lactams, 99% to quinolones, 98% to

erythromycin and 92% showed high level resistance to streptomycin. Furthermore, 28% of the

isolates were tetracycline-R, 7% gentamycin-R, 2% linezolid-R and 2% chloramphenicol-R.

Glycopeptide resistance was not detected.

The identified resistance genes were: ermB, ermT and mrsC (encoding macrolide-resistance),

ant6-Ia, and aph(3’)-III (high level resistance to streptomycin and kanamycin, respectively),

aac(6’)-Ie_aph(2’)-Ia (high level gentamycin-resistance), tetM and tetL (tetracycline-resistance).

The resistance to quinolones was due to the amino acid alterations S80I or S80R in ParC and

S83Y or S83R in GyrA. The determination of mutations involved in the resistance to ampicillin

is now in course.

The detected virulence genes were: entA (96%), acm (96%), scm (94%), pilA (94%), sgrA (92%),

ecbA (85%), esp (82%) and hyl (17%).

The isolates were classified in 20 pulse-types, highlighting the presence of two main clones with

111 and 24 isolates, corresponding to MLST sequence types ST117 and ST17, respectively.

Conclusions

Most of the strains are part of the sub-cluster CC17 that is well adapted to the hospital

environment. The multi-resistant E. faecium clone ST117 has emerged and disseminated in our

hospital where it has become endemic and represents the 70% of the isolates.

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Antecedentes

Enterococci

El género bacteriano Enterococcus, perteneciente a la familia de las Enterococcaceae, está

formado por bacterias Gram-positivas que son parte de la microbiota normal gastro-intestinal

humana y animal y pueden además estar presentes en el intestino de insectos y en ambientes tan

diversos como alimentos fermentados e incluso en plantas, suelo, agua y superficies inertes ya

que poseen una gran capacidad de adaptación a diferentes condiciones de temperatura, acidez, y

condiciones hipo e hipertónicas (Lebreton, Willems, & Gilmore, 2014).

A pesar de que este género está compuesto por más de 50 especies, las de mayor interés clínico

debido a su relación con casos graves de bacteriemias y endocarditis, sepsis neonatal, infecciones

del tracto urinario, y abscesos intra-abdominales y pélvicos son Enterococcus faecalis y

Enterococcus faecium. Actualmente son una de las principales causas de infección nosocomial.

Hasta mediados de la década de 1990, E. faecalis era la especie más prevalente aislada en muestras

clínicas, cuya presencia representaba entre el 90% y 95% de los casos; a partir de entonces y con

la aparición de nuevas cepas resistentes a los antibióticos normalmente empleados en terapia

(principalmente vancomicina y ampicilina), la prevalencia de E. faecium ha ido incrementándose

considerablemente, encontrándose ahora en una situación de “Prioridad 2: Elevada” en la lista de

patógenos prioritarios para la Investigación y desarrollo de nuevos antibióticos de la Organización

Mundial de la Salud (OMS) (Lebreton, Willems, & Gilmore, 2014) (OMS, 2017) (Kafil &

Asgharzadeh, 2014).

Colonización e infección

Normalmente el cuerpo humano está colonizado por aproximadamente 1012 especies diferentes

de microorganismos que se ubican en diferentes zonas y contribuyen con el desarrollo de los

tejidos y la homeostasis del sistema inmunológico; a estas poblaciones bacterianas se las conoce

como “microbiota normal”. E. faecalis y E. faecium son encontrados normalmente en el intestino

grueso y delgado, principalmente en los consorcios yeyuno-íleon, apéndice cecal (vermiforme) y

recto-sigmoidal, siendo más comunes en las heces humanas (Lebreton, Willems, & Gilmore,

2014).

Comúnmente la infección por enterococos resulta de una colonización previa del tracto gastro-

intestinal que una vez que se ha establecido, puede persistir por meses o años. Cuando las bacterias

llegan a actuar como patógenos oportunistas, atraviesan la barrera mucosa hasta causar

infecciones sistémicas en hospedadores que manifiestan factores de riesgo tales como: pacientes

ancianos, inmuno-comprometidos, sometidos a procedimientos invasivos o que hayan estado

sometidos a quimioterapia o antibiótico-terapia o trasplantes (Lebreton, Willems, & Gilmore,

2014) (Ortega, 2010).

5

Existe una gran variedad de infecciones relacionadas con la presencia de Enterococci, como

endocarditis, bacteriemias, infecciones del tracto urinario, e infecciones intra-abdominales,

pélvicas y de tejidos blandos; meningitis e incluso infecciones respiratorias, cuyo tratamiento

resulta complicado por factores como su resistencia y el estado de los pacientes que, en su

mayoría, son inmuno-comprometidos. En algunos casos, se han aislado otros microorganismos

que acompañan a la infección por el enterococo; en estas situaciones, resulta difícil definir qué

microorganismo es el causante real de la infección (Agudelo & Huycke, 2014).

Resistencia a antibióticos en Enterococci

Desde la aparición en el año 1988 de cepas de enterococos resistentes a vancomicina (VRE:

vancomycin resistant Enterococci) en Francia y el Reino Unido, ha ido aumentando la prevalencia

en ambientes hospitalarios y comunitarios de cepas que poseen también resistencia a penicilinas

y resistencia de alto nivel a aminoglucósidos (HLR: high level resistance), además de a otros

antibióticos, con sus consiguientes complicaciones terapéuticas. La rápida diseminación de estos

enterococos multirresistentes que incluso han llegado a ser considerados endémicos en algunos

países, así como sus posibilidades terapéuticas limitadas les ha convertido en un problema

particularmente grave (Pinholt, et al., 2015) (Rincón, et al., 2014) (Cercenado, Enterococcus:

resistencias fenotípicas y genotípicas y epidemiología en España, 2011) (Kafil & Asgharzadeh,

2014).

Debido a que Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium son parte de la microbiota normal

del intestino humano, están expuestos a una gran variedad de antibióticos durante el transcurso

de las terapias médicas, que marcan un antes y un después en su dinámica ecológica y que trae

como consecuencia, complicaciones en el tratamiento de infecciones.

Se definen dos tipos principales de resistencia a antibióticos:

La resistencia intrínseca que está codificada en el genoma de todos los miembros de la

especie. Los enterococos son intrínseca o naturalmente resistentes a las cefalosporinas y

algunas penicilinas, a concentraciones bajas de aminoglucósidos y a

trimetoprim/sulfametoxazol.

La resistencia adquirida que está presente solo en algunos individuos de la especie y que

se ha obtenido por transferencia genética horizontal de elementos genéticos móviles o por

mutaciones en genes del cromosoma por selección, tras la exposición a diferentes

antibióticos. Las bases principales de la resistencia a antibióticos son: producción de

enzimas que inactivan los antibióticos, disminución de la permeabilidad de la membrana

celular, modificación de la diana intra o extracelular, modificación de la vía metabólica

(como el caso de VREs) o producción de bombas de flujo activo.

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El interés del estudio de los Enterococci y sus resistencias a antibióticos, radica en que estos

microorganismos han desarrollado una capacidad extraordinaria para adquirir exitosos niveles de

tolerancia y resistencia a cualquiera de los antibióticos desarrollados para su uso terapéutico. Tal

es el caso del cloranfenicol, eritromicina y tetraciclinas, cuya aplicación en casos clínicos fue

seguida rápidamente del desarrollo de resistencias, aminoglucósidos, ampicilina, glucopéptidos,

quinolonas, estreptograminas, linezolid, daptomicina y tigeciclina.

1. β-lactámicos: estos antibióticos inhiben el crecimiento bacteriano actuando como

“sustratos suicidas” para D, D-transpeptidasas, también llamadas proteínas de unión a la

penicilina (PBPs), que catalizan la reticulación (el entrecruzamiento por

transpeptidación) de las cadenas laterales del peptidoglicano durante su maduración;

después de esta modificación, y, por lo tanto, inactivación de las PBPs, la síntesis de la

pared celular se ve inhibida.

Los enterococos presentan resistencia intrínseca a la mayoría de las cefalosporinas y en

general son clínicamente sensibles a β-lactámicos como la ampicilina y penicilina. Estos

últimos antibióticos constituyen por lo tanto la opción principal para el tratamiento de las

infecciones por enterococos.

La resistencia intrínseca en enterococos hacia la actividad de los β-lactámicos está

determinada por la producción de PBP5, que es una proteína de unión a la penicilina de

baja afinidad, que está codificada cromosómicamente y permite llevar a cabo la síntesis

del peptidoglicano en concentraciones de antibiótico que saturan todas las PBPs del

enterococo. Mutaciones en el gen pbp5 también están involucradas en aquellos casos de

resistencia adquirida, principalmente a ampicilina (Kristich, Rice, & Arias, 2014)

(Cercenado & Cantón, Detección Fenotípica de Mecanismos de Resistencia en

GramPositivos, 2011).

2. Aminoglucósidos: Los aminoglucósidos actúan mediante su unión al ARN ribosomal

16S de la subunidad 30S del ribosoma, interfiriendo con la síntesis de proteínas. La

resistencia intrínseca en Enterococci es de bajo nivel ya que su transporte hacia el interior

de la bacteria es deficiente. La combinación de agentes activos de la pared celular (β-

lactámico) junto con un aminoglucósido, generan una sinergia en la actividad bactericida

cuyo mecanismo no está comprendido en su totalidad, aunque parece que implicaría una

mejor captación del aminoglucósido. La adquisición de genes que codifican enzimas

modificadoras del aminoglucósido anulan este efecto, incluso en combinación con

agentes activos de la pared celular.

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La resistencia de alto nivel a los aminoglucósidos es, por lo general, adquirida en

elementos móviles que codifican enzimas modificadoras del aminoglucósido tales como:

Fosfotransferasas (APH), que emplean ATP para fosforilar un grupo hidroxilo del

antibiótico,

Acetiltransferasas (AAC), que emplean acetil-CoA para acetilar un grupo amino del

antibiótico,

Nucleotidil-transferasas (ANT), que emplean ATP para adenilar un grupo hidroxilo

del antibiótico.

El gen aac(6)-Ie-aph2-Ia, codifica para una enzima bifuncional que posee una actividad

acetilasa y fosforilasa, resultado de la unión de dos genes ancestrales, que inhibe la

actividad antibiótica principalmente de gentamicina, amikacina y kanamicina. Se ha

encontrado en cerca del 90% de aislados de enterococos con altos niveles de resistencia

a gentamicina y está codificado en transposones o plásmidos conjugativos.

Por su parte el gen aph(3)-IIIa, codifica una fosfotransferasa que confiere un elevado

nivel de resistencia a amikacina; además se ha observado que la presencia de este gen

podría estar relacionado con la resistencia a la acción sinérgica de la combinación

ampicilina-amikacina. El gen ant(6)-Ia (aadE), es responsable de la resistencia de alto

nivel a la estreptomicina mediante la producción de una nucleotidil transferasa.

La resistencia de alto nivel a estreptomicina no viene acompañada de otro tipo de

resistencia; sin embargo, una resistencia de alto nivel a gentamicina, implica resistencia

al resto de aminoglucósidos con excepción de la estreptomicina (Kristich, Rice, & Arias,

2014) (Cercenado, Enterococcus: resistencias fenotípicas y genotípicas y epidemiología

en España, 2011) (Tedim, et al., 2016).

3. Macrólidos, lincosamidas y estreptograminas: Estos antibióticos actúan inhibiendo la

síntesis de proteínas mediante la unión a la subunidad 50S del ribosoma. A pesar de que

no se utilizan en el tratamiento contra Enterococci, su resistencia es prácticamente

generalizada. La resistencia adquirida más común radica en la producción de una enzima

que metila una adenina específica en el ARNr 23S de la subunidad 50S ribosomal, que

produce una reducción de la afinidad de la unión al ribosoma por parte de macrólidos,

lincosamidas y estreptograminas; este fenotipo es conocido como MLSB (Macrólido-

lincosamida-estreptogramina B). Esta enzima está codificada principalmente por el gen

ermB y, en algunas ocasiones, por los genes ermT y ermA. La resistencia a macrólidos

puede deberse también a la presencia del gen transferible mefA, que codifica una bomba

de flujo activo que expulsa el macrólido al exterior de la célula, aunque este efecto es

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menor al generado por ermB. Otro gen de importancia descrito es msrA que confiere

resistencia a macrólidos y estreptogramina B.

Mientras E. faecalis presenta una resistencia intrínseca a las estreptograminas

Quinupristina/Dalfopristina (Q-D), E. faecium es generalmente sensible. Esto puede

deberse a la existencia de un transportador ABC codificado en el cromosoma de E.

faecalis, llamado LSA.

4. Resistencia a glucopéptidos: sus principales representantes son la vancomicina,

teicoplanina y sus derivados. Su modo de acción consiste en la inhibición del crecimiento

bacteriano por interferencia de la síntesis del peptidoglicano. Estos antibióticos se unen

al dipeptido terminal de los precursores del peptidoglicano D-Ala-D-Ala, previniendo

que las enzimas de biosíntesis de la pared celular (por ejemplo, las PBPs) los utilicen

como sustrato para la transglicosilación y transpeptidación, deteriorando así la integridad

de la pared celular.

La resistencia a vancomicina, aunque es relativamente rara en E. faecalis, está

ampliamente diseminada entre las cepas de E. faecium aisladas en el ámbito hospitalario.

El mecanismo bioquímico que genera esta resistencia consiste en la producción de

precursores del peptidoglicano alterados mediante la sustitución del dipeptido terminal

D-Ala-D-Ala (alanina) por D-Ala-D-Lac (lactato) o D-Ala-D-Ser (serina), los cuales

tienen una afinidad menor entre mil y siete veces, respectivamente, por la vancomicina.

La expresión de estos fenotipos en enterococos, está determinada por ocho operones que

codifican la resistencia adquirida a glucopéptidos: vanA, vanB, vanD, vanE, vanG, vanL,

vanM y vanN; mientras que vanC (con sus variantes vanC-1, vanC-2 y vanC-3), codifica

para la resistencia intrínseca, que constituye una propiedad de los Enterococcus móviles:

E. gallinarum y E. casseliflavus.

5. Resistencia a quinolonas: Normalmente, las fluoroquinolonas presentan una actividad

moderada contra los Enterococci. Inhiben el crecimiento bacteriano por interferencia en

la replicación del ADN, específicamente mediante la unión a las enzimas que controlan

el superenrollamiento del ADN, como son las topoisomerasas de tipo II (ADN girasa y

topoisomerasa IV) inhibiéndolas, lo que genera rupturas en la doble hebra del ADN con

consecuencias letales.

En algunas especies, la resistencia a quinolonas está determinada por mutaciones en las

“regiones determinantes de resistencia a quinolonas” de los genes que codifican la ADN

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girasa y la topoisomerasa IV, que producen una inhibición en la unión de la enzima al

antibiótico, lo que permite la replicación del ADN a pesar de la presencia del antibiótico.

Mutaciones en el gen parC, que codifica para la subunidad ParC de la topoisomerasa IV,

constituye un inicio de la resistencia a quinolonas en los enterococos; éstas son seguidas

por mutaciones en el gen gyrA que codifica la subunidad gyrA de la enzima ADN girasa.

Ambas mutaciones en conjunto, dan lugar a una resistencia alta a las quinolonas en

enterococos (Petersen & Jensen, 2003).

6. Resistencia a linezolid: este antibiótico actúa interfiriendo con el crecimiento bacteriano

por inhibición de la síntesis de proteínas a través de la interacción con el complejo de

iniciación de la traducción. La resistencia a linezolid está asociada a mutaciones en el

lazo central del dominio V del ARNr 23S, siendo la más común la mutación G2576U.

Dichas mutaciones evitan o reducen la unión del antibiótico a la subunidad ribosomal. En

enterococos existen múltiples copias de este gen por lo que se produce un mayor nivel de

resistencia cuanto mayor número de alelos mutados. Se ha observado que esta resistencia

se da en mayor medida en pacientes cuyo tratamiento se ha basado en la aplicación de

linezolid por largos periodos de tiempo, por lo que las poblaciones resistentes son

producto de una selección y su proliferación; aunque también se ha observado que la

diseminación clonal está presente (Kristich, Rice, & Arias, 2014) (Sánchez & de la Torre,

2013) (Cercenado, Enterococcus: resistencias fenotípicas y genotípicas y epidemiología

en España, 2011). Recientemente se ha detectado resistencia a linezolid transferible por

el gen cfr, que codifica una metilasa que cataliza la metilación posttranscripcional del

nucleótido A2503 en el ARNr 23S.

7. Resistencia a tetraciclinas: estos antibióticos actúan inhibiendo la síntesis de proteínas

mediante la unión a la subunidad ribosomal 30S bacteriana. Cumplen con una función

básicamente bacteriostática y aunque de amplia aplicación en el tratamiento contra

microorganismos, la alta resistencia en cepas de enterococos, la hace inadecuada para

casos de infecciones producidas por estas bacterias. Los genes involucrados más

frecuentemente en esta resistencia en enterococos son tetM y tetL. La tigeciclina, un

antibiótico miembro de las tetraciclinas, muestra un espectro de actividad más amplio,

que le brinda actividad frente a casi el 80% de las cepas de E. faecalis y E. faecium

sensibles y resistentes a vancomicina, siendo parte de las alternativas terapéuticas para el

tratamiento de infecciones por estos microorganismos.

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Factores de Virulencia en Enterococci

Los factores de virulencia se pueden definir como sustancias que son necesarias para causar

enfermedades en los organismos huésped, pero no son necesarias para la supervivencia del

organismo patógeno. Aunque en ciertas cepas, la expresión de estos genes confiere a los

microorganismos características adicionales que, junto a la resistencia a antibióticos que

codifican, les permite adaptarse y diseminarse de manera más eficiente por el ambiente

hospitalario, generando brotes infecciosos de difícil control, no se encuentran en todos los aislados

clínicos de interés. Hay que tener en cuenta que la infección por Enterococci depende de muchas

variables que involucran características tanto del organismo patógeno cómo del huésped. Se

pueden considerar factores de patogenicidad en esta bacteria a aquellos que contribuyen a una

mejor adaptación de la misma para la colonización del tracto intestinal, su translocación a través

de la pared del intestino y su fijación a órganos internos u otros tejidos del huésped.

Estudios disponibles se centran en diversas propiedades asociadas con la virulencia como la

adherencia a varios componentes de tejidos del huésped, la formación de biofilms y la infección

en modelos animales (Strateva, Atanasova, Savov, Petrova, & Mitov, 2016).

En E. faecium, se han descrito los siguientes determinantes de virulencia: acm (adhesin of

collagen from E. faecium), esp (enterococcal surface protein) y otros MSCRAMMs (microbial

surface component recognizing adhesive matrix molecules) y estructuras proteicas de superficie

conocidas como pili (bpfm pili).

1. Acm: Estudios realizados en aislados clínicos de E. faecium relacionados con la

adherencia al colágeno han demostrado una alta asociación de este gen con la virulencia

cuando se compara con cepas de la misma especie procedente de otros ambientes (animal

o fecal). Esto sugiere que la adherencia a colágeno puede estar relacionada con la

capacidad de estos microorganismos para colonizar, persistir y causar infecciones en

ambientes hospitalarios. El gen involucrado en este efecto denominado acm (adhesina de

colágeno para E. faecium), codifica una proteína de la familia MSCRAMM (microbial

surface components recognizing adhesive matrix molecules) y determina el nivel de

adherencia en función de la cantidad de Acm producido en la superficie celular

(Montealegre, et al., 2016).

Se ha confirmado que este gen es un mediador de la adherencia al colágeno por parte de

E. faecium. Su presencia se ha evidenciado en casi todos los aislados invasivos del

microorganismo; aunque también está presente en casi una cuarta parte de los aislados de

origen no clínico, en estos es inactivo o se encuentra frecuentemente interrumpido por la

inserción de un transposón.

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Otros estudios han demostrado que anticuerpos anti-Acm, obtenidos de suero de un

paciente con endocarditis, inhiben significativamente la adherencia de E. faecium al

colágeno, lo que hace de Acm una potencial diana terapéutica para el desarrollo de

estrategias basadas en anticuerpos para aplicación en inmuno-profilaxis o en combinación

con antibióticos para el tratamiento de infecciones causadas por este organismo (Garsin,

et al., 2014) (Strateva, Atanasova, Savov, Petrova, & Mitov, 2016).

2. Ebpfm pili: En las bacterias gram-positivas, las estructuras denominadas “pili” son

usualmente codificadas por dos o tres genes contenidos en un operón, y están

estrechamente relacionadas tanto con la adhesión de las bacterias a la matriz extra-celular

como con la formación de biofilms.

Ebpfm es un operón que incluye tres genes codificantes de pili, que inicialmente fueron

llamados ebpAfm, ebpBfm y ebpCfm. Aunque aún no está comprendido en su totalidad,

los pili codificados por Ebpfm podrían cumplir un papel similar en E. faecium y en E.

faecalis, como la adhesión al colágeno, fibrinógeno y plaquetas del huésped en casos de

endocarditis. Se ha demostrado que en E. faecium TX16 (primer genoma de E. faecium

disponible) se producen tres pili adicionales además de otros genes MSCRAMM (fms8 o

acm, fms10 o scm, fms21 o pilA y sgrA), los cuales guardan relación con los mecanismos

de adherencia y en consecuencia de virulencia (Garsin, et al., 2014) (Montealegre, et al.,

2016).

3. Esp: el gen esp se localiza en una isla de patogenicidad y codifica una proteína de anclaje

a la pared celular (LPXTGmotif). Estudios realizados han demostrado que esp en E.

faecium, al igual que en E. faecalis, está implicado con la formación de biofilms y

aumenta la virulencia en infecciones del tracto urinario en modelos animales, así como la

virulencia en endocarditis. Sin embargo, no se ha observado su relación en casos de

peritonitis en ratones, colonización intestinal y adherencia al epitelio intestinal (Garsin,

et al., 2014).

4. Hyl: el gen hyl (hialuronidasa) presenta una prevalencia relativamente alta en aislados

clínicos de E. faecium cuando se compara con aislamientos de E. faecium comunitarios y

está codificado por mega-plásmidos.

5. Bacteriocinas: son péptidos antimicrobianos producidos a nivel del ribosoma bacteriano,

procesados o no por enzimas adicionales de modificación post-traduccional (PTM:

Posttranslational modification), que son exportados al medio extra-celular. (Alvarez-

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Sieiro, Montabán-López, Dongdong, & Kuipers, 2016). Las bacteriocinas producidas por

enterococos guardan similitud a las producidas por otras bacterias ácido lácticas (como

Lactobacilli) cuya actividad confiere beneficios a la salud humana cuando se emplean en

alimentación, por ejemplo. Sin embargo, en enterococos la actividad de las bacteriocinas

puede ser interpretada como un factor de virulencia ya que su capacidad de eliminar

bacterias que compiten por nutrientes y por un mismo nicho, le permite prevalecer en el

entorno, mejorando así su capacidad de colonización y prevalencia en el huésped; y en

consecuencia le confiere mayor oportunidad de infección (Padilla, Núñez, Padilla, &

Lobos, 2012).

Genes involucrados en la producción de bacteriocinas se han identificado en cepas de E.

faecalis y E. faecium aislados de diferentes ambientes, pero parecen ser más habituales

en cepas aisladas del tracto gastrointestinal humano y de animales. El gen entA, ha sido

ampliamente identificado en cepas de E. faecium de origen clínico (Ness, Diep, & Ike,

2014).

Epidemiología

Desde finales de la década de 1980 e inicios de la década de 1990, el género bacteriano

Enterococcus se ha convertido en un importante patógeno causante de serias afecciones en el ser

humano. Factores como la resistencia a antibióticos intrínseca o adquirida, junto con los factores

de virulencia antes citados, brindan a cepas de Enterococcus, una gran capacidad para propagarse

exitosamente, sobretodo en ambientes hospitalarios. Esta diseminación de cepas multirresistentes

y “más virulentas” de origen nosocomial, directa o indirectamente de paciente a paciente, depende

en gran parte de variables como la higiene de manos del personal sanitario y de quienes están en

contacto directo con los pacientes, de la limpieza del ambiente hospitalario y de los instrumentos

médicos y quirúrgicos y de controles efectivos sobre los brotes nosocomiales (Raven, et al., 2016)

(OMS, 2017).

La capacidad de determinadas cepas de enterococos para colonizar e infectar principalmente a

pacientes inmuno-comprometidos e intervenidos en las unidades de cuidados intensivos de los

hospitales, (que, en ciertos casos, reciben tratamientos con múltiples antibióticos) junto al

desarrollo y aplicación de terapias médicas invasivas y al notable incremento de la resistencia a

antibióticos en aislamientos clínicos tanto de E. faecalis como de E. faecium, hace necesaria la

investigación de estas cepas con fines epidemiológicos y de control. De hecho, es destacable la

diseminación global de determinadas cepas multirresistentes de E. faecium. Esta diseminación,

explica que en la actualidad E. faecium haya llegado a ser tan prevalente como E. faecalis en

muestras clínicas. (Tedim, et al., 2016) (Daylan Cilo, et al., 2014) (Rincón, et al., 2014) (Agudelo

& Huycke, 2014). Los estudios epidemiológicos han adquirido gran importancia en el campo de

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la microbiología clínica debido a la cantidad de información que proporcionan para una política

adecuada de control de infecciones; además, ayudan con el entendimiento de la estructura

poblacional de los microorganismos estudiados, de la relación evolutiva entre diferentes cepas y

de su diseminación en el ambiente hospitalario.

Se ha utilizado una gran cantidad de métodos para establecer la relación clonal entre aislamientos

de E. faecium, pero los más extendidos son el PFGE (Pulsed field gel electrophoresis) y el MLST

(Multilocus sequence typing).

Mientras la técnica de tipado de PFGE se aplica para definir la epidemiología local o durante un

periodo corto de tiempo, la técnica de tipado MLST se aplica para definir la epidemiología global

o a lo largo de un tiempo establecido de una especie bacteriana en particular. Su aplicación se ha

extendido a estudios de población y biología evolutiva. La técnica consiste en la amplificación y

secuenciación de fragmentos internos de varios genes housekeeping de la bacteria. Para el estudio

de Enterococcus faecium se analiza la secuencia interna de siete genes conservados (atpA, ddl,

gdh, purK, gyd, pstS y adk), que presuntamente representan la historia evolutiva de sus genomas.

Es frecuente su utilización para el análisis de los aislados clínicos de E. faecium resistentes a

ampicilina, quinolonas y otros antibióticos normalmente empleados en la terapia (Raven, et al.,

2016). En general el MLST se aplica a una selección de cepas representativas de cada grupo

filogenético a partir del árbol que ha sido determinado mediante el análisis de los pulso-tipos

vistos con el PFGE. La secuencia tipo sería la suma de los alelos encontrados para cada uno de

los siete genes. Los datos obtenidos por MLST para distintas cepas de E. faecium se pueden

analizar vía eBurst, un algoritmo usado ampliamente para el estudio de las relaciones filogenéticas

entre aislados para generar hipótesis sobre el origen evolutivo en bacterias. Como resultado se

determinó que la mayoría de cepas clínicas causantes de infecciones pertenecían a un gran clúster

que fue denominado “lineaje C1” y posteriormente “complejo clonal 17 (CC17)” por ST17, la

secuencia tipo de la que parecía que derivaban o secuencia tipo fundadora. Este grupo de cepas

relacionadas entre sí poseían, entre sus características comunes, resistencia a ampicilina y

ciprofloxacino, además de factores de virulencia como el gen esp y genes MSCRAMM y mayor

virulencia en modelos animales. Sin embargo, asumir que todo el complejo CC17 provenía de

una sola ST originaria, parece ser erróneo ya que en E. faecium la tasa de recombinación es muy

alta por lo que ésta genera mayor diversidad genética que las mutaciones, por lo tanto, el análisis

por eBurst, que no lo tiene en cuenta, no resulta fiable. En consecuencia, se han aplicado nuevos

algoritmos que tienen en cuenta también a la recombinación homóloga para analizar los datos

obtenidos por MLST, como el BAPS (Bayesian Analysis of Population). Estos análisis, sugieren

que el complejo clonal CC17 consta realmente de dos grandes grupos con diferente origen

evolutivo: BAPS 2-1 (que contiene la secuencia tipo ST78), y BAPS 3-3 (con las secuencias tipo

ST17 y ST18). A ambos grupos pertenecen la mayoría de aislados clínicos estudiados en distintos

14

hospitales de todo el mundo (Raven, et al., 2016) (Palmer, van Schaik, Willems, & Gilmore,

2014). Estas secuencias tipo caracterizan a las tres líneas principales hospitalarias de E. faecium:

línea ST78, línea ST17 y línea ST18. Al tener diferente origen ancestral, los genes que

caracterizan a los aislados clínicos que las componen se han adquirido independientemente en

cada una de las líneas.

Objetivos e Hipótesis

Estudios previos realizados en el Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (HUMV), el

hospital de referencia de la Comunidad Autónoma de Cantabria, durante los años 2005 a 2008

han demostrado que la mayoría de aislados de E. faecium obtenidos de muestras clínicas

pertenecen al sub-clúster CC17 (antes conocido como complejo clonal 17), sobre todo a las líneas

humanas ST17 y ST18. Estas cepas son, en general, multirresistentes (resistentes a muchos de

los antibióticos disponibles en la terapia) y codifican para diferentes genes de virulencia que les

confieren una ventaja selectiva para la colonización del tracto intestinal humano y para su

diseminación y persistencia dentro del ambiente hospitalario. A partir del año 2009 hasta la

actualidad hemos observado un aumento brusco en las bacteriemias producidas por E. faecium en

nuestro hospital, de forma que de menos de 10 hemocultivos positivos para crecimiento de E.

faecium por año hemos pasado a casi 30 por año. Este aumento también se ve reflejado en el

número total por año de aislamientos de E. faecium de muestras clínicas.

Cuando se han realizado estudios a largo plazo en diferentes hospitales se han observado

diferencias temporales en la prevalencia de determinados clones, pero no se sabe cuál es la

dinámica de aparición y diseminación de nuevos clones.

Por ello y para intentar comprender qué ha pasado en nuestro hospital a partir del año 2009 que

explique estas diferencias con respecto a los años anteriores, nos propusimos ampliar el estudio

arriba mencionado, investigando la población de E. faecium aislados durante los años 2009 a

2016. Ya que las cepas aisladas de hemocultivos representan bien la población total de E. faecium

en nuestro hospital (estudio arriba mencionado), nos centraremos sólo en el estudio de estos

aislamientos.

Nuestra hipótesis de partida es:

En nuestro hospital se ha introducido un clon nuevo de E. faecium CC17 más adaptado al

ambiente hospitalario que se ha diseminado rápidamente por las diferentes Unidades y Servicios

Clínicos.

15

Nuestros objetivos concretos son:

1. Determinar la relación clonal entre las cepas de Enterococcus faecium aisladas a partir de

muestras clínicas de hemocultivos, procedentes del HUMV durante los años 2009 a 2016.

2. Determinar el fenotipo y el genotipo de resistencia a antibióticos de las cepas en estudio.

3. Analizar la presencia de genes de virulencia en las cepas en estudio.

16

Metodología

Hospital

El Hospital Universitario Marqués de Valdecilla es un hospital terciario, ubicado en la ciudad de

Santander en la comunidad autónoma de Cantabria (España) con 850 camas. El laboratorio de

Microbiología Clínica recibe muestras tanto de pacientes admitidos en el propio hospital como de

pacientes que acuden a consulta externa de las diversas Especialidades, así como derivados de la

Atención Primaria de un área de unos 300.000 habitantes

Muestras, identificación bacteriana y ensayos de sensibilidad a antibióticos

Se aislaron 157 cepas de Enterococcus faecium procedentes de hemocultivos remitidos al Servicio

de Microbiología Clínica entre enero de 2009 y agosto de 2016. La identificación bacteriana, a

nivel de especie junto con el perfil de sensibilidad a antibióticos de los aislamientos se determinó

con el sistema Vitek 2 (BioMérieux) (Tabla 1). Tras la identificación y estudios de sensibilidad,

las cepas se guardaron prospectivamente a -80°C.

La sensibilidad a tetraciclinas se realizó mediante la técnica de difusión por disco, de acuerdo a

las recomendaciones del CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI, 2007).

Tabla 1: Antibióticos analizados por Vitek 2 para la determinación del perfil de resistencia de los aislamientos de E.

faecium estudiados

Nombre del Antibiótico Grupo/Familia

Amoxicilina β-lactámico (penicilina)

Ampicilina β-lactámico (penicilina)

Penicilina-G β-lactámico (penicilina)

Imipenem β-lactámico (carbapenem)

Ciprofloxacino Quinolona

Levofloxacino Quinolona

Gentamicina (alto nivel) Aminoglucósido

Kanamicina (alto nivel) Aminoglucósido

Estreptomicina (alto nivel) Aminoglucósido

Teicoplanina Glucopéptido

Vancomicina Glucopéptido

Eritromicina Macrólido

Tigeciclina Tetraciclina

Cloranfenicol Anfenicol

Cotrimoxazol Sulfamida

Nitrofurantoína Nitrofurano

Quinupristina/Dalfopristina Estreptogramina

Linezolid Oxazolidinona fluorada

(sintético)

Tomado de BioMérieux, 2017.

17

Detección de genes de resistencia

La determinación de los mecanismos de resistencia a antibióticos se realizó mediante reacción en

cadena de la polimerasa (PCR) con oligonucleótidos específicos para cada uno de los genes

ensayados, tal como se indica en la Tabla 2:

Aminoglucósidos: aac(6)-Ie-aph2-Ia, aph(3)-IIIa, ant(6)-Ia (aadE) y sat4,

Macrólidos: ermB, msrC, ermT,

Tetraciclinas: tetL, tetM,

Cloranfenicol: cat

Tabla 2: Lista de cebadores y sus secuencias, empleados en estudio de los mecanismos de resistencia de los

aislamientos de E. faecium en estudio.

Resistencia a

antibióticos Gen Secuencias

Aminoglucósidos

aac(6)-Ie-aph2-Ia 5’- CAGAGCCTTGGGAAGATGAAG -3’

5’- CCTCGTGTAATTCATGTTCTGGC -3’

aph(3)-IIIa 5’- GCCGATGTGGATTGCGAAAA -3’

5’- GCTTGATCCCCAGTAAGTCA -3’

ant(6)-Ia (aadE) 5’- ACTGGCTTAATCAATTTGGG -3’

5’- GCCTTTCCGCCACCTCACCG -3’

sat4 5’- GTTGGCGTATAACATAGTATCG -3’

5’- CTGCGAAAAAATTGGAACC -3’

Macrólidos

ermB 5’- GAAAAGGTACTCAACCAAATA -3’

5’- AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC -3’

msrC 5′- AAGGAATCCTTCTCTCTCCG -3’

5′- GTAAACAAAATCGTTCCCG -3’

ermT 5′- TCAAAGCATCATATAAATGAA -3’

5′- GCTAATATTGTTTAAATCGTCAAT -3’

Tetraciclinas

tetM 5′- GTTAAATAGTGTTCTTGGAG -3’

5′- CTAAGATATGGCTCTAACAA -3’

tetL 5′- ATAAATTGTTTCGGGTCGGTAAT -3’

5′- AACCAGCCAACTAATGACAATGAT -3’

Cloranfenicol cat 5′- AACAAAATGACAAACGGG -3’

5′- TATCCTTGGTTATCAGGG -3’

El programa de amplificación consistió en un ciclo de desnaturalización inicial a 95°C durante 7

minutos, seguido por 35 ciclos de 95°C, 30 segundos, 50°C, 30 segundos y 72°C, 1 minuto,

seguido de una extensión final a 72°C durante 10 minutos.

Los productos de PCR fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% seguido

de una tinción en bromuro de etidio y detectados con el Sistema de Imagen Alpha-imager del

foto-documentador Alpha-view. Los datos de presencia/ausencia de cada uno de los genes fueron

ingresados en la base de datos correspondiente.

La base de la resistencia a quinolonas se determinó mediante amplificación de la región específica

de los genes gyrA y parC (Tabla 3) tal y como se ha indicado anteriormente; los productos de

PCR se purificaron con el kit Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) y se enviaron a secuenciar

18

a Macrogen España. La secuencia obtenida se comparó con la secuencia “wt” del gen

correspondiente con el programa Multalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/) y se

localizaron las mutaciones en cada uno de los aislamientos. Para su ejecución, se seleccionaron

cepas resistentes a quinolonas representativas de uno de los diferentes clones o pulso-tipos

obtenidos.

Tabla 3: Secuencias de los cebadores gyrA y parC.

Resistencia a


Quinolonas

gyrA 5’- CGGGATGAACGAATTGGGTGTGA-3’

5’- AATTTTACTCATACGTGCTTCGG-3’

parC 5’- TTCCCGTGCATTTCGATCAGTACTTC-3’

5’- CGTATGACAAAGGATTCGGTAAATC-3’

El mecanismo que explica la resistencia a ampicilina en E. faecium se debe en general a

mutaciones en el extremo carboxilo de PBP5. Para su identificación se emplearon los cebadores

de la Tabla 4. Esta parte del estudio se encuentra en desarrollo.

Tabla 4: Secuencias de los cebadores pbp5.

Resistencia a


Penicilina pbp5 5’- AACAAAATGACAAACGGG-3’

5’- TATCCTTGGTTATCAGGG-3’

Detección de factores de virulencia

La presencia de los genes de virulencia estudiados (esp, hyl, entA, sgrA, ecbA, acm, scm y pilA)

se determinó mediante PCR con las condiciones de amplificación arriba mencionadas utilizando

los cebadores indicados en la Tabla 5.

Tabla 5: Lista de cebadores y sus secuencias, empleados en estudio de virulencia en E. faecium.

Gen Secuencias

esp 5′- AGATTTCATCTTTGATTCTTGG-3’

5′- AATTGATTCTTTAGCATCTGG-3’

hyl 5′- ACAGAAGAGCTGCAGGAAATC -3’

5′- GACTGACGTCCAAGTTTCCAA-3’

entA 5′- TATGGGGGTACCACTCATAG -3’

5′- ACCTAAAAAACCACCTAT-3’

sgrA 5′- AATGAACGGGCAAATGAG -3’

5′- CTTTTGTTCCTTAGTTGGTATGA -3’

ecbA 5′- GCAGTTTACAATGGTGTGAAGCAA -3’

5′- CGGCTAATGAGTATTTGTCGTTCC -3’

acm 5′- CAGGCAGAGATATCAGCAG -3’

5′- ATTCTCATTTGTAACGACTAGC -3’

scm 5′- GAAACATACATTCCTAAAGACCCTGG -3’

5′- ACCATTGTCGCTGATAAATATT -3’

pilA 5′- CTTATTGGAATGTTAGGAATCAT -3’

19

5′- TCAGTAGCAGTCAGCTTTCC -3’

Electroforesis en campo pulsado

El ADN total de cada uno de los aislamientos se preparó en bloques de agarosa y se digirió con

SmaI (Roche, Barcelona) siguiendo las recomendaciones de la SEIMC (Sociedad Española de

Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica). La electroforesis en campo pulsado se llevó

a cabo con el CHEF DRIII System (Bio-Rad) tal y como se indica en Coll, Coque, Domínguez,

Vázquez, & Vila, 2005. Los patrones de PFGE se interpretaron de acuerdo a los criterios

indicados por Tenover y col., y se analizaron mediante el software FPQuest 4.5 de Bio-Rad que

dio lugar a un dendrograma que permitió definir la relación filogenética entre las cepas estudiadas.

MLST (Multilocus sequence typing)

El MLST se realizó a cepas seleccionadas en función de su patrón de PFGE de acuerdo al esquema

de MLST de E. faecium utilizando 7 genes housekeeping, tal y como se indica en la página web

de MLST en la sección de E. faecium (MLST, 2017). Las secuencias tipo MLST (o STs) se

generaron utilizando la página web http://efaecium.mlst.net/.

El ensamblaje de secuencias para determinar las STs (secuencias tipo), se realizó con el software

Vector NTI de ThermoFisher Scientific.

http://efaecium.mlst.net/

20

Resultados

Perfil de resistencia a antibióticos y caracterización de los mecanismos de resistencia

La mayoría de los aislamientos de E. faecium procedentes de hemocultivos recogidos durante los

años 2009 a 2016, presentó resistencia a las quinolonas (cipro y levofloxacino), eritromicina y β-

lactámicos (ampicilina y amoxicilina) (96%). Y un porcentaje importante eran resistentes a altos

niveles de estreptomicina y kanamicina (92%).

Las resistencias de menor prevalencia fueron a: tetraciclina (28%), la combinación de

quinupristina/dalfopristina (14%), gentamicina (7%) y linezolid (2%) (Tabla 6).

Tabla 6: Porcentaje de cepas de E. faecium resistentes a los antibióticos estudiados.

Antibióticos %Resistencia

Ciprofloxacina/Levofloxacino 99,4

Eritromicina 98,7

Ampicilina/Amoxicilina 96,2

Gentamicina (Alto Nivel) 7

Kanamicina (Alto Nivel) 92,3

Estreptomicina (Alto Nivel) 92,3

Tetraciclina 28

Quinupristina/Dalfopristina 14,7

Linezolid 2

Cloranfenicol 2

Tres aislamientos fueron resistentes a cloranfenicol, representando el 2% del total estudiado.

Ninguna de las cepas estudiadas presentó resistencia a Tigeciclina, sin embargo, los datos

obtenidos mediante Vitek 2, dieron un nivel intermedio de resistencia a este antibiótico en una

cepa. De la misma manera, ninguno de los aislamientos presentaron resistencia a glucopéptidos

(vancomicina y teicoplanina).

Ya que la mutirresistencia se define como la resistencia a tres o más antibióticos no relacionados

entre sí, la mayoría de los aislamientos (96%) fueron multirresistentes (Figura 1). Incluso es de

destacar que un 86% de las cepas de E. faecium estudiadas, presentaron resistencia simultánea, a

al menos, 5 antibióticos pertenecientes a diferentes familias.

La resistencia a macrólidos se asoció fundamentalmente a los genes de resistencia msrC y ermB

(Figura 2) , que además fueron los genes con mayor prevalencia en el estudio (99 y 87%,

respectivamente) (Figura 2). Aquellas cepas que no codificaban el gen ermB a pesar de ser

resistentes a eritromicina, fueron positivas para el gen ermT.

21

Figura 1: Porcentaje de cepas resistentes a un número determinado de antibióticos no relacionados.

El 89% de las cepas analizadas portaba los genes, aph(3)-III y, ant(6)-Ia (aadE), cuya expresión

está relacionada con la resistencia de alto nivel a los aminoglucósidos kanamicina y

estreptomicina, respectivamente (Figura 2). El gen aac(6)-Ie-aph2-Ia fue el responsable de la

resistencia a Gentamicina en seis de las diez cepas gentamicina-resistentes.

La resistencia a tetraciclina se asoció a los genes tetL y tetM, que presentaron una prevalencia del

27% y 6%, respectivamente, en las cepas estudiadas.

Las tres cepas que presentaron resistencia a cloranfenicol resultaron positivas a la presencia del

gen de resistencia “cat”. Además, el gen se encontró en una cepa adicional que no manifestaba

resistencia a este antibiótico, lo que sugiere que el gen, aunque está presente, no se expresa.

La base de la resistencia a quinolonas en nuestros aislamientos fueron alteraciones en ParC: S80I

(isoleucina por serina) y S80R (arginina por serina) y GyrA: S83Y (tirosina por serina) y S83R

(arginina por serina). De los análisis realizados, se determinó que un 74,5% de los aislamientos

de E. faecium estudiados presentaron simultáneamente las mutaciones ParC(S80I)+GyrA(S83Y),

aquellos correspondientes a los pulso-tipos 1, 3 y 5 (ver Figura 4). El 15,3% de las cepas

estudiadas contenían las mutaciones ParC(S80I)+GyrA(S83R), aquellas coincidentes con los

pulso-tipos 2 y 13. La cepa caracterizada con el pulso-tipo 10 presentó las mutaciones

ParC(S80R)+GyrA(S83Y), mientras que la cepa con el pulso-tipo 8 contenía la mutación

GyrA(S83Y).

0%2%

2%10%

55%

31%

%CEPAS RESISTENTES A GRUPOS DE ANTIBIÓTICOS

1R

2R

3R

4R

5R

>6R

22

Figura 2: Variedad y porcentaje de los genes de resistencia presentes en los aislamientos estudiados.

Detección de factores de virulencia

Los genes de virulencia más prevalentes en las cepas de E. faecium estudiadas fueron entA, acm

(fms8), scm (fms10) y pilA (fms21), con porcentajes mayores a 94% (Figura 3). Aunque con una

prevalencia menor, se detectaron también los genes sgrA(orf2351) en un 92% de los aislamientos,

ecbA(orf2430) en un 85% y esp en un 81% de las cepas. El gen hyl se encontró en un 17,2% de

los aislamientos, siendo el menos prevalente de los genes de virulencia estudiados (Figura 3).

Figura 3: Genes de virulencia identificados en los aislamientos de E. faecium estudiados

87,3

99,4

89,8 89,8 88,5

27,4

5,72,5 1,9

Po

rcen

taje

GENES DE RESISTENCIA

ermB msrC ant6 aph3 sat4 tetM tetL cat ermT

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

1

81,5

17,2

95,5 91,785,4

95,5 94,3 94,3

Genes de Virulencia

esp hyl entA sgrA(orf2351)

ecbA(orf2430) acm (fms8) scm (fms10) pilA(fms21)

23

Relación clonal de los aislamientos de E. faecium productores de bacteriemias

Los aislamientos se clasificaron en 20 pulso-tipos diferentes (Figura 4), destacando la presencia

de dos clones principales “Clon 1” y “Clon 2” que incluían al 70,7% y al 14,6% de las cepas

estudiadas, respectivamente (Figura 4).

El análisis por MLST de las cepas seleccionadas por cada patrón de PFGE, mostraron 3

secuencias tipo conocidas: ST117 (Clon_1), ST17 (Clon_2 y pulso-tipo 13) y ST18 (cepa 4,

pulso-tipo 20). La Tabla 7 incluye el análisis MLST de la cepas estudiadas indicando los alelos

encontrados para cada uno de los genes, así como la ST que corresponde a estas combinaciones

y el número de aislamientos pertenecientes a cada ST, así como el pulso-tipo característico (Tabla

7). Para algunas cepas este análisis continúa desarrollándose.

Tabla 7: Análisis de MLST de los aislamientos de E. faecium estudiados

Pulso-tipo ST N° Cepas atpA ddl gdh purK gyd pstS adk

1 117 111 9 1 1 1 1 1 1

2,13 17 24 1 1 1 1 1 1 1

3 ND 4 1 1 1 1 1 1 ND

5 ND 2 9 1 1 1 12 1 ND

8 ND 1 9 3 1 6 1 1 ND

10 ND 1 15 1 1 44 ND 20 ND

20 18 1 7 1 1 1 5 1 1

Datos obtenidos mediante el análisis en: http://efaecium.mlst.net/

ND: No Determinado

En la Tabla 8 se presenta un resumen con toda la información obtenida en esta sección.

Dic

e (O

pt:2

.41

%) (T

ol 0

.7%

-0.7

%) (H

>0

.0%

S>

0.0

%) [1

9.4

%-9

7.4

%]

PF

GE

_S

maI

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

PF

GE

_S

ma

I

11

-37

98

14

-40

10

14

-62

39

11

-16

85

12

-11

08

12

-33

48

12

-90

0

15

-17

32

15

-44

22

14

-10

87

14

-89

6

13

-27

76

13

-51

5

11

-84

9

12

-44

03

12

-49

03

12

-50

13

13

-26

09

13

-37

59

13

-14

90

13

-22

81

10

-55

64

10

-55

90

16

-48

88

12

-55

17

9-3

73

7

15

-11

09

15

-59

25

15

-57

13

16

-20

38

15

-30

20

15

-52

75

14

-46

6

14

-29

44

16

-57

4

11

-62

05

15

-51

80

13

-55

36

9-1

47

0

12

-30

11

14

-62

6

10

-29

69

10

-31

60

10

-32

05

10

-37

94

10

-38

92

10

-37

33

12

-21

45

12

-23

34

12

-19

64

12

-20

50

12

-18

43

10

-31

27

12

-31

70

15

-55

60

10

-45

17

12

-12

27

10

-69

83

11

-14

74

11

-57

3

11

-67

8

14

-43

12

12

-41

31

13

-42

02

13

-43

53

11

-19

02

11

-27

65

11

-45

0

11

-52

50

11

-67

6

15

-70

31

14

-32

9

14

-61

42

11

-59

3

11

-65

2

13

-22

80

13

-26

12

13

-31

2

15

-64

72

15

-75

38

12

-41

32

12

-64

76

13

-22

2

13

-17

13

12

-25

45

12

-26

59

12

-27

72

10

-52

68

14

-14

68

16

-47

24

13

-21

51

11

-15

93

13

-35

6

15

-82

97

14

-20

86

14

-45

50

13

-59

12

14

-18

65

14

-19

74

14

-21

92

16

-00

9

14

-24

33

15

-60

63

15

-61

88

14

-12

51

15

-65

98

14

-20

85

15

-18

44

15

-23

48

15

-99

2

15

-30

16

15

-22

25

16

-00

2

11

-24

28

13

-84

5

13

-25

66

16

-13

48

16

-20

2

12

-11

63

16

-19

30

15

-61

87

15

-82

0

15

-58

12

15

-65

18

15

-63

29

16

-70

6

16

-39

60

15

-59

98

16

-46

67

13

-59

14

14

-63

71

15

-44

21

15

-32

6

13

-27

02

15

-34

91

10

-50

00

9-4

79

4

9-5

06

7

9-1

87

1

9-3

45

6

9-4

16

2

11

-46

68

12

-68

4

12

-41

7

12

-74

24

10

-63

91

11

-53

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riR, L

evR

, StrR

Am

pR

, Cip

R, E

riR, L

evR

, StrR

Am

pR

, ImiR

, Cip

R, L

evR

, Co

triR, P

en

iR, E

riR, S

trR, K

mR

Am

pR

, ImiR

, Cip

R, L

evR

, Co

triR, P

en

iR, E

riR, S

trR, K

mR

Am

pR

, ImiR

, Cip

R, L

evR

, Co

triR, P

en

iR, E

riR, S

trR, K

mR

Am

pR

, ImiR

, Cip

R, L

evR

, Co

triR, P

en

iR, E

riR, S

trR, K

mR

Am

pR

, ImiR

, Cip

R, L

evR

, Co

triR, P

en

iR, E

riR, S

trR, K

mR

Am

pR

, ImiR

, Cip

R, L

evR

, Co

triR, P

en

iR, E

riR, S

trR, K

mR

Am

pR

, ImiR

, Cip

R, L

evR

, Co

triR, P

en

iR, E

riR, S

trR, K

mR

Am

pR

, ImiR

, Cip

R, L

evR

, Co

triR, P

en

iR, E

riR, S

trR, K

mR

Am

pR

, ImiR

, Cip

R, L

evR

, Co

triR, P

en

iR, E

riR, S

trR, K

mR

Am

pR

, ImiR

, Cip

R, L

evR

, Co

triR, P

en

iR, E

riR, S

trR, K

mR

Am

pR

, ImiR

, Cip

I, Le

vI, Pe

niR

, EriI

Cip

I, Le

vI, EriR

, Q/D

I

Le

vI, EriI

Cip

I, Le

vI, EriI

Cip

R, L

evR

, StrR

, ClfR

Am

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, Pe

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, EriR

, StrR

, Km

R

Am

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, ImiR

, Le

vI, NitR

, Pe

niR

, EriR

Clon 1Clon 2

* * ***

Figura 4: Pulso-tipos de las cepas de E. faecium estudiadas y su relación clonal.

Tabla 8: Resumen de los datos obtenidos del análisis de cepas de E. faecium procedentes de hemocultivos.

N° Cepa MLST Pulso-tipo Perfil de Resistencia Genes de Resistencia Genes de Virulencia

1 17 13 Ap,Cip,Er,HGm,HSt,Cl ermB,msrC,ant6,aac6aph2,aph3,sat4,cat esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,scm,pilA

2 117 1 Ap,Cip,Er,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,scm,pilA

3 117 1 Ap,Cip,Er,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

4 18 20 Ap,Cip,Q-D,Er,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,entA,sgrA,acm,scm



7 117 1 Ap,Cip,HSt msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

8 117 1 Ap,Cip,Er,HKm,HSt msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

9 117 1 Ap,Cip,Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 entA,ecbA,acm,scm,pilA

10 117 1 Ap,Cip,Er,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

11 117 1 Ap,Cip,Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

12 117 1 Ap,Cip,Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA


14 117 1 Ap,Cip,Er,HKm,HSt ermB,msrC,aac6aph2ant6,aph3,sat4 entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

15 117 1 Ap,Cip,Er,HGm,HKm,HSt ermB,aac6aph2,msrC,ant6,aph3,sat4,cat esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm

16 117 1 Ap,Cip,Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

17 117 1 Ap,Cip,Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

18 ND 17 Cip,HSt msrC,aac6aph2,cat entA,acm,scm

19 17 2 Ap,Cip,Er,HGm,HKm ermB,aac6aph2,msrC,aac6aph2 esp,hyl,entA,sgrA,acm,scm,pilA

20 17 2 Ap,Cip,Er,HGm,HKm ermB,aac6aph2,msrC,tetM,tetL esp,hyl,entA,sgrA,acm,scm,pilA

21 117 1 Ap,Cip,Er,HGm,HKm ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,pilA

22 117 1 Ap,Cip,Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 pilA

23 117 1 Ap,Cip, Er,Lz,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 entA,sgrA,scm,pilA

24 117 1 Ap,Cip,Er,HGm,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 ecbA,acm,pilA

25 117 1 Ap,Cip,Er,HKm,HSt msrC,ant6,aph3,sat4 entA,sgrA,ecbA,pilA

26

26 117 1 Ap,Cip,Er,HKm,HSt msrC,ant6,aph3,sat4 sgrA,acm,scm,pilA

27 117 1 Ap,Cip,Er,Lz,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

28 117 1 Ap,Cip,Er,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

29 17 2 Ap, Cip, Er,Q-D,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

30 117 1 Ap, Cip, Nit,Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

31 117 1 Ap, Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA


33 117 1 Ap, Cip, Er,Lz,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

34 117 1 Ap, Cip, Er,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

35 117 1 Ap, Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,sat4,tetM esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

36 17 2 Ap ,Cip, Er,Q-D,HGm,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

37 117 1 Ap, Cip, Er,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

38 117 1 Ap, Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA



41 ND 4 Cip,Er msrC,tetM esp,entA,scm

42 117 1 Ap, Cip, Er,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

43 ND 10 Ap, Cip, Er,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,tetM,tetL entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

44 ND 4 Cip, Er msrC,aph3 esp,entA,scm




48 17 2 Ap, Cip, Er,Q-D,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

49 17 2 Ap, Cip, Er,Q-D,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

50 117 1 Ap, Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,pilA

51 117 1 Ap, Cip, Er,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

52 117 1 Ap, Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

27

53 117 1 Ap, Cip, Er,HKm,HSt msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

54 117 1 Ap, Cip, Er,HKm,HSt msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA














68 ND 14 Ap, Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

69 ND 7 Ap, Cip, Er,HGm,HKm,HSt ermB,aac6aph2,msrC,tetM entA,acm,scm,pilA

70 ND 15 Ap, Cip, Er,Tet msrC,aac6aph2,sat4,tetM entA,sgrA,acm,pilA

71 117 1 Ap, Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

72 117 1 Ap, ,Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA



75 117 1 Ap, Cip, Nit,Er,Q-D,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA




79 117 1 Ap, Cip, Nit,Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

28








87 17 2 Ap, Cip, Nit,Er,Q-D,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA


89 117 1 Ap, ,Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA


91 ND 12 Ap, Cip, Er,HGm,HKm,HSt ermB,msrC,aac6aph2,ant6,aph3,sat4,cat hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA



94 117 1 Ap, Cip, ,Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

95 ND 8 Ap, Cip, Nit,Er,HSt,Tet msrC,aph3 acm,scm


97 17 2 Ap,Cip, Er,Q-R,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

98 17 2 Ap, Cip, Er,Q-D,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,hyl,entA,ecbA,acm,pilA

99 117 1 Ap, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

100 117 1 Ap,Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

101 117 1 Ap,Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

102 117 1 Ap,Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

103 117 1 Ap,Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

104 117 1 Ap,Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA



29

107 ND 9 Cip, Er,HKm,HSt,Tet msrC,ant6,aph3,sat4,tetM entA,acm,scm,pilA

108 ND 18 Amo, Cip, Er,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM entA,sgrA,acm,pilA

109 17 2 Amo, Cip, Er,Q-D,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA


111 117 1 Ap Cip, Er,HKm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA







118 ND 5 Ap, Cip, Er,Tet ermB,msrC,tetM,tetL entA,sgrA,acm,scm,pilA

119 17 2 Ap, Cip, Nit,Er,Q-D,HKm,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

120 ND 16 Cip, Er,Q-D msrC acm,scm




124 117 1 Ap, Cip, Er msrC esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

125 ND 3 Ap, Cip, Er,Tet msrC,tetM,tetL,ermT entA,sgrA,acm,scm,pilA

126 117 1 Ap, Cip, Er,HGm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

127 17 2 Ap, Cip, Nit,Er,Q-D,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,hyl,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

128 ND 11 Cip, Er msrC entA,acm,scm

129 ND 3 Ap, Cip, Er,HGm,HSt,Tet msrC,tetM,tetL,ermT entA,sgrA,acm,scm

130 117 1 Ap, Cip, Er,HGm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

131 ND 3 Ap, Cip, Nit,Er,Tet msrC,tetL,ermT entA,sgrA,acm,scm,pilA

132 117 1 Ap, Cip, Er,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

133 ND 5 Ap, Cip, Er,HGm,HSt,Tet ermB,msrC,aac6aph2,ant6,aph3,sat4,tetM,tetL hyl,entA,sgrA,acm,scm,pilA

30

134 117 1 Ap, Cip,Er,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

135 117 1 Ap, ,Cip, Er,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA



138 117 1 Ap, Cip, Er,HGm,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA






144 117 1 Ap, Cip, Nit,Er,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA





149 ND 19 Ap, Cip,Nit,Er - esp,acm,pilA



152 117 1 Ap,Cip, Er,HSt,Tet msrC,ant6,aph3,sat4,tetM esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

153 ND 3 Ap,Cip,Er,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,sat4,tetM,tetL esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA

154 117 1 Ap,Cip, Er,HSt ermB,msrC,ant6,aph3,sat4 esp,entA,sgrA,ecbA,acm,scm,pilA



157 ND 6 Ap,Cip, Er,HSt,Tet ermB,msrC,ant6,aph3,tetM,tetL esp,entA,sgrA,acm,scm,pilA

ND: No Determinado

Ap: ampicilina/amoxicilina; Cip: ciprofloxacina; Er: Eritromicina; HSt: Estreptomicina (alto nivel); HGm: Gentamicina (alto nivel); HKm: kanamicina (alto nivel); Nit: nitrofurantoína; Cl:

cloranfenicol; Tet: tetraciclina, Q-D: Quinuprsitina-Dalfopristina; Lz: Linezolid.

Discusión

El considerable incremento de casos de infecciones severas en sangre causadas por Enterococcus

faecium multirresistentes a partir del año 2009 en el Hospital Universitario Marqués de Valdecilla

es la razón que fundamenta el desarrollo de este trabajo que busca conocer la situación actual de

este patógeno en nuestro hospital. El principal hallazgo realizado es el descubrimiento de que un

nuevo clon particularmente bien adaptado al ambiente hospitalario (ST117), se ha introducido y

diseminado en nuestro hospital, de forma que representa el 70% de los aislamientos y ha

desplazado a clones muy prevalentes que estaban presentes en el hospital desde 2002, como la

ST18, de la que sólo hemos encontrado una cepa, e incluso la ST17, que ahora tan sólo representa

un 14% de las cepas estudiadas frente al casi 50% de prevalencia en el estudio anterior. De hecho,

a partir de 2005, esta ST17 hizo lo mismo con la dominante entonces que era la propia ST18

(Romo, et al., 2009). Esto está de acuerdo con estudios a largo plazo realizados en diferentes

hospitales donde han observado diferencias temporales en la prevalencia de determinados clones

(Tedim, et al., 2016) (Werner, et al., 2008). Recientemente se ha documentado la expansión de la

línea ST78 de E. faecium en el ambiente hospitalario a nivel de España y Europa (Tedim, et al.,

2016). Nuestro clon 1, ST117, pertenece a esta línea clonal, por lo que nuestros resultados

concuerdan bien con lo publicado. Además, la prevalencia de aislamientos pertenecientes a las

tres líneas evolutivas ST17, ST18 y más recientemente ST78 se ha reportado también en los

estudios realizados en otros hospitales. Estas líneas se consideran clones de alto riesgo (Willems,

Hanage, Bessen, & Feil, 2011).

En nuestro hospital, los análisis de sensibilidad provistos por Vitek2 mostraron que la mayoría de

cepas de E. faecium procedentes de hemocultivos presentan resistencia a la acción de más de

cinco antibióticos no relacionados entre sí, principalmente al grupo de las quinolonas, la

eritromicina y las penicilinas, donde los porcentajes son mayores al 96%. De igual manera se

evidenció un alto porcentaje de cepas resistentes a altos niveles de estreptomicina (92%). Estos

datos coinciden con estudios previos de autores como López et al, 2012, y otros más recientes

que han sido realizados con aislados de infecciones en sangre (Tedim, et al., 2016) donde se

observa una situación similar. Sin embargo, la resistencia a cloranfenicol de las cepas que hemos

estudiado y que está presente en un 2% de nuestros aislados, difiere con la información obtenida

por López et al, donde manifiesta la presencia de esta resistencia en todas las cepas de su estudio.

La resistencia a vancomicina en aislados de E. faecium, ha presentado una prevalencia muy baja

en los hospitales españoles, a diferencia de lo que pasa en Estados Unidos o en determinados

países europeos, donde la prevalencia es alta (Francia, 2005) (EARS-Net, 2017). Esta situación

la hemos evidenciado en el presente estudio ya que ninguna de las cepas presentó resistencia a

vancomicina ni teicoplanina (ambos glucopéptidos).

32

Respecto a los genes de resistencia estudiados, cabe mencionar que su relación con los datos de

sensibilidad antibiótica obtenidos por Vitek2, coincide satisfactoriamente, siendo los genes msrC,

ermB, ant6 y aph3, que codifican resistencia a eritromicina y a aminoglucósidos respectivamente,

los más prevalentes. De hecho, el porcentaje similar de aislados que codifican los genes ant6,

aph3 y sat4 parece indicar que un elemento genético móvil estaría implicado en la adquisición de

estos genes, en este caso podría ser un transposón, el Tn5405 (Clewell, Weaver, Dunny, Coque,

& Francia, 2014) que se ha descrito anteriormente portando estos genes en cepas clínicas de E.

faecium. Es de destacar la baja presencia detectada (7%) de la resistencia a alto nivel a

gentamicina en comparación a otros estudios (Gudiol, et al., 2013).

La resistencia a tetraciclina parece deberse a la expresión de los genes tetL y tetM, que presentaron

una prevalencia del 27% y 6%, respectivamente, en las cepas estudiadas, lo que refuerza los datos

fenotípicos, donde un 28% presentó resistencia a este antibiótico.

Todos los genes de resistencia detectados se han encontrado previamente tanto en cepas clínicas

de E. faecium como en cepas de origen muy diverso (López, Álvarez-Martínez, Marco, & Torres,

2012) (Rincón, et al., 2014).

Los datos proporcionados por Vitek 2 de la resistencia fenotípica a las quinolonas se confirman

por el estudio de las mutaciones en los genes parC y gyrA que han determinado cuatro

combinaciones diferentes que están relacionadas con 7 de los 20 pulso-tipos obtenidos. En

conjunto estos pulso-tipos corresponden al 92% del total de las cepas, un valor muy cercano al

porcentaje de resistencia fenotípica a quinolonas. Todas las mutaciones encontradas se han

descrito previamente en la literatura (Petersen & Jensen, 2003).

Respecto a los factores de virulencia estudiados, los genes más prevalentes en las cepas de E.

faecium fueron entA, acm, scm, pilA, sgrA y ecbA todos ellos con porcentajes cercanos al 90%.

Destacando la gran importancia de la actividad de las bacteriocinas, la formación de pili y las

proteínas de unión a diferentes matrices en la capacidad de colonización y/o infección de las cepas

estudiadas.

Por su parte el gen esp que codifica una proteína de la superficie celular fue detectado en un menor

porcentaje en comparación con los anteriores (82%), mientras que el gen hyl fue el que presentó

la menor prevalencia en este estudio con un 17%. Estos resultados difieren en parte con estudios

realizados por López et al., donde estos dos genes (principalmente esp) fueron identificados en

todas las cepas de E. faecium resistentes a vancomicina, lo que podría sugerir, según el autor, que

la adquisición de hyl se da en un proceso posterior que brinda a la bacteria la capacidad de adquirir

determinantes que faciliten su persistencia.

33

Si unimos estos datos a los aportados por estudios anteriores llevados a cabo por nuestro grupo

de investigación podemos concluir que clones derivados de las líneas principales de E. faecium

ST18, ST17 y ST78 que codifican múltiples determinantes de resistencia a antibióticos y

virulencia se han aislado de diferentes muestras clínicas recogidas por el Servicio de

Microbiología de nuestro hospital. Estudios de vigilancia microbiológica y medidas de control

deberían de implementarse para evitar que uno de estos clones de alto riesgo adquiera alguno de

los operones más frecuentes que dan lugar a resistencia a glucopéptidos (vanA o vanB) y la posible

aparición de un brote por E. faecium resistente a vancomicina en el hospital como ya ocurrió en

el año 2002.

Conclusiones

1. Un alto porcentaje de las cepas de E. faecium que han causado bacteriemias en el Hospital

Universitario Marqués de Valdecilla desde 2009 a 2016 son multirresistentes, presentando

resistencias a la mayoría de los antibióticos usados en su tratamiento, con la excepción de

vancomicina/teicoplanina y tigeciclina.

2. La mayoría de los aislamientos estudiados codifican múltiples determinantes de resistencia a

antibióticos.

3. Un número elevado de las cepas estudiadas portan múltiples genes que les confieren una

ventaja selectiva considerable para la colonización del tracto gastrointestinal humano, tales

como bacteriocinas, pili y proteínas de superficie que permiten la adhesión a diferentes tejidos

del huésped.

4. La mayoría de las cepas pertenecen a las principales líneas clonales de E. faecium,

previamente englobadas en el complejo clonal CC17, particularmente bien adaptadas al

ambiente hospitalario, responsables de la mayoría de brotes nosocomiales a nivel global y

consideradas por ello clones de alto riesgo.

5. El clon de E. faecium multirresistente ST117 se ha introducido y diseminado en el hospital,

donde se ha hecho endémico y representa ya al 70% de los aislamientos estudiados,

reemplazando a otros clones mayoritarios en el estudio previo.

Importancia y aplicaciones del trabajo

Las conclusiones obtenidas en este trabajo son importantes a la hora de racionalizar la puesta en

marcha de estudios de vigilancia microbiológica y medidas de control, que deberían de

implementarse para evitar que uno de estos clones de alto riesgo adquiera alguno de los operones

más frecuentes que dan lugar a resistencia a glucopéptidos (vanA o vanB) y la posible aparición

de un brote por E. faecium resistente a vancomicina en el hospital.

34

Direcciones futuras

1. Completar los estudios para determinar los mecanismos de resistencia a β-lactámicos de

las cepas en estudio.

2. Completar los datos MLST de los diferentes pulso-tipos obtenidos.

3. Determinar los elementos genéticos móviles (plásmidos, sobre todo), responsables de la

adquisición y diseminación de los genes de resistencia a antibióticos en los aislamientos

de E. faecium del hospital.

35

Bibliografía

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