UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA

COLEÇÃO DE CULTURAS – MICOTECA URM

Título do Projeto:

Caracterização do acervo da Micoteca URM visando a

disponibilização de culturas como fonte de recursos

biotecnológicos

EDITAL FACEPE 16/2012

APOIO À DISPONIBILIZAÇÃO PARA A PESQUISA DE LABORATÓRIOS

MULTIUSUÁRIOS E DE ACERVOS DE INTERESSE CIENTÍFICO

Enfoque desta proposta: ACERVOS DE INTERESSE CIENTÍFICO

Proponente: Profa. Dra. Cristina Maria de Souza Motta

Curadora da Micoteca URM

Recife,

2012

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a. IDENTIFICAÇÃO DA PROPOSTA

Título do projeto:

Caracterização do acervo da Micoteca URM visando a disponibilização de culturas como

fonte de recursos biotecnológicos

Dados da entidade proponente:

Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de

Micologia, Coleção de Culturas – Micoteca URM, Av. Prof. Nelson Chaves, s/n, Cidade

Universitária, Recife-PE, Fone: (81) 2126.8948, Fax: (81) 2126.8480.

Proponente e Coordenador:

Profa. Dra. CRISTINA MARIA DE SOUZA MOTTA, Universidade Federal de Pernambuco,

Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia, Curadora da Coleção de Culturas

– Micoteca URM, Av. Prof. Nelson Chaves, s/n, Cidade Universitária, Recife-PE,

smotta@ufpe.br, Fone: (81) 2126.8948, Fax: (81) 2126.8480, Professor Adjunto 3, DE.

EDITAL FACEPE 16/2012

APOIO À DISPONIBILIZAÇÃO PARA A PESQUISA DE LABORATÓRIOS

MULTIUSUÁRIOS E DE ACERVOS DE INTERESSE CIENTÍFICO MULTIUSUÁRIOS –

FACEPE

b) Justificativa para a realização do projeto, incluindo a descrição da natureza e

relevância, para atividades de pesquisa, do acervo ou dos laboratórios/serviços

especializados que são objeto do apoio solicitado

A Coleção de Culturas - Micoteca URM (www.ufpe.br/micoteca), do Departamento

de Micologia, Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco,

Recife-PE, foi fundada em 1954 pelo Prof. Augusto Chaves Batista, tem como curadora a

Profa. Cristina Maria de Souza Motta e vice-curadora a Profa. Rejane Pereira Neves. Esta

coleção apresenta um acervo diversificado de fungos pertencentes aos filos Zygomycota,

Ascomycota, Basidiomycota e “Deuteromycota” (Fungos anamorfos). A Micoteca URM está

registrada no Commonwealth Mycological Institute (CMI) sob a sigla URM (University

Recife Mycologia) e é filiada ao Word Federation for Culture Collections (WFCC) sob o

número 604 (MICOTECA, 2012; WORLD DATA CENTER FOR MICROORGANISMS,

WDCM, 2012; SOUZA-MOTTA, 2012). A coleção utiliza para preservação os métodos: óleo

mineral, liofilização, água destilada e, ultracongelamento a -80º C é o método mais

recentemente implementado, através do apoio do CNPq em 2009. Ao acervo da Micoteca

URM já foram inseridas aproximadamente 6.700 entradas de culturas de fungos e, ao longo

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dos anos desde a fundação, cerca de 700 já foram consideradas inviáveis. As culturas do

acervo pertencem aos Oomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota e

“Deuteromycota” (Fungos anamorfos), todas identificadas ao nível de espécie e mantidas em

duplicata em no mínimo dois métodos de preservação. No total, cerca de 20.000 culturas

estão preservadas na Micoteca URM. Além de receber amostras de fungos para compor o

acervo, a Micoteca URM atende a pedidos de fornecimento de amostras, isolamento e

identificação de culturas, liofilização e treinamento de estudantes e profissionais na área de

taxonomia e preservação, oferecendo também cursos de extensão. Estes pedidos são

procedentes de instituições de ensino e/ou pesquisa, nacionais e internacionais; de

laboratórios que utilizam amostras de microrganismos em testes para fabricação de

medicamentos, enzimas e outros metabolitos de interesse econômico e, dos que realizam

diagnóstico de micoses; e da comunidade em geral (SOUZA-MOTTA, 2012). De 2005 até

julho de 2012, foram incorporados ao acervo 1.768 amostras de fungos, procedentes de solos,

resíduos industriais, água doce e marinha, sedimento de manguezal, alimentos, vegetais,

endofíticos e animais. Estas amostras estão disponíveis à comunidade científica e a outros

interessados. Neste mesmo período foram identificadas ao nível de espécie 2.322 amostras e

fornecidas 3.352 amostras de fungos para instituições de ensino e pesquisa nacionais e

internacionais.

Coleções de culturas contribuem diretamente para o estudo da sistemática e da

biodiversidade mundial, por manterem e preservarem culturas que são essenciais para estudos

representando uma importante fonte de recursos biológicos permitindo a condução de

inúmeros trabalhos científicos, assegurando o sucesso de sua utilização em processos,

principalmente, biotecnológicos (FIGUEIREDO, 2001; CANHOS, 2006). Os métodos de

preservação de microrganismos asseguram a viabilidade, morfologia, fisiologia e genética,

mantendo a cultura por longo tempo e todos com o mesmo princípio: retardar ou paralisar o

metabolismo celular. Dentre estes métodos, podem ser citados o método de óleo mineral, água

destilada, liofilização, nitrogênio líquido, ultracongelamento a -80°C, sílica gel, solo e

repiques seriados (SMITH; ONIONS, 1994; LACAZ et al., 2002; NAKASONE et al., 2004).

O termo Centro de Recurso Biológico (CRB) foi primeiro associado ao programa

Microbiological Resource Centre (MIRCEN), lançado pela UNESCO em 1946, com o

objetivo de estabelecer centros de recursos microbiológicos, preservando uma diversidade

microbiana extremamente valiosa e ameaçada pela falta de recursos financeiros em países

menos desenvolvidos. Em 1998, o Japão tomou a iniciativa de propor à Organização para

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Cooperação e o Desenvolvimento Econômico (OCDE) (OCDE, 2010), o estudo dos CRBs

como elementos chave da infra-estrutura científica e tecnológica das ciências da vida e

biotecnologia. Em fevereiro de 1999, realizou-se em Tóquio um Workshop da OCDE

dedicado as infra-estruturas científicas e tecnológicas para apoiarem os CRBs. Em 2001, a

OCDE publicou o relatório “Biological Resource Centers – Underpinning the Future of Life

sciences and Biotechnology”, que enfatiza o potencial dos CRBs, para consolidarem o futuro

das ciências da vida e biotecnologia, enquanto recomendava a criação de uma rede de centros

de recursos biológicos global. Os CRBs são uma parte essencial da infra-estrutura que

suportam as ciências da vida e a biotecnologia. Fornecem serviços e são depositários de

células vivas, de genomas de organismos, e da informação relacionada com a hereditariedade

e as funções biológicas dos sistemas. O relatório enfatiza ainda a necessidade das coleções

aderirem a elevados padrões de qualidade e de competência exigida pela comunidade

internacional de cientistas e da indústria no fornecimento de informação e materiais

biológicos. Finalmente, o relatório desafia os estados membros a criarem os CRBs nacionais

que respeitem padrões de qualidade, de competência e de estabilidade financeira, garantidos

por critérios internacionais e sistemas governamentais ou independentes de

acreditação/certificação. Nesta abordagem, surgiu a idéia de se construir um Global BRC

Network (GBRCN) que apóie a cooperação internacional e o desenvolvimento econômico

(BRASIL, 2002; LIMA, 2007)

No Brasil, em 2001 foi instituído pelo Ministério de Ciência e Tecnologia um Grupo

de Trabalho, com a finalidade de elaborar “um documento técnico sobre o panorama nacional

relativo às atividades de metrologia, normalização, regulamentação técnica e avaliação da

conformidade, aplicáveis a microrganismos”. Em 2002, foi publicado o documento “Sistema

de Avaliação da Conformidade de Material Biológico” enfatizando a constituição de sistemas

integrados, que possibilitem operar de forma harmônica, alinhada com as tendências

internacionais (BRASIL, 2002).

Em 2004, o ministro da ciência e tecnologia no comitê para política científica e

tecnológica, aprovou o documento elaborado pelo grupo de trabalho OCDE-BRC, contendo

regras base e regulamentos para futuros membros do GBRCN. Este documento define as

exigências gerais para o funcionamento de todos os BCRs como partes do GBRCN, tendo

como base as normas do common Access to Biological Resources and Information (CABRI) e

da World Federation for Culturwe Collection (WFCC), bem como o sistema de gestão da

qualidade da UK National Culture Collection (UKNCC). Como consequência de todo esse

trabalho, os países membros e não membros da OCDE foram tomando iniciativas para

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transferir as coleções de culturas tradicionais para este novo conceito e, assim, posicionarem-

se para uma adesão efetiva ao futuro GBRCN. Em 2007, a OCDE publicou o guia de boas

práticas para os centros de recursos biológicos (gestão da qualidade, biossegurança,

conservação dos recursos biológicos e gestão dos dados) (LIMA, 2007).

Em 2005, atendendo à demanda formulada pelo Centro de Referência em Informação

Ambiental – CRIA e SICoL, no levantamento preliminar das Coleções de Culturas Nacionais

constavam 26 Coleções, destacaram-se 7 (sete) Coleções de Serviço (fornecem culturas

microbianas e apresentam controle de qualidade das coleções): Fiocruz – RJ; EMBRAPA;

CBMAI (CPQBA-UNICAMP); Instituto Adolfo Lutz; Instituto Biológico – SP; Coleção de

Cultura de Fitobactérias de Instituto Biológico de Campinas e Micoteca URM da UFPE

(VAZZOLER; UMINO, CANHOS, 2005).

Para seguir todo este panorama e visando aumentar a qualidade dos serviços de

identificação, fornecimento e preservação de culturas de fungos a pesquisadores desta e de

outras instituições nacionais e internacionais, está sendo implantada na Micoteca URM, a ISO

9001:2008. Esta norma tem por objetivo especificar requisitos para um sistema de gestão da

qualidade, implementando a capacidade para fornecer produtos que atendam a padrões

internacionais e visa também aumentar a satisfação do usuário, buscando a melhoria continua

do sistema. Em meados de outubro de 2012, será iniciada também a implantação da ISO

17025:2005, com o apoio do Convênio FINEP 01.08.0392.00.

Atualmente, existem 60 coleções de culturas brasileiras, 25 preservam fungos, estando

seis no nordeste, sendo quatro em Pernambuco, uma na Bahia e uma no Ceará. A Micoteca ,

CENTER FOR MICROORGANISMS, 2012).

A partir de 2005, a Micoteca URM, sob a curadoria da Profa. Cristina Maria de Souza

Motta, vem sendo apoiada por auxílio financeiro de diversas agências como CAPES, CNPq,

FACEPE e FINEP, e a equipe vem também oferecendo cursos de treinamento e participando

de curso de atualização para atender ao que está acontecendo no mundo em coleções de

culturas.

Em 05 de abril de 2010 a Micoteca URM foi aprovado o credenciamento pelo

Conselho de Gestão do Patrimônio Genético, como Instituição Fiel Depositária de Amostras

de Componente do Patrimônio Genético, sob o número 024/2010 SECEX/CGEN.

Em 2011, a Micoteca URM ministrou curso avançado intitulado “Identificação

Polifásica de Fungos Filamentosos dos Gêneros Aspergillus e Penicillium com Aplicação

Biotecnológica” em parceria com a Micoteca da Universidade do Minho-MUM, Braga,

Portugal. O curso foi ministrado pela Dra. Cristina Souza Motta, curadora da Micoteca URM,

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pelos doutores Nelson Lima e Cledir Santos da MUM-Portugal e contou com a participação

da Drª Zofia Kozakiewicz e Dr. Jens Christian Frisvad, ambos do Reino Unido, e

reconhecidos mundialmente como grandes especialistas em taxonomia dos gêneros

Aspergillus e Penicillium.

Todas essas ações citadas acima demonstram o compromisso da equipe da Micoteca

URM em estar em constante atualização e busca de recursos, para atender a demanda

decorrente dos avanços na microbiologia industrial, biotecnologia e engenharia genética e

genômica, visando o fornecimento de serviços e material biológico, que atendam às normas

internacionais e boas práticas laboratoriais.

Neste contexto, a Micoteca URM está caracterizando amostras estocadas quanto a

aspectos taxonômicos e biotecnológicos, através de projetos de pesquisa e dos desenvolvidos

por alunos de graduação e pós-graduação em parcerias com instituições nacionais e

internacionais como a Micoteca da Universidade do Minho em Braga, Portugal, com o

Laboratório de Tecnologia de Bioativos (LABTECBIO) e a Unidade Acadêmica de

Garanhuns (UAG), ambos da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), com o

Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (CETENE). Outra parceria internacional está

sendo estabelecida com o Cereal Research Centre/Agriculture and Agrifood Canada, no

âmbito deste projeto.

As características morfológicas e fisiológicas além de análise de metabólitos têm sido

utilizadas na identificação de espécies, mas por causa de sua reconhecida variação não tem

sido suficientemente satisfatórias. Recentemente, dados de seqüências multilocus aliados a

outros critérios também tem se mostrado úteis para o reconhecimento de espécies (GEISER et

al, 2007). Devido às alterações taxonômicas de alguns gêneros de fungos, como Aspergillus,

Cladosporium, Colletotrichum, Fusarium, Penicillium e Trichoderma, se faz necessário a

revisão e a atualização taxonômica contínua de espécies pertencentes ao acervo da Micotea

URM. A identificação de novas culturas e a autenticação taxonômica de fungos desta coleção,

não apenas pela taxonomia clássica, documentando os caracteres morfológicos por

microscopia óptica de luz e eletrônica de varredura, mas sim através de uma abordagem

polifásica que integra taxonomia clássica (morfologia e fisiologia), técnicas moleculares e a

técnica de MALDI-TOF MS, garantirão qualidade ao acervo da coleção.

Estudos recentes realizados sobre identificação de fungos e caracterização através de

MALDI-TOF MS (Matrix Assited Laser Desorption Ionization - Time of Flight Mass

Spectrometry) têm mostrado o potencial desta nova abordagem, com boa discriminação na

maioria dos casos. A validação por MALDI-TOF MS pode ser alcançada usando linhagens

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fúngicas de referência para a obtenção de espectros correspondentes em bancos de dados,

além disso, os dados podem ser incluídos aos de morfologia, bioquímica e biologia molecular,

caracterizando desta forma uma abordagem polifásica (SANTOS et al., 2009). Neste sentido,

MALDI-TOF MS tem vantagens importantes sobre os métodos morfológicos e moleculares,

sendo uma tecnologia rápida, onde uma simples raspagem de um meio de cultura contendo o

fungo pode ser analisada por essa técnica (KELLER et al., 2008; SANTOS et al., 2009). Por

outro lado, a análise do secretoma fungos também pode ser como uma ferramenta de

diagnóstico para a identificação de estirpes de Fusarium. Para isso se faz é necessário

identificar péptidos únicos das proteínas secretadas que são cepa-específicos. Os secretomas

de Fusarium spp. utilizando uma abordagem LC-MS, demonstrou conter muitas proteínas

(DWIVEDI et al, 2008; BROWN et al., 2012).

Em 2007 um workshop internacional na Holanda pôs em ampla discussão sobre várias

questões para uma delimitação dos táxons Aspergillus e Penicillium, foi recomendada uma

abordagem polifásica neste contexto. Características morfológicas devem ser combinadas

com outros caracteres que incluem seqüenciamento de DNA, dados fisiológicos, ecológicos e

análise de extrólitos. Tem sido sugeridos o seqüenciamento da região ITS do rDNA além de

outros loci mais variáveis, no caso de espécies estreitamente relacionadas, tais com B-

tubulina, actina, calmodulina e outros gens ricos em introns (SAMSON et al., 2007).

Os Zygomycetes apresentam características morfológicas variadas, como a presença

de hifas cenocíticas, contendo septos apenas na base das estruturas de reprodução, ou

apresentam septos espaçados de forma irregular, além de estruturas assexuadas como

esporângios, esporangiósporos, esporangíolos, merosporângios e merósporos. Podem ser

isolados de diversos substratos como solo, excrementos e órgãos vegetais (ALEXOPOULOS

et al., 1996; KENDRICK, 2000). Varias espécies desse grupo são capazes de produzir

enzimas e ácidos orgânicos com potencial biotecnológico (CORDEIRO NETO et al., 1997,

SANTIAGO & SOUZA-MOTTA, 2006, NEVES et al., 2012). Esse aparato enzimático faz de

muitas espécies do grupo excelentes competidoras em comparação com os demais fungos. A

maioria dos Zygomycetes, principalmente os pertencentes à ordem Mucorales, apresentam

rápido crescimento, mesmo em meios de cultura simples, sendo os primeiros a colonizar

vários substratos, degradando os açucares menos complexos (RICHARDSON, 2009).

Para dar continuidade a ampliação ao aumento do acervo da Micoteca URM, serão

isolados fungos filamentosos de solo e endofíticos da Caatinga, bem como leveduras

presentes em mel das abelhas sem ferrão coletadas em área deste rico bioma.

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Em geral, os fungos do solo possuem largo potencial biotecnológico, sendo

amplamente utilizados para a produção de enzimas de interesse industrial, ambiental,

farmacêutico, alimentício, etc. No entanto, estima-se que apenas 5% dos fungos existentes nos

solos tenham sido descritos (BDT, 2006). Nesse contexto destacam-se os fungos filamentosos

presentes em solos do bioma Caatinga, ainda pouco conhecidos pela ciência. A Caatinga é um

bioma exclusivo do Brasil, que abriga espécies de vegetais animais e micro-organismos

endêmicas, apresentando clima semi-árido, quente e com baixa pluviosidade, entre 200 e 800

mm anuais (LEAL et al., 2005; FRANCA - ROCHA et al., 2007; ALVES et al., 2009).

Por outro lado, na busca de microrganismos novos para a ciência, produtores de

substâncias de interesse econômico na medicina, na agricultura e indústria, os endofíticos, que

podem ser isolados do interior de tecidos vegetais desinfestados superficialmente, e que não

causam danos ao hospedeiro, se mostram como uma moderna e relativamente inexplorada

fonte de diversidade microbiana produtora de metabólitos biologicamente ativos, dentre os

quais destacam-se as enzimas (STROBEL et al., 2004; HALLMANN et al.,1997) e podem

desempenhar um papel importante na sobrevivência das plantas, melhorando a absorção de

nutrientes (GASONI e GURFMKEL, 1997; MALINOWSKI, BRAUER e BELESKY, 1999),

desenvolvimento e produção de metabólitos de promoção do crescimento, como giberelinas

(CHOI et al., 2005; RIM et al., 2005) e auxinas (DAI, YU e LI, 2008), auxiliando na

adaptabilidade ecológica do hospedeiro por incrementar a tolerância a estresses bióticos e

abióticos. Dentre as substâncias antitumorais produzidas por microrganismos endofíticos se

encontra a L-asparaginase que tem sido muito utilizada no tratamento anticancerígeno

(STROBEL et al., 1996; SARQUIS et al., 2004; THEANTANA et al., 2007, 2009; HYDE e

SOYTONG, 2008; LAPMAK et al., 2010; XU et al., 2010; SONIYAMBI et al., 2011; QUI et

al., 2012). Na literatura, são escassos os trabalhos referentes à avaliação da micobiota

endofítica de Cactaceae (BILLS, 1996), com exceção de um estudo preliminar de fungos

endofíticos associados à Opuntia stricta de regiões semi-áridas da Austrália (FISHER et al.,

1994), outra de espécies de cactos do Arizona (SURYANARAYANAN et al. 2005), e fungos

endofíticos isolados de Opuntia ficus-indica no nordeste do Brasil (BEZERRA et al., 2012).

Além de fungos do solo e endofíticos provenientes do bioma Caatinga, ainda são

desconhecidas as leveduras presentes no mel produzido por abelhas sem ferrão, como

mandaçaia (Melipona mandacaia), mandurí (Melipona marginata), cupira (Patarmonia

cupira) e canudo (Scaptotrigona postiça) comuns em áreas de Caatinga. Existe um crescente

interesse na microbiota do mel, uma vez que ele é utilizado desde como alimento até a

formulação de fármacos e cosméticos (SODRÉ et al. 2007). Algumas leveduras conhecidas

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por osmofílicas são capazes de se desenvolverem no mel uma vez que toleram as condições

de baixa atividade de água e alta concentração de açucares desse alimento, podendo crescer

até mesmo no mel maduro, fermentando-o facilmente (SODRÉ et al. 2007). A habilidade das

leveduras colonizarem uma grande variedade de vegetais e substratos contribui para sua

diversidade de espécies, entretanto no Brasil, poucas espécies de leveduras foram descritas,

havendo possibilidade de novas descobertas (MAUTONE, 2008).

Com isto, o isolamento e identificação de fungos solo, endofíticos e de mel,

provenientes de áreas de Caatinga pode ser promissor para o aumento do acervo da Micoteca

URM e pela provável obtenção de espécies novas para a ciência e com possível capacidade de

produção de metabolitos de interesse biotecnológico.

Culturas de fungos serão caracterizadas quanto a produção das enzimas lipase, L-

asparaginase, tanase, xilanase, celulase, pectinase, amilase e protease, para que possam ser

empregadas com segurança por outros pesquisadores e pela indústria.

As lipases são enzimas capazes de catalisar reações de hidrólise, esterificação,

transesterificação e lactonização (esterificação intramolecular) em lipídios (PASTORE, 2003;

SAXENA et al., 2003; BUSSAMARA et al., 2010). Do ponto de vista econômico e industrial,

as lipases obtidas de microrganismos (bactérias, leveduras e fungos filamentosos) são as mais

utilizadas nos setores alimentícios e farmacêuticos (PEREIRA-MEIRELLES, 1997).

A tanase é uma enzima que hidrolisa ésteres e ligações laterais de taninos hidrolisáveis

como ácido tânico, em glicose e ácido gálico (HELBIG, 2000; BANERJEE, et al, 2001;

COSTA, et al., 2008), podendo ser produzida na presença de acido tânico por fungos

filamentosos, bactérias e leveduras. Dentre os fungos filamentosos produtores de tanase, o

gênero Penicillium é o segundo melhor produtor, precedido apenas por espécies de

Aspergillus (AGUILAR et al., 2001 a,b; MACEDO et al., 2005; COSTA, et al., 2008). Esta

enzima pode ter vasta aplicação na indústria de bebidas (principalmente sucos e cervejarias)

cosméticos, farmacêutica e indústria química (LEKHA; LONSANE, 1994), sendo

principalmente utilizada para a produção de ácido gálico na estabilização da coloração dos

vinhos, refrigerantes a base de café, processo de tratamento do couro, detanificação de

alimentos e para tratamento de efluentes na indústria de couros (BANERJEE, et al, 2001).

As xilanases são um complexo de enzimas responsáveis principalmente pela hidrólise

das ligações β-1,4 presentes na xilana vegetal, componente da hemicelulose. Entre os fungos,

Aspergillus e Trichoderma são excelentes produtores da enzima em escala industrial.

(COUGHLAN; HAZLEWOOD, 1993; MOORE-LANDECKER, 1996). A xilanase pode ser

utilizada na dieta de animais monogástricos para hidrolisar os polissacarídeos não-amiláceos

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como β-glucanos e arabinoxilanos, encontrados em cereais. A presença de altos níveis destes

polissacarídeos na dieta destes animais resulta em baixa conversão alimentar e lentidão no

ganho de peso (ALBERTON et al., 2009). Na indústria de papel, participa auxiliando no

branqueamento da polpa e reciclagem de papel. Tais enzimas podem ainda ser aplicadas na

clarificação de sucos e vinhos, na fabricação de café solúvel, no aumento do teor nutricional

da silagem e para dar textura a derivados lácteos (HALTRICH, 1996; NEVES et al., 2011).

Na natureza, a celulose, polissacarídeo mais abundante, é degradada pela hidrólise

enzimática das celulases, um complexo celulolítico composto por endo- -1-4-glicanases, exo-

-1-4-glicanases e -glicosidases, que atuam em sinergismo (BHAT, 2000). As

endoglicanases quebram aleatoriamente as cadeias de celulose e diminuem o comprimento

dessas cadeias (endo-1-4- -D-glicano-hidrolase). As exo- -1-4glicanase atacam as

extremidades do polímero com o grupo final redutor ou não redutor e produzem

primeiramente celobiose. Estas quando presentes na mistura celulolítica, representam muitas

vezes 50 a 70% de todas as enzimas. As -glicosidases, que hidrolisa a celobiose à glicose,

remove a celobiose, que inibe as reações de degradação de celulose. A utilização de enzimas

celulolíticas isoladas de culturas de fungos na alimentação de ruminantes tem mostrado

resultados satisfatórios, como aumentos na digestibilidade da matéria seca e da fibra em

detergente neutro, na produção de leite e no teor de gordura, e no ganho de peso em bovinos

(SINGH et al, 2009). Aspergillus japonicus URM5620 é um dos promissores para produção

desta enzima (HERCULANO et a., 2012). As pectinases formam um grupo de enzimas que

degradam substâncias pécticas, hidrolisando ligações glicosídicas ao longo da cadeia

carbônica. Podem ser produzidas por plantas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias.

Dentre os fungos, o gênero Aspergillus se destaca como bom produtor destes biocatalizadores,

especialmente certas linhagens de A. niger (DINU et al., 2007, MACIEL et al., 2011). As

pectinases apresentam grande importância comercial na indústria de sucos de frutas, na

recuperação de óleos essenciais, na extração de óleos vegetais, na fabricação de ração para

animais, na indústria de vinhos, na indústria têxtil e na indústria de papel e celulose

(UENOJO; PASTORE, 2007).

As amilases são enzimas capazes de degradar o amido, sendo obtidas do malte ou

produzidas por diversos vegetais ou microrganismos, através de processos fermentativos

(CUZZI et al., 2011). Essa classe de enzimas é utilizada na indústria alimentícia para

preparação de cervejas, geléias e obtenção de glucose livre para as mais variadas aplicações

(MICHELIN, 2005). Além da indústria de alimentos, estas enzimas podem ser utilizadas na

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formulação de detergentes e nas indústrias de papel, farmacêutica, fermentação e têxtil

(OLIVEIRA et al., 2007).

Asparaginase é uma enzima usada como agente quimioterápico para o tratamento de

câncer humano (WRISTON; YELLIN, 1973; CAPIZZI et al., 1984). A prática terapêutica

mais comum é injetar enzima livre por via intravenosa, a fim de diminuir a concentração

sanguínea de L-asparagina (MITCHELL et al. 1994). No entanto, L-asparaginase originada a

partir de bactérias e quando utilizada por longo prazo, pode causar hipersensibilidade, levando

a reações alérgicas e anafilaxia (REYNOLDS; TAYLOR, 1993, KEATING et al., 1993). Há

uma busca para as outras fontes de produção de L-asparaginase para que se dimuniam os

efeitos colaterais ocasionados pela utilização dessa substância quando sintetizada por

bactérias. Fungos como Aspergillus, Colletotrichum, Eupenicillium, Fusarium, Penicillium e

Talaromyces têm sido relatados como grande potencial para a produção de asparaginase com

menores efeitos colaterais ao ser humano (WADE et al., 1971; IMADA et al., 1973; WIAME

et al.,1985; PINHEIRO et al., 2001; SARQUIS et al., 2004; THEANTANA et al. (2007,

2009)). A demanda por L-asparaginase tende a aumentar nos próximos anos devido a

potencial aplicação no tratamento de tumores cancerígenos contribuindo para a cura de

diversos pacientes acometidos por câncer (KRISHNAN et al., 1998; SOLIMAN et al., 2005;

PEDRESCHI et al., 2008).

Outro grupo de enzimas com elevada aplicação biotecnológica é o das proteases. As

proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de proteínas, possuem ampla variedade de

aplicações, estando entre os três maiores grupos de enzimas industriais. Constituem um dos

mais importantes grupos de enzimas industriais e têm aplicação em diferentes indústrias,

como de alimentos, bebidas, têxtil, farmacêutica e de detergentes. Na indústria de alimentos, a

protease provoca a degradação de proteínas pela hidrólise das ligações peptídicas e esta

reação é importante na preparação de uma grande variedade de produtos alimentícios

processados. O interesse científico em proteases e suas ações em diferentes proteínas dos

alimentos não somente podem resultar em melhores produtos, mas também estimulam o

desenvolvimento de um grande número de novas aplicações para as proteases na produção de

alimentos e seus ingredientes (MELO et al., 2009).

A atual proposta visa a ampliação e caracterização do acervo da Micoteca URM

através de uma abordagem polifásica, sobretudo o aumento do número de amostras fúngicas

que terão regiões do seu DNA sequenciado pela plataforma multiusuária de Genômica e

Expressão Gênica do Centro de Ciências Biológicas da UFPE na forma de serviço

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tecnológico. O sequenciamento do DNA das amostras torna-se uma excelente ferramenta por

ser uma técnica com elevada precisão na identificação das espécies. Compondo a abordagem

polifásica, as análises morfológicas e moleculares serão integradas às análises por MALDI

TOF-MS. Além da ampliação e caracterização do acervo, com esta proposta pretende-se a

manutenção da ISO 9001/2008, que está em implementação com previsão da obtenção da

certificação em dezembro de 2012, com apoio do projeto Multiusuário APQ-0290-2.12/10 do

Edital FACEPE 07-2010.

c) Descrição das condições atuais de utilização do acervo, inclusive quanto ao número e

diversidade de pesquisadores/grupos/instituições usuárias e disponibilidade de acesso

por pesquisadores de outros grupos/instituições de pesquisa

Como uma coleção que foi fundada em 1954, as culturas do acervo da micoteca URM

deve está em contínua reativação e autenticação taxonômica.

A Micoteca URM disponibiliza culturas de fungos para diversos pesquisadores de

Pernambuco e de outros estados do Brasil, pesquisadores de diversas instituições de ensino,

pesquisa e do setor privado do país utilizam culturas do acervo desta coleção, dentre as

instituições podemos citar: Laboratório de Biocontrole Farroupilha LTDA-RS, Laboratório de

Análises e Pesquisas Clínicas Carbélia-PR; Universidade Federal de Alagoas, Centro de

Tecnologias Estratégicas de Pernambuco (CETENE), Universidade Federal de Pernambuco,

Universidade Federal Rural de Pernambuco (Campus Recife, Garanhuns e Serra talhada),

LAMEN – Garanhuns/PE, Laboratório de Controle Biológico – Maceió/AL, Laboratório de

Imunopatologia Keizo Asami-LIKA, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz – SP,

Centro de Tecnologia de Análises LTDA. Vitória-ES, Hospital das Clínicas- UFPE, Hospital

Veterinário da UFRPE, UNICHAPECÓ, Universidade Federal de São Paulo, Universidade do

Vale do Paraíba, Universidade Federal da Paraíba, Universidade Estadual de Minas Gerais,

BioRJ Produtos Biológicos e Científicos LTDA, Laboratório Químico e Farmacêutico Nikkho

do Brasil LTDA, Universidade Estadual de Campinas, Universidade Federal do Espírito

Santo, Universidade Federal de Campina Grande, Faculdade Pernambucana de Saúde,

Universidade Católica de Pernambuco, Universidade de Pernambuco, Instituto de Medicina

Integral de Pernambuco, Escola de Engenharia de Lorena (USP), Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Ribeirão Preto (USP), Universidade Estadual de Montes

Claros(UNIMONTES), Hospital Otávio de Freitas (Recife), Biotech- Maceió –AL, Instituto

de Botânica de São Paulo, Universidade Estadual do Mato Grosso do Sul, Universidade

Federal do Pampa, Universidade Estadual de Mato Grosso, Universidade Federal da Paraíba,

13

Universidade Federal de Sergipe, UNAERP/SP, Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, EMBRAPA Jaguariúna - SP, FEJAL /

CESMAC – AL, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Faculdade de Filosofia, Ciências

e Letras de Ribeirão Preto – SP, Coleção do Departamento de Parasitologia da Universidade

Federal do Amazonas – DPUA, Universidade Estadual de Maringá-PN, Universidade de

Brasília, Universidade Federal Rural do Rio Grande do Sul, LAF-NUCT Campus São

Cristovão, Universidade Federal de Viçosa, Associação Caruaruense de Ensino Superior e

Claeff Engenharia e Produtos Químicos LTDA. Camaragibe-PE. Os pesquisadores estão

listados em uma tabela no ítem do relatório ao final deste texto.

A Micoteca URM disponibiliza também culturas para o desenvolvimento projetos de

pesquisa, de iniciação científica, monografias de conclusão de curso de graduação e

especialização, dissertações e teses, gerando diversas publicações em periódicos nacionais e

internacionais, contribuindo com a formação de recursos humanos especializados.

Cursos que a Micoteca URM atende com o fornecimento de culturas:

Cursos de Graduação:

Instituição: Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)

Bacharelado em Ciências Biológicas

Bacharelado em Biomedicina

Bacharelado em Ciências Biológicas-Ciências Ambientais

Instituição: Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE)

Medicina Veterinária – Unidade Acadêmica de Garanhuns(UAG)

Engenharia de Pesca – Unidade Acadêmica de Serra talhada (UAST)

Zootecnia – UAG e UAST

Agronomia – UAG

Engenharia de Alimentos – UAG

Programas de Pós-graduação:

Instituição: Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)

Biologia de Fungos

Ciências Biológicas

Bioquímica e Fisiologia

Ciências Farmacêuticas

14

Biotecnologia

Inovação Terapêutica

Genética e Biologia celular

Instituição: Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE)

Biociência Animal

Fitopatologia

Química

Biociência Animal Química

Biologia Aplicada à Saúde Química

Produção Agrícola/UAG

Rede Nordeste de Biotecnologia- RENORBIO.

Disponibilidade de acesso por pesquisadores de outros grupos/instituições de pesquisa

Uma das metas deste projeto é continuar o apoio a implantação de um laboratório de

micologia na Unidade Acadêmica de Serra Talhada (UAST), da Universidade Federal de

Pernambuco (UFRPE), consolidação a formação de novo grupo de pesquisa em micologia

nesta unidade, que não tem Pós-Graduação na área. Os professores desta unidade envolvidos

neste projeto, foram recentemente contratados pela UAST são André Luiz Cabral Monteiro de

Azevedo Santiago e Cynthia Costa, ex-alunos do Programa de Pós-Graduação em Biologia de

Fungos do Departamento de Micologia da UFPE.

A implementação do acervo também atenderá a outros pesquisadores de diversas

instituições de Pernambuco e do país, e proporcionará um melhor atendimento aos atuais

usuários.

d) Descrição das condições e mecanismos específicos que se pretende implantar para a

disponibilização do acervo de interesse científico à comunidade de pesquisadores,

inclusive de outras instituições

Utilização de novas técnicas de identificação de fungos filamentos e leveduras, como a

técnica com a biologia molecular incluindo sequenciamento de regiões do genoma das

espécies novas e das que a taxonomia clássica não seja suficiente para identificar ao nível de

15

espécie. Desta forma, serão disponibilizadas culturas do acervo da Micoteca URM, com

identificação mais precisa para pesquisadores do Estado e do país;

Implantação de um setor na Micoteca URM para amplificação de regiões do DNA de

culturas do acervo, pois o Laboratório de Biologia Molecular do Depatamento de Micologia,

está sobrecarregado, tornando o tempo longo para análises das amostras;

Compondo uma abordagem polifásica para identificação e autenticação das espécies do

acervo da Micoteca URM será também utilizada a técnica do MALDI TOF-MS;

Implantar e disponibilizar on line no site da Micoteca URM (www.ufpe.br/micoteca) um

banco de imagens de culturas de fungos pertencentes ao acervo desta coleção, com as imagens

de culturas de fungos obtidas por microscopia óptica de luz e eletrônico de varredura;

Manutenção do Sistema de Gestão Laboratorial baseado na ISO 9001:2008, previsto para

ser implantado na Micoteca URM, em dezembro de 2012, com o apoio do Projeto FACEPE

Multiusuário do Edital 07/2010, e ISO 17025 previsto para ser implantado na Micoteca URM,

em outubro de 2013, com o apoio do Convênio FINEP: 01.08.0392.00, através auditorias e

assessorias semestrais por empresas especializadas;

Dar continuidade ao apoio a implantação de um laboratório de micologia na Unidade

Acadêmica de Serra Talhada-PE, da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE),

com a aquisição de materiais de consumo e de equipamentos necessários. Com isto, pretende-

se ampliar os estudos em taxonomia de fungos do semi-árido e aumento do acervo da

Micoteca URM com estes isolados. Esta atividade foi iniciada com o apoio do Projeto

FACEPE Multiusuário do Edital 07/2010;

Provável geração de processos e produtos passíveis de obtenção de patentes com o acervo

da coleção;

Implementação na rotina, o fornecimento também de culturas liofilizadas, para diminuir o

tempo entre a solicitação do interessado e a entrega da(s) amostra(s) de fungo(s),

proporcionando assim um atendimento mais rápido, seguro, preciso e de menor custo.

Disponibilização pela Micoteca URM de um maior do número de culturas do acervo

produtoras de enzimas com aplicações biotecnológicas diversas, podendo ser utilizadas por

outros pesquisadores e pelo setor industrial.

e) Objetivos e metas a serem alcançados

Ampliar o número de amostras de fungos pertencentes ao acervo da Micoteca URM,

autenticadas taxonomicamente através do sequenciamento de regiões do DNA;

16

Ampliar o acervo da Micoteca URM através de coleta e isolamento e recebimento de

fungos filamentosos e leveduras de outros pesquisadores, isolados de diversos

ambientes, substratos e hospedeiros;

Implantar na rotina, o fornecimento também de culturas liofilizadas;

Implantar na Micoteca URM, um setor para extração e amplificação de regiões do

DNA de culturas do acervo;

Aumentar o número de amostras de fungos fornecidas a pesquisadores e outros

interessados;

Identificar até o nível de espécie culturas de fungos filamentosos recém isoladas,

através de uma abordagem polifásica;

Caracterizar o secretoma de30 isolados de Fusarium solani pertencentes ao acervo da

Micoteca URM, utilizando uma abordagem LC-MS;

Reativar e revisar taxonomicamente culturas de interesse biotecnológico do acervo da

Micoteca URM, por abordagem polifásica;

Implantar e disponibilizar on line no site da Micoteca URM (www.ufpe.br/micoteca)

um banco de imagens de culturas de fungos pertencentes ao acervo desta coleção,

obtidas por microscopia óptica de luz e de varredura;

Caracterizar e disponibilizar para outros pesquisadores culturas de fungos

filamentosos e leveduras produtoras de enzimas de interesse biotecnológico, como

lipase, L-asparaginase, tanase, xilanase, celulase, pectinase, amilase e protease, assim

como com atividade antimicrobiana;

Colaborar na formação de recursos humanos nas áreas de taxonomia de fungos e

biotecnologia;

Manter e implantar novas parcerias nacionais e internacionais;

Manter um Sistema de Gestão Laboratorial baseado nas Normas ISO 9001:2008 e ISO

17025:2005;

Divulgar as atividades desenvolvidas pela Micoteca URM em eventos, reuniões e

artigos publicados em revistas nacionais e internacionais.

Metas

Acervo da Micoteca URM ampliado em 5% do total de acesso atual até a conclusão

do projeto;

Aumento em 20% do fornecimento de amostras do acervo da Micoteca URM;

17

Aumento do número de culturas de fungos reativadas e autenticadas

taxonomicamente, em cerca de 200 culturas, de dezembro de 2013 a novembro de

2014;

Implantação do fornecimento de culturas de fungos liofilizadas a partir de junho de

2013;

Implantação na Micoteca URM de um setor para extração e amplificação de regiões

do DNA de culturas do acervo até o final do projeto;

Isolamento e identificação por taxonomia clássica, cerca de 1000 culturas de fungos

filamentosos e leveduras a partir de janeiro 2013 até outubro de 2013;

Caracterização molecular de aproximadamente 100 amostras de Aspergillus e

Penicillium e 65 culturas de Mucor do acervo da Micoteca URM, de março de 2013 a

março de 2014;

Sequenciamento de cerca 100 de fragmentos amplificados da região ITS do rDNA do

gen calmodulina e β tubulinina, de culturas de fungos do acervo da Micoteca URM, de

março de 2013 a setembro de 2014;

Deposito no GenBank de cerca de 200 sequências dos táxons estudados, até novembro de

2014;

Identificação cerca de 100 culturas de fungos utilizando também a técnica do MALDI

TOF MS de março de 2013 a outubro de 2014;

Conhecimento do secretoma de 50 isolados de F. solani pertencentes ao acervo da

Micoteca URM, utilizando uma abordagem LC-MS até o final do projeto;

Caracterizção qualitativa cerca de 100 culturas de fungos do acervo da Micoteca URM

quanto a produção de enzimas, , assim como com atividade antimicrobiana até

novembro de 2014;

Disponibilização de cerca de 200 culturas caracterizadas por abordagem polifásica e

quanto à produção de enzimas, assim como com atividade antimicrobiana na

conclusão do projeto;

Manutenção do Sistema de Gestão Laboratorial ao final do projeto;

Formação de cerca de 20 alunos e profissionais nas áreas de taxonomia de fungos e

biotecnologia ao longo do projeto;

Publicação de cerca de 100 resumos em eventos e 10 artigos em revistas nacionais e

internacionais.

18

f) Metodologia a ser empregada;

1. Ampliação do acervo da Micoteca URM

1.1. Coletas e isolamento de espécies de Zygomycetes, Aspergillus e Penicillium presentes

em solo de áreas de Caatinga de municípios de Pernambuco

Serão realizadas coletas de amostras de solo de áreas de Caatinga nos municípios de

Buíque, Ibimirim, Serra Talhada e Tupanatinga. Em cada área serão distribuídos

aleatoriamente 5 quadrantes de 25m2 (5x5m) respeitando uma distância mínima de 10m entre

si. Em cada quadrante serão coletadas seis subamostras de solo em pontos equidistantes a uma

profundidade de 0-20 cm, totalizando 5 amostras. As amostras de solo serão coletadas, com

auxílio de uma pá de jardinagem, acondicionadas em sacos plásticos etiquetados, conservadas

em caixas de isopor com gelo e encaminhadas para manipulação no laboratório de pesquisa da

Micoteca URM. Para o isolamento, uma suspensão do solo coletado será feita segundo o

método de Clark (1965) modificado, até a obtenção das diluições 1:1000 e 1:10000. De cada

diluição, 1 mL será semeado em triplicata na superfície dos meios: ágar Sabouraud, pH 5,5

acrescido de cloranfenicol (80μg/L) e rosa bengala (0,05ml/L) e em ágar dichloran glycerol

(DG- 18) (HOCKING E PITT, 1980) que favorece o desenvolvimento de fungos xerofílicos,

contidos em placas de Petri em triplicata. As placas permanecerão à temperatura ambiente (28

ºC ± 1 ºC) e o crescimento das colônias será acompanhado por até 72 horas. Após purificação,

os isolados serão transferidos para meios específicos (BENNY, 2008, LACAZ et al., 2002)

para posterior identificação.

1.2. Coletas e isolamento de fungos endofíticos da catingueira (Caesalpinia pyramidalis

Tui.) em área de Caatinga

O material vegetal será transportado ao Departamento de Micologia da Universidade

Federal de Pernambuco (UFPE) e processado em até 24 horas. De cada planta, serão retirados

15 fragmentos de cerca de 1cm2, perfazendo 45 fragmentos em cada amostra vegetal

(indivíduo). Serão inoculados cinco fragmentos em cada placa de Petri, totalizando 81 placas

para cada coleta. O material vegetal será desinfestado de acordo com Araújo et al. (2002).

Após a desinfestação, os fragmentos serão transferidos assepticamente para a superfície do

meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA) suplementado com antibióticos (cloranfenicol e

tetraciclina), para suprimir o crescimento bacteriano. As placas de Petri serão incubadas a

30ºC por até 30 dias, verificadas diariamente e qualquer colônia de fungo presente será

isolada, purificada e mantida em BDA para posterior identificação. Para verificar a eficácia da

19

desinfestação alíquotas da última água de lavagem (1 mL), serão inoculadas no mesmo meio

contido em placas de Petri, seguindo as mesmas condições de incubação.

1.3. Coletas e isolamento de leveduras presentes no mel de abelhas sem ferrão e dos

frutos de plantas da Caatinga

Será coletado o mel das abelhas sem ferrão: mandaçaia (Melipona mandacaia),

mandurí (Melipona marginata), cupira (Patarmonia cupira) e canudo (Scaptotrigona

postiça). As coletas serão realizadas entre janeiro e dezembro de 2013 em uma área de

Caatinga e outra urbana, ambas localizadas no município de Serra Talhada/PE, Brasil.

Conforme recomendado por Gilliam, Roubik e Lorenz (1990) e Souza et al. (2009),

amostras de 1mL de mel serão obtidas por meio de sucção com seringa descartável

diretamente nos potes fechados de armazenamento das colmeias das abelhas. Antes da

retirada da alíquota para análise, os potes de mel serão previamente higienizados

externamente com água destilada e álcool 70% segundo Gilliam, Roubik e Lorenz (1990) para

retirada de sujeiras e microrganismos externos.

Todas as amostras serão etiquetadas e acondicionadas em caixa isotérmica para o

transporte e processamento no laboratório de Biologia da Universidade Federal Rural de

Pernambuco - Unidade Acadêmica de Serra Talhada (UFRPE-UAST) para isolamento dos

micro-organismos. Em seguida as culturas puras, serão identificadas na Micoteca URM. As

leveduras serão isoladas por meio do plaqueamento em superfície seguindo as recomendações

de Vargas (2006) e incubadas por 5-8 dias a 35º C ± 3°C.

As colônias serão purificadas e analisadas quanto às características morfológicas e repicadas

para tubos contendo meio ágar Sabouraud acrescido de 0,2mg/L de clorafenicol, incubadas a

30º C por 48 h e em seguida estocadas sob refrigeração para posterior identificação.

2. Reativação de fungos do acervo da Micoteca URM

Para reativação, as culturas serão transferidas para Caldo Glicosado (LACAZ et al.,

2002) e mantidas à 28ºC por três dias. Após crescimento, serão transferidas para o meios de

cultura específicos, contidos em tubos de ensaio e posteriormente mantidas à mesma

temperatura. Para autenticação taxonômica das culturas, serão observadas as características

macroscópicas, tais como: coloração, consistência e diâmetro das colônias e, microscópicas

como: estruturas somáticas e reprodutivas, sendo estas últimas observadas através do cultivo

sob lamínula (DALMAU, 1929) utilizando o meio Ágar Czapeck, onde serão semeados

20

fragmentos da colônia em dois pontos eqüidistantes da placa, cobrindo-os com lamínulas

esterilizadas e incubados a 28ºC. Após aproximadamente 7 dias, será removida a lamínula do

cultivo e colocada sobre uma lâmina de microscopia, contendo uma gota de corante Azul de

Aman para posterior observação das microestruturas sob microscópio de luz

3. Identificação e autenticação de culturas de fungos

3.1 Fungos filamentosos

Taxonomia clássica

Para a identificação através de taxonomia clássica de todas as amostras de fungos

serão observadas características macroscópicas (coloração, aspecto e diâmetro das colônias) e

microscópicas (microestruturas somáticas e reprodutivas). A identificação será realizada

através de literatura específica, como: Benny (1982), Domsch (1993), Hesseltine & Fennel

(1995), Jacobs & Botha (2008), Klick e Pitt (1988); Klich (2002), Mehrotra & Mehrotra

(1979, 1978), Mirza et al. (1979), Pitt (1991), Raper e Thom (1949), Samson e Frisvad

(2004), Schipper (1978, 1984, 1990), Subrahamanyam (1983), dentre outros.

Visualização de microestruturas de culturas de fungos por Microscopia Óptica de

varredura (MEV)

Características microscópicas de cerca de 100 amostras de fungos serão também

observadas também por MEV no CETENE. As amostras serão armazenadas a 5 ºC em estufa

BOD por 24 h, sendo em seguida processadas segundo a metodologia adaptada de Kitajima &

Leite (1997).

Caracterização Molecular

Cerca de 200 amostras de fungos serão selecionadas para a caracterização molecular.

Estas amostras serão àquelas cuja identificação por taxonomia clássica não seja conclusiva e

as prováveis espécies novas. As atividades de amplificação do DNA serão realizadas no

Departamento de Micologia, Micoteca URM, UFPE.

Extração do DNA genômico e amplificação da Região ITS do rDNA

A extração do DNA genômico será realizada de acordo com O’DONNELL (1979) e

KURAMAE-IZIOKA et al. (1997). A massa micelial será triturada na presença de nitrogênio

líquido e o micélio colocado em tubos de Eppendorf de 1,5 mL. Serão adicionados 700 µL do

tampão de extração (tris-HCl 1M; pH 8,0; NaCl 5M; EDTA 0,5 mM; pH 8,0; dodecil sulfato

21

de sódio 10%) previamente aquecido a 65°C. As amostras serão incubadas em banho-maria a

65°C, por 30 minutos, e agitadas, levemente, a cada 10 minutos. Em seguida, serão

adicionados 500 µL de acetato de potássio (5M), procedendo-se a homogeneização,

incubação no gelo por 30 minutos e centrifugação a 14500g por 10 minutos. Retirado o

sobrenadante, um volume da solução clorofil (clorofórmio/álcool isoamílico na proporção de

24:1), será adicionado, seguido de centrifugação a 14500g por 10 minutos. Após a

centrifugação, o sobrenadante será transferido para novos tubos, aos quais será adicionado um

volume de isopropanol absoluto resfriado a 4°C. Após inversão dos tubos por várias vezes, os

mesmos serão centrifugados para precipitação do DNA, descartando-se o sobrenadante em

seguida. O “pellet” será lavado com etanol 75%, e as amostras submetidas à centrifugação a

14500g por 10 minutos. Após secagem em temperatura ambiente, o DNA será ressuspendido

em 70 µL de tampão TE (Tris-HCl 1M e EDTA 0,5M; pH 8,0), e a suspensão de DNA será

armazenada a -20°C até o momento do uso.

Amplificação das regiões ITS 1 e ITS2, gens B-tubulina e calmodulina

Caso ocorram novos táxons ou dificuldade na identificação de algumas espécies, as mesmas

serão analisadas pela amplificação e sequenciamento das regiões ITS1 e ITS2 do rDNA, gens

B-tubulina e calmodulina. O DNA total será extraído segundo Kuramae Itioka (1997). As

regiões ITS1 e ITS2 serão amplificadas utilizando os primers ITS 1 e ITS 4, como descrito

por Varga et al. (2000) e White et al. (1990). A amplificação parcial do gen β tubulina será

realizada utilizando os primers Bt2a e Bt2b, segundo Glass e Donaldson (1995) e Samson et

al. (2004). A amplificação parcial do gen calmodulina será feita como descrito por Serra et al.

(2006). Um ou dois representantes, de cada gênero, com taxonomia clássica confirmada, serão

utilizados como controle e analisados molecularmente.

Culturas de Zygomycetes- Amplificação das regiões ITS 1 e ITS2

Serão amplificadas e sequenciadas regiões ITS1 e ITS2 do rDNA de 65 culturas de

Mucor estocadas na Micoteca URM, bem como as culturas pertencentes ao filo Zygomycetes

que estejam sendo incorporadas à Coleção e apresentem dificuldade de identificação

por taxonomia clássica, ou sejam prováveis espécies novas. O DNA extraído será usado como

molde para as reações de PCR usando os primers ITS1 e ITS4 (White et al. 1990). As reações

de amplificação serão realizadas em um volume final de 50 µl, contendo75 mM Tris-HCl pH

8,8, 200 mM (NH4)2SO4, 0.01% Tween 20, 2 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTPs, 1 µM de

cada primer e 2 unidades de TaqTM

DNA polimerase (Fermentas, Maryland, USA) e 25ng de

22

DNA; os parametros de ciclagem serão 5 minutos a 94°C, 40 ciclos de amplificação com

desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 59°C por 30 segundos, elongação a 72°C

por 1 minuto e extensão final a 72°C por 30 segundos. Os produtos de amplificação do locus

ITS1-5.8S-ITS2 do rDNA serão separados por eletroforese em gel de agarose 1,4% a 3 V/cm

em tampão de corrida TBE 0,5X, pH 8,0, utilizando-se marcador de peso molecular 100pb

(“Invitrogen Life Tecnologies”), corado em solução de brometo de etídio por 30 minutos e

visualizado em trans-iluminador de luz ultravioleta.

Para espécies de outros gêneros, será utilizada a metodologia específica com base em

literatura especializada.

Purificação do DNA e sequenciamento das regiões amplificadas

O DNA amplificado será purificado no Depto. de Micologia/UFPE utilizando-se o

“PureLink PCR Purification Kit” (Invitrogen) e seqüenciado diretamente ou clonado com o

“CloneJETTM

PCR Cloning kit” (Fermentas; Carlsbad, USA), seguindo instruções do

fabricante, e sequenciado. As análises de sequenciamento de DNA serão realizadas na

plataforma multiusuária de Genômica e Expressão Gênica do Centro de Ciências Biológicas

da UFPE na forma de serviço tecnológico. Com isso, dados moleculares de alta qualidade e

com muita rapidez serão gerados e comporão a plataforma de taxonomia polifásica da

Micoteca URM.

Análise filogenética

Inicialmente as sequências das amostras serão comparadas às estocadas no

“GenBank”, a partir do BLASTn, para confirmação genética dos táxons estudados.As

sequências obtidas serão alinhadas com outras recuperadas do GenBank, usando o programa

ClustalX (Larkin et al. 2007) e editadas com o BioEdit (Hall 1999). Antes da análise

filogenética o modelo de substituição nucleotídica será estimado usando-se Topali 2.5 (Milne

et al. 2004). A Análise de máxima verossimilhança (1.000 bootstraps) será realizada com

PhyML (Guindon & Gascuel 2003) a partir do programa Topali 2.5, usando o modelo de

substituição nucleotídica selecionado previamente. A análise de neighbor-joining e máxima

parcimônia (com 1.000 bootstraps cada) será executada a partir do PAUP*4b10 (Swofford

2003).

23

Caracterização das culturas de Aspergillus, Penicillium e Fusarium por MALDI-TOF

MS

As culturas serão crescidas por três dias em meio líquido e em seguida lavadas com

água destilada e liofilizadas. O micélio seco de cada uma das culturas será transferido como

uma película fina para o aço inoxidável modelo do MALDI e em seguida misturado com 1 µL

da solução matriz do MALDI (10mg/ml de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico em água/acetonitrila

(1:1), com 0,03 % de ácido trifluoroacético). Após essa mistura cada amostra será seca a

temperatura ambiente e as análises realizadas utilizando o MALDI-TOF MS com um laser de

nitrogênio a 337 nm (Voyager DE-PRO, Applied Biosystems, Foster City, CA) de modo

linear. Durante o tempo de separação das proteínas ocorrerá os picos a uma precisão de massa

de pelo menos 200 ppm. Rotineiramente o intervalo de massas é de m/z = 2000-20000 Da

(KALLOW et al., 2006). Escherichia coli DH5alfa será utilizado para a calibração externa. O

banco de dados será o SARAMIS (Spectral Archiving and Microbial Identification System),

onde será feita a comparação dos espectros. (KALLOW et al., 2006).

O secretoma de F. solani será analizado por uma abordagem LC-MS de acordo com

Brown et al., (2012). Proteínas secretadas a partir de meios líquidos serão concentradas

através de precipitação com acetona, digerida com tripsina e analisada por LC-MS num

espectrómetro de massa. Serão comparados secretomes entre estirpes de F. solani para

identificar péptidos estirpe-específicos que podem ser utilizados para analisar as estirpes

usando uma abordagem mais simplificada com MALDI-MS.

Análises ecológicas das comunidades de fungos isolados

As comunidades de fungos serão avaliadas em termos quantitativos e qualitativos a

partir de dados populacionais (frequência de ocorrência, abundância relativa) e sua

estruturação, analisada por meio de índices ecológicos (riqueza e diversidade). Serão

estimadas a frequência de ocorrência (Fi) das espécies e a abundância relativa. As

abundâncias relativas das espécies serão classificadas como: < 0,5% = rara, ≥ 0,5 < 1,5% =

ocasional, ≥ 1,5 < 3,0% = comum, ≥ 3,0% = abundante (Schnittler e Stephenson, 2000). A

riqueza de espécies será avaliada como uma relação entre o número de espécies observadas e

o tamanho da amostra. Para o cálculo da diversidade será utilizado o índice de diversidade de

Shannon-Wiener. A comparação dos estimadores de riqueza ou diversidade será feita através

de ANOVA 2-fatores (setor x área).

24

Análises das propriedades físico-químicas das amostras de solo

As propriedades físico-químicas das amostras de solo, serão determinadas por um

laboratório credenciado. Serão analisadas as seguintes propriedades: matéria orgânica (M.O),

pH, fósforo (P), Nitrogênio (N), Carbono (C), Magnésio (Mg), Potássio (K), Alumínio (Al),

Sódio (Na), Enxofre (S), cálcio (C), cobre (Cu), ferro (Fe).

3.2 - Leveduras

Identificação e autenticação taxonômica de culturas do acervo da Micoteca URM

As culturas serão, identificadas e autenticas de acordo com os critérios taxonômicos

clássicos (características macroscópicas, microscópicas e fisiológicas) e moleculares. A

morfologia das células vegetativas crescidas em meio líquido e sólido, a formação de

pseudomicélio, micélio verdadeiro e clamidosporo serão realizadas de acordo com Lodder

(1970); a formação de balistosporos segundo Carmo-Souza; Phaff (1962). Para observação

das características dos ascos e ascósporos, as amostras serão cultivadas em ágar Gorodkowa

a 25±3 ºC por 15 dias (BARNETT et al., 2000). Os testes de fermentação (zimograma) e

assimilação (auxonograma) de fontes de carbono e nitrogênico (Zimograma), serão realizados

segundo Barnett et al. (2000). Para identificação serão também observados os demais testes:

requerimento vitamínico (crescimento em meio isento de vitamina), crescimento em meio de

alta pressão osmótica, em elevadas temperaturas, produção de ácido, etecção da presença

extracelular de componentes amiloides e hidrólise da uréia (LODDER, 1970; BARNETT et

al., 2000).

4. Caracterização de culturas de fungos da Micoteca URM quanto à produção de

enzimas

4.1 Seleção de Culturas de Aspergillus com potencial para produção de lipases

Serão avaliadas 18 espécies de Aspergillus (A. caepitosus, A. awamori, A. niveus, A.

niger, A. variecolor, A. melleus, A. flavus, A. sclerotiorum, A. parasiticus, A. versicolor, A.

fumigatus, A. japonicus, A. stromatoides, A. candidus, A. sydowii, A. ocraceus, A. duricaulis,

A. terreus). Discos de 5 mm de diâmetro das culturas serão transferidos para o centro da placa

de Petri com meio de cultura proposto por SIERRA (1957), ajustado o pH para 7,4. As

culturas serão incubadas a 37ºC e 28ºC, e observadas durante 24, 48, 72 e 96 horas, para

detecção de um halo claro em torno das colônias indicativo de atividade lipolítica. A seleção

25

será realizada em triplicata. O Índice Enzimático (IE) será expresso pela medida da relação

entre o diâmetro do halo e o diâmetro do crescimento da colônia segundo Hankin et al. (1971)

e Hankin e Anagnostakis (1975). As espécies que apresentarem halo de degradação serão

selecionadas para avaliação quantitativa da produção de lipase através de Fermentação em

Estado Sólido, utilizando resíduo de licuri, Syagrus coronata (Martius) Beccar como

substrato, fornecido pela COOPERLIC – Cooperativa de Colhedores e Beneficiadores de

Licuri - Caldeirão Grande, Bahia. As fermentações serão realizadas em frascos Erlenmeyers

de 250 mL, 10 g de resíduo umedecido com tampão fosfato 0,1 mol/L contanto que a umidade

inicial seja 40 %, pH 7,0. Os frascos serão esterilizados em autoclave, resfriados e inoculados

com 1 mL da solução de esporos na concentração 5x108 esporos/mL e incubados 30°C por

120 horas. Para obtenção do extrato bruto, em cada 24 h serão retirados três frascos para

extração da enzima e dosagem da atividade enzimática. Em cada frasco serão adicionados 50

mL de água destilada esterilizada com 0,01% de Tween 80 e mantidos em agitador rotativo

(Shaker) a 150 rpm durante 10 minutos. A enzima bruta do material fermentado será extraída

por filtração direta usando em papel de filtro (CELAB 22,15 micra). Os filtrados serão

distribuídos em tubos Falcon de 50 mL e preservados em 4°C para futuras análises (SABU et

al., 2005) e será considerado como extrato enzimático bruto.

4.2 Seleção de Culturas de Trichosporon com potencial para produção de lipases

Serão utilizadas 20 culturas de Trichosporon, preservadas sob óleo mineral na

Micoteca URM de 1954 a 2010. Cada cultura será transferida para frascos de Erlenmeyer de

250 mL contendo os seguintes meios de cultura: Meio I- composto por 1% (v/v) de óleo de

oliva (industrial) adicionado de 0,5% (p/v) extrato de levedura, pH 6,5 e Meio II- contendo

1% (v/v) de óleo de mamona (artesanal) adicionado de 0,5% (p/v) extrato de levedura, pH 6,5.

Os meios de cultura serão esterilizados a 120ºC durante 15 minutos, resfriados e inoculados

com disco de 5 mm obtidos a partir da colônia central e incubados em agitador orbital a 160

rpm a 30ºC por 96 horas. O meio fermentado será filtrado utilizando papel de filtro (CELAB).

Serão estudados os parâmetros como: temperatura, pH, concentração de extrato de levedura e

concentração de óleo, utilizando um planejamento fatorial completo (24). Será utilizado para o

Meio I óleo de oliva (10% m/v) e Meio II óleo de mamona (10% m/v) como substratos para

dosagem da enzima, os quais serão emulsionados por três minutos com goma arábica (5%

p/v) em água destilada. A 5 mL desta emulsão será adicionado 1 mL do extrato enzimático

bruto, incubado por 1 hora a 37ºC, posteriormente titulados com uma solução de NaOH (0,05

M) segundo Watanabe et al. (1977).

26

4.3 Seleção de fungos com potencial para produção de L-asparaginase

Serão testadas 50 culturas de fungos estocadas na Micoteca URM. Todos os isolados

de fungos endofíticos serão cultivados em meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA)

durante 7 dias. Discos de 5 mm de micélio serão transferidos para placas de Petri contendo o

meio ágar Czapek Dox’s modificado (ACDM) (SAXENA; SINHA, 1981). O ensaio em placa

de ágar será utilizado para selecionar os fungos produtores de L-asparaginase. O meio ACDM

será composto por glicose (2,0 g/L), L-asparagina (10,0 g/L), KH2PO4 (1,52 g/L), KCl (0,52

g/L), MgSO4.7H2O (0,52 g/L), CuNO3.3 H2O (0,001 g/L), ZnSO4.7H2O (0,001 g/L),

FeSO4.7H2O (0,001 g/L), pH 6,2 e suplementado com vermelho de fenol (0,009%

concentração final) que será utilizado como indicador de produção de L-asparaginase. Placas

de ACDM sem asparagina serão utilizadas como controle. Todas as placas serão incubadas a

30 °C por cinco dias. O raio da zona cor-de-rosa e o diâmetro da colônia serão mensurados

após a incubação. A zona cor-de-rosa indica a capacidade de produção de L-asparaginase pelo

fungo (GULATI et al., 1997; THEANTANA et al., 2007).

4.4 Seleção de culturas de Aspergillus e Penicillium com potencial taninolítico,

celulolítico e xilanolítico

Culturas de Aspergillus e Penicillium serão repicadas para o centro do meio agar

Czapek, modificado pela substituição da sacarose por 10 g/L de ácido tânico (C76H42O56),

contido em placas de Petri, sendo incubadas em estufa a 30°C por 72h. Após a incubação, a

aparência das colônias e tamanho do halo em torno das colônias será determinada

(MURUGAN et al., 2007). As culturas que apresentarem halo de degradação do ácido tânico

serão selecionadas para avaliação quantitativa da produção de tanase através de fermentação

em estado sólido, utilizando folhas da mangueira (Mangifera indica L.) como substrato,

preparadas segundo Trevino-Cueto et al. (2007). Em frascos tipo Erlenmeyers de 125 mL será

adicionado 5.0 g de folhas da mangueira previamente tratadas e 5 mL de solução de sais na

composição (g/L): KH2PO4, 1.0 g; NH4NO3, 5g, NaCl 1g, MgSO4.7H2O 1g e ácido tânico

40g (Figura 01). O pH será ajustado para 5.5. Os frascos contendo as folhas serão

esterilizados a 121°C durante 20 min. Os frascos serão inoculados com 1 mL da solução de

esporos na concentração 5x108 esporos/mL e incubados a 30°C em estufa BOD. Após 120h

de fermentação, em cada frasco serão adicionados 50 mL de água destilada esterilizada com

0,01% de Tween 80 e mantidos em agitador rotativo (Shaker) a 150 rpm durante 10 minutos.

Em seguida o material fermentado será submetido a filtração direta usando em papel de filtro

27

(CELAB 22,15 micra). O filtrado de cada frasco será considerado extrato bruto enzimático e

preservado em 4°C para futuras análises (SABU et al., 2005).

4.5 Seleção de culturas de fungos quanto a produção de L-aparaginase

Um disco de 5 mm de micélio das culturas de fungos cultivados em cada placa de Petri

contendo o meio de cultura BDA serão usados como inóculo em frascos de Erlenmeyer (250

mL) contendo 50 mL de Czapex Dox’s modificado (CDM). Os fracos de Erlenmeyer serão

incubados a 30 ° C em agitador rotativo a 120 rpm durante 5 dias. Após esse período, as

culturas serão filtradas utilizando papel de filtro Whatman nº 1 e centrifugadas a 6000 rev

min-1

por 15 min.

4.6 Seleção de culturas de Mucor e Penicillium com potencial proteolítico

As linhagens serão replicadas no Meio seletivo para protease (meio básico

modificado) para classificar os possíveis produtores da enzima protease. O meio utilizado será

o proposto por Couri & Farias (1995), tendo por leite desnatado ou gelatina 10,00 (g/L) como

substrato, pH 4,5. A inoculação de cada espécie será realizada em triplicata a 30ºC por 96

horas. As espécies selecionadas como produtoras de protease serão inoculadas no meio de

produção. Em meio MS-2 para a produção dos metabólitos, descrito por Porto et al. (1996)

composto por farinha de soja 4,0% (p/v) dentre outros, pH inicial 7,0, por 48, 72 e 96 horas a

uma temperatura de 30oC. As condições serão modificadas e analisadas para otimizar a

produção da enzima. Outros constituintes como a milhocina, entrecasca da mandioca e a

palma forrageira serão avaliados como fonte de nitrogênio e/ou carbono para o crescimento da

espécie selecionada.

4.7 Detecção de Atividade Pectolítica

Para detecção pectinolítica será inoculado 2 µL de uma suspensão contendo 107 esporos

previamente padronizada. O teste será realizado na superfície de placas contendo meio sólido

(1,25% cítrico pectina, potássio fosfato 50mM pH 5,5, 6.7g / L extrato levedura, 0,2% e 1,5%

ágar glicose). Após quatro dias de crescimento a 25ºC, será vertida sobre as placas uma

solução com 0,05% vermelho congo (Sigma C-6277) e incubadas à temperatura ambiente

durante uma hora. Em seguida, a solução será removida da superfície do meio e lavada com

água destilada. A atividade pectinase será evidenciada pela formação de halo claro em torno

28

das colônias em placas com pectina conforme descrito e a Zona de atividade (ZA) será

calculada de acordo com a metodologia proposta por por Uenojo e Pastore (2007).

4.8 - Detecção de Atividade Amilásica

Para detecção da atividade amilolítica, 2 µL de uma suspensão contendo 107 esporos do

fungo a ser estudado serão inoculados no centro da superfície de uma placa de Petri contendo

meio mínimo (MM), cuja composição é, em g L-1: NaNO3 (0,38), KH2PO4 (1,19),

MgSO47H2O (0,50), KCl (0,50), FeSO47H2O (0,01), glicose (10), agar (20), suplementado

com 2% de Tween 80 (sorbitano monolaurato), suplementado com amido solúvel 2% e pH

6,0. As placas serão incubadas a 28 ºC, por sete dias. Após esse período, as placas serão

reveladas com lugol e a zona de atividade (ZA) será calculada como descrito anteriormente.

(Cuzzi et al., 2011).

4.9 Métodos analíticos

4.9.1 Dosagem do conteúdo de proteínas

A determinação da concentração protéica será realizada através do método de

Bradford (1976) modificado, que utiliza como corante o “Coomassie Brilhant Blue”, para

detectar quantidades mínimas de proteínas em líquidos biológicos. A curva de calibração será

realizada a partir de soluções estoques de soroalbumina bovina (BSA).

4.9.2 Atividades enzimáticas

Atividade lipásica

Para quantificação da atividade lipásica das culturas de Aspergillus e Trichosporon por

fermentação em estado sólido (FES) será realizada pelo método titulométrico, utilizando óleo

de oliva (10% m/v) como substrato para dosagem da enzima, segundo Watanabe et al. (1977).

A dosagem da atividade será realizada em triplicata e a média aritmética dos valores será

utilizada para determinação do cálculo da atividade enzimática segundo a equação

determinada por Leal (2000).

Atividade de L-asparaginolítica

A atividade de L-asparaginase será determinada do filtrado do CDM pela técnica de

Nesslerização e expressas como UI mL-1

, como descrito por Imada et al. (1973). As amostras

serão incubadas a 37 °C por 60 minutos e depois a reação será interrompida com 100μL de

29

ácido tricloroacético (TCA) 1,5M. Dessa mistura serão retirados 100μL os quais serão

adicionados a 750μL água destilada esterilizada. O reagente de Nessler será adicionado e a

mistura incubada a 20 °C por 20 minutos. Todas as reações serão medidas em leitora de

microplacas a 450 nm. Uma unidade de L-asparaginase será considerada como a quantidade

de enzima que catalisa a formação de 1 μmol de amônia por min a 37 °C (GULATI et al.,

1997; THEANTANA et al., 2007). Todas as análises serão realizadas em triplicata.

Atividade taninolítica

A atividade enzimática da tanase das culturas de Aspergillus e Penicillium será

determinada colorimetricamente de acordo com Sharma et al. (2000) com modificações. Em

tubo de ensaio, serão adicionados 0.4 mL do extrato enzimático e em seguida 0,6 mL de

solução etanólica de rodanina, permanecendo em repouso por 5 minutos. Após este período,

serão adicionados 0,4 mL da solução de hidróxido de potássio 0,5 N. Após três minutos, serão

adicionados 8,6 mL de água destilada e após agitação, cada amostra, em triplicata, será lida

em espectrofotômetro a 520 nm. O aparelho será calibrado com um tubo nas mesmas

condições da amostra, porém com água destilada em substituição ao extrato enzimático.

Atividade xilanolítica

Para determinação da atividade xilanolítica das culturas de Aspergillus e Penicillium

será utilizado xilana a 1% como substrato. Será homogeneizado 1g do substrato em 70 mL de

solução 50 mM de tampão acetato de sódio, pH 5,0 a 60°C. Em seguida, a solução será

aquecida até a fervura em uma chapa de aquecimento com agitação magnética.

Posteriormente, a solução será resfriada em banho de água à temperatura ambiente. Após

resfriada, a solução permanecerá sob agitação lenta durante 2h30 a 60°C. A solução de xilana

será completada com tampão acetato de Sódio 50 mM, pH 5,0, até um volume final de

100mL. Em seguida, será utilizada uma mistura de 1,35mL de solução de xilana a 1%, logo

após a estabilização da temperatura (banho-maria, 50°C por 5 minutos). Serão adicionados

0,150 mL do extrato enzimático (PEG, sal, PEG branco e sal branco). Serão transferidos

0,300mL da mistura para outro tubo de ensaio e adicionados 0,900mL de Ácido

Dinitrosalicílico (DNSA) (MILLER, 1959), interrompendo a atividade da enzima para

determinar os açúcares redutores totais. Tais ensaios serão realizados em triplicata. Após

aquecimento dos tubos, em água fervente a 100°C por 10 minutos, os mesmos tubos serão

mergulhados por alguns minutos em um recipiente com água gelada. Logo após, a leitura será

realizada em espectrofotômetro a 540nm.

30

Atividade celulolítica

Serão realizadas atividade de celulase total ou FPase, Atividade da CMCase e

Atividade da G. A celulase total será determinada de acordo com o método proposto por

Ghose (1987) utilizando tiras de papel de filtro Whatman nº1 (50 mg, 1x6 cm), recortadas e

enroladas foram mergulhadas em solução de 0,5 mL do extrato enzimático com 1,0 mL de

tampão citrato (50 mM, pH 5,0) contida em tubos de ensaio. A hidrólise será interrompida

com a adição de 1 mL do reagente Ácido Dinitrossalicílico (DNSA) (MILLER, 1959) para

quantificação do conteúdo de açúcares redutores. A absorbância das soluções será mensurada

a 540 nm de comprimento de ondas, por meio de espectrofotômetro e pela confrontação da

leitura óptica com uma curva de calibração, na qual a D-glucose será utilizada como padrão.

A determinação da atividade da CMCase, será realizada segundo as determinações de Ghose

(1987). Para a determinação da G, será utilizada a metodologia descrita por Schwan-Estrada

et al (2003).

Atividade Proteásica

A atividade proteásica será determinada a 25ºC como descrito por Ginther (1979). O

substrato protéico utilizado será a azocaseína 1% (p/v) (Sigma, St. Louis, Mo USA) diluída

em solução tampão Tris-HCL 0,2 M pH 7,6, contendo 10mM CaCl2. A atividade enzimática

será definida como uma unidade de atividade (U) a quantidade de enzima que produz um

aumento na densidade ótica de 1.0, a 440nm no período de uma hora.

4.7.3 Avaliação da atividade antimicrobiana

Os testes de avaliação da atividade antimicrobiana dos peptídeos bioativos obtidos

pela hidrólise das caseínas do leite caprino pelo extrato enzimático obtido por via

microbiológica e vegetal serão realizados pelo método CIM (Concentração Inibitória Mínima)

conforme descrito pela norma do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2003).

Os micro-organismos utilizados serão Enterococcus faecalis ATCC 138, Bacillus subtilis

ATCC 86, Escherichia coli ATCC 224, Pseudomonas aeruginosa ATCC 416, Klebsiella

pneumoniae ATCC 02 e Staphylococcus aureus ATCC 1007. As concentrações do

hidrolisado testadas contra estes micro-organismos serão 250mg, 125mg, 62,5mg, 50mg,

40mg, 30mg, 20mg e 10mg e os tempos de hidrólise testados serão de 40min e 2h – 24h.

31

4.8 Design experimental e análise estatística

Para análise estatística dos dados serái empregada a análise multivariada de um

planejamento experimental fatorial fracionário 25. Deste fatorial, será obtido um total de 32

ensaios diferentes entre si e quatro repetições no ponto central. Através dos resultados das

atividades específicas de cada enzima do complexo celulolítico (U/mL), será avaliada a

resposta de cada tratamento aplicado em confronto com as variáveis e níveis relacionados: ao

substrato utilizado e diferentes concentrações e às condições físicas para produção. Os

componentes observados explicarão 97,53% da variação nos dados (λ > 0,97) e suas

correlações. O processamento estatístico dos dados será realizado utilizando-se o programa

STATISTICA (Statsoft INC, 2008).

4.9. Efeito do pH e da temperatura na atividade das enzimas

O efeito do ao pH sobre a atividade lipásica será detectado pela verificação da

atividade, após incubação por 1 hora, do extrato enzimático bruto a 37ºC em diferentes pHs

(Tampão Citrato- fosfato 0,05 M pH 5,0-7,0 e Tampão Tris-HCL 0,05 M pH 7,0-9,0), na

proporção 1:1. O efeito da temperatura será determinado utilizando o pH ótimo selecionado

previamente, após incubação por 1 hora, do extrato enzimático em diferentes temperaturas

com variação entre 30 a 80 ºC, com uma faixa de variação de 5 °C. Após o período de

incubação, a atividade enzimática será realizada como descrita no item anterior. Todas as

análises serão realizadas em triplicata.

4.10. Estabilidade das enzimas ao pH e à temperatura

Para determinação da estabilidade da enzima à temperatura, o extrato enzimático será

previamente incubado a temperaturas de 30º a 90ºC com variação de 10°C por 1 hora e em

seguida serão submetidas à determinação da atividade lipolítica. Para determinação da

estabilidade da enzima ao pH o extrato enzimático será previamente submetido à ação de

diferentes valores de pH pelo uso das soluções tampões, com pH variando entre 5,0 a 8,8 por

um período de 1 hora e em seguida serão submetidas à determinação da atividade lipolítica.

As análises serão realizadas em triplicata.

4.11 Recuperação das enzimas com maior significância de resultados

Estudos de partição da celulase em sistema bifásico aquoso PEG/Citrato

32

Nos ensaios de recuperação de tanase serão utilizados tubos de vidro graduados (15

mL) onde serão pesados os sistemas de duas fases aquosas que possuirão concentrações

definidas através das curvas binodais. Os parâmetros de extração a serem estudados são:

massa molar e concentração do PEG, pH e concentração do sal na extração da enzima do

meio de fermentação. Para a extração da enzima, os sistemas serão preparados inicialmente

com PEG de diferentes massas molares (400, 1000, 3350 e 8000 g/mol) e sal segundo

Oliveira et al. (2001) e Sarubbo (2000).

Planejamento fatorial para otimização da extração das enzimas

Os estudos de extração serão baseados em planejamento experimental segundo Barros

Neto (2002). Existem vários fatores que interferem no sistema de duas fases aquosas, e eles

poderão ser analisados de tal forma que se poderá identificar o nível de significância e a

interação entre estes fatores sobre o coeficiente de partição, aumento de pureza e rendimento

da enzima com os respectivos erros experimentais. Para análise estatística dos resultados

serão utilizadas três variáveis respostas: coeficiente de partição, aumento de pureza e

rendimento. A melhor condição final de extração será definida como aquela que proporcionar

a melhor combinação entre as respostas.

Análise estatística

A análise estatística dos resultados será realizada com o auxílio do software Statistica

6.0.

5 – Manutenção do Sistema de Gestão Laboratorial da Micoteca URM

O Sistema de Gestão que está sendo implantado na Micoteca URM, é com base na

Norma ISO 2001:2008 com o apoio do Projeto FACEPE Multiusuários Edital 08/2010. A

previsão para a certificação é dezembro de 2012, sendo a Micoteca URM a primeira coleção

de culturas a obter este certificado no Brasil. A manutenção do sistema será realizada através

de auditorias internas realizadas por empresa especializada. Estas ações estão voltadas para

garantir a qualidade dos serviços da coleção e será de extrema importância para atendimento a

padrões internacionais e para fazer parte do Centro de Recursos Biológicos do Brasil, que está

sendo implementado nas instalações do InMetro, em Xerém-RJ.

6 - Métodos de preservação dos fungos

33

Os métodos de preservação utilizados serão: óleo mineral esterilizado (Sherf, 1943) e

água destilada esterilizada (CASTELLANI, 1967), liofilização (RAPER & ALEXANDER,

1945) e as espécies raras e as linhagens com potencial para produção de metabólitos de

interesse biotecnológico, serão também preservadas por ultracongelamento a -80 °C (SMITH

& ONIONS, 1994).

7 – Fornecimento de amostras liofilizadas do acervo da Micoteca URM

Para agilizar o fornecimento de amostras do acervo da Micoteca URM, todas as

amostras de fungos reativadas e autenticadas taxonomicamente serão liofilizadas em frascos

de penicilina (5 mL) (RAPER & ALEXANDER, 1945). As amostras serão enviadas também

nesta condição, pois algumas solicitações precisam ser atendidas com as amostras ativas em

meios de cultura específicos. Acompanhando as amostras, serão enviadas instruções de

reativação e manipulação.

g) Descrição dos mecanismos de gerenciamento do projeto, incluindo a composição

nominal e o modo de funcionamento propostos para o Comitê Gestor

Propomos para gerenciamento do projeto, os nomes dos professores Erika Valente de

Medeiros, Cristiano Souza Lima como membros externos a instituição proponente e as

professoras Janete Magali de Araújo e Leonor Costa Maia, como membros internos da

Universidade Federal de Pernambuco.

Erika Valente de Medeiros é Professora Adjunta da Unidade Acadêmica de

Garanhuns/UFRPE, tem Doutorado em Agronomia - Fitotecnia Universidade Federal Rural

do Semi-Árido. Atua nas áreas Microbiologia Aplicada, Fitossanidade Microbiologia e

Bioquímica do Solo.

Leonor Costa Maia é Licenciada em Ciências Biológicas (Faculdade de Filosofia do

Recife), Especialista em Biossistemática Vegetal e em Micologia, Mestre em Botânica

(Universidade Federal Rural de Pernambuco) e PhD em Phytopathology (University of

Florida). Atualmente é Professora Titular da Universidade Federal de Pernambuco, exercendo

as funções de Curadora do Herbário URM, Chefe do Laboratório de Micorrizas e Vice-

Coordenadora da Pós-graduação em Biologia de Fungos.

Janete Magali de Araújo possui graduação em Bacharelado e Licenciatura em História

Natural pela Universidade Católica de Pernambuco (1965), graduação em Bacharelado em

Química pela Universidade Católica de Pernambuco (1970), mestrado em Ciências

(Microbiologia) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (1976) e doutorado em Genética

34

e Melhoramento de Plantas pela Universidade de São Paulo (1990). Atualmente é professora

associada da Universidade Federal de Pernambuco, Chefe do Departamento de Antibióticos e

Curadora da Coleção de Microrganismos do Departamento de Antibióticos (UFPEDA)

WDCM114.

Cristiano Souza Lima é bolsista de produtividade em pesquisa 2F. Professor Adjunto I

da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Unidade Acadêmica de Garanhuns (UAG),

atuando no ensino de Graduação em Agronomia e Pós-Graduação em Fitopatologia. Possui

Graduação (2000) em Agronomia pela Universidade Federal do Ceará, Mestrado (2002),

Doutorado (2006) e Pós-Doutorado (2008) em Agronomia (Fitopatologia) pela Universidade

Federal de Lavras, com Doutorado Sanduíche na Kansas State University, Estados Unidos.

Atualmente é Curadora da Coleção de Microrganismos do Departamento de Antibióticos

(UFPEDA), Coleção de Culturas de Fungos Fitopatogênicos Profa. Maria Menezes

WDCM923.

O modo de funcionamento proposto para o Comitê Gestor será dividido em quatro

etapas: Curto, Médio e Longo prazo e Conclusão conforme tabela abaixo, através de reuniões

a serem realizadas de acordo com o quadro abaixo:

ETAPA PERÍODO ATIVIDADES

1 Fevereiro/2013 Gerenciar os recursos financeiros a serem utilizados;

Verificação do alcance das metas a serem implementadas

em curto prazo, médio e longo prazo;

Acompanhar a implantação das novas técnicas previstas;

Apresentação de relatório dos recursos orçamentários

utilizados.

2 Junho/2013

3 Fevereiro/2014

4 Novembro/2014

j) Identificação dos demais membros da equipe e de sua contribuição ao projeto

Nome Instituição Função Contribuição

Ana Lúcia

Figueiredo Porto UFRPE Pesquisador

Produção e purificação de

enzimas

André Luiz Cabral

Monteiro de

Azevedo Santiago

UFRPE/UAST Pesquisador Isolamento e identificação

de Zygomycetes

Anthony Alves dos

Santos Junior UFPE

Aluno de

Graduação

Reativação dos fungos do

acervo da Micoteca URM

Bruno Severo

Gomes UFPE Pesquisador

Isolamento e identificação

de leveduras.

Cledir Rodrigues

Santos

Universidade do

Minho - Portugal

Pesquisador

colaborador

Análise dos extrólitos pela

técnica do MALDI TOF MS

Christof Rampitsch Cereal Research

Centre/Agriculture

Pesquisador

colaborador

Detecção de extrólitos de

Fusarium solani

35

and Agrifood

Canada,

Winnipeg/Canada

preservados na Micoteca

URM

Christina Alves

Peixoto CETENE Pesquisador

Obtenção das imagens das

culturas por microscopia

eletrônica de varredura.

Cyndy Mary de

Mello Farias UFPE

Aluna de

Mestrado

Reativação de fungos do

acervo da Micoteca URM

Débora Maria Massa

Lima UFPE Pesquisador

Identificação de culturas de

Fusarium

Dianny Carolyne

Vasconcelos da Silva UFPE

Aluna de

Doutorado

Caracterização de extrólitos

produzidos por fungos

Diogo Xavier Lima UFPE Aluno de

Mestrado

Incorporar dados obtidos ao

acervo da Micoteca - URM.

Évellyn Carollyne

Domingos UFPE

Aluna de

graduação

Seleção de culturas

produtoras de enzimas

Eliane Barbosa da

Silva Nogueira UFPE Técnico

Manipulação das culturas do

acervo da Micoteca URM.

Gladstone Alves da

Silva UFPE Pesquisador

Caracterização molecular

das culturas fúngicas

Heloiza Maria da

Silva Oliveira UFPE

Aluna de

Doutorado

Seleção de culturas

produtoras de enzimas

Ildnay de Souza

Lima Brandão UFPE

Aluna de

Doutorado

Seleção de culturas

produtoras de enzimas

Jadson Diogo Pereira

Bezerra UFPE

Aluno de

Mestrado

Isolamento de fungos

endofíticos

Juliana Silva de

Lima UFPE

Aluna de

Mestrado

Seleção de fungos quanto a

produção de enzimas

Julyanna Cordoville

Fonseca UFPE

Aluno de

Graduação

Caracterização enzimática

de fungos

Keila Aparecida

Moreira UFRPE/UAG Pesquisador

Caracterização enzimática

das culturas de fungos

Laura Mesquita

Paiva UFPE Pesquisador

Caracterização enzimática

de fungos endofíticos

Lidiane Roberta

Cruz da Silva UFPE

Aluna de

Doutorado

Colaborar com a

identificação e produção de

enzimas por fungos

Luan Amim de

Oliveira Penna UFPE

Aluno de

graduação

Atualização do banco de

dados da Micoteca URM

Marcos Antônio de

Morais Júnior UFPE Pesquisador

Sequenciamento de regiões

do DNA de culturas de

fungos

Maria José dos

Santos Fernandes UFPE Pesquisadora

Identificação de culturas de

Aspergillus e Penicillium

Marília de Holanda

Cavalcanti Maciel UFPE

Aluna de

Doutorado

Seleção e produção de

enzimas por fungos

Marília Gomes da

Silva UFPE

Aluna de

Mestrado

Caracterização enzimática

de fungos endofíticos

Matheus Pessoa de UFPE Aluno de Caracterização enzimática

36

Melo Gomes Graduação de fungos

Minelli Albuquerque

Sousa UFPE

Bolsista

PNPD/CAPES

Colaborar com a

caracterização enzimática de

fungos

Neiva Tinti de

Oliveira UFPE Pesquisador

Caracterização molecular

das culturas de fungos

Nelson Manuel

Viana da Silva Lima

Universidade do

Minho - Portugal

Pesquisador

colaborador

Análise molecular e pela

técnica do MALDI TOF MS

Odacy Camilo de

Souza UFPE

Aluna de

Doutorado

Participação na identificação

de fungos filamentosos

Oliane Maria Correia

Magalhães UFPE

Pesquisador

Colaborar com o isolamento

e incorporação de leveduras

Phelipe Manoel

Oller Costa UFPE

Aluno de

Doutorado

Isolamento e colaboração na

identificação de fungos do

solo.

Polyanna Nunes

Herculano

UFRPE/LABTECB

IO

Aluna de

PNPD

Caracterização enzimática

das culturas de fungos

Rejane Pereira

Neves UFPE

Pesquisador

Colaborar com o isolamento

e incorporação de leveduras

Renan do

Nascimento Barbosa UFPE

Aluna de

Mestrado

Caracterização e

identificação de leveduras

Susana Carvalho de

Souza UFPE Técnico

Preparo de documentos para

incorporação dos fungos ao

acervo da micoteca URM

Susane Carvalho de

Souza

UFPE Aluna de

Doutorado

Caracterização molecular

das culturas de Aspergillus e

Penicillium.

Tatiana Souza Porto UFRPE/UAST Pesquisadora Caracterização enzimática

das culturas de fungos

Tatianne Leite

Nascimento UFPE

Aluna de

Doutorado

Isolamento e identificação

de fungos endofíticos.

Vanilla Mergulhão

Alves da Silva UFPE

Aluna de

Graduação

Caracterização enzimática

de culturas de fungos

Virgínia Michelle

Svedese UFPE Pesquisadora

Colaboração para

preparação das amostras

para obtenção das imagens

das culturas por microscopia

eletrônica de varredura.

37

h) Orçamento detalhado, com a devida justificativa para cada item solicitado e

totalização individualizada das seguintes rubricas:

(i) Capital (equipamento e material permanente) TOTAL: R$ 125.223,60 e material

bibliográfico (R$ 5.000,00)

EQUIPAMENTOS/

DESTINOS

JUSTIFICATIVA VALOR

UNITÁRIO

(R$)

VALOR

TOTAL

(R$)

Armário de ferro Armazenamento material de

consumo

1.200,00 1.200,00

Cabine de segurança

biológica Classe 2

(UAST/UFRPE e

Micoteca URM)

Manipulação de micro-organismos 15.000,00 30.000,00

Cuba horizontal e fonte de

alimentação

Eletroforese 5.700,00 5.700,00

Data Log/ Raitec Acompanhamento da temperatura do

Ultrafreezer

1.200,00 1.200,00

Deionizador de água 50L Purificador de água - Mili-Q 850,00 850,00

Destilador de água Purificação de água 1.000,00 1.000,00

Impressora Laser Impressão de documentos 2.000,00 2.000,00

Kit micropipeta volume

variável

Dispensação de líquidos e fluidos em

pequenos volumes

1.800,00 1.800,00

Lupa Observação de caracteres

morfológicos dos fungos

7.000,00 7.000,00

Máquina de gelo 10Kg Incubação de amostras para análise 8.473,60 8.473,00

Liofilizador Liofilização de um maior número de

amostras

34.000,00 34.000,00

Termociclador com

gradiente

Técnicas de PCR 28.000,00 28.000,00

Transiluminador/ gradiente Visualização de amostras de

DNA/RNA

4.000,00 4.000,00

TOTAL 125.223,00

Material bibliográfico R$ 5.000,00

Necessário para aquisição de materila bibliográfico atualizado e aquisição

de normas de sistema de gestão.

(ii) Passagens – TOTAL: R$ 15.000,00

38

As passagens estão previstas para participação dos membros da equipe em eventos

científicos, treinamentos e/ou eventos científicos na área. As passagens internacionais serão

utilizadas para visitas científicas e para vinda dos pesquisadores de Universidades localizadas

fora do país para treinamentos da equipe.

(iii) Diárias – TOTAL: R$ 8.000,00

As diárias são necessárias para a realização de coletas e participação em reuniões, visitas,

cursos e eventos científicos.

(iv) Bolsas – TOTAL: R$ 161.800,00

BDCT-NM1

Numero de bolsas: 2

Duração: 6 meses

Valor mensal: R$ 360,00

Valor total: R$ 4.320,00

Justificativa: Esta bolsa será destinada a aluno de segundo grau, desenvolvendo atividade de

preparo de materiais e meios de culturas na Micoteca URM, para o desenvolvimento do

projeto.

BDCT-NS1

Numero de bolsas: 2

Duração: 6 meses

Valor mensal: R$ 450,00

Valor total: R$ 5.400,00

Justificativa: Esta bolsa será destinada a aluno de graduação, desenvolvendo atividade de

recebimento de pedidos de identificação e incorporação de amostras na Micoteca URM e

atualização do site desta coleção.

BCT 5

Numero de bolsas: 3

Duração: 12 meses

Valor mensal: R$ 2.880,00

Valor total: R$ 103.680,00

Justificativa: Estas bolsas serão destinadas a mestres/doutores com experiência em taxonomia

polifásica e caracterização de fungos quanto a produção de enzimas.

BCT 6

39

Numero de bolsas: 2

Duração: 12 meses

Valor mensal: R$ 2.200,00

Valor total: R$ 52.800,00

Justificativa: Estas bolsas serão destinadas a especialista em taxonomia de fungos com

experiência no desenvolvimento de diversos projetos de pesquisa.

BCT 9

Numero de bolsas: 1

Duração: 3 últimos semestres

Valor mensal: R$ 600,00

Valor total: R$ 14.400,00

Justificativa: Esta bolsa será destinada a aluno de graduação, desenvolvendo atividade de

recebimento de pedidos de identificação e incorporação de amostras na Micoteca URM e

atualização do site e do banco de dados desta coleção.

BCT 10

Numero de bolsas: 4

Duração: 12 meses

Valor mensal: R$500,00

Valor total: R$ 24.000,00

Justificativa: Esta bolsa será destinada a estudantes de graduação para colaborar com as

atividades propostas no projeto, nas áreas de isolamento, identificação, reativação,

preservação e/ou caracterização de fungos quanto a produção de enzimas.

(v) Outros itens de custeio

a) Material de Consumo – TOTAL: R$ 107.225,99

MATERIAL JUSTIFICATIVA QTDE VALOR

UNITÁRIO

(R$)

VALOR

TOTAL

(R$)

ABC

Análise molecular –

reações de

sequenciamento

6 310,85 1.865,10

Acetato de etila (1L) Preparo de soluções 2 10,00 20,00

Acetato de sódio

(500mL)

Preparo de soluções 2 9,10 18,20

Ácido tricloroacético Preparo de soluções 1 98,00 98,00

40

(500g)

Adesivo de placa

Análise molecular –

reações de

sequenciamento

1 771,96 771,96

Ágar bacteriológico

(500g)

Preparo de meios de

cultura

4 274,00 1.096,00

Azul de Coomassie

(25g)

Quantificação de

proteínas

1 38,70 38,70

Balão de fundo chato

(1000mL)

Preparo de meios de

cultura e soluções

3 51,00 153,00

Becker de vidro

(1000mL)

Preparo de reagentes e

soluções

6 20,00 120,00

Becker de vidro

(500mL)

Preparo de meios de

cultura e soluções

2 12,40 24,80

Big dye

Análise molecular –

reações de

sequenciamento

6 2.884,99 17.309,94

Cacodilato de sódio

trihidratado (grau

microscopia eletrônica)

(500g)

Preparo de tampão

para processamento de

amostras pra

microscopia eletrônica

de transmissão

4 925,20 3.700,80

Capilar 50cm

Análise molecular –

reações de

sequenciamento

2 4.465,02 8.930,04

Carbonato de cálcio

(500 g)

Identificação de

leveduras

1 44,00 44,00

CBC

Análise molecular –

reações de

sequenciamento

6 435,79 2.614,74

Cloreto de cálcio

(500g)

Preparo de meios de

cultura

1 44,00 44,00

Cloreto de mercúrio

(100g)

Caracterização

enzimática

1 76,80 76,80

Cloreto de potássio

(500g)

Identificação de

leveduras

1 52,80 52,80

Condicion

Análise molecular –

reações de

sequenciamento

12 77,70 932,40

41

Dextrose (500g) Preparo de meios de

cultura

6 12,00 72,00

dNTP set, 100 mM, 4 x

250 µl

Análise molecular 2 350,00 700,00

Etanol 95% (1000mL) Preparação de

soluções 1 29,48 29,48

Extrato de levedura

(500g)

Preparo de meios de

cultura

4 110,00 440,00

Extrato de malte (500g) Preparo de meios de

cultura

3 210,00 630,00

Ferricianeto de potássio

trihidratado (500g)

Pós-fixação de

amostras pra

microscopia eletrônica

2 117,00 234,00

Formamida HI DI

Análise molecular –

reações de

sequenciamento

10 176,00 1.760,00

Fosfato de sódio

dibásico heptahidratado

(500g)

Preparo de tampão

para processamento de

amostras pra

microscopia eletrônica

2 358,00 716,00

Fosfato de sódio

monobásico (500g)

Preparo de tampão

para processamento de

amostras pra

microscopia eletrônica

2 15,80 31,60

Frasco de Erlenmeyer

(250mL)

Preparo de reagentes e

soluções

20 32,00 640,00

Frascos de Erlenmeyer

(1000mL)

Preparo de reagentes e

soluções

3 40,00 120,00

Frascos de penicilina 5

mL

Liofilização das

amostras de fungos

500 4,00 2.000,00

Galactose (100g) Identificação de

leveduras

1 175,70 175,70

Gelatina em pó (500g) Caracterização

enzimática

1 490,00 490,00

GelRed™ para corar

dsDNA, ssDNA ou

RNA em gel de agarose

ou pós coloração

Análise molecular

1 970,00 970,00

42

Glucosamina (100g) Identificação de

leveduras

1 429,00 429,00

Glutaraldeído grau I (10

amp. De 10mL)

Preparo de tampão pra

processamento de

amostras para

microscopia eletrônica

5 310,00 1.550,00

Kit de capilares Análise molecular 2 8.500,00 17.000,00

Kit de extração de DNA Análise molecular 8 450,00 3.600,00

Kit de marcação de

DNA

Análise molecular 3 2.890,00 8.670,00

Kit de purificação de

produto de PCR (250

reações)

Análise molecular 1 1.500,00 1.500,00

Kit para síntese de

cDNA

Análise molecular 1 950,00 950,00

Kit purificação RNA

total - RNeasy Plant

mini kit (20rxn)

Análise molecular

1 716,43 716,43

L – Arabinose (25g) Identificação de

leveduras

1 176,00 176,00

Lâmina 26x76mm

(caixa com 100 unid.)

Visualização das

estruturas fúngicas ao

microscópio

30 3,00 90,00

Lamínulas 24x32mm Visualização das

estruturas fúngicas ao

microscópio

30 3,00 90,00

Maltose (100g) Identificação de

leveduras

1 86,70 86,70

Marcador molecular

(200 L)

Análise molecular 3 550,00 1.650,00

Material de escritório

(papel A4, envelopes,

pastas, etc.)

Redação e

armazenamento de

informações,

relatórios e

documentos

-

-

1.100,00

Material para

informática (cartuchos,

toners, DVDs, pen

drives, etc.)

Redação,

armazenamento e

impressão de

informações,

relatórios e

-

-

1.000,00

43

documentos

Material plástico

descartável

Análises moleculares

e enzimáticas

- - 5.000,00

Metil-α-D-glicosídeo

(1g)

Identificação de

leveduras

1 570,00 570,00

Peptona bacteriológica

(500g)

Preparação de meios

de cultura

3 270,00 810,00

Placa de microtitulação,

fundo chato, 6 poços

Análise de amostras 40 8,20 328,00

Placa de microtitulação,

fundo chato, 96 poços

Análise de amostras 10 2,66 26,60

Placas de Petri

(80x15mm)

Isolamento, cultivo e

identificação dos

fungos

300 3,50 1.050,00

Placas de Petri

(90x15mm)

Isolamento, cultivo e

identificação dos

fungos

300 4,00 1.200,00

Rafinose (25g) Identificação de

leveduras

1 297,00 297,00

Soro albumina bovina

(100g)

Caracterização

enzimática

1 356,00 356,00

Taq Polymerase Análise molecular 10 200,00 2.000,00

Tetróxido de ósmio

(conjunto com 10

unidades de 1g)

Pós-fixação de

amostras pra

microscopia eletrônica

1 6.000,00 6.000,00

Trealose (10g) Identificação de

leveduras

1 128,00 128,00

Tris-Base

(Hidroxymethyl

aminomethano)

Preparo de reagentes e

soluções

1 153,00 153,00

Tubos de Durham Identificação de

leveduras

200 0,50 100,00

Tubos de ensaio

(16x100mm)

Cultivo, isolamento e

identificação dos

fungos

100 0,40 40,00

Tubos de ensaio

(18x180mm)

Cultivo, isolamento,

preservação e

identificação dos

fungos

600 0,80 480,00

44

UltraPure™ Agarose

100g

Análise molecular 5 492,80 2.464,00

UltraPure™ EDTA

500g

Análise molecular 1 303,60 303,60

UltraPure™ Tris

Hydrochloride 1Kg

Análise molecular 1 303,60 303,60

Xilose (25g) Identificação de

leveduras

2 44,00 88,00

TOTAL 107.225,99

b) Serviços de terceiro pessoas jurídica – TOTAL R$ 30.000,00

- Manutenção de equipamentos R$ 5.000,00

- Manutenção Certificação ISO 9001/2008 e ISO 17025/2005 R$ 16.000,00

- Serviços de marcenaria para confecção de armários para

armazenamento do acervo preservado sob óleo mineral R$ 6.000,00

- Aquisição de cepas padrão R$ 3.000,00

ORÇAMENTO TOTAL

RUBRICAS BOLSISTAS VALOR (R$)

Custeio Consumo 107.225,99

Serviços de terceiro 30.000,00

Passagem 15.000,00

Diária 8.000,00

Capital Equipamentos e

material permanente

125.223,00

Material bibliográfico 5.000,00

Bolsas 190.200,00

TOTAL 480.648,99

45

i) Cronograma de atividades;

Etapas Meses

JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ

Ampliação do acervo

da Micoteca URM

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

# # # # # #

Reativação e

autenticação

taxonômica das

culturas

#

#

#

# # # # # # #

#

X

#

Isolamento e

identificação das

culturas

#

#

#

#

#

#

# # # # # #

Caracterização das

culturas quanto a

produção de

metabólitos de

interesse

biotecnológico

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

#

Caracterização

molecular das culturas

*

*

#

*

#

#

#

#

#

#

# # #

Seqüenciamento da

região ITS do r DNA

do gen calmodulina e b

tubulinina

* * * * * * * * * # # #

Identificação de

culturas pela técnica do

MALDI TOF MS

*

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

# #

Melhoria da qualidade

dos serviços

* * * * #

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

#

Participação em

cursos e treinamentos

#

*

#

*

Fornecimento de

amostras liofilizadas

* * * * * #

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

Implantação do setor

de extração e

amplificação de DNA

* * *

Fornecimento de

material biológico

com qualidade

* * * * * *

Formação de alunos e

profissionais

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

#

*

# # # # X

#

X

#

Avaliação do comitê

gestor

#

*

Manutenção do

Sistema de Gestão

Laboratorial

#

* #

*

Entrega de Relatório

final

*

X= 2012; # = 2013; * = 2014

46

k) Indicação de colaborações ou parcerias interinstitucionais já estabelecidas para o

desenvolvimento do projeto, relevantes para sua exeqüibilidade;

A Coordenadora desta proposta participou e participa como coordenadora e como

membro da equipe de projetos em parceria com diversas instituições nacionais e

internacionais.

Para o presente projeto, foram estabelecidas parcerias com instituições nacionais e

duas internacionais: Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (CETENE); Unidade

Acadêmica de Garanhuns (UAG/UFRPE); Unidade Acadêmica de Serra Talhada

(UAST/UFRPE); o Laboratório de Tecnologia de Bioativos-LABTECBIO/UFRPE; a

Micoteca MUM, da Universidade do Minho em Braga-Portugal e o Cereal Research Centre,

Agriculture and Agrifood Canada, Winnipeg/Canada.

l) Disponibilidade efetiva de infra-estrutura e de apoio técnico para o desenvolvimento

do projeto;

Estão envolvidos com o desenvolvimento do projeto, pesquisadores, colaboradores,

técnicos e alunos de graduação e pós-graduação.

As instituições participantes (UFPE, UFRPE, CETENE e Universidade do Minho em

Braga-Portugal, e o Cereal Research Centre, Agriculture and Agrifood Canada,

Winnipeg/Canada), se comprometem em disponibilizar todos os equipamentos e em dar apoio

de pessoal técnico qualificado, necessários para a realização do projeto. A Universidade do

Minho disponibilizará pesquisadores especializados para a autenticação taxonômica das

culturas por técnicas clássicas, moleculares e pelo MALDI TOF MS.

Na UFPE, a Coleção de Culturas-Micoteca URM da UFPE ocupa um total de 104,73

m2, contendo 7 salas: uma sala para equipamentos, uma onde ficam os armários contendo o

acervo mantido em óleo mineral e água destilada esterilizada, uma dos pesquisadores, uma de

apoio para vidrarias, uma para microscopia, uma de manipulação das culturas e uma sala de

computadores. A Micoteca conta com os seguintes equipamentos: 1 Liofilizador (Edwards), 3

capelas de segurança biológica-Nível 2, 7 refrigeradores, 2 freezer, 1 ultrafreezer a -80C, 3

BODs, 1 autoclave de bancada, 1 destilador, 1 banho maria, 1 câmara de visualização ultra

violeta, 1 microondas, 1 estufa de incubação, 1 estufa de esterilização e secagem, 2

potenciômetros, 1 espectrofotômetro, 2 rotaevaporadores, 1 centrifuga refrigerada, 1

incubadora com agitação orbital e controle de temperatura, 2 balanças semi analíticas, 2

balanças analíticas, 6 microscópios ópticos de luz, 1 câmera digital para microfotografias, 1

estereomicroscópio e 6 computadores. A plataforma multiusuária de Genômica e Expressão

47

Gênica do Centro de Ciências Biológicas da UFPE, provê serviços tecnológicos para todos os

laboratórios de pesquisa da UFPE e poderá atender às necessidades da Micoteca URM. Para

isso, será utilizado o sequenciador de DNA Gene analyser 3500 da Applied Biosystems, com

oito capilares. Para a preparação de amostras em larga escala, a plataforma conta com um

sistema de automação de preparação de amostras modelo QAgilit da empresa Quiagen que é

capaz de processar mais de 500 amostras de reação de marcação de DNA para

sequenciamento por dia. Esta plataforma conta ainda com um corpo de técnicos de nível

superior responsáveis pelo recebimento e processamento das amostras e envio dos resultados

de sequenciamento.

As observações e registros das características microscópicas das culturas serão realizados

no CETENE, no Laboratório Multiusuário de Microscopia (LAMM) Eletrônica quee

Microanálise constitui um centro de facilidades instrumentais com capacidade de realizar desde

análises de rotina como a de amostras biológicas de diversas origens. Em relação aos

equipamentos disponíveis no LAMM, relacionamos entre os principais: o Microscópio eletrônico

de transmissão FEI Tecnai G200KV, equipado com câmara CCD, analisador EDX e STEM, e

módulo de tomografia digital para obtenção de imagens tridimensionais de alta resolução; o

microscópio eletrônico de transmissão FEI Morgagni 268D com câmara CCD, configurado e

otimizado para análises em amostras de materiais biológicos; o microscópio eletrônico Field

Emission Ambiental FEI Quanta 200 FEG, que permite a aquisição de imagens com resolução de

até 1.2 nm. Equipado com CCD e analisador EDX. O equipamento inclui também o módulo de

STEM que permite realização de imagens em microscopia eletrônica de transmissão e módulo de

aquecimento até 1000oC; sputtering "Super Cool de Alto Vácuo", para evaporação de camadas

condutoras em amostras TEM/SEM (Cr,W,Au/Pd,Pt) para recobrimentos FE-SEM; bomba de

membrana e turbo molecular montadas dentro do gabinete para garantir um vácuo isento de óleo.

MODELO: SCD 500; o aparelho de Ponto Crítico, Baltec, que realiza a secagem de amostras

pelo método de ponto crítico, sem alteração da tensão superficial das mesmas, o que permite a

manutenção da topografia de superfície das estruturas dos fungos.

A técnica do MALDI TOF MS para autenticação taxonômica das culturas e análise de

extrólitos será realizada no CETENE, na Universidade do Minho, Braga, Portugal e no Cereal

Research Centre/Agriculture and Agrifood Canada, Winnipeg/Canada.

Nas instalações da Unidade Acadêmica de Garanhuns-UAG e no Laboratório de

Tecnologia de Bioativos-LABTECBIO da UFRPE serão realizadas a produção e purificação

de enzimas, disponibilizando os materiais e equipamentos necessários. No LABTECBIO,

serão realizadas as etapas de caracterização das enzimas e apresenta os principais

48

equipamentos, temos: Leitora de microplacas, Câmara de Fluxo laminar, Centrifuga de

bancada refrigerada, Shaker com temperatura controlada, Sistema completo para eletroforese

horizontal, Sistema completo para eletroforese vertical, Espectrofotômetro UV/Vis, Banhos

termostatizados, Sistema de Água Ultrapura, Câmara Clímática e Liofilizador. Estas unidades

ainda contarão com infra-estrutura da Central Analítica (CENLAG), local específico para

trabalhos voltados para a pesquisa na área de caracterização, determinação de melhores

condições de produção e purificação de enzimas.

Nas instalações da Unidade Acadêmica de Serra Talhada da UFRPE serão realizados o

isolamento de fungos do solo da caatinga e a identificação dos que pertencerem aos

Zygomycota, os demais serão identificados pela equipe da Micoteca URM. Com o

desenvolvimento deste projeto, pretende-se implementar um laboratório de micologia, pois

recentemente foram contratados dois professores Doutores em Biologia de Fungos pela

UFPE, porém a infra-estrutura atual precisa ser melhorada para que estes pesquisadores

desenvolver suas pesquisas. A infraestrutura atual conta com 1 balança analítica, balança

semi-analítica, espectrofotômetro, centrífuga para Eppendorf, destilador, estufa e mufla.

m) Estimativa dos recursos financeiros de outras fontes que serão aportados pelos

eventuais Agentes Públicos e Privados parceiros.

Parte do projeto utilizará os recursos financeiros procedentes da PROPESQ/UFPE,

obtido como apoio institucional para o desenvolvimento das atividades da Micoteca URM.

Outra fonte financeira será procedente do projeto abaixo:

- Projeto: COLEÇÕES DE CULTURAS DE MICRORGANISMOS MICOTECA URM E

UFPEDA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO,

Referência nº 2083/2007

Agência Financiadora: Convênio FINEP 01.08.0392.00

Edital TIB 10 – Centro de Recursos Biológicos, período 2008 - 2013.

Valor: R$ 571.879,00

Coordenadora: Profa. Cristina Maria de Souza Motta (UFPE).

- Projeto: AMPLIAÇÃO DO CONHECIMENTO SOBRE AS PLANTAS E FUNGOS DO

BRASIL

Edital CNPq nº 47/2010 - Chamada 2 - Pesquisa em Redes Temáticas para ampliação

do conhecimento sobre a biota, o papel funcional, uso e conservação da Biodiversidade

Brasileira.

49

Processo número 563342/2010-2.

Situação: Em andamento Natureza: Projetos de pesquisa

Coordenadora: Leonor Costa Maia (UFPE)

- Projeto: BIODIVERSIDADE E REGENERAÇÃO NATURAL EM FLORESTAS

TROPICAIS SECAS BRASILEIRAS

Edital CNPq nº 47/2010 - Chamada 2 - Pesquisa em Redes Temáticas para ampliação

do conhecimento sobre a biota, o papel funcional, uso e conservação da Biodiversidade

Brasileira.

Processo número 563342/2010-2.

Situação: Em andamento Natureza: Projetos de pesquisa

Coordenador: Mário Marcos do Espírito Santo (UFMG)

- Projeto: PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DA QUERATINASE DE ASPERGILLUS

SULPHUREUS URM 5029 EM FORMULAÇÕES DE DETERGENTES DE

LAVANDERIA E NA DEPILAÇÃO DO COURO

Situação: Em andamento Natureza: Auxílio financeiro e bolsa PNPD

Período: 2012-2015

Agências: CAPES e FACEPE

Coordenador: Cristina Maria de Souza Motta (UFPE)

- Recurso Próprio: UFPE/PROPESQ e Prestação de Serviços da Micoteca URM.

n) Relatório de atividades e dos resultados alcançados com o apoio recebido em termos

de disponibilização de acesso ao acervo/laboratório/serviço apoiado a pesquisadores de

outros grupos/instituições.

O projeto “Ampliação e caracterização do acervo da Micoteca URM visando a

disponibilização de culturas como fonte de recursos biotecnológicos para o estado de

Pernambuco”, está apoiado no âmbito do Edital 07/2010 “Multiusuários” FACEPE, Processo

Nº APQ-0290-2.12/10, coordenado pela Profa. Cristina Maria de Souza Motta (Depto. de

Micologia/UFPE). Estão relacionadas abaixo as metas e os resultados obtidos em cada uma

50

delas. A metodologia utilizada para o alcance das metas está descrita no projeto do Edital

07/2010.

Alcance das Metas Propostas no Projeto

Acervo da Micoteca URM ampliado em 10% do total de acesso atual até a conclusão do

projeto; e

Reativar e autenticar taxonomicamente cerca de 200 culturas de fungos de dezembro de

2010 a dezembro de 2011;

O alcance destas duas metas estão mostrados na Tabela 1. Pode ser verificado que o

número de serviços prestados pela URM vem aumentando. Os anos 2008, 2009 e 2010, fazem

parte da tabela apenas para comparação em relação aos anos seguintes que já havia o apoio

financeiro da FACEPE, no âmbito do Edital 07/2010 “Multiusuários”. Estas solicitações são

procedentes de alunos, professores e pesquisadores de instituições de ensino e/ou pesquisa,

públicas e privadas e de laboratórios e indústrias do setor privado no país. Em 2001, o número

de solicitações quase dobrou em relação ao ano anterior. O número de amostras fornecidas

corresponde também ao número de amostras reativadas e autenticadas taxonomicamente.

Tabela 1: Número de amostras de fungos identificadas, fornecidas e incorporadas através dos

serviços da Micoteca URM (2008 até agosto de 2012)

ANO IDENTIFICAÇÃO FORNECIMENTO INCORPORAÇÃO

2008 60 218 132

2009 175 326 242

2010 513 480 149

2011* 529 820 211

2012*# 470 200 185

* Período apoiado também pela FACEPE através do Projeto Multiusuário APQ-0290-

2.12/10; # Até agosto de 2012.

Isolar e identificar por taxonomia clássica, cerca de 1000 culturas de fungos a partir de

janeiro 2011 até dezembro de 2011;

Foram isoladas e identificadas, 1.967 amostras de fungos procedentes de solo, de plantas

(endofíticos) (Tabela 2).

51

Tabela 2. Número e procedência das culturas isoladas e identificadas por taxonomia

clássica a partir de janeiro 2011 até dezembro de 2011

Caracterização molecular de aproximandamente 50 amostras de Aspergillus e Penicillium

de março de 2011 a março de 2012;

Foram realidadas amplificações da região ITS do rDNA, dos genes ß tubulina e

calmodulina de 52 culturas de Penicillium e 40 de Aspergillus, 12 de outros gêneros. As

amostras de DNA das culturas de fungos foram amplificadas no Laboratório de Biologia

Molecular do Departamento de Micologia da UFPE e sequenciadas no Centro de Estudos do

Genoma Humano da USP-SP. Com os resultados obtidos, amostras do acervo da URM foram

autenticadas taxonomicamente, algumas confirmadas e outras reclassificadas. Os dados estão

sendo incorporados ao banco de dados da Micoteca URM.

Identificar cerca de 100 culturas de fungos utilizando também a técnica do MALDI TOF

MS de março de 2011 a outubro de 2012;

Até o momento, foram caracterizados por MALDI-TOF ICMS no CETENE, 50 isolados

de Penicillium e 40 de Aspergillus, procedentes da Micoteca URM.

Disponibilização de cerca de 100 culturas caracterizadas por diversas técnicas

taxonômicas e quanto a produção de enzimas na conclusão do projeto;

Como verificado na Tabela 1, mais de 100 culturas foram identificadas e na Tabela 3,

observa-se que 232 culturas foram caracterizadas quanto a produção de enzimas.

Procedência dos isolados Nº de

isolados

Zygomycetes Solo 99

Penicillium Solo 802

Fungos endofíticos

Acerola 437

Aroeira 308

Cavalinha 235

Cactaceae (palma forrageira) 86

TOTAL 1.967

52

Tabela 3. Número de isolados caracterizados quanto à produção de enzimas.

Enzimas Fungos Número de isolados

Lipase

Trichosporon 39

Geotrichum 15

Aspergillus 18

Fitase Mucor, Rhizomucor e Absidia 13

Celulase Aspergillus 36

Tanase Penicillium 50

Queratinase Aspergillus 11

Pectinase Aspergillus 25

Protease Aspergillus, Penicillium, Mucor e

Rhizomucor

25

Total 232

Implantação do Sistema de Gestão Laboratorial ao final do projeto;

No projeto inicial, a proposta foi implementar ações com base na Norma ISO 17025, para

isso é necessário a conclusão da reforma da infraestrutura da Micoteca URM, já apoiada pela

instituição, porém não concluída. Então para iniciarmos a implantação de um Sistema de

Gestão, foi solicitado à FACEPE e atendido, a implantação da ISO 9001/2008. A

implantação da ISO 17025, será apoiada pelo Convênio FINEP: 01.08.0392.00, coordenado

pela Profa Cristina Maria de Souza Motta, curadora da Micoteca URM.

Em abril de 2012 foi iniciada a consultoria por empresa especializada para obtenção

certificação, com base na norma ISO 9001/2008. Atividades já alcançadas: diagnóstico,

definição da estrutura do Sistema de Gestão (SG), elaboração de planos de ação, mapeamento

dos processos, descrição do escopo, elaboração do Manual do SG, elaboração de POPs,

treinamento da equipe, elaboração da documentação referente ao controle de documentos e de

registros e definição da política do SG. A previsão para obtenção da certificação é dezembro

de 2012.

Formação de cerca de 20 alunos e profissionais nas áreas de taxonomia de fungos e

biotecnologia ao longo do projeto;

Em outubro de 2011, foi ministrado o curso “Identificação Polifásica de Fungos

Filamentosos dos Gêneros Aspergillus e Penicillium com Aplicação Biotecnológica”, no

53

Hotel Holyday Inn, São Paulo-SP. A organização foi da Micoteca da Universidade do Minho,

Portugal e da Micoteca URM, UFPE, Brasil. Foram membros da comissão organizadora:

Nelson Lima, Cledir Santos, Marta Simões, MUM, Portugal, Cristina Motta, URM, UFPE,

Brasil, Lara Sette, UNESP, Brasil. Vinte e oito inscritos foram obtidos, sendo 27 do Brasil,

(FIOCRUZ, Rio de Janeiro e Manaus), UFPE, HC-UFES, UFRRJ, USP, UNIFESP, INT,

UFMT, UFMG, UFRB, Embrapa Agroenergia, UERJ, UECE e uma da Venezuela (do

INHRR). Participaram também como palestrantes: Zofia Kozakiewicz (UK), Jens Frisvad

(Dinamarca), Marta Taniwaki (ITAL, Brasil).

Por outro lado, alunos de graduação (12) e pós-graduação nos níveis mestrado (8) e

doutorado (6) desenvolveram suas monografias, dissertações e teses orientados pela equipe do

projeto.

Publicação de cerca de 100 resumos em eventos e 10 artigos em revistas nacionais e

internacionais;

Foram apresentados 108 trabalhos em eventos nacionais e internacionais (Tabela 4).

Tabela 4: Trabalhos apresentados pela equipe do projeto, em eventos nacionais e

internacionais no período de 2010 a 2012.

Eventos Nº de trabalhos

XVIII Simpósio Nacional de Bioprocessos, Caxias do Sul/RS, 2011 03

44° Congresso Brasileiro de Fitopatologia, Bento Gonçalves, 2011 02

2o Congresso Brasileiro de Palma e outras Cactáceas, Garanhuns, 2011 02

X Congresso de Ecologia do Brasil, São Lourenço-MG, 2011 01

II Simpósio de Biossegurança, Recife-PE, 2011 01

26° Congresso Brasileiro de Microbiologia, Foz do Iguaçu-PR, 2011 22

30th Annual Meeting of the European Culture Collections'

Organization, 2011, Utrecht - Holanda

01

Congresso Nacional MicroBiotec11, Braga, Portugal, 2011 01

XI Jornada de Ensino, Pesquisa e Extensão da UFRPE, Recife, 2011 04

XIX Congresso de Iniciação Científica da UFPE, 2011 06

I Congresso Nacional de Ciências Biológicas, Recife-PE, 2011 08

31th Annual Meeting of the European Culture Collections'

Organizations (ECCO), Braga, Portugal, 2012

10

20 Encontro Pernambucano de Micologia (EPEM), Recife-PE, 2012.

(aceitos para apresentação)

8

XXI Congresso Latinoamericano de Microbiologia, Santos-SP 2012.

(aceitos para apresentação)

32

TOTAL 108

Prêmios recebidos:

Título do trabalho: Polyphasic identification of Aspergillus section Nigri preserved

under mineral oil at URM Culture Collection. (Primeiro lugar)

54

Título do trabalho: Three new aflatoxigenic species of Aspergillus section Flavi

isolated in Portugal. (Terceiro lugar)

Tipo de participação: Pôster.

Evento: European Culture Collections' Organizations 30 Meeting (ECCO) CBS, Utrecht,

the Netherlands, 2011.

Título do trabalho: Seleção preliminar de fungos endofíticos de palma forrageira

(Cactaceae) quanto a produção de enzimas extracelulares.

Tipo de participação: Pôster.

Evento: I Congresso Nacional de Ciências Biológicas, Universidade Católica de

Pernambuco, Recife-PE. 2011.

Trabalhos publicados em periódicos

1. GOMES, B. S., SIQUEIRA, A.B.S., Maia, R.C.C., GIAMPAOLI, V., TEIXEIRA, E. H.,

ARRUDA, F.V.S., NASCIMENTO, K.S., LIMA, A. N., SOUZA-MOTTA, C. M.,

CAVADA, B.S., PORTO, Ana Lúcia Figueiredo. Antifungal activity of lectins against

yeast of vaginal secretion. Brazilian Journal of Microbiology (Impresso). , v.1, p.770 - 778,

2012.

2. COSTA, P. M. O., SOUZA-MOTTA, C. M., MALOSSO, E. Diversity of filamentous

fungi in different systems of land use. Agroforestry Systems (Print). , v.85, p.195 - 203,

2012.

3. Neves, Maria Luiza Carvalho, Porto, Tatiana Souza, Souza-Motta, Cristina Maria, Spier,

Michele Rigon, Soccol, Carlos Ricardo, Moreira, Keila Aparecida, Porto, Ana Lúcia

Figueiredo. Partition and recovery of phytase from Absidia blakesleeana URM5604 using

PEG-citrate aqueous two-phase systems. Fluid Phase Equilibria. , v.318, p.34 - 39, 2012.

4. HERCULANO, P. N., PORTO, T. S., MACIEL, M. H. C., MOREIRA, K. A., SOUZA-

MOTTA, C. M., PORTO, Ana Lúcia Figueiredo. Partitioning and Purification of the

Cellulolytic Complex Produced by Aspergillus japonicus URM5620 Using PEG-Citrate

in an Aqueous Two-Phase System. Fluid Phase Equilibria. , v.335, p.8 - 13, 2012.

5. BEZERRA, J. D. P., Santos, M. G. S., Svedese, V. M., LIMA, D. M. M., FERNANDES,

M. J. S., PAIVA, L. M., SOUZA-MOTTA, C. M. Richness of endophytic fungi isolated

55

from Opuntia ficus-indica Mill. (Cactaceae) and preliminary screening for enzyme

production. World Journal of Microbiology & Biotechnology. , v.28, p.1 - 7, 2012.

6. Herculano, Polyanna Nunes, Porto, Tatiana Souza, Moreira, Keila Aparecida, Pinto,

Gustavo A. S., Souza-Motta, Cristina Maria, Porto, Ana Lúcia F. Cellulase Production by

Aspergillus japonicus URM5620 Using Waste from Castor Bean (Ricinus communis L.)

Under Solid-State Fermentation. Applied Biochemistry and Biotechnology. , p.1057 - 1067,

2011.

7. CAMBUIM, I. I. F. N., MACEDO, D. P. C., DELGADO, M., LIMA, K. M., SANTOS, G.,

MENDES, G. P., SOUZA-MOTTA, C. M., LIMA, D. M. M., FERNANDES, M. J. S.,

MAGALHÃES, O. M. C., QUEIROZ, L. A., NEVES, R. P. Clinical and mycological

evaluation of onychomycosis among Brazilian HIV/AIDS patients. Revista da Sociedade

Brasileira de Medicina Tropical (Impresso). , v.44, p.40 - 42, 2011.

8. SILVA, L., SOUZA, O., FERNANDES, M. J. S., LIMA, D. M. M., COELHO, R. R. R.,

Souza-Motta, Cristina. Culturable fungal diversity of shrimp Litopenaeus vannamei

Boone from breeding farms in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology (Impresso). , v.42,

p.49 - 56, 2011.

9. Vieira, Paula Danielle de Souza, SOUZA-MOTTA, C. M., Lima, Debora, Torres, Jorge

Braz, Quecine, Maria Carolina, Azevedo, Joao Lucio, Oliveira, Neiva Tinti de. Endophytic

fungi associated with transgenic and non-transgenic cotton. Mycology. , v.2, p.91 - 97,

2011.

10. Siqueira, Virginia Medeiros, Conti, Raphael, Araújo, Janete Magali, Souza-Motta,

Cristina Maria. Endophytic fungi from the medicinal plant Lippia sidoides Cham. and

their antimicrobial activity. Symbiosis (Philadelphia, Pa.). , v.53, p.89 - 95, 2011.

11. SILVA, D. C. V., Tiago, P.V., MATTOS, J. L. S., PAIVA, L. M., SOUZA-MOTTA, C.

M. Isolamento e seleção de fungos filamentosos do solo de sistemas agroflorestais do

Município de Bom Jardim (PE) com base na capacidade de produção de enzimas

hidrolíticas. Revista Brasileira de Botânica (Impresso). , v.34, p.607 - 610, 2011.

12. Herculano, Polyanna N., LIMA, D. M. M., FERNANDES, M. J. S., NEVES, R. P.,

SOUZA-MOTTA, C. M., PORTO, A. L. F. Isolation of Cellulolytic Fungi from Waste of

Castor (Ricinus communis L.). Current Microbiology (Print). , v.62, p.1416 - 1422, 2011.

13. Neves, Maria Luiza Carvalho, Silva, Milena Fernandes da, Souza-Motta, Cristina Maria,

Spier, Michele Rigon, Soccol, Carlos Ricardo, Porto, Tatiana Souza, Moreira, Keila

Aparecida, Porto, Ana Lúcia Figueiredo. Lichtheimia blakesleeana as a New Potencial

Producer of Phytase and Xylanase. Molecules (Basel. Online). , v.16, p.4807 - 4817, 2011.

56

14. GOMES, B. S., Souza-Motta, Cristina M., LIMA, A. N., Porto, Ana Lúcia Figueiredo.

Pathogenic characteristics of yeasts isolated from vaginal secretion preserved under

mineral oil. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases

(Online). , v.17, p.460 - 466, 2011.

15. MACIEL, M. H. C., HERCULANO, P. N., PORTO, T. S., TEIXEIRA, M. F. S., Moreira,

Keila Aparecida, Souza-Motta, Cristina. Production and partial characterization of

pectinases from forage palm by Aspergillus niger URM4645. African Journal of

Biotechnology. , v.13, p.2469 - 2475, 2011.

16. LEAL, A. F. G., MACEDO, D. P. C., Souza-Motta, Cristina, FERNANDES, M. J. S.,

MAGALHÃES, O. M. C., NEVES, R. P. Ocorrência de fungos filamentosos de

importância médica em água de bebedouro. Revista do Instituto Adolfo Lutz (Impresso). ,

v.69, p.580 - 583, 2010.

17. Araújo Viana, Daniela, Albuquerque Lima, Carolina, Neves, Rejane Pereira, Mota,

Cristina Souza, Moreira, Keila Aparecida, Lima-Filho, José Luiz, Cavalcanti, Maria Taciana

Holanda, Converti, Attilio, SOUZA-MOTTA, C. M. Porto, Ana Lúcia Figueiredo.

Production and Stability of Protease from Candida buinensis. Applied Biochemistry and

Biotechnology. , p.13, 2010.

Artigos aceitos para publicação

1. SILVA, L. R. C., SANTOS, C. R., LIMA, J. S., FERNANDES, M. J. S., Moreira, Keila

Aparecida, Souza-Motta, Cristina Maria. Diversity of PENICILLIUM in soil of Caatinga

and Atlantic Forest areas of Pernambuco, Brazil: an ecological approach. Nova

Hedwigia. , 2012.

2. SILVA, A. C., QUEIROZ, A. E. S. F., PORTO, T. S., SPIER, M. R., SOCCOL, C. R.,

PORTO, A. L. F., SOUZA-MOTTA, C. M., MOREIRA, K. A. Partial Characterisation of

an Inulinase Produced by Aspergillus japonicus URM5633. Brazilian Archives of Biology

and Technology (Impresso). , p.671 - 676, 2012.

3. BEZERRA, J. D. P., LOPES, D. H. G., SANTOS, M. G. S., Svedese, V.M., PAIVA, L. M.,

CORTEZ, J. S. A., SOUZA-MOTTA, C. M. Riqueza de micro-organismos endofíticos em

espécies da família Cactaceae. Boletín de la Sociedad Latinoamericana y del Caribe de

Cactáceas y otras Suculentas. , 2012.

Capítulos de livros publicados

1. SOUZA-MOTTA, C. M.

57

Micoteca URM In: Estudos Universitários.22 ed.Recife : Universidade Universitária, 2011,

v.27, p. 167-169.

Outras atividades:

Atualização do Site e do banco de dados da Micoteca URM – todas as informações

associadas às culturas do acervo estão sendo incorporadas ao banco de dados desta

coleção.

Pesquisadores e respectivas instituições públicas e privadas que utilizaram os serviços da

Micoteca URM nos anos de 2010 a 2012 (até agosto).

Pesquisador/Professor Instituição Sigla

Alan Villela Pomella Laboratório de Biocontrole Farroupilha

LTDA

LBF

Albino Citon Laboratório de Análises e Pesquisas

Clínicas Carbélia-PR

LAPCC

Adriana Todarop’ Universidade Federal de Alagoas UFAL

Adriana Ferreira de Souza Centro de Tecnologias Estratégicas de

Pernambuco

CETENE

Alexandre Libanio Silva Reis Centro de Tecnologias Estratégicas de

Pernambuco

CETENE

Ana Beatriz Sotero Siqueira Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Ana Cristina Regis de Barros

Correia

Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Ana Lucia Figueiredo Porto Universidade Federal Rural de

Pernambuco

UFPE

Ana Maria C. T de Arruda Lamen – Garanhuns/PE LAMEN

Ana Maria Souto Maior Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Ana Paula Portela Laboratório de Controle Biológico –

Maceió/AL

BIOTECH

Ana Thereza dos Santos Universidade Federal de Pernambuco UFPE

André Luiz C.M. de A.

Santiago

Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Armando Marsden Lacerda

Filho

Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Bruno Sampaio Laboratório de Imunopatologia Keizo

Asami

LIKA

Bruno Severo Gomes Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Carlos Eduardo de Araújo

Batista

Escola Superior de Agricultura Luiz de

Queiroz - SP

ESALQ

Carlos Henrique Pessoa de

Menezes e Silva

Centro de Tecnologia de Análises LTDA.

Vitória-ES

CTA

Carolina da Silva Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Cibele Callou Hospital das Clínicas- UFPE HC-UFPE

Cynthia de Oliveira

Nascimento

Hospital Veterinário da UFRPE HV-UFRPE

Cynthia Maria Carneiro Costa Universidade Federal Rural de UFRPE-UAST

58

Pernambuco

Cristina Maria de Souza Motta Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Daiane Felberg Antunes

Galvão

Universidade de Pernambuco UAG-UPE

Delson Laranjeira Universidade Federal Rural de

Pernambuco

UFRPE

Diogo Luan de Oliveira Unichapecó UNICHAPECÓ

Dulce Helena Ferreira de

Souza

Universidade Federal de São Paulo UNIFESP

Dráuzio Eduardo Naretto

Rangel

Universidade do Vale do Paraíba UNIVAP

Edeltrudes de Oliveira Lima Universidade Federal da Paraíba UFPB

Eduardo da Silva Martins Universidade Estadual de Minas Gerais –

Frutal

UEMG

Edmilson Nascimento BioRJ Produtos Biológicos e Científicos

LTDA

BioRJ

Elza Áurea de Luna Alves

Lima

Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Elvira Maria Bezerra de

Alencar

Universidade de Pernambuco UPE

Fabiane Cardoso Laboratório Químico e Farmacêutico

Nikkho do Brasil LTDA

Nikkho do

Brasil

Fernanda Lopes Motta Universidade Estadual de Campinas UNICAMP

Fernando Braleim Universidade Federal do Espírito Santo UFES

Flávia Cristina dos Santos

Lima

Universidade Federal de Campina Grande UFCG

Frederico Costa Faculdade Pernambucana de Saúde FPS-IMIP

Galba Campos Takaki Universidade Católica de Pernambuco UNICAP

Genilda Mendes Universidade de Pernambuco UPE

Geogges Gomes Oliveira Instituto de Medicina Integral de

Pernambuco

IMIP

Gianne Rizzoto Araújo Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Grazielle Santos Silva Escola de Engenharia de Lorena USP

Hamilton Cabral Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Ribeirão Preto

USP

Henrique Maia Valério Universidade Estadual de Montes Claros UNIMONTES

Idalina Inês Fonseca Nogueira

Cambuim

Hospital Otávio de Freitas HOF

Isabel Cristina Biotech- Maceió -AL BIOTEC-AL

Helio Fernandes de Melo Universidade Federal Rural de

Pernambuco. Campus Serra Talhada

UFRPE-UAST

Janete Magali de Araújo Universidade Federal de Pernambuco UFPE

José Ivanildo de Souza Instituto de Botânica de São Paulo IBOT-SP

João Lúcio de Azevedo Escola Superior de Agricultura "Luiz de

Queiroz"

ESALQ-USP

Joelleton Oliveira Universidade Estadual do Mato Grosso do

Sul

UEMS

Julia Campos Centro de Tecnologias Estratégicas de CETENE

59

Pernambuco

Juliana Tomazzoni Bold Universidade Federal do Pampa UFP-RS

Kátia Aquino Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Keila Aparecida Moreira Unidade Acadêmica de Garanhuns UFRPE

Kelly Lana Araújo Universidade Estadual de Mato Grosso UEMT

Kelly Samara de Lira Mota Universidade Federal da Paraíba UFPB

Larissa Isabela Oliveira de

Souza

Universidade Federal de Alagoas UFAL

Laura Mesquita Paiva Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Leonildo Bento Galiza da

Silva

Universidade Federal Rural de

Pernambuco

UFRPE

Leonice Asfora Sorubbo Universidade Católica de Pernambuco UNICAP

Lilian M. M. Fiuza Laboratório Química Farmaceutica Nikko

do Brasil LTDA – Rio de Janeiro/RJ

NIKKO

Luciana Cristina Lins de

Aquino

Universidade Federal de Sergipe UFSE

Luiz Henrique Souza

Guimarães

Universidade de São Paulo USP

Luiza Ribas Casseb UNAERP/SP UNAERP/SP

Luiz Roberto D. de Abreu Universidade Federal do Rio Grande do

Norte

UFRN

Madson Ralide Universidade Estadual de Montes Claros UNIMONTES

Marcelo Fraga Universidade Federal Rural do Rio de

Janeiro

UFRRJ

Marcela Motta Drechsee EMBRAPA EMBRAPA

Maria Anilda dos Santos

Araújo

FEJAL / CESMAC - AL CESMAC

Marina Kimico Kadawaki Universidade Estadual do Oeste do

Paraná

UNIOESTE

Maria de Lourdes Polizelli Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras

de Ribeirão Preto - SP

FFCLRP

Maria Francisca Simas

Teixeira

Coleção do Departamento de

Parasitologia da Universidade Federal do

Amazonas - DPUA

UFAM

Marialba A. A. de Castro Universidade Estadual de Maringá-PN UEM

Marilene da Silva Cavalcanti Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Maurício Batista Filho Instituto de Botânica de São Paulo IBSP

Nadia S. Parachin Universidade de Brasília UNB

Nadja Elizabeth P. Lopes Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Neiva Tinti de Oliveira Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Nelson Correia Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Norma Buarque de Gusmão Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Oliane Maria Correia

Magalhães

Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Patrícia Maria Guedes Paiva Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Polyana Nunes Herculano Universidade Federal Rural de

Pernambuco

UFRPE

Raiza Guerra Lima de

Medeiros

Universidade Federal do Rio Grande do

Norte

UFRN

60

Rejane Pereira Neves Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Renata Pereira Limberger Universidade Federal Rural do Rio

Grande do Sul

UFRRS

Rita de Cassia Mendonça de

Miranda

LAF-NUCT Campus São Cristovão UFS

Robert Weingart Barreto Universidade Federal de Viçosa UFV

Romero Moura Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Ronnison Alves Marques Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Rosimary Leão Associação Caruaruense de Ensino

Superior

ASCES

Sabrina Garcia Bioetto Universidade de São Paulo USP

Sergio Barbosa da Silva Universidade de Pernambuco UPE

Simone Quinelato Bezerra Universidade Federal Rural do Rio de

Janeiro

UFRRJ

Silvia Mariana Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Suraia Said Universidade de São Paulo USP

Taciana de Amorim Silva Universidade Federal do Amazonas UFAM

Tânia Montenegro Stamford Universidade Federal de Pernambuco UFPE

Thais Rossini de Oliveira Universidade de Campinas UNICAMP

Thiago Cavalcante da Silva Claeff Engenharia e Produtos Químicos

LTDA. Camaragibe-PE

CLAEFF

Uiara Pomina Universidade Estadual de Montes Claros UNIMONTES

Wagner Bettiol Embrapa – Jaguariúna - SP EMBRAPA

Zilmeire Alves Marques Universidade Federal Rural de

Pernambuco

UFRPE

Zoilo Pires de Camargo Universidade Federal de São Paulo UNIFESP

A Micoteca URM disponibiliza também culturas para o desenvolvimento projetos de

pesquisa, de iniciação científica, monografias de conclusão de curso de graduação e

especialização, dissertações e teses, gerando diversas publicações em periódicos nacionais e

internacionais, contribuindo com a formação de recursos humanos especializados.

61

Referências Bibliográficas

AGUILAR, C.N.; AUGUR, C.; FAVELA-TORRES, E.; VINIEGRA-GONZÁLEZ, G. 2001.

Induction and repression patterns of fangal tannase in solid-state and submerged cultures.

Process Biochemistry, 36, 565-570.

AGUILAR, C.N.; AUGUR, C.; FAVELA-TORRES, E.; VINIEGRA-GONZÁLEZ, G. 2001.

Production of tannase by Aspergillus niger Aa-20 in influence of glucose and tannic acid.

Journal of industrial Microbiolgy and Biotecnology, 20, 612-614.

ALBERTON, L. R.Produção de xilanase em resíduos agroindustriais por

Streptomycesviridosporus T7A e aplicação do extrato bruto em veterinária. (Tese) Doutorado

em Processos Biotecnológicos, Universidade Federal do Paraná, 2004.

ALEXOPOULOS, C.J., MIMS, C. W., BLACKWELL, M. 1996.Introductory Mycology.4. ed.

New York: John Wiley & Sons, 870 p.

ALVES, J.J.A.; ARAÚJO, M.A.; Nascimento, S.S. 2009. Degradação da caatinga: uma

investigação ecogeográfica. Caminhos de Geografia9: (27): 143 – 155.

ARAÚJO, W.L.; LIMA, A.O.S.; AZEVEDO, J.L.; MARCON, J.; SOBRAL, J. K.; LACAVA,

P.T. Manual: Isolamento de microorganismos endofíticos. ESALQ, Piracicaba, 2002, 86 p.

BARNETT, J. A.; YAMADA, T., NOZAMA, Y. Yeasts: Characteristics and identification. 3 ªed.

Cambridge: University Press. 2000. 1002 p.

BARROS NETO, B.; SCARMINIO, I. C.; BRUNS, R. E. Como fazer experimentos: pesquisa e

desenvolvimento na ciência e na indústria. Editora da Universidade de Campinas -

UNICAMP, Campinas, São Paulo, 2ª ed., p.401, 2002.

BENNY, G.L. The methods used by dr. R. K. Benjamin, and other mycologists to isolate

Zygomycetes. Aliso n.26, p.37-61, 2008.

BENNY, G.L. Zygomycetes. Synopsis and Classification of Living Organisms. McGraw - Hill

Book Co. Inc., New York. P.184-195, 1982.

BEZERRA, J.D.P., SANTOS, M.G.S., SVEDESE, V.M., LIMA, D.M.M., FERNANDES,

M.J.S., PAIVA, L.M., SOUZA-MOTTA, C.M. 2012. Richness of endophytic fungi isolated

from Opuntia ficus-indica Mill. Cactaceae) and preliminary screening for enzyme production.

World Journal of Microbiology and Biotechnology.

BHAT, M. K. 2000. Cellulases and Related enzymes in biotechnology.Biotechnology Advances

18: 355-383.

62

BILLS, G.F. 1996 Isolation and analysis of endophytic fungal communities from woody plants.

In: Redlin, S.C., Carris, L.M. (Ed). Endophytic Fungi in Grasses and Woody Plants:

systematics, ecology, and evolution. APS. St Paul, MN. 31–65.

BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities

of protein utilizing the principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry, n.72,

p.248-254, 1976.

BROWN, N.A., ANTONIW, J., HAMMOND-KOSACK, K.E., The predicted secretome of the

plant pathogenic fungus Fusarium graminearum: a refined comparative analysis. PLoS One.

2012, 7, e 33731.

BUSSAMARA, R.; FUENTEFRIA, A. M.; OLIVEIRA, E. S.; BROETTO, L.; SIMCIKOVA,

M.; VALENTE, P.; SCHRANK, A.; VAINSTEIN, M. H. Isolation of a lipase-secreting yeast

for enzyme production in a pilot-plant scale batch fermentation. Bioresource Technology, p.

268-275, 2010.

CANHOS, V.P., UMINO, C.Y., MANFIO, G.P. 2006. Coleções de microrganismos: coleções de

culturas de microrganismos. 82-101. Disponível em:

<http://www.biota.org.br/pdf/v72cap03.pdf> Acesso em: 11 de dezembro de 2011.

CAPIZZI, R.L., POOLE, M., COOPER, M.R., RICHARDS, F., STUART, J.J., JAKSON, D.V.,

WHITE, D.R., SPURR, C.L., HOPKINS, J.O., MUSS, H.B. 1984. Treatment of poor risk

acute leukaemia with sequential higdone ARA-C and asparaginase.Blood 63, 649-700.

CHOI, W.Y., RIM, S.O., LEE, J.H., LEE, J.M., LEE, I.J., CHO, K.J., RHEE, I.K., KWON, J.B.,

KIM, J.G. 2005 Isolation of gibberellins producing fungi from the root of several

Sesamumindicum plants. Journal of Microbiology and Biotechnology 15, 1, 22–28.

CLARKE, K.R.; WARWICK, R.M. 1994. Change in marine communities – an approach to

statistical analysis and interpretation. Plymouth Marine Laboratory, USA.

CORDEIRO NETO, F.,PERSSONI, R.A.B., FIGUEIREDO-RIBEIRO, R.C.L. 1997. Fungos

produtores de inulinases isolados da rizosfera de Asteraceae herbácea do cerrado (Moji-

Guaçu, SP, Brasil). Revista Brasileira de Ciência do Solo 21, 149-153.

COSTA, A.M; RIBEIRO, W.X..; KATO, E.; MONTEIRO, A.R.G; PERALTA, R.M. Production

of tannase by Aspergillus tamarii in Submerged Cultures. Brazilian Archives of Biology and

Technology, 51, 399-404, 2008.

COUGHLAN, M.P.; HAZLEWOOD, G.P. Beta-1,4-D-xylan-degrading enzymesystems:

biochemistry, molecular biology and applications. Biotechnology andApplied Biochemistry,

v.17, p.259-289, 1993.

63

COURI, S.; FARIAS, A.X. Genetic manipulation of Aspergillus niger for increased synthesis of

pectinolytic enzymes. Review Microbiology, v. 26, p. 314-317, 1995.

CUZZI, C.; LINK, S.; VILANI, A.; ONOFRE, S. B. 2011. Enzimas extracelulares produzidas

por fungos endofíticos isolados de Baccharis dracunculifolia d.c. (Asteraeceae). Gl. Sci.

Technl, v. 04, p. 47 – 57.

DAI, C.C., YU, B.Y., LI, X. 2008 Screening of endophytic fungi that promote the growth of

Euphorbia pekinensis. African Journal of Biotechnology 7, 19, 3505–3510.

DALMAU, L.M. Remarques sur la technique mycologique. Annales Parasitologie et Humaine

Comparée, 7:536-545, 1929.

DINU, D.; NECHIFOR, T. M.; STOIAN G.; COSTACHE, M.; DINISCHIOTU, A. 2007.

Enzymes with new biochemical properties in the pectinolytic complex produced by

Aspergillus niger MIUG 16. Journal of Biotechnology, v.1,31:128-137.

DOMSCH, K.H.; GAMS, W.; ANDERSON, T. Compendium of soil fungi. San Francisco: IHW

– Verlag, 1993, 859p.

DWIVEDI, R., SPICER, V., HARDER, M., ANTONOVICI, M., et al., Practical Implementation

of 2D HPLC Scheme with Accurate Peptide Retention Prediction in Both Dimensions for

High-Throughput Bottom-Up Proteomics. Anal. Chem. 2008, 80, 7036-7042.

FISHER, P. J., SUTTON, B. C., PETRINI, L. E., PETRINI, O. 1994. Fungal endophytes from

Opuntiastricta: a first report. Nova Hedwigia 59, 195–200.

FRANCA-ROCHA, W.; SILVA, A.B.; NOLASCO, M.C.; LOBÃO, J.; BRITTO, D.; CHAVES,

J.M.; ROCHA, C.C. 2007. Levantamento da cobertura vegetal e do uso do solo do Bioma

Caatinga. In: Anais XIII Simpósio Brasileiro de Sensoriamento Remoto, Florianópolis, Brasil,

pp. 2629-2636.

FRISVAD JC, SAMSON RA. Polyphasic taxonomy of Penicillium subgenus Penicillium. A

guide to identification of food and air-borne terverticillate penicillia and their mycotoxins.

Stud Mycol. v.49,1–173, 2004.

GASONI, L. GURFMKEL, B.S. 1997 TheendophyteCladorrhinumfoecundissimum in cotton

roots: phosphorus uptake and host growth. Mycological Research 101, 867–870.

GEISER, D.M.; KLICH, M.A.; FRISVAD, J.C.; PETERSON, S.W.; VARGA, J.; SAMSON,

R.A. The current status of species recognition and identification in Aspergillus. Stud Mycol.

v.59, n.1, p.1-10, 2007.

GINTHER, C. L. Sporulation and the production of serine protease and cephamycin c by

Streptomyces lactamdurans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 15, 522-526, 1979.

64

GLASS, N. L.; DONALDSON, G. C. Development of primer sets designed for use with the PCR

to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Appl. Environ. Microbiol . v.61,

p.1323–1330, 1995.

GUINDON, S.; GASCUEL, O. 2003. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large

phylogenies by maximum likelihood. Systematic Biol. 52:696–704.

GULATI, R., SAXENA, R.K., GUPTA, R. 1997. A rapid plate assay for screening L-

asparaginase producing micro-organisms. Lett Appl Microbiol 24, 23-26.

HALL, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis

program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids Symp. Ser. 41:95–98,

HALLMANN, J.A.; QUADT-HALMANN, W.; MAHAFFEE, F.; KLOEPPER, J.W. 1997

Bacterial endophytes in agricultural crops. Canadian Journal of Microbiology 43, 895-914.

HALTRICH, D.; NIDETZKY, B.; KULBE, K.D; STEINER, W.; ZUPANIC, S. Production of

fungal xilanases.BioresourceTechnology, v. 58, p. 137-161, 1996.

HELBIG, E. Ação da maceração prévia ao cozimento do feijão-comum (Phaseolus vulgaris, L)

nos teores de fitatos e taninos e conseqüências sobre o valor protéico. 67 f. Dissertação

(Mestrado) Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2000.

HERCULANO, P. N., PORTO, T. S., MACIEL, M. H. C., MOREIRA, K. A., SOUZA-MOTTA,

C. M., PORTO, A. L. F. Partitioning and Purification of the Cellulolytic Complex Produced

by Aspergillus japonicus URM5620 Using PEG-Citrate in an Aqueous Two-Phase System.

Fluid Phase Equilibria, v.335, p.8 - 13, 2012.

HESSELTINE, C.W.; FENNEL, D.I. The genus Circinella. Mycologia, v.7, p.193-211, 1995.

HYDE, K.D., SOYTONG, K. 2008 The fungal endophyte dilemma. Fungal Divers33, 163–173.

IMADA, A., IGARASI, S., NAKAHAMA, K., ISONO, M. 1973 Asparaginase and Glutaminase

Activities of Micro-organisms, SGM 76, 85-99.

JACOBS, K.; BOTHA, A. 2008.Mucorrenisporus sp. nov., a new coprophilous species from

southern Africa. Fungal Divers 29:27–35.

KEATING, M.J., HOLMES, R., LERNER, S., HO, D. H. 1993. L-asparaginase and PEG

asparaginase – Past, present and future. Leuk Lymphoma 10, 153-157.

KELLER, B. O.; SUI, J.; YOUNG, A. B.; WHITTAL, R. M. Interferences and contaminants

encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, v.627, p.71-81, 2008.

KENDRICK, B. 2000. The Fifth Kingdom. 3 ed. Mycologue publications.

KLICH, M. A. Biogeography of Aspergillus species in soil and litter. Mycologia, v. 94: 21-27,

2002.

65

KREGER-VAN RIJ , N. J. W. The yeast: a taxonomic study. 3ª ed. Amsterdan: Elsevier Science

Publication, 1984.

KRISHNAN, S., PRAPULLA, S.G., RAJALAKSHMI, D., MISRA, M.C., KARANTH N.G.

1998. Screening and selection of media components for lactic acid production using Plackett-

Burman design. Bioprocess Eng 19, 61-65.

KURAMAE-IZIOKA, E.E.; LOPES, C.R.; SOUZA, N.L.; MACHADO, M.A. 1997.

Morphological and molecular characterization of Colletotrichum spp. from citrus orchards

affected by post bloom fruit drop in Brazil. Eur. J. Plant Pathol., 103:323-329.

LACAZ, C. S.; PORTO, E.; MARTINS, J. E. C.; HEINS-VACARRI, E. M.; MELO, N. K.

Tratado de Micologia Médica. 9. ed. São Paulo: Editora Savier, p. 1104, 2002.

LAPMAK, K., LUMYONG, S., THONGKUNTHA, S., WONGPUTTISIN, P., SARDSUD, U.

2010 L-Asparaginase Production by Bipolarissp. BR438 Isolated from Brown Rice in

Thailand Chiang Mai J. Sci. 37(1), 160-164

LARKIN, M.A.; BLACKSHIELDS, G.; BROWN, N.P.; CHENNA, R.; MCGETTIGAN, P.A.;

MCWILLIAM, H.; VALENTIN, F.; WALLACE, I.M.; WILM, A.; LOPEZ, R.;

THOMPSON, J.D.; GIBSON, T.J.; HIGGINS, D.G. 2007. Clustal W and Clustal X version

2.0. Bioinformatics 23:2947–2948.

LEAL, I.L.; SILVA J.M.C.; TABARELLI, M.; LACHER JR, T.E. 2005. Mudando o curso da

conservação da biodiversidade na Caatinga do Nordeste do Brasil. Megadiversidade 1(1):

139-146.

LEKHA, P.K.; LONSANE, B.K. And properties of tannin acyl hidrolase produced by PKL 104

in solid-state, liquid surface and submerged fermentations. Process Biochemistry, 29, 497-

503, 1994.

LODDER, J. The Yeast: a taxonomic study. Oxford: North Holland Publishing Company, 1970.

1385p.

LONG WANG; WEN-YING ZHUANG. A Phylogenetic analyses of penicillia based on partial

calmodulin gene sequences. BioSystems v.88, p. 113–126, 2007.

LONG WANG; WEN-YING ZHUANG. Eupenicillium saturniforme, a New Species Discovered

from Northeast China. Mycopathologia, v.167, p.297–305, 2009.

MACEDO, G.A.; MATSUDA, L.K.; BATTESTIN, V. Seleção de Fungos Produtores de Tanases

em resíduos Vegetais Ricos em Taninos. Ciênc. Agrotec. v.29, p.833-838, 2005.

MACIEL, M. H. C., HERCULANO, P. N., PORTO, T. S., TEIXEIRA, M. F. S., Moreira, Keila

Aparecida, Souza-Motta, Cristina. Production and partial characterization of pectinases from

66

forage palm by Aspergillus niger URM4645. African Journal of Biotechnology. , v.13, p.2469

- 2475, 2011.

MALINOWSKI, D.P., BRAUER, D.K., BELESKY, D.P. 1999 Neotyphodiumcoenophialum-

endophyte affects root morphology of tall fescue grown under phosphorus deficiency. Journal

of Agronomy and Crop Science 183, 53–60.

MAUTONE, J.N. Diversidade e potencial biotecnológico de leveduras e fungos semelhantes a

leveduras isolados de folhas de figueiras do Parque de Itapuã, RS, Brasil. Dissertação

(mestrado)- Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Instituto de Ciências Básicas da

Saúde. Programa de Pós- Graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente. Porto

Alegre, 2008.

MEHROTRA, B.S.; MEHROTRA, B.M. 1979-1978.Another azygosporicspecies of Mucorfrom

India.Sydowia 31:94–96.

MELO, M.N.; FERRE,R.; CASTANHO, M.A.R.B. Antimicobial peptides: linking partition,

activity and high membrane-bound concentration. Nature opinion, v.7, 2009.

MICHELIN, M. Estudo da glucoamilase e da ƒ¿-amilase produzidas pelo fungo Paecilomyces

variotii: purificacao, caracterizacao bioquimica e relacoes filogeneticas. 2005. 160f.

Dissertacao (Mestrado em Ciencias) . Departamento de Biologia . Universidade de Sao Paulo,

Ribeirao Preto, 2005.

MICOTECA URM. Histórico. Disponível em: <http://www.ufpe.br/micoteca/historico. html>.

Acesso em: 15 de agosto de 2012.

MILNE, I.; WRIGHT, F.; ROWE, G; MARSHAL D.F.; HUSMEIER, D.; MCGUIRE, G. 2004.

TOPALi: Software for Automatic Identification of Recombinant Sequences within DNA

Multiple Alignments. Bioinformatics 20:1806–1807.

MIRZA, J.H.; KHAN, S.M.; BEGUN, S.; SHAGUFTA, S. 1979. Mucorales of

Pakistan.Universityo f Agriculture, Faisalabad.

MURUGAN, K.; S. SARAVANABABU, M.; M. ARUNACHALAM. Screening of tannin acyl

hydrolase (E.C.3.1.1.20) producing tannery effluent fungal isolates using simple agar plate

and SmF process. Bioresource Technology, v.98, p. 946-949, 2007.

NAKASONE KK, Peterson AW, Jong S. Preservation and distribuition of fungal cultures. In:

Mueller GM, Bills GF, Foster MS. Biodiversity of fungi, inventory and monitoring methods.

1st ed. San Diego: Elsevier Academic Press; 2004.

NEVES, M. L. C., PORTO, T. S., SOUZA-MOTTA, C. M., SPIER, M. R., SOCCOL, C. R.,

MOREIRA, K. A., PORTO, A. L. F. Partition and recovery of phytase from Absidia

67

blakesleeana URM5604 using PEG-citrate aqueous two-phase systems. Fluid Phase

Equilibria, v.318, p.34 - 39, 2012.

O’DONNELL, K.L. 1979. Zygomycetes in culture. University of Georgia, Georgia.

OCDE. www.oecd.org/dataoecd. > Acesso em: 13 de maio de 2010.

OLIVEIRA, G. G. G.; SILVA, D. P.; ROBERTO, I. C.; VITOLO, M.; PESSOA-JUNIOR, A.

Purificação de glicose-6-fosfato desidrogenase em sistemas de duas fases aquosas utilizando

PEG/citrato. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. v.37, n.2, p.176-187, 2001.

OLIVEIRA, A.N; OLIVEIRA, L.A.; ANDRADE, J.S.; CHAGAS-JUNIOR, A.F. 2007. Produção

de amilase por rizóbios, usando farinha de pupunha como substrato. Ciência e Tecnologia de

Alimentos, Campinas, v.27, n.1, p. 61 – 66.

PASTORE, G.M.; COSTA, V. S.; KOBLITZ, M.G.B. Purificação parcial da lipase extracelular

produzida por nova cepa de Rhizopus sp. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 23, p. 135-

140, 2003.

PEDRESCHI, F., KAACK, K., GRANBY, K. 2008. The effect of Asparaginase on acrylamide

formation in French fries. Food Chem 109, 386–392.

PEREIRA-MEIRELLES, F. V.; ROCHA-LEÃO, M. H. M.; SANTŤ ANNA, G. L. A stable

lipase from Candida lipolytica -Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 63-65, p. 73-95,

1997.

PINHEIRO, I.O., ARAUJO, J.M., XIMENES, E.C.P.A., PINTO, J.C.S., ALVES, T.L.M. 2001

Production of L-asparaginase by Zymomonas mobilis strain CP4. BD 06, 243-244.

PITT, J.I. 1988. A laboratory guide to common Penicillium species . Commonealth scientific and

Industrial Research organization Division Food Processing. 187p.

PORTO, A. L. F., CAMPOS-TAKAKI, G. M. and LIMA FLIHO, J. L. Effects of culture

conditions on protease production by Streptomyces clavuligerus growing soy bean flour

medium. Applied Biochemistry Biotechnology, v. 60, p.115-122, 1996. QUI, F., ZHAN, Y.,

ZENG, F., JING, T. 2012. Effect of endophytic fungi on the growth situation in cell

suspension cultures of Acer ginnala Maxim. AMR 343-344, 384-390.

RAPER, K.B.; FENNELL, D.I. The genus Aspergillus.Baltimore.Williams & Wilkins. 1965.

686p.

RAPER, K.B.; THOM, C. 1949. A manual of the penicillia. Baltimore, Williams & Wilkins, 709

p.

REYNOLDS, D.R., TAYLOR, J.W. 1993. The Fungal Holomorph: A Consideration of Mitotic

Meiotic and Pleomorphic Speciation, CAB International, Wallingford. UK.

68

RICHARDSON, M. 2009. The ecology of the Zygomycetes and its impact on environmental

exposure. ClinMicrobiol Infect15, 2-9.

RIM, S.O., LEE, J.H., CHOI, W.Y., HWANG, S.K., SUH, S.J., LEE, I.J., RHEE, I.K., KIM, J.G.

2005. Fusarium proliferatum KGL0401 as a new gibberellins-producing fungus. Journal of

Microbiology and Biotechnology 15, 4, 809–814.

RODRIGUES, W.C. 2005. DivEs - Diversidade de espécies. Versão 2.0. Software e Guia do

Usuário. Disponível em: <http://www.ebras.bio.br>. Acesso em: 10/05/2007.

ROSA, C. A.; LACHANCE, M. A.; SILVA, J. O. C.; TEIXEIRA, A. C. P.; MARINI, M. M.;

ANTONINI, Y.; MARTINS, R. P. Yeast communities associated with stingless bees. FEMS

Yeast Research, v. 4, p. 271-275, 2003.

SAMSON R.A. , VARGA J. , WITIAK S.M. GEISER D.M. The species concept in Aspergillus:

recommendations of an international panel 3Stud Mycol 59(1): 71-73 2007

SAMSON, R. A.; FRISVAD, J. C. Penicillium Subgenus Penicillium: new Taxonomics

Schemes, Mycotoxins and Other Extrolites. 2004. Studies in Mycology, 49: 1-260

SANTIAGO, A.L.C.M.A., SOUZA-MOTTA, C.M. 2006. Mucorales isolados do solo de

mineração de cobre e produção de amilase e inulinase.Acta BotanicaBrasilica.20, 641-647.

SANTOS, C.; PATERSON, R. R. M.; VENÂNCIO, A.; LIMA, N. 2009. Filamentous fungal

characterizations by matrix-assisted laser desorptionionization time-of-flight mass

spectrometry. Journal of Applied Microbiology, 1-11.

SARUBBO, L. A. 2000. Caracterização de um novo sistema bifásico aquoso e aplicação em

extração de proteínas com coluna de discos perfurados rotativos. Tese Doutorado em

Engenharia-química) - Universidade de Campinas/UNICAMP, Campinas, 174p.

SARQUIS, M.I.M., OLIVEIRA, E.M.M., Santos, A.S., Costa, G.L. 2004 Productionof L-

asparaginasebyfilamentousfungi. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 99, 489-492.

SAXENA, R.K., SINHA, U. 1981. L-Asparaginase and glutaminase activities in the cultures

filtrates of Aspergillus nidulans. Curr. Sci 50, 281-219.

SAXENA, R.K.; W.S DAVIDSON, SHEORAN, A.; GIRI, B. Purification and characterization

of an alkaline thermostable lipase from Aspergillus carneus. Process Biochemistry, p 239-

247, 2003.

SCHIPPER MAA. 1978. On certain species of Mucor with a key to all accepted species. Studies

in Mycology 17: 1-69.

SCHIPPER MAA. 1984. A revision of the genus Rhizopus I. The Rhizopus stolonifer group and

Rhizopus oryzae. Studies in Mycology 25: 1-34.

69

SCHIPPER, M.A.A. (1990). On certain species of Mucor with a key to all accepted species.

Studies in Mycology 25: 1–53.

SCHNITTLER M, STEPHENSON SL. 2000. Myxomycetes biodiversity in four different forest

types in Costa Rica. Mycologia 92: 626-637.

SELWAL M.K., SELWAL, K.K. 2011 High-level tannase production by Penicillium

atramentosum KM using agro residues under Submerged fermentation. Ann Microbiol 62(1):

139-148.

SERRA, R., CABANES, F. J., PERRONE, G., CASTELLA, G., VENANCIO, A., MULE, G. &

KOZAKIEWICZ, Z. (2006). Aspergillus ibericus: a new species of section Nigri isolated

from grapes. Mycologia 98, 295–306.

SHARMA S, BHAT T.K., DAWRA R.K. (2000) A Spectrophotometric Method for Assay of

Tannase Using Rhodanine. Anal Biochem 279:85–89. doi:10.1006/abio.1999.4405

SHERF, A.F. 1943. A method for maintaining Phytomonas sepedonica in culture for long periods

without transfer. Phytopathol 33, 330-332.

SINGH, A., SINGH, N., NARSIBISHNOI, R. 2009. Production of Cellulases by

AspergillusHeteromorphus from Wheat Straw under Submerged Fermentation.International

Journal of Civil and Environmental Engineering v. 1, n.1. SMITH; ONION. 1994. Projeto

“The Tree of Life” em http://tolweb.org.

SODRÉ, G.S; MARCHINI, L.C.; ROSA, V.P; MORETI, A.C.C.C; CARVALHO, C.A.L.

Conteúdo microbiológico de méis de Apis mellifera (Hymenoptera: apidae) dos estados do

Ceará e Piauí. B. Indústr.anim., N. Odessa,v.64, n.1, p.39-42,jan./mar., 2007.

SOLIMAN N.A., BEREKAA M.N., ABDEL-FATTAH Y.R. 2005. Polyglutamic acid production

by Bacillus sp. SAB-26: application of Plackett-Burman experimental design to evaluate

culture requirements. Appl. Microbiol. Biotechnol 69, 259-67.

SONIYAMBI, A.R., LALITHA, S., PRAVEESH, B.V., PRIYADARSHINI, V. 2011 Isolation,

Production and Anti-tumor activity of L-asparaginase of Penicillium sp. Internacional Journal

of Microbiological Research 2 (1), 38-42.

STATSOFT. 1997. Statistic for Windows 5.1. CD ROM. TULSA, STATSOFT INC.

RODRIGUES, W.C. 2005. DivEs - Diversidade de espécies. Versão 2.0. Software e Guia do

Usuário. Disponível em: <http://www.ebras.bio.br>. Acesso em: 10/05/2007. (

STROBEL, G., DAISY, B., CASTILLO, U., HARPER, J. Natural Products from Endophytic

Microorganisms. Journal of Natural Products 67(2): 257-268, 2004.

STROBEL, G.A., HESS, W.M., FORD E., SIDHU, R.S., YANG, X. 1996 Taxol from fungal

endophyte and issue of biodiversity. Journal of Industrial Microbiology 17, 417–423.

70

SUBRAHAMANYAM, A. 1983.Studies on thermo mycology.Mucorthermohyalospora sp.

nov.BibliothecMycol 91:421–423.

SURYANARAYANAN, T.S., WITTLINGER, S.K., FAETH, S.H. 2005. Endophytic fungi

associated with cacti in Arizona. Mycol. Res 109, 5, 635–639.

SWOFFORD, D.L. 2003. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other

Methods). Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.

THEANTANA, T., HYDE, K.D., LUMYONG, S. 2007 Asparaginase production by endophytic

fungi isolated from some Thai medicinal plants. KMITL Sci. Tech. J 7, S1, 13-18.

THEANTANA, T., HYDE, K.D., LUMYONG, S. 2009 Asparaginase production by endophytic

fungi from Thai medicinal plants: citoxicity properties. IJIB 7, 1.

UENOJO, M.; PASTORE, G.M.. 2007. Pectinases: Aplicações Industriais e Perspectivas.

Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,

Universidade Estadual de Campinas, CP 6121, 13083-862 Campinas – SP, Brasil. Quim.

Nova, Vol. 30, No. 2, 388-394.

VARGA, J., KEVEI, F., HAMARI, Z., TO´ TH, B., TE´ REN, J., CROFT, J. H. &

KOZAKIEWICZ, Z. (2000). Genotypic and phenotypic variability among black Aspergilli. In

Integration of Modern Taxonomic Methods for Penicillium and Aspergillus classification, pp.

397–411. Edited by R. A. Samson & J. I. Pitt. Amsterdam: Harwood Academic Publishers.

VARGAS, T. Avaliação da qualidade do mel produzido na região dos Campos Gerais do Paraná.

2006. 134f. Dissertação (Mestrado em Ciência e tecnologia de alimentos) – Universidade

Estadual de Ponta Grossa, Ponta Grossa, 2006.

WADE, H.E., ROBINSON, H.K., PHILIPS, B.W. 1971. Asparaginase and glutaminase activities

of bacteria. J Gen Microbiol 69, 299-312.

WATANABE, N., OTA, Y., MINODA, Y., YAMADA, K. Isolation and identification of

alkaline lipase producing microrganisms, cultural conditions and some properties of crude

enzymes. Agricultural and Biological Chemistry, v.41, p.1353-1358, 1977.

WHITE TJ, BRUNS T, LEE S, TAYLOR J, 1990. Amplification and direct sequencing of fungal

ribosomal RNA genes for phylogenetics. 315–322, in Innis MA, Gelfand DH, Shinsky JJ,

White TJ, (eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, San

Diego.

WIAME, J.M., GRENSON, M., ARST, N.H.J.R. 1985. Nitrogen catabolite repression in yeasts

and filamentous fungi. Adv Microbiol Physiol 26, 1-88.

Wriston, J.C., Yellin, T. 1973 L-asparaginase: A review. Adv. Enzimol 39, 185.

71

World Data Center for Microorganisms (WDCM). 2012. Home Pages of Culture Collections in

the World. Disponível em: <http://wdcm.nig.ac.jp/hpcc.html>. Acesso em:15 de Maio de

2008.

XU, J.; EBADA, S.S.; PROKSCH, P. 2010. Pestalotiopsis a highly creative genus: chemistry and

bioactivity of secondary metabolites. Fungal Divers. doi:10.1007/s13225-010-0055-z.

ZAR JH. 1996. Biostatistical analysis. Prentice-Haal, New Jersey.