Caracterização química, avaliação da toxicidade e ...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE MEDICINA PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE ÁREA DE FARMACOLOGIA Caracterização química, avaliação da toxicidade e atividade cicatrizante de feridas do extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea guilleminiana Gaudich. Fabiana de Freitas Figueiredo Cuiabá - MT 2018
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE MEDICINA
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ÁREA DE FARMACOLOGIA
Caracterização química, avaliação da toxicidade e atividade
cicatrizante de feridas do extrato aquoso do infuso das folhas
de Sorocea guilleminiana Gaudich.
Fabiana de Freitas Figueiredo
Cuiabá - MT
2018
Caracterização química, avaliação da toxicidade e atividade
cicatrizante de feridas do extrato aquoso do infuso das folhas
de Sorocea guilleminiana Gaudich.
Fabiana de Freitas Figueiredo
Orientador: Prof. Dr. Domingos Tabajara de Oliveira Martins
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde, para do título
de mestre em Ciências da Saúde, área de
concentração Farmacologia.
Cuiabá - MT
2018
FICHA CATALOGRÁFICA
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.
F475c Figueiredo, Fabiana de Freitas.
Caracterização química, avaliação da toxicidade e atividade cicatrizante de feridas do extarto aquoso do infuso das folhas de
Sorocea guilleminiana Gaudich. / Fabiana de Freitas Figueiredo. -- 2018
113 f. : il. color. ; 30 cm.
Orientador: Domingos Tabajara de Oliveira Martins. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de
Mato Grosso, Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde, Cuiabá, 2018. Inclui bibliografia.
1. Sorocea guilleminiana. 2. cicatrização de feridas. 3.
toxicidade. 4. antigenotóxico. 5. compostos fenólicos. I. Título.
DEDICATÓRIA
Primeiramente a Deus, pelo dom da vida e por toda a força diante dos obstáculos que já
cruzaram meu caminho e aos meus pais, Rubens William de Figueiredo Cunha e Sebastiana
Pereira de Freitas Figueiredo Cunha e meus irmãos Rubens Ferreira da Cunha Netto e Fernanda
de Freitas Figueiredo que nunca mediram esforços para que eu realizasse meus sonhos, por toda
a dedicação e amor, meu muito obrigada, sem vocês não teria conseguido.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Domingos Tabajara de Oliveira Martins, uns dos maiores
pesquisadores do nosso país, pelo conhecimento compartilhado, ensinamentos, dedicação,
paciência, confiança e incentivo, e por me mostrar que apesar de todas as dificuldades, não
devemos desistir de fazer o que amamos.
À Universidade Federal de Mato Grosso e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
da Saúde da Faculdade de Medicina (FM), pela oportunidade de formação acadêmica.
Ao Prof. Dr. Amilcar Sabino Damazo, Coordenador do Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde - FM/UFMT, durante o período de realização deste mestrado, pelo apoio na
realização do mesmo.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela minha
bolsa de mestrado e ao CAPES Pró – Amazona e INCT – INAU/CNPq pela ajuda de auxilio
financeiro e carro na coleta de material botânico.
Ao Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA/UFMT) pela análise criteriosa e
autorização para experimentação animal.
Ao estagiário pós-doutoral do Programa de Pós-Graduação em Ciências em Saúde da
FM/UFMT, Dr. Arunachalam Karuppusamy por me ajudar na depilação e anestesia das ratas
no experimento de cicatrização por modelo de excisão e incisão.
Ao estagiário pós-doutoral do Programa Pós-Graduação em Ciências da Saúde da
FM/UFMT, Dr. Antonio Macho Quiroz por me ajudar nos experimentos de citometria de fluxo,
muito obrigada.
Ao Prof. Edson Moleta Colodel e a todo o Laboratório de Patologia Veterinária (LPV)
pelas análises histopatológicas.
À Profª. Drª. Larissa Maria Scalon lemos por me ajudar no experimento de micronúcleo
e cometa, por me ajudar como pesquisadora a pensar no porque das técnicas desses
experimentos e por me deixar auxiliar no seu experimento de citometria de fluxo.
À Profª. Drª. Carla Galbiati da Universidade do Estado de Mato Grosso- UNEMAT por
dividir comigo o experimento de cicatrização por modelo de excisão me ajudando todos os dias.
À Profª. Drª. Isanete Geraldini Bieski, que em seu trabalho de etnofarmaologia com a
população do Vale do Juruema trouxe até nós a Sorocea guilleminiana.
Ao Ms. Claudio Luis Venturini por me ensinar a técnica de cicatrização por modelo de
excisão no primeiro dia de ensaio, meu muito obrigada. Ao Ms. Guilherme Vieira Botelho de
Almeida por me ajudar nas traduções em inglês e a traduzir meu resumo para Sociedade
Brasileira de farmacologia e terapêutica Experimental (SBFTE).
Ao mestrando Marco Tulio Marra Machado por sempre estar disponíveis a me ajudar nos
experimentos in vivo, sendo prestativo e me ajudando a coordenador o experimento de
cicatrização
À doutoranda Darley Maria Oliveira, por me ajudar nas contas, na sutura por modelo de
incisão, na transformação de Newton por Pascoal, por me ajudar a pensar nos experimentos e
principalmente por me ajudar no experimento de microbiologia.
À Ma. Eduarda Pavan por em ajudar na sutura do experimento por incisão, por deixar me
deixar rodar alguns experimentos juntos como micronúcleo e cometa.
À Ma. Géssica Fraga e Emilly Della Pasqua por me permitirem participarem de seus
experimentos, para que assim eu pudesse aprender as técnicas de seus experimentos e
principalmente no experimento de toxicidade subcrônica.
Aos técnicos do laboratório de Farmacologia da FM, Ms. Joaquim Corsino e Ma. Maria
Cristina Fuzzari pelo conhecimento compartilhado e auxílio no preparo de reagentes, por
anestesiar os animais no experimento de cicatrização por incisão, pela compra de materiais de
laboratório e ao cultivo da linhagem N3T3.
À equipe do Laboratório de Histologia, Joselina Maria da Silva e Luiz Cáceres da Silva,
por me ensinarem a mexer no equipamento de processamento de amostras para emblocar as
peças histológicas.
À Profª. Drª. Virginia Claudia da Silva coordenadora do Laboratório de Química de
Produtos Naturais e sua equipe por me emprestar o liofilizador que foi de grande importância
para meu trabalho.
Aos estagiários, alunos de iniciação científicas e bolsistas do Laboratório de
Farmacologia, pela imensa ajuda em meus experimentos: Paulo Othávio Almeida, Matheus
Marcos Engelbretch, Layren Antonielli Ferreira, Raira Paes, William Kelvin, Vinnie Cedro,
por me ajudarem no experimento de cicatrização por modelo de incisão e excisão.
Às funcionarias do Biotério Central da Universidade Federal de Mato Grosso: Suryann
Correa Orro, Marilene Marciana da Cruz, Adrielen Rondon, Ana Ester Germana e Ana
Cláudia Feitosa por estarem sempre dispostas a me ajudar e a reservarem os animais quando
precisava.
Ao Prof. Ms. Benedito Luiz Figueiredo, coordenador do Biotério Central da Universidade
Federal de Mato Grosso, pela liberação dos animais.
HAM + DMEM Meio eagle dulbecco modificado com
nutriente F12
Hb Hemoglobina
HCM Hemoglobina a corpuscular média
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
5 – ASA Ácido 5-aminossalicílico
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ANOVA Análise de variância uma via
ATC Ácido tricloroacético
AU Ácido úrico
BHI Infusão de cérebro e coração
BHT Butilidroxitolueno
CAT Catalase
CGEN Conselho de Gestão de Patrimônio Genético
CHCM Concentração de hemoglobina corpuscular
média
CI50 Concentração inibitória 50%
CIM Concentração inibitória mínima
CT Colesterol total
DTNB 5,5'-Dithiobis-(2-Nitrobenzoic Acid)
EASg Extrato aquoso de Sorocea guilleminiana
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EGF Fator de crescimento epidérmico
EP Erro Padrão
EtOH Etanol
FAL Fosfatase alcalina
FGF Fator de crescimento derivado dos
fibroblastos
GAMA GT Gamaglutamiltransferase
GSH Glutationa
H2O2 Peróxido de hidrogênio
Ht Hematócrito
HTAB Brometo de hexadeciltrimetamônio
IDN Índice de divisão nuclear
IL-1 Interleucina 1
IL- 6 Interleucina 6
IL-8 Interleucina 8
IL- 10 Interleucina 10
IL- 12 Interleucina 12
IL- 17 Interleucina 17
MCP-1 Proteína Quimiotática de Monócito – 1
MDA Malondialdeído
MEC Matriz extracelular
MIP Proteína Inflamatória Macrofágica
MMA Ministério do Meio Ambiente
MN Micronúcleo
MPO Mieloperoxidade
NO Óxido nítrico
NOAEL Nenhum efeito adverso observado
NOEL Nenhum efeito observado
OECD Organização para a Cooperação e
Desenvolvimento Económico
PBS Tampão fosfato
PDGF Fator de crescimento derivado de plaqueta
PGs Prostaglandinas
PGE2 Prostaglandina E2
PI Iodeto de propídeo
RANTES Ativação de Regulação de Células T Normais
SBF Soro Bovino Fetal
SEMA Secretária de Estado de Meio Ambiente
SNC Sistema nervoso central
SOD Superóxido dismutase
TBA Ácido tiobarbiturico
TGF- β Fator de crescimento transformador beta
TGF- α Fator de crescimento transformador alfa
TGO Transaminase oxaloácetica
TMB Tetrametilbenzidina
TNBS Ácido trinitrobenzenosulfônico
TNF α Fator de necrose tumoral α
Txs Tromboxanas
VCM Volume corpuscular médio
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. A. Representação do corte histológico da pele e da derme ampliada (B). ............... 22
Figura 2. Fases da cicatrização e a deposição dos componentes da matriz cicatricial ao longo
do tempo. Fonte: BROUGHTON et al., 2006 adaptado. ..........................................................26
Figura 3. Mapa da distribuição geográfica da planta Sorocea guilleminiana nas regiões do
Brasil. Fonte:http://florabrasil.jbrj.gov.br/reflora/floradobrasil/FB28113>.Acesso em: 22 de
outubro de 2016. ...................................................................................................................... 31
Figura 4. Imagem ilustrativa do corte da pele no modelo de ferida por incisão em ratos. Fonte:
C.L.Venturini, 2017 adaptado. ................................................................................................. 47
Figura 5. Molde para corte da pele utilizado no ensaio de ferida por incisão em ratos.
Fabricação: D.T.O. Martins, J.C.S. Lima e P.E.O. Matos ....................................................... 47
Figura 6. Imagem ilustrativa do tensiômetro utilizado no ensaio de ferida por incisão.
Fabricação: D.T. O. Martins, P.E.O. Mattos, J.C.S. Lima e L. A. de Paula .............................49
Figura 7. Fingerprint por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) do extrato bruto
metanólico (EBM) das folhas de Sorocea guilleminiana (EMSg).
.................................................................................................................................................. 55
Figura 8. Perfil (ultravioleta) dos compostos 1-4, indicados na Figura 7 ................................. 56
Figura 9. Avaliação da citotoxicidade de células de ovário de hamster chinês (CHO-k1) tratadas
por 24 h (A) ou 72 h (B), com o extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea guilleminiana
(EASg) ou doxorrubicina (Doxo), em ensaio de citometria de fluxo. Cada ponto representa a
porcentagem de viabilidade celular (%), expressa como média ± EP., em três experimentos
independentes em duplicata ..................................................................................................... 57
Figura 10. Avaliação da viabilidade de fibroblastos murinos N3T3 tratadas por 24 h (A) ou 72
h (B), com o extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg) ou
doxorrubicina (Doxo), em ensaio de citometria de fluxo. Cada ponto representa a porcentagem
de viabilidade celular (%), expressa como média ± EP., em três experimentos independentes
em duplicata ............................................................................................................................ 58
Figura 11. Efeito da aplicação tópica do extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea
guilleminiana (EASg) sobre a resistência da ferida à tensão (Pa), em modelo de feridas incisas
em ratos, avaliado no 9o dia. Cada barra representa a média ± EP. de 9 animais/grupo. ANOVA
uma via seguida do teste de Student-Newman-Keuls *p < 0,05; **p < 0,01 versus veículo.....63
Figura 12 Efeito da aplicação tópica do veículo, extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea
guilleminiana (EASg 2,10 ou 50 mg/g) e Fitoscar® (60 mg/g) sobre a atividade da
mieloperoxidase (MPO), em homogenato de tecido de pele de rato, em modelo de cicatrização
por ferida por incisão. As colunas representam média ± EP para n = 9 - 10 animais/ grupo.
ANOVA uma via seguido de teste de Student-Newman-Keuls. ***p < 0,001 vs veículo. 66
Figura 13. Efeito da aplicação tópica do extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea
guilleminiana (EASg 2, 10 ou 50 mg/g), veículo e Fitoscar® (60 mg/g) sobre os níveis de
glutationa (GSH), em homogenato de tecido de pele de ratos, em modelos de cicatrização por
ferida de incisão. As colunas representam a média ± EP para n =9 – 10 animais/grupo. Anova
uma via seguido de teste de Student-Newman-Keuls. *p < 0,05 vs veículo .......................... 67
Figura 14. Efeito aplicação tópica do extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea
guilleminiana (EASg 2, 10 ou 50 mg/g), veículo e Fitoscar® (60 mg/g) sobre a atividade da
catalase (CAT), em homogenato de tecido de pele de ratos, em modelo de cicatrização de ferida
por incisão. As colunas representam a média ± EP para n =9 – 10 animais/grupo. Anova uma
via seguido de teste de Student-Newman-Keuls. ** p < 0,01 vs veículo. ............................... 67
Figura 15. Efeito da aplicação tópica do veículo, extrato aquosos do infuso das folhas de
Sorocea guilleminiana (EASg 2, 10 ou 50 mg/g) e Fitoscar® (60 mg/g) sobre os níveis de
Interleucina 12p70 (IL-12p70) (A), Interleucina 1ß (IL-1ß) (B), Interleucina 10 (IL-10) (C),
Interleucina 17 (IL-17) (D), fator de necrose tumoral α (TNFα) (E), em modelo de ferida por
incisão em ratos. Cada coluna representa a média ± EP. de 9 animais/grupo. ANOVA uma via
seguida do teste de Student-Newman-Keuls *p < 0,05; vs veículo. ........................................ 68
Figura 16. Efeito da aplicação tópica do veículo, do extrato aquoso do infuso das folhas de
Sorocea guilleminiana (EASg 2, 10 ou 50 mg/g) e Fitoscar® (60 mg/g) sobre os níveis de óxido
nítrico (NO), em modelo de ferida por incisão, em ratos. As colunas representam a média ± E.P.
de três ensaios independentes em duplicata. Anova uma via................................................... 70
Figura 17. Efeito do extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg 0,8;
4 e 20 µg/mL) sobre a taxa de proliferação/migração de células N3T3, em ensaio in vitro de
riscamento de monocamada celular (scratch assay). O fator de crescimento derivado de
plaquetas (PGDF) foi usado como controle positivo. As colunas representam a média ± E.P. de
três ensaios independentes em duplicata. ANOVA uma via seguida do teste de Student-
Newmn-Keuls.***p < 0,001 vs. veículo. †p < 0,05 vs. PDGF ................................................ 71
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Sistema de eluição utilizado para obtenção do perfil cromatográfio por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) do extrato bruto metanólico das folhas de Sorocea
guilleminiana (EMSg). ............................................................................................................ 42
Tabela 2. Valores de aberrações nucleares em células epiteliais de ovário de hamster chinês
(CHO-k1) expostas por 24 h ao meio de cultura, extrato aquoso do infuso das folhas Sorocea
guilleminiana (EASg, 10; 30 ou 100 µg/mL) e doxorrubicina (Doxo, 0,03 µg/mL).).
.................................................................................................................................................. 59
Tabela 3. Valores dos danos nucleares induzidos por peróxido de hidrogênio (H2O2), em células
epiteliais de ovário de hamster chinês (CHO-k1), submetidas ao pré-, co- e pós- tratamento com
extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg). 60
Tabela 4. Variação de peso corporal durante o ensaio de toxicidade aguda em camundongos
tratados com extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg) ............ 61
Tabela 5. Peso relativo das principais órgãos de camundongos tratados com extrato aquoso do
infuso das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg) em dose única de 2000 mg/kg
................................................................................................................................................. 61
Tabela 6. Efeito da aplicação tópica do extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea
guilleminiana (EASg) sobre a taxa de contração da ferida (%) e período de re-epitelização (Re,
em dias) em modelo de ferida por excisão em ratos ............................................................... 62
Tabela 7. Efeito da aplicação tópica do veículo, extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea
guilleminiana (EASg, 2, 10 e 50 mg/g) e Fitoscar® (60 mg/g) sobre vários parâmetros do
processo de cicatrização de feridas cutâneas por excisão, em ratos ......................................... 65
Tabela 8. Efeito da aplicação tópica do veículo (creme não iônico), extrato aquoso do infuso das
folhas de Soroceaguilleminiana(EASg, 2, 10 e 50 mg/g) e Fitoscar® (60 mg/g) sobre
diferenciação do tipo de colágeno no processo de cicatrização de feridas cutâneas por incisão,
em ratos.......................................................................................................................................
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Drogas, reagentes e corantes utilizados nos ensaios farmacológicos ......................35
Quadro 2. Materiais permanentes, equipamentos e softwares utilizados nos bioensaios,
ensaios farmacológicos e toxicológicos .................................................................................... 38
Quadro 3. Ficha individual para anotações dos escores de avaliação das características
microscópicas do processo de cicatrização de feridas cutâneas. As intensidades das variáveis (0
a 4) foram multiplicadas por fatores positivos ou negativos baseados na sua importância para a
cicatrização. A soma destes produtos corresponde ao escore total para cada animal .... 50
16
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 21
1.1 Pele ..................................................................................................................................... 21
1.2 Classificação das Feridas .................................................................................................... 22
1.3 Processo de Cicatrização .................................................................................................... 23
1.3.1 Fase Inflamatória ............................................................................................................. 23
1.3.2 Fase Proliferativa ............................................................................................................. 25
1.3.3 Fase de Remodelagem ou Maturação. ............................................................................ 26
1.4 Farmacoterapia da Cicatrização .......................................................................................... 27
1.5 Plantas Medicinais ............................................................................................................. 29
1.6 Sorocea guilleminiana Gaudich. ........................................................................................ 31
2 JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 32
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 33
3.1.1 Objetivo geral .................................................................................................................. 33
3.2 Objetivos específicos .......................................................................................................... 33
4 MATERIAIS ........................................................................................................................ 33
4.1. Material Botânico ............................................................................................................................................33
4.2 Animais ............................................................................................................................... 34
4.3 Linhagens celulares ............................................................................................................ 34
4.4 Micro-organismos ............................................................................................................... 34
4.5 Drogas reagentes, meios de cultura e corantes ................................................................... 35
4.6 Equipamentos, materiais permanentes e softwares ............................................................ 38
5 MÉTODOS .......................................................................................................................... 40
5.1 Obtenção do extrato aquoso ............................................................................................... 40
5.1.1 Determinação do rendimento e concentração do EASg .................................................. 40
5.1.2 Análises fitoquímica quali e quantitativas do EASg ....................................................... 41
5.2 Quantificação de metabólicos secundários ......................................................................... 41
5.2.1 Teor de fenólicos ............................................................................................................. 41
5.2.1.2 Teor de flavonoides ...................................................................................................... 41
5.2.2 Avaliação fitoquimica ...................................................................................................... 41
5.2.2.1 Preparação do extrato metanólico bruto e frações de Sorocea guilleminiana .............. 41
5.2.2.2 Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ..................................................................42
17
.......42
.......43
5.2.2.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ..............................................
5.3 Avaliação da Toxicidade .............................................................................................
5.3.1 Teste de toxicidade in vitro ............................................................................................. 43
5.3.1 Ensaio de citotoxicidade .................................................................................................. 43
5.3.2 Ensaio de viabilidade celular...........................................................................................43
5.3.3 Ensaio de Genotoxicidade ............................................................................................... 44
5.3.3.1 Teste do Micronúcleo (MN) com Bloqueio de Citocinese .......................................... 44
5.3.3.2 Teste de Cometa............................................................................................................ 45
5.3.4 Teste de toxicidade in vivo .............................................................................................. 45
5.3.4.1 Teste hipocrático (dose única) ...................................................................................... 45
5.4 Avaliação da atividade cicatrizante in vivo......................................................................... 46
5.4.1 Ferida por excisão. .......................................................................................................... 46
5.4.1.1 Determinação da taxa de contração e período de re-epitelização. ............................... 47
5.4.2 Ferida por incisão. ........................................................................................................... 47
5.4.2.1 Determinação da força de tensão ................................................................................. 48
5.4.2.2 Análises histopatólogicas ............................................................................................. 49
5.4.2.2.1 Preservação das amostras ......................................................................................... 49
5.4.2.2.2 Processamento das amostras .................................................................................... 50
5.4.2.2.3 Cortes e colaração. ................................................................................................... 50
5.4.2.2.4 Análises microscópicas ............................................................................................. 50
5.4.3 Determinação da atividade antioxidante in vivo ............................................................. 51
5.4.3.1 Preparação das amostras para análises enzimáticas e não enzimáticas ........................ 51
5.4.3.2 Avaliação da atividade da mieloperoxidase ................................................................. 52
5.4.3.3 Quantificação do conteúdo de glutationa ..................................................................... 52
5.4.3.4 Quantificação da atividade da catalase ........................................................................ 52
5.4.3.5 Determinação de malondialdeído. ................................................................................ 53
5.4.4 Determinação de citocinas .............................................................................................. 53
5.4.5 Determinação de óxido nítrico (NO) .............................................................................. 53
5.5 Avaliação da atividade cicatrizante in vitro. ...................................................................... 54
5.5.1 Riscamento de Monocamada Celular (Scratch Assay). ................................................. 54
5.6 Atividade Antibacteriana .................................................................................................. 54
5.7 Análises dos dados .............................................................................................................. 54
6 RESULTADOS ................................................................................................................... 55
18
6.1 Rendimento do extrato e concentração do EASg ............................................................... 55
6.2 Analises fitoquímicas ......................................................................................................... 55
6.3 Avaliação da toxicidade ...................................................................................................... 56
6.3.1 Citotoxicidade .................................................................................................................. 56
6.3.2 Viabilidade Celular. ........................................................................................................ 57
6.3.3 Ensaios de Genotoxicidade .............................................................................................. 59
6.3.3.1 Teste de Micronúcleo ................................................................................................... 59
6.3.3.2 Teste de Cometa............................................................................................................ 59
6.3.4 Toxicidade Aguda (dose única) .......................................................................................60
6.4 Avaliação da atividade cicatrizante in vivo. ....................................................................... 62
6.4.1 Ferida por excisão. .......................................................................................................... 62
6.4.1.1 Determinação da contração de ferida e período de re-epitelização. ............................. 62
6.4.2 Ferida por incisão. ........................................................................................................... 63
6.4.2.1 Determinação da força de tensão. ................................................................................ 63
6.4.2.2 Análises microsccópicas .............................................................................................. 64
6.4.3 Determinação da atividade antioxidante in vivo. ............................................................. 65
6.4.3.1 Avaliação da atividade da mieloperoxidase.................................................................. 65
6.4.3.2 Quantificação do conteúdo de glutationa ..................................................................... 66
6.4.3.3 Quantificação da atividade da catalase ........................................................................ 67
6.4.4 Determinação de citocinas e fatores de cresciemnto. ...................................................... 68
6.4.5 Determinação de óxido nítrico. ....................................................................................... 70
6.5 Avaliação da atividade cicatrizante in vitro ....................................................................... 71
6.5.1 Riscamento de monocamada celular (Scratch Assay). ................................................... 71
7 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 72
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................ 78
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 79
ANEXOS ................................................................................................................................. 94
19
RESUMO Caracterização química, avaliação da toxicidade e atividade cicatrizante de feridas do extrato
aquoso do infuso das folhas de Sorocea guilleminiana Gaudich. Figueiredo, F. F. Dissertação
apresentação ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Ciências da saúde, Área de Concentração Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Domingos Tabajara de Oliveira Martins.
Sorocea guilleminiana, Moraceae, popularmente conhecida como “espinheira-santa-falsa”, é um arbusto
ou árvore nativo (a) e endêmico (a) do Brasil, de ocorrência no Cerrado e Mata Atlantica, cuja infusão
das folhas é popularmente utilizada para tratamento de feridas, infecção, gastrite, doença renal e
inflamação. O objetivo do trabalho foi avaliar a toxicidade e atividade cicatrizante de feridas do extrato
aquoso do infuso das folhas de S. guilleminiana (EASg), em modelos experimentais in vivo e in vitro.
O EASg foi preparado pela infusão do pó das folhas em água fervente (10 g/L) por 15 min. As análises
fitoquímicas foram realizadas por cromatografia de camada delgada (CCD) e líquida de alta eficiência
(CLAE). A citotoxicidade em células epiteliais de ovário de hamster chinês (CHO-k1) e a viabilidade
em fibroblastos N3T3 do EASg (6,25 – 800 µg/mL) foram avaliadas por citometria de fluxo. A
genotoxicidade do EASg (10, 30 e 100 µg/mL) foi avaliada em células CHO-k1 pelos testes de
micronúcleo (MN) e cometa (COM). A avaliação do EASg (0,8; 4 e 20 µg/mL) sobre a
proliferação/migração foi realizada em ensaio de riscamento de monocamada em células N3T3. Para
avaliação da toxicidade aguda, foi realizada a administração oral única de EASg (até 2000 mg/Kg) em
camundongos Swiss-Webster. A atividade cicatrizante do EASg foi avaliada nos modelos de ferida por
excisão e incisão, em ratos Wistar. O mecanismo de ação cicatricial do EASg foi avaliado através da
avaliação da atividade de mieloperoxidase (MPO) e da catalase (CAT) e pelas determinações dos níveis
de glutationa (GSH), citocinas TNF-α, IL-1β, IL-17, IL-12p70 e IL-10 utilizando o modelo de ferida
por incisão. As análises fitoquímicas preliminares do extrato bruto revelaram a presença de flavonoides,
esteroides e terpenos. Não foram observadas alterações quanto à citotoxicidade, viabilidade, bem como
ausência de genotoxicidade pelo teste de MN. No teste de COM, o pré- tratamento com EASg preveniu
o dano ao DNA nas três concentrações testadas (p < 0,001), enquanto o co-tratamento reduziu o dano
apenas na menor concentração (p < 0,001). O pós-tratamento com EASg reduziu o dano genético
induzido por peróxido de hidrogênio na menor e maior concentração (p < 0,001). O EASg (0,8; 4 e 20
µg/mL) aumentou a proliferação/ migração das células N3T3 (p < 0,001). No modelo da ferida por
excisão, o EASg (2 e 50 mg/g) aumentou a taxa de contração da ferida no 5°, 7° e 9° dia (p < 0,05),
enquanto fitoscar ® (60 mg/g), padrão para este experimento, aumentou a taxa de contração no 9° dia
(p < 0,05). Não houve alteração no período de re-epitelização em nenhuma dose testada. Na ferida por
incisão, o EASg (2 e 50 mg/g) aumentou (p < 0,01) a resistência do tecido à tração. O EASg (2, 10 e 50
mg/g) e fitoscar (60 mg/g) reduziram a expressão da atividade da MPO (p < 0,001). O EASg, nas doses
de 2 e 50 mg/g aumentou os níveis teciduais de GSH (p < 0,05) e CAT (p < 0,01). O EASg não alterou
os níveis de IL- 1β, IL-10, IL-17 e TNF-α, no entanto o EASg na dose de 50 mg/g aumentou (p < 0,05)
os níveis de IL-12p70. Pode-se afirmar que o EASg é seguro quando administrado por via oral em dose
única, não apresenta citotoxicidade e genotoxicidade nos modelos testados, e ainda sugere-se potencial
antigenotoxigênico e antigenotóxico. Os resultados comprovam o uso popular do infuso de S.
guilleminiana para tratamento de feridas cutâneas, provavelmente por este estimular a proliferação de
fibroblastos com consequente deposição de colágeno e transformação em miofibroblastos, essenciais no
processo de cicatrização de feridas, em decorrência de seu efeito antioxidante, exercido possivelmente
pelos compostos fenólicos.
Palavras-chave: Sorocea guilleminiana, cicatrização de feridas, toxicidade, antigenotóxico, compostos
fenólicos.
20
ABSTRACT
Chemical characterization, evaluation of toxicity and wound healing activity of aqueous extract of the
infusion of Sorocea guilleminiana Gaudich leaves. Figueiredo, F. F. Dissertation presentation to the
Post-Graduation Program in Health Sciences, Faculty of Medicine, Federal University of Mato Grosso,
as a partial requirement for the Master Degree in Health Sciences, Area of specialization Pharmacology.
Advisor: Prof. Dr. Domingos Tabajara de Oliveira Martins.
Sorocea guilleminiana, Moraceae, popularly known as “espinheira-santa-falsa”, is a native and endemic
Brazilian shrub found in the Cerrado and Atlantic forest, whose infusion of leaves is popularly used to
treat wounds, infection, gastritis, kidney disease and inflammation. The objective of this study was to
evaluate the toxicity and wound healing activity of the aqueous extract of S. guilleminiana leaf infusion
(AESg) in experimental models in vivo and in vitro. The AESg was prepared by infusion, the leaves
powder was mixed in boiling water (10 g/L) for 15 min. Phytochemical analyzes were performed by
thin layer (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). Cytotoxicity in Chinese hamster
ovary epithelial cells (CHO-K1) and cell viability of AESg in N3T3 fibroblasts (6.25 - 800 μg/mL) were
assessed by flow cytometry. The genotoxicity of AESg (10, 30 and 100 μg/mL) was evaluated in CHO-
K1 cells by the micronucleus (MN) and comet (COM) tests. The evaluation of AESg (0.8, 4 and 20
μg/mL) on proliferation/migration was performed in a monolayer scratch test in N3T3 cells. For acute
toxicity assessment, single oral administration of AESg (up to 2000 mg/kg) in Swiss-Webster mice was
performed. The wound healing activity of the AESg was evaluated in the excision and incision wound
models in Wistar rats. The wound healing mechanism of action of the AESg was assessed through the
evaluation of activity of myeloperoxidase (MPO) and catalase (CAT) and by the determinations of the
levels of glutathione (GSH), cytokines TNF-α, IL-1β, IL-17, IL-12p70, and IL-10 using the incision
wound model. Preliminary phytochemical analyzes of the crude extract revealed the presence of
flavonoids, steroids and terpenes. No changes were observed regarding cytotoxicity, viability, as well
as absence of genotoxicity by MN test. In the COM test, pre-treatment with AESg prevented DNA
damage at the three concentrations tested (p<0.001), while co-treatment reduced the damage only at the
lowest concentration (p<0.001). Post-treatment with AESg reduced the genetic damage induced by
hydrogen peroxide in the lowest and highest concentration (p<0.001). AESg (0.8, 4 and 20 μg/mL)
increased proliferation/migration of N3T3 cells (p<0.001). In the excision wound model, AESg (2 and
50 mg/g) increased the rate of wound contraction on the 5th, 7thand 9thday (p<0.05), while Fitoscar® (60
mg/g), standard for this experiment, increased the rate of contraction at day 9 (p<0.05). There was no
change in the re-epithelialization period at any dose tested. In the incision wound AESg (2 and 50 mg/g)
was increased (p<0.01) tissue resistance to traction. AESg (2, 10 and 50 mg/g) and Fitoscar® (60 mg/g)
reduced the MPO activity (p<0.001). AESg at doses of 2 and 50 mg/g was increased levels of GSH
(p<0.05) and CAT (p<0.01). AESg did not alter the levels of TNF-α, IL-1β, IL-17 and IL-10, however,
AESg at 50 mg/g increased (p<0.05) IL-12p70 levels. It can be stated that AESg is safe when
administered orally in a single dose, does not present cytotoxicity and genotoxicity in the models tested,
and antigenotoxic potential is suggested. These results confirm the popular use of infusion of S.
guilleminiana for treatment of cutaneous wounds, probably because it stimulates the proliferation of
fibroblasts with consequent deposition of collagen and transformation in myofibroblasts are essential in
the process of wound healing, due to its antioxidant effect, possibly exerted by phenolic compounds.
Keywords: Sorocea guilleminiana, wound healing, toxicity, antigenotoxicity, phenolic compounds.
21
1. INTRODUÇÃO
1.1 A pele
A pele (Figura 1) é o maior órgão do corpo humano, constituído por duas camadas, a
epiderme e a derme. Sua principal função é a proteção mecânica contra agentes lesivos de
origem física, química e biológica, além de auxiliar na homeostasia, termorregulação e síntese
de vitamina D (SZWED & SANTOS, 2015).
A epiderme apresenta um epitélio escamoso estratificado pavimentoso queratinizado e sofre
constante rotatividade, se regenerando a cada 48 horas. O estrato basal se comunica com as camadas
mais internas enviando projeções que se assemelham aos dedos que alcançam a derme (NYAME et
al., 2014). O epitélio da pele delgada se divide em quatro camadas: córnea, granulosa, espinhosa e
germinativa, sendo a primeira a mais externa ao organismo. As células predominantes na epiderme
são os queratinócitos, que estão sempre em constante proliferação na camada mais íntima,
movimentando as células mais velhas para a superfície, e assumindo uma forma mais achatada.
Após a perda nuclear, os queratinócitos formam o estrato córneo, a parte mais superficial da pele.
Esse tipo celular é o principal responsável pela resposta da cicatrização de feridas (NYAME et al.,
2014; GANTWERKER; HOM, 2012).
A derme localizada abaixo da epiderme, confere uma base firme para sua sustentação. É
composta de tecido conjuntivo frouxo e denso não modelado, ricos em vasos, glândulas
sebáceas, sudoríparas, folículos pilosos e corpúsculos tácteis, sendo dividida em duas camadas:
a papilar, a mais superficial, na qual são encontradas as papilas dérmicas e fibras conjuntivas
frouxas e elásticas que estão perpendiculares à junção dermo-epidérmica, sendo muito
vascularizada, e a reticular a mais profunda e densa, formada por fibras conjuntivas não-
remodeladas e as fibras elásticas em plexos (KOLARSICK et al., 2011).
A derme apresenta como principal linhagem celular os fibroblastos. São células que
possuem prolongamento citoplasmático, capacidade de adaptação, que podem se diferenciar em
fibrócitos ou miofibroblastos. Estes últimos são tipos celulares com características entre
fibroblasto e célula muscular lisa e atuam principalmente no processo de contração centrípeta
de feridas. Os fibroblastos atuam na composição da matriz extracelular (ME), por meio da
síntese de colágeno, elastina e substância fundamental amorfa (LIMA, 2010).
Logo abaixo da derme encontra-se o tecido subcutâneo essencial para o amortecimento de
traumas, isolamento e reserva calórica. Os adipócitos são células especializadas na síntese e
armazenamento de gordura ao longo da vida. Estima-se que 80% da gordura do organismo esteja
22
armazenada e distribuída no tecido subcutâneo. Além disso, esse tecido desempenha também uma
função endócrina, secretando a leptina e também auxiliando no remodelamento e na fagocitose
(CHU, 2008; BURNS et al., 2010). A leptina é um hormônio produzido, principalmente pelos
adipócitos, que atua na homeostase energética e funciona como um sinalizador da quantidade de
energia e gordura acumulada (LAUA et al., 2014).
Figura 1. A. Representação do corte histológico da pele e da derme ampliada (B).
A B
Fonte: A. COCHARD et al., 2003 e B. GRAY et al.,1995 adaptadas.
1.2 Classificação das feridas
Quanto à causa, as feridas podem ser classificadas em cirúrgicas, traumáticas e
ulcerativas. As feridas cirúrgicas do tipo incisão são caracterizadas pela ausência de perda
substancial de tecido, com bordas geralmente aproximadas por sutura, enquanto as do tipo de
excisão há remoção da pele. Já as feridas traumáticas são as provocadas acidentalmente por um
agente de origem mecânica (ex. contusão, perfusão ou corte), química (ex. iodo, cosmético,
ácido sulfúrico) ou física (ex. frio, calor ou radiação) (ETHRIDGE; LEONG; FHILLIPS, 2010).
Já as feridas do tipo ulcerativas são escavadas, circunscritas à pele, apresentando necrose de
tecidos resultantes de traumatismos ou doenças relacionadas com o suprimento sanguíneo
inadequado (SANTOS, 2011).
Quanto ao conteúdo microbiano, as feridas podem ser limpas, potencialmente
contaminadas, contaminadas ou infectadas (SANTOS, 2011). As feridas limpas são as que não
apresentam sinais de infecção; as potencialmente contaminadas são os ferimentos que
apresentam contaminação grosseira, em acidente doméstico, por exemplo, as feridas
contaminadas são feridas causadas em acidentes, que não foram devidamente higienizadas, e
23
que tiveram contato com terra e fezes, por exemplo, com sinais nítidos de infecção.
Quanto ao tipo de cicatrização, as feridas podem ser de primeira, segunda ou terceira
intenção. A cicatrização de primeira intenção ocorre quando há aproximação direta das bordas
da ferida, em geral pela sutura cirúrgica. A de segunda intenção se dá por meio do processo
biológico natural sem a aproximação das bordas, sendo o processo de cicatrização mais lento,
quando comparado com a de primeira intenção (MAUAD, 2005). Já a de terceira intenção,
acontece, quando as feridas são corrigidas cirurgicamente após a formação de tecido de
granulação ou para controle da infecção, a fim de que apresentem melhores resultados
funcionais e estéticos (SANTOS, 2011).
Quanto ao grau de abertura da lesão, as feridas podem ser: abertas ou fechadas. As feridas
são abertas quando as bordas da pele estão afastadas, enquanto nas fechadas as bordas da pele
estão justapostas (SANTOS, 2011).
Quanto ao tempo de traumatismo as feridas podem ser agudas ou crônicas, sendo as
feridas agudas aquelas originadas de cirurgia ou traumas, nestes casos a reparação ocorre em
tempo adequado, sem complicações, enquanto que nas feridas crônicas há déficit de tecido
resultante de lesão ou insulto duradouro e elas não cicatrizam facilmente (ETHRIDGE;
LEONG; FHILLIPS, 2010).
1.3 Processo de cicatrização
A cicatrização de feridas consiste em um processo organizado da cascata de eventos
celulares e bioquímicos que interagem para regeneração e a reconstituição do tecido lesionado,
pela liberação de vários fatores de crescimento, citocinas e compostos sanguíneos de baixo peso
molecular que regulam e modelam este processo (YOUNG; MCNAUGHT, 2011; REINKE;
SORG, 2012).
Há diversos fatores que podem afetar positiva ou negativamente o processo de
cicatrização. Fatores positivos que afetam a cicatrização são feridas limpas, umidade, utilização
de antissépticos com ação antimicrobiana, já os fatores que afetam negativamente são
contaminação ambiental, infecção sistêmica concomitante, deficiência nutricional, doenças
sistêmicas associadas, como diabetes e obesidade mórbida contribuem negativamente para a
cicatrização (ISSAC et al., 2010).
O processo de cicatrização, segundo Clark (1985), é divido em três fases: fase
inflamatória, proliferativa ou de granulação e de remodelagem ou de maturação. Todas essas
fases estão interrelacionadas. A mesma lesão pode apresentar vários estágios de cicatrização
24
simultaneamente, podendo estar infectada, com tecido de granulação e/ou tecido necrótico
(RAWAT et al., 2012).
1.3.1 Fase inflamatória
A fase inflamatória inicia logo ao surgimento da lesão com liberação de substâncias
vasoconstritoras como primeira resposta (CAMPOS; BORGES-BRANCO; GROTH, 2007;
RAWAT et al., 2012).
No local onde o endotélio é lesado há um estímulo para que se inicie a cascata de
coagulação visando a homeostasia. Quando a cascata é iniciada são liberados fatores de
crescimento de plaquetas, tais como fator de crescimento transformador beta (TGF-β) e também
o fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF), fator de crescimento derivado dos
fibroblastos (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), prostaglandinas (PGs) e
tromboxanas (TXs), que atraem neutrófilos a ferida (ISSAC et al., 2010).
Após 24 h da lesão, as substâncias quimiotáticas liberadas pelas plaquetas atraem
neutrófilos para o local. Essas células são as primeiras a chegar em maior concentração e a
produzir radicais livres que ajudam na eliminação de bactérias (SZWED & SANTOS, 2015).
Após 48 até 96 h, os macrófagos migram para a ferida. Essas células desempenham papel
fundamental no final do desbridamento iniciado pelos neutrófilos (SZWED & SANTOS, 2015).
A IL-17 é uma citocina pró-inflamatória, que leva à formação de IL-6 e IL-8 (quimiocina)
e da molécula de adesão intercelular em fibroblastos humanos. A produção de citocinas pró-
inflamatórias como fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina 1 (IL-1) e interleucina
6 (IL-6) ocorre rapidamente após a lesão. TNF-α e IL-1 são os principais mediadores da resposta
inflamatória aguda, exercendo papéis importantes na ativação de células endoteliais, induzindo
a produção de óxido nítrico (NO), assim como aumento da expressão de moléculas de adesão,
que contribuem para o recrutamento e acúmulo de mais fagócitos na área inflamada. A IL-10
inibe as citocinas pró-inflamatórias, principalmente TNF α, IL-1 e IL-6, produzidas por
macrófagos e monócitos ativados, estimulando a produção endógena de citocinas anti-
inflamatórias. Além disso, aumenta a proliferação de mastócitos e impede a produção de IFNγ
pelas células matadoras naturais (PARK et al., 2010).
A fase inflamatória também é modulada por quimiocinas, como a proteína inflamatória
macrofágica (MIP), a proteína quimiotática de monócito - 1 (MCP-1), ativação de regulação de
células T normais (RANTES) e a interleucina - 8 (IL-8). As MIP integram os eventos
inflamatórios e de reparo tecidual, sendo responsáveis pelo acúmulo inicial de macrófagos nesta
25
fase (VITORINO FILHO, 2011).
Os macrófagos são grandes células, derivadas de monócitos, que desempenham papel
chave na continuidade do processo cicatricial, por secretarem os principais fatores de
crescimento e citocinas. Os sinalizadores químicos produzidos por eles atraem mais macrófagos
para o local e intensificam a migração e proliferação de fibroblastos, principais componentes
do tecido de granulação, e células endoteliais promotoras da angiogênese. Os macrófagos
produzem fatores de crescimento incluindo o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).
Tantas propriedades essenciais tornam o macrófago um elo de transição entre a fase
inflamatória e a proliferativa (VITORINO FILHO, 2011).
1.3.2 Fase proliferativa
A fase proliferativa tem início 96 h após a lesão e estende-se até o final da segunda
semana. É dividida em três etapas: re-epitelização, angiogênese e formação de tecido de
granulação (ABEGÃO, 2014).
As respostas inflamatórias iniciais à lesão fornecem a estrutura essencial para a formação
de uma posterior barreira funcional (LI; CHEN; KIRSNER, 2007). Nessa fase verifica-se um
franco predomínio de mecanismos celulares que permitem a produção de uma nova barreira
permeável (re-epitelização), neovasos (angiogênese) e reestruturação da integridade da derme
(fibroplasia) (LAURENANO & RODRIGUES, 2011).
A re-epitelização ocorre, precocemente, se a membrana basal estiver intacta. As células
epiteliais migram em direção superior e as camadas normais da epiderme são restauradas em
três dias. Se houver lesão na membrana basal, as células epiteliais das bordas da ferida começam
a proliferar tentando restabelecer a barreira protetora (ABEGÃO, 2014).
A angiogênese é estimulada pelo fator de necrose tumoral alfa (TNF- α), e é essencial
para o suprimento de oxigênio e nutrientes para a cicatrização (MANDELBAUM; SANTIS;
MANDELBAUM, 2003). Esta necessidade nutricional e de oxigênio é determinada pelos
capilares sanguíneos neoformados. As células endoteliais formam brotos nas extremidades de
capilares intactos e crescem para dentro da área lesada para juntar-se a outros brotos a fim de
formarem uma rede de capilar. Esta nova rede capilar preenche totalmente o leito da lesão e,
junto com o colágeno, forma o tecido de granulação (ABEGÃO, 2014).
O tecido de granulação é a parte final da fase proliferativa, sendo as principais células da
fase proliferativa os fibroblastos e as células endoteliais (ABRACEZE, 2013).
Para que os fibroblastos que estão no tecido vizinho migrem para o local da ferida
26
precisam ser ativados para sair de seu estado de quiescência. O PDGF é o fator de crescimento
mais importante na proliferação e ativação dos fibroblastos, os quais liberam o TGF-β que
estimula os fibroblastos a produzirem colágeno tipo I e a transformarem-se em
miofibroblastos que promovem o fechamento da ferida (PAGGIARO; NETO; FERREIRA,
2010).
Outros fatores de crescimento envolvidos no processo cicatricial são: o fator epidérmico,
que estimula a epitelização; o fator transformador de crescimento alfa (TGF-α), responsável
pela angiogênese e epitelização; o fator fibroblástico, que estimula a proliferação celular e
angiogênese e o TGF-β, responsável pelo aumento da síntese matricial (CAMPOS; BORGES-
BRANCO; GROTH, 2007).
1.3.3 Fase de remodelagem ou maturação
Na fase de remodelação atuam os fibroblastos que produzem o colágeno e o deposita de
maneira organizada. O colágeno é uma proteína encontrada abundantemente na matriz
extracelular (MEC), fundamental na organização do tecido e na resistência, sendo a mais
abundante do tecido conectivo em fase de cicatrização (PAGGIARO; NETO; FERREIRA,
2010).
O colágeno produzido inicialmente é mais fino do que o colágeno presente na pele
normal, e tem orientação paralela à pele. Com o tempo, o colágeno inicial (colágeno tipo III) é
reabsorvido e um colágeno mais espesso é produzido e organizado ao longo das linhas de tensão
(colágeno tipo I). Estas mudanças se refletem em aumento da força tênsil da ferida. A lise da
matriz antiga é promovida por colagenases que são secretadas por fibroblastos e leucócitos. A
cicatrização tem sucesso quando há equilíbrio entre a síntese da nova matriz e a lise da matriz
antiga, havendo sucesso quando a deposição é maior (LIMA & ARAUJO, 2013).
Na evolução das fases de cicatrização (Figura 2), ocorre um dinamismo de sobreposição,
observando uma correlação entre o aparecimento do colágeno maduro e o aumento da
resistência tênsil da ferida.
Figura 2. Fases da cicatrização e a deposição dos componentes da matriz cicatricial ao longo
do tempo. Fonte: BROUGHTON et al., 2006 adaptado.
27
Fases da cicatrização de ferida
O processo de cicatrização de uma ferida pode ser acompanhado de diversas formas. Na
avaliação subjetiva, realizando acompanhamento clínico que será considerado satisfatório
quando ocorrer o fechamento completo da ferida. Na avaliação objetiva, diversas técnicas
podem ser utilizadas para determinar a evolução do reparo tecidual de forma mais precisa.
Dentre essas técnicas estão: a planimetria digital, a tensiometria, a microscopia, a
histomorfometria, a imunohistoquímica, entre outras. O conhecimento e a combinação de
diferentes métodos complementares de avaliação são essenciais para tornar o acompanhamento
da cicatrização mais completo e preciso (TAZIMA; VICENTE; MORIYA, 2008).
1.4 Farmacoterapia da cicatrização
A preocupação com o tratamento de feridas é descrita desde a antiguidade, por Hipócrates
e Celsus. Na pré-história, agentes como extratos de plantas, água, neve, gelo, frutas e lama eram
aplicados sobre as feridas. Na Mesopotâmia, as feridas eram lavadas com água ou leite e o
curativo realizado com mel ou resina. Lã de carneiro, folhas e cascas de árvores eram utilizadas
para sua cobertura. Os egípcios concluíram que uma ferida fechada cicatrizava mais rápido do
que uma aberta e, por isso, utilizavam tiras de pano para manter unidas as margens da lesão
(JORGE, 2008).
Hipócrates, que lançou as bases da medicina cientifica, recomendava que as feridas
fossem mantidas limpas e secas, e preconizava sua limpeza com água morna, vinho e vinagre
28
(DEALEY, 2001). Já no final de 1840 e a Segunda Guerra Mundial, o foco para tratamento de
feridas era a utilização de antissépticos, agentes com ação antimicrobiana e a proteção com
coberturas secas. Nessa época baseavam-se na crença de que o ambiente seco proporcionava
melhores condições de cicatrização, sendo largamente desenvolvidos e utilizados agentes
tópicos que provocam o dessecamento do leito da ferida, e as coberturas consistiam basicamente
de gaze seca, fixada com espessa camada de fitas adesivas (ERENO, 2003).
Embora já se aceitasse que o pressuposto de que a criação de um ambiente úmido na
ferida trazia efeitos extremamente benéficos para o processo cicatricial, bem como reduzia a
dor, devido à proteção das terminações nervosas contra o dessecamento, até início da década
de 1960 esses recursos ainda não estavam sendo desenvolvidos pela indústria. Só a partir de
1962, quando Winter e Roove (1962) demonstraram que a taxa de epitelização era 50% mais
rápida em um ambiente úmido e que a formação de crostas era minimizada, houve grande
interesse pelo desenvolvimento de pesquisas, produção e comercialização desse tipo de recurso,
ocorrendo uma verdadeira “revolução no conceito de curativos” (MANDELBAUM; SANTIS;
MANDELBAUM, 2003).
Os medicamentos comumente usados e que têm um impacto significativo na cicatrização
de feridas, abrangem os anti-inflamatórios (esteroides- AIEs e não esteroides - AINEs) e
quimioterápicos (antissépticos e antibióticos) (GUO & DIPIETRO, 2010).
Os glicocorticóides sistêmicos (GC), que são freqüentemente usados como agentes anti-
inflamatórios, sendo conhecidos por inibir a ferida repando-a através de efeitos anti-
inflamatórios globais e supressão de respostas de feridas celulares, incluindo a proliferação de
fibroblastos e síntese de colágeno. Os esteroides sistêmicos fornecem a recuperação da ferida
com a incompleta granulação e reduzem a contração da ferida (FRANZ et al., 2007). Os
glicocorticoides também inibem a produção do fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF-
1), um fator transcricional chave na cicatrização de feridas (WAGNER et al., 2008). Além dos
efeitos sobre o próprio reparo, os corticosteroides sistêmicos podem aumentar o risco de
infecção da ferida. Enquanto os corticosteróides aumentam o risco da nfecção da ferida, a
aplicação tópica produz efeitos bastante diferentes. Tratamento tópico de baixa dosagem de
corticosteroides em feridas crônicas foi introduzido para acelerar a cicatrização de feridas,
reduzir a dor e exsudar e suprimir a formação de tecido de hipergranulação em 79% dos casos.
Embora esses efeitos positivos sejam impressionantes, um monitoramento cuidadoso é
necessário para evitar um potencial risco aumentado de infecção com uso prolongado
(HOFMAN et al., 2007).
29
Os AINEs, como o ibuprofeno, são amplamente utilizados para o tratamento de
inflamações e artrite reumatóide e dor (PIERINGER et al., 2007). Existem alguns achados que
sugerem que os AINEs de curto prazo têm um impacto negativo na cura. Contudo, permanece
aberta a questão se o uso de AINEs, em longo prazo, interfere com a cura da ferida. Em modelos
animais, o uso sistêmico de ibuprofeno demonstrou efeito anti- proliferativo na cicatrização de
feridas, resultando em diminuição do número de fibroblastos, ruptura enfraquecida força,
redução da contração da ferida, epitelização retardada (DONG et al., 1993; DVIVEDI et al.,
1997; KRISCHAK et al., 2007) e angiogênese comprometida (JONES et al., 1999). Os efeitos
da baixa dose da aspirina na cura não é completamente clara. Em termos de aplicação tópica de
AINEs nas superfícies de feridas crônicas, uso local de ibuprofeno fornece a cicatrização de
feridas úmidas, reduz a persistência e dor temporária da ferida e beneficia a cicatrização venosa
crônica de úlcera na perna (PRICE et al., 2007).
A maioria dos fármacos quimioterápicos é projetada para inibir células do metabolismo,
divisão celular rápida e angiogênese e assim inibe muito dos caminhos que são críticos para o
reparo de ferida. Esses medicamentos inibem síntese do DNA, RNA e a síntese de proteínas,
resultando na diminuição da fibroplasia e neovascularização de feridas (WALDRON &
ZIMMERMAN-POPE, 2003; FRANZ et al., 2007). O uso de antibioticos atrasa a migração
celular da ferida, precocemente reduz a formação de matriz de feridas, causa menor produção
de colágeno, prejudica a proliferação de fibroblastos e inibe a contração das feridas (FRANZ et
al., 2007). Além do que, esses agentes enfraquecem o sistema imune dos pacientes, e, assim,
impedem a fase inflamatória de cura e aumenta o risco de infecção da ferida. Também induzem
neutropenia, anemia e trombocitopenia, deixando as feridas vulneráveis à infecção, causando
menor fornecimento de oxigênio para às mesmas e tornam os pacientes vulneráveis ao
sangramento excessivo no local da ferida (GUO & DIPIETRO, 2010).
Os antibióticos constituem parte essencial do tratamento de feridas infectadas. Com o
passar dos anos, verificou-se o surgimento de resistência microbiana à antibioticoterapia,
exigindo o lançamento de novas classes antibióticas com custos mais elevados e, portanto, de
difícil acesso às populações menos favorecidas. A fitoterapia é uma prática bastante utilizada
pelas comunidades rurais para o tratamento de feridas e as plantas medicinais representam uma
fonte importante de recurso terapêutico (SOUZA, 2010).
1.5 Plantas medicinais
Ao longo dos tempos a sabedoria popular vem sendo transmitida de forma empírica entre
30
as gerações. O conhecimento tradicional sobre o uso das plantas é vasto e, em muitos casos, é
o único recurso disponível que a população rural de países em desenvolvimento tem ao seu
alcance (DE JESUS, 2009).
A atenção dirigida pelas autoridades e administrações de saúde para o uso de plantas
medicinais aumentou consideravelmente nos últimos anos, por diferentes razões e em diferentes
setores. Incentivo em investimentos públicos em plantas medicinais tem sido feito pela OMS
desde 1978, observando-se crescente aceitação da fitoterapia por profissionais de saúde da
atenção básica assim como a observação do aumento de seu uso pela população (SIVEIRA;
BANDEIRA; ARRAIS, 2008).
Atualmente, observa-se um crescimento na utilização de fitoterápicos pela população
brasileira. Alguns fatores poderiam explicar o aumento do uso desses medicamentos, como os
avanços ocorridos na área cientifica que permitiram o desenvolvimento de medicamentos
fitoterápicos reconhecidamente seguros e eficazes, como também uma forte tendência de busca,
pela população, por terapias menos agressivas destinadas ao atendimento primário à saúde
(RIBEIRO, 2005).
As plantas medicinais além do uso tradicional e empírico “in natura” ou processada de
maneira simples (chás, garrafadas, banhos, etc), são muito importantes para a pesquisa
farmacológica e para desenvolvimento de novos medicamentos, quando suas partes ou seus
constituintes químicos são usados diretamente como agentes terapêuticos (fitoterápicos ou
medicamentos que contêm fitofármacos), mas também como matéria-prima para a semissíntese
de fármacos ou ainda como modelo (templates) para o modelo para desenvolvimento de
compostos farmacologicamente ativos (SOUZA, 2010).
Dentre 520 medicamentos aprovados no período de 1983 a 1994 pela agência americana
Food and Drug Administration (FDA) e por outras similares em diversos países, 30
medicamentos eram derivados diretamente de produtos naturais, plantas em sua maioria, e 173
foram desenvolvidos a partir de fármacos semissínteticos de um produto natural como modelo
para sua síntese (SOUZA, 2010).
É recomendação da Organização Mundial de Saúde (OMS) a incorporação de práticas de
saúde envolvendo plantas medicinais e seus derivados aos sistemas públicos de saúde. De
acordo com a OMS, 80% da população mundial depende ou faz uso de algum tipo de planta
31
tradicional no tratamento de suas doenças, e desta, em média 85% utilizam alguma planta, seus
extratos vegetais e seus princípios ativos na composição medicamentosa (SILVA, 2002), devido
ao custo elevado de medicamentos provenientes das indústrias e a facilidade de acesso a estas
drogas vegetais. Esses produtos são utilizados para várias finalidades, em diversas sistemas de
medicina (alopatia, homeopatia, fitoterapia, entre outros), baseados em evidências históricas ou
pessoais, onde geralmente não são atribuídos nenhum evento adverso (SILVA, 2002).
Vê-se nas plantas medicinais um infindável número de substâncias aplicáveis como
recurso terapêutico, em vista de que há aproximadamente 420 mil espécies vegetais
catalogadas, porém somente 5% destas têm sua composição química e atividade biológica
investigada.
O Brasil se destaca no cenário global como o país detentor da maior biodiversidade
vegetal do Planeta, englobando aproximadamente 56.000 espécies vegetais, correspondendo a
aproximadamente 22% do total mundial (MASCARENHAS, 2009). Possui ainda uma rica
diversidade cultural, contando povos indígenas, quilombolas, pescadores artesanais,
agricultores familiares, sertanejos, ribeirinhos, entre outros, que estão diretamente em contato
com a biodiversidade e têm contribuído para o conhecimento de espécies referidas como
medicinais (BIESKI et al., 2015). O Brasil possui 6 domínios fitogeográficos: Floresta
Amazônica, Floresta Atlântica, Cerrado, Pantanal, Caatinga e Pampas, reconhecidos pela
diversidade biológica e presença de espécies endêmicas (YUNES et al., 2001).
O Estado do Mato Grosso se destaca por apresentar três dos principais biomas brasileiros:
a Floresta Amazônica, Cerrado e Pantanal. Também conta com diversas comunidades
tradicionais, distribuídas em todo o território, formadas por índios e não índios (MATO
GROSSO, 2012).
A Amazônia Legal foi criada por força da lei militar e é um termo político, abrangendo
todos os estados da região Norte, parte oeste do Maranhão, na região nordeste e a maior parte
do Mato grosso, na região Centro-Oeste. Possui área de 5.217.423 km2, o que representa 60%
do território nacional, dos quais 80% ocupados pela Amazônia (SANTOS et al., 2009).
Um das plantas de ocorrência na região do Vale do Juruena, Mato Grosso, Amazônia
Legal e com uso popular para o tratamento de feridas é a Sorocea guilleminiana Gaudich, objeto
desse estudo.
32
1.6 Sorocea guilleminiana Gaudich.
Sorocea guilleminiana (S. guilleminina) é um arbusto ou árvore, pertencente à família
Moraceae, endêmica e nativa do Brasil (Figura 3), distribuída nas regiões Centro-Oeste (Distrito
Federal, Goiás e Mato Grosso), Sudeste (Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e São
Paulo) e parte do Nordeste (Bahia e Maranhão). Ocorre também na Serra da Mantiqueira, nos
estados de Minas Gerais e Rio de Janeiro, habitando áreas de floresta ombrófila densa,
estacional semidecidual e cerrado (http://floradobrasil.jbrj.gov.br).
Na maior parte do Brasil é conhecida popularmente como espinheira-santa-falsa, bainha-
de-espada, pau-tiu, tendo como sinônimos: Balanostreblus ilicifolius Kurz; Sorocea
castaneifolia Huber; Sorocea grandifolia S. Moore; Sorocea hilariana (Casar.) Bureau;
Sorocea houlletiana Gaudich.; Sorocea jureiana Romaniuc; Sorocea klotzschiana Baill.;
Sorocea macrogyne Lanj. & Wess. Boer e Trophis hilariana Casar.
Figura 3. Mapa da distribuição geográfica da planta Sorocea guilleminiana nas regiões do
Brasil. Fonte:http://florabrasil.jbrj.gov.br/reflora/floradobrasil/FB28113>.Acesso em: 22 de
outubro de 2016.
Bieski et al. (2015), em levantamento realizado junto à população do vale do Juruema
– MT, relatam o uso do infusão das folhas de S. guilleminiana para cicatrização de
33
feridas,estômago, inflamação e como diurético. Segundo Medeiros et al. (2005) S.
guilleminiana o chá obtido a partir do cozimento das folhas tem amplo e reconhecido uso para
problemas gástricos.
2. JUSTIFICATIVA
As feridas crônicas e seu tratamento geram uma enorme carga sobre o sistema de saúde,
tanto em termos de custos e a intensidade de cuidados (WYSOCKI, 1996).
As plantas medicinais e outros produtos naturais são recursos terapêuticos amplamente
utilizados no auxílio da cicatrização de feridas cutâneas, podendo afetar duas das três fases do
processo de reparo (GURTNER et al., 2008).
Apesar de existir um grande número de produtos disponíveis para o tratamento de feridas,
ainda se buscam substâncias de uso tópico com este propósito, tanto pela necessidade de
ampliação do arsenal terapêutico, quanto pela existência de controvérsias sobre o tratamento
de feridas; ademais, há escassez de informações acerca dos efeitos adversos provocados por
alguns componentes dos produtos comumente utilizados (FERREIRA, 2013).
Os preparados caseiros das folhas de S. guilleminiana têm amplo uso pela população que
habita a Região Central do Brasil como cicatrizante de feridas cutâneas, no entanto, até a
presente data, nenhum estudo farmacológico foi realizado para comprovar o uso das folhas de
S. guilleminana no tratamento de feridas cutâneas.
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Avaliar a atividade e os mecanismos de ação cicatrizante do extrato aquoso das folhas
de Sorocea guilleminiana (EASg), em modelos experimentais in vitro e in vivo, bem como
realizar análises fitoquímicas do extrato.
3.2 Especificos
Proceder com as análises químicas qualitativas e quantitativas do EASg;
Avaliar a toxicidade in vivo do EASg;
Avaliar o potencial citotóxico do EASg in vitro;
Avaliar o potencial genotóxico do EASg in vitro;
Avaliar a atividade cicatrizante do EASg em modelo de ferida por excisão e
34
incisão em ratos;
Avaliar a atividade antioxidante do EASg in vivo;
Avaliar a participação do NO na ação cicatrizante do EASg, em modelo de
ferida por incisão em ratos;
Avaliar a participação das citocinas pró- e anti-inflamatórias na ação cicatrizante
do EASg, em modelo de ferida por incisão em ratos;
Avaliar a atividade proliferativa/migratória do EASg in vitro e;
Avaliar o potencial antibacteriano do EASg in vitro.
4. MATERIAL
4.1 Botânico
Cinco quilos (5 kg) de folhas de Sorocea guilleminiana foram coletados, na Chácara
Comunidade Quilombola Campina de Pedro, Poconé, Mato Grosso, Brasil, coordenadas GPS:
S 16° 0.1247’ W 056° 56.705’, com autorização da proprietária da área, Dona Maria Evódia,
após obtenção da autorização (n°. 010728/2013-9) pelo Conselho Gestão de Patrimônio
Genético do Ministério do meio Ambiente (CGen/MMA), Brasil e Secretaria de Estado de Meio
Ambiente (SEMA, nº. 022/2011).
A planta foi identificada e autenticada pelo taxonomista Prof. Dr. Germano Guarim Neto,
do Departamento de Botânica e Ecologia, da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT) e
amostras testemunhas da planta contendo flores encontram-se depositadas no Herbário UFMT
(exsicata BI - 882).
4.2 Animais
Foram utilizados camundongos albinos da espécie Mus musculus, variedade Swiss-
Webster, pesando entre 25-30 g e ratos albinos da espécie Rattus norvegicus, variedade Wistar,
pesando entre 180-200 g, ambos provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de
Mato Grosso. Todos os animais foram acondicionados em gaiolas de polipropileno com tampa
inox modelo UFMT, com água ad libitum e dieta apropriada com ração Nuvilab® (Quimtia,
Paraná, Brasil) ad libitum, mantidos em condições controladas de temperatura (25 ± 1 ºC),
ciclos claro/escuro de 12 h e adaptados às condições laboratoriais por no mínimo 48 h. Quando
necessário, os animais foram submetidos à jejum alimentar de 18 h, em gaiolas de polipropileno
com grades anticoprofágica e água ad libitum até 1 h antes de cada experimento, utilizando-se
grupos de 6 - 7 animais. Os experimentos com animais foram realizados somente após a
35
autorização pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA/UFMT), sob n°
23108.175769/2016-53.
4.3 Linhagens celulares
Para os ensaios in vitro foram utilizadas células epiteliais de ovário de hamster chinês
(CHO-k1 ATCC CCL-61) adquiridos do Banco de Células da Rio de Janeiro (BCRJ) e
fibroblastos (N3T3 ATCC CRL-1658). Após descongeladas, as células foram mantidas em
meio Eagle modificado por Dulbecco’s (DMEM) + HAM F12, suplementado com 10% de soro
bovino fetal (SBF), acrescidos de penicilina (110 U/mL), estreptomicina (100 µL/mL) e
anfotericina B (1 µg/mL), ambas incubadas a 37°C com atmosfera de 5% de CO2.
4.4 Microrganismos
Para os ensaios antimicrobianos foram utilizadas cepas de bactérias provenientes da
American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA). Essas foram mantidas
congeladas em leite desnatado Molico® e subcultivadas dois dias antes dos ensaios para
impedir transformações pleomórficas. Bactérias: Escherichia coli 25922, Pseudomonas
aeruginosa 27853, Salmonella typhimurium 14028, Shigella flexneri 12022, Enterococcus
faecalis 29212, Staphylococcus aureus 25923, Staphylococcus epidermidis 12228 e
Streptococcus pyogenes 19615.
4.5 Drogas, reagentes, meios de cultura e corantes
As drogas, reagentes e corantes utilizados durante a realização dos ensaios
farmacológicos foram de pureza analítica, conforme Quadro 1.
Quadro 1. Drogas, reagentes e corantes utilizados nos ensaios farmacológicos.
PRODUTO MARCA País
5,5 ditiobis (2-nitrobenzóico) (DTNB) SIGMA Brasil
Acetato de sódio anidro MERCK Brasil
Acetona PRO ANALYSI Brasil
Ácido acético glacial SYNTH Brasil
Ácido clorídrico MERCK Brasil
Ácido tânico SYNTH Brasil
Ácido tiobarbitúrico (TBA) SIGMA Brasil
36
Ácido tricloroacético (TCA) VETEC Brasil
Albumina sérica bovina SIGMA Brasil
Álcool butílico VETEC Brasil
Álcool etílico absoluto TEDIA Brasil
Álcool metílico (metanol) SYNTH Brasil
Anfotericina B SIGMA Brasil
Anidrico acético MERCK Brasil
Anisaldeído sulfúrico
Azul de alamar INVITROGEN Brasil
Azul de Evans FLUKA Brasil
Azul de Trypan SIGMA Brasil
BHI caldo NEWPROV Brasil
Bicarbonato de sódio SYNTH Brasil
Brometo de hexadeciltrimetlamônio
(HTAB)
SIGMA Brasil
Butilidroxitolueno (BHT) LABSYNTH Brasil
Carbonato de sódio VETEC Brasil
Cetamina 10% SYNTEC Brasil
Citocalasina B SIGMA Brasil
Citrato de sódio dihidratado VETEC Brasil
Claritromicina MEDLEY Brasil
Cloreto de alumínio MERCK Brasil
Cloreto de potássio MERCK Brasil
Cloreto de sódio SYNTH Brasil
Cloreto Férrico MERCK Brasil
Clorofórmio MERCK Brasil
Corante panótico rápido Newprow Brasil
Creme não iônico ÚNICA Brasil
Cromatoplacas de sílica GF254 MERCK Brasil
Dicloridrato de o-dianasidina SIGMA Brasil
Diclorometano SIGMA Brasil
Dimetilssulfóxido (DMSO) VETEC Brasil
37
Doxorrubicina FLUKA Brasil
EDTA sal dissódico DINÂMICA Brasil
Eosina VETEC Brasil
Estreptomicina SIGMA Brasil
Éter etílico SYNTH Brasil
Fator de necrose tumoral (TNF-α) MULTIPLEX
Fitoscar® APSEN Brasil
Folin reagente QEEL Brasil
Formaldeído 37% SYNTH Brasil
Formalina 10% SYNTH Brasil
Formamida SYNTH Brasil
Fosfato de potássio dibásico SIGMA Brasil
Fosfato de sódio monobásico VETEC Brasil
Fluoreto de fenilmetanossulfonila
(PMSF)
Fluoreto de sódio
Giemsa corante NEWPROV Brasil
Goma arábica SIGMA Brasil
Glutationa reduzida SIGMA Brasil
Griess reagente SIGMA Brasil
Hematoxilina REAGEN Brasil
Hidróxido de sódio REATEC Brasil
Iodeto de propídeo SIGMA Brasil
Interleucina 1β MULTIPLEX
Interleucina 10 MULTIPLEX
Interleucina 12p70 MULTIPLEX
JNK Biotechonology Brasil
Meio Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM)
SIGMA Brasil
Meio leite desnatado (skim milk) BD Brasil
Metanol SIGMA Brasil
Mistura nutriente F-10 HAM SIGMA Brasil
38
Nitrato redutase
Nitrato de sódio
Ortovanadato de sódio SIGMA Brasil
P-Erk Biotechonology Brasil
P-38 Biotechonology Brasil
Parafina histológica ALQUIMIA Brasil
Paraformaldeído SYNTH Brasil
PDGF SIGMA Brasil
Penicilina SIGMA Brasil
Peróxido de hidrogênio PROQUIMIS Brasil
Pirofosfato de sódio desidrato SIGMA Brasil
Propilenoglicol ALQUIMIA Brasil
Reagente de dragendorff SIGMA Brasil
Soro bovino fetal CULTILAB Brasil
Sulfanilamida SYNTH Brasil
Sulfato de cobre pentahidratado VETEC Brasil
Tampão tris (Trizma®) SIGMA Brasil
Tetrametilbenzidina (TMB) SIGMA Brasil
Tripsina SIGMA Brasil
Triton SIGMA Brasil
Twen 80 2% VETEC Brasil
Xilazina 2% SYNTEC Brasil
Xilol SYNTH Brasil
4.6 Equipamentos, materiais permanentes e softwares
Os equipamentos e materiais permanentes utilizados durante a realização dos ensaios
farmacológicos estão descritos no Quadro 2.
Quadro 2. Materiais permanentes e equipamentos utilizados nos bioensaios, ensaios
farmacológicos e toxicológicos.
Especificação Marca País
Aparelho Chemidoc BIO-RAD E.U.A
39
Adobe Photoshop CC 2015
Aparelho HPCL/UV/VIS 325 UV-VIS Detector
ADOBE
VARIAN
Balança analítica OHAUS Brasil
Balança eletrônica de precisão AUW220D SHIMADZU Brasil
Balança eletrônica de precisão modelo WA 205 CHYO Brasil
Balança Mark S3102 classe II BEL Brasil
Balança para pesagem de roedores LÉTICA
Banho Maria OMA Brasil
Banho Maria Reciprocal Shaking Bath PRECISION Brasil
Bisturi CIENTIFIC Brasil
Bisturi tipo punch METALVET Brasil
Câmera digital fotográfica CYBER-SHOT Japão
Centrifuga Excelsa 2 FANEM Brasil
Centrifuga refrigerada R-4239 ALC E.U.A
Centrifuga refrigerada EPPENDORF 5804 E.U.A
Cubeta de Quartzo para espectrofotometria
Citometro de Fluxo ABD E.U.A
Destilador Q341-25 QUIMIS Brasil
Detector ELSD PL-ELS 2100 VARIAN Brasil
Espectrofotômetro MULTISKAN E.U.A
Espectrofotômetro Spectronic Genesys MILTON ROY Brasil
Espectrômetro Mercury (300 MHz 100 MHz
13C)
VARIAN E.U.A
Espectrofotômetro UV-VIS BIOCHROM® UK
Estufa BOD EL141 ELETROLAB Brasil
Estufa de secagem MA-037 FANEM Brasil/ Índia
Fluxo laminar EM 12469 IVECO Brasil
Freezer -20°C CPS 10 INDREL Brasil
Freezer -86°C IULT 335 D INDREL Brasil
Gaiolas metabólicas TECNIPLAST Brasil
Gaiolas de polipropileno
Homogeneizador MA-102 MARCONI Brasil
40
Incubadora de CO2 TE-399 TECNAL Brasil
Leitor de ELISA Multiskan EX Microplate THERMO Brasil
Liofilizador JJ Cientifica JJ CIENTICA Brasil
Luminex® XMAP
TECHNOLOGY
E.U.A
Microcomputador Pentium 400Mhz DELL Brasil
Microscópio invertido TS-100 NIKON Alemanha
Microscópio Óptico STUDAR LAB Germany
Microscópio para capturar imagens CARL ZEISS Alemanha
Micrótomo rotativo universal MICRON Japão
Moinho de Facas TECNAL Brasil
Paquímetro digital DIGIMESS Brasil
Phmetro digital HANNA Brasil
Processador automático de tecido LEICA Suíça
Processador histológico MTP-SLEE MAINZ Suíça
Purificador Milipore® Mili-Q Brasil
Rotaevaporador
Scanner de mesa AVISION 260C Brasil
Software Tritek Comet Score FREEWARE E.U.A
Software Image J® TECNAL
Tensiômetro (confeccionado na UFMT) SEM MARCA Brasil
Termômetro clínico digital B D Brasil
Vórtex PHOENIX Brasil
5. MÉTODOS
5.1 Obtenção do extrato aquoso
As folhas de S. guilleminiana (5 kg) foram limpas, secas à temperatura ambiente e
trituradas em moinho elétrico, em tamis de malha no. 40. O pó seco obtido (10 g) foi posto em
contato com 1.000 mL de água fervente e abafado por 15 min, filtrado em papel de filtro (n°1),
a infusão congelada em -80°C e liofilizada obtendo-se assim o extrato aquoso do infuso de S.
guilleminiana (EASg), o qual foi envasado em frasco âmbar e armazenado em freezer -
41
30 °C. Para uso tópico nos animais, o EASg foi dissolvid em propilenoglicol 1% e incorporado
em creme não iônico (baixa oleosidade, constituído de cera auto emulsionante Polawax,
propilenoglicol, parabenos, vaselina, EDTA dissódico e água destilada). Quando usado para
fins sistêmico (in vivo), o EASg foi emulsificado em água destilada com o auxílio de Tween 80
a 2% e, para os experimentos in vitro, o EASg foi dissolvido em DMSO 0,02 % em meio de
cultura DMEM.
5.1.1 Determinação do rendimento e concentração do EASg
A determinação do rendimento (R%) do EASg foi realizada utilizando-se a fórmula:
R (%) = Peso seco (g/g) x quantidade de extrato obtido (g) x100
Quantidade total de pó obtido (g)
Para o cálculo da concentração do infuso, três alíquotas contendo 5 mL deste foram
transferidos para frascos de vidro vazios, previamente pesados e mantidos em estufa a 80 ºC
por 24 horas e pesados de hora em hora, até peso constante, conforme fórmula:
Concentração (mg/mL) = média dos pesos dos frascos com infuso seco (mg) - média dos
pesos dos frascos vazios (mg)/5 mL
5.1.2 Análises fitoquímicas quali e quantitativas do EASg
Todos os ensaios fitoquímicos foram realizados no Curso de Farmácia da Universidade
do Vale do Itajaí, sob a supervisão do Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho.
5.2 Quantificação de metabólitos secundários do EASg
5.2.1 Teor de fenólicos
A quantificação de compostos fenólicos foi realizada pelo método Folin–Ciocalteu,
conforme descrito por Amorim et al. (2008), empregando-se ácido tânico como padrão. Em
triplicatas, soluções metanólicas (0,2 mL) do extrato (1 mg/mL, p/v) ou do padrão (0,1 - 2,0
µg/mL, p/v) foram misturadas com solução aquosa do reagente Folin-Ciocalteu (0,5 mL a 10%,
v/v), carbonato de sódio (1 mL a 75%, p/v) e 8,3 mL de água [purificada e deionizada em
purificador Millipore® Milli-Q sistema gradiente (água milli-Q), cuidadosamente agitados e
mantidos por 30 min ao abrigo da luz. A absorbância foi mensurada a 760 nm, em
42
espectrofotômetro UV-VIS equipado com cubetas de quartzo de 1 cm em percurso óptico,
calibrado com água milli-Q. Os teores de fenóis totais foram determinados por interpolações
das absorbâncias das amostras contra uma curva de calibração construída com diferentes
concentrações do padrão ácido tânico e expressos como miligramas equivalentes de ácido
tânico por grama de extrato seco (mg EAT/g).
5.2.1.2 Teor de flavonoides
A quantificação de flavonoides totais foi realizada de acordo com a descrição de Peixoto-
Sobrinho et al. (2008) com modificações, empregando rutina como padrão. As reações foram
realizadas em triplicata e mediante a mistura de 0,5 mL de soluções metanólicas do extrato (1
mg/mL, p/v) ou do padrão (1 - 10 µg/mL, p/v) com uma solução aquosa de ácido acético (0,5
mL a 60%, v/v), solução metanólica de piridina (2 mL a 20%, v/v), cloreto de alumínio (1 mL
a 5%, p/v) e água milli-Q (6 mL). O complexo reacional foi cuidadosamente agitado e mantido
por 30 min ao abrigo da luz e as absorbâncias serão mensuradas a 420 nm em espectrofotômetro,
calibrado com água milli-Q. Os teores de flavonoides totais foram determinados por
interpolação das absorbâncias das amostras contra uma curva de calibração construída com as
diferentes concentrações do padrão rutina e expressos como miligramas equivalentes de rutina
por grama de extrato seco (mg ER/g).
5.2.2 Avaliação fitoquímica
5.2.2.1 Preparação do extrato metanólico e frações de Sorocea guilleminiana
Cerca de 80 g de folhas de S. guilleminiana foram secas à temperatura ambiente, rasurada
e submetidas à maceração em solução de metanol absoluta por 7 dias. Utilizou-se quantidade
de solvente necessária para que todo material vegetal utilizado fosse coberto pelo mesmo. Após
este período, foi realizada a filtração do solvente do material vegetal, o solvente foi evaporado
em rotaevaporador à pressão reduzida, a 50 ⁰C para obtenção do extrato bruto metanólico de S.
guilleminiana (EMSg). Uma parte do EMSg (1 g) foi dissolvida sucessivamente em
clorofórmio (2 x 5 mL) e em acetona (2 x 5 mL) para obtenção das frações clorofórmica e
acetônica, com rendimentos de 49 mg e 100 mg, respectivamente.
5.2.2.2 Cromatografia em camada delgada
As análises cromatográficas preliminares dos constituintes químicos do EMSg e frações
foram realizadas através de cromatografia em camada delgada (CCD), em cromatoplacas, com
43
fase estacionária de sílica gel 60 F254 (Merck) e fase móvel constituída por uma mistura de
solventes, em diferentes proporções (hexano:acetato de etila e clorofórmio:metanol). As
cromatoplacas foram reveladas em câmara de Ultravioleta (UV) com comprimento de onda de
254 e 365 nm. Foram usados reveladores seletivos como anisaldeído sulfúrico (terpenoides e
esteroides), cloreto férrico (flavonoides e fenólicos) e reagente de Dragendorff (alcaloides),
além de KOH para cumarinas (UGAZ, 1994).
5.2.2.3 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
A amostra (EMSg) foi diluída em metanol a 2 mg/mL. Injeções da amostra: 20 µL.
Coluna: Phenomenex® Sinergy 4 µm Hydro-RP 80A (150 x 4,60 mm) condicionada à 35°C.
Usou-se a fase móvel contendo: A= água acidificada pH 2,5 com ácido fórmico e B= acetonitrila
- sistema de gradiente de 40 min, sob fluxo de 1.0 mL/min, conforme Tabela 1.
Tabela 1. Sistema de eluição utilizado para obtenção do perfil cromatográfio por cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) do extrato metanólico das folhas de Sorocea guilleminiana
(EMSg).
Tempo (min) Fase móvel
A B
0.001 95 5
5.00 90 10
10.00 85 15
25.00 80 20
30.00 73 27
31.00 60 40
32.00 50 50
35.00 95 5
40.00 95 5
A: água acidificada com ácido fórmico; B: acetonitrila.
5.3 Avaliação da toxicidade
5.3.1 Testes de toxicidade in vitro
5.3.1.1 Ensaio de citotoxicidade
44
Depois de descongeladas, as células CHO-k1 foram mantidas em meio DMEM,
suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) a 37° C, em atmosfera de 5% de CO2 e 90%
de umidade, sendo a citotoxicidade avaliada por citometria de fluxo (TAVECHIO et al., 2008).
As células foram plaqueadas na densidade de 1,5x105 cél/mL em placa de 24 poços (duplicata),
apenas com o meio (controle de esterilidade), DMSO 0,02% (veículo), ou com EASg nas
concentrações de 6,25 – 800 µg/mL, e como controle positivo utilizou-se a doxorrubicina (100
- 0,01 µg/mL). Após 24 e 72 h dos tratamentos, as placas foram retiradas da estufa e tiveram o
meio e tratamentos removidos. Após, adicionou-se 1 mL de tripsina para dissociação das
células, então seguiu-se com a centrifugação da suspensão celular à 4° C à velocidade de 1960
x g por 5 min. Após centrifugação, o pellet formado foi ressuspendido em 1 mL de PBS 1 vez.
A leitura das amostras foi realizada em citômetro de fluxo imediatamente após adição de 1 µL
do marcador iodeto de propídeo (PI, 5 mg/mL). Os resultados foram expressos em termos de
concentração inibitória 50% (CI50), que se refere à concentração da droga que inibe 50% da
proliferação celular. Valores de CI50 < 4 µg/ mL e < 30 µg/mL foram considerados citotóxicos
para substâncias puras e impuras, respectivamente (SUFFNESS & PEZZUTO, 1990).
5.3.1.2 Ensaio de viabilidade celular
Para a avaliação da viabilidade celular de fibroblastos N3T3 seguiu-se com a metodologia
descrita na seção 5.3.1 Essa foi realizada para selecionarem-se as concentrações não citotóxicas
a serem usadas nos ensaios in vitro e que envolveram N3T3.
5.3.1.3 Ensaio de genotoxicidade
Em ambos os ensaios micronúcleo (MN) e cometa (COM), as células CHO-k1 cultivadas
até a quarta passagem, foram plaqueadas na densidade de 1x106 cél/poço, no caso do ensaio de
MN e 5x105 cél/poço no caso do ensaio de COM e incubadas overnight à 37°C em atmosfera
de 5% de CO2. Para cada tratamento, dois poços contendo células foram incubados em placas
de 6 poços contendo meio Eagle Dulbecco modificado (DMEM), que serviram como controle
de esterilidade e DMSO 0,02%, que serviram como controle negativo (veículo). Para o teste de
MN, as células foram pré-tratadas com EASg (10, 30 ou 100 µg/mL) e doxorrubicina (0,03
µg/mL). No teste de COM, as células foram expostas ao H2O2 (50 µM), por um período de 4 h
após 24 h dos pré-tratamentos com EASg (10, 30 ou 100 µg/mL). As células co-tratadas
receberam simultaneamente EASg (10, 30 ou 100 µg/mL) e H2O2 durante 4 h, e, para o pós-
tratamento, as células foram tratadas com H2O2 por 4 h, tiveram o agente genotóxico removido
45
e foram tratadas com EASg (10, 30 ou 100 µg/mL) por um período de 24 h.
5.3.1.3.1 Teste do micronúcleo com bloqueio de citocinese
Para o teste de MN, foi utilizada a técnica descrita por Fenech (2000) e Oliveira et al.
(2014) modificada. Passadas 24 h dos pré-tratamentos, as células foram tratadas com
citocalasina B (4,5 µg/mL), droga bloqueadora da citocinese, e incubadas por mais 24 h. Após
tripsinização, as células foram centrifugadas a 400 x g, à 4º C, o sobrenadante descartado,
adicionados 5 mL de citrato de sódio 1% gelado e as células foram ressuspenssas. Após 15 s,
5 mL de solução fixadora (metanol/ácido acético, 3:1) e 4 gotas de formaldeído foram
adicionadas. A suspensão celular foi centrifugada a 400 x g por 5 min. O sobrenadante foi
descartado e o pellet fixado em metanol/ácido acético (3:1) por mais duas vezes, sem a adição
de formaldeído. Após a terceira etapa de fixação, descartou-se parte do sobrenadante,
mantendo-se aproximadamente 1 mL deste, e a suspensão foi gotejada em lâminas previamente
limpas e geladas para secar. Após secagem, as lâminas foram coradas com corante panótico
rápido durante 4 min.
Foram analisadas mil células binucleadas por lâmina que apresentaram núcleos intactos
de tamanhos semelhantes, mesmo padrão de coloração e dentro do limite citoplasmático, com
membrana celular regular, excluindo-se células em processo de apoptose ou necrose. A
frequência de MN foi quantificada considerando-se aqueles que apresentavam a mesma cor e
morfologia do núcleo, com diâmetro ente 1/16 a 1/3 dos núcleos principais, não refringentes,
não ligados ou conectados e nem sobrepostos a um dos núcleos principais. Também foram
quantificados as frequências de pontes dicêntricas (PD) e brotos (BT). O índice de divisão
nuclear (IDN) foi calculado por IDN= [(1 x células mononucleadas) + (2 x células binucleadas)
+ (3 x células multinucleadas)]/N, onde N=número total de células. O menor valor de IDN
possível é 1,0, o que ocorre se todas as células viáveis não conseguirem se dividir durante o
período de bloqueio de citocinases e, são, portanto, todas mononucleadas. Se todas as células
viáveis completarem uma divisão nuclear e, portanto, são todas binucleadas, o valor IDN é 2.0.
O valor de IDN só pode ser superior a 2,0 se uma proporção substancial de células viáveis tiver
completado mais de uma divisão nuclear durante a fase de bloqueio de citocinases e, portanto,
contém mais de dois núcleos (FENECH, 2000)
5.3.1.3.2 Teste de cometa
Após tratamento, as células foram removidas pela adição de tripsina 1%, centrifugadas a
46
400 x g, por 5 min, o sobrenadante descartado, as células ressuspendidas e as viáveis contadas
pela adição de azul de tripan, até obtenção de pelo menos 2x104 cél em 200 µL de gel agarose
0,5% de baixo ponto de fusão (previamente aquecida em banho-maria à 37º C). As amostras
(80 µL) foram gotejadas em lâminas cobertas com uma fina camada de agarose de ponto de
fusão normal, cobertas com lamínula e mantidas em geladeira a 4 °C por 5 min para
solidificação. Foram preparadas duas lâminas para cada amostra. Em seguida, foram incubadas
em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris) à 4ºC, overnight. Após a lise, as
lâminas foram colocadas em solução tampão para corrida (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH
> 13) por 20 min e submetidas à corrida de eletroforese a 25 V, 30 mA, por 30 min. Ao final da
eletroforese, as lâminas foram incubadas em solução de neutralização (0,4 M Tris, pH 7,5) por
15 min, fixadas em etanol 96 º GL por 5 min, coradas com GelRed™ e lidas em microscópio
de fluorescência com aumento de 400 x.
O dano genético foi identificado pela presença de uma cauda semelhante à de um COM
formado por fragmentos de DNA, quantificado por meio da razão entre a intensidade formada
pela cauda do COM e intensidade total do COM, multiplicado por 100 e expresso em
% de DNA na cauda. Foram contados 100 nucleoides por lâmina, devidamente fotografados e
avaliados com auxílio do software TriTek Comet ScoreTM Freeware.
5.3.2 Testes de toxicidade in vivo
5.3.2.1 Toxicidade aguda (dose única)
Camundongos machos e fêmeas foram distribuídos em 4 grupos (n=6/cada), submetidos
a jejum de sólidos por 18 h, pesados e tratados através de gavagem (v.o.) com EASg na dose de
2000 mg/kg ou véiculo (Tween 80 a 2% em água destilada, 0,1 mL/10 g p.c.). Após a
administração, os animais foram observados individualmente nos tempos 0, 15, 30 e 60 min, 2,
4 e 8 h e uma vez ao dia, durante 14 dias, quanto ao aparecimento de alterações
comportamentais indicativas de excitação ou depressão do sistema nervoso central (SNC), bem
como palidez, cianose, alterações na urina e fezes, segundo método preconizado pela OECD
(2002).
Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno com ração e água ad libitum
passadas 2 h dos tratamentos. As alterações físicas e comportamentais foram anotadas em uma
tabela de Malone (MALONE & ROBICHAUD, 1962) e, ao final do 14º dia, os animais foram
pesados novamente para a determinação da variação de peso durante o experimento,
sacrificados pela administração intraperitoneal (ip.) de 60 mg/kg cetamina e 8 mg/kg de xilazina
47
para remoção dos principais órgãos (pulmões, coração, fígado, rins, baço e estômago), os quais
foram inspecionados macroscopicamente quanto a alterações anatômicas, de cor e tamanho e
determinados os pesos relativos destes [(peso do órgão/p.c. no 14º dia) x 100].
5.4 Avaliação da atividade cicatrizante in vivo
5.4.1 Ferida por excisão
Para realização do ensaio de cicatrização por excisão, foi seguido o modelo preconizado
por SAHA et al. (1997) com adaptações. Ratas pesando entre 180 - 200 g foram anestesiadas
por injeção ip. de xilazina (60 mg/kg) e cetamina (100 mg/kg) a um volume de 0,1 mL/100g
p.c. Após foram depiladas nos flancos dorsais, posicionadas em decúbito ventral e imobilizadas
para o procedimento cirúrgico. As regiões depiladas foram limpas com álcool etílico 70 % e,
em seguida, com auxílio de um punch n°16 foi feita uma excisão e ressecção da pele e do
panículo carnoso até a fáscia muscular superficial, produzindo a ferida (área completa de 500
mm2). A região dorsal foi escolhida para impedir que o animal se morda de forma a aumentar
o trauma e prejudicar a cicatrização.
As feridas foram previamente limpas com salina 0,9 %, para então iniciar o tratamento
tópico e diário com o veículo (propilenoglicol 1% + creme não iônico), EASg (2, 10 ou 50 mg/g
em creme não iônico) ou Fitoscar® [(extrato seco da casca de Stryphnodendron adstringens
Coville (Mart.) Coville a 50%)] na dose de 60 mg/g de pomada (correspondente a 30 mg de
fenois totais e 27 mg de taninos totais) e em quantidades suficientes para cobrir a área lesada.
Os animais foram mantidos em gaiolas individuais de polipropileno com tampa inox modelo
UFMT até o dia em que a ferida estivesse completamente curada.
5.4.1.1 Determinação da taxa de contração da ferida e período de re-epitelização
A taxa de contração da ferida foi determinada conforme técnica de Saha et al. (1997)
adaptado. No dia zero, que corresponde ao dia da realização da excisão da pele, e com auxílio
de um marcador permanente contornou-se as bordas da ferida em papel de transparência
obtendo-se a medida da área da ferida do dia zero. Esse procedimento foi repetido nos dias
ímpares 1, 3, 5 e, assim por diante, até o dia que o completo fechamento da ferida. As
transparências foram escaneadas e a área de cada ferida, obtida pelo cálculo do perímetro por
meio do software Adobe Photoshop® (versão 2015) e fixando a régua em 10 cm para ter-se a
resolução da imagem em 1187 pixels e, assim, a taxa de contração da ferida pode ser calculada
através da formula:
Taxa de contração (%) = Área do dia zero (mm2) - Área do dia avaliado (mm2) x100
48
Área do dia zero (mm2)
O período de re-epitelização foi calculado através do número de dias necessários para a
completa cicatrização das feridas, constatada visualmente pelo completo fechamento da lesão
(SHRIMANKER et al., 2013).
5.4.2 Ferida por incisão
Ratas pesando entre 180-200 g foram anestesiadas por injeção ip. de xilazina (60 mg/kg)
e cetamina (100 mg/kg) a um volume de 0,2 mL/100 g p.c. Após, foram depiladas nos flancos
dorsais, posicionadas em decúbito ventral e imobilizadas para o procedimento cirúrgico. As
regiões depiladas foram limpas com álcool etílico 70 %, com auxílio de bisturi duas incisões
longitudinais distantes a 1,5 cm da linha mediana iniciando na omoplata estendendo por 6 cm
de comprimento através da pele e camada muscular. As bordas de cada uma das feridas foram
unidas por três pontos cirúrgicos realizados a uma distância de 1 cm de cada (Figura 4).
Previamente aos tratamentos, as feridas foram limpas com salina 0,9 % e aplicados
diariamente o veículo (propilenoglicol 1% + creme não iônico®), EASg (2, 10 ou 50 mg/g) ou
Fitoscar® em quantidade suficiente para cobrir a área lesada. No 9° dia, os animais foram
sacrificados com sobredose de xilazina (60 mg/kg) e cetamina (200 mg/kg ip.) e a pele dorsal
excisada, essa pele foi colocada em molde (Figura 5) e as tiras separadas (Figura 4), duas tiras
de pele de 1,5 cm por 0,5 cm foram utilizadas para determinação da força de tensão, uma
amostra foi preservada para análises histológicas, três amostras utilizadas para ensaios
antioxidantes e uma para dosagem de citocinas (MUSTOE et al., 1987 adaptado).
Figura 4. Imagem ilustrativa do corte da pele no modelo de ferida por incisão em ratos.
Fonte: C.L.Venturini, 2017 adaptado.
49
Figura 5. Molde para corte da pele utilizado no ensaio de ferida por incisão em ratos.
Fabricação: D.T.O. Martins, J.C.S. Lima e P.E.O. Matos.
5.4.2.1 Determinação da força de tensão
Para a determinação da resistência à tração da ferida, foi utilizado o método de Nagy e
Zingg (1971) modificado. Conforme Figura 6, o aparelho de tensiômetro serve para medir a
força de tensão e quanto tempo leva para romper a tira da ferida. As tiras excisadas (figura 6)
de pele com a cicatriz perpendicular ao comprimento foram fixadas em duas garras maciças a
0,5 cm de sua borda, uma garra foi presa a um gancho fixo e a outra fixada a um sistema de
tração por gravidade onde foi adicionado água até que a cicatriz se rompa. O volume de água
necessário para romper a pele lesionada foi pesado (kg) e a resistência à tensão calculada pela
fórmula (1):
F (Pa) = m.g (1)
Área
F (Pa) = força em Pascal
Massa (m) = kg
constante gravitacional (G) = 9,80665 m/s2
m.G = kg.m/s2 = N
Área = base.altura (cm2 . 10-4) = m2
Uma determinação foi realizada em cada incisão e a média das duas medidas realizadas
nas feridas em cada dorso do animal foi utilizada como a resistência à tensão da ferida.
Figura 6. Imagens ilustrativas do tensiômetro utilizado no ensaio de ferida por incisão.
Fabricação: D.T. O. Martins, P.E.O. Mattos, J.C.S. Lima e L. A. de Paula.
50
5.4.2.2 Análises histopatológicas
As análises histopatológicas do fragmento de pele foram realizadas no Laboratório de
Patologia Veterinária (LPV), Hospital Veterinário, UFMT, sob a supervisão do Prof. Dr. Edson
Moleta Colodel e a parte de coloração e análise pelo prof. Dr. Amilcar Sabino Damazo.
5.4.2.2.1 Preservação das amostras
Fragmentos de pele da ferida foram seccionados com molde preservando-se
aproximadamente 1,5 cm em cada borda da lesão e com largura de aproximadamente 0,5 cm.
Posteriormente, esses fragmentos foram acondicionados em cassetes histológicos devidamente
identificados e submersos em formalina 10 % tamponada por um período mínimo de 24 h
(HUMASON, 1972).
5.4.2.2.2 Análise histopatológica
Os tecidos foram fixados em paraformaldeído a 4% por 24 h, desidratadas em série
crescente de soluções etanólicas, clarificadas em xilol e emblocadas em parafina.
Posteriormente as amostras foram cortadas em micrótomo rotativo com 5 μm de espessura e
coradas pela técnica de hematoxilina e eosina; pela técnica de tricrômico de masson (TM), para
quantificação de colagenese; e pela técnica de Picrosirius red, para avaliar o colágeno do tipo I
(ALLEN, 1992).
As lâminas contendo os cortes histológicos foram analisadas em microscópio de luz dois
avaliadores distintos e de forma cega, ou seja, os mesmos não possuíam conhecimento dos
grupos analisados. Sendo classificadas de acordo com a ocorrência e intensidade em que foram
encontradas e transformadas em variáveis quantitativas discretas (0 a 4) para cada achado
51
histológico e foram multiplicadas por fatores positivos ou negativos, baseados na sua
importância para a cicatrização, estabelecidos por MYERS; POSTLETHWAIT; SMITH (1961)
com adaptações, conforme Quadro 3. As somas desses produtos corresponderam ao escore total
para cada animal.
Quadro 3. Ficha individual para anotações dos escores de avaliação das características
microscópicas do processo de cicatrização de feridas cutâneas. As intensidades das variáveis (0
a +4) foram multiplicadas por fatores positivos ou negativos baseados na sua importância para
a cicatrização. A soma destes produtos corresponde ao escore total para cada animal.
Variáveis 0 +1 +2 +3 +4
Fator
Total Ausente Discreto Leve Moderado Acentuado
Neutrófilos - 10
Eosinófilos - 4
Edema/Sangue - 4
Inflamação crônica (Linfócitos/Plasmócitos)
- 3
Necrose/degeneração - 2
Reepitelização + 5
Proliferação
fibroblástica
(Fibroplasia)
+ 5
Neovascularização + 5
Colagênese + 10
Grupo: Animal: Escore Total
Fonte: MYERS et al. (1961) com adaptações
5.4.3 Determinação da atividade antioxidante in vivo
A tira da pele foi pesada, conservada em tampão Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM e
Trton X-100 a 1% e armazenada em biofreezer a – 80 ºC.
5.4.3.1 Preparação das amostras para as análises enzimáticas e não enzimáticas
Amostras contendo tiras de pele foram descongeladas, desintegradas e homogeneizadas
em tampão fosfato de potássio (200 mM, pH 6,5), uma alíquota de 50 µL do homogenato
52
resultante foi retirada para a realização da quantificação do conteúdo de glutationa (GSH), e
o homogenato restante foi centrifugado a 7377 x g por 20 min. O sobrenadante resultante foi
usado para as determinações das atividades das enzimas catalase (CAT) e malondialdeído
(MDA). O pellet resultante foi usado para determinação da atividade da mieloperoxidase
(MPO).
5.4.3.2 Avaliação da atividade da mieloperoxidase
Foi utilizado método de Nabavi et al. (2013) adapatado, baseado na reação do
tetrametilbenzidina (TMB) com a enzima MPO, produzindo coloração azul. Para a realização
dessa técnica o pellet do sobrenadante foi ressuspendido com 1 mL de tampão fosfato 0,08 M
com brometo de hexadeciltrimetilamônio (HTAB) 0,5% (pH 6,4), sonicado por 5 s, e
centrifugado por 20 min a 9145 x g a 4 ºC. Em microplaca, 30 µL do sobrenadante foram
misturados a 200 µL de um mix de soluções (100 µL de tampão fosfato 0,08M, 85 µL de tampão
fosfato 0,22 M e 15 µL de H2O2 a 0,017%). Após, a reação foi iniciada com a adição de 20 µL
de TMB, e incubada por 3 min a 37 ºC. A reação foi interrompida com a adição de 30 µL de
acetato de sódio (1,46 M, pH 3,0), e lida em espectrofotômetro a 620 nm.
5.4.3.3 Quantificação do conteúdo de glutationa
A quantidade de grupos sulfidrílicos não protéicos na tira de pele foi determinada através
do método de Sedlak e Lindsay (1988) adapatado. Em 50 µL deste homogenato foi adicionado
40 µL de ácido tricloroacético (TCA) 12%, agitados por 10 min em Vortex e centrifugados por
15 min a 706 x g. Alíquotas de 10 µL do sobrenadante juntamente com 290 µL de tampão Tris-
HCl 0,4 M (pH 8,9) foram depositadas em microplacas de 96 poços. A reação foi iniciada com
a adição de 5 µL de 5,5’-ditiobis 2-ácido nitrobenzóico (DTNB) a 0,01 M (um reagente que
quando em contato com o grupo SH – tiol dos grupos sulfidrílicos, produz coloração amarela)
5 min antes da leitura espectrofotométrica (415 nm). Os procedimentos foram realizados a 4 ºC,
e os valores individuais interpolados numa curva padrão de GSH e expressos em µg GSH/g
tecido.
5.4.3.4 Quantificação da atividade da catalase
Para a determinação da atividade da CAT foi usado o método descrito por Aebi et al.
(1984) adpatado. A pele foi homogeneizada com tampão fosfato (ph 7,0 50 mM) e centrifugada
a 11.180 x g durante 10 min a 4°C. Solução de H2O2 1 mM (2 mL) em tampão de fosfato (pH
53
7,0 50 mM) foram colocados em uma cubeta de quartzo, 20 µL de amostra adicionada; e a
leitura tomada imediatamente em 240 nm (A240 = 0,380-0,400), e em a cada minuto durante 4
min usando um espectrofotômetro UV-vis. Os valores de absorvência foram extrapolados a
partir de uma curva padrão obtida a partir de concentrações de H2O2 em solução tampão de
fosfato 50 mM (y = 0,0002x + 0,3473; R2 = 0,9646). Os resultados foram expressos em mM de
proteína H2O2/min/g. A concentração das proteínas totais foi realizada pelo método de Bradford
e os valores de proteína foram extrapolado a partir de uma curva padrão de concentrações de
BSA (y = 0,0003x + 0,2601; R2 = 0,9752).
5.4.4 Determinação de citocinas
As tiras de pele foram descongeladas, desintegradas e homogeneizadas em tampão
fosfato 0,2 M e as concentrações de interleucina 1ß (IL-1ß), interleucina 10 (IL-10), interleucina
12 p70 (IL-12 p70), interleucina 17 (IL-17) e fator de necrose tumoral α (TNFα) foram
determinadas seguindo as instruções descritas no kit Milliplex® Map pelo uso de um
instrumento de detecção baseado em fluxo duplo laser Luminex® XMAP.
5.4.5 Determinação de óxido nítrico (NO)
A avaliação do conteúdo total de nitrato/nitrito (NO -/NO -) foi determinado pelo 3 2
reagente de Griess, que indica a formação de oxido nítrico. Primeiramente os tecidos foram
pesados e homogeneizadas em solução tampão fosfato de potássio (200 mM, pH 6,5), o
homogenato foi centrifugado por 15 min a 1500 x g para obtenção do sobrenadante. Para a
conversão de NO3- em NO2
-, as amostras obtidas foram plaqueadas (placa de 96 poços) em
duplicata (80 µL de cada sobrenadante) e incubadas por 10 min com uma solução reagente (40
µL da enzima nitrato redutase, substrato NADPH, KH2PO4 em agua destilada). Para curva
padrão de referência de nitrito foi realizado plaqueamento, a partir da solução de nitrato de sódio
(NaNO2) de 200 µM (1:2). Após a conversão de nitrato em nitrito, 80 µL da solução de Griess
(1% de sufanilamida em 1% H3PO4/0,1% de NEED/agua destilada/ 1:2) foi adicionada em cada
poço. A coloração purpura final obtida pela reação leitura foi feita em espectrofotometria na
absorbância de 540 nm e os resultados foram expressos em µM de NO- 2, usando como referência
a curva padrão de nitrito para a obtenção dos valores (CHEN et al., 2000).
5.5 Avaliação da atividade cicatrizante in vitro
5.5.1 Riscamento de monocamada celular (scratch assay)
54
Fibroblastos da linhagem N3T3 cultivados em meio contendo 10 % de SBF, foram
colocados em placa de cultura de células com 24 poços, a uma concentração de 5x105 cél/poço
e feito um risco na monocamada de células por meio de uma ponteira de micropipeta de 10 µL,
conforme método modificado de Fronza et al. (2009) adaptado. Os resquícios de debridamento
celular foram removidos por lavagem com solução tampão fosfato-salino (PBS). O meio
DMEM com 10% de SBF foi utilizado como controle negativo e o fator de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF, 5 ng/mL) como controle positivo. O EASg foi testado nas
concentrações de 0,8; 4 e 20 µg/ml, através da incubação por 12 h, a 37 °C e atmosfera de 5 %
de CO2. A taxa de contração foi calculada utilizando 3 imagens por poço, capturadas em
microscópio óptico invertido acoplado a uma câmera digital fotográfica e as imagens avaliadas
em software ImageJ®.
5.6 Atividade antibacteriana
As concentrações inibitórias mínimas (CIM) do EASg foram determinadas pelo método
de microdiluição em caldo, utilizando meio Muller-Hinton (Himedia) para cepas bacterianas
(CLSI, 2012). O EASg foi solubilizado e adicionado ao meio de cultura, resultando em
concentrações de 6,25 - 800 µg/mL obtidas por meio de diluição seriada. Os inóculos
bacterianos foram ajustados a 0,5 na escala MacFarland, que correspondeu a 1x108 UFC/mL.
As microplacas serão incubadas por 24 h a 37 ºC, sob agitação constante, e a leitura das
absorbâncias realizada em espectrofotômetro a 450 nm. Como droga padrão antibacteriana, foi
utilizada o cloranfenicol nas mesmas concentrações que o extrato.
5.7 Análises dos dados
Para a tabulação e análises dos dados foi utilizado o software GraphPad Prism versão
6.01. Os testes paramétricos foram expressos como média ± EP. (erro padrão). Para comparação
de duas médias usou-se o teste de Student pareado. As comparações estatísticas com mais de
duas médias foram analisadas por análise de variância (ANOVA) uma via, seguida, quando
houve significância estatística, teste de comparações múltiplas de Student- Newman-Keuls.
Para testes não paramétricos utilizou mediana e seus quartis analisada pelo teste de Kruskal
Wallis seguida do teste de Dunn. Valores de p menores que 0,05 foram considerados
significantes. A determinação da CI50 será feita a partir de uma regressão linear, relacionando-
se o percentual de inibição em função do logaritmo das concentrações testadas e admitindo-se
55
um intervalo de confiança de 99 % (p < 0,01) para a reta obtida. Para os ensaios in vitro que
não envolveram análises estatísticas, utilizou a média ± EP. de três experimentos independentes
em duplicata.
6. RESULTADOS
6.1 Determinação do rendimento e concentração do EASg
O EASg apresentou um rendimento de 14 % (p/p), em termos de quantidade de pó das
folhas. Considerando que a população toma três xícaras de chá por dia (600 mL) do infuso das
folhas e que a concentração do infuso é de 1,4 mg/mL, estima-se que um indivíduo de 60 kg
tome 840 mg/dia ou 14 mg/kg/dia.
6.2 Análises fitoquímicas
Os resultados preliminares por CCD indicaram a forte presença de compostos polares,
especialmente flavonoides (4 majoritários), além de terpenos e/ou esteroides (2 majoritários)
no EBM das folhas de S. guilleminiana. Não foram encontrados alcaloides e cumarinas. Por
outro lado, o cromatograma obtido por CLAE (Figura 7), sugere pelo menos a presença de 4
substâncias majoritárias no EMSg, com tempos de retenção (TR) em 12,5; 13,2, 18,6 e 21,5
min (também em ordem de concentração crescente), possivelmente os detectados por CCD na
fração acetônica, a mais polar e com característica para extração de compostos fenólicos. A
Figura 8 indica o perfil, por meio de análise de ultravioleta, dos compostos detectados,
compatíveis com absorções de compostos fenólicos nas regiões de 230-250 e 320-360 nm.
Figura 7. Fingerprint por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) do
extrato metanólico das folhas de Sorocea guilleminiana (EMSg).
25
20
15
10
5
0
5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
1
2
3
4
56
Figura 8. Perfil (ultravioleta) dos compostos 1-4 (fenólicos), indicados na Figura
7.
6.3 Avaliação da toxicidade
6.3.1 Citotoxicidade
Na Figura 9 estão mostrados os percentuais de citotoxicidade quando as células CHO
foram tratadas com EASg e doxorrubicina. O EASg apresentou ausência de citotoxicidade nos
tempos de 24 (A) e 72 (B) h, com valores de CI50 > 800 µg/mL (24 h) e CI50 > 800 µg/mL (72
h), respectivamente. A doxorrubicina, padrão para esse ensaio, mostrou também ausência de
citotoxicidade nessas células, tanto no tempo de 24 h (CI50 = 10,93 ± 1,34 µg/mL) como de 72
h (CI50 = 0,56 ± 0,01 µg/mL).
Figura 9. Avaliação da citotoxicidade de células de ovário de hamster
chinês (CHO-k1) tratadas por 24 h (A) ou 72 h (B), com o extrato aquoso
do infuso das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg) ou doxorrubicina
(Doxo), em ensaio de citometria de fluxo. Cada ponto representa a
porcentagem de viabilidade celular (%), expressa como média ± EP., de
três experimentos independentes em duplicata.
57
A análise da citotoxicidade em CHO-k1 permitiu, selecionar as concentrações do EASg
utilizadas para os ensaios toxicológicos in vitro (ensaios de micronúcleo e cometa).
6.3.2 Viabilidade celular
Na Figura 10 estão mostrados os percentuais de viabilidade celular quando as células
N3T3 foram tratadas com EASg e doxorrubicina. O EASg apresentou ausência de
citotoxicidade nos tempos de 24 (A) e 72 (B) h, com valores de CI50 > 800 µg/mL (24 h) e CI50
> 800 µg/mL (72 h), respectivamente. A doxorrubicina, padrão para esse ensaio, mostrou
também ausência de citotoxicidade nessas células, tanto no tempo de 24 h (CI50 = 100,00 ± 1,00
µg/mL) como de 72 h (CI50 = 49,04 ± 0,65 µg/mL).
0 .0 0 1 0 .0 1 0 .1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0
0
5 0
1 0 0
2 4 h
g /m L
% m
orte
D oxo
E A S g
0 .0 0 1 0 .0 1 0 .1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0
0
5 0
1 0 0
7 2 h
g /m L
% m
orte
D oxo
E A S g
Figura 10. Avaliação da viabilidade de fibroblastos murinos N3T3
tratadas por 24 h (A) ou 72 h (B), com o extrato aquoso do infuso das
folhas de Sorocea guilleminiana (EASg) ou doxorrubicina (Doxo), em
58
ensaio de citometria de fluxo. Cada ponto representa a porcentagem de
viabilidade celular (%), expressa como média ± EP., de três experimentos
independentes em duplicata.
A análise da viabilidade celular em N3T3 permitiu, não apenas avaliar superficialmente
a citotoxicidade, como também selecionar as concentrações do EASg utilizadas no ensaio
farmacológico in vitro de scratch assay.
CI50 = 49,04 ± 0,65 µg/mL
CI50 > 800 µg/mL
B
CI50 > 800 µg/mL
CI50 = 100,00 ± 1,00 µg/mL
59
6.3.3 Ensaios de genotoxicidade
6.3.3.1 Teste do micronúcleo
As células CHO-k1 tratadas com EASg (10; 30 ou 100 µg/mL) apresentaram número de
MN, PD e BT estatisticamente iguais aos do grupo veículo (DMSO 0,02%). A doxorrubicina,
controle positivo para esse ensaio, aumentou significativamente (p < 0,001) o número de MN,
PT e BT em 3,66, 4,85 e 5,13 vezes, respectivamente, quando comparados ao grupo veículo.
Os IDN no grupo controle foi de 1,74. O tratamento com EASg (10; 30 ou 100 µg/mL) reduziu
os valores de IDN, atingindo o efeito máximo de 20,68% com 10 µg/mL. A doxorrubicina (0,03
µg/mL), padrão para esse ensaio, reduziu em 36,20 % o valor do IDN em relação ao grupo
veículo (Tabela 2).
Tabela 2. Valores de aberrações nucleares em células epiteliais de ovário de hamster
chinês (CHO-k1) expostas por 24 h ao meio de cultura, extrato aquoso do infuso das
folhas Sorocea guilleminiana (EASg, 10; 30 ou 100 µg/mL) e doxorrubicina (Doxo,
0,03 µg/mL).
MN PD BT IDN
Veículo 24,75 ± 2,59 7,75 ± 2,28 6,00 ± 0,70 1,74
EASg (µg/mL) 10 23,33 ± 2,30 7,00 ± 2,64 14,00 ± 4,00 1,38
30 25,66 ± 6,35 4,00 ± 10,00 9,00 ± 4,35 1,39
100 30,00 ± 3,80 6,00 ± 3,60 14,00 ± 8,66 1,44
Doxo (µg/mL) 0,03 90,60 ± 7,60*** 37,60 ± 1,20*** 30,80 ± 1,10*** 1,11
Contagem das aberrações nucleares realizada em 1000 células binucleadas por lâmina. MN: micronúcleo; PD:
pontes dicêntricas; BT: brotos; IDN: índice de divisão nuclear. Média ± E.P. de três ensaios independentes em
duplicata. ANOVA uma via seguida do teste de Student-Newman-Keuls. ***p < 0,001 versus veículo.
6.3.3.2 Teste de cometa
A Tabela 3 mostra a porcentagem de dano no DNA na cauda do cometa em células CHO-
k1 expostas ao H2O2 (50 µM) e submetidas ao tratamento prévio, simultâneo ou posterior ao
EASg (10, 30 ou 100 µg/mL).
No grupo pré-tratamento, a incubação das células por 4 h, com H2O2, causou aumento de
cerca de 3171 vezes (p < 0,001) do dano ao DNA, em relação as células que receberam apenas
o veículo. O pré-tratamento com EASg (10, 30 e 100 µg/mL) preveniu (p < 0,001) as células
CHO-k1 do dano genético induzido por H2O2, reduzindo-o em 3567; 4077 e 2594 vezes,
respectivamente.
60
No grupo co-tratamento, a incubação das células CHO-k1 com H2O2 por 4 h resultou em
aumento de cerca de 516 vezes (p < 0,001) do dano genético das células CHO-k1, em relação
ao grupo meio de cultura. O co-tratamento com EASg resultou em redução de cerca de 430
vezes (p < 0,001) do dano ao DNA apenas com a menor concentração (10 µg/mL), em relação
ao grupo tratado apenas com H2O2.
No grupo pós-tratamento, a incubação das células H2O2 por 4 h resultou em aumento do
dano ao DNA de 2,20 vezes (p < 0,001) em relação ao grupo meio. O pós-tratamento com EASg
causou redução (p < 0,001), do dano ao DNA de 1,57 e 1,37 vezes respectivamente, com 10 e
100 µg/mL, em relação ao grupo que recebeu apenas H2O2.
Tabela 3: Valores dos danos nucleares induzidos por peróxido de hidrogênio (H2O2), em células
epiteliais de ovário de hamster chinês (CHO-k1), submetidas ao pré-, co- e pós- tratamento com
extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg).
aDNA na cauda do cometa (%)
Pré-tratamento Có-tratamento Pós-tratamento
Veículo 0,0009 (0,0007;0,0015) 0,0005 (0,0004;0,0006) 0,0005 (0,0004 ;0,0006)
10 0,0008 (0,0006;0,0011) ††† 0,0006 (0,0006;0,0008) †††
0,0007 (0,0005;0,0011)†††
EASg
(µg/mL)
30 0,0007 (0,0006;0,0010) ††† 0,0023 (0,0015;0,0046) 0,0010 (0,0006;0,0017)
100 0,0011 (0,0006; 0,0015)††† 0,0013 (0,0007;0,0047) 0,0008(0,0006;0,0010)†††
H2O2 (µM) 50 2,8540 (0,0010;9,6360)*** 0,2578 (0,0006;3,8730) *** 0,0011 (0,0007;0,0022)***
a O dano foi quantificado em 100 nucleoides por lâmina. Mediana (Q1;Q3) de três experimentos independentes em duplicata.
Análise de Kruskal Wallis seguida do teste de Dunn. ***p < 0.001 versus veículo; †††p < 0.001 versus H2O2.
6.3.4 Toxicidade aguda in vivo (dose única)
Quando administrado em dose de 2000 mg/kg, em camundongos de ambos os sexos, o
EASg não causou sinais e sintomas de toxicidade e nem alterou significamente (p < 0,05) o
peso dos animais ao longo dos 14 dias de observação (Tabela 4). Entretanto, verificou-se
aumento de 31,07% (p < 0,05) do peso relativo do estômago nos camundongos fêmeas (Tabelas
5).
61
Tabela 4. Variação de peso corporal durante o ensaio de toxicidade aguda em
camundongos tratados com extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea guilleminiana
(EASg).
Δ Ganho de peso (g)
Grupo
Dose (mg/kg v.o)
M F
Veículo
EASg
-----
2000
9,45±1,80 9,66 ±1,71
7,18±0,53 5,7±0,60
M: macho; F: fêmea ., Média ± EP. de 6 animais/grupo. Teste “t”de Student pareado. NS – p > 0,05.
Tabela 5. Pesos relativos dos principais órgãos de camundongos tratados com extrato aquoso do infuso das
folhas de Sorocea guilleminiana (EASg) em dose única oral de 2000 mg/kg.
Sexo Grupo Peso relativo (peso órgão/peso corporal x100)
Coração Fígado Pulmões Baço Rim D Rim E Estômago
Macho Veículo 0,17±0,02 2,10±0,15 0,19±00,2 0,15±0,01 0,21±0,00 0,22±0,00 0,26±0,03
EASg 2000 0,16±0,02 2,05±0,12 0,19±0,02 0,19±0,06 0,20±0,03 0,24±0,10 0,22±0,03
Fêmea Veículo 0,13±0,01 1,38±0,11 0,16±0,00 0,11±0,01 0,14±0,01 0,14±0,01 0,20±0,02
EASg 2000 0,12±0,01 1,34±0,05 0,16±0,02 0,14±0,04 0,14±0,01 0,15±0,01 0,26±0,04*
Média ± EP. de 6 animais/grupo. ANOVA uma via seguida do teste de Student-Newman-Keuls. *p < 0,05 versus veículo.
64
6. 4 Avaliação da atividade cicatrizante in vivo
6.4.1 Ferida por excisão
6.4.1.1 Determinação da taxa de contração de ferida e período de re-epitelização
Na Tabela 6 podem ser vistos os valores das taxas de contração da ferida e período de re-
epitelização das feridas por excisão, em ratos tratados topicamente com diferentes tratamentos.
O tratamento tópico com EASg (2 mg/g) causou aumento das taxas de contração das feridas,
no 5° e 9° dias em 64,43 ± 9,95% e 89,13 ± 3,19% (p < 0,05), respectivamente, enquanto o
tratamento com 50 mg/g de EASg aumentou a taxa de contração no 7° e 9° dias em 82,66 ± 7,47 e
90,08 ± 3,13 (p < 0,05) respectivamente, em relação ao veículo (propilenol 1% + creme não iônico).
O tratamento tópico com Fitoscar® (60 mg/g de pomada), droga padrão para esse ensaio, resultou
em aumento das taxas de contração da ferida apenas no 9° dia em 90,49 ± 3,98 (p < 0,05),
respectivamente, quando comparados ao veículo.
Com relação a re-epitelização, o tratamento com EASg ou Fitoscar® não alterou
significamente (p > 0,05) o tempo de re-epitelização da ferida quando comparado ao grupo veículo.
A completa re-epitelização nos grupos tratados com EASg (2, 10 e 50 mg/g) deu-se,
respectivamente, em 19,67 ± 0,30; 19,20 ± 0,37 e 20,00 ± 0,43 dias, com Fitoscar® em 21,80 ±
0,36 dias, no referido grupo com veículo (20,80 ± 0,40 dias) (p > 0,05).
Tabela 6. Efeito da aplicação tópica do extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea
guilleminiana (EASg) sobre a taxa de contração da ferida (%) e período de re-epitelização (Re, em
dias) no modelo de ferida por excisão em ratos.
Taxa de contração das feridas (%)
Dia Veículo EASg
(mg/g)
Fitoscar®
(mg/g)
- 2 10 50 60
1 7,75 ± 0,70 12,23 ± 1,32 8,14 ± 0,77 9,08 ± 1,22 12,37 ± 1,29
3 23,83 ± 0,78 31,50 ± 1,41 22,02 ± 0,86 22,76 ± 1,43 25,31 ± 1,79
5 44,88 ± 1,22 64,43 ± 0,94* 56,93 ± 1,32 54,74 ± 1,55 53,82 ± 1,13
7 74,55 ± 0,58 79,92 ± 0,48 78,75 ± 0,68 82,66 ± 0,79* 73,92 ± 0,54
9 83,48 ± 0,59 89,13 ± 0,38* 89,18 ± 0,35 90,08 ± 0,33* 90,49 ± 0,42*
11 91,59 ± 0,49 93,92 ± 0,31 93,19 ± 0,13 92,43 ± 0,36 95,12 ± 0,22
65
Média ± E.P. de 8 animais/grupo. ANOVA uma via seguida do teste de Student-Newman-Keuls. *p < 0,05 versus veículo.
6.4.2 Ferida por incisão
6.4.2.1 Determinação da força de tensão
Os resultados da força de resistência da ferida à tensão estão mostrados na Figura 11. No
grupo veículo, a resistência da ferida à tensão foi de 51,60 ± 3,53 Pa. A aplicação tópica do EASg
(2, 10 e 50 mg/g) em feridas incisas causou aumento da resistência nas doses de 2 mg/g (45,73%,
p < 0,001) e 50 mg/g (35,27%, p <0,05) quando comparados ao grupo veículo. Nos animais tratados
com Fitoscar® (60 mg/g), a força de resistência da ferida (22,09 %, p > 0,05) não deferiu da do
grupo veículo.
Figura 11. Efeito da aplicação tópica do extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea
guilleminiana (EASg) sobre a resistência da ferida à tensão (Pa), em modelo de feridas incisas em
ratos, avaliado no 9o dia. Cada barra representa a média ± EP. de 9 animais/grupo. ANOVA uma
via seguida do teste de Student-Newman-Keuls *p < 0,05; **p < 0,01 versus veículo.
Ve i 2 1 0 5 0 6 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Fo
rç
a d
e t
en
sã
o (
Pa
)
* * *
A E S g F ito s c a rm g / g m g / g
6.4.2.1 Análises histopatológica
Os eventos do processo de cicatrização de feridas foram observados e registrados para
o grupo veículo, EASg (2, 10 e 50 mg/g de creme não iônico) e Fitoscar (60 mg/g), controle
positivo (Tabela 7).
13 92,32 ± 0,57 95,77 ± 0,33 95,88 ± 0,24 95,44 ± 0,38 95,56 ± 0,38
15 93,62 ± 0,49 97,07 ± 0,22 97,29 ± 0,21 96,45 ± 0,34 96,96 ± 0,24
17 96,44 ± 0,42 97,97 ± 0,18 98,18 ± 0,27 98,39 ± 0,23 97,75 ± 0,21
19 97,45 ± 0,42 99,06 ± 0,12 99,43 ± 0,10 99,14 ± 0,17 98,60 ± 0,18
21 99,03 ± 0,27 99,62 ± 0,,07 99,53 ± 0,09 99,22 ± 0,15 98,53 ± 0,19
23 100 ± 0,00 100 ± 0,00 100 ± 0,00 100 ± 0,00 100 ± 0,00
Re (dias) 20,80 ± 040 19,67 ± 0,30 19,20 ± 0,37 20,00 ± 0,43 21,80 ± 0,36
66
O EASg na dose de 2 mg/g não alterou nenhum dos parâmentos histológicos avaliados
(Tabela 7). Em comparação com o grupo veículo, nas doses de 10 e 50 mg/g houve uma redução
significativa na migração de neutrófilos e eosinófilos, linfócitos e necrose, e um aumento da
reepitelização. Além disso, um maior índice de proliferação foi observado com a dose de 50
mg/g. O padrão Fitoscar® (60mg/g) também reduziu a migração de neutrófilos e eosinófilos e
necrose e aumentou o índice de reepitelização e proliferação. Ao contrario do EASg, a Fitoscar
®não alterou o índice de linfócitos, enquanto uma colagênese significativa foi observada
(Tabela 7).
O efeito do EASg sobre o tipo de colágeno (I ou III) presente nas amostras de ferida
cutânea está descrito na Tabela 8. A aplicação tópica do EASg (2,10 e 50 mg/g) promoveu
aumento (p < 0,001) no colágeno tipo I de 217,23%, 249,23% e 248,94%, respectivamente. O
tratamento com Fitoscar® (60 mg/g) resultou em um valor semelhante para colageno tipo I
(249,94%, p < 0,001), quando comparado ao gruo veículo. Para colágeno tipo III, todas as doses
de EASg reduziram (p < 0,001) o colageno tipo III em 69,37%, 72,21% e 63,21%,
respectivamente, como Fitoscar ® (66,21%, p < 0,001), quando comparado ao grupo veículo
(Fig. 12 e tabela 8). Para a análise da substancia fundamental amorfa, nem o extrato, nem a
Fitsocar ® alteraram as quantidades de substancia relacionadas ao veículo (Tabela 8).
Tabela 7. Efeito da aplicação tópica do veículo (creme não iônico), extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg,
2, 10 e 50 mg/g) e Fitoscar® (60 mg/g) sobre vários parâmetros do processo de cicatrização de feridas cutâneas por incisão, em ratos.
Grupos Mediana (Q1; Q3)
NEUT (-10) EOS (-4) INFL (-3) NEC (-2) REE (5) PROL (5) NEOV (5) COL (10)
Veículo -40 (-40; -20) -5 (-5; -5) -12 (-12; -6) -6 (-6; -4) 10(5; 10) 20 (20; 30) 30 (20; 30) 40 (40; 40)
EASg
mg/g
2
-20 (-20; -20)
-5 (-5; -5)
-9 (-9; -9)
-2 (-4; -2)
10 (10; 15)
30 (20; 30)
20(20; 30)
40(40; 60)
10 -10 (-10;0)*** 0 (0; 0)** -3 (-6; -3)* -2 (-2; 0)* 15 (15; 20)** 30 (30; 40) 30 (27,5; 30) 60 (40; 60)
50 0 (-20; 0)** 0 (0; 0)** -3 (-6; -3)* 0 (-2; 0)*** 15 (15; 20)** 40 (30; 40)* 30 (27,5; 30) 60 (40; 60)
Fitoscar
mg/g
60
-10 (-10; -10)*
0 (0; 0)**
-6 (-6; -3)
-2 (-2; 0)*
15 (15; 20)**
40 (30; 40)*
20 (20; 30)
60 (60; 60)**
Seções de pele com feridas cutâneas coradas com Hematoxilina/Eosina foram classificadas como: ausente (0), discreta (1), leve (2), moderada (3), acentuada (4)
multiplicada pelo fator correspondente para NEUT: (neutrófilos) fator -10, EOS: (eosinófilos) fator -4, INFL: (inflamação) fator -3, NE: (necrose) fator -2, RE:
(reepitelização) fator 5, PROL: (proliferação de fibroblastos) fator 5, NEOV: (neovascularização) fator 5, e COL: (colâgense) fator 10. Análise de Kruskal Wallis seguida do
teste de Dunn.* p < 0,05; ** p < 0, 01; ***p < 0.001 versus veículo.
68
Tabela 8: Efeito da aplicação tópica do veículo (creme não iônico), extrato aquoso do infuso das
folhas de Soroceaguilleminiana(EASg, 2, 10 e 50 mg/g) e Fitoscar® (60 mg/g) sobre
diferenciação do tipo de colágeno no processo de cicatrização de feridas cutâneas por incisão,
em ratos.
Substância fundamental: componentes não fibrosos da matriz extracelular. Análise de Kruskal Wallis seguida do teste de Dunn.
***p < 0.001 versus veículo.
Figura 12. Análise histopatológica da cicatrização da pele após o tratamento tópico com Extrato aquoso
de Sorocea guilleminiana (EASg). (A-C) Grupo controle negativo, evidenciando tecido cicatrizado,
porém com ausência de organização do colágeno do tipo I. (D-F) Grupo tratado com EASg 2 mg/g
evidenciando cicatrização com pouca organização de colágeno do tipo I. (G-L) Grupos tradados com
EASg 10 e 50 mg/g apresentado cicatriz com alta organização de colágeno do tipo I. (M-O) Grupo
controle positivo, tratado com fitoscar 60mg/g, apresentado cicatriz com baixa organização de colágeno
do tipo I. Coloração: (A, D, G, J, M) HE; (B, E, H, K, N) sirius red; (C, F, I, L, O) tricrômico de Masson.
Barra = 100 µm.
Treatment Collagen type I (%) Collagen type III (%) Amorphous Fundamental
Substance (%)
Vehicle 17.00 ± 1.76 62.30 ±1.26 20.00 ± 1.65
AESg 2 mg/g 53.93 ±1.35*** 19.08 ± 3.14*** 27.00 ± 3.06
AESg 10 mg/g 59.37 ± 2.34*** 17.31± 1.92*** 23.00 ± 3.46
AESg 50 mg/g 59.32 ± 2.73*** 22.92 ± 4.34*** 18.00 ± 2.90
Fitoscar® 60 mg/g 59.49 ± 1.3*** 21.05 ± 2.66*** 17.00 ± 2.44
69
6.4.3 Determinação da atividade antioxidante in vivo
6.4.3.1 Avaliação da atividade da mieloperoxidase
Como mostrado na Figura 13, a atividade da MPO no grupo veículo foi de 1,99 ± 0,29.
O tratamento com EASg (2, 10 e 50 mg/g) reduziu a atividade da MPO na ferida por incisão
em 71,35; 73,21 e 78,08 % (p < 0,001), respectivamente, em relação ao grupo veículo. Com
Fitoscar ® (60 mg/g), a redução da atividade da MPO foi de 70,50% (p < 0,001).
Figura 13. Efeito da aplicação tópica do veículo, extrato aquoso do infuso
das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg 2, 10 ou 50 mg/g) e Fitoscar®
(60 mg/g) sobre a atividade da mieloperoxidase (MPO), em homogenato
de tecido de pele de ratos, em modelo de cicatrização de ferida por incisão.
As colunas representam média ± EP de n = 9 - 10/animais/grupo. ANOVA
uma via seguida de teste de Student- Newman-Keuls. ***p < 0,001 vs
veículo.
Ve h 2 1 0 5 0 6 0
0
1
2
3
MP
O (
U/g
/tis
su
e)
* * *
m g /gA E S g F ito s c a r m g /g
6.4.3.2 Quantificação do conteúdo de glutationa
No grupo veículo o conteúdo de GSH foi de 11,6 ± 1,69. A aplicação tópica de 2 e 50
mg/g do EASg causou um aumento (p < 0,05) dos níveis de GSH em 75,86 % e 61,20%,
respectivamente, em relação ao grupo veículo. O tratamento tópico com Fitoscar ® (60 mg/g)
não alterou o nível de GSh em relação ao grupo veículo (Figura 14).
Figura 14. Efeito da aplicação tópica do veículo, extrato aquoso do infuso
das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg 2, 10 ou 50 mg/g) e Fitoscar®
70
(60 mg/g) sobre os níveis de glutationa (GSH) em homogenato de tecido
de pele de ratos, em modelo de cicatrização por ferida de incisão. As
colunas representam a média ± EP para n = 9 - 10/animais/grupo. ANOVA
uma via seguido de teste de Student- Newman-Keuls. *p < 0,05 vs veículo.
Ve h 2 1 0 5 0 6 0
0
1 0
2 0
3 0µ
g G
SH
/g t
iss
ue
**
A E S gF ito s c a r m g /g
m g /g
6.4.3.3 Quantificação da atividade da catalase
A atividade da catalase no grupo que recebeu veículo foi de 43,9 ± 4,25
µM/min/gtecido. A aplicação tópica do EASg resultou em aumento da atividade da catalase
(85,87%, p < 0,01) apenas com a maior dose (50 mg/g). Fitoscar ® (60 mg/g) não alterou a
atividade da catalase (Figura 15).
Figura 15. Efeito da aplicação tópica do veículo, extrato aquoso do infuso
das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg 2, 10 ou 50 mg/g) e Fitoscar
(60 mg/g) sobre a atividade da catalase (CAT), em homogenato de tecido
de pele de ratos, em modelo de cicatrização de ferida por incisão. As
colunas representam a média ± EP para n = 9 – 10/animais/grupo. ANOVA
uma via seguido de teste de Student- Newman-Keuls. **p < 0,01 vs
veículo.
71
Ve h 2 1 0 5 0 6 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
uM
CA
T/m
in/g
tis
su
e
* *
A E S gF ito s c a rm g /g m g /g
6.4.4 Determinação de citocinas
O tratamento tópico dos ratos submetidos à ferida por incisão com EASg
(2, 10 e 50 mg/g) não alterou os níveis de IL-1ß, IL-10, IL-17 e TNF α em relação
aos grupos veículo (Figura B - E). No entanto, o EASg na maior dose aumentou em
123,07 % (p < 0,05) os níveis de IL 12 em relação ao grupo veículo.
A aplicação tópica de Fitoscar® (60 mg/g) não modificou os níveis de
nenhuma das citocinas testadas quando comparadas aos respectivos veículos (Figura
16 A-E).
Figura 16. Efeito da aplicação tópica do veículo, extrato aquoso do infuso
das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg 2, 10 ou 50 mg/g) e Fitoscar®
(60 mg/g) sobre os níveis de Interleucina 12p70 (IL-12) (A), Interleucina
1 beta (IL-1β) (B), Interleucina 10 (IL-10) (C), Interleucina 17 (IL-17) (D)
e Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (E), em modelos de ferida por
incisão em ratos. Cada coluna representa a média ± EP para n = 9 –
10/animais/grupo. ANOVA uma via seguido de teste de Student-Newman-
Keuls. *p < 0,05 vs veículo.
72
Ve h 2 1 0 5 0 6 0
0
2 0 0 0
4 0 0 0
6 0 0 0
8 0 0 0
1 0 0 0 0
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tok
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A E S g m g /g F ito s c a r m g /g
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4 0 0
6 0 0
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tok
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su
e (
pg
/g)
A E S g m g /g F ito s c a r m g /g
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73
Ve h 2 1 0 5 0 6 0
0
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1 0 0
1 5 0
2 0 0
cy
tok
ine
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su
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pg
/g)
A E S g m g /g F ito s c a r m g /g
E .
6.4.5 Determinação de óxido nítrico (NO)
O tratamento tópico com EASg (2, 10 e 50 mg/g) e Fitoscar® (60 mg/g) não alterou os
níveis de NO nas feridas incisas de ratos, como visto na Figura 17.
Figura 17. Efeito da aplicação tópica do veículo, do extrato aquoso do
infuso das folhas de Sorocea guilleminiana (EASg 2, 10 e 50 mg/g) e
Fitoscar® (60 mg/g) sobre os níveis de óxido nítrico (NO), em modelo de
ferida por incisão em ratos. As colunasrepresentam a média ± E.P. de três
ensaios independentes em duplicata. ANOVA uma via.
Ve h 2 1 0 5 0 6 0
0
2
4
6
NO
3/N
O2
(mg
/tis
su
e)
A E S g m g /g F ito s c a r m g /g
6.5 Avaliação da atividade cicatrizante in vitro
6.5.1 Riscamento de monocamada celular (scratch assay)
As células que não sofreram qualquer tipo de estimulo (meio) apresentaram taxa de
proliferação/migração de 56,8%. O aumentou (p <0,001) a taxa de proliferação/migração dos
74
fibroblastos em todas concentrações testadas, atingindo seu maior valor (61,55%) com 4
µg/mL. Com 5 ng/mL de PDGF, a taxa de proliferação/migração foi aumentada em 51,44% (p
< 0,001), em relação ao grupo veículo, sendo esta taxa (6,67%) menor (p < 0,05) do que a
observada para 4 µg/mL do EASg (Figura 18).
Figura 18. Efeito do extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea
guilleminiana (EASg 0,8; 4 e 20 µg/mL) sobre a taxa de
proliferação/migração de células N3T3, em ensaio in vitro de riscamento
de monocamada celular (scratch assay). O fator de crescimento derivado
de plaquetas (PGDF) foi usado como controle positivo. As colunas
representam a média ± E.P. de três ensaios independentes em duplicata.
ANOVA uma via seguida do teste de Student-Newmn-Keuls. ***p < 0,001
vs. veículo. †p < 0,05 vs. PDGF.
M e d iu m 0 ,8 4 2 0 1 0 0 5
0
2 0
4 0
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8 0
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* * *
* * *
* * ** * *
P D G F n g /m L g /m L
6. DISCUSSÃO
Sorocea guilleminiana é usada na forma de infusão das folhas pela população do Vale
do Juruema para o tratamento de feridas, infecções, gastrite, doença renal e inflamação (Bieski
et al., 2015). Foi preparado o extrato aquoso do infuso das folhas de Sorocea guilleminiana
(EAsg) para caracterização química, avaliação da toxicidade e atividade cicatrizante de feridas
em modelos experimentais in vivo e in vitro. Usou-se essa preparação para reproduzir na íntegra
o modo de preparo utilizado na medicina popular.
75
No Brasil, a A RDC nº 26/2014 dividiu os produtos fitoterápícos licenciados em duas
categorias: i. medicamento fitoterápico, que é o produto licenciado com base em testes de
segurança e eficácia, em ensaios clínicos e não clínicos e ii. produto tradicional à base de
plantas, licenciado através da tradicionalidade de uso, porém com base em provas de eficácia e
segurança apresentadas no pedido de licenciamento (CARVALHO et al., 2017 ).
No levantamento realizado junto às comunidades que habitam o Vale do Juruena não
foi informada qualquer toxicidade pelo uso de preparados das folhas de S. guilleminiana. No
entanto, os estudos de avaliação toxicológica pré-clínica de uma droga ou planta medicinal
visando o desenvolvimento de um fármaco ou medicamento fitoterápico exigem testes de
segurança em modelos animais e in vitro (LAPA et al., 2000).
Os testes de citotoxicidade são frequentemente os primeiros utilizados para avaliação da
segurança de fármacos e extratos de plantas medicinais (ANVISA, 2013). A citotoxicidade do
EASg foi avaliada em células CHO-Kl, considerada um teste alternativo recomendado por
agências de regulação de medicamentos em todo o mundo, por ser por ser sensível reprodutível,
fácil de gerenciar e envolver menor custo (PINTO; KANEKO; PINTO, 2010). O EASg não
apresentou citotoxicidade em células CHO-K1, considerando os critérios estabelecidos por
Suffness e Pelluzo (1990), indicando ausência de efeitos adversos resultantes da interferência
nos processos essenciais para a sobrevivência, proliferação e função celular (OECD/GD 129,
2010).
A relação entre citotoxicidade in vitro e letalidade aguda in vivo, permite a determinação
das doses de partida para testes de toxicidade oral aguda em roedores (NIH, 2006; OECD/GD 129,
2010). Para avaliação da toxicidade aguda oral do EASg empregou-se o sreening hipocrático,
que consiste na administração de doses únicas do material em teste em camundongos e
observação por 14 dias do aparecimento de sinais e sintomas típicos de toxicidade, bem como
de sua letalidade (ANVISA, 2013).
A administração de doses do EASg de até 2000 mg/kg em camundongos de ambos os
sexos, não foi seguida de quaisquer alterações físicas e comportamentais doa animais, a não ser
um aumento do peso relativo do estômago nos camundongos fêmeas. Alterações nos órgãos são
indicadores claros de dano causado pelas substâncias testadas em modelo de toxicidade aguda
(TRAESEL et al., 2014). Como essa alteração só ocorreu nas fêmeas é provável que diferenças
hormonais entre os sexos possam estar envolvidas neste efeito (SANTOSA; JENSEN, 2015).
No entanto, o extrato será avaliado pelo teste toxicidade subcrônica em ratos para avaliar melhor
esse e outros possíveis efeitos adversos. Este é o primeiro relato sobre a avaliação da toxicidade
76
aguda de S. guilleminiana que constatou que o EASg é seguro quando administrado por via
oral, em dose única. Os resultados de citotoxicidade em CHO-K1 e toxicidade aguda in vivo em
camundongos indicam que o EASg é seguro quando tomado de forma aguda.
Com base nos resultados de toxicidade aguda em camundongos, pode-se afirmar que a
população que faz uso do infuso das folhas de S. guilleminiana, toma diariamente uma dose
total de cerca de 214 vezes menor do que a dose máxima testada (2000 mg/kg) em
camundongos, a qual essa dose se mostrou não tóxica, indicando uma ampla margem de
segurança quando do uso oral deste preparado pelas comunidades. No entanto, para se verificar
o efeito acumulativo do infuso quando tomado de modo prolongado (por 30 dias ou mais)
fazem-se necessários à avaliação deste através de testes de toxicidade subcrônica e crônica em
roedores e não roedores (AHMAD, 2008).
Em situações em que é necessário o uso prolongado ou contínuo de um dado
medicamento, faz-se necessário a avaliação de seu potencial genotóxico (HORNBERG et
al.,2004). Com a finalidade de avaliar o potencial genotóxico do EASg utilizou-se os testes de
MN e COM in vitro (CHO-k1), considerados um dos principais testes para avaliação do
potencial que um dado medicamento tem de provocar mutações genéticas e/ou cromossômicas
(TIMBRELL, 2009).
O teste de MN foi utilizado para avaliar o dano do DNA cromossômico quantificando-
se o número de MN, DB, NB e o valor de IDN em células CHO-k1, usando citocalasina B (4,5
µg/mL) como droga bloqueadora da citocinese. A observação de que os danos nos
cromossomos podem ser causados pela exposição de radiação de ions ou substancias
carcinogenicas estão entre as primeriras evidências confiaveis que agentes quimicos e fisicos
poderiam ser os principais causadores do material genético em células eucarioticas (FENECH,
2000).
O EASg não causou alterações no número de MN, PD e BT, porém reduziu, em todas
as concentrações, o valor de IDN, atingindo 26,08 % de redução com 10 µg/mL. A redução do
IDN indica que parte das células CHO-k1 não completaram a divisão celular durante a fase de
bloqueio da citocinese quando expostas ao EASg (PAGE, 2012).
Em todos os guias de avaliação toxicológica pré-clínica é referida, pelo menos, a
realização de mais de um teste para confirmar ou não o potencial genotóxico de um dado
produto (ANVISA, 2010). Desse modo, realizou-se o ensaio de COM utilizando-se H2O2 como
agente genotóxico. O H2O2 causa extenso dano oxidativo do DNA através do aumento
expressivo da formação de ROS, sendo considerado como um dos causadores maiores de
77
mutações e morte celular (SPONCHIADO et al., 2016). O EASg foi capaz de reduzir o dano
ao DNA induzido por H2O2 quando do pré, co e pós-tratamento, sugerindo que o extrato
previne, evita desenvolvimento e repara o dano nuclear, portanto, apresentando atividade
antigenotoxigênica e antigenotóxica. Esse resultado torna necessário avaliar o potencial
antimultagênico do extrato no teste de AMES (CANO et al., 2017).
Após os estudos toxicológicos preliminares, procedeu-se com a avaliação da atividade
cicatrizante do EASg, através dos testes de ferida por excisão e incisão em ratos e de riscamento
de monocamada em células N3T3.
A cicatrização de feridas é um processo que consiste em diferentes fases como
inflamação, proliferação e remodelação ou maturação (SHRIMANKER et al., 2013). O modelo
de feridas por excisão é o método mais utilizado para avaliar substâncias com potencial
atividade cicatrizante de feridas. Basicamente, avalia a evolução do processo cicatricial,
mediante determinação da taxa de contração das feridas e do período de re- epitelização da pele
(POPE, 1996; SHRIMANKER et al., 2013).
O EASg (2 e 50 mg/kg tópico) aumentou a taxa de contração da ferida por excisão em
ratos no 5°, 7° e 9° dias, enquanto a pomada Fitoscar®, droga padrão para este ensaio, foi ativa
apenas no 9° dia. Ambos preparados atuaram no período correspondente à fase proliferativa,
que inicia em torno do 4° dia e se estende até o 14° dia. Nessa fase, os fibroblastos dos tecidos
vizinhos migram para a ferida e o TGF-β liberado estimula os fibroblastos a produzirem
colágeno tipo I e a transformarem-se em miofibroblastos, que promovem a contração da ferida.
No entanto, o EASg e a Fitoscar ® não interferiram no período de re-epitelização,
acontecimento terminal no processo de reparo, e que depende da ativação dos queratinócitos,
indicando que a atividade cicatrizante verificada para estes dois preparados não se dá na fase
de remodelagem (GONÇALEZ et al., 2016) e que o efeito do EASg se deu mais precocemente
e de forma mais extensa que a droga padrão.
A resistência à tração de uma ferida indica o quanto o tecido reparado resiste à ruptura
sob tensão e pode indicar, em parte, a qualidade e o grau de cicatrização de feridas (PAWAR et
al., 2013). O modelo de ferida por incisão em ratos foi utilizado para avaliar se o EASg
aumentava a força de resistência da ferida no 9° dia. Nesse modelo, o EASg aumentou
significativamente a resistência da ferida à tração, enquanto a pomada Fitoscar® não alterou
esta propriedade. Esses resultados indicam que o EASg pode estar favorecendo a proliferação
de fibroblastos e acumulo continuo de colágeno, componente extracelular mais abundante no
tecido de granulação e responsável pela resistência da tração na pele (MAHONEY et al., 2008).
78
As análises histopatológicas da pele incisa dos ratos revelaram que o EASg nas doses
de 10 e 50 mg/g, aumentou de forma significativa a reepitelização e proliferação no 9º dia do
ensaio, enquanto a Fitocar® (60 mg/g tópico) aumentou de forma significativamente os
parâmetros de reepitelização, proliferação e colagenese. Segundo Mukherjee et al (2000) a
intervenção em qualquer uma das fases do processo cicatricial pode, eventualmente, levar a
uma promoção no processo de cura da ferida. O aumento de colágeno tipo I em todas as doses
de extrato testada e a fitoscar (padrão desse experimento), indica que a ferida está tendo mais
produção de novo colágeno e ajuda na força de resistência a ferida com essa nova produção
Com o intuito de confirmar se o efeito cicatrizante do EASg observado nos ensaios de
feria por excisão e de aumento da resistência da ferida incisa à tração se deu pelo aumento da
atividade estimulante da proliferação/migração de fibroblastos realizou-se o teste de riscamento
em monocamada usando-se fibroblastos N3T3. Esse ensaio tem sido amplamente utilizado para
se ter uma visão do potencial poder de reparo dérmico de drogas, mediante determinação da
percentagem da área fechada no riscamento (SHRIMANKER et al., 2013). O EASg em todas
as concentrações testadas (0,8, 4 e 20 µg/mL) promoveu aumentou a taxa de
proliferação/migração celular, sendo significantemente mais efetivo que o PGDF (5 ng/mL)
quando administrado na concentração de 4 µg/mL (GURTNER et al., 2008). Esses resultados
juntamente com os obtidos no modelo de ferida por incisão indicam que a ação cicatrizante do
EASg depende, pelo menos, em parte, de seu efeito estimulante direto sobre a proliferação ou
migração de fibroblastos. Até o presente momento, não há estudos que comprovem a atividade
cicatrizante do EASg, nem de outras atividades, assim sendo todos os resultados apresentados
para esse estudo são inéditos.
Demonstrada a atividade cicatrizante de ferida pelo EASg, partiu-se os estudos de
mecanismo de ação envolvendo alguns marcadores deste processo. Foram avaliados o poder
antioxidante do EASg, através dos ensaios de MPO, GSH e CAT, e anti-inflamatório, através
da determinação de citocinas pró-(IL-1β, TNF-α, e IL-12p70 e IL-17) e anti-inflamatórias (IL-
10) e NO no modelo de ferida incisa em ratos.
A MPO é uma enzima liberada, principalmente, quando da ativação de neutrófilos,
caracterizada pelo poderoso efeito pró-oxidante e pró-inflamatório. Catalisa a conversão de Cl-
e H2O2, a ClO- durante a inflamação (LORIA et al., 2008). O EASg apresentou potente e intensa
redução da atividade da MPO, em todas as doses (0,2, 10 e 50 mg/kg tópico), reduzindo a
formação de espécies reativas de oxigênio pela MPO.
A GSH é um dos principais constituintes dos mecanismos de defesa celular contra o
79
estresse oxidativo, a qual atua diretamente ou via glutationa peroxidase nas reações de
scavenger de ROS. O conteúdo intracelular de GSH e glutationa oxidada (GSSG) normalmente
é mantido elevado, através da redução da GSSG à GSH pela enzima glutationa redutase. Isso
permite que haja uma quantidade considerável de GSH para atuar como uma substância
antioxidante no organismo (PARIHAR et al., 2008). Neste estudo, o EASg apresentou potente
atividade antioxidante, aumentando os níveis de GSH quando da aplicação tópica de 0,2 e 50
mg/g.
A CAT compõe, juntamente com a GPx e SOD, o grupo de enzimas antioxidantes
endógenas e constituem o primeiro nível de defesa contra os radicais livres,. Promove a
hidrolise da H2O2, em H2O e O2 (RATNAM et al., 2006). A aplicação tópica do EASg aumentou
a atividade da CAT apenas na maior dose. Analisando conjuntamente os resultados do EASg
sobre a produção de ROS em feridas incisas, pode-se afirmar que a redução destas espécies
reativas pelo EASg é parte importante de seu efeito cicatrizante de feridas.
A cicatrização de feridas cutâneas envolve uma série de processos complexos que
precisam da interação de citocinas e fatores de crescimento produzidos por muitas células
especializadas diferentes. Durante a resposta tardia, o macrófago ativado é essencial para a
transição da fase inflamatória para a proliferativa, atuando na angiogênese, fibroplasia e síntese
de óxido nítrico (NO), além de numerosas enzimas secretadas pelos macrófagos, incluindo as
colagenases. Os seus principais produtos são as citocinas pró-inflamatórias: TNF- α, IL-1 e IL-
6, que neutralizam agentes invasivos e limitam o dano tecidual, além de citocinas anti-
inflamatórias IL-10, TGF- β e inibidores de metaloproteinases, que combatem o recrutamento
e ativação de células inflamatórias, reduzem a formação de radicais ivres de oxigênio
(BROUGHTON II; JANIS; ATTINGER, 2006; BANGERT; BRUNNER; STINGL,2011;
WIDGEROW, 2012). A IL-10 atua por bloqueio seletivo da expressão de genes codificadores
de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, favorecendo a cicatrização.
A liberação dessas citocinas pró-inflamatórias TNF- α, IL-1β, IL-6 e IL-8 , IL-17 e IL12,
via ativação de NF-kB, um fator de transcrição, resulta em resposta inflamatória através do
recrutamento de neutrófilos e macrófagos para a ferida (KANDHARE et al., 2014a). Isso leva
à liberação de ROS e espécies reativas de nitrogênio (RNS) incluindo superóxido, peróxido
hidrogênio, radical hidroxilo, ácido hipocloroso, óxido nitrico e peroxinitrito que contribuem
para a patogênese de feridas. Foi relatado que níveis elevados de TNF-a e IL-1β causaram
apoptose e diminuição da proliferação de fibroblastos resultando em retardo da cicatrização de
feridas (BASHIR et al., 2009).
80
A administração do EASg sobre a ferida incisa não alterou significantemente as
concentrações de TNF-α, IL- 10 e IL-1β e IL-17 e reduziu os níveis de IL-12 apenas na maior
dose. Esses resultados indicam que o efeito cicatrizante de ferida pelo EASg não envolve a
participação de citocinas e assim o EASg não interfere com os papeis reguladores que exercem
estes mediadores durante a fase proliferativa do processo cicatricial, espoecilamente de
fibroplasia e recrutamento de fibroblastos.
Uma perspectiva importante para o reparo é a modulação do óxido nítrico (NO) um
mensageiro intracelular que participa em vários processos patológicos e fisiológicos. Produzido
durante a fase inflamatoria e proliferativa, este é capaz de regular a formação de colágeno, a
proliferação celular e a contração de ferida. Serve como um oxidante e armadilha ROS e protege
a célula de peroxidação lipídios, dano do DNA e morte celular (PATIL et al., 2012b, 2012e). O
tratamento com EASg não foi capaz de reduzir os níveis de NO nas feridas incisas no 9° dia,
indicando que o efeito cicatrizante verificado para o EASg independe do NO.
Os resultados preliminares da fitoquimica por CCD indicaram forte presença de
compostos especialmente flavonoides, além de terpenos e/ou esteroides no EBM das folhas de
S. guilleminiana, classes com uma vasta atividade farmacológica, incluindo cicatrizante de
feridas (VIEIRA, 2008). Por HPLC foi confirmado a presença de compostos fenólicos. Esses
resultados, embora preliminares, são promissores e instigam a continuidade dos estudos
fitoquímicos para o isolamento e identificação dos possíveis princípios ativos presente nesta
planta.
8- CONCLUSÃO
O EASg é seguro quando administrado por via oral e em única dose. Não é citotóxico e
nem genotóxico e apresenta potencial antigenotoxigênico e antigenotóxico. Os resultados
comprovam o uso popular do infuso de S. guilleminiana para tratamento de feridas cutâneas,
possivelmente por estimular a proliferação de fibroblastos com consequente deposição de
colágeno e transformação em miofibroblastos, essenciais no processo de cicatrização. Esse
efeito pode estar relacionado à potente atividade antioxidante do EASg, possivelmente
decorrentes das presenças de compostos fenólicos no EASg. No entanto, ensaios
complementares são necessários para elucidar o mecanismo de ação cicatrizante de ferida
apresentado pelo EASg e os possíveis compostos envolvidos nesta ação.
81
9- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABEGÃO, K.G.B. Efeitos do gel de plasma rico em plaquetas heterólogo na cicatrização
de feridas dérmicas padronizadas em coelhos. (DISSERTAÇÃO) Mestrado em Ciência
Animal, Presidente Prudente. Universidade do Oeste Paulista, 2014.
ABRUCEZE, L.H.B. Avaliação da eficácia dos biocurativos em ratos Wistar com lesões de
82
pele causadas por queimaduras. (DISSERTAÇÃO) Mestrado em Biotecnologia, Botucatu.
Faculdade de Medicina de Botucatu, 2013.
AEBI, H. Catalase in vitro. Methods Ensymol, 1984.
AHMAD, M. H. A review of medicinal plant research at the University of West Indies, Jamaica,
1948-2001. West Indian Medicinal Journal, v 55, n 4, p 243-269, 2008.
ALLEN, T.C. Hematoxylin and eosin. In: Prophet, E. B.; Mills, B.; Arrington, B. J.; Sobin, H.
L. Laboratory Methods in histotechnology. AFIP: Washington, 1992.
AMORIM, E.L.C.; NASCIMENTO, J.E.; MONTEIRO, J.M.; SOBRINHO, T.J.S.; ARAUJO,
T.A.S.; ALBUQUERQUE, U.P. A simple and accurate procedure for the determination of
tannin and flavonoid levels and some applications in ethnobotany and ethnopharmacology.
Func Ecosyst and Communit. v. 2, n. 1, p. 88- 94, 2008.
ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RDC n° 26, de 13 de maio de 2014.
ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia para condução de estudos não
clínicos de toxicologia e segurança farmacológica necessários ao desenvolvimento de
medicamentos, versão 2, 2013.
ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RE n°90. Guia para a realização de
estudos de toxicologia pré-clinica de fitoterápicos, 2010. BANGERT, C.; BRUNNER, P.M.;
STINGL, G. Immune functions of the skin. Clin. Dermatol., v. 29, p. 360–376, 2011.
BASHIR, M.; SHARMA, M.; WERTH, V. TNF-a production in the skin. Archives of
Dermatological Research, v.301, p.87–91, 2009.
BIESKI, I.G.C.; SANTOS, F.R.; OLIVEIRA, R.M.; ESPINOSA, M.M.; MACEDO, M.;
ALBUQUERQUE, U. P.; MARTINS, D. T.O. Ethnopharmacology of Medicinal Plants of
the Pantanal Region (Mato Grosso, Brazil). Evidence-Based Complementary and Alternative
Medicine, 2012.
83
BIESKI, I. G. et al. Ethnobotanical study of medicinal plants by population of Valley of Juruena
Region, Legal Amazon, Mato Grosso, Brazil. J Ethnopharmacol, Jul 30 2015.
BANGERT, C.,BRUNNER, P.M., STINGL, G. Immune functions of the skin. Clin. Dermatol.,
v. 29, p. 360–376, 2011.
BORGES, E.L. Fatores Intervenientes no processo de Cicatrização. In: BORGES, E. L. et al.
Feridas como tratar. 2° Edição. Belo Horizonte: Coopmed, 2008.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RDC n° 17 de 24 de
fevereiro de 2000. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Diário Oficial da
República Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, DF, 25 fev. 2000.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RDC n° 48 de 16de
março de 2004. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Diário Oficial da
República Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, DF, 18 mar. 2004a.
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Portaria n° 971 de
03 de maio de 2006. Aprova a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares
(PMPIC) no Sistema Único de Saúde. Diário Oficial da República do Brasil, Poder Executivo,
Brasília, DF de 4 mai. 2006a.
BRASIL. Presidência da República. Casa Civil. Decreto n° 5813 de 22 de junho de 2006.
Aprova a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos e dá outras providências.
Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, DF, 22 jun.2006b.
BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria Interministerial nº 2.960, de 9 de dezembro de 2008.
Aprova o Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos e cria o Comitê Nacional
de Plantas Medicinais e Fitoterápicos. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Poder
Executivo, Brasília, DF, 10 dez. 2008.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities
84
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, v. 72, p.
248–54, 7 maio 1976.
BROUGHTON, G; JANIS, J.E.; ATTINGER, C.E. The basic science of wound healing. Plast
Reconstr Surg. 2006;117(7 Suppl):12S-34S
CAMPOS, A.C.L.; BORGES-BRANCO, A.; GROTH, A.K. Cicatrização de feridas. ABCD,
Arquivo Brasileiro de cirurgia Digestiva, V. 20, n.1, São Paulo, 2007.
CANO, B.L.; MOREIRA, M.R.; GOULART, M.O.; GONÇALVES, N.S.; VENEZIANI,
R.C.S.; BASTOS, J.R.; AMBROSIO, S.R.; DOS SANTOS, R.A. Comparative study of the
cytotocity and genotoxicity of kaurenoic acid and its semi-synthetic derivatives methoxy
kaurenoic acid and kaurenol in CHO-K1 cells. Food and chemical toxicology, v.102, 2017.
CARVALHO, L.H.; BRANDÃO, M.G.L.; SANTOS-FILHO, D.; LOPES, J.L.; KRETTLI,
A.U. Antimalarial activity of crude extracts from Brazilian plants studied in vivo in
Plasmodium berghei-infected mice and in vitro against Plasmodium falciparum in culture.
Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 24, 1113- 1123, 2017.
CHAN, P.; O’HARA, G.; HAYES, A.W. Principles and methods for acute and subchronic
toxicity. Principles and methods of toxicology, v. 12, p. 17-19, 1982.
85
CHEN, J.C.; CHEN, H.M.; SHYR, M.H.; FAN, L.L.; CHI, T.Y.; CHI, C.P.; CHEN, M.F.
Selective inhibition of inducible nitric oxide in ischemia-reperfusion of rat small intestine.
Journal of the Formosan Medical Association, v. 99, n.3, p.213-218, 2000.
CLARK, R.A.F. Cutaneous tissue repair. Basic biologic considerations. Jorn. Am. Acad
Dermatol, 1985.
COCHARD, L.R. Atlas de embriologia humana de Netter. Porto Alegre: Artmed; 2003.
DEALEY, C. Cuidados de Feridas: um guia para as enfermeiras. São Paulo, Editora:
Atheneu, 2001.
DE ALMEIDA,T. L. Desenvolvimento de membrana composta de PVAL e quitosana
compatível com o sistema dermo – epidérmico. Dissertação de mestrado em ciências na área
de tecnologia nuclear. INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES,
Universidade de São Paulo, 2009.
DE AZEVEDO NETA MAHON, C. P. et al. Toxicological evaluation of the hydroethanolic
extract of Dilodendron bipinnatum Radlk. J Ethnopharmacol, v. 155, n. 1, p. 665-71, Aug 8
2014.
DE JESUS, N.Z.T.; LIMA, J.C.S.; DA SILVA, R.M.; ESPINOSA, M.M.; MARTINS, D.T.O.
Levantamento etnobotânico de plantas popularmente utilizadas como antiúlceras e
antiinflamatórias pela comunidade de Pirizal, Nossa Senhora do Livramento - MT, Brasil.
Revista Brasileira de Farmacognosia, v.19, n.1A, p.130-139, 2009.
DONG, Y-L; FLEMING, R.Y.D.; YAN, T.Z; HERNDON, D.N; WAYMACK, J. P. Effect of
ibuprofen on the inflammatory response to surgical wounds. J Trauma, v. 35, p. 340-343,
1993.
DVIVEDI, S.; TIWARI, S.M.; SHARMA, A. Effect of ibuprofen and diclofenac sodium on
experimental wound healing. Indian, J Exp Biol, v. 35, p.1243-1245, 1997.
86
ERENO, D. Curativo de Borracha. Revista Pesquisa Fapesp, número 88, junho de 2003,
disponível em http://www.fapesp.org.br/ www.revistapesquisa.fapesp.br
ETHRIDGE, R. T.; LEONG, M.; PHILLIPS, M.T. Cicatrização de feridas. In: TOWNSEND,
C.M. et al. Tratamento de cirurgia. Rio de Janeiro: Elsever, 2010.
FENECH, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research. v. 455, p. 81–
95,2000.
FERREIRA, A.S.; BARBIERI, C.H.; MAZZER, N.; CAMPOS, A.D.; MENDONÇA, A.C.
Measurement of healing area using planimetry after applying low-intensity ultrasound to the
skin of rats. Revista Brasileira Fisioterapia, v. 12, n. 5, p. 351-8, 2008.
FERREIRA, H. R. Efeitos da suplementação de β-hidroxi-β-metilbutirato (hmb) através
de marcadores fisiológicos, bioquímicos e biomecânicos em atletas de alto rendimento de
canoagem. (TESE) Doutorado em Educação Física do Programa de Pós Graduação em
Educação Física do Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Paraná. 2013.
FLORA DO BRASIL 2020 em construção. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível
em: <http://floradobrasil.jbrj.gov.br/ >. Acesso em: 26 Abr. 2018.
FRANZ, M.G.; STEED, D.L.; ROBSON, M.C. Optimizing healing of the acute wound by
minimizing complications. Current Problems in Surgery, v.44, n.11, 2007.
FRONZA, M.; HEINZMANN, B.; LAUFER, S.; MERFORT, I. Determination of the wound
healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. Journal of
ethnopharmacology v. 126, p. 463–467, september.2009.
GAO, R.; YUAN, Z.; ZHAO, Z.; GAO, X. Mechanism of pyrogallol autoxidation and
determination of superoxide dismutase enzyme activity. Bioelectrochem. Bioenerg, v.45, 1998.
87
GAUTAM, M.K.; PUROHIT, V.; AGARWAL, M.; SINGH, A.; GOEL, R.K. In vivo healing
potential of Aegle marmelos in excision, incision, and dead space wound models, 2014.
GAUTAM, M.K.; et al. Healing effects of Aegle marmelos (L.) Correa fruit extarct on
experimental colitis. Indian Journal of Experimental Biology, vol. 51, no. 2, pp. 157–164, 2013.
GONZALEZ, A.C.; COSTA, T.F.; ANDRADE, Z. A., MEDRADO, A.R.A.P. Wound
healing - A literature review. Anais Brasileiros de Dermatologia, v.91, n.5, 2016.
GRAY, H; et al. Gray’s anatomy: the anatomical basis of medicine and surgery. Nova Iorque:
Churchill Livingstone; 1995. p.76.
GUO, S.; DIPIETRO, L.A. Factors Affecting Wound Healing. Journal of Dental Research,
v.89, n°3, p.219-229, 2010
GURTNER, G.C.; WERNER, S.; BARRANDON, Y.; LONGAKER, M.T. Wound repair and
regenerations. Nature, v. 15, n.453,2008.
HALL, J.E. In: PROPHET, E.B.; MILLS, B.; ARRINGTON, B.J.; SOBIN, H. L. Laboratory
Methods in Histotechnology. AFIP: Washington, 1992.
HOFMAN, D. et. al. Use of topical corticosteroids on chronic leg ulcers. Journal of Wound
Care, v. 16, n. 5, 2007.
HORNBERG, J.J. et al. Exploratory toxicology as na integrated parto f drug Discovery. Parte
I. Why and how. Drug Discovery today, v. 19, n.8, p.1131-1135, 2004.
HUMASON, G. L. Animal Tissue Techniques. 3. ed.: San Francisco: WH Freeman. p.641,
1972.
88
ICH, 2012. International Conference on Harmonisation; guidance on S2 (R1) Genotoxicity
Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals intended for Human Use; availability.
Notice in: Food, D.A. (Ed.), pp. 33748–33749.
ISHIDA, Y., MUKAIND, N., KONDO, T. The role of IL-1 receptor antagonist in skin wound
healing. Inflamm Reg, v. 28, p. 31 – 35, 2008.
ISSAC, C.; LADEIRA, P.R.S.; DO RÊGO, F.M.P.; ALDUMATE, J. C.B.; FERREIRA, M.C.
Processo de cura das feridas: Cicatrização fisiológica. Revista Médica, 2010.
JACCOB, A. A. Protective effect of N-acetylcysteine against ethanol-induced gastric ulcer: A
pharmacological assessment in mice. J Intercult Ethnopharmacol, v. 4, n. 2, p. 90-5, Apr-Jun
2015.
JONES, M.K.; WANG, H.; PESKAR, B. M.; LEVIN, E.; ITANI, R.M.; SARFEH, I.J.; et al.
Inhibition of angiogenesis by nonsteroidal anti-inflammatory drugs: insight into mechanisms
and implications for cancer growth and ulcer healing. Nat Med, v.5, p. 1418-1423, 1999.
JORGE, M.P. Atividade cicatrizante do extrato bruto de Arrabidaea chica (HUMB. E BONPL)
Verlot. Campinas, 2008.
KANDHARE, A. D.; GHOSH, P.; BODHANKAR, S. L. Naringin, a flavanone glycoside,
promotes angiogenesis and inhibits endothelial apoptosis through modulation of inflammatory
and growth factor expression in diabetic foot ulcer in rats. Chemico Biological Interactions,
v. 219, p.101–12, 2014a.
KANDHARE, A.D.; RAYGUDE, K.S.; GHOSH, P.; et al. Effect of hydroalcoholic extract of
Hibiscus rosa sinensis Linn. leaves in experimental colitis in rats. Asian Pacific Journal
Tropical Biomedicine, v5,p337–44, 2012 d.
KANDHARE, A. D.; RAYGUDE, K. S.; SHIVA KUMAR, V.; et al. Ameliorative effects
quercetin against impaired motor nerve function, inflammatory mediators and apoptosis in
neonatal streptozotocin-induced diabetic neuropathy in rats. Biomedicine Aging Pathology,
89
v.2, p173–86, 2012 e.
KRISCHAK, G.D.; AUGAT, P.; CLAES, L.; KINZL, L.; BECK, A. The effects of
nonsteroidal anti-inflammatory drug application on incisional wound healing in rats. Journal
Wound Care, v.16, p. 76-78, 2007.
LAPA, A.J. et al. Farmacologia e toxicologia de produtos naturais. In: SIMÕES, C.M.M.; et al.
Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2° ed. Florianópolis, UFSC. Porto Alegre: UFRGS,
cap. 35, p.181-196, 2000.
LAUREANO, A; RODRIGUES, A.M. CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS. Revista da Spdv,
[s.l], v. 3, n. 69, p.355-367, 2011.
LI, J.; CHEN, J.; KIRSNER, R. Pathophysiology of acute wound healing. Clinica
Dermatologica, 2007.
LIMA, C.R.O. Reparação de feridas cutâneas incisionais em coelhos após tratamento com
barbatimão e quitosana. (DISSERTAÇÃO) Mestrado em Veterinária, Programa de Pós-
Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária, Universidade Federal de Goiás, 2010.
LIMA, M.H.M.; ARAUJO, E.P. Diabetes mellitus e o processo de cicatrização cutânea diabetes
mellitus and the process of cutaneous healing. Cogitare Enfermagem, v.18, n.1, 2013.
LORIA, V.; DATO, I.; GRAZIANI, F.; BIASUCCI, L.M. Myeloperoxidase: a new biomarker
of inflammation in ischemic heart disease and acute coronary syndromes. Mediators
Inflammation. 2008; 2008: 135625. DOI: 10.1155/2008/135625.
MAHONEY, M.G. et al. Extracellular matrix in cutaneous ageing: the effects of 0.1% copper-
zinc malonate-containing cream on elastin biosynthesis. Experimental dermatology, v. 18, n.
3, p. 205–11, mar. 2008.
MAITY, P. D.; BANDYOPADHYAY, U.; MISHRA, S.K. biological activities of crude
extracts and chemical constituents of bae, Aegle marmelos (L.) Corr. Indian Journal of
Experimental Biology, vol. 47, no. 11, pp. 849–861, 2009.
90
MALONE, M.H.; ROBICHAUD, R.C. A Hippocratic screen for pure or crude drug materials.
Lloyd, v. 25, p. 320-332, 1962.MANDELBAUM, S.H.; DI SANTIS. E.P.; MANDELBAUM,
M.H.S. Cicatrização: conceitos atuais e recursos auxiliares – Parte 1. Anais Brasileiro de
Dermatologia. Rio de Janeiro, 2003.
MARKLUND, S. e MARKLUND, G. Involvement of the superoxide anion radical in the
autoxidation of Pyrogallol and a conveniente assay for superoxide dismutase. The Journal
FEBS, v.47, n.3, 1974.
MASCARENHAS, A. O. Gestão estratégica de pessoas. São Paulo: Cengage Learning. 2009.
MASCARENHAS, G. A Biodiversidade Brasileira no Âmbito do Acordo TRIPS. 2009, v. 3,
m. 2 jul/dez, p. 24, 2009. Disponível em: <
http://ocs.ige.unicamp.br/ojs/rbi/article/view/277/193 >.
MAUAD JR., R.J. Cicatrização de feridas. In: MORAES, I. N. Tratado de clínica cirúrgica.
São Paulo: Roca, 2005. v.2, Cap. 238, p.1789-1792.
MATO GROSSO. 2012.”Planos plurianual 2010-2015 do Governo do Estado,”Projeto de lei.
Seplan, MT.
MATOS, F. J. de. Introdução à fitoquímica experimental. Fortaleza: Edições UFC, 1988.
MEDEIROS, F.; LEITÃO, S. G.; FONSECA-KRUEL, V. S.; SILVA, I. M.; MARTINS, K.
Aspectos biométricos dos frutos e sementes de Sorocea guilleminiana Gaudich. (Moraceae)
nativa do acre. xii congresso de ecologia do brasil, 2005.
MUKHERJEE, P.K. et al. Evaluation of in vivo wound healing activity of Hypericum patulum
(Family:Hypericaceae) leaf extract on different wound model in rats. Journal of
ethnopharmacology, v.70, p.315-21, 2000.
MUSTOE, T.A. et al. Accelerated healing of incisional wounds in rats induced by transforming
91
growth factor-β. Science, v. 237, p. 1333-1335, 1987.
MYERS, A. H.; POSTLETHWAIT, R. W.; SMITH, A. G. Histologic grading of the
experimental healing wound. Archives of Surgery, v. 83, n.5, p.771-74, 1961.
NABAVI, S.F. et al., Hepatoprotective effect of gallic acid isolated from Peltiphyllum peltatum
against sodium fluoride-induced oxidative stress. Industrial Crops and Products, v. 44, p.50-
55, 2013.
NAGY, E.; ZINGG, W. Simple standardized method of studying the tensile strength of healing
incisions in animals. Cannadian journal surgery, v. 14, p. 136-140, 1971.
NAKAYAMA, G.R. et al. Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and
viability in vitro. Journal of immunological methods, v. 204, n. 2, p. 205–8, 26 maio 1997.
OECD. Test No. 423: Acute Oral toxicity - Acute Toxic Class Method. OECD Publishing,
2002.
OECD. Guidance document on using cytotoxicity tests to estimate starking doses for acute oral
systemic toxicity tests, n°129. Paris: OECD, 2010.
OLIVEIRA, M.C.; LEMOS; L.M.S.; OLIVEIRA, R.G.; DALL׳OGLIO, E.L.; SOUSA
JÚNIOR, P.T.; MARTINS, D.T.O. Evaluation of toxicity of Calophyllum brasiliense stem bark
extract by in vivo and in vitro assays. Journal of Ethnopharmacology, v.155, p.30–38, 2014.
PAGE, S. Ruthenium compounds as anticâncer agentes. Education in chemistry, p.26-29, 2012.
PAGGIARO, A.O.; NETO, N.T.; FERREIRA, M.C. Princípios gerais do tratamento de feridas.
Revista Medica, São Paulo, V. 89, n. 3, 2010.
PARIHAR, A. et al. Oxidative stress and anti-oxidative mobilization in burn injury. Burns, v.
3/4, p. 6 -1 7, 2008.
92
PARK, B. K.; LEE, S.; SEO, J. N; RHEE, J.W.; PARK, J.B; KIM, Y.S; CHOI, I.G.; KIM,
Y.E.; LEE, Y.; KWON, H.J. Protection of burn-induced skin injuries by the flavonoid
kaempferol. BMB Rep. v.43, p. 46-51, 2010.
PATIL, M. V. K.; KANDHARE, A. D.; BHISE, S. D. Pharmacological evaluation of ethanolic
extract of Daucus carota Linn root formulated cream on wound healing using excision and
incision wound model. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, v.2, p.646–55, 2012d.
PATIL, M. V. K.; KANDHARE, A. D.; GHOSH, P.; BHISE, S. D. Determination of role of
GABA and nitric oxide in anticonvulsant activity of Fragaria vesca L. ethanolic extract in
chemically induced epilepsy in laboratory animals. Oriental Pharmacy and Experimental
Medicine, v.12, p.255–64, 2012 e.
PEIXOTO-SOBRINHO, T.J.S. et al. Validação de metodologia espectrofotométrica para
quantificação dos flavonóides de Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel. Revista Brasileira
Ciências Farmacêuticas, v.44, n.4,2008.
PIERINGER, H; STUBY, U; BIESENBACH, G. Patients with rheumatoid arthritis undergoing
surgery: how should we deal with antirheumatic treatment?. Seminars in Arthritis and
Rheumatism, v.36, 2007.
PINHEIRO, A.L.B. Advances and perspectives on tissue repair and healing. Photomedicine
and Laser Surgery, v.27, n.6, 2009.
PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; PINTO, A.F. Ensaios toxicológicos de inocuidade. In:
. Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e
cosméticos. São Paulo: Atheneu Editora, 2010. ed. 3, p. 697-772.
POPE, E.R. Cicatrização da pele. In: BOJRAB, M.J. Mecanismos das moléstias na cirurgia dos
pequenos animais. 1. ed. São Paulo: Manole; 1996. p.178-183.
PRICE, P.; FOGH, K.; GLYNN, C.; KRASNER, D. L.; OSTERBRINK, J.; SIBBALD, R.G.
Why combine a foam dressing with ibuprofen for wound pain and moist wound healing?
93
International Wound Journal, v.4, n.1, 2007.
PROPHET, E.B.; MILLS, B.; ARRINGTON, J.B.; SOBIN. L.H. Laboratory methodsin
histotechnology. Armed Forces Institute of pathology, American registry of pathology.
Washington. p.279, 1992.
RATNAM, D.V. et al. Role of antioxidants in prophylaxis and therapy: A pharmaceutical
perspective. Journal of Controlled Release, v. 113, p. 189–207, 2006.
REINKE, J.M.; SORG, H. Wound repair and regeneration. Eur. Surg. Res., v. 49, n. 1, 2012.
RIBEIRO, A.Q.; LEITE, J.P.V.; DANTAS- BARROS, A.M. Perfil I de utilização de
fitoterápicos em farmácias comunitárias de belo Horizonte sob a influência da legislação
nacional. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.15, n.1, 2005.
SAHA, K. et al. Wound healing activity of Leucas lavandulaefolia Rees. Journal of
ethnopharmacology, v. 56, n. 2, p. 139–44, abr. 1997.
SANCHES, A.C.C. et al., Antioxidant and antifungal activities of extracts and condensed
tannins from Stryphnodendron obovatum Benth. Revista brasileira de ciências
farmacêuticas, v.41, p.101-106, 2005.
SANTOS, J.B. Avaliação e tratamento de feridas: orientações aos profissionais de saúde. Porto
Alegre: Hospital das clínicas de Porto Alegre, 2011.
SANTOS, S. dos; AMOROZO, M.C.M.; MING, L.C. Uso popular de plantas medicinais na
comunidade rural da Vargem Grande, Municipio de Natividade da Serra, SP. Revista
Brasileira de Plantas Medicinais, v.10, n.3, p.67-81, 2009.
SANTOSA. S.; JENSEN, M.D. The Sexual Dimorphism of Lipid Kinetics in Humans. Front
Endocrinol (Lausanne), v. 6, p. 103, 2015.
SEDLAK, J.; LINDSAY, R.H. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein suldhydryl
94
groups in tissue with Elman´s reagente. Anal Biochem., v.24, n.25, 1968.
SILVA, R. B. L. A Etnobotânica de plantas medicinais da comunidade quilombola de Curiaú,
Macapá- AP, 2002. 172f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) - Universidade Federal Rural
da Amazônia. Manaus, AM. 2002.
SILVEIRA, P.F.; BANDEIRA, M.A.M.; ARRAIS, P.S.D. Farmacovigilância e reações
adversas às plantas medicinais e fitoterápicos: uma realidade. Revista Brasileira de
Farmacognosia, v. 1, n.4,2008.
SHRIMANKER, M. et al Review: Screening Models for Wound Healing Activity in Animals.
Americam journal of pharmtech research, v. 3, May, 2013.
SONEJA, A., DREWS, A., MALINSKI, T. Role of nitric oxide, nitroxidative and
oxidativestress in wound healing. Pharmacological Reports, v. 57, p. 108 - 119, 2005.
SOUZA, A.P.G. F. Efeito da Casearia sylvestris Swartz (Guaçatutonga) e do Laser In Ga P nas
diferentes fases do processo de cicatrização de feridas dérmicas. Universidade Federal de
Viçosa, Minas Gerais, 2010.
SPONCHIADO, G. et al. Quantitative genotoxicity assays for analysis of medicinal plants: A
systematic review, Journal of Ethnopharmacology, V 178, p. 289-296, 2016.
SUFFINESS, M.; PEZZUTO, J. Assays related to cancer drug discovery. In: Hostettmann, K.
(Ed.), Methods in Plant Biochemistry: Assays for Bioactivity. Academic Press, London, pp.
71–133, 1990.
SZWED, D.N.; SANTOS, V. L. P. dos. Fatores de crescimento envolvidos na cicatrização de
pele. Cadernos da Escola de Saúde, Curitiba, V.1, N.15,2015.
TAVECHIO, M.; SIMONE, M.; BERNASCONI, S.; TOGNON, G.; MAZZINI, G.; ERBA, E.
Multi-parametric flow cytometric cell cycle analysis using TO-PRO-3 iodide (TP3): detailed
protocols. Acta Histochem,V.110, p. 232-244, 2008.
95
TAZIMA, M.F.G.S.; VICENTE, Y.A.M.V.A.; MORIYA, T. Biologia da ferida
e cicatrização. Fundamentos em clinica cirúrgica. Ribeirão Preto, 2008.
TIMBRELL, J.A. Principles of biochemistry toxicology. 4° Ed. Nova Iorque. Editora Informa
Heathcare, 2009.
TRAESEL, G. K. et al. Acute and subacute (28 days) oral toxicity assessment of the oil
extracted from Acrocomia aculeata pulp in rats. Food and Chemical Toxicology, v. 74, p. 320-
325, 12//2014.
UCHIYAMA, M. & MIHARA, M. Determination of malonaldehyde precursor in tissues by
thiobarbituric acid test. National Institute of Hygienic Sciences, 1977.
VIEIRA, A.P. et al. Flavonoid action second intention healing in surgically-induced clean
wounds in Wistar rats. Ciências Biólogicas e da Saúde, v.29, n.1, 2008.
VITORIANO FILHO, R. N. L. Uso de polissacarídeo extraído do exsudato de cajueiro
(anacardium occidentale l.) na terapêutica tópica de feridas. (DISSERTAÇÃO) Mestrado
em Ciência Animal da Universidade Federal do Piauí. Teresina- Piauí, 2011.
WALDRON, D.R.; ZIMMERMAN-POPE, N. Superficial skin wounds. In: Textbook of small
animal surgery. Slatter DH, editor. NY: Saunders, pp 260-271, 2003.
WANG, Q.L. et al. Acute and 30-day oral toxicity studies of administered carnosic acid. Food
and Chemical Toxicology, v. 50, n. 12, p. 4348-55, Dec 2012.
WAGNER, A.E., et. al. Dexamethasone impairs hypoxia- inducible factor-1 function.
Biochemical and Biophysical Research Communications, v.372, n.2, 2008.
WERNER, S., KRIEG, T., SMOLA, H. Keratinocyte–Fibroblast Interactions in Wound
Healing. J Invest Dermatol, v. 127, p. 998–1008, 2007.
WIDGEROW, A.D. Cellular resolution of inflammation—catabasis. Wound Rep Reg, v.20, p.
96
2–7, 2012.
WINTER,G.D. Formation of the scab and the rate of epithelization of superficial wounds in the
skin of the young domestic pig. Nature,1962.
WHITE, J. R.; WINTER, J. A.; ROBINSON, K. Differential inflammatory response to
Helicobacter pylori infection: etiology and clinical outcomes. J Inflamm Res, v. 8, p. 137-47,
2015.
WYSOCKI, A.B. Wound fluids and the pathogenesis of chronic wounds. Journal of Wocn,
v.23,n.6, 1996.
YOUNG, A.; MCNAUGHT, C.E. The physiology of wound healing. Surgery, v.29, n.10,
2011.
YUNES, R.A.; PEDROSA, R.C.; CECHINEL FILHO, V. Fármacos e fitoterápicos: a
necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil.
Quimica Nova, v. 24, n.1, 2001.
ZHANG, H.; CHEN, F.; WANG, X.; YAO, H-Y. Evaluation of antioxidant activity of parsley
(Petroselinum crispum) essential oils and identification of its antioxidants constituents. Food Research
International, v. 39, p. 833-839, 2011.
97
ANEXO
ANEXO I
Quadro 2. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Projeto: “C o n h e c i m e n t o e t n o f a r m a c o b o t â n i c o d e p l a n t a s m e d i c i n a i s u t i l i z a d a s p o r c o m u n i d a d e s
t r a d i c i o n a i s d o D i s t r i t o N o s s a S e n h o r a A p a r e c i d a d o C h u m b o , P o c o n é , M a t o G r o s s o , B r a s i l
” Pesquisadores: Mestranda Isanete Geraldini Costa Bieski e seu orientador Prof. Dr. Domingos Tabajara de Oliveira Martins, da
Universidade Federal de Mato Grosso.
Estamos fazendo uma pesquisa nesta comunidade, visitando algumas casas, para conversar com as pessoas mais velhas, que
tenham de 40 anos acima. Nós estamos fazendo esta pesquisa com objetivo de saber informações sobre o conhecimento que vocês tem sobre
as plantas medicinais. A única coisa que precisamos é de conversar com o senhor (a) sobre este assunto.
O resultados desta pesquisa serão dados ao participante, caso este solicite, sendo que este poderá entrar em contato com a pesquisadora em
caso de dúvidas sobre o estudo ou desistência como participante. Segue o contato da pesquisadora, endereço e telefones, podendo ligar a
cobrar: Área de Farmacologia do Departamento de Ciências Básicas em Saúde da Faculdade de Ciências Medicas da Universidade Federal
de Mato Grosso, Tele/fax, (65)-3615-8862 /3615-8854 / Celular. (65) 9633-1077 ou ainda pelo e-mail: [email protected] Av. Fernando
Correa da Costa S/N. CEP.: 78.0000-000 - CCBS I
Também poderás entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa, localizado no Hospital Universitário Julio Muller em
Cuiabá MT- Fone/Fax: (65) 3615-7254
Eu,
CONSENTIMENTO
, residente no endereço:
fui informado sobre a pesquisa que esta sendo feita em nossa comunidade. Estou satisfeito com a
explicação que me deram. Fui informado de que apenas terei que dar informações sobre aquilo que sei sobre o uso de plantas
medicinais para tratar doenças. Entendi tudo e estou ciente de que todas as informações sobre a minha pessoa e família não será
divulgada. Também estou ciente de que terei o direito de recusar ou desistir da minha participação, sem que isto acarrete em punição
a minha pessoa ou família. Minha participação é voluntária e por esta razão assino este documento. Qualquer duvida ou
esclarecimento pode entrar em contato a cobrar nos telefones abaixo.
Também poderei entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa, localizado no Hospital Universitário Julio Muller em Cuiabá MT-
Fone/Fax: (65) 3615-7254
Este termo foi lido por mim em / / (data) pelo entrevistador, abaixo assinado.
Declaro também, que recebi cópia do presente termo de consentimento.
Assinatura do entrevistado:
Nome do entrevistador: Ass.:
ISANETE GERALDINI COSTA BIESKI
98
Pesquisador Principal
Poconé - MT de de 20
99
ANEXO II
100
ANEXO III
101
102
ANEXO IV
103
104
ANEXO - V
105
ANEXO VI
Tabela 32. COORDENADAS EM UTM DAS COMUNIDADES RURAIS DO DISTRITO NOSSA SENHORA DO CHUMBO.
POCONÉ - MT
ORDEM COMUNIDADE E N ORDEM COMUNIDADE E N
1 Cangas 546049 8222151 23 Mundo Novo 530841 8238378
2
Ceú Azul 534620
8253743
24
Os cágados
530863
8220286
3
Chumbo 529449
8225837
25
Passagem de Carro
527626
8250432
4 Agroana
492863
8228910
26
Pesqueiro
495530
8238393
5 Agrovila
497677
8225640
27
Ramos
502632
8240855
6 Bahia do Campo
512245
8224821
30
Sangradouro
490999
8237458
7 Bandeira
507931
8224545
31
Santa Helena
525360
8220862
8 Barreirinho
508556
8234026
32
São Benedito
497448
8227107
9 Campina de Pedra
513280
8226023
33
Sete Porcos
508198
8239930
10 Campina de Pedra II
526755
8241908
34
Urubamba
501088
8250145
11 Canto do Agostinho
531974
8220589
35
Varal
510247
8243716
12 Capão verde
525415
8249423
36
Várzea Bonita
530682
8220958
13 Carretão
492753
8233076
37
Varzearia
493631
8235097
14 Chafariz
507580
8248240
38
Zé Alves
517402
8230002
15
Coetinho
511964
8221614
39
Cidade de Poconé
540143
8202734
16 Deus Ajuda
494666
8231637
17 Figueira
512619
8225992
18 Furnas I
526120
8231937
19 Furnas II
518094
8230178
20 Imbé
513188
8226639
21 Minadouro
511341
8217783
22 Morro Cortado
532051
8252927
106
ANEXO VII
ANEXO VIII
107
108
109
ANEXO XIX
110
ANEXO X
111
ANEXO XI
Apêndice
Citotoxidade
Citotoxicidade Concentração Média 24h Média 72h
meio 0,001 1,85 5
doxo 100 100 99,15 99,45
doxo 10 10 44,35 98,65
doxo 1 1 3,60 76,7
doxo 0,1 0,1 1,70 7,8
doxo 0,01 0,01 1,50 4,65
EASg 800 800 3,95 15,9
EASg 400 400 2,25 8,5
EASg 200 200 2,25 6,1
EASg 100 100 2,25 5,05
EASg 50 50 2,25 5,05
EASg 25 25 2,25 5,05
EASg 12 12 2,25 5,05
EASg 6,25 6,25 7,00 5,05
Viabilidade Celular
Viabilidade celular Concentração Média 24h Média 72h
meio 0,001 2,25 5,05
doxo 100 100 29,25 96,35
doxo 10 10 5,2 16,45
doxo 1 1 2,5 4,7
doxo 0,1 0,1 2,65 5,05
doxo 0,01 0,01 2,25 5,05
EASg 800 800 3,95 15,9
EASg 400 400 2,25 8,5
EASg 200 200 2,25 6,1
EASg 100 100 2,25 5,05
EASg 50 50 2,25 5,05
EASg 25 25 2,25 5,05
EASg 12 12 2,25 5,05
EASg 6,25 6,25 7 5,05
Hipocrático
1° dia Veículo
N° animais Macho Fêmea
1 28,5 24
2 26,4 22,5
3 29,1 20,5
4 27,4 21,2
5 28 21,2
6 26,2 21,6
14° dia Veículo
1 40,9 30
2 35,5 28,7
3 40,3 26,7
4 36,1 27,3
5 37,5 26
6 33,3 26,5
1° dia EASg 2000 mg/kg
N° de animais Macho Fêmea
1 28,5 22,7
2 28,4 21,3
3 30,5 22,3
4 25,4 21,1
5 25,7 20,5
6 25,2 22
14° dia EASg 2000 mg/kg
1 38,6 30,1
2 37,2 27,3
3 37,8 29,8
4 35,5 28,6
5 33,4 28
6 37,9 29,2
Micronúcleo
Meio EASg 10 EASg 30 EASg 100 Doxo
31 22 33 38 90
21 26 22 33 94
27 22 22 19 88
Cometa
Ferida por incisão
veiculo EASg 2 EASg 10 EASg 50 Fitoscar 60
46,16 61,57 67,31 70,91 77,04
50,41 73,2 68,95 84,41 70,07
67,62 57,44 54,77 44,24 48,03
61,42 67,39 56,04 82,77 62,85
52,21 93,83 77,41 82,75 66,88
46,95 88,91 76,34 48,26 77,36
32,68 70,77 88,88 35,87 47,76
61,58 88,49 64,31 93,2 65,03
45,7 85,99 51,77
MPO
Veículo EASg 2 EASg 10 EASg 50 Fitoscar 60
2,349206 0,977578 0,448889 0,369048 0,594595
2,038961 0,387205 0,479167 0,404523 0,439252
1,201128 0,543933 0,506826 0,364662 0,513761
1,485714 0,6625 0,633562 0,273556 0,735577
3,201149 0,524138 0,379934 0,436759 0,640394
1,65 0,298969 0,963964 0,652361 0,721154
0,592834 0,318725 0,547782 0,463612
GSH
Veículo EASg 2 EASg 10 EASg 50 Fitoscar 60
17,46809 27,22872 10,34043 34,59574 13,77128
17,81383 22,73404 12,28191 29,48936 21,08511
17,25532 25,15426 29,91489 13,98404 8
7,148936 22,3617 20,26064 21,29787 8,132979
14,80851 14,62234 18,53191 12,84043 17,46809
6,56383 19,25 13,13298 13,49202 15,04787
7,069149 13,95745 14,06383 11,7766
CAT
Veículo EASg 2 EASg 10 EASg 50 Fitoscar 60
34,46830488 34,41456149 48,88193202 121,4178822 51,21407544
34,88840394 16,78208966 36,74101856 103,8109178 31,74026074
36,46283492 54,84832069 56,6983044 48,38617592 34,93221544
37,94695778 59,30621451 84,4676052 71,11249449 38,12542362
66,15095431 85,74010556 65,88677757 57,19001987 41,59661603 78,58620304 53,66726297 65,57690338 104,1045518
25,00692887 103,0170039
Citocinas
IL-12p70
veiculo EASg 2 EASg 10 EASg 50 Fitoscar 60
233,8488 1288,22 1412,026 5707,327 1780,457
0 1081,655 1803,435 9669,17 912,6909
1771,074 3212,567 3072,158 3542,467 743,0284
212,5449 529,4077 1597,636 1967,395 696,2487
1467,521 0 1227,284 1934,152 399,2618
3539,53 4384,159 5634,005 1599,915 865,6896
1951,581 797,8121 4218,573 2419,312 2227,877
2456,829 807,7517 3326,779 1032,717 1253,179
1905,407 872,6709 1648,657 1498,813 2151,573 4179,963 677,1664
IL- 1β
veiculo EASg 2 EASg 10 EASg 50 Fitoscar 60
240,112 579,1052 575,7131 509,4815 1486,852
411,4612 395,9836 720,459 2072,332 698,5379
770,374 994,9289 1298,661 1434,861 1064,094
437,92 377,0912 587,5361 1019,395 1134,54
624,6487 0 678,9221 648,2653 715,3188
1726,296 1815,78 3574,927 429,5403 513,0757
1055,548 572,0825 2101,948 936,6592 1675,212
1581,979 475,3668 2154,509 359,8639 508,197
1171,808 581,4639 623,8004 477,4001 867,0879
1952,991 572,5821
IL-10
veiculo EASg 2 EASg 10 EASg 50 Fitoscar 60
16,38558 0 160,4148 0,199813 375,4965
0 70,4993 210,0964 979,3354 17,19284
567,1693 343,0559 85,92793 520,8145 130,3039
129,3364 0 91,08465 266,58 158,7789
46,88418 0 191,716 673,9865 0
356,752 597,3827 671,6976 270,7967 5,576747
298,2057 0 1138,209 386,8791 59,88036
283,8354 0 250,6481 335,2081 0
340,5413 0 281,0995 98,44759 396,7264 580,0586 39,09312
IL-17
veiculo EASg 2 EASg 10 EASg 50 Fitoscar 60
28,27712 0 0 0 218,3389
0 0 0 0 0
461,8031 256,5446 0 98,90924 30,5119
197,0895 0 0 219,2655 0
0 0 29,4776 559,4993 0
724,6604 234,873 0 0 0
262,1646 0 727,8694 499,6831 0
282,3664 0 84,7274 277,9233 0
440,3683 0 221,4715 0 0 0 0
TNF- α
veiculo EASg 2 EASg 10 EASg 50 Fitoscar 60
1,496689 0 13,14332 0 23,83813
0 2,964281 7,575801 112,7787 3,239845
18,91881 23,88941 10,57157 46,83516 4,755561
5,338431 6,828743 11,19604 31,47959 5,794782
0 0 4,594356 48,21386 14,93753
24,84317 99,7318 36,22645 6,247389 11,41101
11,59655 9,276783 21,44876 19,79925 30,19411
14,32794 19,55888 16,91455 19,36339 11,3025
7,435004 7,930153 9,796538 0 19,45353
52,74068 11,51629
Óxido nítrico
Veículo EASg 2 EASg 10 EASg 50 Fitoscar 60
4,258514 3,178756
3,296083
3,348066
2,583181
6,041475 1,675806 4,284946 4,214511 2,421329
2,665992 3,402632 3,008351 3,582969 3,544181
4,739645 4,068075 3,952618 4,645215 3,172113
3,487624 4,039735 2,799658 2,375 4,07541
3,29881 2,413093 2,981336 3,893333 3,148611 2,483126 3,187375 4,863813 4,827703 1,553364 3,088571 4,990099 5,032303 2,899772
Scratch assay
Meio EASg 0,8 µg/mL EASg 4 µg/mL EASg 20 µg/mL PDGF 5 ng/mL
61,65354 90,26317 92,80354 68,36558 85,44842
53,32377 90,32187 90,7033 70,7915 85,50791
55,41681 88,4504 91,77134 68,39208 87,1106
