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FURG
Tese de Doutorado
Impacto do uso de fungicidas na produção de Ocratoxina A por
Aspergillus carbonarius e na fermentação alcoólica por
Saccharomyces cerevisiae.
___________________________________
Carmen Luiza de Azevedo Costa
PPGQTA
Rio Grande, RS - Brasil
2019
ii
Impacto do uso de fungicidas na produção de Ocratoxina A por
Aspergillus carbonarius e na fermentação alcoólica por
Saccharomyces cerevisiae.
por
Carmen Luiza de Azevedo Costa
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Química Tecnológica e Ambiental da Universidade Federal
do Rio Grande (RS), como requisito parcial para obtenção
do título de DOUTOR EM QUÍMICA.
PPGQTA
Rio Grande, RS - Brasil
2019
Rio Grande, Dezembro de 2019.
iii
iv
v
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, a Deus por ter me dado forças para que eu conseguisse chegar
até aqui e por me proporcionar a alegria de realizar os meus sonhos.
Aos meus pais, Fátima e Luiz, por constituírem minha base me ensinando o
caminho do bem e também a sempre lutar pelos meus objetivos e sonhos. Essa vitória
também é de vocês.
Ao meu companheiro de vida Cleiton, te agradeço imensamente por tudo, por
estar sempre ao meu lado nos momentos bons e ruins, me apoiando e me fazendo
acreditar que é possível realizar os nossos sonhos, aturando todo o estresse que é
essa vida acadêmica. Sempre dizendo “Vai dar tudo certo”. Te Amo Muito!!!
A todos os meus familiares amados, meus irmãos Marcelo e Luizy, minha
madrasta Paula, meu padrasto Claudio, minha cunhada Tati e meus sobrinhos que
amo muito, Marina e Lorenzo. Muito obrigada por todo apoio e pelas palavras de
incentivo sempre me desejando o bem!!
Aos meus queridos amigos Daia, Diego, Giselle e Rita obrigada por todo apoio e
por fazerem parte da minha vida!!!
À minha orientadora Jaqueline, por ter aceitado me orientar mesmo sem me
conhecer. Agradeço pela orientação, pelos conselhos, incentivo e ensinamentos ao
longo dessa jornada. Te agradeço também pelos momentos de descontração e pela
confiança em mim depositada.
À professora Eliana te agradeço pela receptividade, dedicação e empenho
depositado no seu trabalho no laboratório, sempre pronta para solucionar nossas
dúvidas.
A Maristela por todo ensinamento e coleguismo ao longo dessa trajetória, te
agradeço por tudo.
Aos colegas de laboratório agradeço ao Maicon por toda a amizade
desenvolvida ao longo desses quatro anos, pelos momentos de alegria e descontração
vividos no laboratório. A minha amiga Elisa parceira de disciplinas, laboratório e
estudos, sempre pronta para ajudar, te agradeço muito. A Eliza e a Carol que estavam
sempre dispostas para ajudar nos experimentos e também por todos os momentos
alegres vividos no laboratório. A Ane te agradeço muito, pelas nossas conversas,
conselhos e por estar sempre pronta para me ouvir.
vi
Aos demais colegas, agradeço a Kelly, Sabrina, Karen, Ana, Marcy, Verônica,
Fran, Cíntia, Rafa, Wesclen, Diean e Chicão por toda parceria no laboratório, pelos
momentos de aprendizagem e também nos momentos de descontração.
Aos professores, funcionários e colegas do Programa de Pós Graduação em
Química Tecnológica e Ambiental – FURG, pela convivência e ensinamentos ao longo
dessa caminhada.
vii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................vii
LISTA DE TABELAS........................................................................................................ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ................................................................. xivii
RESUMO..................................................................................................................... xviv
ABSTRACT.....................................................................................................................xv
ii
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................1
2. OBJETIVOS..................................................................................................................4
2.1 OBJETIVO GERAL.....................................................................................................4
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................................4
3. REVISÃO DA LITERATURA...................................................................................5
3.1 UVAS E VINHOS NO BRASIL....................................................................................5
3.2 MICOTOXINAS ..........................................................................................................8
3.3 OCRATOXINA A.......................................................................................................10
3.3.1 Ocorrência de ocratoxina A em uvas e vinhos......................................................11
3.4 TÉCNICAS PARA O CONTROLE DE OTA EM UVAS E VINHOS..........................13
3.5 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E DETECÇÃO DE OTA..............................................16
3.6 FUNGICIDAS............................................................................................................20
3.6.1 Modo de ação dos fungicidas................................................................................23
4. MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................25
4.1 Reagentes, solventes e Material..............................................................................25
4.1.1 Equipamentos.......................................................................................................26
4.2 MÉTODOS...............................................................................................................26
4.2.1 Preparo das soluções............................................................................................26
viii
4.2.2 Ocorrência de OTA no vinho.................................................................................28
4.2.2.1 Amostragem.......................................................................................................28
4.2.2.2 Extração Quantificação de Micotoxina no vinho.................................................28
4.2.2.3 Validação do Método..........................................................................................29
4.2.2.4 Estimativa de ingestão de OTA pelo consumo de vinho....................................31
4.2.3 Crescimento fúngico de Aspergillus carbonarius e manifestação toxigênica........31
4.2.3.1 Avaliação do crescimento fúngico......................................................................32
4.2.3.2 Produção de OTA no meio de cultura PDA........................................................33
4.2.4 Efeito da micotoxina OTA e dos fungicidas cresoxim metílico e famoxadona na
fermentação alcoólica.....................................................................................................34
4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo............................................................................34
4.2.4.2 Condições de cultivo...........................................................................................34
4.2.4.3 Determinações tecnológicas no fermentado: acidez, etanol, açúcar redutor,
proteínas e MEV.............................................................................................................35
4.2.4.4 Determinações bioquímicas no fermentado: concentração celular, atividade
enzimática da peroxidase, produção de glutationa e concentração de OTA ................36
4.2.4.5 Parâmetros cinéticos..........................................................................................37
4.2.5 Limpeza de vidraria e tratamento de resíduos......................................................38
4.2.6 Análise Estatística.................................................................................................39
5. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS..........................................40
5.1 ESTUDO DA OCORRÊNCIA DE OTA EM VINHO..................................................40
5.2 ESTUDO DO POTENCIAL TOXIGÊNICO EM PRESENÇA DOS FUNGICIDAS...43
5.2.1 Crescimento micelial e conteúdo de glicosamina..................................................43
5.2.2 Produção de ocratoxina A pelo fungo Aspergillus carbonarius.............................47
5.3 EFEITO DA MICOTOXINA OTA E DOS FUNGICIDAS CRESOXIM METÍLICO E
FAMOXADONA NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA .....................................................52
5.3.1 Alterações bioquímicas: produção de biomassa, atividade enzimática da
peroxidase, produção de glutationa e concentração de OTA.........................................52
5.3.2 Alterações tecnológicas: acidez, etanol, açúcar redutor, proteínas e MEV...........57
6.CONCLUSÕES............................................................................................................65
7.SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS..........................................................66
8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................67
9. ANEXOS.....................................................................................................................98
ix
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mapa da distribuição da produção de uva no Brasil.......................................5
Figura 2: Processo de fabricação do vinho tinto .............................................................6
Figura 3:Estrutura química das principais Ocratoxinas.................................................11
Figura 4:Estrutura química do fungicida cresoxim-metílico...........................................21
Figura 5: Estrutura química do fungicida famoxadona..................................................22
Figura 6: Célula fúngica com o local de atuação dos fungicidas no complexo III da
cadeia transportadora de elétrons, localizada nas cristas mitocondriais........................24
Figura 7: Dados do crescimento micelial durante 7 dias de tratamento........................43
Figura 8: Crescimento micelial durante 7 dias de tratamento.......................................44
Figura 9: Inibição do crescimento micelial nos tratamentos com os fungicidas durante 7
dias de tratamento.......................................................................................................44
Figura 10: Crescimento micelial (cm) e o conteúdo de glicosamina (mg g-1) no grupo
controle sem fungicida (A), e nos grupos de tratamento cresoxim-metílico
(1000 µg mL -1) (B) e famoxadona (600 µg mL -1) (C)..................................................47
Figura 11: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA no meio
BDA, no grupo controle..................................................................................................47
Figura 12: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA no meio
BDA, no grupo tratado com famoxadona.......................................................................48
Figura 13: Cromatograma obtido em HPLC-FL através da extração de OTA no meio
BDA, no grupo tratado com cresoxim-metílico...............................................................48
Figura 14: Crescimento do halo fúngico, produção de Ocratoxina A pelo fungo
Aspergillus carbonarius e relação entre produção de OTA e crescimento fúngico no
grupo controle sem fungicida (A), e nos grupos de tratamento cresoxim-metílico
(1000 µg mL -1) (B) e famoxadona (600 µg mL -1) (C)...................................................49
Figura 15: Imagens obtidas por MEV das células de Sacharomices cerevisiae em 96h
de fermentação alcoólica em todos os cultivos..............................................................63
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Toxinas fúngicas de maior ocorrência em alimentos.....................................10
Tabela 2. Ocorrência de ocratoxina A em vinho............................................................12
Tabela 3. Curvas de calibração de OTA no solvente e na matriz, LOD e LOD de OTA
em vinho e recuperação em três níveis de OTA em vinho.............................................40
Tabela 4. Dados da ocorrência de OTA em 50 amostras de vinho tinto, 31 do tipo seco
e 19 do tipo suave, obtidos no estado do Rio Grande do Sul........................................41
Tabela 5: Crescimento do halo (cm) e conteúdo de glicosamina no grupo controle sem
a presença de fungicida e nos grupos de tratados com os fungicidas cresoxim-metílico
e famoxadona.................................................................................................................46
Tabela 6: Produção de Ocratoxina A pelo fungo Aspergillus carbonarius no grupo
controle sem a presença de fungicida e nos grupos de tratamento com a presença dos
fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona...................................................................49
Tabela 7: Dados de inibição da produção de micotoxinas (IMM), dados de inibição do
crescimento micelial (IMG) e os dados de inibição específica da produção de
micotoxinas por grama de fungicida na placa de cultura (IMM Esp./Fungicida)............50
Tabela 8: Concentração celular (mg mL-1) de cultivos realizados com Saccharomyces
cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de OTA e dos fungicidas
cresoxim-metílico e famoxadona e no controle sem contaminantes..............................53
Tabela 9: Relação entre a concentração de ocratoxina A (OTA) e a produção de
glutationa (GSH) e a atividade da enzima peroxidase (PO) nos cultivos realizados com
Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de contaminantes
orgânicos........................................................................................................................54
Tabela 10: Valores da produção de glutationa (GSH) e a atividade da enzima
peroxidase (PO) nos cultivos realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio de
cultura sintético na presença de contaminantes orgânicos e grupo controle sem
contaminantes................................................................................................................57
Tabela 11: Monitoramento do pH no meio de cultivo na presença de OTA e dos
fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona e controle sem contaminantes, ao longo de
96h de fermentação alcoólica submersa pela levedura Saccharomyces cerevisiae......58
xii
Tabela 12: Concentração de açúcar redutor (mg mL-1) de cultivos realizados com
Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de cresoxim-
metílico, famoxadona, OTA e controle sem contaminantes...........................................58
Tabela 13: Velocidade específica máxima de crescimento (µ max) dos cultivos
realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de
OTA e dos fungicidas cresoxim-metílico, famoxadona e controle sem contaminantes..59
Tabela 14: Concentração de proteínas (mg mL-1) nos cultivos realizados com
Saccharomyces cerevisae em meio de cultura sintético na presença de contaminantes
orgânicos e grupo controle sem contaminantes.............................................................60
Tabela 15: Produção de etanol obtido durante o cultivo submerso com a
Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de contaminantes
orgânicos e grupo controle sem contaminantes.............................................................61
Tabela 16: Fatores de conversão obtidos durante o cultivo de Saccharomyces
cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de contaminantes orgânicos e
grupo controle sem contaminantes.................................................................................62
xiii
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ε-Absortividade molar
ACN –Acetonitrila
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC – Association of Official Analytical Chemists
ATP -Adenosina Trifosfato
BOD- câmara germinativa
DTNB- 5,5`-dithiobis-2-nitrobenzoic acid
GC- Cromatografia Gasosa
GSH- glutationa
HPLC- Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de Fluorescência, do
inglês High Performance Liquid Chromatography with fluorescence detection
IARC – Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer, do inglês International
Agency for Research on Cancer
IMM- Inibição da Produção de Micotoxinas
IMG- Inibição do Crescimento Micelial
IMM esp.- Inibição específica da Produção de Micotoxinas por grama de fungicida na
placa de cultura
LLE – Extração Líquido-Líquido, do inglês Liquid-Liquid Extraction
LMT – Limite Máximo Tolerado
LOD – Limite de Detecção, do ingês Limit of Detection
LOQ – Limite de Quantificação, do inglês Limit of Quantification
OTA – Ocratoxina A
OTB- Ocratoxina B
OTC- Ocratoxina C
OTα- Ocratoxina α
OTβ- Ocratoxina β
pH – Potencial hidrogeniônico
PDA- Agar Potato Dextrose
PO- Peroxidase
Qol- inibidores da quinona oxidase
xv
Qo - Quinona oxidase
QuEChERS – Rápido, Fácil, Barato, Eficiente, Robusto e Seguro, do ingês Quick,
Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe
R – Recuperação
RPM- Rotações Por Minuto
RSD – Desvio Padrão Relativo, do inglês Relative Standard Deviation
SPE- Extração em Fase Sólida, do inglês Solid-Liquid Extraction
tR – Tempo de Retenção
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RESUMO
Título: Impacto do uso de fungicidas na produção de Ocratoxina A por
Aspergillus carbonarius e na fermentação alcoólica por Saccharomyces
cerevisiae.
Autor: Carmen Luiza de Azevedo Costa
Orientador: Prof. Dra. Jaqueline Garda Buffon
A contaminação por fungos do gênero Aspergillus é frequente em uvas, apresentando espécies produtoras de micotoxinas, que são metabólitos secundários que apresentam amplo espectro de toxicidade, baixa massa molar, termoestabilidade e atuam em baixas concentrações. Dentre as principais espécies toxigênicas encontradas em uvas está o Aspergillus carbonarius que pode produzir Ocratoxina A (OTA). Para limitar a contaminação fúngica em uvas são empregados os fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona, que por sua vez, podem afetar a produção de micotoxinas pelas espécies toxigênicas, além da sua ação residual nas frutas e derivados. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de cresoxim-metílico e famoxadona na manifestação toxigênica do Aspergillus carbonarius, além do efeito destes fungicidas e da OTA na ação da levedura Saccharomyces cerevisiae durante a fermentação alcoólica. Primeiramente foi validado o método QuEChERS para a extração e HPLC-FL para determinar OTA em 50 amostras comerciais de vinho tinto do Rio Grande do Sul. Depois foi avaliado, in vitro, o efeito do uso dos fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona nas concentrações de 1000 µg mL-1 e 600 µg mL-1, respectivamente, sobre o potencial toxigênico de Aspergillus carbonarius. Por fim foi determinada a influência da ocorrência destes fungicidas e da OTA nas concentrações de 2 e 4 µg L-1, durante a fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae em meio sintético. A OTA foi detectada em 86% das amostras em uma faixa de concentração entre 0,45 e 4,65 µg L-1, cuja média foi de 1,63 µg L-1. Os fungicidas foram eficazes para reduzir o crescimento fúngico em até 70%, embora tenham desencadeado o potencial toxigênico. Durante a fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae, na presença dos fungicidas e OTA, foram observadas alterações às 48 h de fermentação, ocorrendo a maior redução de micotoxina nos cultivos expostos a OTA. Os cultivos coexpostos a micotoxina e aos fungicidas apresentaram redução de OTA ao longo das 96 h de fermentação, estando diretamente relacionada ao aumento da atividade da enzima peroxidase, produção de glutationa e da síntese proteica. Todos os cultivos na presença de fungicidas e OTA apresentaram menor produção de etanol e alterações morfológicas na parede celular da levedura. Portanto, o uso de fungicidas pode contribuir com o controle fúngico, no entanto, afeta o potencial toxigênico do fungo aumentando sua produção de OTA em uvas, alterando o metabolismo da levedura durante a fermentação alcoólica. Palavras-chave: Uva, micotoxina, fungicida, estrobilurinas e oxazolidinones.
xvii
ABSTRACT
Title: Impact of fungicide use on Ochratoxin A production by Aspergillus
carbonarius and alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae.
Author: Carmen Luiza de Azevedo Costa
Advisor: Prof. Dra. Jaqueline Garda Buffon
Contamination by Aspergillus fungi is frequent in grapes with mycotoxin producing species, which are secondary metabolites that have a broad spectrum of toxicity, low molar mass, thermostability and act at low concentrations. Among the main toxigenic species found in grapes is Aspergillus carbonarius which can produce Ocratoxin A (OTA). To limit fungal contamination in grapes, cresoxim-methyl and famoxadone fungicides are used, which in turn can affect the production of mycotoxins by toxigenic species, as well as their residual action on fruits and derivatives. The objective of this study was to evaluate the effect of cresoxim-methyl and famoxadone fungicides on the toxigenic manifestation of Aspergillus carbonarius, as well as their effect and OTA on the action of Saccharomyces cerevisiae yeast during alcoholic fermentation. Firstly, a QuEChERS method for extraction and HPLC-FL to validate OTA in 50 commercial samples of Rio Grande do Sul red wine was validated. Then, in vitro, the effect of the use of cresoxim-methyl and famoxadone on the concentrations of 1000 µg mL-1 and 600 µg mL-1, respectively, on the toxigenic potential of Aspergillus carbonarius. Finally, the influence of the occurrence of these fungicides and OTA at concentrations of 2 and 4 µg L-1 was determined during alcoholic fermentation. Saccharomyces cerevisiae in synthetic medium. OTA was detected in 86% of the samples in a concentration range between 0.45 and 4,65 µg L-1, with a mean of 1,63 µg L-1. Fungicides were effective in reducing fungal growth by up to 70%, although they triggered the toxigenic potential. During alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae, in the presence of fungicides and OTA, changes were observed at 48h of fermentation, with the largest reduction of mycotoxin in crops exposed to OTA. Cultures coexposed with mycotoxin and fungicides showed reduction of OTA throughout the 96h of fermentation. All reductions were directly related to increased peroxidase enzyme activity, glutathione production and protein synthesis. All crops presented lower ethanol production and morphological changes in the yeast cell wall. Therefore, the use of fungicides may contribute to fungal control; however, it affects the fungal toxigenic potential by increasing its OTA production in grapes, altering yeast metabolism during alcoholic fermentation. Keywords: Grape, mycotoxin, fungicide, strobilurins and oxazolidinones.
xviii
1
1. INTRODUÇÃO
A contaminação fúngica é uma das principais causas de perda econômica no
setor de viticultura, causada principalmente por fungos do gênero Aspergillus, que
possuem algumas espécies produtoras de micotoxinas (ABARCA et al., 2019). Este
setor destaca-se no estado do Rio Grande do Sul que, neste ano de 2019 atingiu a
produção de 614,3 milhões de kg de uvas (IBRAVIN, 2019). O consumo de uvas se dá
na forma in natura e processada (WANG et al., 2017) e sua qualidade é afetada por
diferentes variáveis nas fases de amadurecimento e pós a colheita (POZZAN et al.,
2015).
A contaminação fúngica e por micotoxinas pode ocorrer da pré-colheita ao
armazenamento (SHI et al., 2018). As micotoxinas apresentam amplo espectro de
toxicidade, baixa massa molar, termoestabilidade e atuação em baixas concentrações
(ZAIN, 2011). O consumo de alimentos contaminados diminui a expectativa média de
vida da população gerando um problema global (MARTINS et al., 2012). Dentre as
micotoxinas as aflatoxinas, ocratoxinas, tricotecenos, zearalenona, fumonisinas e os
alcaloides de ergot destacam-se como as de maior importância na saúde pública e na
agroeconomia (KÖPPEN et al., 2010).
As ocratoxinas correspondem a um grupo de metabólitos secundários
produzidos principalmente por fungos de dois gêneros: Penicillium e Aspergillus.
Aspergillus carbonarius é uma das principais espécies de fungos toxigênicos que
produzem Ocratoxina A (OTA) em uvas (ZHANG et al., 2017). Esta toxina é
considerada nefrotóxica, hepatotóxica, genotóxica, teratogênica e imunotóxica a
animais (PATHARAJAN et al., 2011) e classificada de acordo com a Agência
Internacional de Pesquisa sobre o Câncer, como um possível carcinógeno humano
(grupo 2B) (IARC, 1993).
Devido a sua estabilidade térmica, estudos relatam a ocorrência de OTA em
diversos gêneros alimentícios e bebidas, como: cereais, café, vinho, frutos secos,
cervejas e suco de uva (ZHU et al., 2015). A primeira ocorrência de OTA em vinhos foi
descrita por Zimmerli e Dick (1996), seguindo-se por outros autores (LEE et al., 2012;
TERRA et al., 2012; CAO et al., 2013; DI STEFANO et al., 2015; DE JESUS et al.,
2017; ARRÚA et al., 2019; SILVA et al., 2019; ZURGA et al., 2019).
2
Com o elevado índice de ocorrência de OTA em matrizes alimentares a ANVISA
(2011) por meio da RDC n.° 7/2011, estabeleceu o limite máximo de 2 µg OTA Kg-1
para vinhos, sucos e polpa de uva. Esse mesmo limite é adotado em países da União
Europeia (COMISSION EUROPEAN, 2006).
O estabelecimento dos limites máximos toleráveis contribui para o conhecimento
da qualidade dos alimentos ingeridos pela população. Entretanto, devido à
complexidade das micotoxinas, a determinação destes analitos não é fácil e consiste
em três etapas principais: a extração do analito; a limpeza (“clean up”) e a detecção e
quantificação por instrumentos analíticos de alta sensibilidade. Para a limpeza
destacam-se a utilização de extração em fase sólida (SPE) e a extração líquido-líquido
(LLE). Para a separação destacam-se a cromatografia gasosa (GC) e também a
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detector de fluorescência quando
relacionado à OTA (BADIALE-FURLONG, 2008; TURNER, SUBRAHMANYAM,
PILETSKY, 2009).
Com o objetivo de prevenir a contaminação fúngica e a possível ocorrência de
micotoxinas em matrizes alimentares os fungicidas são utilizados durante a
produtividade agrícola. Entre os fungicidas utilizados na viticultura estão o cresoxim-
metílico e famoxadona, os quais afetam processos fermentativos, modificando a ação
das leveduras, causando desde lentas fermentações até a alteração na concentração
de compostos fenólicos e na produção de álcoois (GONZALEZ-ALVAREZ et al., 2012;
DORNELLAS et al., 2013; BRIZ-CID et al., 2014; NOGUEROL-PATO et al., 2014;
MULERO et al., 2015).
Assim, além da possibilidade das uvas estarem contaminadas com fungicidas e
micotoxinas, representando um risco ao consumidor, a ocorrência destes
contaminantes, também podem afetar a ação microbiana durante processos
fermentativos, resultando em produtos com a qualidade alterada (GONZÁLEZ-
ÀLVAREZ et al., 2012).
Portanto, devido à importância do conhecimento da qualidade do vinho ingerido
pela população e também a carência de estudos sobre os efeitos desses fungicidas na
viticultura e durante o processo de fabricação do vinho, considerou-se, neste estudo,
que o uso dos fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona podem afetar a manifestação
toxigênica do fungo Aspergillus carbonarius, que contaminam as culturas de uva, com
consequente ocorrência de vinhos contaminados com OTA. Além disso, a presença de
3
resíduos dos fungicidas e da OTA podem alterar o processo fermentativo por
Saccharomyces cerevisiae e consequentemente a qualidade do produto fermentado.
4
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar os efeitos do uso de cresoxim-metílico e famoxadona sobre o potencial
toxigênico de Aspergillus carbonarius, assim como a influência destes fungicidas e
da OTA na ação da levedura Saccharomyces cerevisiae durante a fermentação
alcoólica.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar a ocorrência de OTA em vinho tinto empregando método
validado para esta matriz;
Avaliar o potencial toxigênico de Aspergillus carbonarius em presença
dos fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona;
Caracterizar a fermentação alcoólica quanto à influência de cresoxim-
metil, famoxadona e OTA nos parâmetros cinéticos da levedura
Saccharomyces cerevisiae.
5
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1 UVAS E VINHOS NO BRASIL
A viticultura no Brasil teve início no ano de 1532, mas apenas no ano de
1875, devido à imigração italiana, teve seu início no estado do Rio Grande do Sul.
Os imigrantes trouxeram mudas de videiras europeias que se adaptaram muito
bem a região, porém devido a doenças fúngicas foram extintas. Então outras
variedades de uvas já cultivadas no país predominaram nos parreirais da região sul
(NIEDERLE, VITROLLES, 2010).
O cultivo de uvas no Brasil ocupa uma área aproximada de 78 mil hectares,
desde o extremo sul até regiões próximas ao equador, estabelecendo à base da
sustentação agroindustrial de algumas regiões do país (Figura 1) (IBRAVIN, 2019);
devido ao clima temperado, a produção é mais expressiva na região sul e sudeste.
As uvas estão entre as frutas de maior consumo sob a forma in natura ou
processada como vinhos, sucos, geleias entre outros. No entanto, as fases de
amadurecimento e pós-colheita são afetadas pelo elevado índice de perecibilidade,
o que afeta a qualidade sensorial e nutricional da uva e seus derivados (VANZELA,
BAFFI e SILVA, 2015).
Figura 1- Mapa da distribuição da produção de uva no Brasil.
Fonte: IBRAVIN, 2019.
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Metade da produção de uvas no Brasil é destinada a produção do vinho
(EMBRAPA, 2017). No estado do Rio Grande do Sul concentra-se 90% da
produção nacional de vinhos, com uma pequena porcentagem sendo produzida em
Santa Catarina, Pernambuco, Minas Gerais e Bahia, atingindo no ano de 2018 a
produção de 664.205.024 kg de uvas e 257.082.856 L de vinho (UVIBRA, 2018). A
ampla variedade disponível no mercado, juntamente com a divulgação dos
benefícios do vinho a saúde, faz com que a procura pelo vinho seja elevada;
apresentando no ano de 2018 um aumento 15,9% em seu consumo (IBRAVIN,
2019).
O vinho segundo a regulamentação brasileira é resultante do processo de
fermentação alcoólica da uva fresca ou do mosto, gerando um produto com um
conteúdo médio de 12% (v.v-1 a 20 °C) grau alcoólico. O processo de fermentação
alcoólica é catalisado por um conjunto de reações que determinam as
características aromáticas do vinho (LASRAM et al., 2012) e que são classificados
de acordo com seu processo de fermentação como vinho tinto, vinho rosado e
vinho branco (MAPA, 1988).
Na Figura 2 estão esquematizadas as etapas de fabricação do vinho, com
ênfase para o esmagamento, fermentação, decantação e engarrafamento.
Figura 2- Processo de fabricação do vinho tinto
Fonte: IVDP, 2018.
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Após a colheita e o recebimento, as uvas são higienizadas e ocorre o
desengace para separar o engaço do recipiente de fermentação. A presença dos
engaces resulta em grande liberação de tanino, gerando sensação adstringente e
herbácea ao vinho (MANFROI et al., 2010).
Logo após é realizado o esmagamento das uvas com o objetivo de romper a
película da baga para liberar o suco contido, neste momento se dá o início da
fermentação alcoólica. Esse procedimento promove a extração de antocianinas
presentes nas cascas das uvas gerando a coloração do vinho tinto. Após as uvas
com suas partes líquidas e sólidas são encaminhadas para o tanque de
fermentação (DALL et al.,2014).
Nesta etapa ocorre a adição de ácido sulforoso que possui ação bactericida,
antioxidante e conservante, evitando a proliferação de micro-organismos
responsáveis pela oxidação do vinho. Grande parte do dióxido de enxofre gerado é
liberado durante a fermentação alcoólica (EMBRAPA,2007).
Embora a fermentação possa ser realizada pela flora levuriana nativa,
recomenda-se a utilização de levedura selecionada, para garantir a uniformidade
da fermentação alcoólica (DUARTE et al., 2010). Na Equação 1 esta apresentada a
reação que ocorre durante a fermentação alcoólica, nesse período a levedura
Saccharomyces cerevisiae é responsável pela transformação dos açúcares do
mosto em etanol, gás carbônico, energia e outros compostos como: glicerol, ácido
succínico, ácido acético, ácido lático e ésteres, os quais são importantes na
qualidade sensorial do vinho (VANZELA, BAFFI e SILVA, 2015).
C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + Energia (1)
O processo de vinificação em vinho tinto ocorre em temperaturas entre 26 °C
a 30 °C, ocorrendo liberação de calor em média de 1 °C a cada 17 g L-1 de açúcar.
Temperaturas elevadas ocasionam a proliferação de micro-organismos
contaminantes, gerando danos ao produto final. A manutenção da faixa de
temperatura ideal é importante para o rendimento alcoólico, reduzindo as perdas de
etanol por evaporação, o que interfere diretamente nas propriedades sensoriais e
formação de componentes aromáticos (EMBRAPA, 2007).
8
A fermentação alcoólica é encerrada quando ocorre o consumo de todo
açúcar disponível para ser fermentado ou também em temperaturas acima de
33° C impedindo a ação das leveduras. Ao final da fermentação alcoólica é
realizada a descuba, que é a separação das cascas do vinho líquido (DALL et
al.,2014).
Após a descuba ocorre a fermentação malolática que pode ser espontânea
ou artificial pela introdução de bactérias. Nesta etapa, ocorre a redução da acidez
do vinho pela transformação do ácido málico em ácido lático e a formação de
dióxido de carbono (DAUDT et al., 2008).
Por fim o vinho é filtrado para assegurar sua estabilidade físico-química e
microbiológica e também para sua clarificação, pela remoção de partículas
suspensas, tornando a bebida límpida e cristalina. Após a filtragem o vinho é
engarrafado e rotulado (LIMA et al., 2019).
A qualidade do produto final é resultado da efetividade de cada fase do
processo e também da qualidade das uvas utilizadas. Quando o vinho é produzido
com uvas contaminadas por fungos toxigênicos, micotoxinas podem estar
presentes no produto final (CLOUVEL et al., 2008).
3.2 MICOTOXINAS
Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos
filamentosos, principalmente dos gêneros Penicillium, Aspergillus e Fusarium
(QUILES et al., 2016). Esses compostos atuam em baixas concentrações,
possuem baixa massa molar, são termo-estáveis e possuem um amplo espectro de
toxicidade (TURNER et al., 2009), contaminando grande parte dos produtos
agrícolas e dos alimentos produzidos, provocando danos à saúde humana e animal
(HEIDTMANN-BEMVENUTI et al., 2012).
A biossíntese de micotoxinas ocorre sob condições específicas, dependendo
principalmente da temperatura, teor de umidade, atividade de água e pH (PLEADIN
et al., 2015). A contaminação por fungos pode ocorrer em qualquer estágio da
cadeia produtiva: pré-colheita, entre a colheita, secagem e durante o
armazenamento (KOPPEN et al., 2010). A ocorrência de alimentos contaminados
por fungos não garante que a micotoxina esteja presente, por outro lado a ausência
9
do fungo no alimento não garante a ausência de micotoxinas que podem estar
presentes por longo tempo em situações diversas, mesmo que o fungo tenha
perdido a sua viabilidade (PLEADIN et al., 2019).
Quando ingeridos, os metabólitos secundários são capazes de causar
depressão no sistema imunológico, podendo ocasionar efeitos carcinogênicos,
teratogênicos e estrogênicos em animais e humanos (ROCHA et al., 2014). A
ingestão pode ser de forma direta pelo consumo de grãos, frutas e de produtos
derivados dessas matérias-primas, como vinho, cerveja, frutas secas entre outros
(CASTELLARI et al., 2001; CAST, 2003; BULLERMAN e BIANCHINI, 2007; ALGÜL
e KARA, 2014) ou de forma indireta, quando ingerido leite, ovos e carnes gerados
de animais que se alimentaram com rações contaminadas e acabam por excretar
essas toxinas (SHUNDO et al., 2006; IMPERATO et al., 2011; KUMAR et al., 2012;
MAJEED et al., 2013; WASKIEWICZ et al., 2013).
Devido à falta de especificidade do efeito danoso, as micotoxinas ocasionam
doenças que são chamadas de micotoxicoses, que muitas vezes não são
diagnosticadas (PLEADIN et al., 2015). Os efeitos dependem da dose e da
frequência com que são ingeridas, podendo ocasionar efeitos agudos, subagudos e
crônicos. O efeito agudo é a rápida manifestação, sendo caracterizados por
diarreias, hemorragias, distúrbios gastrointestinais, podendo levar a morte. Os
efeitos subagudos ocorrem com doses menores ao longo de um intervalo maior de
exposição, causando alterações em órgãos humanos e animais. Os efeitos
crônicos ocorrem pela exposição mínima de seis meses ao contaminante e os
danos podem ser carcinogênicos, genotóxicos, hepatotóxicos, teratogênicos,
nefrotóxico e imunotóxico (RAWAL et al., 2010).
Aproximadamente 500 compostos já foram reconhecidos como micotoxinas,
dos quais 300 já foram detectados em alimentos (BROOW et al., 2015). Segundo a
organização das nações unidas para a alimentação e a agricultura (FAO), 25% dos
alimentos produzidos no mundo estão contaminados com micotoxinas (FAO, 2018).
As toxinas fúngicas de maior ocorrência em alimentos estão citadas na Tabela 1:
Aflatoxinas, Ocratoxinas, Tricotecenos, Zearalenona, Fumonisinas, Patulinas e
Alcaloides de Ergot (PEREIRA, SANTOS, 2015).
10
Tabela 1- Toxinas fúngicas de maior ocorrência em alimentos
3.3 OCRATOXINA A
Ocratoxina A (OTA) foi identificada pela primeira vez na África do Sul como
um metabólito fúngico tóxico para animais produzido pela cepa de Aspergillus
ochraceus (VAN DER MERVE, STEYN, FOURRIE, 1965). Os principais fungos que
metabolizam esta toxina são Penicillium verrucosum, Aspergillus ochraceus,
Aspergillus carbonarius e Aspergillus niger (MAGNOLI et al., 2007). Aspergillus
carbonarius é o principal contaminante produtor de OTA em uvas especialmente na
fase de maturação em regiões tropicais e subtropicais, apresentando a capacidade
de contaminar uvas saudáveis (BORDINI et al., 2013).
Micotoxina Produtos Afetados Referência
Aflatoxina Amendoim, nozes, milho, trigo e
leite
MARTINS et al., (2017)
LIVERPOOL-TASIE et al., (2019)
MARIMÓN et al., (2019)
Ocratoxinas
Grãos, Leguminosas, frutas
secas, café, cacau, salame e
ovos
OUETHRANI et al., (2013)
ALTAFINI et al., (2019)
PIRES et al., (2019)
KABAK, 2019
Tricotecenos Trigo, milho, cevada, aveia, arroz
ARRACHÉ et al., (2018)
MUNKVOLD et al., (2019)
HANVI et al., (2019)
Zearelenona Milho, trigo HAN et al., (2019)
JIANG et al., (2019)
Fumonisinas Milho, trigo, cevada, arroz
ABDALLAH et al., (2018)
CENDOYA et al., (2018)
SULTANA et al., (2019)
UDOVICKI et al., (2019)
Patulinas Maçã, morango, tomate, azeitona,
carne e ovos
YANG et al., (2014)
TOROVIC et al., (2018)
PRZYBYLSKA et al., (2019)
SAJID et al., (2019)
Alcaloides de Ergot Cereais ROMERA-TORRES et al., (2018)
11
OTA é derivado de policetídio com a porção dihidroisocumarina ligada por
uma ligação amida com a porção carboxila da fenilalanina. Seu nome químico é (R)
–N- [(5- cloro- 3,4 -di-hidro- 8- hidroxi- 3- metil- 1- oxo- 1H- 2-benzonpiran-7-il)
carbonil]- L- fenilalanina, com fórmula molecular de C20H18ClNO6, massa molecular
de 408,3 g mol-1, apresentando uma estrutura cristalina que fluoresce emitindo
comprimento de onda correspondente ao verde. Ela é solúvel em solventes polares
orgânicos quando em meio ácido, apresenta estabilidade a acidez e a altas
temperaturas (KHOURY, ATOUI, 2010). Além da Ocratoxina A (OTA) existem a
Ocratoxina B (OTB), Ocratoxina C (OTC), Ocratoxina α (OT α) e Ocratoxina β
(OTβ) (Figura 2) (GIL-SERNA et al., 2018). A Ocratoxina A é a mais tóxica devido à
presença do átomo de cloro em sua composição e também, entre as ocratoxinas, é
a micotoxina de maior ocorrência em matrizes alimentares (AMÉZQUETA et al.,
2012).
Figura 2- Estrutura química das principais Ocratoxinas
Fonte: GIL-SERNA et al., 2018.
A ocorrência de OTA está relacionada com a inibição da fertilidade e com a
Nefropatia Endêmica dos Balcãs, uma doença renal crônica encontrada no Sudeste
da Europa (SCHMIDT-HEYDT et al., 2013), relacionada também com a indução de
formação de tumores no trato urinário em humanos (MARIN-KUAN, 2011). Em
estudos com animais apresenta efeitos carcinogênicos (BROWN et al., 2007),
genotóxicos (TOZLOVANU et al., 2006), neurotóxicos (SAVA et al., 2006),
teratogênicos (BALASAHEB et al., 2007), imunossupressores (ROSSIELLO et al.,
2008) e mutagênicos (PALMA et al., 2007). Classificada pela IARC (International
Agency for Research on Cancer) como possível carcinógeno para humanos (grupo
2B) (IARC, 1993).
12
Estudos demonstram que a via de produção da OTA envolve a fenilalanina e
a diidroisocumarina os quais são derivados da via do chiquimato e da via
pentacetida, respectivamente. Na primeira etapa ocorre a formação de uma cadeia
policetida isocumarínica através da condensação de uma molécula de acetato com
quatro moléculas de malonato. Na segunda etapa a cadeia policetida sofre uma
modificação com a formação do anel lactona e a adição de um grupo carboxil
derivado de S-metilmetionina. Na terceira etapa ocorre a incorporação de um
átomo de cloro pela ação da cloroperoxidase e finalmente ocorre a ligação a
fenilalanina a ocratoxina α formando a ocratoxina A (HARRIS, MANTLE, 2001).
Seus efeitos tóxicos são atribuídos principalmente à redução do
metabolismo proteico, competindo com a fenilalanina pelos sítios de ligação de
enzimas específicas, causando a inibição da síntese protéica. Essas alterações no
metabolismo das proteínas podem ocasionar a ocorrência de várias infecções
(DUARTE, LINO, PENA, 2011).
Devido à presença do aminoácido fenilalanina em uma fração na sua
estrutura, a OTA quando atinge a corrente sanguínea se liga a proteínas
plasmáticas, o que torna a micotoxina presente no sangue por mais tempo, sendo
mais tóxica ao organismo. Uma parte sofre excreção biliar sendo reabsorvida pelo
intestino e túbulos renais retornando dessa forma a circulação sanguínea sendo
distribuída a diferentes tecidos. Sua nefrotoxicidade está possivelmente
relacionada com a disfunção mitocondrial que causa a falta de energia gerando
espécies reativas de oxigênio (AMÉZQUETA et al., 2012).
Esta toxina apresenta moderada termoestabilidade, permitindo sua
ocorrência durante o processamento dos alimentos, sendo consumida através de
cereais, vinhos, café, leite, especiaria, cacau entre outros (AMÉZQUETA et al.,
2009). Em virtude da ocorrência de micotoxinas em diferentes matrizes
alimentares, foi implementada no Brasil a RDC n°7 de 18 de fevereiro de 2011
(ANVISA, 2011) que estabelece limites máximos tolerados (LMT) de micotoxinas
em alimentos, estabelecendo o limite máximo para OTA de 2 µg L-1 para polpa de
uva, suco de uva, vinho e seus derivados. O mesmo limite é estabelecido para
países da Comunidade Europeia por meio da resolução EC n.º 123 de janeiro de
2006 (EC, 2006). A dose semanal máxima tolerável de 0,12 µg kg-1 de peso
corporal, para o consumo de OTA, definida pelo Comitê Especialista em Aditivos
13
Alimentares das Nações Unidas/Organização Mundial da Saúde (JECFA, 2001) e
também pela Autoridade Europeia para a Segurança Alimentar (EFSA, 2006).
3.3.1 Ocorrência de ocratoxina A em uvas e vinhos
Os fungos da espécie Aspergillus carbonarius são os principais
colonizadores e produtores de OTA em uvas (VISCONTI et al., 2008). A
contaminação pode ocorrer durante o período de maturação, devido à irrigação
excessiva e pelos danos causados por insetos e aves, o que reduz a qualidade das
uvas, afetando diretamente a qualidade organoléptica dos vinhos (WELKE et al.,
2009).
OTA foi identificada e quantificada pela primeira vez em 1996, em vinhos
originados do sul da Europa, apresentando a maior concentração de 0,4 µg mL-1
(ZIMMERLI e DICK, 1996). No Brasil, o primeiro relato de ocorrência de OTA em
vinhos foi em 2004, apresentando concentrações entre 0,02 a 0,07 µg L-1 (ROSA et
al., 2004). Na Tabela 2 estão apresentados registros da literatura evidenciando a
ocorrência mundial de OTA em vinhos.
Em 42% dos estudos citados a concentração de OTA está acima da
concentração de 2 µg L-1 permitida pela legislação (ANVISA, 2017; EC, 2006).
3.4 TÉCNICAS PARA O CONTROLE DE OTA EM UVAS E VINHOS
Devido à frequente ocorrência e a toxicidade desta micotoxina técnicas para
descontaminação vêm sendo estudadas. As técnicas mais utilizadas incluem
estratégias de pré-colheita (preventivas) e pós-colheita (corretivas) e envolvem
métodos físicos, químicos e microbiológicos (SOLFRIZZO et al., 2009).
O uso de fungicidas destaca-se na estratégia de pré-colheita e entres as
estratégias de pós-colheita, destacam-se os métodos químicos com a utilização de
peróxidos, hipocloritos e amonização (RUBERT et al., 2013) e entre os métodos
físicos destacam-se a redução da concentração de micotoxina pela remoção dos
sólidos por precipitação e filtragem durante o processo de vinificação (NUNEZ et
al., 2008; FLORES FLORES et al., 2015; BAURER, et al., 2016). Além disto, os
tratamentos químicos e físicos apresentam como desvantagem interferir no valor
14
nutricional e na palatabilidade das bebidas e alimentos, não sendo aceitos para o
uso prático (VARGA et al., 2005).
Tabela 2- Ocorrência de ocratoxina A em vinhos.
País N° de amostras positivas / Total
Faixa de
Ocorrência (µg L
-1)
Referência
África 95/96 0,08 - 0,4 REMIRO et al., (2013)
Argentina 8/94 0,02- 4,82 PONSONE et al., (2010)
Brasil 12/16 0,03-0,62 TERRA et al., (2012)
Brasil 1/34 nd*- 4,50 WELKE et al., (2010)
China 44/77 <0,1- 5,65 ZHANG et al.,(2013)
China 183/223 0,01- 0,98 ZHONG et al., (2014)
China 18/63 0,02- 1,18 WU et al., (2011)
Chile 1/5 nd* - 2,42 ARRUÁ et al., (2019)
Croácia 85/110 0,003 - 0,16 ZURGA et al., (2019)
Estados Unidos 28/31 0,3 - 2,0 DE JESUS et al., (2017)
Grécia 34/44 0,1 - 0,71 SARIGIANNIS et al., (2014)
Itália 90/96 <1- 3,86 PIETRI et al., (2010)
Itália 695/1002 0,1 -2,63 SPADARO et al., (2010)
Itália 2/30 0,35 - 2,34 PRELLE et al., (2013)
Itália 41/57 nd* - 0,73 DI STEFANO et al., (2015)
Portugal 9/12 <1 - 1,23 PENA et al., (2011)
Portugal 4/59 0,23 -1,18 SILVA et al., (2019)
Tunísia 14/18 0,09 - 1,5 LASRAM et al., (2013)
nd*: não detectado.
Entre os métodos microbiológicos destacam-se a utilização de bactérias,
fungos e leveduras. As leveduras são fungos unicelulares com forma arredondada,
a grande maioria pertence ao filo Ascomiceto e reproduzem-se da forma sexuada
ou assexuada. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o micro-organismo mais
aproveitado em processos bioquímicos, utilizando açúcar para produzir à energia
necessária a sobrevivência, gerando etanol como produto desse processo
(BANERJEE, 2009). A parede celular externa é formada por manoproteínas e β-
glucanos, os quais apresentam a propriedade de adsorção física, troca iônica e
complexação, podendo adsorver micotoxinas reduzindo a contaminação em
alimentos (FAUCET-MARQUIS et al., 2014).
15
Meca, Blaiotta e Ritieni (2010) descreveram a redução de 50% na
concentração de OTA em vinho tinto, devido à adsorção celular durante a
fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae. O mesmo mecanismo foi
descrito por Bejaoui et al., (2006) e Piotrowska et al., (2013) ocorrendo um
decréscimo linear da concentração de OTA durante o processo de fermentação do
vinho.
Durante o processo cervejeiro a levedura Saccharomyces cerevisiae,
também reduziu a concentração das micotoxinas desoxinivalenol (DON) e
zearalenona, em 16 e 31%, respectivamente, durante 96 h de fermentação (WALL-
MARTÍNEZ et al., 2019). No processo de fabricação de suco de maçã a mesma
levedura reduziu em 89% a concentração da micotoxina patulina (OPORTO et al.,
2019) e também há relatos de redução de até 81% da aflatoxina M1 durante o
processo de fermentação em produtos lácteos (FOROUGHI et al., 2018). Portanto,
as leveduras são ótimos agentes de controle biológico, em função da sua biologia e
por apresentarem propriedades não tóxicas (PONSONE et al., 2012).
A redução da concentração de micotoxinas também é observada pela
degradação por fungos não toxigênicos, ocorrendo a clivagem da molécula pela
hidrólise da ligação amida que une a porção isocumarina, com a ação de enzimas
proteolíticas intra ou extracelulares, gerando fenilalanina e a molécula de
ocratoxina α (ABRUNHOSA et al., 2011), que não apresenta efeito tóxico (KUPSKI
et al., 2016). Abrunhosa, Serra e Venâncio, (2002) relatam 80% de redução da
concentração de OTA no meio de cultura na presença do fungo Aspergillus.
Mesmo com vários estudos relatando formas eficazes em reduzir os níveis
de micotoxinas em diferentes matrizes alimentares, o controle químico é a técnica
mais utilizada para a prevenção do crescimento fúngico e a produção de
micotoxinas por fungos toxigênicos.
O controle químico pode ser realizado com a utilização de produtos
popularmente denominados de agrotóxicos (CARPINTEIRO et al., 2010). De
acordo com o Decreto Federal n° 4.074 de 4 de Janeiro de 2002, os agrotóxicos
são produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos utilizados para
prevenir, destruir, repelir ou mitigar qualquer praga, classificados em: inseticidas,
acaricidas, bactericidas, nematicidas, herbicidas e fungicidas (JARDIM et al., 2009).
O recurso de proteção mais utilizado em viticulturas até o momento é a prevenção
16
da colonização fúngica com o uso de fungicidas, os quais têm sido extensivamente
utilizados, na tentativa de proteger as videiras, tornando-os cada vez mais
dependentes do uso destes produtos químicos (CARPINTEIRO et al., 2010).
Devido à relevância socioeconômica do setor vitivinícola no estado do Rio
Grande do Sul e ao elevado índice de estudos relatando a ocorrência de OTA,
torna-se imprescindível o conhecimento da qualidade de vinhos consumidos pela
população. Para isso métodos analíticos de extração e detecção de micotoxinas
em amostras de alimentos são muito importantes. A análise de contaminantes no
vinho é um desafio, por se tratar de uma matriz complexa que contém água,
açúcar, álcool e uma variedade de substâncias orgânicas e inorgânicas
(NASCIMENTO, 2005; RUBERT et al., 2013).
3.5 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E DETECÇÃO DE OCRATOXINA A
Devido a frequente ocorrência de micotoxinas em diferentes matrizes
alimentares métodos analíticos que possibilitem a identificação e quantificação em
baixos níveis de concentração são necessários. As amostras de alimentos
geralmente não podem ser analisadas sem o preparo da amostra, devido a baixa
concentração dos analitos. A etapa de extração e a fase de limpeza chamada de
“clean up” são determinantes durante o procedimento (MARTINS et al., 2012).
O método de Tanaka é um método utilizado para a determinação de
micotoxinas em distintas matrizes alimentares apresentando eficiência analítica
(TANAKA et al., 2000). Consiste na extração sólido-líquido, utilizando a proporção
1:10 de amostra e solvente extrator, respectivamente. O elevado volume de
solvente utilizado torna o método inviável, em função do volume de resíduos
gerado e também ao elevado custo dos solventes (HACKBART et al., 2012). A
técnica de Microextração Dispersiva Líquido-Líquido baseia-se na utilização de um
solvente extrator que seja imiscível em água, um solvente dispersor que seja
miscível em água e também a presença de uma solução aquosa que permita a
interação entre o solvente extrator e o solvente dispersor (REZZAE et al., 2006).
Esse tipo de extração apresenta vantagens em utilizar pouco volume de solventes,
ser rápido, simples e compatível com equipamentos analíticos como cromatógrafo
gasoso e cromatógrafo líquido (WEI, LI, WANG, 2007; MELWANKI, FUH, 2008). A
17
técnica de Extração Sólido-Líquido consiste na separação de componentes de uma
matriz em fase sólida, com a utilização de um solvente líquido (LEDOUX, 2011). A
técnica de Dispersão da Matriz em Fase Sólida consiste na dispersão da amostra
sobre um suporte sólido, seguido de eluição (DÓREA, LANÇAS, 1999).
O método QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Ruged and Safe)
(ANASTASSIADES et al., 2003) é o método mais utilizado, devido as suas
vantagens em ser rápido, fácil, econômico, efetivo, robusto e seguro para a análise
de matrizes complexas. A extração do analito é feita com a utilização de um
solvente com diferentes polaridades, sendo comumente utilizado: acetonitrila,
acetona ou acetato de etila. Após é realizada a etapa de partição com a utilização
de sulfato de magnésio, que pode ser empregado de forma isolada ou com outros
sais. Com agitação e centrifugação da amostra se obtém uma alíquota da fase
orgânica que é submetida à limpeza “clean up”. Essa etapa é muito importante no
processo de extração de micotoxina no vinho, pois em virtude da sua cor, essa
matriz apresenta muitos interferentes, tornando-a uma matriz complexa. Essa
etapa aumenta a pureza do extrato, auxiliando que interferentes não apresentem o
mesmo tempo de retenção que o analito. Após essa etapa o sobrenadante
resultante pode ser determinado diretamente ou concentrado caso seja necessário
(MARTINS et al., 2012).
O método QuEChERS modificado (FERNANDES et al., 2013) foi utilizado
para a extração de ocratoxina A no vinho. O analito foi extraído com acetonitrila
acidificada (1% de ácido acético) e a partição realizada com a adição de uma
mistura de sais contendo sulfato de magnésio, resultando em uma reação
exotérmica.
Para a eliminação dos interferentes presentes na matriz utilizou-se sílica
como adsorvente. Assim o analito ficou retido na fase orgânica. Após o processo
de extração e limpeza, uma alíquota do sobrenadante foi seco sob corrente de
nitrogênio, ressuspenso em fase móvel para posterior análise em cromatógrafo.
Entre as técnicas analíticas de detecção de micotoxinas a cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) é a mais utilizada, devido a sua alta sensibilidade,
sendo aplicável em diferentes tipos de matrizes (PAN et al., 2014). O detector
ultravioleta é utilizado em uma das seguintes formas: fluorescência, condutividade
elétrica, espectro de massas ou índice de refração. O detector padrão de UV utiliza
18
comprimentos de onda entre 195 a 375 nm sendo regulado de acordo com o
analito. O DAD é formado por arranjos de diodos, sendo um dos mais eficientes na
detecção de tricotecenos (FU et al., 2009).
O detector de fluorescência baseia-se na radiação recebida pela molécula
através de uma emissão de curta duração. A fluorescência pode ser medida
através da excitação da amostra no comprimento de onda de absorção medindo o
comprimento de onda de fluorescência (GALARCE- BUSTOS et al; 2014). A
velocidade de relaxação influencia na análise por fluorescência, portanto apenas
moléculas com estrutura rígidas podem ser analisadas dessa forma. Micotoxinas
do tipo OTA, ZEA e Aflatoxinas apresentam duplas ligações o que tornam suas
estruturas rígidas, ocorrendo também o efeito de ressonância, permitindo serem
analisadas por fluorescência apresentando baixos limites de detecção e
quantificação (CHEN et al., 2017).
É necessário que os dados gerados apresentem precisão e exatidão
adequadas para que o método seja validado (LANÇAS, 2004). A verificação da
eficiência metodológica é um processo contínuo que se dá desde o início do
desenvolvimento do método analítico, sendo necessário que os resultados obtidos
garantam confiabilidade sobre a amostra analisada (SANTE, 2017), através da
curva analítica e lineariedade, limite de detecção e limite de quantificação, precisão
e exatidão (ANVISA, 2003).
A curva analítica é realizada através da análise de diferentes concentrações
do analito em estudo, utilizando soluções padrão. Com os resultados é obtida uma
relação matemática que possibilita a obtenção da equação da reta (LANÇAS et al.,
2004; RIBANI et al., 2004). O gráfico de calibração é realizado com o mínimo de
cinco níveis de concentração da solução-padrão, sendo necessário que as
concentrações escolhidas preencham uma faixa de 50 a 150% do analito que se
quer analisar (SANTE, 2017). A equação da reta é considerada adequada quando
o coeficiente de correlação linear “r” apresenta um valor acima de 0,90 (INMETRO)
ou um valor igual ou acima de 0,99 (ANVISA) (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003).
Quando a amostra em estudo apresenta interferentes que possam dificultar
a análise, os quais podem eluir no mesmo tempo que o analito, torna-se necessário
elaborar uma curva na matriz, com o objetivo de evitar falsos resultados durante a
análise (RODRIGUES, 2010).
19
Os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) indicam se o método
utilizado é capaz de detectar e quantificar o analito em baixas concentrações. O
LOD corresponde a menor concentração detectável do analito, capaz de distinguir
com segurança do ruído do equipamento e o LOQ corresponde a menor
concentração quantificada do analito, com exatidão e precisão aceitáveis (SANTE,
2017; LANÇAS, 2004). A relação sinal/ruído é utilizada para a determinação dos
LODs e LOQs, sendo realizada através da comparação entre a medição de
amostras em baixas concentrações conhecidas do analito na matriz e também da
matriz sem o analito (branco), desta forma estima-se o valor aceitável da razão
sinal/ruído de 3 para LOD e 10 para LOQ (RIBANI et al., 2004; CASSIANO et al.,
2009).
Com os valores de exatidão é possível saber quanto os dados obtidos se
assemelham com os valores de referência aceitos como verdadeiro (LANÇAS,
2004). A exatidão é expressa em porcentagem e pode ser analisada de acordo
com o uso de materiais de referência, adição de padrão, ensaios de recuperação e
comparação de métodos (SANTE, 2017). Os ensaios de recuperação são
usualmente utilizados para determinar os valores de exatidão e necessitam
apresentar valores entre 70 e 120% de recuperação na análise de micotoxinas,
calculados pela comparação da resposta obtida do analito adicionado na matriz em
estudo com a reposta obtida do analito adicionado ao solvente (BRITO et al., 2003;
CASSIANO et al., 2009; SANTE, 2017). A precisão de um método é obtida pelos
resultados repetidos de uma mesma amostra entre ensaios independentes
(SANTE, 2017). São aceitos valores de até 20% de precisão para a análise de
elementos traços, podendo ser avaliada através da reprodutibilidade, repetibilidade
e precisão intermediária (BRITO et al., 2003).
A reprodutibilidade refere-se ao grau de concordância entre os resultados
obtidos de uma mesma amostra, realizado com alterações de operador,
equipamento, local, etc. A repetibilidade representa a concordância entre os
resultados de análises sucessivas utilizando um mesmo método, efetuadas sob as
mesmas condições em um pequeno intervalo de tempo com o mesmo
procedimento, mesmo instrumento, mesmo analista e mesmas condições de
análise (INMETRO, 2003).
20
3.6 FUNGICIDAS
Os fungicidas são extensivamente utilizados na área da viticultura, com o
objetivo de amenizar as perdas decorrentes da contaminação por fungos
toxigênicos, insetos e outros patógenos (CARPINTEIRO et al., 2010). Entre os
fungicidas mais utilizados na viticultura estão o cresoxim-metílico e famoxadona
(MULERO et al., 2015), os quais podem ser classificados de acordo com a fase da
aplicação como: preventivos, que são aplicados na fase de pré-infecção; curativos,
que são aplicados após a infecção; e erradicativos, que são aplicados após o
sintoma. Cada ingrediente ativo presente no fungicida age em um sítio específico
do fungo desencadeando processos bioquímicos que levam o organismo a morte,
podendo afetar a parede celular, membrana plasmática, mitocôndrias, retículo
endoplasmático, ribossomos ou núcleo (ANGELOTTI et al., 2012).
A utilização de fungicidas é mais intensa em regiões de clima quente e
úmido na tentativa de prevenir e controlar os ataques fúngicos, pois essas
condições favorecem a ocorrência de doenças em vinhas, as quais causam
importantes perdas econômicas no setor de viticultura (FONTANA et al., 2011).
Entre os fungicidas detectados em vinho tinto, destaca-se a ocorrência de
cresoxim-metílico e famoxadona (LIU et al., 2010; AGUILERA et al., 2014;
RAHMAN et al., 2014; CHEN et al., 2017). Estes contaminantes pertencem a
classe III de risco toxicológico e podem promover alterações bioquímicas durante o
processo de fermentação do vinho devido a modificações nas membranas
celulares da levedura Saccharomyces cerevisiae, afetando sua função específica,
com consequente redução na velocidade das fermentações, redução na
concentração de compostos fenólicos, diminuição na atividade antioxidante e até a
alteração na concentração de etanol (HÝSEK et al., 2005; MULERO et al., 2015;
OLIVA et al., 2015; APONTE, BLAIOTTA, 2016).
Durante o processo de fermentação alcoólica a concentração destes
contaminantes pode ser reduzida (BORTOLETTO et al., 2015). Gonzalez-
Rodríguez et al., (2009) relatam uma redução de 50% na concentração de
fungicidas detectada na uva em relação à concentração detectada no vinho,
indicando a possibilidade de ocorrer degradação ou adsorção deles durante a
fabricação do vinho.
21
Mesmo que as concentrações de fungicidas e micotoxinas estejam menores
no vinho do que nas uvas, há preocupação com a contaminação do produto final
(MARTINS et al., 2012). Portanto, o consumo destes contaminantes pode afetar a
saúde humana, uma vez que a sua ingestão é concomitante a outros alimentos
com este mesmo perfil de contaminação, reforça a preocupação com a segurança
da população (GARBI et al., 2010).
O fungicida cresoxim-metílico (Figura 4) pertence à classe das estrobilurinas
e apresenta o nome químico Methyl (E)-2-methoxyimino [2-(o-tolyloxymethyl)
phenyl] acetate e a seguinte fórmula molecular C18H19NO4 (LEE et al., 2018).
Figura 4- Estrutura química do fungicida cresoxim-metílico
As estrobilurinas compreendem uma classe de fungicidas sintéticos que
apresentam excelente ação antifúngica, sendo extensivamente utilizados para
prevenir doenças fúngicas foliares em uma ampla gama de culturas em todo o
mundo (JERNBERG et al., 2003; DORNELLAS et al., 2013). Atuam prevenindo a
germinação dos esporos, com ação curativa inibindo o desenvolvimento dos fungos
nos estágios de pós-germinação (VENÂNCIO et al., 1999). Seu ingrediente ativo
age em um sítio específico do fungo ocasionando a inibição da respiração
mitocondrial (LIKAS et al., 2007).
De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), é
aceitável a ingestão diária de até 0,40 mg kg-1 (ANVISA, 2009). A concentração
para uso no campo recomendada pelo fabricante é de 0,1 kg ha-1 (MAPA-03198) e
o limite máximo de resíduo de cresoxim-metílico em uvas é de 0,5 mg kg-1
(ANVISA, 2009).
O fungicida famoxadona (Figura 5) pertence à família das oxazolidinones e
apresenta o nome químico Famoxadona [3-anilino-5-metil -5- (4-fenoxifenil) - 1,3-
22
oxazolidine-2,4-diona], utilizado para o controle de doenças fúngicas foliares,
apresentando eficiência contra o míldio da videira (NEUBURGER et al., 2003). Ele
inibe a respiração mitocondrial, apresentando ação bioquimicamente similar à
classe das estrobilurinas (ABREU et al., 2006), atuando na proteção e erradicação
da doença fúngica, pela rápida absorção e distribuição na planta (LIKAS et al.,
2007).
Figura 5- Estrutura química do fungicida famoxadona
De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) é
aceitável, a ingestão diária de até 0,006 mg kg-1 (ANVISA, 2018). A concentração
para uso no campo recomendada pelo fabricante é de 0,06 kg ha-1 (MAPA-01499)
e o limite máximo de resíduo de famoxadona permitido em uvas é de 2 mg kg-1
(ANVISA, 2018).
3.6.1 Modo de ação dos fungicidas
Os fungicidas podem ser classificados de acordo com seu modo de ação: os
fungicidas de contato que formam uma película protetora na superfície da planta,
impedindo a penetração do patógeno; os fungicidas mesostêmicos que apresentam
elevada afinidade com a camada cerosa das folhas; os fungicidas sistêmicos que
se movem na planta pelos vasos condutores atingindo locais distantes do local
aplicado; e os fungicidas translaminares que se distribuem de forma limitada nos
tecidos (KOLOSOVA et al., 2017).
Os fungicidas da classe das estrobilurinas e da classe oxazolidinones são
eficazes no combate ao crescimento fúngico, conhecidos como inibidores da
quinona oxidase (Qol), devido a presença de grupos químicos que se ligam ao sítio
específico na mitocôndria, onde ocorre a respiração celular. A transferência de
elétrons é bloqueada no nível do complexo III (citocromo BC1), impedindo a síntese
23
de ATP (adenosina trifosfato), interrompendo a produção de energia (Figura 6).
Esses fungicidas são considerados de ação rápida, pois interrompem o primeiro
ciclo de vida dos fungos, no estágio de esporos, o qual requer elevado nível
energético (BALBA et al., 2007).
Os fungicidas do tipo estrobilurinas e oxazolidinones pertencem a uma das
classes mais importantes de compostos utilizados no controle de doenças em
cereais, frutas e vegetais (KOLOSOVA et al., 2017). Apresentando relevância nas
lavouras em virtude dos seus efeitos benéficos a planta, pois apresenta a
capacidade de ativar a enzima NADH- nitrato redutase, o que proporciona o
aumento do aproveitamento de nitrato e sua incorporação na planta pelas
moléculas de clorofila (DOURADO NETO et al., 2005).
Figura 6- Célula fúngica com o local de atuação dos fungicidas no complexo
III da cadeia transportadora de elétrons, localizada nas cristas mitocondriais.
Fonte: Adaptado de PARREIRA et al., 2009.
24
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Reagentes, solventes e material
- Saccharomyces cerevisiae (Biolievito cerevisiae), BIOTEC SUL (Brasil);
- Aspergillus carbonarius, Coleção de Culturas da Fundação André Tosello (Brasil);
- Ocratoxina A (pureza > 98%), SIGMA ALDRICH (Brasil);
- Cresoxim-metílico, BASF S.A. (Brasil);
- Famoxadona, DUPONT™ (Brasil);
- Acetonitrila grau HPLC, PANREAC (Espanha);
- Acetonitrila P.A., VETEC (Brasil);
- Água destilada, QUIMIS 341-25 (Brasil);
- Água purificada em sistema Direct-Q UV3, MILLIPORE (resistividade de 18,2 MΩ
cm) (EUA);
- Sílica Gel 60, MACHEREY-NAGEL (Alemanha);
- Cloreto de sódio, SYNTH (Brasil);
- Sulfato de magnésio, SYNTH (Brasil);
- Citrato de sódio tribásico dihidratado, SYNTH (Brasil);
- Citrato de sódio dibásico sesquihidratado, SYNTH (Brasil);
- Glicose anidra, SYNTH (Brasil);
- Guaiacol P.A., VETEC (Brasil);
- Fosfato de sódio monobásico, VETEC (Brasil);
- Fosfato de sódio dibásico, VETEC (Brasil);
- Extrato de levedura, ACUMEDIA (Brasil);
- Agar potato dextrose, ACUMEDIA (Brasil);
- Clorofórmio P.A., SYNTH (Brasil);
- Peróxido de hidrogênio 30%, ÊXODO CIENTÍFICA (Brasil);
- Gás nitrogênio;
- Hexano P.A., SYNTH (Brasil);
- Etanol P.A., SYNTH (Brasil);
25
- Membrana de acetato de celulose de 47 mm de diâmetro e 0,45 μm de diâmetro
de poro MILLIPORE (Brasil);
- Frascos de vidro âmbar;
- Vidraria comum de rotina (béquer, erlenmeyer, pipetas volumétricas, balões
volumétricos, etc...).
4.1.1 Equipamentos
- Balança analítica de precisão FA2104N, BIOPRECISA (Brasil);
- Banho ultrassônico 25 mHz, UNIQUE (Brasil);
- Banho ultrassônico, UNIQUE Ultra Cleaner 700 (Brasil);
- Banho maria, BIOPAR COEL TLK 48 (Brasil);
- Bomba de vácuo, PRISMATEC (Brasil);
- Microcentrífuga, MINISPIN (Brasil);
- Centrífuga refrigerada, CIENTEC CT-5000R (Brasil);
- Coluna analítica, Gemini C18 (250 x 4,5 mm, 5 μm) PHENOMENEX (EUA);
- Concentrador, TECNAL TE-019 (Brasil);
- Cromatógrafo Líquido, SHIMADZU (Japão) equipado por um sistema de bombas
26 (modelo LC- 20AT), desgaseificador da fase móvel (modelo DGU20A5),
controlador (modelo CBM-20A), injetor manual com alça de amostragem de 20 μL
(modelo 7725i) e detector de fluorescência (modelo FL – 10AXL);
- Espectrofotômetro modelo Cary 100 – UV-VISABLE, VARIAN (EUA);
- Micropipetadores automáticos com capacidade variável de 10 – 5000 μL;
- Shaker incubadora, TECNAL TE-420 (Brasil);
- Vórtex Mixer, VIXAR (Coreia).
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Preparo das soluções
A solução estoque de Ocratoxina A foi preparada a partir de recipiente
comercial com 1 mg da micotoxina que foi dissolvida em benzeno: acetonitrila (98:2
v/v) até uma concentração de 100 µg mL-1. Após a solução estoque foi diluída para
26
se obter uma solução padrão com concentração de 50 µg mL -1 segundo relação
massa/volume e confirmada em espectrofotômetro. A concentração da solução
trabalho foi verificada utilizando os valores de absortividade molar (ɛ= 5550 L mol-1
cm-1) e comprimento de onda de máxima absorbância (333 nm) em benzeno: ácido
acético (99:1) (Equação 2). A pureza do composto foi confirmada com a
quantificação em espectrofotômetro de ultravioleta (AOAC, 2007).
µg mL-1= Abs. x M M x 1000 x F C x ɛ -1x C-1 (2)
Onde:
Abs = valor da absorbância da solução padrão
M.M. = massa molecular da micotoxina
FC = fator de correção do instrumento
ɛ = absortividade molar da micotoxina no comprimento de onda de máxima
absorbância em acetonitrila
C = largura da cubeta (1 cm).
Os fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona foram preparados em água
destilada para a obtenção da solução estoque e armazenados em refrigerador
(4°C) até o uso.
O volume de 1 mL da solução trabalho de famoxadona na concentração de
18 mg mL-1 foi adicionado nas placas de Petri com posterior adição de 29 mL de
meio PDA resultando em uma concentração de 600 µg mL-1 recomendada pelo
fabricante para o uso no campo. O volume de 1 mL da solução de famoxadona na
concentração 0,60 mg L-1 foi adicionado ao reator tipo erlenmeyer com posterior
adição de 199 mL de meio de cultura sintético resultando em uma concentração de
3 mg L-1 .
O volume de 1 mL da solução trabalho de cresoxim-metílico na
concentração de 30 mg mL-1 foi adicionado nas placas de Petri com posterior
adição de 29 mL de meio PDA resultando em uma concentração de 1000 µg mL-1
recomendada pelo fabricante para o uso no campo. O volume de 1 mL da solução
de cresoxim-metílico na concentração 0,15 mg mL-1 foi adicionado ao reator tipo
erlenmeyer com posterior adição de 199 mL de meio de cultura sintético resultando
em uma concentração de 0,75 mg L-1.
27
4.2.2 Ocorrência de OTA no vinho
4.2.2.1 Amostragem
As amostras de vinho tinto (N= 50) foram coletadas aleatoriamente com
diferentes lotes entre janeiro e dezembro de 2018, em estabelecimentos
comerciais, na cidade do Rio Grande- Rio Grande do Sul. As amostras foram
divididas de acordo com o tipo: 31 amostras de vinho tinto seco e 19 amostras de
vinho tinto suave, variando entre os tipos Carbenet Sauvignon, Malbec, Merlot,
Pinot noir. As uvas utilizadas para a elaboração dos vinhos variaram entre os tipos:
Americana, Carbenet Sauvignon, Bordo, Tannat, Isabel, Concord, Couderc, Merlot
e Niágara. O grau alcoólico variou entre 12% a 13% (v v-1) e o pH na faixa de 3,1 a
3,8. Todas as amostras foram armazenadas a 4 °C.
4.2.2.2 Extração e Quantificação de Micotoxina no vinho
A extração da micotoxina no vinho foi realizada pelo método de QuEChERS
(FERNANDES et al., 2013) com modificações. Em tubos falcon foram adicionados
4 mL de vinho e 4 mL de acetonitrila acidificada com 1% de ácido acético, após a
homogeneização em vórtex foi adicionado 2,6 g de sais (sulfato de magnésio
anidro, cloreto de sódio, citrato de sódio tribásico di-hidratado, citrato de sódio
dibásico sesquihidratado, na proporção 4: 1: 1: 0,5) os tubos foram
homogeneizados em vórtex durante 1 min e centrifugados durante 5 min a 1489 g.
A etapa de limpeza foi realizada com 2,5 mL do sobrenadante adicionando
125 mg de sílica e 375 mg de sulfato de magnésio anidro, após homogeneizado em
vórtex durante 1 min e centrifugado durante 5 min a 1489 g.
O volume de 1,5 mL do sobrenadante foi transferido para um frasco e o
solvente evaporado sob corrente de N2. O extrato seco foi ressuspenso em 1 mL
de fase móvel (60% de acetonitrila, 40% de água Mili-Q acidificada com 1% de
ácido acético) seguido da centrifugação e injeção cromatográfica.
28
A OTA foi quantificada em cromatógrafo líquido de alta eficiência com
detector de fluorescência (HPLC-FL) de acordo com Kupski e Badiale-Furlong,
(2015) com modificações. Para a separação foi utilizada a coluna cromatográfica
analítica Gemini C18 (250 x 4,5 mm, 5 μm) PHENOMENEX (EUA) em um
Cromatógrafo Líquido SHIMADZU (Quito, Japão) equipado por um sistema de
bombas (modelo LC- 20AT), desgaseificador de fase móvel (modelo DGU20A5),
controlador (modelo CBM-20A), injetor automático com amostragem de 20 μL
(modelo 7725i) e com detector de fluorescência (modelo FL- 10AXL). A fase móvel
empregada foi constituída de acetonitrila e água Mili-Q acidificada (1% de ácido
acético) 60:40 (v.v-1), respectivamente, com o volume de vazão de 0,8 mL min-1 e
temperatura de 25 ºC. Os comprimentos de onda utilizados para a detecção de
OTA foram de 333 nm e 460 nm, para excitação e emissão, respectivamente.
4.2.2.3 Validação do Método
A validação da técnica cromatográfica para a extração e detecção de OTA
seguiu as figuras de mérito descritas a seguir (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003;
EUROPA COMISSION REGULATION (EC), 2006).
As curvas analíticas foram construídas com padronização externa no
solvente e na matriz, com o objetivo de avaliar a lineariedade do método.
Concentrações a partir de 0,5 µg L-1 até 5,0 µg L-1 das soluções padrões analíticas
foram utilizadas para a construção da curva de ocratoxina A.
A diluição da solução trabalho foi realizada em acetonitrila, para a obtenção
da padronização externa no solvente. A padronização externa por superposição da
matriz foi realizada a partir da diluição da solução trabalho, com o extrato da matriz.
O branco foi composto pela matriz isenta da micotoxina.
As determinações foram realizadas em triplicata, para a obtenção dos dados
de regressão linear através do software do equipamento. Dessa forma, o
coeficiente de correlação linear foi avaliado, obtendo-se a lineariedade do método.
A relação sinal/ruído foi empregada para estimar os LOD e LOQ,
considerando que o sinal gerado foi no mínimo de 3 a 10 vezes maior que a razão
do sinal da linha de base (ruído), respectivamente. Os limites do método (LOQm e
LODm) QuEChERS modificado foram obtidos pela determinação em soluções
29
analíticas com diferentes concentrações preparadas pelas diluições da solução
padrão trabalho com o extrato da matriz, branco, extraído por QuEChERS
modificado (KUPSKI e BADIALE-FURLONG, 2015).
Os ensaios de recuperação definiram a exatidão do método. Amostras de
vinho (isentas de micotoxina) foram fortificadas com OTA nas concentrações de
1,0 µg L-1; 2,0 µg L-1 e 5,0 µg L-1 e para a extração foi utilizado o método de
QuEChERS modificado.
Para a quantificação de OTA foi utilizado à padronização por superposição
na matriz e os cálculos para expressar a porcentagem de recuperação foram
realizados de acordo com a Equação 3.
R (%)= [C1-C2/ C3] x 100 (3)
Onde:
C1= Concentração determinada após a fortificação
C2= Concentração determinada na amostra não fortificada (branco)
C3= Concentração esperada para o nível de fortificação
Para avaliar a precisão instrumental foram feitas análises sucessivas da
solução padrão na concentração de 2,0 µg L-1 (n = 10) e estimada pelo erro puro
relativo (RSD%) com relação a média das áreas de todas as análises. A precisão
do método foi avaliada em função da repetibilidade e da precisão intermediária.
Para o estudo da repetibilidade foi realizada a extração por QuEChERS,
modificado, em três níveis de fortificação, em triplicata, e estes níveis foram
analisados também em triplicata. A partir de nove determinações realizadas foi
calculado o RSD% para a repetibilidade. Para o estudo da precisão intermediária,
as nove determinações foram avaliadas em função de diferentes dias e, após,
também foi calculado o RSD%.
A sensibilidade foi determinada com a inclinação da reta da curva analítica,
correspondendo ao coeficiente angular da equação linear.
A seletividade foi determinada pelo do sinal do analito gerado em HPLC-FL e
pelo espectro de absorção do sinal do analito comparado ao do padrão.
30
O efeito de matriz foi determinado com curva analítica no solvente e curva
analítica na matriz, em que foram analisadas as inclinações das retas, conforme
Equação 4:
EFM(%)= [X1-X2/X2]X 100 (4)
Onde:
X1=inclinação da curva obtida pela injeção da solução analítica de OTA,
preparada no extrato da matriz (vinho);
X2= inclinação da curva obtida pela injeção da solução analíticas de OTA,
preparada no solvente ((60:40) / (ACN: Ág.Acid)).
4.2.2.4 Estimativa de ingestão de OTA pelo consumo de vinho
A estimativa foi realizada de acordo com a Equação 5 (ZHONG et al., 2014).
Y= X.C/ W (5)
Onde:
Y= dose diária (µg kg-1 corpóreo)
X= vinho consumido (µg L-1)
C= nível de concentração de OTA no vinho (µg L-1)
W= peso corpóreo (kg)
4.2.3 Crescimento fúngico de Aspergillus carbonarius e manifestação toxigênica
Aspergillus carbonarius foi mantido em câmara germinativa (BOD) em meio
agar potato dextrose (PDA) com foto período de 12 h durante 7 dias a 26 °C (QIAN
et al., 2016) para a obtenção dos discos miceliais. Para a avaliação toxigênica de
Aspergillus carbonarius foi utilizado o método analítico “in vitro”. Ao tratamento
denominado controle foi adicionado 30 mL de meio PDA as placas de petri com
10 cm de diâmetro. Aos tratamentos com os fungicidas cresoxim-metílico e
31
famoxadona foi adicionado 1 mL da solução trabalho e 29 mL de meio PDA. Logo
após a solidificação do meio, discos de micélio (1,0 cm de diâmetro) foram
inoculados ao centro da placa de petri. As culturas foram incubadas com foto
período de 12 h durante 7 dias a 26 °C. Diariamente foram removidas, em triplicata,
da BOD os cultivos tratados e o cultivo controle para o acompanhamento do
crescimento e manifestação toxigênica de Aspergillus carbonarius.
4.2.3.1 Avaliação do crescimento fúngico
O diâmetro das colônias foi medido diariamente e os valores foram
expressos em cm, em quintuplicada. O efeito do tratamento foi avaliado pela
medida dos diâmetros das colônias expressos em centímetro e também pelo
conteúdo de glicosamina (mg mL-1). Os testes foram realizados em triplicata.
O crescimento fúngico foi estimado tendo como referência o grupo controle.
A porcentagem de inibição fúngica foi calculada de acordo com Lappa et al., (2017)
(Equação 6).
Inibição (%)= (1-T/C) x100 (6)
onde T é o diâmetro do micélio fúngico tratado com fungicida e C é o diâmetro do
controle fúngico.
A taxa de crescimento fúngico em meio PDA foi determinada medindo-se o
diâmetro (em cm) das colônias, com régua em duas direções perpendiculares
durante os sete dias de experimento, calculando-se os valores médios e o desvio
padrão. Para obter a taxa máxima de crescimento do fungo Aspergillus
carbonarius, foi realizada a linearização da fase exponencial do crescimento em
função do tempo (HAMIDI- ESFAHANI et al., 2007). A linearização foi obtida com a
Equação 7:
Ln X/X0=µmax.T (7)
onde x é o cm final, x0 é o cm inicial, T é o tempo (horas), µmax é a velocidade
máxima.
O crescimento fúngico também foi avaliado pelo conteúdo de glicosamina, a
cada 1 g de biomassa seca a 60 °C durante 4 h foram adicionados 5 mL de HCl 6
32
M seguido por aquecimento a 100 °C durante 40 min. Após o hidrolisado foi
neutralizado com uma solução de NaOH 3 M e titulado com KHSO4 (1% m/v). A
reação colorimétrica foi realizada com o reagente de Erlish (DAB- p-
dimetilaminobenzaldeído) dissolvido em 15 mL de etanol absoluto e 15 mL de HCl
concentrado. O conteúdo de n-acetilglucosamina foi medido com a curva padrão de
glicosamina (0,01 a 0,2 g L-1) utilizando a unidade de absorbância
espectofotométrica de 530 nm (PAGNUSSAT et al., 2013).
4.2.3.2 Produção de OTA no meio de cultura PDA
A extração de micotoxinas do meio de cultura foi realizada de acordo com
Kupski et al., (2018). A cada 10 g de amostra foram adicionados 2 mL de HCl 2 M e
10 mL de clorofórmio. Em seguida os tubos foram homogeneizados em vórtex
durante 1 min e centrifugados (10 min/3220 xg), a partição com clorofórmio foi
repetida três vezes e após centrifugação (10 min/3220 xg) a fração de clorofórmio
foi evaporada sob corrente de nitrogênio para posterior análise em HPLC-FL. Os
extratos foram ressuspensos em 1 mL de fase móvel (60% Acetonitrila, 40% água
Mili-Q acidificada com 1% de ácido acético) e realizada a injeção no sistema
cromatográfico. A eluição realizada na coluna cromatográfica Kromasil C18 (5 mm
150X4,6 mm) a 25 °C com vazão de 0,8 mL min-1 e com detector de fluorescência
com comprimento de onda de excitação e emissão de 333 nm e 460 nm,
respectivamente.
A inibição da produção de micotoxinas (IMM), a inibição do crescimento
micelial (IMG), a inibição específica da produção de micotoxinas por grama de
fungicida na placa de cultura (IMM esp.), foram calculados de acordo com as
Equações 8, 9,10 (Nguefack et al., 2004).
IMM= (OTA C – OTA T) / OTA C (8)
IMG= (cd C- cd T) / cd C (9)
IMM Esp = ((OTA Control – OTA T) / OTA C) Fung (10)
33
onde OTA C é a concentração de OTA (ng g-1meio) no controle, OTA T é a
concentração de OTA (ng g-1meio) no tratamento, cd C é o diâmetro (cm) da colônia
de micélio sem tratamento com fungicida, cd T é o diâmetro (cm) da colônia de
micélio tratado com fungicida e Fung é a concentração (mg mL-1) de fungicida
utilizado.
4.2.4 Efeito da micotoxina OTA e dos fungicidas cresoxim metílico e famoxadona
na fermentação alcoólica
4.2.4.1 Preparo do meio fermentativo
O meio de cultura sintético, utilizado para a fermentação alcoólica, foi
composto por glicose (200 g L-1), ácido tartárico (4 g L-1), extrato de levedura
(10 g L-1), peptona (20 g L-1) e o pH ajustado em 3,5 utilizando carbonato de
potássio (ZHANG et al., 2007). A levedura liofilizada de Saccharomyces cerevisiae
(200 µg mL-1) foi diluída em 12 mL de água mili-Q e incubada em agitador rotatório
a 200 rpm durante 10 min a 26 °C, para sua homogeneização.
4.2.4.2 Condições de cultivo
O cultivo submerso foi realizado em reatores de vidro cônicos com volume
útil de 250 mL contendo 188 mL de meio de cultura sintético e 12 mL do meio
contendo a levedura na concentração de 200 µg mL-1 correspondendo a adição de
6% do volume de meio fermentativo. A fermentação foi realizada a 26 °C durante
96 h. O efeito da micotoxina e fungicidas na fermentação alcoólica foi avaliado
adicionando ao reator um volume de solução padrão de Ocratoxina A
correspondente a concentração final no meio de cultivo de 2 e 4 µg L-1
(denominado OTA 2 e OTA 4, respectivamente). A adição da solução de
micotoxina foi realizada previamente a adição do meio de cultivo, sendo o solvente
evaporado sob corrente de nitrogênio. O mesmo procedimento foi empregado para
os fungicidas famoxadona (3 mg L-1) e cresoxim-metílico (0,75 mg L-1)
denominados de F e CM, respectivamente. Os contaminantes também foram
avaliados de forma concomitante, com adição simultânea de OTA em 2 µg L-1 e
34
famoxadona em 3 mg L -1 (OTA 2+ F), OTA em 2 µg L-1 e cresoxim-metílico em
0,75 mg L-1 (OTA 2 + CM), OTA em 4 µg L-1 e famoxadona em 3 mg L-1 (OTA 4+
F), OTA em 4 µg L-1 e cresoxim-metílico em 0,75 mg L-1 (OTA 4 +CM).
Posteriormente, o meio de cultura foi adicionado aos reatores e homogeneizado em
agitador rotatório a 100 rpm durante 10 min para solubilização dos contaminantes,
seguida da adição do inóculo. O cultivo controle foi realizado sem a adição dos
contaminantes. Alíquotas foram retiradas assepticamente a cada 24 h de cultivo
para o acompanhamento da concentração celular, pH, concentração de açúcares
redutores, atividade enzimática da peroxidase, produção de glutationa, proteínas
solúveis totais, etanol e extração e quantificação da ocratoxina A. Ao final de 96 h
da fermentação foi realizada a microscopia nas células da levedura.
4.2.4.3 Determinações tecnológicas no fermentado: acidez, etanol, açúcar redutor,
proteínas e MEV
O pH foi medido potenciometricamente com pHmetro calibrado com as
soluções tampões de pH 4 e 7, conforme AOAC (2000).
Os açúcares redutores foram determinados pelo método ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959), usando glicose para a curva padrão. A cada
1 mL de meio fermentado, foi adicionado 1 mL de NaOH (0,1 M) e 1 mL de DNS.
Incubados a 100 °C, durante 5 min e resfriados em banho de gelo. O volume de
7 mL de água destilada foi adicionado e a absorbância medida a 540 nm em
espectrofotômetro (Cary UV-VIS 100, Walnut Creek, EUA).
Para a quantificação das proteínas solúveis totais foi utilizado o método
adaptado de Lowry et al.,(1951). A cada 0,5 mL de amostra foi adicionado, 0,5 mL
NaOH (1 mol L-1), 4 mL de solução alcalina (Anexo 1), deixando reagir por 10 min,
e posteriormente, 1 mL do reagente de Folin-Ciocalteau 2 mol L-1 (diluído 1:2 com
água destilada). Após 30 min as absorbâncias foram medidas em
espectrofotômetro a 660 nm (Cary UV-VIS 100, Walnut Creek, EUA).
O etanol foi quantificado de acordo com Klarić et al., (2014) em cromatógrafo
a gás (CG-2010 Shimadzu) equipado com injetor Split / Splitless e detector de
ionização de chama, coluna Crossbond (diphenil dimethil polysiloxane) de 30 m,
0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm de espessura de 75% de película-fenil-
35
metilpolisiloxano. O volume de injeção manual empregado foi de 1 µL, a
temperatura de entrada 230 °C, a pressão da coluna de 2,33 psi e a vazão do gás
de arraste de nitrogênio 0,5 mL min-1. A velocidade média do gás de nitrogênio de
10 cm s-1. A temperatura do forno foi mantida a 26 °C durante 7 min e em seguida
aumentou de 26 °C para 50 °C a uma taxa de 1 °C min-1 e finalizando com 200 °C
(taxa de 15 °C min-1) durante 4 min. A temperatura do detector por ionização de
chama (FID) foi de 250 °C e o fluxo do gás transportador de nitrogênio foi
de 25 mL min -1. O etanol foi identificado através da elaboração de uma curva com
o padrão do etanol diluído em água ultrapura e os resultados foram expressos em
porcentagem.
Ao final da fermentação (96 h) alíquotas do precipitado celular foram
mantidas durante 48 h a 4 °C em 1 mL de solução de glutaraldeído (3%) em
tampão fosfato 0,05 M (pH 6,8). As amostras foram lavadas com água destilada e
desidratadas com lavagens sucessivas de etanol (30, 50, 70 e 95%),
permanecendo 20 min em cada concentração e 45 min em etanol absoluto. Após,
foram secas em estufa a 30°C, colocadas em stubs e cobertas com ouro paládio
para visualização em microscópio eletrônico de varredura com espectro de energia
dispersiva a 25 kV e com magnitude de 1000 a 5000 X (TAO; JIA; ZHOU, 2014).
4.2.4.4 Determinações bioquímicas no fermentado: concentração celular,
atividade enzimática da peroxidase, produção de glutationa e concentração de OTA
A concentração celular foi avaliada em espectrofotômetro (Cary UV-VIS 100,
Walnut Creek, EUA) pela medida da densidade óptica de OD600nm. Para obter a
concentração celular foi feita uma curva padrão a partir da levedura cultivada nas
mesmas condições do inóculo. Após 24 h parte do meio foi centrifugado a 1894 g
durante 10 min e o sobrenadante descartado. A massa celular foi lavada com água
destilada seguido de secagem em estufa a 60 °C até atingir massa constante. No
meio fermentado restante foram feitas diferentes diluições com água destilada e
determinada a absorbância. De acordo com o resultado de massa celular seca foi
determinada a concentração celular para cada diluição. Com os dados obtidos foi
realizada a regressão linear obtendo a curva padrão para o cálculo da
concentração celular (mg mL-1) (Chang et al., 2018).
36
A glutationa intracelular foi extraída com 1,5 mL de etanol 40%, adicionado a
1,5 mL de meio fermentado, seguido de banho a 30 °C por 2 h e centrifugado a
1804 g, por 10 min. Para a reação colorimétrica foi adicionado 1,5 mL de tampão
fosfato de potássio 0,5 mol L-1 (pH 8,0), 0,03 mL de ácido 5,5-ditiobis-2-
nitrobenzóico a 0,5 mL do sobrenadante. Após 3 min a absorbância foi medida em
espectrofotômetro a 412 nm (Cary UV-VIS 100, Walnut Creek, EUA). A solução de
etanol 40% substituiu o sobrenadante configurado como branco (Owens e Belcher,
1965). A concentração de GSH (mg mL-1) foi calculada usando a curva padrão, de
L-glutationa reduzida. A solução de GSH foi preparada em 100 mL, dissolvendo
0,01 g em HCl 0,01 mol L-1 (resfriado) sendo mantida congelada. Para o preparo da
solução de DTNB, 0,396 g deste reagente e 0,15 g de NaHCO3 foram dissolvidos
em tampão fosfato de sódio (0,1 mol L-1, pH 7,0). O volume foi ajustado para
100 mL e a solução mantida congelada até o momento do uso.
A atividade enzimática da peroxidase (PO) foi realizada de acordo com
Garda-Buffon; Kupski; Furlong (2011). A cada 1 mL de meio fermentado, foi
adicionado: 1,5 mL de tampão fosfato 5 mmol L-1 (pH 6,0), 2 mL de água destilada,
0,5 mL do substrato guaiacol (0,5%) e 1 mL de peróxido de hidrogênio (0,08%). A
mistura foi incubada durante 30 min em banho-maria a temperatura de 30 ºC e a
absorbância dos compostos oxidados determinadas em espectrofotômetro a
470 nm (Cary UV-VIS 100, Walnut Creek, EUA). A unidade de atividade específica
da enzima PO é definida como a massa de proteína capaz de aumentar a unidade
de absorbância em 0,001/min-1 mgproteína-1.
A extração e quantificação de OTA do meio de cultura fermentado foram
realizadas conforme descrito no item 4.2.2.2.
4.2.4.5 Parâmetros cinéticos
A velocidade máxima de crescimento (µmax) foi obtida pela regressão
exponencial aplicada à fase logarítmica de crescimento (HAMIDI-ESFAHANI et al.,
2007).
Os fatores de relação* (GSH) e relação** (PO) foram estimados empregando
as Equações 11 e 12 respectivamente:
37
relação* (GSH) = OTA ng/ml / GSHmg/ml (11)
relação** (PO) = OTA ng/ml / POU/ml (12)
Onde:
OTA ng/ml= concentração de ocratoxina A (ng mL-1).
GSHmg/ml = produção de glutationa.
POU/ml = atividade da peroxidase.
Os fatores de conversão YP/S (substrato em produto), YX/S (substrato em
biomassa) e YP/X (biomassa em produto) foram estimados empregando as
equações 13, 14 e 15 respectivamente: (SCHMIDELL et al., 2001).
YP/S = P - P0 / S0 - S (13)
YX/S = X - X0 / S0- S (14)
YP/X = P-P0 / X0-X (15)
Onde:
P = produto (GSH) ou (etanol); S = substrato (glicose); X = biomassa (células).
4.2.6 Limpeza de vidraria e tratamento de resíduos
A limpeza da vidraria utilizada nos experimentos e os resíduos dos ensaios
foram tratados através da imersão do material em hipoclorito de sódio na
concentração de 1%. Esta solução degrada a estrutura química dos compostos,
permitindo o descarte do material. Os resíduos de solventes orgânicos foram
rotulados e armazenados de acordo com a sua classificação, seguindo
regulamento para tratamento de resíduos estabelecidos na Escola de Química e
Alimentos.
38
4.2.7 Análise Estatística
Todos os ensaios foram realizados em triplicata. A análise estatística dos
dados foi realizada utilizando o programa “Statistica” (versão 7.0, Statsoft, Inc.,
Tulsa, EUA) usando análise de variância (ANOVA), considerando a média das
triplicatas dos ensaios por teste de Tuckey a 5% (p < 0.050).
39
5. APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
5.1 ESTUDO DA OCORRÊNCIA DE OTA EM VINHO
A validação do método analítico de acordo com as figuras de mérito indicado por
órgão regulamentadores (INMETRO, 2003; ANVISA, 2003; EUROPA COMISSION
REGULATION (EC), 2006) apresentado na Tabela 3. Devido a presença de
interferentes, a curva de calibração foi realizada na matriz, com coeficiente de
correlação linear acima de 0,99 e o método apresentou exatidão com recuperações
entre 80 e 99% (Sante, 2017).
Tabela 3- Parâmetros de validação do método QuECHeRS
Parâmetros Curva na matriz
Equação da curva y= 4248,2x- 2796,8
Lineariedade 0,5- 5,0 μg L-1
Coeficiente de correlação 0,99
LODM 0,34 μg L-1
LOQM 0,5 μg L-1
OTA no vinho Recuperação (%)
1,0 μg L-1
99
Níveis 2,0 μg L-1
80
5,0 μg L-1
85
LODM – Limite de detecção do método; LOQM- Limite de quantificação do método.
Após a validação do método, a avaliação da ocorrência de OTA foi realizada em
50 amostras de vinho tinto de marcas variadas e diferentes lotes produzidos no estado
do Rio Grande do Sul. As determinações foram realizadas em triplicata, apresentando
concentrações detectáveis de OTA em 43 amostras, estando 28 amostras com
concentrações abaixo de 2 µg L-1, limite máximo tolerado (LMT) pela legislação
brasileira (ANVISA, 2017). Na Tabela 4 esta apresentada a média de OTA nas
amostras de vinho e também a faixa de ocorrência. Em 7 amostras de vinho OTA não
foi detectada mas em15 amostras de vinho as concentrações estavam acima do LMT,
estabelecido pela RDC n.° 7/2011 (ANVISA, 2017). Os dados de ocorrência de OTA
nas amostras de vinho tinto esta apresentado no Anexo 2.
40
Tabela 4- Dados de OTA em 50 amostras de vinho tinto, 31 do tipo seco e 19 do tipo suave, obtidos no estado do Rio Grande do Sul.
Vinho Tinto Seco Suave
Número de Amostras
50
31
19
Positivas (%)
43 (86%)
28 (93%)
15 (75%)
Não detectada (%) 7 (14%) 3 (10%) 4 (20%)
Acima do LMT* (%) 15 (30%) 9 (18%) 6(12%)
Média detectada (µg L-1
) 1,63
2,08
1,07
Mínimo (µg L-1
) 0,71 0,71 0,75
Máximo (µg L
-1)
4,65
4,65
2,78
Carbenet Sauvignon - 12 8
Merlot - 5 2
Pinot noir - 3 5
Malbec - 8 -
Acima do LMT*: Limite máximo tolerado 2 µg L-1
(ANVISA, 2017).
Os resultados obtidos estão de acordo com outros autores que relatam a
ocorrência de OTA em vinhos proveniente de países como Argentina, entre 0,02-
4,82 µg L-1 (PONSONE et al., 2010), Brasil 4,50 µg L-1 (WELKE et al., 2010), China
entre <0,1- 5,65 µg L-1 (ZHANG et al., 2013) e Itália entre <1- 3,86 µg L-1 (PIETRI
et al., 2010). Em outros estudos a faixa detectada foi menor, como nos vinhos
provenientes da África, entre 0,08 - 0,4 µg L-1 (REMIRO et al., 2013), Brasil entre
0,03-0,62 µg L-1 (TERRA et al., 2012), China entre 0,01- 0,98 µg L-1 (ZHONG et al.,
2014), Grécia entre 0,1 - 0,71 µg L-1 (SARIGIANNIS et al., 2014), Itália entre
0,35 - 2,34 µg L-1 (PRELLE et al., 2013), Portugal entre 1 - 1,23 µg L-1 (PENA et al.,
2011) e Tunísia entre 0,09 - 1,50 µg L-1 (LASRAM et al., 2013).
41
A ocorrência mundial de contaminação com ocratoxina A em vinhos tinto
está relacionada ao processo de vinificação, pois durante a maceração das uvas, a
micotoxina presente é transferida para o vinho aumentando a concentração de
OTA no produto final (WELKE et al., 2009). É necessário salientar que a ocorrência
da micotoxina além de causar alterações das propriedades sensoriais do vinho,
gera preocupação quanto à saúde dos consumidores (SERRATOSA et al., 2010).
O consumo de vinho no Brasil cresceu 15,8% no ano de 2018, ocupando a
17° posição no ranking do consumo mundial, sendo ingerido 330 milhões de litros
anualmente, equivalentes a 2 L per capita ( WURZ et al., 2019). Este fato deve ser
considerado relevante quando relacionado à ocorrência de OTA em vinhos.
A verificação do risco à saúde da população consumidora de vinho tinto foi
realizada de acordo com a estimativa quantitativa da ingestão da ocratoxina A
(Equação 5). (ZHONG et al.,2014), levando-se em consideração o consumo médio
per capita anual de 2 L de vinho na concentração média de OTA de 1,63 µg L-1, o
peso corpóreo médio no Brasil de 70 e 60 kg para homens e mulheres,
respectivamente (IBGE, 2008), resultando na estimativa da concentração de OTA
ingerida anualmente de 0,046 µg kg-1 para os homens e 0,054 µg kg-1 para as
mulheres. Considerando o consumo diário de uma taça de 200 mL de vinho
(PRADO et al., 2013), durante 7 dias o consumo seria de 0,032 µg kg-1 para os
homens e 0,038 µg kg-1 para as mulheres. Considerando a concentração máxima
encontrada de 4,65 µg de OTA por litro de vinho, teríamos o consumo de 0,093 µg
kg-1 para os homens e 0,108 µg kg-1 para as mulheres.
Estas concentrações são consideradas seguras em relação à exposição de
OTA definida pela Autoridade Européia para a Segurança Alimentar (EFSA, 2006)
e também pelo Comitê Especialista em Aditivos Alimentares das Nações
Unidas/Organização Mundial da Saúde (JECFA, 2001), que estabelecem à dose
semanal máxima tolerável de 0,120 µg kg-1 de peso corporal. No entanto, foi
estimado o risco consumo diário relativo somente ao vinho, sem considerar o
consumo em conjunto a outros alimentos como arroz (GOMES et al., 2015), cereais
(PINOTTI et al., 2016) e frutas (OUF et al., 2015) que são descritos pelos altos
níveis de contaminação por OTA. Este dado é importante para ser considerado na
dieta brasileira e assim estimar o risco de exposição à OTA a que brasileiros estão
submetidos.
42
De acordo com os dados obtidos na ocorrência de OTA em vinho tinto,
percebe-se que um elevado índice de amostras apresentou quantidades
detectáveis de micotoxina. O que torna importante o estudo do potencial toxigênico
de Aspergillus carbonarius na presença dos fungicidas, cresoxim-metílico e
famoxadona, utilizados no cultivo de uvas.
5.2 ESTUDO DO POTENCIAL TOXIGÊNICO EM PRESENÇA DOS FUNGICIDAS
5.2.1 Crescimento micelial e conteúdo de glicosamina
Os dados de crescimento micelial de Aspergillus carbonarius ao longo dos 7
dias de tratamento, para o grupo controle e os expostos aos fungicidas cresoxim-
metílico na concentração 1000 µg mL-1 e famoxadona na concentração de 600 µg
mL-1 são apresentados na Figura 7.
Figura 7- Dados do crescimento micelial durante 7 dias de tratamento, para o grupo controle e os expostos aos fungicidas cresoxim-metílico na concentração
1000 µg mL-1 e famoxadona na concentração de 600 µg mL -1.
As imagens do crescimento micelial referente ao último dia de tratamento
podem ser observadas na Figura 8. O grupo controle (A) sem o tratamento com
fungicida e os grupos tratados com os fungicidas cresoxim-metílico 1000 µg mL-1
(B) e famoxadona 600 µg mL-1 (C).
43
Figura 8- Crescimento micelial durante 7 dias de tratamento. (A) grupo controle, (B) grupo tratado com cresoxim-metílico 1000 µg mL-1, (C) grupo tratado com
famoxadona 600 µg mL-1.
Os grupos tratados com os fungicidas cresoxim-metílico (B) e famoxadona
(C) apresentaram uma redução de 70 e 60%, respectivamente, no crescimento
micelial. Os dados de percentual de inibição de crescimento estão relacionados ao
grupo controle sem a presença do fungicida (A). Após o 5° dia de incubação, não
houve diferença significativa na inibição do crescimento micelial em ambos os
grupos tratados com os fungicidas demonstrando a eficácia do fungicida (Figura 9).
Figura 9- Inibição do crescimento micelial nos tratamentos com os fungicidas durante 7 dias de tratamento em relação ao grupo controle.
Dados do gráfico obtido por ANOVA seguida de Tukey, Letras idênticas, representa ausência de diferença significativa.
44
Os fungicidas das classes das estrobilurinas e oxazolidinone são eficazes
para combater o crescimento micelial e são conhecidos como inibidores de
quinona, por possuírem grupos químicos que se ligam ao sítio específico na
mitocôndria, onde ocorre à respiração celular, esse local é chamado de sítio de
oxidação quinol (Qo). Essa ligação impede a transferência de elétrons entre o
citocromo B e o citocromo C, interrompendo a síntese de ATP e a produção de
energia. Uma ação rápida que interrompe o primeiro ciclo de vida dos fungos, no
estágio de esporos (BALBA et al., 2007). Essas classes de fungicidas são muito
utilizadas em todo o mundo para o controle de doenças em cereais, frutas e
vegetais (ABREU et al., 2006; LIKAS et al., 2007, KOSOLOVA et al., 2017).
Durante os 7 dias de incubação a diferença entre os grupos tratados e o
grupo controle pode ser enfatizada pela velocidade máxima de crescimento. O
grupo controle sem o tratamento com os fungicidas apresentou uma velocidade
máxima de crescimento de 1,68 µ (h-1), o grupo tratado com o fungicida cresoxim-
metílico apresentou uma menor taxa de crescimento, possuindo um período de
latência entre o terceiro e quarto dia de acompanhamento de formação do micélio,
apresentando uma velocidade máxima de crescimento de 0,19 µ (h-1). O grupo
tratado com o fungicida famoxadona, apresentou um maior crescimento
exponencial que o grupo tratado com cresoxim-metílico, embora mais lento do que
no grupo controle, apresentando a velocidade máxima de crescimento de
0,44 µ (h-1). Pela avaliação de velocidade máxima de crescimento, observa-se que
os grupos tratados com os fungicidas tiveram uma redução na velocidade de
crescimento. O grupo tratado com o fungicida cresoxim-metílico apresentou uma
menor velocidade de crescimento, apresentando ao final dos 7 dias de incubação
um halo fúngico em torno 2 cm. O grupo tratado com o fungicida famoxadona
apresentou uma velocidade de crescimento superior chegando ao final do período
de 7 dias de incubação com um halo em torno de 4 cm. Os resultados obtidos
comprovam a eficácia dos fungicidas em reduzir significativamente o crescimento
de Aspergillus carbonarius em relação ao grupo controle, sendo o fungicida
cresoxim-metílico o mais eficaz (Figura 9).
O crescimento micelial também foi acompanhado, pela determinação do
conteúdo de glicosamina (Tabela 5). A parede celular fúngica é composta
principalmente de quitina, um polímero linear e insolúvel que consiste em ligações
45
α-1,4-n-acetilglicosamina, portanto um bom indicador do desenvolvimento fúngico
(AIDOO et al., 1981; SCOTTI et al., 2001).
A medida do crescimento dos fungos pelo conteúdo de glicosamina foi,
neste caso, um indicador confiável de crescimento, pois está diretamente
relacionado com os dados de crescimento micelial em todos os grupos. O grupo
controle apresentou um significativo crescimento ao longo dos 7 dias de incubação,
principalmente no quarto e sétimo dia, também apresentando os maiores
conteúdos de glicosamina. O grupo tratado com cresoxim- metílico que apresentou
uma taxa de crescimento mais lenta durante os 7 dias de incubação também
apresentou uma menor concentração de glicosamina. O grupo tratado com
famoxadona obteve uma maior taxa de crescimento e também um maior conteúdo
de glicosamina.
Tabela 5- Crescimento do halo (cm) e conteúdo de glicosamina no grupo controle sem a presença de fungicida e nos grupos de tratados com os fungicidas
cresoxim-metílico e famoxadona.
Tempo
(dias)
Controle Cresoxim-metílico Famoxadona
Halo
(cm-1
)
Glicosamina
(mg g-1
)
Halo
(cm-1
)
Glicosamina
(mg g-1
)
Halo
(cm-1
)
Glicosamina
(mg g-1
)
1 1,00a
1,2 a
1,00a
1,2 a
1,00a
1,2 a
2 1,40ab
3,2 b
1,36ab
2,7 b
1,70bc
3,1 b
3 3,03f
7,8fg
2,00bcd
5,2 c
2,03bcd
5,2 c
4 4,10h
8,4g
2,00bcd
5,3 cd
2,63def
5,3 cd
5 7,03i
15,4h
2,00bcd
5,3 cd
2,76ef
5,9d
6 8,20j
19,6 i
2,13cde
5,5 cd
3,23fg
6,8e
7 9,46k
23,8 j
2,26cde
5,7 d
3,86gh
7,6f
Valores médios de ensaios realizados em triplicata ± desvio padrão. Letras iguais indicam que não há diferenças estatisticamente significativas (p> 0,05).
Na Figura 10 observa-se a relação direta entre o crescimento micelial e o
conteúdo de glicosamina. Os resultados encontrados estão de acordo com
PAGNUSSATT et al., (2013) que também constataram que a medida de
crescimento pelo conteúdo de glicosamina em Fusarium graminearum também foi
um bom indicativo de crescimento fúngico.
46
5.2.2 Produção de OTA pelo fungo Aspergillus carbonarius
Aspergillus carbonarius tem seu destaque por ser um dos mais importantes
patógenos encontrados em uvas (LAPPA et al., 2017). Sua produção de micotoxina
foi quantificada pela determinação de OTA do meio de cultura dos grupos tratados
e do grupo controle. Os cromatogramas gerados, em HPLC-FL, estão
apresentados nas Figuras 11, 12 e 13.
Altas concentrações de OTA (Tabela 6) foram produzidas pelo fungo
Aspergillus carbonarius, evidenciando que os fungicidas utilizados foram eficazes
em inibir o crescimento, mas também elevaram o potencial toxigênico dos fungos
resistentes.
Figura 10- Crescimento micelial (cm) e o conteúdo de glicosamina (mg g-1) no grupo controle sem fungicida (A), e nos grupos de tratamento cresoxim-metílico
(1000 µg mL- 1) (B) e famoxadona (600 µg mL-1) (C).
47
Figura 11- Cromatograma obtido em HPLC-FL de OTA produzida no meio BDA no grupo controle.
Figura 12- Cromatograma obtido em HPLC-FL de OTA produzida no meio BDA no grupo tratado com famoxadona.
Figura 13- Cromatograma obtido em HPLC-FL de OTA produzida no meio BDA no grupo tratado com cresoxim-metílico.
Os grupos tratados com os fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona
tiveram um menor crescimento micelial. No entanto, possivelmente devido ao
estresse químico causado na presença dos fungicidas, houve um aumento
significativo da produção de micotoxina. O grupo controle no último dia de
incubação produziu 199,3 ng g-1 de OTA, estando de acordo com estudos descritos
na literatura, os quais evidenciam a produção de OTA por Aspergillus carbonarius
(Tabela 6) (CHEONG et al., 2017; ZHANG et al., 2017; TRYFINOPOULOU et al.,
2019; KAPETANAKOU et al., 2018).
Quando comparado com o grupo controle, os fungos tratados com
famoxadona produziram o dobro de concentração de OTA, mas com um
48
crescimento fúngico 40% menor, enquanto para os fungos tratados com cresoxim-
metílico a concentração de OTA foi semelhante ao grupo controle e o crescimento
fúngico foi 30% menor.
Tabela 6- Produção de Ocratoxina A pelo fungo Aspergillus carbonarius no grupo controle sem a presença de fungicida e nos grupos de tratamento com os
fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona.
Tempo
(dias)
Controle Cresoxim-metílico Famoxadona
Halo
(cm-1
)
OTA
(ng g-1
)
Halo
(cm-1
)
OTA
(ng g-1
)
Halo
(cm-1
)
OTA
(ng g-1
)
1 1,00a
0a
1,00a
0a
1,00a
0a
2 1,40ab
11,95abc
1,36ab
2,47ab
1,70bc
2,98ab
3 3,03f
31,25bcd
2,00bcd
4,29ab
2,03bcd
37,69cd
4 4,10h
55,75de
2,00bcd
94,3fg
2,63def
128,4hi
5 7,03i
70,3ef
2,00bcd
120,5gh
2,76ef
141,3hi
6 8,20j
133,6hi
2,13cde
135,0hi
3,23fg
206,7j
7 9,46k
199,3j
2,26cde
151,3i
3,86gh
408,3k
Letras idênticas significam ausência de diferenças estatísticas (p> 0,05)
O potencial toxigênico do fungo Aspergillus carbonarius foi determinado de
acordo com a relação entre a produção de OTA e o tamanho do halo fúngico
(Figura 14). Com base na relação, observa-se que no quinto dia de tratamento com
cresoxim-metílico o potencial toxigênico do fungo foi maior do que o potencial
toxigênico quando tratado com famoxadona, não apresentando diferença
significativa no segundo, quarto e sexto dia de tratamento.
Figura 14- Crescimento do halo fúngico, produção de Ocratoxina A pelo fungo Aspergillus carbonarius e relação entre produção de OTA e crescimento fúngico no
grupo controle sem fungicida (A), e nos grupos de tratamento cresoxim-metílico (1000 µg mL- 1) (B) e famoxadona (600 µg mL-1) (C).
49
Para uma melhor compreensão da eficácia dos fungicidas e o seu potencial
toxigênico sobre o fungo Aspergillus carbonarius, torna-se necessária a análise do
índice de inibição da produção de micotoxinas (IMM), do índice de inibição do
crescimento micelial (IMG) e o índice de inibição específico da produção de
micotoxina (IMM esp/fung). O índice de inibição específico da produção de
micotoxina é a estimativa da inibição por grama de fungicida utilizado durante os
tratamentos. Os dados de inibição estão na Tabela 7.
Tabela 7- Inibição da produção de micotoxinas (IMM), de inibição do crescimento micelial (IMG) e de inibição específica da produção de micotoxinas por grama de
fungicida na placa de cultura (IMM Esp. / Fungicida).
Tempo (dias)
IMM IMG IMM
esp. fung.
Cresoxim-
metílico* Famoxadona**
Cresoxim-
metílico* Famoxadona**
Cresoxim-
metílico* Famoxadona**
1 0h
0h 0
h 0
h 0
h 0
h
2 0,78l
0,74k
0,02c
-0,21a
2,6E-0,2k
4,1E-0,2m
3 0,87m
-0,16g
0,34d
0,33d
2,9E-0,2l
-8,7E-0,3g
4 -0,6d
-1,27a
0,51f
0,36e
-2,0E-0,2e
-7,1E-0,2a
5 -0,58e
-0,81c
0,72i
0,61h
-1,9E-0,2f
-4,5E-0,2c
6 0,05i
-0,45f
0,74j
0,61h
1,7E-0,3i
-2,5E-0,2d
7 0,27j
-.0,96b
0,76k
0,59g
9,03E-0,3j
-5,3E-0,2b
* 1000 µg mL-1
, ** 600 µg mL-1
O emprego da concentração de fungicida recomendada pelos fabricantes
mostrou que o fungicida cresoxim-metílico foi o mais efetivo na inibição do
crescimento micelial, apresentando também uma menor produção de micotoxina
quando comparado ao fungicida famoxadona. Cresoxim-metílico inibiu até 76% o
crescimento micelial, principalmente entre os dias 5 e 7 de tratamento e o
famoxadona inibiu 61%.
A partir do terceiro dia de incubação pode-se observar que o grupo tratado
com famoxadona apresentou maior produção de micotoxina em relação ao grupo
controle. O fungicida cresoxim-metílico inibiu a produção de micotoxina até o
terceiro dia de incubação e apresentou no sétimo dia cerca de 76% de IMG e 27%
de IMM em relação ao grupo controle e 41% e 62% da produção, respectivamente,
quando comparado ao grupo tratado com famoxadona. Em relação à inibição
50
específica, o fungicida famoxadona apresentou eficiência apenas no segundo dia
de tratamento e o fungicida cresoxim-metílico apresentou uma melhor eficiência na
inibição específica por todo período de ensaio, observado na Tabela 7.
Fato semelhante foi descrito por Elnner (2005) para fungicidas pertencentes
à classe das estrobilurinas, os quais potencializaram a produção de micotoxina por
fungos do gênero Fusarium, demonstrando que a presença do fungicida aumentou
o potencial toxigênico do fungo. Feska et al., (2019) também relataram que o uso
de fungicidas contendo estrobilurinas foi eficiente na redução da contaminação
fúngica por Fusarium em grãos, mas o uso destes fungicidas causaram aumento
na produção da micotoxina desoxinivalenol. Andrieu et al., (2001) verificaram a
potente eficácia de famoxadona na inibição do crescimento de esporos de
Plasmopara vitícola e Phytophthora infestans, usando concentrações abaixo de
1 mg L-1. A inibição do crescimento fúngico acompanhado pelo aumento da síntese
de metabólitos secundários pelas cepas resistentes também é observada em
outras classes de fungicida (SCHMIDT et al., 2008). Corio-Costet (2011) também
relata que inicialmente a utilização de fungicidas do grupo QoI foram bem
sucedidos contra Plasmopara viticola, uma das doenças economicamente mais
importantes no cultivo de uvas em todo o mundo, mas estudos contraditórios
comprovam que vem ocorrendo uma diminuição significativa na eficácia
antifúngica, devido ao aparecimento de cepas resistentes.
A utilização de fungicidas embora possa ser eficaz na prevenção do
crescimento de fungos, pode não apresentar a mesma eficiência na prevenção da
produção de micotoxina. Outro fato importante é que o uso de fungicidas na
agricultura pode levar ao surgimento de resistência fúngica entre espécies
toxigênica, além disso, estes isolados resistentes são capazes de permanecer no
ambiente na ausência do fungicida (CORIO-COSTET et al., 2012).
É importante ressaltar a eficiência antifúngica de alguns compostos
químicos, obtidos de fontes naturais, entre eles: compostos fenólicos, óleos
essenciais e peptídeos (HEIDTAMANN-BEMVENUTI et al., 2012, PAGNUSSAT et
al., 2012). A taxa de crescimento fúngico de 12 cepas toxigênicas de Fusarium
graminearum, foi reduzida com a utilização de compostos fenólicos obtidos da
Spirulina (PAGNUSSAT et al., 2013). No estudo de Gabaston et al., (2017), a
51
utilização de estilbenos, uma classe de compostos polifenólicos, demonstraram
potencial como fungicida natural contra o míldio P. vitícola.
O uso de óleos essenciais vegetais também atraiu a atenção dos
pesquisadores Wang et al., (2018), os quais investigaram as ações antifúngicas de
11 óleos essenciais contra três tipos de fungos toxigênicos: Aspergillus flavus,
Penicillium viridicatum e Aspergillus carbonarius. Eles identificaram que 4 dos 11
óleos essenciais analisados apresentaram capacidade antifúngica, promovendo
forte inibição do crescimento fúngico, os quais foram medidos pelo diâmetro das
colônias formadas.
A utilização de produtos naturais com ação antifúngica é uma boa alternativa
na tentativa de reduzir o uso de fungicidas químicos na agricultura. Além disto, a
utilização de fungicidas não tem sido totalmente eficaz na proteção das plantações,
principalmente quando relacionado ao desenvolvimento da resistência fúngica.
Sendo assim, o uso desses compostos naturais poderia ser uma maneira
eficaz e segura de proteger as culturas contra fungos toxigênicos, pois além dos
fungicidas não estarem sendo completamente eficaz no combate ao crescimento
fúngico, a sua utilização acentua a produção de micotoxinas pelas espécies
toxigênicas resistentes.
5.3 EFEITO DA MICOTOXINA OTA E DOS FUNGICIDAS CRESOXIM METÍLICO
E FAMOXADONA NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
5.3.1 Alterações bioquímicas: produção de biomassa, atividade enzimática da
peroxidase, produção de glutationa e concentração de OTA
A concentração celular foi monitorada diariamente durante 96 h de
fermentação (Tabela 8), apresentando crescimento exponencial em todos os
cultivos até 48 h. O mesmo comportamento foi relatado por Li et al., (2018) durante
a fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae exposta a concentrações
de 100 µg L-1 a 1000 µg L-1 da micotoxina patulina.
A partir de 72 h de fermentação no grupo controle e nos grupos expostos
apenas aos fungicidas foi observado à fase de declínio do desenvolvimento da
levedura, apresentando uma concentração celular em torno de 16% menor.
52
Enquanto nos grupos expostos a micotoxina nas concentrações de 2 µg L-1 e
4 µg L-1 e nos grupos coexpostos aos fungicidas e micotoxinas a partir da 72h de
fermentação foi observado a manutenção da fase estacionária do desenvolvimento
da levedura, apresentando uma menor concentração celular.
Tabela 8- Concentração celular (mg mL-1) de cultivos realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de OTA e dos
fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona e no controle sem contaminantes.
Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1
: S.c. em MCS + OTA 2 µg L
-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L
-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico
(0,75 mg L-1
); CM + OTA 2 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1
) + OTA 2µg L-1
, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L
-1) + OTA 4 µg L
-1, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1), F+
OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L-1
) + OTA 2 µg L-1
, F+ OTA 4 µg L-1
: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1) + OTA 4 µg L
-1.Todos os experimentos apresentaram coeficiente de variação menor
que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).
OTA nas concentrações de 2 e 4 µg L-1 reduziu em torno de 45% o
crescimento celular. Resultado semelhante foi encontrado no estudo de Abolmaali
et al., (2008), quando a levedura Saccharomyces cerevisiae em presença da
micotoxina deoxinivalenol na concentração de 5 µg mL-1, apresentou uma redução
de 50% em seu crescimento, quando comparado ao grupo controle. A inibição do
crescimento celular em presença da micotoxina ocorre pelo elevado gasto
energético na ativação das rotas metabólicas de detoxificação reduzindo a sua taxa
de crescimento (FRANCESCA et al., 2010).
Entre as rotas metabólicas de detoxificação destaca-se a atividade
enzimática da peroxidase (PO) e a produção de glutationa (GSH) que estão
relacionadas a processos redox. A redução de OTA do meio foi calculada pelas
Equações 11 e 12, respectivamente (Tabela 9).
Tempo
(h) Controle
OTA
2 µg
OTA
4 µg CM
CM +
OTA
2 µg
CM +
OTA
4 µg
F
F+
OTA
2 µg
F+
OTA
4 µg
0 0,30a
0,29a
0,28a
0,27a
0,26a
0,28a
0,25a
0,26a
0,28a
Conc. 24 2,16b
1,07b
1,12b
1,79b
1,81b
2,13b
1,45b
1,93b
1,95c
Celular 48 5,84d
2,82c
2,81c
5,28d
3,10d
3,12d
5,41d
3,28d
2,75d
(mg mL-1) 72 5,75
d 2,24
d 2,29
d 4,65
d 2,50
c 2,79
c 4,16
d 2,53
c 1,40
b
96 4,83c
2,18d
2,16d
3,95c
2,44c
2,69c
3,48c
2,47c
1,34b
53
Tabela 9- Relação entre a concentração de ocratoxina A (OTA) e a produção de glutationa (GSH) e a atividade da enzima peroxidase (PO) nos cultivos realizados com
Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de OTA e dos fungicidas cresoxim-metílico e famoxadona.
Cultivo Tempo
(h)
OTA
(µg L-1
)
OTA
(%)
GSH
(mg mL-1
)
Relação*
(OTA/GSH)
PO
(U mL-1
)
Relação**
(OTA/PO)
0 1,97a 100 0,11
a 19 0,004
a 510
24 0,78b 40 0,40
b 2,0 0,044
b 18
OTA 48 0,45c 23 0,50
b 0,9 0,048
b 9,5
(2 µg L-1
) 72 1,03d 52 0,76
c 1,4 0,009
a 115
96 1,06d 54 1,10
d 1,0 0,022
c 48
0 3,97a
100 0,13a
30 0,005a
817
OTA 24 2,82b
71 0,43b
6,6 0,052b
55
(4 µg L-1
) 48 1,43e
36 0,75c
1,9 0,080c
18
72 2,22d
56 0,86d
2,6 0,055b
41
96 2,51e
63 1,17e
2,1 0,017a
153
0 1,97a
100 0,12a
17 0,008ab
253
CM 24 1,34b
68 0,29b
4,7 0,068c
19
+ 48 1,22b
62 0,57c
2,2 0,018b
67
(2 µg L-1
) 72 1,06c
54 0,64d
1,5 0,006a
186
96 0,85d
43 1,11e
0,8 0,011ab
76
0 3,95a
100 0,10b
40 0,005a
753
CM 24 2,82b
71 0,54a
5,3 0,068c
37
+ 48 2,60d
66 0,58a
4,5 0,015a
181
(4 µg L-1
) 72 2,52d
64 0,71a
3,6 0,008a
307
96 1,57c
40 1,21c
1,3 0,033b
47
0 1,98a 100 0,15
b 13 0,008
a 241
F 24 1,50d
76 0,44a
3,4 0,087c
17
+ 48 1,39d
70 0,43a
3,1 0,018a
76
(2 µg L-1
) 72 1,23b
62 0,71c
1,7 0,097a
127
96 0,67c
34 1,47d
0,4 0,035b
19
0 3,96a
100 0,15b
26 0,007a
564
F 24 2,77b
70 0,41a
6,7 0,085d
32
+ 48 2,52c
64 0,46a
5,5 0,037c
68
(4 µg L-1
) 72 2,16d
55 0,73c
2,9 0,011a
187
96 1,75e
44 1,30d
1,4 0,023b
80
Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1: S.c. em MCS + OTA
2 µg L-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L
-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L
-1); CM + OTA 2 µg: S.c.
em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1) + OTA 2µg L
-1, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L
-1) +
OTA 4 µg L-1, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1), F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1) + OTA 2 µg L
-1,
F+ OTA 4 µg L-1 : S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1) + OTA 4 µg L
-1.Todos os experimentos apresentaram coeficiente de
variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).
54
A elevação da atividade enzimática da PO e o aumento da produção de
GSH, no intervalo de 48 h de fermentação nos cultivos expostos a OTA nas
concentrações 2 µg L-1 e 4 µg L-1, estão relacionadas a redução na concentração
da micotoxina observado em 77% e 64%, respectivamente.
Os cultivos co-expostos a micotoxina e fungicidas apresentaram
comportamentos diferentes. A concentração de OTA foi diminuindo ao longo das
96h de fermentação. Os cultivos expostos à OTA e ao cresoxim-metílico
apresentaram no tempo de 24 h uma redução em torno de 30% de OTA,
finalizando em 96h de fermentação com uma redução de 60%. Os cultivos
expostos à OTA e co-expostos a famoxadona, apresentaram em torno de 30% de
redução de OTA no tempo de 24 h e no tempo de 96 h de fermentação
apresentaram 66% de redução na concentração de 2 µg L-1 e 56% de redução na
concentração de 4 µg L-1. As reduções estão diretamente relacionadas à atividade
enzimática da PO no tempo de 24 h e a produção de GSH a partir deste tempo de
cultivo, apresentando maior concentração no tempo de 96 h de fermentação.
A presença dos contaminantes no cultivo, a partir das 24 h de fermentação,
a levedura ativa as rotas metabólicas para reduzir a toxicidade no meio de cultura,
preservando a célula durante o processo fermentativo (GARDA-BUFFON;
BADIALE-FURLONG, 2010). A redução na concentração de micotoxina nos
cultivos expostos a OTA, pode estar relacionado a capacidade adsortiva da
levedura Saccharomyces cerevisiae (MECA; BLAIOTTA; RITIENE, 2010). Este
processo de adsorção na parede da levedura está relacionado à presença de
manoproteínas com a capacidade de se ligar a micotoxina (COSTA et al., 2012). A
capacidade de adsorção também esta ligada a dessorção, fenômeno que pode
estar vinculado aos cultivos com a adição somente de OTA, que após 48 h
apresentaram o aumento da concentração da micotoxina (SHETTY et al., 2007).
Para verificar possíveis interferências entre a micotoxina e o meio de cultura
sintético foi realizada a quantificação de OTA ao longo das 96 h em meio de cultura
sintético, sem a adição do inóculo. Não apresentando variação na concentração de
OTA ao longo das 96 h de cultivo em nenhum dos tratamentos realizados, sem a
adição da levedura. Evidenciando que a redução na concentração de OTA
apresentada na Tabela 2 deve-se ao aumento da atividade da enzima oxidativa PO
55
e também aumento da produção de GSH, além da capacidade adsortiva da
levedura.
Os resultados observados nesse estudo estão de acordo com os descritos
por Garda-Buffon et al., (2011), que mostrou que a atividade de enzimas
oxidoredutases estão relacionadas com a velocidade de degradação de DON no
meio de cultivo contaminado com 50 µg.mL-1 da micotoxina, observando em 48 h
de fermentação a maior velocidade de degradação relacionada com a maior
atividade da enzima peroxidase (PO). A redução nos níveis de micotoxina pela
atividade da PO foi descrita por Saião Nora et al., (2019), onde a utilização desta
enzima está relacionada a redução de 17% nos níveis de OTA em suco de uva. A
redução de 70% nos níveis de zearalenona foi relatado por Garcia et al., (2019),
com o uso de PO comercial em solução modelo. Feltrin et al., (2017), também
relatam que a enzima PO na sua forma pura obtida do farelo de soja, reduziu 80%
a concentração de DON.
Neste estudo a atividade enzimática da peroxidase e a produção de
glutationa foram elevadas em 48 h e 72 h de fermentação, respectivamente, para
os cultivos contaminados com os fungicidas (Tabela 10). Resultado da ativação das
rotas metabólicas da levedura relacionado à presença dos contaminantes no meio
de cultura. A produção de glutationa variou de 0,10 a 0,72 mg mL-1 no controle e de
0,12 a 1,22 mg mL-1 para os cultivos com os fungicidas, apresentando um pico em
72 h de fermentação em todos os cultivos.
A diferença entre o cultivo controle e os demais, pode ter sido promovida
pelo estresse ocasionado pela presença dos contaminantes, gerando aumento no
consumo de energia das leveduras, levando a mudanças no metabolismo e o
aumento da geração de moléculas protetoras, como a glutationa (DONG et al.,
2007). A presença de contaminantes resulta na geração de espécies reativas de
oxigênio (ROS), convertendo a glutationa reduzida (GSH), que é a molécula
protetora antioxidante mais abundante no meio intracelular, a glutationa oxidada
(GSSG), reduzindo a toxicidade do meio (LOIZZO et al., 2011).
56
Tabela 10- Valores da produção de glutationa (GSH) e a atividade da enzima peroxidase (PO) nos cultivos realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio
de cultura sintético na presença de cresoxim-metílico e famoxadona e controle sem contaminantes.
Cultivo Tempo
(h)
GSH
(mg mL-1
)
PO
(U mL-1
)
0 0,10a 0,002
a
24 0,12b 0,030
c
Controle 48 0,30d 0,010
b
72 0,72e 0,001
d
96 0,23c 0,001
d
0 0,12c 0,006
a
Cresoxim- metílico 24 0,50a 0,175
c
48 1,03b 0,041
b
72 1,11b 0,010
a
96 0,52a 0,009
a
0 0,12a 0,008
a
Famoxadona 24 0,47b 0,113
b
48 1,60d 0,021
a
72 1,22c 0,010
a
96 0,59b 0,011
a
Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS), sem contaminantes. Cresoxim- metílico: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L
-1), Famoxadona:
S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L-1
). Todos os experimentos apresentaram coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre
os dias (p < 0,05).
5.3.2 Alterações tecnológicas: acidez, etanol, açúcar redutor, proteínas e MEV
Todos os cultivos apresentaram até 48 h de fermentação uma redução em
torno de 5% no valor de pH (Tabela 11). A acidez é uma das características mais
importantes em escala industrial, devido ao controle a contaminação bacteriana e
por influenciar na qualidade da fermentação, interferindo diretamente na formação
de subprodutos, alterando a cor e o sabor do vinho (RIZZON et al., 2010;
MORALES et al., 2013; RYU et al., 2018). Embora seja uma das características
mais importantes, a legislação não estabelece faixa ideal para valores de pH, em
qualquer tipo de vinho, mas de acordo com registros na literatura durante a
fermentação alcoólica os valores de pH devem permanecer abaixo de 3,6 para
evitar o início da fermentação malolática (BAMFORTH, 2007; RIZZON et al., 2010).
57
Tabela 11- Monitoramento do pH no meio de cultivo na presença de OTA e dos fungicidas cresoxim-metílico e famoxadone e controle sem contaminantes, ao longo
de 96 h de fermentação alcoólica submersa pela levedura Saccharomyces cerevisiae.
Tempo
(h)
Cont. OTA
2µg
OTA
4µg CM
CM +
OTA
2µg
CM +
OTA
4µg
F
F+
OTA
2µg
F+
OTA
4µg
0 3,63a 3,54
a 3,56
a 3,64
a 3,50
a 3,53
a 3,61
a 3,50
a 3,52
a
24 3,50c 3,30
b 3,31
b 3,43
b 3,41
c 3,44
c 3,40
c 3,43
c 3,40
c
48 3,55b 3,28
b 3,28
b 3,41
b 3,36
b 3,35
b 3,33
b 3,37
b 3,36
b
72 3,56b 3,29
b 3,29
b 3,41
b 3,37
b 3,37
b 3,42
c 3,37
b 3,34
b
96 3,65a 3,30
b 3,31
b 3,43
b 3,40
c 3,42
c 3,43
c 3,41
c 3,40
c
Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1
: S.c. em MCS + OTA 2 µg L
-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L
-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L
-1); CM + OTA 2 µg: S.c. em MCS
+ cresoxim-metilico (0,75 mg L-1
) + OTA 2µg L-1
, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1
) + OTA 4 µg L-1
, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1), F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1) + OTA 2 µg L
-1, F+ OTA 4 µg L
-1 :
S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L-1
) + OTA 4 µg L-1
.Todos os experimentos apresentaram coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).
O período da redução do pH coincide com o período de aumento da
biomassa, o que esta relacionado à manutenção das rotas metabólicas envolvidas
na geração energética das células da levedura e também na produção de ácidos
orgânicos como ácido cítrico, acético e pirúvico, gerados durante o processo de
fermentação alcoólica (LUO et al., 2016). O crescimento celular está relacionado ao
consumo de substrato (Tabela 12).
Tabela 12- Concentração de açúcar redutor (mg mL-1) de cultivos realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de cresoxim-
metílico, famoxadona, OTA e controle sem contaminantes.
Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1: S.c. em MCS +
OTA 2 µg L-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L
-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L
-1); CM + OTA
2 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1) + OTA 2µg L
-1, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico
(0,75 mg L-1) + OTA 4 µg L
-1, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1), F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg
L-1) + OTA 2 µg L
-1, F+ OTA 4 µg L
-1 : S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1) + OTA 4 µg L
-1.Todos os experimentos
apresentaram coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).
Tempo
(h) Controle
OTA
2 µg
OTA
4 µg CM
CM +
OTA
2 µg
CM +
OTA
4 µg
F
F+
OTA
2 µg
F+
OTA
4 µg
Conc.
açúcar
redutor
(mg mL-1
)
0 195,0c
193,8d
197,8d
195,7d
194,2d 197,4
d 199,0
d 194,4
d 197,9
d
24 110,2b
128,9c
124,7c
129,9c
99,6c
81,8c
89,7c
94,9c
134,8c
48 5,41a
50,4b
33,2b
4,43b
42,7b
36,6b
3,94b
46,9b
35,9b
72 1,24a
1,81a
1,34a
2,29a
0,93a
0,57a
2,37a
0,58a
0,83a
96 1,18a
1,28a
1,22a
2,12a
0,72a
0,53a
2,17a
0,53a
0,77a
58
Em 48 h de fermentação houve o consumo 95% dos açucares redutores
no cultivo controle e nos cultivos com cresoxim-metílico e famoxadona. Enquanto
os cultivos com a adição da micotoxina em ambas as concentrações e nos cultivos
coexpostos aos fungicidas e micotoxinas foi observado o menor consumo, 75% do
substrato.
O menor consumo do substrato está relacionado à velocidade de
crescimento celular da levedura (Tabela 13), onde no cultivo controle e nos cultivos
com cresoxim-metílico e famoxadona apresentaram as maiores velocidades de
crescimento em relação aos demais.
Tabela 13- Velocidade específica máxima de crescimento (µ max) dos cultivos realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na
presença de OTA e dos fungicidas cresoxim-metílico, famoxadona e controle sem contaminantes.
Cultivo µ max (h-1
) Intervalo da fase
exponencial (h)
Redução do µ max
(%)
Controle 2,70 0-48
OTA 2 µg L-1
1,31 0-48 51
OTA 4 µg L-1
1,30 0-48 52
CM 2,50 0-48 7
CM+ OTA 2 µg L-1
1,42 0-48 47
CM + OTA 4 µg L-1
1,47 0-48 46
F 2,18 0-48 19
F + OTA 2 µg L-1
1,51 0-48 44
F + OTA 4 µg L-1
1,23 0-48 54
Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1: S.c. em MCS + OTA
2 µg L-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L
-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L
-1); CM + OTA 2 µg: S.c.
em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1) + OTA 2µg L
-1, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L
-1) +
OTA 4 µg L-1, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1), F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1) + OTA 2 µg L
-1,
F+ OTA 4 µg L-1 : S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1) + OTA 4 µg L
-1.Todos os experimentos apresentaram coeficiente de
variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).
Estudos relatam que a exaustão de nutrientes pode elevar a síntese
proteica, em virtude da ação protetora contra o estresse oxidativo gerado
(FRANCESCA et al., 2010). Neste estudo a elevação da síntese protéica (Tabela
14) ocorreu concomitante a atividade enzimática da peroxidase, apresentando 20%
de aumento para os grupos expostos a OTA em ambas as concentrações 133%
para cresoxim-metílico e OTA, em ambas as concentrações, 35% para famoxadona
e OTA, em ambas as concentrações, 148% para cresoxim-metílico e 184% para
59
famoxadona. A elevação da síntese protéica também ocorreu concomitante ao
aumento da produção de glutationa, apresentando 16% de aumento para os grupos
expostos a OTA, em ambas as concentrações, e para cresoxim-metílico e
famoxadona coexpostos a OTA, em ambas as concentrações, no tempo de 96 h de
fermentação.
Tabela 14- Concentração protéica (mg mL-1) nos cultivos realizados com Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de OTA e dos
fungicidas cresoxim-metílico, famoxadona e controle sem contaminantes. Temp
o
(h)
Controle OTA
2 µg
OTA
4 µg CM
CM +
OTA
2 µg
CM +
OTA
4 µg
F
F+
OTA
2 µg
F+
OTA
4 µg
0 3,03c
3,37b
3,15a
3,65a
3,34c
3,24c
3,43a
3,57a
3,49a
24 6,59d
8,28a
8,52d
9,08d
7,86a
7,58a
9,75e
4,62b
4,65b
48 5,21b
10,34d
10,62e
6,64c
2,28b
2,12b
7,50d
3,28a
3,22a
72 4,41ab
6,41c
6,61b
5,18b
5,80d
5,62d
6,71c
6,44c
6,02c
96 3,87a
7,47a
7,37c
4,29a
7,25a
7,18a
5,33b
7,49d
7,27d
Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1
: S.c. em MCS + OTA 2 µg L-1
. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L
-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L
-1); CM + OTA 2 µg: S.c. em MCS + cresoxim-
metilico (0,75 mg L-1
) + OTA 2µg L-1
, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1
) + OTA 4 µg L-1
, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1), F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1) + OTA 2 µg L
-1, F+ OTA 4 µg L
-1 : S.c. em MCS +
famoxadona (3 mg L-1
) + OTA 4 µg L-1
.Todos os experimentos apresentaram coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).
A elevação da síntese protéica frente à toxicidade do meio de cultivo
também está relacionada à detoxificação dos fungicidas e da micotoxina presentes
no meio de cultivo (BADIALE-FURLONG et al., 2008; PHAM et al., 2008; GARDA-
BUFFON, BADIALE-FURLONG, 2010).
A presença de OTA e dos fungicidas no meio de cultura afetou a produção
de etanol % (v v-1) pela levedura Saccharomyces cerevisiae (Tabela 15) O grupo
controle apresentou em 72 h de fermentação a sua maior produção de etanol,
enquanto que todos os grupos expostos a micotoxina apresentaram a maior
produção de etanol no tempo de 96 h de fermentação e os grupos expostos
somente ao fungicida no tempo de 48 h de fermentação.
O aumento da concentração de etanol está relacionado com a elevação da
produção de glutationa (Tabela 9 e 10). Durante o processo de fermentação a
produção de glutationa pode ser dividida em três etapas. Na primeira etapa os
níveis de glicose diminuem e a produção de etanol e glutationa aumentam. Na
segunda etapa o etanol é consumido como fonte de carbono para o crescimento
celular e para a síntese de glutationa, evidenciado na Tabela 16, os valores de
60
conversão de etanol em glutationa apresentando os maiores valores nos cultivos
expostos a micotoxina. E na terceira etapa a glicose e o etanol são consumidos e
as células param de crescer (WEN, ZHANG e TAN, 2006).
Tabela 15- Produção de etanol (%) obtido durante o cultivo submerso com a Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de OTA e dos
fungicidas cresoxim-metílico, famoxadona e controle sem contaminantes.
Tempo
(h) Controle
OTA
2 µg
OTA
4 µg CM
CM +
OTA
2 µg
CM +
OTA
4 µg
F
F+
OTA
2 µg
F+
OTA
4 µg
0 0a
0a
0a
0a
0a
0a
0a
0a
0a
24 4,3b
4,8b
5,6b
4,9b
3,7b
3,8b
4,6b
4,5b
4,8b
48 12,1d
10,9c
10,8c
12,2e
7,5d
7,6d
12,9d
10,7d
7,1d
72 13,2c
11,8d
11,2d
11,6d
7,0d
7,6d
11,6d
11,0d
9,5d
96 12,4d
12,1d
11,9e
9,2c
10,8c
10,7c
8,9c
12,3c
12,2c
Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L-1
: S.c. em MCS + OTA 2 µg L
-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L
-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-
metilico (0,75 mg L-1
); CM + OTA 2 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1
) + OTA 2µg L-1
, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L
-1) + OTA 4 µg L
-1, F: S.c. em MCS +
famoxadona (3 mg L-1
), F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L-1
) + OTA 2 µg L-1
, F+ OTA 4 µg L
-1 : S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1) + OTA 4 µg L
-1.Todos os experimentos apresentaram
coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).
A GSH é um tipo de defesa não enzimática que desempenha importante
papel no metabolismo atuando como um agente redutor para que a enzima
glutationa peroxidase (GPx) catálise as espécies reativas de oxigênio (ROS)
geradas na presença de contaminantes (BRIGELIUS-FLOHÉ e MAIORINO, 2013).
Quando a levedura se encontra em sua fase exponencial, ocorre o consumo da
glicose como substrato energético, produzindo etanol, o que desencadeia a
ativação das rotas metabólicas com a produção de GSH como molécula protetora
(LOIZZO et al.,2011). Na fase estacionária, devido à escassez de substrato
energético, o etanol gerado é utilizado como fonte de carbono para a manutenção
celular e produção de GSH. Durante a fermentação quando os níveis de etanol
estavam elevados e a concentração de glicose estava baixa, não houve redução
significativa do crescimento celular, demonstrando a utilização do etanol como
fonte energética. O etanol em elevadas concentrações causa mudanças
morfológicas na levedura e também impede seu crescimento, portanto o consumo
61
do etanol como fonte de carbono é também uma forma de defesa (WEN, ZHANG e
TAN, 2006; DONG et al., 2007).
Para avaliar os parâmetros estudados, a Tabela 16 apresenta os fatores de
conversão de substrato em produto (Y P/S), substrato em biomassa (Y X/S), e
biomassa em produto (Y P/X), obtidos durante o cultivo e calculados de acordo com
as Equações 13, 14 e 15.
Tabela 16- Fatores de conversão obtidos durante o cultivo de Saccharomyces cerevisiae em meio de cultura sintético na presença de OTA e dos fungicidas
cresoxim-metílico e famoxadone e grupo controle sem contaminantes.
Cultivo
Y P/S
(mgGSH/
gglicose)
Y X/S
(mgcélulas/
mgglicose)
Y P/X
(mgGSH/
mgcélulas)
Y P/S
(mgetanol/
gglicose)
Y P/X
(mgGSH/
mgetanol)
Controle 0,69 0,023 0,01 0,64 0,01
OTA 2 µg 5,18 0,010 0,50 0,62 0,08
OTA 4 µg 5,30 0,009 0,55 0,60 0,08
Cresoxim-metílico 2,05 0,019 0,10 0,40 0,04
CM + OTA 2 µg 5,10 0,011 0,45 0,55 0,09
CM + OTA 4 µg 5,59 0,012 0,45 0,54 0,10
Famoxadona 2,42 0,016 0,14 0,45 0,05
Famoxadona + OTA 2 µg 6,84 0,011 0,59 0,63 0,10
Famoxadona + OTA 4 µg 5,82 0,005 1,07 0,61 0,09
Legenda: Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). OTA 2 µg L
-1: S.c. em
MCS + OTA 2 µg L-1. OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L
-1. CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L
-1);
CM + OTA 2 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1) + OTA 2µg L
-1, CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS +
cresoxim-metilico (0,75 mg L-1) + OTA 4 µg L
-1, F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1), F+ OTA 2 µg: S.c. em
MCS + famoxadona (3 mg L-1) + OTA 2 µg L
-1, F+ OTA 4 µg L
-1 : S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1) + OTA
4 µg L -1.Todos os experimentos apresentaram coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma
coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).
A produção de GSH quando relacionada à concentração de glicose e a
concentração celular, apresenta maior conversão em todos os cultivos com OTA,
isso confirma que a presença da micotoxina ativa as rotas da levedura para a
detoxificação e metabolização da micotoxina presente no meio de cultura. O
mesmo é observado na conversão de glicose em células, pois todos os cultivos
expostos a OTA apresentaram uma menor conversão, devido ao excessivo gasto
energético na ativação de rotas metabólicas para a detoxificação, com a finalidade
de reduzir o estresse oxidativo ocasionado pela presença de micotoxina, reduzindo
seu crescimento celular devido ao déficit energético. Os cultivos somente com os
62
fungicidas apresentaram maior conversão de glicose e também de células em GSH
do que o controle, demonstrando que a presença do fungicida ativa as rotas
metabólicas para a detoxificação celular. Em relação à conversão de glicose em
etanol, observa-se que o grupo controle e os grupos expostos a micotoxina nas
duas concentrações apresentaram semelhantes fatores de conversão, enquanto os
cultivos somente com os fungicidas apresentaram menor produção de etanol (LI et
al., 2004).
A presença de etanol e contaminantes no meio de cultura podem promover
alterações morfológicas nas células da levedura Saccharomyces cerevisiae. Para
verificar sua morfologia, foram avaliadas as imagens das células do cultivo no
tempo de 96 h de fermentação, com a utilização de um microscópio eletrônico de
varredura (MEV) (Figura 15).
Figura 15- Imagens obtidas por MEV das células de Saccharomyces cerevisiae em 96h de fermentação alcoólica em todos os cultivos.
Legenda: A:Controle: Saccharomyces cerevisiae (S.c.) em meio de cultura sintético (MCS). B: OTA 2 µg L-1: S.c. em MCS +
OTA 2 µg L-1. C: OTA 4 µg: S.c. em MCS + OTA 4 µg L
-1.D: CM: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L
-1); E:
CM + OTA 2 µg: S.c. em MCS + cresoxim-metilico (0,75 mg L-1) + OTA 2µg L
-1, F: CM + OTA 4 µg: S.c. em MCS + cresoxim-
metilico (0,75 mg L-1) + OTA 4 µg L
-1, G: F: S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1), H: F+ OTA 2 µg: S.c. em MCS +
famoxadona (3 mg L-1) + OTA 2 µg L
-1, I: F+ OTA 4 µg L
-1 : S.c. em MCS + famoxadona (3 mg L
-1) + OTA 4 µg L
-1.Todos os
experimentos apresentaram coeficiente de variação menor que 5%. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os dias (p < 0,05).
63
A contaminação do meio com OTA em ambas as concentrações,
promoveram deformações morfológicas na parede da levedura (B e C) e algumas
células com ruptura. Os cultivos expostos ao cresoxim-metílico coexpostos a OTA
nas duas concentrações (E e F) além da deformação morfológica apresentaram
alto nível de ruptura da parede celular.
As células dos cultivos expostos ao famoxadona e a micotoxina nas duas
concentrações (H e I) também apresentaram deformações morfológicas e ruptura
celular, nos cultivos expostos apenas aos fungicidas (D e G) apresentaram uma
rugosidade na parede celular, no cultivo controle (A) a célula mostrou sua
morfologia normal.
64
6.CONCLUSÕES
O método QuEChERS apresentou eficiência para extração de OTA, de
acordo com as figuras de mérito, apresentando boa linearidade, recuperação e
exatidão. OTA ocorreu em 43 amostras de vinhos tinto originados do Estado do Rio
Grande do Sul, com média de 1,63 ng mL-1. De acordo com o consumo per capita a
ingestão de baixos volumes de vinho não oferece risco ao consumidor.
Os fungicidas cresoxim-metílico (1000 µg mL-1) e famoxadona (600 µg mL-1),
nas concentrações recomendadas pelos fabricantes, foram eficazes em reduzir o
crescimento fúngico de Aspergillus carbonarius; CM reduziu 76% e F reduziu 61%.
No entanto, o potencial toxigênico do fungo foi afetado na presença dos fungicidas,
aumentando significativamente a produção de OTA pelo fungo.
A presença dos fungicidas e da micotoxina na fermentação por
Saccharomyces cerevisiae afetou bioquimicamente o cultivo. O crescimento celular
foi 45 % menor em todos os cultivos com a presença de OTA, possivelmente
devido ao gasto energético na ativação das rotas metabólicas para a detoxificação.
A redução de micotoxina, nos cultivos expostos a OTA nas concentrações de 2 e 4
µg L-1, ocorreu em 48 h de fermentação. Os cultivos coexpostos a micotoxina e aos
fungicidas apresentaram redução em torno de 60 % de OTA ao longo da
fermentação. Todas as reduções estão relacionadas às elevações da atividade
enzimática da peroxidase e da produção de GSH, concomitantemente com a
elevação da síntese proteica. Em relação ao grupo controle, todos os grupos
tratados apresentaram menor produção de etanol e alterações morfológicas na
parede celular da levedura.
Os resultados obtidos nesse estudo contribuem com um método adequado e
validado para a análise de OTA em amostras de vinho tinto, gerando informações
sobre o potencial toxigênico do fungo Aspergillus carbonarius, quando exposto a
fungicidas. Bem como informações sobre as alterações bioquímicas e cinéticas
durante a fermentação alcoólica do vinho, na presença de contaminantes,
proporcionando subsídios para órgãos reguladores e setor industrial.
65
7. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
- Determinar o perfil de álcoois em amostras de vinho tinto, concomitante a
concentração de ocratoxina A;
-Quantificar a concentração de fungicidas: cresoxim-metílico e famoxadona durante
a fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae;
-Verificar as alterações morfológicas no fungo Aspergillus carbonarius na presença
dos fungicidas;
-Fazer a fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae utilizando o mosto
de uva como meio de cultivo;
- Verificar o efeito da fortificação de moléculas oxirredutoras, como a glutationa, na
fermentação alcoólica na presença de contaminantes.
66
8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9. ANEXOS
Anexo 1: Solução Alcalina
- Solução 1:
0,0625 g CuSO4 avolumar para 100 mL com água destilada;
- Solução 2:
1,65g Tartarato duplo de Na e K, avolumar para 100 mL com água destilada;
- Solução 3:
26,1 g NaCO3 e solubilizar em 1,044 litros da água destilada fervida e resfriada;
Homogeneizar 3 mL da solução 1 + 3 mL da Solução 2 + 1,044 L da solução 3.
Armazenar refrigerada em frasco âmbar.
99
Anexo 2- Dados da ocorrência de OTA em 50 amostras de vinho tinto, obtidos no estado do Rio Grande do Sul.
Vinho Ocorrência (µg L-1)
Tinto Seco
Carbenet Sauvignon
Amostra 1 2,00
Amostra 2 1,34
Amostra 3 1,30
Amostra 4 2,08
Amostra 5 3,96
Amostra 6 1,54
Amostra 7 2,05
Amostra 8 1,57
Amostra 9 1,92
Amostra 10 1,08
Amostra 11 1,39
Amostra 12 1,02
Amostra 13 nd*
Merlot
Amostra 1 2,00
Amostra 2 0,71
Amostra 3 1,60
Amostra 4 3,56
Amostra 5 2,00
Amostra 6 nd*
Amostra 7 nd*
Pinot noir
Amostra 1 4,65
Amostra 2 2,93
Amostra 3 2,04
Malbec
Amostra 1 3,56
Amostra 2 2,56
Amostra 3 1,90
Amostra 4 4,39
Amostra 5 1,20
Amostra 6 1,96
Amostra 7 1,92
Amostra 8 1,32
100
Tinto Suave
Carbenet Sauvignon
Amostra 1 2,78
Amostra 2 0,56
Amostra 3 0,75
Amostra 4 0,81
Amostra 5 0,82
Amostra 6 2,61
Amostra 7 0,87
Amostra 8 0,76
Amostra 9 nd*
Merlot
Amostra 1 1,09
Amostra 2 2,27
Amostra 3 nd*
Amostra 4 nd*
Pinot noir
Amostra 1 2,78
Amostra 2 1,71
Amostra 3 2,09
Amostra 4 2,30
Amostra 5 1,32
Amostra 6 nd*
nd*: não detectado