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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA A SAÚDE CAROLINE DECKMANN NICOLETTI DESENVOLVIMENTO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (p/p) COM POLISSORBATO 80 COMO AGENTE SOLUBILIZANTE NITERÓI 2015

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS APLICADAS A PRODUTOS

PARA A SAÚDE

CAROLINE DECKMANN NICOLETTI

DESENVOLVIMENTO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (p/p) COM POLISSORBATO 80

COMO AGENTE SOLUBILIZANTE

NITERÓI

2015

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CAROLINE DECKMANN NICOLETTI

DESENVOLVIMENTO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (p/p) COM POLISSORBATO 80

COMO AGENTE SOLUBILIZANTE

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Aplicadas a Produto para a

Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade

Federal Fluminense, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde.

Campo de Confluência: Tecnologia Farmacêutica.

Orientadora:

Prof.a Dr.ª Débora Omena Futuro

Co-Orientador:

Prof. Dr. Raphael Cruz

Niterói, RJ

2015

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N 643 Nicoletti, Caroline Deckmann

Desenvolvimento de géis de papaína a 4,0% (p/p) com polissorbato 80 como agente solubilizante/ Caroline Deckmann Nicoletti; orientadora: Débora Omena Futuro. – Niterói, 2015. 113f. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense, 2015. 1. Géis 2. Papaína 3. Concentração Micelar Crítica 4. Cicatrização de feridas I. Futuro, Débora Omena II. Título

CDD 541.34513

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CAROLINE DECKMANN NICOLETTI

DESENVOLVIMENTO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (p/p) COM POLISSORBATO 80

COMO AGENTE SOLUBILIZANTE

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Aplicadas a Produto para a

Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade

Federal Fluminense, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde.

Campo de Confluência: Tecnologia Farmacêutica.

Aprovada em 31 de março de 2015.

BANCA EXAMINADORA

Prof.a Dr.ª Débora Omena Futuro – UFF Orientadora

Dr.ª Alessandra Lifsitch Viçosa - Farmanguinhos – FIOCRUZ

Dr.ª Zaida Maria Faria de Freitas - Faculdade de Farmácia - UFRJ

Niterói 2015

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DEDICATÓRIA

Ao meu marido e companheiro, Marcio, pelo amor, incentivo e paciência.

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AGRADECIMENTOS

À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Débora Omena Futuro pela amizade, por ter aceitado o

desafio, pela oportunidade, confiança e ensinamentos. Meu reconhecimento por termos feito

essa caminhada juntas.

Ao professor Dr. Raphael Cruz pelo conhecimento na área da físico-química tão assombrosa

para nós farmacêuticos.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde e seus

docentes, o meu obrigado.

À CAPES pela bolsa de mestrado, possibilitando que eu me dedicasse exclusivamente a esse

projeto.

Aos professores Dr.ª Deborah Quintanilha Falcão, Dr.ª Samanta Cardozo Mourão, Dr.ª

Thelma Machado, Dr.ª Luciana Esper e Déo Anselmo Pinheiro por acompanharem o meu

caminhar e contribuírem com incentivos e opiniões; bem como com a cedência de matérias-

primas, materiais e instrumentos.

Às meninas da Central Analítica, em especial a Nelise, que me despertou e auxiliou a

compreender a metodologia tão complexa.

A Dy que com amor e dedicação tem sempre um repositor de energias, principalmente para as

horas difíceis. A Ju, com seu sorriso contagiante torna o dia sempre melhor.

Aos amigos e colegas de laboratório, Mariana, Vitor, Marcielle (minha cumadre), Letícia,

Alessandra, Hingrid, Kessiane, Rafael, Anne, Daniele, Lorena, Patricia Alice, Juliana, Ana

Carolina, que estiveram comigo tornando os momentos no laboratório mais agradáveis e

produtivos.

À Patricia, minha irmã da UFF, que me apoiou, deu força, sendo um exemplo de

companheirismos nas boas e más horas. As horas de laboratório foram muito mais fáceis ao

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seu lado. Impossível esquecer o dia em que fiz a primeira placa de atividade proteolítica, você

estava lá e segurou minha mão, literalmente.

À amiga Sandra, que aceitou o desafio de me ensinar a língua inglesa, tão assustadora para

mim. Somente com os seus ensinamentos foi possível iniciar essa jornada.

À minha família, que mesmo de longe, me apoiou e acreditou em mim.

A todos, sinceramente muito obrigada!

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É preciso que eu suporte duas ou três larvas se quiser conhecer as borboletas.

Antoine de Saint-Exupéry

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RESUMO

NICOLETTI, C.D. Desenvolvimento de géis de papaína a 4,0% (p/p) com polissorbato 80 como agente solubilizante. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, 2015. A papaína é uma enzima proteolítica utilizada no tratamento de feridas. É parcialmente solúvel em água e tem baixa estabilidade em preparações farmacêuticas, dessa forma os géis com concentrações de papaína acima de 1% podem apresentar precipitados. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de géis de papaína a 4% (p/p) usando tensoativos como agente solubilizante. Como fase inicial do estudo realizou-se a determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC) por meio da medida de tensão superficial de geis de papaína a 4,0% (p/p) com e sem L-cisteína e diferentes concentrações de polissorbato 80. Novas preparações foram desenvolvidas usando-se concentrações de polissorbato e L-cisteína que resultavam na completa solubilização da papaína. O estudo de estabilidade dos géis de papaína a 4,0% (p/p) com polissorbato 80 foi planejado e executado a partir de desenho experimental fatorial 33 em amostras armazenadas sob refrigeração por 30 dias. As variáveis independentes estipuladas foram concentração de L-cisteína, concentração de polissorbato 80 e o tempo de armazenagem; a variável dependente avaliada foi a concentração de papaína ativa. Todas as amostras foram analisadas quanto à manutenção das características sensoriais e físico-químicas. Durante o período de avaliação as preparações conservaram-se como géis homogêneos, mantendo-se estáveis quanto aos valores de pH, de viscosidade e de estabilidade termodinâmica. Estas amostras não apresentaram mudanças no seu comportamento reológico. As preparações estudas apresentaram concentrações de papaína ativa entre 90 e 110% apos 24 horas de preparo, mas não foi possível a manutenção desta atividade durante o período de estudo. As avaliações estatísticas decorrentes do desenho experimental fatorial resultaram em gráficos de superfície de resposta e de contorno, que demonstraram que o tempo é o fator de maior influência sobre a perda da atividade da papaína nas preparações em gel. A L-cisteína interfere favoravelmente para a manutenção da atividade, mas sua ação isolada é incapaz de sobrepor-se ao efeito do tempo. A associação da L-cisteína e do polissorbato 80 também apresenta ação favorável a manutenção da atividade enzimática, que se torna evidente somente nas maiores concentrações estudadas para estes adjuvantes. Palavras-chave: Papaína; Concentração Micelar Crítica; Atividade proteolítica; Desenho experimental fatorial

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ABSTRACT

NICOLETTI, C.D. Development of papain gels at 4.0% (w/w) with polysorbate-80 as solubilizing agent. Dissertation (Master’s degree). Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal Fluminense, 2015. Papain is a proteolytic enzyme used in the treatment of wounds. It is partially soluble in water and has low stability in pharmaceutical preparations thus gels with papain above 1% concentration may have precipitated. This study aimed to the development of papain gels at 4% (w / w) using surfactants as solubilizing agent. As the initial phase of study was carried out to determine the critical micellar concentration (CMC) by action of surface tension of papain gels at 4.0% (w / w) with and without L-cysteine and different concentrations of polysorbate 80. New preparations were developed using concentrations of polysorbate and L-cysteine resulted in complete solubilization of papain. The stability study of papain gels at 4.0% (w / w) polysorbate 80 was planned and carried out from 33 factorial experimental design for samples stored under refrigeration for 30 days. The independent variables were prescribed concentration of L-cysteine, concentration of polysorbate 80 and the storage time; the evaluated dependent variable was the concentration of active papain. All samples were analyzed for the maintenance of sensorial and physicochemical characteristics. During the evaluation period preparations presented as homogeneous gels, remaining stable as the pH, viscosity and thermodynamic stability. These samples showed no changes in their rheological behavior. The preparations studied showed ative papain concentrations between 90 and 110% after 24 hours of preparation, but it was not possible to maintain this activity over the study period. The statistical evaluations resulting from the factorial experimental design resulted in response surface graphs and contour, showing that time is the most influential factor on the loss of papain activity in preparations gel. L-cysteine favorably affects the maintenance of the activity, but its action alone is unable to override the effect of the time. The combination of L-cysteine and polysorbate 80 also presents favorable action to maintain the enzyme activity, which becomes evident only at the highest concentrations investigated for these adjuvants. Keywords: Papain; Critical Micelle Concentration; Proteolytic activity; Factorial experimental design

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Estrutura geral dos polímeros de carboxivinil .........................................................21

Figura 2: Estrutura tridimensional da papaína, onde os dois domínios da cadeia principal estão

representados em verde e o sítio catalítico, em azul.................................................................23

Figura 3: Representação das forças atrativas na superfície a no meio do líquido. ...................33

Figura 4: Tensão superficial de solução de tensoativo x concentração, com formação de

micelas. .....................................................................................................................................34

Figura 5: Mecanismos de estabilização de proteínas por surfactantes, que podem (a)

posicionar-se na interface e evitar a adsorção de proteínas, ou (b) se associam com as

proteínas e preferencialmente, assim, evitar a aproximação e agregação................................37

Quadro 1: Quadro das 5 regiões de intereações proteína-tensoativo e interface......................38

Figura 6: Estrutura química geral dos polissorbatos. O alifático (hidrofóbico) caudas de

polissorbato 20 e 80 pode variar em comprimento e grau de insaturação, enquanto que o teor

de óxido de polietileno (PEO) mantém-se constante................................................................39

Figura 7: Representação esquemática das alterações microscópicas de volume causada por

processo de associação de um surfactante não iônico a géis de carbômero.. ...........................43

Figura 8: Etapas da associação do tensoativo ao polímero; A) a concentração do tensoativo

esta superior a concentração de agregação crítica (CAC) e dá-se inicio a associação entre os

dois componentes; B) a concentração do tensoativo esta acima do ponto de saturação do

polímero (PSP)... ......................................................................................................................43

Figura 9: Tensiômetro com indicativo dos acessórios básicos.................................................50

Figura 10: Cubetas para análise de potencial zeta em aparelho Zetasizer® Nanoseries – Nano

ZS90 – Malvern Instruments ....................................................................................................52

Figura 11: Desenho esquemático do reômetro rotacional de cilindros concêntricos. ..............57

Figura 12: Reação de fluorescência catalisada pela papaína....................................................58

Figura 13: Esquema da microplaca de 96 poços para análise de uma amostra. .......................60

Figura 14: Gráfico da Tensão Superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série com

cisteína......................................................................................................................................65

Figura 15: Representação gráfica do cálculo das equações de reta usadas para o

estabelecimento da CMC no gráfico de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da

série com cisteína......................................................................................................................66

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Figura 16: Gráfico da Tensão Superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série sem

cisteína......................................................................................................................................67

Figura 17: Representação gráfica do calculo das equações de reta usadas para o

estabelecimento da CMC no gráfico de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da

série sem cisteína......................................................................................................................68

Figura 18: Desenho esquemático da dupla camada elétrica, segundo o modelo de Stern, das

cargas presentes na superfície da partícula que fornecerão valores de potencial zeta. ............71

Figura 19: Gráfico de Potencial Zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série com cisteína 73

Figura 20: Gráfico de Potencial Zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série sem cisteína.73

Figura 21: Diapositivos de amostras dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1 ........76

Figura 22: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta x taxa de cisalhamento de géis de

papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1......................................................................................78

Figura 23: Histograma dos valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a

P9, em D1 .................................................................................................................................81

Figura 24: Curva de Calibração da papaína 30.000 USP-U/mg...............................................82

Figura 25: Concentração de papaína ativa dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D184

Figura 26: Diapositivos de amostras dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias

(continua)..................................................................................................................................85

Figura 27: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento

dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D1 ....................................................................89

Figura 28: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento

dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D7 ....................................................................89

Figura 29: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento

dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D15 ..................................................................90

Figura 30: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento

dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D23 ..................................................................90

Figura 31: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento

dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D30 ..................................................................90

Figura 32: Histograma dos valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9

em 30 dias.................................................................................................................................92

Figura 33: Histograma dos valores da concentração de papaína ativa dos géis de papaína a

4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias ................................................................................................96

Figura 34: Taxa de redução percentual da atividade proteolítica em 30 dias...........................97

Figura 35: Histograma de resíduos brutos pelo modelo...........................................................98

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Figura 36: Histograma de valores preditos pelo modelo..........................................................98

Figura 37: Gráfico de valores preditos por valores observados ...............................................99

Figura 38: Gráfico normal probabilístico dos resíduos brutos .................................................99

Figura 39: Gráfico dos resíduos brutos x resíduos estimados segundo Student suprimidos ....99

Figura 40: Diagrama de Pareto dos efeitos padronizados. .....................................................101

Figura 41: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da

papaína ativa em função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80, fixando o Tempo

em D1 .....................................................................................................................................101

Figura 42: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da

papaína ativa em função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo

em D7 .....................................................................................................................................102

Figura 43: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da

papaína ativa em função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo

em D15 ...................................................................................................................................102

Figura 44: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da

papaína ativa em função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo

em D23 ...................................................................................................................................102

Figura 45: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da

papaína ativa em função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo

em D30 ...................................................................................................................................103

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Propriedades físicas da papaína. ...............................................................................24

Tabela 2: Uso x Concentração dos polissorbatos .....................................................................40

Tabela 3: Características físicas e toxicidades dos Polissorbatos.............................................41

Tabela 4: Formulação do gel base de Carbômero 940. ............................................................48

Tabela 5A: Formulações da série de géis de papaína com L-cisteína......................................49

Tabela 5B: Formulações da série de géis de papaína sem L-cisteína.......................................49

Tabela 6: Desenho experimental fatorial..................................................................................53

Tabela 7: Formulações para o estudo obtidas a partir de desenho experimental fatorial 33.....54

Tabela 8: Parâmetros avaliativos das características sensoriais das preparações.....................55

Tabela 9: Valores de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série com cisteína.

..................................................................................................................................................65

Tabela 10: Valores de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série de

preparações sem cisteína. .........................................................................................................67

Tabela 11: Valores de pH dos géis de papaína a 4,0% (p/p) das duas séries de preparações. .70

Tabela 12: Valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p) das duas séries de preparações.

..................................................................................................................................................72

Tabela 13: Valores de L-cisteína e Polissorbato 80 nas formulações de géis de papaína a 4,0% (p/p).......74

Tabela 14: Características sensoriais dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1 .......75

Tabela 15: Valores de pH dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1.........................77

Tabela 16: Valores de Viscosidade Absoluta em função da velocidade e taxa de cisalhamento

dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1 ...................................................................79

Tabela 17: Valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1........80

Tabela 18: Resultados experimentais obtidos na curva de calibração da papaína padrão

secundários 30.000 USP-U/MG. ..............................................................................................82

Tabela 19: Valores de unidade de fluorescência e concentração de papaína ativa dos géis de

papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1......................................................................................83

Tabela 20: Avaliação das características sensoriais das amostras dos géis de papaína a 4,0%

(p/p), P1 a P9 em 30 dias..........................................................................................................87

Tabela 21: Valores de pH e seus percentuais de variação dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1

a P9 em 30 dias.........................................................................................................................88

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Tabela 22: Valores logarítmicos da viscosidade absoluta na velocidade de 0,4 RPM dos géis

de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias............................................................................91

Tabela 23: Valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias ..92

Tabela 24: Resultados do tratamento de médias para avaliação de significância (teste de Tukey) para

valores de potencial zeta das amostras individuais no decorrer dos 5 tempos para cada amostra ....93

Tabela 25: Valores de unidade de fluorescência por minuto para os géis de papaína a 4,0%

(p/p), P1 a P9 nos cinco tempos de análise...............................................................................94

Tabela 26: Valores de concentração absoluta e de concentração percentual de papaína ativa

dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias .............................................................95

Tabela 27: Valores da taxa de redução percentual de papaína ativa (TRP) dos géis de papaína

a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias..............................................................................................97

Tabela 28: Estimativa de efeito para a concentração de papaína ativa ..................................100

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................... 16

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................................. 18

2.1 CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS ......................................................................................18

2.2 SISTEMAS COLOIDAIS ..................................................................................................20

2.3 PAPAÍNA...........................................................................................................................22

2.42.4 SOLUBILIDADE DE SUBSTÂNCIAS........................................................................28

2.4.1 ESTRATÉGIAS DE SOLUBILIZAÇÃO.......................................................................29

2.4.2 TENSOATIVOS..............................................................................................................31

2.4.3 COMPLEXOS PROTEÍNA-TENSOATIVOS ...............................................................36

2.4.4 POLISSORBATOS .........................................................................................................39

3. OBJETIVO........................................................................................................................... 45

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................45

4. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................................. 46

4.1 MATERIAIS ......................................................................................................................46

4.2 MÉTODOS.........................................................................................................................47

4.2.1. DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4% (P/P)

UTILIZANDO TENSOATIVO COMO AGENTE SOLUBILIZANTE .................................47

4.2.2 CARACTERIZAÇÃO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4% (P/P) UTILIZANDO

TENSOATIVO COMO AGENTE SOLUBILIZANTE...........................................................53

4.2.3 ESTUDO DE ESTABILIDADE DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4% (P/P).........................61

4.2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA..............................................................................................62

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................... 64

5.1 DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4% (P/P)

UTILIZANDO TENSOATIVO COMO AGENTE SOLUBILIZANTE. ................................64

5.1.1 CONCENTRAÇÃO MICELAR CRÍTICA DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (P/P)

COM TENSOATIVO...............................................................................................................65

5.2 CARACTERIZAÇÃO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4% (P/P) UTILIZANDO

TENSOATIVO COMO AGENTE SOLUBILIZANTE...........................................................74

5.2.1 CARACTERIZAÇÃO DOS GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0% (P/P) EM D1......................75

5.2.2 ESTUDO DE ESTABILIDADE DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4,0 % (P/P).....................85

5.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................................98

6. CONCLUSÕES...................................................................................................................104

7. REFERÊNCIAS..................................................................................................................107

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1. INTRODUÇÃO

A pele é o maior órgão do corpo humano representando 15% do peso corpóreo. Tem

como função primordial proteger o corpo contra ações químicas e físicas além de prevenir a

perda de água e de outras substâncias pelo corpo. Divide-se em três camadas, a epiderme,

derme e hipoderme (AZULAY, 2008; CAMARGO, 2006). A interrupção do tecido corpóreo

decorrente de algum trauma, seja ele químico ou mecânico, que venha a comprometer a

integridade anatômica da pele recebendo a denominação de ferida (AZULAY, 2008), e pode

repercutir fisicamente, psicoemocionalmente e socialmente em seus portadores (MACIEL,

2008; SILVA, 2003). Doenças crônicas, especialmente as cardiovasculares e o diabetes estão

relacionadas ao desenvolvimento de feridas, úlceras arteriais, úlceras diabéticas, úlceras

venosas, úlceras por pressão, dentre outras (MACIEL, 2008).

A utilização da papaína no tratamento de feridas tem sido amplamente estudada

quanto à sua ação, sendo estabelecidos protocolos para sua utilização em diversos tipos de

lesões, como as supras citadas. Ela se destaca como uma ótima alternativa para o tratamento

de feridas, pois se trata de uma enzima proteolítica de origem vegetal, extraída do látex do

fruto verde de Carica papaya, apresentando-se ao mercado com baixo custo, podendo ser

usada em pacientes e feridas diversas, além da ausência de efeitos colaterais (VELASCO,

1993; SANCHEZ, 1991; FERREIRA, et al 2008; SILVA, 2003; HAX, 2009). Os únicos

efeitos adversos relatados estão relacionados à pacientes que apresentam sensibilidade ao

látex do mamão, que poderão apresentar sensibilidade à papaína também (PIEPER; CALIRI,

2003).

Apesar do potencial das enzimas para o uso como ativos em cosméticos e

medicamentos, a manutenção de sua estabilidade é problemática, já que a maior parte das

enzimas, em temperatura ambiente, perde sua atividade biológica em aproximadamente um

mês (YOUNG-CHU, 2000). Além disso, trata-se de uma molécula parcialmente solúvel em

água e em preparações farmacêuticas, dessa forma os géis com concentrações de papaína

acima de 1% podem apresentar precipitados (MIURA, 2012).

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O presente projeto pretende avaliar a eficiência de adjuvantes técnicos à géis de

papaína no intuito de ampliar a estabilidade desta enzima nas preparações, assim como

melhorar a sua homogeneidade nas preparações.

No primeiro momento buscou-se alcançar a concentração de polissorbato 80 na qual

os sistemas apresentar-se-iam homogêneos. De posse deste resultado desenhou-se um estudo

experimental fatorial de 33, sendo as variáveis independentes a concentração dos adjuvantes

(cisteína e polissorbato 80) e o tempo de armazenagem. As análises estatísticas dos resultados

foram avaliadas a partir de gráficos de superfície de resposta e de contorno.

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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS

Ferida é a interrupção da continuidade de qualquer um dos tecidos corpóreos, tanto

em maior quando em menor extensão, podendo ser locais ou sistêmicas. A lesão poderá ser

causada por trauma físico, químico, mecânico ou fisiológico de defesa orgânica desencadeada

por alguma afecção clínica (CESARETTI, 1998). As feridas também podem ser classificadas

como agudas e crônicas, dependendo da natureza do processo de cicatrização (FERNANDES,

2012).

A cicatrização de feridas é iniciada imediatamente após a ocorrência da lesão. Trata-

se de um processo dinâmico, contínuo e complexo, composto por diversos tipos de células

(epiteliais, inflamatórias, plaquetas e fibroblastos) e fases sobrepostas (BLANES, 2004;

CAMARGO, 2006; CESARETTI, 1998; DECLAIR, 2002; HAX, 2009). Morfologicamente,

identificam-se três fases da cicatrização: inflamatória, proliferativa e de maturação (BLANES,

2004; CESARETTI, 1998; HAX, 2009), porém não se aterá a nenhuma dessas fases, mas sim

a cicatrização em si. Há a dependência de vários fatores para que ocorra a cicatrização, dentre

locais e gerais destaca-se: localização anatômica, tipo de pele e raça (CAMARGO, 2006).

O tratamento de feridas vem sendo alvo de muitos estudos, englobando

conhecimentos relacionados aos tipos de lesões, processo de reparação do tecido lesado e

demais fatores das etapas de cicatrização. O conhecimento adquiridos tem resultando no

desenvolvimento de novas estratégias para seu tratamento (PEREIRA; BACHION, 2005).

Existe hoje mais de 2.500 dispositivos diferentes indicados ao tratamento de feridas agudas e

crônicas (MANDELBAUM, 2003a).

Com avanços tecnológicos foram desenvolvidas de novas tecnologias terapêuticas

para o tratamento de feridas, entre elas: cultura de tecidos e transplante de fibroblastos

(Hyalograf 3D), terapia por vácuo e câmaras hiperbáricas, moldes de contato total,

tratamentos fisioterápicos: massagem, eletroterapia, ultra-som, termoterapia, laser de baixa

potência, oxigenoterapia hiperbárica, silicones (placas e tiras), modulação e terapia genética,

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albumina, ácido hialurônico, derivado do intestino de porco entre outras tecnologias de ponta.

Elas são, normalmente, de alto custo e não estão acessíveis à grande parte da população.

Sendo assim, o terapia tópica continua sendo a prática eleita dentre os médicos

(MANDELBAUM, 2003b, ROL et al. 2005).

As formas farmacêuticas de uso tópico, ungüentos, géis, cremes ou pastas, formados

por uma base semi-sólida hidrofílica ou hidrofóbica onde será incorporado o fármaco são

estratégias viáveis a todos os pacientes (AULTON, 2005).

É preciso favorecer as condições locais por meio da terapia tópica para viabilizar o

processo fisiológico de cicatrização. Pode-se definir terapia tópica como o conjunto de

condutas que visam à cura precoce das feridas, compreendendo a limpeza, o desbridamento e

a cobertura (BLANES, 2004; GOMES; CARVALHO, 2002).

A limpeza da ferida deve ser feita com uso de técnica e fluido de modo que minimize

o trauma físico e químico. As soluções utilizadas variam, podendo ser água e/ou soluções

fisiológicas. O desbridamento é o processo de retirada do tecido desvitalizado ou necrótico,

visando a limpeza, deixando o local da ferida apto para que ocorra a cicatrização (SANTOS,

2000).

Mandelbaum, (2003b) fez uma revisão dos principais recursos disponíveis no Brasil,

ácidos graxos essenciais (AGE); alginato de cálcio; anti-sépticos e degermantes; bandagens

para a compressão; carvão ativado e prata; sulfadiazina de prata; filmes semipermeáveis;

colágeno biológico e enzimas combinadas; fatores de crescimento celular; acetato de celulose

e outras membranas permeáveis ao vapor; protetores cutâneos; hidropolímeros; hidrogéis;

hidrocolóides e enzimas proteolíticas, entre outros de menor relevância.

O hidrocolóides, hidropolímeros e hidrogéis foram lançados no Brasil na década de

90, somado a propriedade umidificante, eles permitem a evaporação do exsudato, o que

promove a granulação e diminuição da compressão dos tecidos recém formados

(MANDELBAUM, 2003a).

A umidade e o aquecimento propiciam a cicatrização tecidual (BOATENG et al.,

2008). Além disso, tal ambiente impede danos teciduais por ressecamento, promove a

atividade de enzimas líticas, que retiram debris residuais no início da cicatrização. Com a

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oclusão aumenta a taxa de epidelização e a baixa da pressão inicial de oxigênio, que irá

promover a fase inflamatória cicatricial (FERNANDES, 2012)

2.2 SISTEMAS COLOIDAIS

Sistemas coloidais apresentam um componente disperso no seio de outro, são

caracterizados pela presença de partículas compreendidas entre 0,001 e 0,1 µm, ou seja,

partículas maiores do que as soluções verdadeiras mas menores que às das suspensões. As

dispersões coloidais que tem a fase externa um líquido serão chamadas de sóis e classificados

em liófobos, quando a viscosidade e tensão superficial não são modificadas quando é efetuada

a mistura, e liófilos quando as partículas serão impregnadas pelo dissolvente, comportando-se

como se fossem líquidas (PRISTA et al., 1995; AULTON, 2005; SINKO, 2008;

VILLANOVA, ORÉFICE, CUNHA, 2010).

Os soles liófilos poderão ser constituídos por produtos naturais ou sintéticos (como

os carbômeros, por exemplo) de elevado peso molecular que se encontram distribuídos e

intumescidos por completo em um meio contínuo líquido formando um semi-sólido

denominado de gel ou hidrogel. A denominação de hidrogel é usada quando o meio

dispersante for água, logo o colóide hidratar-se-á. Assim, o produto final terá maior

viscosidade que o líquido inicial (FERREIRA, 2005; SINKO, 2008).

Os géis possuem características térmicas e mecânicas que pode ser avaliada por

métodos simples. Muitos géis apresentam histerese diante de aquecimento e em geral não

possuem temperatura específica de gelificação (KAMERZELL et al., 2011). Além disso,

apresenta uma grande superfície específica, o que resulta em propriedades singulares

(SINKO, 2008).

Os hidrogéis naturais e sintéticos são empregados na cura de feridas, como suportes

para a engenharia dos tecidos e em sistemas de liberação sustentada. Sua utilização em feridas

se mostra vantajosa ao manter o ambiente úmido, condição esta fundamental para a absorção,

assepsia e desbridamento de tecidos necrosados e fibróticos, favorecendo a atividade

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enzimática e patrocinando o processo de cicatrização. Além disso, o gel não excede os limites

da lesão se distribuindo prontamente, além da fácil remoção (GOULART, 2006).

Uma alternativa para preparações de uso tópico contendo papaína trata-se de uma

formulação de gel que segundo a Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 2010) trata-se de uma

dispersão coloidal basicamente hidrofílica, onde se empregam polímeros inertes estáveis

quimicamente e fisicamente (EXCIPIENTES, 1998). Graças à pequena afinidade pelo sebo

cutâneo, o gel tem pequena penetração, desta forma desenvolve uma película sobre a pele de

ativo a partir da evaporação da água (MOSQUETA, 1996).

2.3.1 Carbômeros

Os polímeros sintéticos de alto peso molecular de acido acrílico são usados como

agentes emulsionante, geleificantes, suspensores ou aglutinantes em comprimidos de

liberação controlada (FERREIRA, 2008, KOLENG, McGINITY, 2006; PRISTA et al., 1995).

Os carbômeros são sintetizados a partir do ácido acrílico combinado, fazendo

ligações cruzadas, com alilsacarose ou ali-éteres de pentaeritrol (Figura 1) (AULTON, 2005;

FERREIRA, 2008).

Figura 1: Estrutura geral dos polímeros de carboxivinil (KOLENG, McGINITY, 2006; PRISTA, 1995).

Ao incorporar o polímero em água, obtêm-se molécula enovelada com baixa

capacidade espessante devido a faixa de pH ácida (2,8 e 3,2). Para obter-se viscosidade e

transparência é necessário elevá-lo ao uma faixa de pH de 4,5 a 11. A neutralização dos

grupos carboxilas do carbômero permite o alongamento de sua molécula e assim a formação

de uma matriz coloidal. A neutralização poderá ser alcançada lançando mão de bases

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inorgânicas como hidróxido de sódio (KOLENG, McGINITY, 2006) ou amônio, e bases

orgânicas como trietananolamina e aminometilpropanol (AMP-95). A estabilidade do gel é

obtida na faixa de pH de 6,0 a 11,0, sendo o máximo da viscosidade alcançada em pH 7,0

(FERREIRA, 2008).

Comercialmente os carbômeros recebem várias denominações como Acrypol;

Acritamer, sendo a mais conhecida Carbopol®. Segundo Ferreira (2008), a observação da letra

P após a designação do número, determina a presença de resíduo de benzeno inferior a 0,1%,

logo, o Carbopol 934P, poderá ser usado em formulações tanto de uso interno quanto externo.

Porém Koleng e McGinity, (2006) relata que para PhEur 2005 apenas aceita-se os polímeros

com a denominação 971P ou 974P para uso interno.

Pinto (2011), em estudo recente, sugere que a presença de polímeros pode aumentar

a estabilidade da emulsão, uma vez que promove a redução da velocidade de separação de

fases.

2.3 PAPAÍNA

A papaína é uma enzima de origem vegetal, isolada do látex das folhas e dos frutos

verdes da espécie Carica papaya Linne. Amplamente utilizada na prática clínica como

agente desbridante, apresenta também características bactericida/bacteriostática, anti-

inflamatória e bioestimulante (CAPUCHO, 2007; MIURA, 2012).

A papaína é uma tiol proteinase, sendo sua molécula é constituída de uma exclusiva

cadeia polipeptídica simples com 212 resíduos de aminoácidos (SANGEETHA; ABRAHAM,

2006).

A estrutura cristalina tridimensional de sua molécula indica que sua cadeia é dobrada

em duas porções aparentes, porém com formações diferentes, de modo a formar uma abertura

sobre a superfície enzimática onde se localiza seu sítio ativo, conforme Figura 2 (NAEEM;

FATIMA; KHAN, 2006; CAPUCHO, 2007). Há resíduos de aminoácidos na posição 25 de

cisteína (Cis 25), na 159 de histidina (His 159) e de asparagina na 175 (Asp 175), os quais

localizam-se na superfície dessa abertura entre as duas porções da molécula. Para Sangeetha e

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Abraham (2006) estes três aminoácidos representam o centro catalítico enzimático, enquanto

que para Brockelehurst (1990) apenas Cis 25 e His 159 interagem para essa ação catalítica.

Figura 2: Estrutura tridimensional da papaína, onde os dois domínios da cadeia principal estão representados em

verde e o sítio catalítico, em azul (CAPUCHO, 2007).

O grupo sulfidrílico encontra-se na posição Cis 25, os seis demais resíduos cisteína

formam três ligações dissulfetos (SZABÓ et al., 2006). Logo sua estrutura é estabilizada por

estas ligações dissulfeto, que ao serem destruídas acarretam na redução da atividade

biológica, catalítica e imunológica da enzima (ZHUANG; BUTTERFIELD, 1991).

A estrutura química da papaína possui um radical sulfidrila (-SH) no seu sítio ativo,

especificamente, no resíduo de cisteína, sendo fundamental que este grupo esteja livre para a

ação de atividade enzimática, na sua forma reduzida. Pode-se, desse modo, adicionar agentes

redutores tais como cisteína, sulfitos, ciamidas, cianeto de hidrogênio, glutationa reduzida e

tioglicolato, porém é facilmente oxidado em soluções aquosas ou em contato com substâncias

compostas por iodo, oxigênio e metais pesados como o ferro, ácidos concentrados e com o

aumento de temperatura. Uma vez que esse radical é oxidado, a enzima perde sua atividade

proteolítica e, com isso, a papaína perde suas propriedades (KIMMEL; SMITH, 1954;

SMITH; KIMMEL; BROWN, 1954; ARNON, 1070; USP XXXI, 2008; CAPUCHO, 2007).

Devido a essas características, recomenda-se que o armazenamento dessa substância

obedeça a condições específicas como abrigo da luz, umidade, oxigênio e calor. Como padrão

para ativação do sítio enzimático e para proteção contra a sua inativação tem-se lançado mão

de um meio contendo cisteína e EDTA (CAPUCHO, 2007; FERREIRA, 2005; MIURA,

2012; SILVA, 2003; USP XXXI, 2008). A maior estabilidade enzimática é conseguida na

faixa de pH 5,0 a 7,0 (SIM et al., 2000).

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As características físicas da papaína descritas na Tabela 1.

Tabela 1. Propriedades físicas da papaína.

Propriedades físicas Características

Apresentação Pó amorfo de cor branca leitosa, com odor forte e característico, similar ao enxofre.

Solubilidade Parcialmente solúvel em água e glicerol. Insolúvel em álcool, éter e clorofórmio.

Massa molecular 23.406 Da Dimensão aproximada 5,0 x 3,7 x 3,7 nm Ponto isoelétrico pH 8,75

λmax 278 nm

Temperatura ótima para atividade enzimática 65ºC Faixa de pH ótimo para atividade enzimática 5,0 a 7,0 Faixa de pH da solução aquosa 2% 4,8 a 6,2

Fonte: ZULLI, 2007; MIURA, 2012.

O uso da papaína é indicado para todas as fases do processo de cicatrização, em

feridas secas ou exsudativas, colonizadas ou infectadas, com ou sem necrose. Neste contexto

a papaína promove o desbridamento químico, ativa o processo de regeneração tecidual e

reduz o período de cicatrização, além de apresentar ação bactericida, bacteriostática e anti-

inflamatória. Em estudo dirigido por Ferreira et al (2008) demonstrou-se que apenas o gel de

papaína a 10% foi capaz de inibir o crescimento do S. aureus e de P. aeruginosas. Já em um

estudo in vitro, com sementes do fruto de Carica papaya em diferentes graus de maturação, a

papaína demonstrou atividade bacteriana (DAWKINS et al.; 2003).

A ação proteolítica da papaína é observada somente em tecidos inviáveis, não

agredindo os tecidos sadios. Este fato deve-se à enzima alfa1-antitripsina, uma antiprotease

plasmática, que evita a atividade enzimática, estando presente somente nas células sadias

(FLINDT, 1978 apud ZULLI, 2007; FERREIRA, 2005). Além disso, no extrato córneo

humano foi identificada uma nova protease, da família da papaína, denominada Stratum

Corneum Cathepsin-L-like Protease (SCCL). Esta enzima tem efeito sobre a degradação das

corneodemosinas (um dos constituintes dos corneodesmossomos), patrocinando o processo de

descamação epidérmica (BERNARD et al., 2003). Este fato pode explicar o desbridamento

promovido pela papaína.

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Sua atividade proteolítica, nas concentrações de 0,1, 0,5 e 1,0% diminuiu a crosta da

queimadura melhorando a cicatrização (RAKHIMOV, 2000). Esta enzima digere os restos

teciduais e representantes insolúveis do exsudato inflamatório, como as fibrinas e material

genético de células necróticas, transformando-os em peptídeos quimiotáticos para os

fibroblastos, os quais irão excitar precocemente a fibroplastia/cicatrização (FERREIRA, et al

2008; MONETTA, 1987; SANCHEZ, 1991; VELASCO, 1993). Sua capacidade de

degradação abrange proteínas que contenham em sua estrutura resíduos do aminoácido

cisteína, como os fatores de crescimento. A exemplo disso há a não degradação do colágeno,

uma vez que o mesmo não possui a cisteína em sua composição (FALANGA, 2002). Existe

uma predisposição de clivagem de ligações peptídicas envolvendo aminoácidos básicos

(CAPUCHO, 2007).

Na prática clínica são utilizadas as concentrações de 2% em feridas com tecido de

granulação, 4% a 6%, em feridas com exsudato purulento, e 8 a 10% quando se observa a

presença de tecido necrótico (HAX, 2009).

Capucho (2007) relata a aplicação da papaína nos mais diversos setores; na indústria

alimentícia: na fabricação de queijos e biscoitos, amaciantes de carne e clarificantes de

cervejas; na produção de detergentes (como promotor de limpeza por meio da degradação

hidrolítica de proteínas encontradas em manchas de sangue, ovo, chocolate, entre outras); na

indústria do couro, para remoção de pelos e amaciante do couro e na indústria cosmética no

preparo de esfoliantes, devido seu poder debridante. Korolkovas (2006) cita a papaína como

agente cáustico.

Além desses destacam-se o uso como agentes depilatórios (TRAVERSA, 2003), em

"peeling" (SANTOS, 2001), como também se observa sua aplicação associada a alfa-

hidroxiácidos e ao ácido salicílico em tratamentos de rejuvenescimento e ressecamento da

pele (OZLEN, 1996).

Comercialmente, nos Estados Unidos, encontra-se o produto Panafil®, associação da

papaína à uréia e à clorofila. Também se encontra o Accuzyme®, produto com papaína e

uréia. Além desses encontra-se um produto de origem italiana o NouriFusion®, que associa a

papaína com as vitaminas A, C e E. A uréia nesse tipo de formulação tem a função de auxiliar

a ação proteolítica da papaína, ao clivar as ligações hidrogênio expondo os sítios ativos da

papaína por ação solvente, alterando suas estruturas tridimensionais. A uréia também atua na

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redução das pontes dissulfeto das proteínas e expõe os resíduos de cisteína, os quais são mais

susceptíveis à ação enzimática. Essa associação, comparada à papaína isolada, demonstra o

dobro da ação e efetividade na digestão de proteínas (MIURA, 2012; CAPUCHO, 2007;

FALANGA, 2002). Ainda existe o produto odontológico para a remoção química do tecido

cariado e infectado, preservando os tecidos saudáveis adjacentes aos dentes, o Papacárie®

(SILVA, 2005). No auxilio na degradação das proteínas da dieta, encontramos o Filogaster®,

que associa a papaína, a pancreatina e a diastase (DEF, 2002; WALSH, HEADON, 1994).

A papaína, no que tange ao tratamento de feridas, pode ser utilizada sob diversas

formas farmacêuticas como solução aquosa, pó, gel e creme (FERREIRA, 2005).

As preparações de uso tópico com papaína são exclusivamente provenientes da

farmácia magistral. Por não apresentar forma industrializada, não se encontram registros de

estudos de estabilidade dessas formulações. As mesmas só passaram a fazer parte do

Formulário Nacional em 2011 (BRASIL, 2011), e sua monografia não apresenta dados sobre

a estabilidade das formulações, tornando impossível assegurar a eficácia e a segurança do

medicamento durante o tempo de tratamento e/ou validade do produto.

Tem-se estudado novas formas farmacêuticas para veicular a papaína, de modo a

aumentar sua estabilidade. Dentre as novas pesquisas há a tentativa de imobilizar a enzima

com o objetivo de estabilizá-la.

Ruas e colaboradores (2006) desenvolveram uma matriz polimérica para obtenção de

um adesivo de uso tópico com ação cicatrizante. Foram analisadas duas dispersões de

silicone. Sendo que a primeira formulação, com monocomponente e sem irradiação,

apresentou um melhor perfil de liberação, enquanto que a segunda, com bicomponente, o

processo térmico alterou a atividade da enzima.

Zulli (2007) incorporou papaína em matrizes poliméricas, com a finalidade de obter

um sistema de liberação controlada da enzima. Utilizou-se látex de borracha natural

bicentrifugado (LBNB); adesivo acrílico (AA); dispersão de silicone monocomponente (SM)

e dispersão de silicone bicomponente (SB). As membranas de dispersão de silicone mono

(SM) e bicomponentes (SB) não apresentaram citotoxicidade. Nestas duas foram incorporados

2% de papaína e estas foram submetidas ao ensaio de liberação com células de difusão de

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Franz. Este resultou em liberação constante da papaína nas 12 horas iniciais do ensaio,

ocorrendo burst effect.

A formulação em gel de papaína pode perder a viscosidade, por conta de sua

concentração. Contudo, não há relatos na literatura sobre a concentração máxima de papaína

em gel que assegure a manutenção das características da formulação (FERREIRA, 2005;

KISIDAY et al., 2002, apud SINKO, 2008).

Pinto (2011) relatou que géis formulados com hidroxietilcelulose não resistiram ao

teste de estresse térmico e centrifugação, enquanto que, dentre as formulações que resistiram a

estes testes, encontram-se formulações com carbômero. Inclusive a formulação que se

associou hidroxietilcelulose a outros polímeros sintéticos tiveram piores desempenhos.

Capucho (2007) testou três diferentes formadores de matrizes poliméricas coloidais

para incorporar a papaína, Pluronic® F127, Carbopol© 940 e Natrosol® 250 HHR sendo de

Carbopol© 940 a mais eficaz para veicular a papaína.

Segundo Miura (2012) faz-se necessária a adequação da concentração do

Carbômero® 940 em relação às concentrações de papaína e dos adjuvantes técnicos, para que

o produto apresente a viscosidade adequada para o uso. Além disso, observou-se com o uso

do EDTA dissódico uma influência positiva para a atividade proteolítica da papaína, porém

sem manutenção prolongada.

Já o emprego de cisteína apresentou uma influência negativa quanto à manutenção da

atividade proteolítica de papaína. A presença de propilenoglicol na formulação demonstrou

não interferir nos resultados da atividade da enzima (MIURA, 2012). Enquanto que o relatado

por Sathish, Kumar e Prakash (2007) foi o aumento da estabilidade da papaína com o uso de

diversas substâncias polihidroxiladas. As avaliações das preparações por um período de 60

dias indicaram a manutenção estabilidade física das preparações, porém a perda da atividade

proteolítica foi acentuada mesmo nas formulações armazenadas sob refrigeração (MIURA,

2012).

Ainda considerando o estudo realizado por Miura (2012) os géis de papaína

apresentaram ausência de cor e odor característico, porém tiveram um aspecto heterogêneo,

caracterizado pela presença de precipitados brancos, atribuídos à papaína. A papaína

apresenta pouca solubilidade em água (ARNON, 1970). Quantidades de papaína superiores a

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concentração de 10 mg/mL tornam sua solubilidade no meio aquoso parcial (MIURA, 2012).

Pinto (2005) descreve um gel de papaína homogêneo e transparente, durante sua avaliação de

estabilidade. Toda via suas formulações estavam em concentrações não maiores de 0,8% de

papaína, quantidade que atender a solubilidade referenciada anteriormente. Capucho (2007),

em sua avaliação prévia de géis de diferentes polímeros com papaína, obteve formulações

opacas e ligeiramente amareladas. Nestes mesmos estudos a concentração de papaína foi de

1%, e, ao considerar-se a quantidade total de água nas diferentes dispersões coloidais,

observa-se que esta se encontra levemente acima da solubilidade da enzima. Diante disso,

quando o objetivo é a obtenção de sistemas transparentes e homogêneos, a forma

farmacêutica de gel apresenta limitações.

Para que substâncias pouco solúveis, como a papaína, sejam adicionadas a quaisquer

veículos, incluindo géis de carbômero, deve-se previamente levigá-las com algum solvente

(ou cossolventes) para favorecer a sua solubilização (FERREIRA, 2008).

2.4 SOLUBILIDADE DE SUBSTÂNCIAS

A solubilidade de uma substância em um solvente sempre será limitada, ou seja, para

a formação de uma solução há a necessidade que os dois componentes (soluto e solvente)

formem uma mistura homogênea. O componente que se encontram líquido e/ou na maior

proporção será chamado de solvente (PRISTA, 1995).

Por sua vez, podemos observar, em sistemas homogêneos, as soluções ideais e as

soluções reais. Na primeira, não há diferença entre as interações das moléculas do soluto com

o solvente em comparação às interações entre as moléculas do soluto puro e do solvente puro.

Porém para as soluções reais as interações soluto-solvente são muito diferentes das interações

soluto-soluto e solvente-solvente (PRISTA, 1995).

Entre vários fatores, a solubilidade em água é de suma importância no

desenvolvimento de uma formulação, para que sua dosagem no sítio alvo seja segura e eficaz.

Esta propriedade tem influência na preparação, na absorção e até mesmo na atividade

biológica de um fármaco. Todo o fármaco, para demonstrar seu efeito terapêutico, deve

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possuir certa solubilidade em água (AULTON, 2005; RUCKENSTEIN, SHULGIN, 2003a e

2003b; MIRANDA, 2011). No entanto, vêem-se no mercado farmacêutico diversas moléculas

lipofílicas já em uso ou com promissor potencial terapêuticos (CHAUD, 2010; MIRANDA,

2011).

2.4.1 Estratégias de Solubilização

Quando a solubilidade em água de uma substância é baixa, recorre-se a alguns

artifícios. Dentre as abordagens para a solubilização de fármacos, as mais frequentemente

utilizadas são, conjuntas ou individualmente, controle do pH; formação de complexos

moleculares hidrossolúveis e uso de tensoativos e/ou co-solventes (PRISTA, 1995;

MAHATO; NARANG, 2012).

O controle de pH tem papel primordial na conquista de soluções de interesse

medicamentoso, este domínio tem direta influência na dissolução do fármaco; na manutenção

da estabilidade, seja ela química como farmacodinâmica; irritação do sítio de ação e local de

administração da substância; e acima de todos a obtenção do efeito terapêutico adequado, o

qual relaciona-se, como já mencionado, com a solubilidade (PRISTA, 1995). Fato

fundamental é que o aumento ou a diminuição do pH poderá causar a precipitação do soluto

na solução (MAHATO, NARANG, 2012). Logo, poderá ser utilizado tampões para a fixação

do pH, para evitar mudanças desfavoráveis (PRISTA, 1995).

A partir do uso de adjuvantes, como benzoato ou salicilato de sódio, teremos a

formação de complexos hidrossolúveis, com a solubilização da cafeína em água. Estes

complexos representam a combinação de duas ou mais moléculas intermolecularmente

ligadas por ligações de hidrogênio ou de van der Walls (PRISTA, 1995).

A exemplo da diversidade de substâncias passíveis de aumentar a solubilidade de

fármacos em água encontra-se o estudo de Loftsson, Fririksdóttir e Gumundsdóttir (1996),

que estudaram soluções aquosas de polímeros (hidroxipropilmetilcelulose e

polivinilpirrolidona), o qual obteve resultados significantes de aumento de solubilidade

mesmo em baixas concentrações (0,10-0,25% (w/v). Barreiro-Iglesias e colaboradores (2003)

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estudaram, a partir de sondas de fluorescência, a rede de carbômero a qual se apresenta de

forma mais apolar do que a água. Assim como demais sistemas coloidais que irão afetar

positivamente a solubilidade (SYNKO, 2008; VILLANOVA; ORÉFICE; CUNHA, 2010).

aumentando a possibilidade de incorporação nestas formas farmacêuticas de moléculas menos

solúveis em água.

Com o mesmo objetivo pode-se lançar mão de ciclodextrinas (CD), estas que tem a

capacidade de modificar as características físico-químicas de moléculas lipofílicas, ao

acomodá-las em sua cavidade interior formando complexos de inclusão. As ciclodextrinas

podem ser usadas sozinhas ou associadas a polímeros solúveis em água, como os

supracitados. Alguns estudos demonstram que essa associação mostra-se vantajosa, pois

aumentará a eficiência de solubilização exigindo menor quantidade de ciclodextrina para a

complexação de fármacos (LOFTSSON, 1994; LOFTOSSON; FRIRIKSDÓTTIR;

GUMUNDSDÓTTIR, 1996; LOFTOSSON; FRIRIKSDÓTTIR, 1998; MIRANDA, 2011).

Chaud (2010) abordou as dispersões sólidas (DS), como subsídio para melhorar a

solubilidade de fármacos. DS nada mais são que um sistema no qual o fármaco sólido é

disperso num transportador hidrófilo biologicamente inócuo.

Os polióis estão entre os agentes solubilizantes mais usados, além dos alcoóis,

solventes orgânicos, tensoativos, sais e óleos (FERREIRA, 2008). É bastante notório que à

adição de um cossolvente orgânico ou carreadores hidrofílicos como, por exemplo,

propilenoglicol, sorbitol, glicerol e os polietilenoglicóis (PEG) alterarão drasticamente a

solubilidade do fármaco em água. A solubilidade de um soluto sólido será maior num

solvente misto (solvente mais co-solvente) do que em qualquer um dos solventes puros

(RUCKENSTEIN, SHULGIN, 2003a e 2003b). A adição de polietilenoglicóis em sistemas

contendo princípios ativos hidrofóbicos tem influenciado significativamente sua solubilização

em meio aquoso, este episódio é associado a menor constante dielétrica do PEG quando

comparada aos demais cossolvente (MEDEIROS, KANIS, 2010).

A partir do uso de tensoativos e co-solventes em presença de água e óleo, poderemos

obter tanto emulsões como micro-emulsões, sendo que ambas são de grande aplicabilidade

para a solubilização de substâncias pouco solúveis (DAMASCENO et al., 2011). Quando

haverá ausência da fase oleosa, porém a presença de fármaco pouco solúvel e tensoativos

ocorrerá a formação de micelas.

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2.4.2 Tensoativos

Tensoativos são substâncias anfifílicas assim conhecidas por possuírem afinidade

tanto a solventes polares como apolares. Nestas substâncias distinguem-se duas regiões de

polaridade distinta: uma região hidrofílica, constituída por grupos iônicos ou não-iônicos

polares, que estão ligados a uma região hidrofóbica composta por uma ou mais cadeias

carbônicas (alquílica ou alquilfenílica) (PIRES, 2002; LEE et al., 2011). Eles têm uma vasta

aplicação na área farmacêutica, compreendendo agentes antiespumante, emulsionante A/O e

O/A, de molhabilidade e de espalhabilidade, detergentes e solubilizantes, apresentando ainda

ações antibacteriana, de proteção e de estabilização de proteínas (SILVA, 2002; SINKO,

2008; LEE et al., 2011; OHTAKE, 2011).

A literatura técnica recomenda que os tensoativos estejam presentes nas formulações

cosméticas e farmacêuticas em concentrações que não excedam a 5% (FERREIRA, 2008).

Os tensoativos podem ser classificados quanto ao seu Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo

(EHL). Esta escala, empiricamente que vai do 0 ao 50, corresponde a polaridade relativa do

tensoativo e assim permite a comparação entre diferentes tipos químicos de tensoativos. Desta

forma, altos valores de EHL estão relacionados aos agentes hidrofílicos e baixos valores

(menores de 9) aos agentes hidrofóbicos. Quando estes agentes têm seu valor de EHL entre 6

e 9, são considerados agentes molhantes, pois ao serem dissolvidos em água diminuem o

ângulo de contato, auxiliando no deslocamento do ar substituído pela fase líquida, uma vez

que as cadeias carbonicas serão adsorvidas na face das partículas hidrofóbicas. A parte polar

fica projetada para parte aquosa, hidratando-se, levando o ângulo de contato próximo de zero.

Para serem considerados como agentes solubilizantes seu EHL deve ser acima de 16

(PRISTA, 1995; AULTON, 2005; SYNKO,2008).

O aumento da solubilidade de substâncias pouco solúveis ou insolúveis no meio de

dispersão é possível graças a propriedade, quando em solução, de formação de micelas. Essa

habilidade de solubilização de fármacos por tensoativos varia conforme a composição

química dos tensoativos envolvidos e com a localização do fármaco na micela. Quando se tem

moléculas anfifílicas em água, a parte apolar ocupa a região do interior da micela e no seu

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exterior estarão as porções polares do tensoativo, em contato com as moléculas de água da

fase contínua (SHAW, 1975; FERREIRA, 2008; SINKO, 2008).

Para a melhoria da propriedade de solubilização de micelas constituídas de

tensoativos catiônicos e aniônicos usa-se como principal método o aumento do raio do núcleo

hidrocarbônico, ou seja, aumento do número de carbonos da cadeia hidrocarbônica na

molécula do tensoativo. Esse aumento irá favorecer a entrada de moléculas na micela, uma

vez que reduzirá a pressão de Laplace (SINKO, 2008).

Porém para micelas compostas de tensoativos não-iônicos a observação desse efeito

não está bem caracterizada (SINKO, 2008), ao passo que para o tensoativo aniônico

constituído de derivado etérico de polietilenoglicol o aumento no tamanho da micela em

número de carbonos acima de 16, não melhora a solubilização de vários fármacos, mas a

inclusão de um grupamento éter ou cetônico na região hidrofóbica afeta a solubilização e a

propriedade micelar (ATTWOOD; ELWORTHY; LAWRENCE, 1989, apud SINKO, 2008).

Quando a energia livre padrão de solubilização (∆Gos) é negativa o processo de

solubilização é espontâneo. Segundo Sinko (2008), valores negativos das funções

termodinâmicas ∆Gos, ∆Ho

s ∆Sos para a solubilização do ácido benzóico em tensoativos não-

iônicos, demonstram sua adsorção na superfície micelar. Os sinais e a amplitude das funções

termodinâmicas podem dar indícios quanto à localização do fármaco solubilizado na micela.

As micelas com formato de bastão podem ser alteradas para globulares em

solubilizados. As primeiras são observadas em tensoativos iônico e não-iônicos e sua

capacidade de solubilização é elevada quando se está próximo da formação de coacervato1

(SINKO, 2008).

É fundamental o conhecimento da localização, distribuição e orientação dos

fármacos solubilizados na micela para que seja possível compreender os aspectos cinéticos da

técnica de solubilização e das interações entre o fármaco e os constituintes micelares, uma vez

que estes fatores interferem na estabilidade molecular quanto à oxidação e à hidrólise, além da

biodisponibilidade da molécula ativa (SINKO, 2008).

1 Coacervato: camada rica em agregados coloidais.

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A indometacina, fármaco pouco solúvel em água e em sorbitol, apresenta redução do

ponto de turvação quando veiculado em soluções aquosas de polissorbato 80 (tensoativo não-

iônico) (ATTWOOD et al., 1989, apud SINKO, 2008). A solubilização deste fármaco

aumenta o tamanho micelar, seja pela sua incorporação na micela do tensoativo, seja pelo

aumento do número de monômeros de polissorbato por micela. O aumento da micela sugere a

sua reestruturação para acomodação do fármaco, ficando esta mais simétrica e hidratada

(SINKO, 2008).

Os tensoativos podem ser chamados de agentes de atividade de superfície, devido a

tendência de acumular-se na fronteira entre as fases, inclusive na interface líquido-vapor

(AULTON, 2005; FLORENCE, ATWOOD, 2011).

A tensão superficial propriamente dita é um predicado físico característico da

interface líquido-vapor (γLV), onde moléculas situadas na superfície apresentam forças

atrativas de coesão com as demais situadas no líquido e abaixo ou adjacentes a elas (Figura 3).

A força adesiva de atração é pequena com as moléculas que constituem a outra interface,

neste caso o ar (SINKO, 2008). Esta força mantém as moléculas juntas pela contração da

superfície dando origem a tensão superficial, levando a mesma a se comportar como uma

membrana elástica, devido às forças atrativas no sentido horizontal e no sentido do seu

interior. Esta energia torna-se elevada quando há um aumento da superfície na mesma massa

do líquido (SINKO, 2008).

Figura 3: Representação das forças atrativas na superfície a no meio do líquido.

(Fonte: SHAW, 1975)

Quando a concentração de tensoativos atinge um determinado estágio, a interface

passa a ficar saturada iniciando a formação de auto-agregados chamados de micelas, o que

também reduzirá a energia livre do sistema e, de acordo com a equação de Gibbs, denota o

aumento da adsorção (SHAW, 1975; SINKO, 2008; LEE et al., 2011). Nesse momento a

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tensão superficial, que antes vinha decaindo, passa a ficar constante mesmo com o aumento

da concentração de tensoativos. Nessa estreita faixa de concentração de tensoativos que

ocorre a mudança de ângulo das retas, ou seja, inflexão da curva, encontra-se a Concentração

Micelar Crítica (CMC), demonstrada na Figura 4 (SILVA, 2002; GUZMÀN, 2010; CAI,

2011; TIWARI, 2011). Cabe ressaltar que a CMC depende de diversos fatores, como estrutura

iônica e características do meio, além da temperatura do meio e da presença de sais que irão

afetar o processo de agregação (GUZMÁN, 2010).

Figura 4: Tensão superficial de solução de tensoativo x concentração, com formação de micelas. (Adaptado de

http://www.kruss.de/services/education-theory/glossary/cmc%20/)

Para um sistema conter moléculas de tensoativos (monômeros) dispersos em água é

necessário estar abaixo do CMC, enquanto que acima dessa concentração o sistema possui

duas fases em equilíbrio: igual a do caso abaixo do CMC e outra contendo micelas de

tensoativos. Neste caso a formação de micelas não é uma agregação progressiva de

monômero de tensoativo e sim um processo de uma etapa, pois leva a formação de uma fase

separada de uma solução aquosa (modelo de separação de fase) (BINANA-LIMBELE,

ZANA, 1989). Outro exemplo de propriedades das soluções micelares é a associação gradual

de monômeros para a formação de uma única micela (número de agregação). A combinação

dessas duas características somadas gera a expressão para a energia livre padrão de

micelização (SHAW, 1975; SINKO, 2008).

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Os agregados formados acima de uma concentração crítica tem morfologias variadas,

As micelas formadas por tensoativos não-iônicos mostram um aumento de polaridade do

núcleo em direção à superfície polioxietileno-água. A interface núcleo-solução aquosa (parte

polar) é uma “paliçada” extremamente hidratada, e esta distribuição anisotrópica favorece a

inserção de diversas moléculas, ou seja, permite a solubilização (SINKO, 2008; PRAZERES,

2012).

Outros estudos demonstram que a CMC irá diminuir com o aumento de grupos

espaçadores1, bem como com a substituição destes por hidroxilas, porém o primeiro tem

maior efeito na diminuição da CMC (TIWARI, 2011).

Soluções de tensoativos aniônicos, catiônicos e não-iônicos foram usadas acima de

suas concentrações micelares críticas para testar a solubilidade de um fármaco insolúvel em

água (Artemotil). Os resultados evidenciam um aumento na solubilidade mediante a

solubilização micelar nas duas primeiras soluções, enquanto que para soluções não-iônicas a

melhoria na solubilização foi pequena (KRISHNA, FLANAGAN, 1989, apud SINKO, 2008).

Outro grupo de pesquisa testou a solubilização de óleo de hortelã-pimenta em água usando o

polissorbato 20 como solubilizante, obtendo resultados diferentes entre misturas homogêneas,

gel aquoso, solução límpida e separação de fases, dependente das concentrações dos 3

componentes (O'MALLEY; PENNATTI; MARTIN, 1958, apud SINKO, 2008). Para a

preparação de formulações límpidas de vitamina A monofásica, a quantidade mínima

presumível de tensoativo para a solubilização da vitamina foi determinada pelo diagrama de

fase (BOON et al., 1961, apud SINKO, 2008).

Os tensoativos podem ser classificados como não iônicos e iônicos, onde os não

iônicos não fornecem íons na solução aquosa e a sua solubilidade neste meio se dá devido as

seus grupamentos funcionais hidrofílicos. Os tensoativos iônicos apresentam cargas elétricas

na parte hidrofílica que formam íons carregados positiva ou negativamente, ao se dissociarem

em água (ROSSI et al., 2006).

1 Grupos espaçadores: também chamado de grupo ligante, refere-se a uma cadeia de hidrocarbonetos.

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2.4.3 Complexos Proteína-Tensoativos

Um dos excipientes mais comuns empregados para controlar as interações

interfaciais das proteínas são os tensoativos não-iônicos, por exemplo, os polissorbatos

(KAMERZELL et al., 2011; LEE et al., 2011; OHTAKE, 2011).

Os tensoativos ao aumentarem a solubilização de proteínas, a partir da interação

direta e ligações hidrofóbicas na superfície protéica, irão cobrir e proteger a mesma de outras

interações indesejáveis. (KAMERZELL et al., 2011).

As proteínas, dentre elas as enzimas, como a papaína, são moléculas de superfície, ou

seja, tendem a adsorver e acumular-se nas interfaces, ficando assim muito suscetíveis à perda

de sua atividade, que também poderá ocorrer pelo desdobramento estrutural e pequenas

agregações moleculares. Algumas modificações de formulações, como mudança do pH e uso

de excipientes, são úteis para minimizar as interações interfaciais das proteínas

(KAMERZELL et al., 2011; LEE et al., 2011; OHTAKE, 2011).

Misturas de proteínas e tensoativos provocam alterações isotérmicas nas interfaces, e

essas mudanças de valores de adsorção, em função do tensoativo, fornecem informações de

grande relevância sobre a composição e propriedades estruturais dessa camada

(KAMERZELL et al., 2011).

Kamerzell e colaboradores (2011) sugerem que ao reduzir a tensão superficial, bem

como a energia livre do sistema, os tensoativos também reduzirão a interação proteína-

proteína e proteína-superfície, uma vez que haverá competição com a proteína para adsorver

nas interfaces. Além disso, teremos um sistema energeticamente desfavorável a adsorção da

proteína na interface (GRAY, 2009). Lee e colaboradores (2011) acrescentam, que

tensoativos aumentam a estabilidade conformacional da proteína e o desdobramento da

energia livre associada à desnaturação/agregação. Lee e colaboradores (2011) e Ohtake

(2011) completam, que a proteção protéica por de tensoativos poderá ocorrer por um dos

mecanismos ou por ambos, ou seja, pelo impedimento da adsorção e/ou pela estabilização da

proteína em solução inibindo a aproximação e conseqüente agregação (Figura 5).

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Figura 5: Mecanismos de estabilização de proteínas por surfactantes, que podem (a) posicionar-se na interface e

evitar a adsorção de proteínas, ou (b) se associam com as proteínas e preferencialmente, assim, evitar a aproximação e agregação (Adaptado: LEE et al. (2011)).

O efeito protetor do tensoativo sobre a proteína estará correlacionado com a CMC,

seja pela formação micelar, ou pela simples solubilização por interações hidrofóbicas. Desta

forma sendo diretamente ligado à concentração da proteína quanto do tensoativo (GRAY,

2009; KAMERZELL et al., 2011; LEE et al., 2011).

Comumente, adiciona-se tensoativos aniônicos e não iônicos, para prevenir a

adsorção de proteínas às superfícies e desta forma estabilizar macromoléculas (BAM;

RANDOLPH; CHELAND, 1995). Por outro lado, concentrações elevadas de tensoativo

podem desestabilizar estas mesmas macromoléculas (KATAKAM; BELL; BANGA, 1995). A

concentração de tensoativo sobre a agregação de proteínas supõe uma ação protetora

correlacionada com a concentração micelar crítica do tensoativo (WANG; JOHNSTON,

1993).

O esquema apresentado no Quadro 1 refere-se a uma mistura de proteína-tensoativo

idealizada e em equilíbrio. É uma referência útil para explicar as observações de sistemas de

maior complexidade. No entanto, por razões teóricas e práticas, as medições do verdadeiro

equilíbrio interfacial, geralmente, não são possíveis e tão claras no caso de misturas de

proteína-tensoativo reais (LEE et al., 2011). Os resultados na prática poderão ser variáveis,

conforme a proteína, o tensoativo, suas concentrações e o meio em que ambas encontram-se

(GRAY, 2009).

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Quadro 1: Quadro das 5 regiões de interações proteínas-tensoativos e interface.

Região 1: Concentrações baixíssimas de tensoativos:

Região 2: Concentrações baixas

de tensoativos:

Região 3: Concentrações moderadas de tensoativos:

Região 4: Concentrações altas de

tensoativos:

Região 5: Concentrações mais altas de tensoativos

(> CMC):

Poucas moléculas de tensoativos têm pouco,

ou nenhum, efeito sobre a tensão

superficial.

O aumento da concentração de

tensoativos diminui a tensão superficial,

levando ao inicio da formação de complexos de

proteínas-tensoativos

Há interações consideráveis entre

proteínas-tensoativos e superfície.

A interação proteína-tensoativo induz ao deslocamento da

proteína pra o interior do líquido (afastando-a

da superfície).

A proteína fica completamente

afastada da superfície. A proteína torna-se

revestida pelos tensoativos.

Representação esquemática da diminuição da tensão superficial associadas a cinco momentos distintos a interação da proteína-tensoativo e interações de tensoativo na interface (Adaptado: LEE et al. (2011) e GRAY (2009)).

É possível observar cinco momentos distintos de interação proteína-tensoativo

dependente da concentração de tensoativos. Na primeira fase a concentração de tensoativos é

nula ou baixíssima, não havendo efeito sobre a tensão superficial, a qual seria a mesma que a

de uma solução pura de proteína; as interações proteínas-tensoativos e nas interfaces são

limitadas. Na segunda fase, na qual ocorre uma mínima adição de tensoativos, observa-se

queda na tensão superficial. Esse fenômeno ocorre graças ao posicionamento do tensoativo na

interface ar-água, mesmo que haja também algumas moléculas dispersas no líquido. Nesta

pequena concentração já se inicia a formação de complexos de proteínas-tensoativos, porém

ainda bastante restritos. Com o crescente aumento de tensoativos observa-se a terceira fase,

onde as interações entre proteínas-tensoativos e superfície tornam-se apreciáveis. A tensão

superficial entra em um platô, a partir do favorecimento energético para a ligação entre o

tensoativo e a proteína. Provavelmente nesse intervalo, a CMC registrada para o tensoativo

em meio isento de proteínas é ultrapassada. Com uma concentração progressiva de

tensoativos registra-se a quarta fase e há interações significantes entre proteínas-tensoativos e

superfície. Estas interações induzem as proteínas a afastarem-se da superfície ao serem

deslocadas para o interior do líquido. Na quinta fase, a partir do aumento contínuo de

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tensoativos na solução, é alcançada a CMC, a qual é específica para a concentração de

proteína utilizada no experimento, portanto, não há mais tensoativos para adsorver na

superfície, uma vez que há forte interação entre as moléculas de tensoativo e a superfície. A

proteína torna-se revestida pelos tensoativos e fica completamente afastada da superfície. Se

houver ainda aumentos progressivos na concentração de tensoativos, esses não produzirão

alteração na tensão superficial, ou seja, manter-se-á dentro deste platô já atingido (GRAY,

2009; LEE et al., 2011).

2.4.4 Polissorbatos

Os polissorbatos (Tweens®) são um grupo de substâncias com características

anfifílicas, sua estrutura molecular esta representada na Figura 6. São tensoativos não-iônicos

derivados polioxietilênicos de ésteres de sorbitano (LAWRENCE, 2006). Possuem ações:

surfactante; emulsionante de preparações estáveis de emulsões farmacêuticas O/A e A/O;

solubilizante de diversas substâncias, dentre óleos essenciais e vitaminas solúveis em óleos;

como agente molhante, dispersor e suspensor de formulações orais e parenterais, onde o uso

varia conforme a concentração (Tabela 2) (AULTON, 2005; LAWRENCE, 2006;

FERREIRA, 2008). São compatíveis com substâncias aniônicas e catiônicas, além de muito

resistentes a mudanças de pH (FERREIRA, 2008).

Figura 6: Estrutura química geral dos polissorbatos. O alifático (hidrofóbico) caudas de polissorbato 20 e 80

pode variar em comprimento e grau de insaturação, enquanto que o teor de óxido de polietileno (PEO) mantém-se constante. (Fonte: LEE et al., 2011)

(Alifático)

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Tabela 2: Uso x Concentração dos polissorbatos

Uso Concentração (%)

Agente Emulsionante

Utilizado isoladamente em Emulsão O/A 1-15

Utilizado em combinação com os emulsionantes hidrofílicos em emulsões de O/A

1-10

Usado para aumentar as propriedades de retenção de água de pomadas

1-10

Agente Solubilizante

Para componentes ativos pobremente solúveis em bases lipofílicas

1-10

Agente Molhante

Para componentes ativos insolúveis em bases lipofílicas 0,1-3

Fonte: LAWRENCE, 2006.

A miscibilidade dos polissorbatos é extremamente abrangente, indo desde com água,

álcool, glicerina, propilenoglicol, polietilenoglicol 400, chegando até ser miscível em óleos

vegetais e mineral (FERREIRA, 2008). Os polissorbatos são bastante hidrofílicos, logo o seu

valor de EHL é alto (Tabela 3) (SYNKO, 2008).

Os tensoativos não-iônicos mostram-se vantajosos graças a baixa toxicidade e

irritabilidade. São também bastamente usados em produtos cosméticos, alimentares, e nas

formulações farmacêuticas por via oral, parenterais (IV e IM), retal, vaginal e tópica, sendo

geralmente, considerados como materiais não tóxicos e não irritantes (AULTON, 2005;

LAWRENCE, 2006; SINKO, 2008). Segundo Ferreira (2008) usa-se a 1% em preparações

oftálmicas. No entanto, existem relatos pontuais de hipersensibilidade a polissorbatos após o

seu uso tópico e intramuscular (LAWRENCE, 2006).

Os tensoativos não-iônicos têm menor efetividade como agentes antibacterianos do

que os demais. Além disso, os polissorbatos reduzem a atividade antimicrobiana de

conservantes parabenos (AULTON, 2005; LAWRENCE, 2006; FERREIRA, 2008, SYNKO,

2008).

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Tabela 3: Características físicas e toxicidades dos Polissorbatos

Solubilidade Polissorbato EHL

Etanol Água Toxidez

Polissorbato 20 16,7 S S

Moderadamente tóxico por vias IV e intraperitoneal. Moderadamente tóxico por ingestão. Irritante a pele humana. LD50 (hamster, oral): 18 g/kg. LD50 (camundongo, IV): 1.42 g/kg. LD50 (rato, oral): 37 g/kg.

Polissorbato 40 15,6 S S Moderadamente tóxico por via IV. LD50 (rato, IV): 1.58 g/kg.

Polissorbato 60 14,9 S S

Moderadamente tóxico por via IV Teratogenia experimental. Efeitos na reprodução. LD50 (rato, IV): 1.22 g/kg.

Polissorbato 80 15,0 S S

Moderadamente toxico por via IV. Ligeiramente tóxico por ingestão. Irritante aos olhos. Teratogenia experimental. Efeitos na reprodução. LD50 (camundongo, IP): 7.6 g/kg. LD50 (camundongo, IV): 4.5 g/kg. LD50 (camundongo, oral): 25 g/kg. LD50 (rato, IP): 6.8 g/kg. LD50 (rato, IV): 1.8 g/kg.

Legenda: S = solúvel (PRISTA, 1995; LAWRENCE , 2006; FERREIRA, 2008, SINKO, 2008).

Na Europa os polissorbato 20, 40, 60, 65 e 80 são aceitos como aditivos em

alimentos. No entanto para o FDA, os polissorbatos 20, 40, 60 e 80 estão incluídos no Guia de

Ingredientes Inativos (indicados para injetáveis, preparações orais, retais, vaginais e tópicas).

No Reino Unido eles são licenciados para uso em medicamentos parenterais e não-parenterais

(LAWRENCE, 2006).

Não incomuns são as irritações cutâneas em diferentes graus, e em menores

proporções, observam-se reações alérgicas. A irritação da pele ocorre pela retirada da camada

protetora de gordura da mesma ou pela reação dela à penetração do tensoativo. As moléculas

de tensoativos livre são de tamanhos pequenos para penetrar na pele, porém quando se

encontram organizados em micelas, a penetração é reduzida e logo a irritação se torna menor.

Ao se utilizar co-tensoativos associados ao tensoativo principal tem-se a irritação diminuída

(DALTIN, 2011).

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Tensoativos de menor valor de CMC tendem a serem menos irritantes à pele. Os

tensoativos não iônicos são menos irritantes que os aniônicos, uma vez que os valores de

CMC são mais altos, dando origem a maiores concentrações de moléculas de tensoativo livre.

A associação de dois ou mais tensoativos provocam menos irritação da pele do que a induzida

pelo contato de cada um individualmente. Isso ocorre pela formação de uma micela mista o

que reduz a CMC do sistema como um todo, diminuindo a concentração de moléculas de

tensoativos livres na solução (DALTIN, 2011).

A literatura técnica relata o amplo uso de polissorbatos na supressão da agregação de

micelas ou partículas suspensas após agitação, liofilização e ciclos de gelo-desgelo, além de

evitar substancialmente a adsorção de proteína em superfícies sólidas (LEE et al., 2011,

OHTAKE, 2011)

Os polissorbato 20 e 80 são os dois tensoativos mais utilizados em incorporações de

fármacos protéicos, sendo o intervalo de concentração de uso, normalmente entre 0,0003 e

0,3% (OHTAKE, 2011).

Barreiro-Iglesias, Alvarez-Lorenzo e Concheiro (2003) observaram que a associação

de polímeros e tensoativos poderá ser influenciada por uma gama bastante diversa de fatores,

os quais incluem características da porção apolar do tensoativo, bem como o caráter iônico;

hidrossolubilidade; conformação estrutural e versatilidade do polímero, sem esquecer da

presença de aditivos e sais.

O entendimento da tensão superficial de um sistema de polímero e tensoativos só é

possível a partir da compreensão dos termos: concentração de agregação crítica (CAC) e

ponto de saturação do polímero (PSP). Abaixo da concentração de agregação crítica não há

gelificação e acima do ponto de saturação de polímero não há aumento da viscosidade com a

adição do polímero (BARREIRO-IGLESIAS, ALVAREZ-LORENZO, CONCHEIRO,

2003; DAL-BÓ, 2007; GUERRA, 2008).

Em um sistema polimérico com a presença de polissorbatos observa-se que o

tensoativo favorecerá a interações intrapoliméricas (uma vez que cada agregado envolve uma

molécula de polímero), o que resultará no maior enovelamento da cadeia polímerica e assim

uma diminuição na viscosidade. Porém acima da CAC e abaixo da CMC temos o oposto, o

tensoativo pode funcionar como uma ponte de ligação entre cadeias de polímero diferentes

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(complexo interpolimérico), que promove o aparecimento de uma rede tridimensional, e,

assim, aumenta a viscosidade (BARREIRO-IGLESIAS, ALVAREZ-LORENZO,

CONCHEIRO, 2003)

Devido às interações polímero-tensoativo, há aumento da atividade do tensoativo na

superfície e, deste modo, não há diminuição da tensão superficial. Com o aumento da

concentração do tensoativo, o mesmo leva o polímero a saturar-se até o PSP. Após o PSP, a

atividade do tensoativo volta a aumentar, abaixando a tensão superficial até um valor

constante onde começa a formação micelar (GUERRA, 2008).

A formação de complexos entre o polissorbato 80 ou polaxamer F-127 com

carbômeros ocorre especialmente por interações tipo ligações de hidrogênio e é acompanhado

por importantes alterações na conformação dos dois elementos. Quando o tensoativo interage

com o gel de carbômero ele poderá mudar a conformação para cercar o polímero (Figura 7 e

8). Esta situação, possivelmente, é responsável pela redução na área ocupada pela molécula de

polímero e um aumento na espessura da camada interfacial de tensoativo, o que justifica a

tensão superficial maior em comparação com os valores do tensoativo sozinho em solução.

(BARREIRO-IGLESIAS, ALVAREZ-LORENZO, CONCHEIRO, 2003).

Figura 7: Representação esquemática das alterações microscópicas de volume causada por processo de associação de um surfactante não iônico a géis de carbômero.(Adapatado de BARREIRO-IGLESIAS,

ALVAREZ-LORENZO, CONCHEIRO, 2003).

Figura 8: Etapas da associação do tensoativo ao polímero; A) a concentração do tensoativo esta superior a

concentração de agregação crítica (CAC) e dá-se inicio a associação entre os dois componentes; B) a concentração do tensoativo esta acima do ponto de saturação do polímero (PSP). (Adaptado de Guerra, 2008).

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Os resultados mostram que, ao escolher a proporção apropriada do tensoativo mais

adequada, é possível modular o escoamento, as propriedades elásticas e o microambiente

difusional de géis de carbômero, sem perder a capacidade gelificação dependente do pH, o

que poderia melhorar a adequação dos géis de carbômero para entrega de fármaco por de

diferentes rotas (BARREIRO-IGLESIAS, ALVAREZ-LORENZO, CONCHEIRO, 2003).

2.5 OUTROS ADJUVANTES

Em quaisquer formas farmacêuticas que contenham adjuvante, se faz necessária a

verificação da interação destes com o próprio fármaco, pois estas podem ocorrer, porém isso

deverá ser apurado no momento da formulação do medicamento (AULTON, 2005).

Como citado por Ohtake (2011), osmólitos também podem ser usados na

estabilização de proteínas. Osmólitos tem a função de proteger as proteínas da desnaturação e

perda de função. Rodrigues (2006) relata que: “aminoácidos e carboidratos são considerados

osmólitos compatíveis, pois agem como estabilizadores protéicos, e mesmo em altas

concentrações não afetam a função da proteína”. Dentre os osmólitos encontramos a categoria

de aminoácidos. Zulli (2007) afirma que a presença de cisteína nas formulações de papaína

ativa a sua atividade por redução do sítio catalítico.

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3. OBJETIVO

Desenvolver géis de papaína 4% (p/p) com uso de tensoativo para obtenção de

preparações homogêneas.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar desenvolvimento farmacotécnico e caracterização de géis de papaína a 4%

(p/p) utilizando tensoativo como agente solubilizante.

Estudar a estabilidade de géis de papaína a 4% (p/p) quanto a sua descrição sensorial,

pH, potencial zeta, reologia e atividade proteolítica.

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4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 MATERIAIS

a) Matérias-primas

• Ácido acético glacial P.A. – Proquímios

• Água purificada de Osmose Reserva

• Água ultra-pura Purelab Flex - Veolia

• Carbômero 940 - AQUPEC HV-505 – Farmos

• Cloridrato de Carbobenzoxi-L-fenilalanil-L-arginina 4-metilcumarina-7-amid (N-CBZ-

PHE-ARG-7-MCA), grau de pureza analítico – Sigma Aldrich

• Cloridrato de Cisteína Anidra – Fagron

• Dimetilsulfóxifo (DMSO) P.A. – Vetec

• Etilenodiaminotetracetato dissódico (EDTA) – Fagron

• Fosfato de sódio dibásico anidro – Vetec

• Hidróxido de sódio em micropérolas – Vetec

• L-Cisteína, cloridrato monohidratada – Farmos

• Metilparabeno – Gemini

• Papaína 6.000 U/mg – Fagron

• Papaína Padrão 30.000 USP-U/mg, substância química de referência – Merck.

• Polioxietileno 20 sorbitano monooleato - Polissorbato 80 (Tween® 80) – Farmos

• Propilenoglicol – Farmos

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b) Equipamentos

• Agitador mecânico – IKA® RW20 digital

• Balança Analítica – Gehaka® AG 200

• Balança Semi-analítica – Marte® BL 320H

• Espectrofluorímetro de microplacas Fluorímetro – FLUOstar OPTIMA

• pHmetro – PHTEK – PHS-3B – PH Meter Model

• Placa Aquecedora – IKA® C-MAG HS 7

• Refrigerador Continental Combinado Frot-Free RFCT 450

• Reômetro Rotacional Rotovisco – Haake RV2

• Ultrapurificador de água – Purelab Flex – ELGA/VEOLIA

• Zetasizer® Nanoseries – Nano ZS90 – Malvern Instruments

4.2 MÉTODOS

4.2.1. Desenvolvimento e caracterização de géis de papaína a 4% (p/p) utilizando tensoativo

como agente solubilizante

4.2.1.1. Preparação do Gel Base de Carbômero 940 para obtenção das preparações estudadas

O gel base utilizado em todas as preparações estudadas foi preparado a partir de

Carbômero 940 na concentração de 1,5% (p/p), conforme apresentado na Tabela 4:

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Tabela 4: Formulação do gel base de Carbômero 940.

Componentes Concentração (% p/p)

Carbômero 940 1,5

Metilparabeno 0,1

Solução de Hidróxido de Sódio a 10% q.s.* pH 6,0

Água purificada q.s.p.** 100,00

* quantidade suficiente para atingir o pH próximo a 6,0 (± 0,1). ** quantidade suficiente para atingir 100% da formulação.

Em um béquer de vidro colocou-se a água purificada e o metilparabeno, os quais

foram colocados sob aquecimento (50°C) até que ocorresse a dissolução completa. A solução

de metilparabeno foi transferida para béquer de plástico e acrescentou-se o polímero de

Carbômero 940 que foi disperso gradualmente nesta mistura sob agitação mecânica constante.

A preparação obtida foi mantida sob agitação até a completa eliminação dos grumos. Foi

adicionado a solução de hidróxido de sódio a 10% em quantidade suficiente para que o gel

atingisse o pH 6,00, a homogeneização foi feita por agitação manual por meio de uma

espátula. O gel permaneceu em repouso por 24 horas para que posteriormente fosse usado em

todas as preparações estudadas.

4.2.1.2 Determinação da Concentração Micelar Crítica de Géis de Papaína 4,0% (p/p) com

Tensoativo

Preparação dos géis de papaína a 4,0% (p/p) com tensoativo e adjuvantes técnicos

Para o estudo da CMC de géis de papaína 4% (p/p) na presença de polissorbato

foram preparadas duas séries de formulações: na primeira estava presente L-cisteína enquanto

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na segunda as amostras foram preparadas sem este componente. As formulações estudadas

estão apresentadas nas Tabelas 5A e 5B.

Tabela 5A: Formulações da série de géis de papaína com L-cisteína

Substâncias (%, p/p)

Formulações Papaína EDTA PPG Cys P80 Gel Base

G1.5 C/CYS ZERO 4,000 0,160 10,000 0,050 - qsp 100

G1.5 C/CYS P80-0.05 4,000 0,160 10,000 0,050 0,050 qsp 100

G1.5 C/CYS P80-0.075 4,000 0,160 10,000 0,050 0,075 qsp 100

G1.5 C/CYS P80-0.10 4,000 0,160 10,000 0,050 0,100 qsp 100

G1.5 C/CYS P80-0.30 4,000 0,160 10,000 0,050 0,300 qsp 100

G1.5 C/CYS P80-0.50 4,000 0,160 10,000 0,050 0,500 qsp 100

Sér

ie 1

G1.5 C/CYS P80-1.00 4,000 0,160 10,000 0,050 1,000 qsp 100

Legenda: PPG = Propilenoglicol; Cys = L-cisteína; P80 = Polissorbato 80

Tabela 5B: Formulações da série de géis de papaína sem L-cisteína

Substâncias (%, p/p)

Formulações Papaína EDTA PPG Cys P80 Gel Base

G1.5 S/CYS ZERO 4,000 0,160 10,000 - - qsp 100

G1.5 S/CYS P80-0.05 4,000 0,160 10,000 - 0,050 qsp 100

G1.5 S/CYS P80-0.10 4,000 0,160 10,000 - 0,100 qsp 100

G1.5 S/CYS P80-0.20 4,000 0,160 10,000 - 0,200 qsp 100

G1.5 S/CYS P80-0.30 4,000 0,160 10,000 - 0,300 qsp 100

G1.5 S/CYS P80-0.50 4,000 0,160 10,000 - 0,500 qsp 100

Sér

ie 2

G1.5 S/CYS P80-1.00 4,000 0,160 10,000 - 1,000 qsp 100

Legenda: PPG = Propilenoglicol; Cys = L-cisteína; P80 = Polissorbato 80

Os componentes sólidos foram pesados e transferidos para um gral de porcelana. A

levigação foi realizada com uma solução de propilenoglicol e polissorbato 80 na concentração

pré-determinada para cada amostra. Procedeu-se incorporação no gel de Carbômero 940 a

1,5% (p/p) por de homogeneização por diluição geométrica com agitação mecânica. As

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amostras foram armazenadas em frascos de polimetil-metacrilato (PMMA) e mantidas em

refrigeração a 5ºC±3, com o objetivo de preservar as características da papaína.

Foram feitos 3 (três) lotes de cada formulação. Todas as amostras foram avaliadas

quanto a manutenção dos valores de pH até o momento da análise.

Avaliação da Concentração Micelar Crítica de géis de papaína a 4,0% (p/p) com

tensoativo por tensão superficial

A Concentração Micelar Crítica (CMC) para géis de papaína a 4,0% foi estabelecida

pela medição da Tensão Superficial das amostras das formulações das tabelas 5A e 5B para os

três lotes preparados. As medições foram feitas em duas alíquotas por amostra, sendo três

leituras da porção superior do frasco e três de sua porção inferior. As leituras foram feitas em

temperatura ambiente de 25ºC, 24 horas após a incorporação da papaína e dos coadjuvantes

ao gel.

A tensão superficial foi medida por anel de platina no Tensiômetro EasyDyne

(KRÜSS® Modelo K20 – Figura 9) localizado no laboratório de aulas práticas de Físico-

Química V, Instituto de Química da UFF.

Figura 9: Tensiômetro com indicativo dos acessórios básicos. (Adaptado:

http://www.kruss.de/products/tensiometers/force-tensiometer-k20/)

Portinhola

Anel Cubeta

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O método faz uso de um anel de platina (Método Du Noüy), acoplado a um

tensiômetro, o qual eleva o anel em direção a superfície e registra o aumento de força

necessária para tal, sendo o valor dado quando a força atinge o seu valor máximo necessário

para desprender um anel de uma superfície, ou seja, quando há a aplicação da máxima força

para o rompimento do filme superficial. Existe uma relação conhecida entre a força de

separação e a tensão superficial, sendo esta representada pela expressão abaixo:

Equação 1:

γ = βF 4πR

Onde: F = refere-se ao empuxo sobre o anel, R = o raio médio do anel e β = um fator de correção, utilizado para compensar o sentido não vertical das forças de tensão.

O anel de platina foi previamente limpo em ácido forte ou na chama, o qual foi

colocado no aparelho em seu devido local e tarado. A amostra foi colocada na cubeta própria

e, posteriormente, foi repousado perfeitamente na horizontal. Graças a uma portinhola acrílica

de proteção foi possível fazer as leituras de tensão superficial com total isenção de

perturbações físicas externas.

O anel seco é introduzido na interface, submerso a uma profundidade de molhagem

pré-estabelecida, aproximadamente 1 cm abaixo da superfície, e em seguida puxado para

cima, em direção a superfície. Ao imergir este anel à preparação e dar inicio ao processo, o

próprio aparelho promove sua retirada e mede a força necessária para o desprendimento do

anel da superfície. Essa força é registrada e dada ao final, juntamente com o desvio padrão

dessa mensuração. O sistema foi programado para registrar a medida de cinco (5) tensões

superficiais fazendo posteriormente uma média destas leituras. Foram consideradas somente

as leituras que tiveram desvio padrão inferior a 10.

O anel foi submergido por mais duas vezes na mesma amostra e destas três leituras

foram feitas as médias. A leitura de tensão superficial foi feita em duas porções da amostra,

uma na parte superior e outra na porção intermediária, sendo feita a média dessas duas

amostragens. Portanto foi feita média de um total de 6 leituras de cada amostra. Além da

triplicata de lote.

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Avaliação de géis de papaína a 4,0% (p/p) com tensoativo por potencial zeta

A medição do potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p) das amostras das duas

série (Tabelas 5A e B) foram feitas em temperatura ambiente de 25ºC, 24 horas após a

incorporação da papaína e dos coadjuvantes ao gel. A leitura foi efetuada no mesmo dia em

que se procedeu a diluição das amostras a uma concentração de 2,0% (p/p) em água ultra-

pura. As medições foram feitas em duas alíquotas por amostra, sendo uma da porção superior

do frasco e outra de sua porção inferior. As amostras foram formuladas em triplicadas.

Os valores foram observados e avaliados pelo do programa Zetasizer Software 7.01.

O potencial zeta foi medido em cubeta apropriada (Figura 10) no aparelho Zetasizer®

Nanoseries – Nano ZS90 – Malvern Instruments localizado no laboratório de DLS (Dynamic

Light Scattering ), sala 104, Instituto de Química da UFF.

Figura 10: Cubetas para análise de potencial zeta em aparelho Zetasizer® Nanoseries – Nano ZS90 – Malvern

Instruments

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53

4.2.2 Caracterização de géis de papaína a 4% (p/p) utilizando tensoativo como agente solubilizante

O estudo da CMC possibilitou estabelecer uma faixa de concentrações do tensoativo

onde a papaína e a L-cisteína encontravam-se nas condições ideais de solubilidade para uma

preparação farmacêutica. Informações obtidas pela literatura permitiram a determinação da

faixa de concentração de L-cisteína seriam utilizadas neste estudo. (MIURA, 2012) As

formulações planejadas para as etapas seguintes do trabalho foram definidas tendo por base

um desenho experimental fatorial de 33. As variáveis independentes foram à concentração de

cisteína e de polissorbato e o tempo de armazenagem. O desenho experimental com seus

diferentes níveis esta representado na Tabela 6 e 7. Os géis formulados foram avaliados em

tempos diferentes, sendo que os dados obtidos logo após a sua preparação foram utilizados

para a caracterização dos produtos.

Tabela 6: Desenho experimental fatorial

Níveis Variáveis

-1 0 1

L- Cisteína monohidratada (%; p/p) 0,000 0,025 0,050

Polissorbato 80 (%; p/p) 0,4 0,700 1,000

Tempo (dias) 1 15 30

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Tabela 7: Formulações para o estudo obtidas a partir de desenho experimental fatorial 33

Variáveis Formulações Cys (%, p/p) P80(%, p/p) Dias

P11 0,000 0,400 1 P21 0,000 0,700 1 P31 0,000 1,000 1 P41 0,025 0,400 1 P51 0,025 0,700 1 P61 0,025 1,000 1 P71 0,050 0,400 1 P81 0,050 0,700 1 P91 0,050 1,000 1 P115 0,000 0,400 15

P215 0,000 0,700 15

P315 0,000 1,000 15

P415 0,025 0,400 15

P515 0,025 0,700 15

P615 0,025 1,000 15

P715 0,050 0,400 15

P815 0,050 0,700 15

P915 0,050 1,000 15

P130 0,000 0,400 30 P230 0,000 0,700 30

P330 0,000 1,000 30

P430 0,025 0,400 30

P530 0,025 0,700 30

P630 0,025 1,000 30

P730 0,050 0,400 30

P830 0,050 0,700 30

P930 0,050 1,000 30 Legenda: Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80

Os géis foram obtidos pela metodologia descrita no item 4.2.1.2. Para cada

formulação foram preparados 02 lotes de 125 g, que foram divididos em 05 potes de vidro

transparentes, com 25g cada. Os vidros foram envolvidos por papel alumínio e fechados com

Parafilm® e tampa própria. Imediatamente após o preparo todas as formulações foram levadas

e preservadas sob refrigeração (5ºC±3) por todo o período do estudo para a manutenção das

propriedades da papaína. A escolha da embalagem primária com uso de papel alumínio se

justifica pela norma Q8 (R2) (ICH, 2009).

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No estudo de estabilidade foram acrescentados dois valores de tempo intermediários,

7 (D7) e 23 dias (D23) além daqueles que seriam usados nas análises para o desenho

experimental. Sendo assim foram considerados cinco tempos (D1; D7; D15; D23 e D30) para

avaliação das características sensoriais, físico-químicas e químicas.

A avaliação do tempo zero é determinada após as primeiras 24 horas da incorporação

da papaína e dos coadjuvantes ao gel (PINTO et al., 2011; CAPUCHO, 2007; MIURA, 2012),

ou seja após o primeiro dia de armazenagem, o qual foi denominado de D1. Ressalta-se que as

amostras foram envasadas em embalagem de vidro envolta de papal alumínio, vedada,

tampadas e acondicionadas sob refrigeração (5ºC±3) imediatamente após sua manipulação.

Características sensoriais

As características sensoriais foram avaliadas em três propriedades: cor, odor e

aspecto. Estes mesmos parâmetros foram descritos por Pinto (2005) e por Miura (2012) e

estão descritos na Tabela 8. As avaliações foram feitas pelo mesmo operador.

Tabela 8: Parâmetros avaliativos das características sensoriais das preparações

Cor

A Amarelado A+ Amarelado pronunciado

A++ Amarelado ainda mais pronunciado (palha)

Odor

C Característico da papaína e do polissorbato 80

LM Levemente modificado, um leve aumento dos odores característicos da papaína e do polissorbato 80, indicam possível inicio da degradação dos

componentes. M Modificado, odor característico da degradação da papaína.

Aspecto

Ho Homogêneo He Heterogêneo, com presença de precipitados

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Avaliação de pH

A medição do pH foi realizada a partir de potenciometria, onde o pHmetro foi ligado

e deixado estabilizar em temperatura ambiente, e calibrado com as soluções tampão de pH

7,00 e 4,00. Procedeu-se a limpeza do eletrodo com água purificada e secagem com papel

absorvente, para a calibração de dois pontos, introduziu o eletrodo na solução tampão de pH

7,00, e após em solução padrão pH 4,00. Sempre limpando com água purificada e secando

com papel absorvente entre uma solução e outra.

As amostras foram retiradas do acondicionamento refrigerado e a análise procedida

após alcançarem a temperatura ambiente. A medida foi feita pela imersão o eletrodo nas

formulações, aguardando até a estabilização do valor para registrar a leitura. A cada amostra

foi procedida a limpeza da sonda com água purificada e a secagem com papel absorvente.

O pH foi medido em pHmetro (PHTEK – PHS-3B – PH Meter Model) localizado no

laboratório de Análise Farmacêutica e Controle de Qualidade, da Faculdade de Farmácia da

UFF.

Comportamento Reológico

As medidas reológicas das diferentes amostras descritas no item 4.2.3 foram

realizadas em temperatura ambiente com o emprego do Reômetro Rotacional Rotovisco –

Haake RV 2, de cilindros concêntricos, localizado no Laboratório de Termodinâmica e

Reologia, no Instituto de Química da UFF.

O sistema de cilindros concêntricos ou co-axiais é munido de dois cilindros de

diâmetros diferentes, sendo o externamente estacionário e o interno rotacional. A amostra foi

colocada entre estes dois e sofre cisalhamento do cilindro interno (ou spindle).

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A amostra foi colocada conforme indicado na Figura 11, a velocidade de rotação foi

crescente de 0,1 a 512 RPM. E o spindle utilizado foi SV II. A partir dessas velocidades e

seus resultados pode-se obter os valores de Taxa de Cisalhamento (γ), Tensão de

Cisalhamento (τ) e Viscosidade Absoluta (η).

Figura 11: Desenho esquemático do reômetro rotacional de cilindros concêntricos.

(Adaptado TREVISAN (2011)).

Avaliação do potencial zeta

Avaliação do potencial zeta das diferentes amostras descritas na Tabela 7 (página 54)

foi executada conforme descrito anteriormente (item 4.2.1.2, página 52) em subitem da

determinação da CMC de géis de papaína 4,0% (p/p) com tensoativo.

.

Amostra

Cilindro Rotatório

Cilindro Estacionário

Sensor de Torque

Motor

Obtenção dos Resultados

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Determinação da concentração de papaína ativa pela avaliação da atividade proteolítica

em géis de papaína a 4,0% (p/p)

Em 1977, Kanaoka descreveram o uso de reagentes orgânicos, derivados amino

cumarínicos (MCA), com capacidade fluorescente. Neste estudo eles observaram reações de

hidrólise com o substrato benzoil-L-arginina-4-metilcumarina-7-amina dando origem ao

produto 7-amino-4-metilcumarina. A linearidade da fluorescência em relação ao tempo de

incubação é proporcional a concentração das enzimas, seja tripsina ou papaína, pois estas

agirão como catalisadoras da reação de hidrólise. A reação pode ser observada na Figura 12.

Os autores ainda apresentam este método como sendo 100 vezes mais sensível quando

comparado com a do substrato cromogênico benzoil-L-arginina-ρ-nitroanilida. (KANAOKA,

1977)

Figura 12: Reação de fluorescência catalisada pela papaína (Adaptado Kanaoka (1977)).

Legenda: 1) n-Benzoil-L- arginina-4-metilcumarina-7-amida (BZ-L-Arg-MCA) 2) 7-amino-4-metilcumarina

Desta forma, para a quantificação da atividade da papaína foi utilizado o cloridrato

de carbobenzoxi-L-fenilalanil-L-arginina 4-metilcumarina-7-amido (N-CBZ-PHE-ARG-7-

MCA). Esta substância terá sua hidrólise catalisada pela papaína liberando o produto

fluorescente, 4-metilcumarina-7-amido, o qual é detectável mesmo em baixas concentrações.

Empregaram-se os filtros de excitação de 360 nm e emissão de 460 nm, enquanto o ganho foi

programado para 1500.

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Para medir a atividade proteolítica da papaína, mesmo quando incorporada em

formulações, foi utilizada a espectrofluorimetria por método de microplacas. Uma

metodologia descrita por Kanaoka et al. (1977), e validada por Miura (2012).

O ensaio foi realizado em Espectrofluorímetro de microplacas de 96 poços

(Fluorímetro – FLUOstar OPTIMA), locado na Central Analítica do Programa de Pós-

Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da UFF.

Foram utilizadas as seguintes soluções:

a) Solução tampão de fosfato-cisteína-EDTA

Em balão volumétrico de 500 mL colocou-se 3,55 g de fosfato de sódio dibásico

anidro os quais foram dissolvidos em 400 mL de água ultra-pura. Adicionou-se 7,00 g de

EDTA dissódico e 2,74 g de cloridrato de cisteína anidro, e então se completou o volume com

água ultra-pura e agitou-se até total dissolução. O pH foi adequado para 6,0 (± 0,1) com

solução de hidróxido de sódio 10% (p/p).

b) Solução do substrato N-CBZ-PHE-ARG-7-MCA

Em frasco de vidro âmbar pesa-se exatamente 25 mg do substrato N-CBZ-PHE-

ARG-7-MCA os quais foram solubilizados em 38 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Uma

alíquota de 400 µL desta solução foi transferida para um balão volumétrico de 25 mL. O qual

teve seu volume completado com solução tampão e homogeneizado sob agitação.

c) Solução de ácido acético 30% (v/v)

Para um balão volumétrico de 100 mL foi transferido 30 mL de ácido acético glacial

e o seu volume foi completado com água purificada, após foi homogeneizado sob agitação.

Em cada poço da microplaca, adicionaram-se:

• 55 µL da solução tampão,

• 125 µL da solução do substrato,

• 20 µL de papaína (gel de papaína ou padrão de papaína) e

• 40 µL de solução de ácido acético 30% (v/v), com o objetivo interromper a reação de

hidrólise.

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As soluções, bem como a placa, foram mantidas em banho de gelo, durante todo o

tempo de preparo da microplaca. Posteriormente a placa foi colocada no aparelho de

fluorimetria e incubada a 40ºC por 45 minutos. A cada 15 minutos a reação foi interrompida

com a adição da solução de ácido acético 30% (v/v), iniciando no tempo zero e terminando

em 45 minutos. O experimento foi realizado em triplicata.

O esquema da microplaca está representado na Figura 13. Os poços em cor cinza

representam a análise de uma amostra: as quatro linhas (A, B, C, D) são referentes ao tempo

de reação (0, 15, 30 e 45 minutos) e as três colunas, às repetições (triplicata).

Figura 13: Esquema da microplaca de 96 poços para análise de uma amostra.

Gráficos com os valores de fluorescência médio em função do tempo de reação

foram confeccionados, obtendo-se assim a velocidade da reação (aumento da fluorescência

por minuto), uma vez que há relação entre o aumento da velocidade de fluorescência em

função da concentração de papaína.

Curva de Calibração

Para a construção da curva de calibração foram pesados exatamente 25 mg de

papaína padrão secundário 30.000 USP-U/MG, os quais foram transferidos para balão

volumétrico de 250 mL. O volume foi completado com solução tampão fosfato de cisteína-

EDTA (conforme 4.2.3.1.5 item a) sob agitação e procedeu-se a homogeneização.

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Desta solução, foram transferidas alíquotas de 180 µL, 300 µL, 600 µL, 1200 µL e

1500 µL para 05 balões volumétricos de 100 mL e seus volumes foram completados com

solução tampão fosfato de cisteína-EDTA e homogeneizados. As soluções foram avaliadas

conforme procedimento descrito anteriormente no item 4.2.3.5. A partir das diluições

supracitadas, em cada poço da microplaca, foram obtidas as concentrações finais de: 0,45;

0,75; 1,50; 3,00 e 3,75 USP-U/mL, respectivamente.

4.2.3 Estudo de estabilidade de géis de papaína a 4% (p/p)

O estudo de estabilidade fornece indicações sobre o comportamento do produto,

conforme as suas particularidades de qualidade e potência, em determinado intervalo de

tempo, frente a condições ambientais a que possa ser submetido, desde a preparação até o

término da validade. Logo este estudo tem o objetivo de estabelecer ou confirmar a vida

média projetada, ou seja, estimar, definir ou ainda acompanhar o prazo de validade, para fins

de registro e comercialização de produtos, bem como aperfeiçoamento de formulações. Deve-

se lembrar que a partir do conhecimento da estabilidade de uma preparação será possível

determinar as condições de estocagem do produto (BRASIL, 2005).

Avaliaram-se as formulações de P1 a P9, por meio das características sensoriais;

físico-químicas: de pH, de potencial zeta e de reologia, além da atividade proteolítica, 24

horas após sua produção e armazenagem sob refrigeração, sendo este considerado D1 (dia 1).

As mesmas análises foram realizadas em 7 dias (D7), 15 dias (D15), 23 dias (D23) e 30 dias

(D30) (BRASIL, 2004; BRASIL, 2005).

Na busca por valores que não distorcessem a realidade, optou-se por trabalhar a

redução da atividade proteolítica a partir da equação abaixo (Equação 2). Esta que representa

a taxa percentual de redução da concentração de papaína ativa (TRP) considerando a

concentração final, a inicial e a diferença de dias transcorridos.

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Equação 2:

Onde: PAF = Concentração de papaína ativa final PAi= Concentração de papaína ativa inicial tF = Tempo (em dias) final ti = Tempo (em dias) inicial

4.2.5 Análise Estatística

Para avaliação dos dados quanto à estatística descritiva (média, desvio padrão,

coeficiente de variação) usou-se o Microsoft Office Excel®, versão 2003. Para análise de

variância e diferença significativa entre os grupos de dados usou-se o ASSISTAT® versão 7.7

beta (2014), empregando a ANOVA, seguida pelo teste Tukey, adotando-se a significância de

5% (p<0,05). Para tratamentos gráficos utilizou-se o OriginPro®, versão 8.

O programa Statistica®, versão 7.0 foi usado para os cálculos das variáveis do desenho

experimental 33, determinação do modelo a ser usado e estudo de superfície resposta dos géis

de papaína a 4,0% (p/p) com variação de tensoativo, cisteína e tempo.

Fontes de variabilidade que pode ter um impacto sobre a qualidade do produto devem

ser identificadas, adequadamente entendida, e posteriormente controlada. Entendendo fontes

de variabilidade e seus impactos a jusante pode-se proporcionar uma oportunidade para mudar

a montante controles e minimizar a necessidade de testes no produto final (ICH, 2009).

O estudo da Metodologia de Superfície de Resposta (RSM) é uma técnica que consiste

em encontrar a região que contem a melhor resposta da variável dependente (atividade

proteolítica) em relação às variáveis independentes (concentração de adjuvantes) e dessa

forma apontar o resultado ótimo, o qual maximize os resultados do sistema complexo

(COMPARINI, 2015; LENTH, 2009).

PAF – PAi TRP = PAi x 100

tF - ti

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Quando se quer estudar a influência das variáveis se faz necessário codificá-las. Todas

deverão oscilar dentro de uma mesma escala proporcionando que cada uma tenha a mesma

potência para a determinação da área sobre a curva (LENTH, 2009).

Por exemplo, no desenho experimental tem-se como ponto central a concentração de

tensoativo em 0,7% (p/p), no limite inferior 0,4% (p/p) e no superior 1,0% (p/p); ou seja, as

concentrações extremas distanciam-se igualmente do ponto central. O mesmo é traçado para a

as concentrações de cisteína, onde temos: 0,000; 0,025 e 0,05% (p/p) e para o tempo: 1; 15 e

30 dias.

Para a determinação do melhor modelo investigou-se o uso ou não de equação

polinomial, bem como se o modelo estaria mais adequado considerando a inexistência de

interações entre os componentes (cisteína, tensoativo e tempo), ou interação de forma linear,

ou ainda interações lineares e quadráticas concomitantes.

Nessa investigação seguiu-se o critério de avaliação dos histogramas de resíduos

brutos e valores preditos com o mínimo de lacunas em X. Miller e Miller (2000) indicam que

também se faz necessária a obtenção de uma reta com resíduos de pequena magnitude, para a

ponderação dos resíduos para avaliação do ajuste do modelo empírico.

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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4% (P/P)

UTILIZANDO TENSOATIVO COMO AGENTE SOLUBILIZANTE.

O estabelecimento da composição das formulações apresentadas na Tabela 5A e B

(pag. 49), foi baseado em primeiro momento na formulação proposta por Miura (2012), que

avaliou o gel de papaína a 4% (p/p), associado aos adjuvantes: cisteína; EDTA e

propilenoglicol. Como suas formulações apresentaram-se heterogêneas, este trabalho dedicou-

se em estudar uma melhor forma de solubilização para a papaína e dos adjuvantes sugeridos.

Optou-se por fazer uso de polissorbato 80, pela sua resistência a alterações de pH,

bem como por sua ampla compatibilidade com substância aniônicas, catiônicas, boa

miscibilidade com substâncias hidrossolúveis e lipossolúveis (FERREIRA, 2008). Além

disso, os polissorbatos possuem baixa toxicidade e irritabilidade. Estes tensoativos são aceitos

na Europa como aditivos alimentares; nos EUA eles estão presentes no Guia de Ingredientes

Inativos do FDA que autoriza seu uso em preparações parenterais, enterais, entre outras; no

Reino Unido eles são licenciados para uso em medicamentos parenterais e não-parenterais

(LAWRENCE, 2006).

Para usufruir da qualidade de solubilizante dos tensoativos, é necessário estudar a

concentração na qual o tensoativo passa a formar micelas. É importante ter ciência que a

concepção micelar ocorrerá em concentrações diferentes para cada formulação (SINKO,

2008; GUZMÁN, 2010).

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5.1.1 Concentração Micelar Crítica de Géis de Papaína a 4,0% (p/p) com Tensoativo

Avaliação da CMC pela tensão superficial

As formulações manipuladas conforme Tabela 5A e 5B (pag. 49), foram avaliadas

quanto a tensão superficial. A medição da tensão superficial das amostras, em triplicata de

lotes, resultou nos valores representados nas Tabelas 9 e 10, para as preparações com e sem

cisteína, respectivamente. Para o estabelecimento da CMC construiu-se gráficos de tensão

superficial por concentração de tensoativo representados nas Figuras 14 a 17.

Tabela 9: Valores de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série com cisteína.

Preparações Concentrações de

Polissorbato 80 (%, p/p) Tensão Superficial

(dyn/cm)*

G1.5 C/CYS ZERO 0,000 211,38 (±11,32)

G1.5 C/CYS P80-0.05 0,050 200,79 (±5,26)

G1.5 C/CYS P80-0.075 0,075 193,97 (±4,69)

G1.5 C/CYS P80-0.10 0,100 197,31 (±4,24)

G1.5 C/CYS P80-0.30 0,300 190,17 (±2,28)

G1.5 C/CYS P80-0.50 0,500 187,73 (±1,96)

G1.5 C/CYS P80-1.00 1,000 189,43 (±3,87)

Legenda; Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80 *Média de três determinações para cada concentração com desvio padrão

180,00

190,00

200,00

210,00

220,00

230,00

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1

Concentração de Polissorbato 80 (%, p/p)

Te

nsã

o S

up

erfi

cia

l

(dyn

/cm

)

Figura 14: Gráfico da Tensão Superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série com cisteína

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A partir do gráfico da figura 14 pode-se ter uma idéia da localização da

Concentração Micelar Crítica, observando a inflexão da curva, em valores próximos a 0,05 e

0,1% de tensoativo. Porém, para maior exatidão foram extrapoladas 2 retas, uma

considerando os valores em queda da tensão superficial e outra considerando o platô. Cada

reta deu origem a uma equação (equações 3 e 4) e pela da interseção dessas retas obteve-se o

valor de 0,09765 para a Concentração Micelar Critica da série de géis de papaína a 4% (p/p)

na presença de 0,05% (p/p) de L-cisteína.

180,00

190,00

200,00

210,00

220,00

230,00

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1Concentração de Polisorbato 80 (%, p/p)

Te

nsã

o S

up

erf

icia

l (d

yn/c

m)

Figura 15: Representação gráfica do cálculo das equações de reta usadas para o estabelecimento da CMC no

gráfico de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série com cisteína

Equação 3:

y = -229,28x + 211,6 R2 = 0,9957

Equação 4:

y = -0,2077x + 189,23 R2 = 0,0036

Onde: y = Tensão Superficial; x = Concentração de Tensoativo (polissorbato 80) (%; p/p); R2= coeficiente de correlação linear

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Os gráficos de tensão superficial da série de géis de papaína que não tiveram a

inclusão de cisteína foram analisados da mesma forma permitindo a obtenção das equações de

reta 5 e 6. Inicialmente a avaliação visual indicava um valore de CMC na faixa de 0,1 a 0,3%

de polissorbato 80. A intercessão das retas indicou o valor de 0,20495 para a Concentração

Micelar Critica da série de géis de papaína a 4% (p/p) sem a presença de cisteína.

Tabela 10: Valores de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série de preparações sem cisteína.

Preparações Concentrações de

Polissorbato 80 (%, p/p)

Tensão Superficial

(dyn/cm)*

G1.5 S/CYS ZERO 0,000 221,00 (±4,60)

G1.5 S/CYS P80-0.05 0,050 221,83 (±8,51)

G1.5 S/CYS P80-0.10 0,100 213,13 (±9,45)

G1.5 S/CYS P80-0.20 0,200 213,70 (±10,23)

G1.5 S/CYS P80-0.30 0,300 203,21 (±12,08)

G1.5 S/CYS P80-0.50 0,500 197,60 (±9,24)

G1.5 S/CYS P80-1.00 1,000 196,47 (±11,64)

Legenda; Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80 *Média de três determinações para cada concentração com desvio padrão

180,00

190,00

200,00

210,00

220,00

230,00

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1

Concentração de Polissorbato 80 (%, p/p)

Te

nsã

o S

up

erfi

cia

l (d

yn/c

m)

Figura 16: Gráfico da Tensão Superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série sem cisteína

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68

180,00

190,00

200,00

210,00

220,00

230,00

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1Concentração de Polissorbato 80 (%, p/p)

Ten

são

Su

perf

icia

l (d

yn/c

m)

Figura 17: Representação gráfica do calculo das equações de reta usadas para o estabelecimento da CMC no

gráfico de tensão superficial dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série sem cisteína

Equação 5:

y = -78,667x + 222,59 R2 = 0,6713

Equação 6:

y = -2,9915x + 207,08 R2 = 0,4296

Onde: y = Tensão Superficial; x = Concentração de Tensoativo (polissorbato 80) (%; p/p); R2= coeficiente de correlação linear

O trabalho de Barreiro-Iglesias, Alvarez-Lorenzo e Concheiro (2003) que estudou a

interação entre polissorbato 80 e carbômeros demonstra a alta tensão na superfície do sistema,

pois na presença de carbômero, a concentração de polissorbato 80 na superfície diminui à

medida que o tensoativo é adsorvido sobre o polímero, de forma a estabilizar-se no interior da

rede polimérica.

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A diferença dos valores de CMC que se observa entre as duas séries de géis, com e

sem cisteína, pode ser devido a presença de cargas efetivas produzidas pela cisteína em

solução alterando a organização das micelas.

Este achado é semelhante ao obtido no estudo feito por Guzmán (2010), estudo este

que observou a influência de ânios, como a Cisteína, sobre as propriedades físicas dos

líquidos, os quais alteram: a solubilidade de líquidos iônicos em água; a formação micelar e

tão logo a tensão superficial.

Guzmán (2010) verificou que na presença de ânions pode-se observar que a tensão

superficial é reduzida, porém a formação de agregados é desfavorecida.

Quando se compara a ação de íons cloreto e brometo sobre a formação de micelas em

sistemas aquosos, indicando que o tamanho dos íons não é, por si só, suficiente para inibir o

processo de agregação que ocorre a uma faixa de concentração baixa, sendo a explicação

baseada na coatropicidade2 do ânion brometo, ou seja, estes são mais facilmente adsorvidos

sobre a superfície dos agregados, reduzindo assim, a repulsão eletrostática e facilitando a

agregação. Enfim, com o tamanho aumentado do ânion a solubilidade do líquido iônico em

água é bastante reduzida, o que dá a entender a ocorrência da formação de uma nova fase

líquida intermediária, termodinamicamente mais estável, que à formação de agregados

(GUZMÁN, 2010).

Cabe ressaltar que o raio cristalográfico da cisteína é igual a 5,156x10-10m

(HARDIRNG e LONG; 1968) enquanto que o do cloreto esta entre 1,41x10-10 e 2,00x10-10 m

(TUBINO e SIMONI; 2007), ou seja encontra-se na mesma ordem de grandeza, sendo o raio

cristalográfico da cisteína apenas entre 2,58 e 3,65 vezes maior.

Em suma, quando se aumenta o tamanho do ânion a solubilidade do líquido iônico

em água é consideravelmente reduzida, sugerindo a formação de uma segunda fase líquida,

onde se tem um líquido iônico puro termodinamicamente mais estável do que a formação de

agregados em solução, ou seja, um grande ânion reduz a tensão superficial, diminuindo

também a CMC, mas não favorece a formação de agregados. Desta forma pode-se dizer que

os ânions poderão induzir a separação de fases, ainda antes da possibilidade de agregação

(GUZMÁN, 2010). 2 Coatropicidade: poder de desestabilizar uma molécula, desde a água ou até mesmo uma enzima, enquanto que cosmotropicidade é o poder de estabilizá-la (MEDEIROS, 2013).

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70

Os géis que utilizam carbômero 940 como excipiente podem sofrer alterações na

consistência em função dos valores de pH alcançados na preparação final. Conhecendo-se esta

fragilidade dos produtos optou-se por verificar se todas as preparações utilizadas para o

cálculo do CMC encontravam-se dentro da faixa de pH condizente com a consistência mais

estável dos géis de carbomero (pH 5,5 e 7,0). Os valores de pH das preparações, apresentados

na Tabela 11, indicam que todos os géis avaliados encontravam-se dentro da faixa de pH onde

a viscosidade sofre menor influência. Cabe ressaltar que o valor de pH do gel base foi de 6,14

(±0,17).

Tabela 11: Valores de pH dos géis de papaína a 4,0% (p/p) das duas séries de preparações.

pH*

Preparações Série 1 Preparações Série 2

G1.5 C/CYS ZERO 5,95 (±0,31) G1.5 S/CYS ZERO 5,77 (±0,26)

G1.5 C/CYS P80-0.05 5,75 (±0,22) G1.5 S/CYS P80-0.05 5,87 (±0,20)

G1.5 C/CYS P80-0.075 5,72 (±0,26) G1.5 S/CYS P80-0.10 5,76 (±0,24)

G1.5 C/CYS P80-0.10 5,71(±0,29) G1.5 S/CYS P80-0.20 5,75 (±0,28)

G1.5 C/CYS P80-0.30 5,69 (±0,25) G1.5 S/CYS P80-0.30 5,73 (±0,34)

G1.5 C/CYS P80-0.50 5,75 (±0,22) G1.5 S/CYS P80-0.50 5,66 (±0,36)

G1.5 C/CYS P80-1.00 5,70 (±0,29) G1.5 S/CYS P80-1.00 5,68 (±0,36)

Legenda; Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80 *Média de três determinações para cada concentração com desvio padrão

A avaliação estatística dos valores de pH entre os lotes usados no estudo indicou que

as amostras não diferiram entre si, com significância de 0,05, assim como também não houve

diferença significativa entre os géis das séries com e sem cisteína..

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71

Avaliação do potencial zeta

O potencial zeta (ζ) é a diferença de potencial entre a camada fortemente ligada (plano

de deslizamento) e a região eletricamente neutra da solução (Figura 18) (SINKO, 2008).

Para verificação do potencial zeta utiliza-se o fenômeno da eletroforese, que envolve

movimento de partículas carregadas pela da fase móvel devido a diferença de potencial

fornecida ao sistema. As partículas carregadas migram para eletrodos com carga oposta e a

velocidade dessa migração depende da carga que envolve a partícula. Conhecendo-se a

direção e a velocidade dessa migração, pode-se determinar o potencial zeta (SINKO, 2008).

A estabilidade de sistemas contendo partículas dispersas pode ser verificada a partir do

potencial zeta (ζ), o qual governa o grau de repulsão entre as partículas dispersas adjacentes

de cargas semelhantes. Se o potencial zeta tem valores entre -30 e 30 (abaixo de |30|),

significa que as forças de atração sobrepõem-se as forças de repulsão entre elas, e haverá,

então, maior possibilidade de agregação dessas partículas (SINKO, 2008). Pode-se dizer que

os sistemas terão maior estabilidade quando seu potencial zeta estiver em valores maiores de

30 e menores de -30 (acima de |30|).

Figura 18: Desenho esquemático da dupla camada elétrica, segundo o modelo de Stern, das cargas presentes na

superfície da partícula que fornecerão valores de potencial zeta. (Adaptado: http://imk209.wikispaces.com/TWL+Electrical+Double+Layer)

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72

Os valores de potencial zeta das amostras das duas séries em estudo (Tabela 5A e B,

pag. 49) estão representados na Tabela 12.

Tabela 12: Valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p) das duas séries de preparações.

Potencial Zeta (mV)*

Preparações Série 1 Preparações Série 2

G1.5 C/CYS ZERO -38,20 (±0,95) G1.5 S/CYS ZERO -48,05 (±0,85)

G1.5 C/CYS P80-0.05 -38,01 (±4,72) G1.5 S/CYS P80-0.05 -46,49 (±4,19)

G1.5 C/CYS P80-0.075 -35,00 (±1,84) G1.5 S/CYS P80-0.10 -45,01 (±0,65)

G1.5 C/CYS P80-0.10 -39,16 (±0,80) G1.5 S/CYS P80-0.20 -46,51 (±0,19)

G1.5 C/CYS P80-0.30 -39,11 (±5,32) G1.5 S/CYS P80-0.30 -42,11 (±1,50)

G1.5 C/CYS P80-0.50 -36,84 (±2,49) G1.5 S/CYS P80-0.50 -41,23 (±0,04)

G1.5 C/CYS P80-1.00 -38,45 (±1,63) G1.5 S/CYS P80-1.00 -44,55 (±2,76)

Legenda; Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80 *Média de três determinações para cada concentração com desvio padrão

Em um primeiro momento, pela comparação os valores de potencial zeta das

preparações com e sem cisteína, observa-se um fato de grande relevância: as amostras com

mesma concentração de tensoativo das duas séries apresentam valores distintos, sendo os

aqueles encontrados nas preparações com cisteína sempre menores. A cisteína, por ser

aniônica, adiciona cargas negativas ao sistema modificando a distribuição das cargas e

tornando a partícula menos negativa e, consequentemente, reduzindo o valor do potencial

zeta. Quanto mais próximo de zero for o valor dessa grandeza, menores serão as forças

repulsivas e, por tanto, ocorre o aumento da tendência de agregação de uma partícula a outra

elevando a possibilidade de precipitação. Guzmán (2010), ao avaliar sistemas aquosos,

demonstrou que a presença do ânion brometo favorece a sua adsorção na superfície das

particulas, reduzindo a repulsão eletrostática e facilitando a agregação.

Vale ressaltar que todos os géis de papaína a 4,0% (p/p) deste estudo apresentam

valores, em modulo, de potencial zeta maiores que 30 indicando que estes sistemas dispersos

encontram-se em condições estáveis de distribuição de cargas.

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73

Os gráficos de potencial zeta pela concentração de polissorbato 80 (Figuras 19 e 20)

indicam, nas duas séries de amostras, que em determinadas concentrações ocorre alterações

significativas no comportamento da curva. É interessante perceber que este fenômeno

acontece nas mesmas concentrações apontadas no gráficos de tensão superficial (Figuras 17 e

18) como sendo a Concentração Micelar Critica. Os dados obtidos nesse trabalho sugerem a

exitência de uma relação entre os valores de potencial zeta e tensão superficial, porém não foi

possível a confirmação quantitativa dessa relação linear. Essa observação enfatiza-se o já dito

por Guzmán (2010), a presença de cisteína afeta a formação micelar.

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,10

-10

-20

-30

-40

-50

Pot

enci

al Z

eta

(m

V)

Concentraçao de Polissorbato (%, p/p)

Figura 19: Gráfico de Potencial Zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série com cisteína

-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,10

-10

-20

-30

-40

-50

Pot

enci

al Z

eta

(m

V)

Concentraçao de Polissorbato (%, p/p)

Figura 20: Gráfico de Potencial Zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p) da série sem cisteína

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74

5.2 CARACTERIZAÇÃO DE GÉIS DE PAPAÍNA A 4% (P/P) UTILIZANDO

TENSOATIVO COMO AGENTE SOLUBILIZANTE

O estudo da Concentração Micelar Crítica em géis de papaína a 4% permitiu

estabelecer as faixas de concentrações de polissorbato 80 e L-cisteína que seriam utilizadas

para o desenvolvimento das preparações deste estudo. As concentrações de polissorbato 80

deveriam estar acima dos valores da CMC para as duas séries estudas anteriormente. O

planejamento das formulações foi baseado em um desenho experimental de 33, onde as

variáveis consideradas foram concentração de cisteína (valores entre 0,000 e 0,050% p/p);

concentração de tensoativo (valores entre 0,400 e 1,000% p/p) e o tempo de estudo (Tabela

13). Os demais itens mantiveram-se suas concentrações constantes em todas as preparações

de: 4% para a papaína, 0,16% de EDTA e 10% Propilenoglicol e quantidade suficiente para

atingir o 100% de gel base.

Todas as amostras foram armazenadas sob refrigeração durante 30 dias. As

avaliações de todos os parâmetros escolhidos foram realizadas em 5 tempos: D1 (24 horas

após a produção), D7 (7 dias), D15 (15 dias), D23 (23 dias) e D30 (30 dias de preparação e

armazenagem). As avaliações realizadas foram: características sensoriais; pH, potencial zeta

comportamento reológico e atividade proteolítica (BRASIL, 2004; BRASIL, 2005). Todas as

análises foram realizadas em dois lotes distintos dos géis.

Tabela 13: Valores de L-cisteína e Polissorbato 80 nas formulações de géis de papaína a 4,0% (p/p).

Substâncias % (p/p) Preparações Cys P80

P1 0,000 0,400 P2 0,000 0,700 P3 0,000 1,000 P4 0,025 0,400 P5 0,025 0,700 P6 0,025 1,000 P7 0,050 0,400 P8 0,050 0,700 P9 0,050 1,000

Legenda: Cys = L-Citeína; P80 = Polissorbato 80

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75

5.2.1 Caracterização dos Géis de Papaína a 4,0% (p/p) em D1

As formulações assim que produzidas foram armazenadas em recipiente de vidro

transparente envoltas de papel alumínio e vedadas com Parafilm® e fechadas com tampa

específica e imediatamente acondicionadas sob refrigeração (5ºC±3). Conforme descrito por

Capucho (2008) e Miura (2012) aguardou-se o prazo de 24 horas para efetuar as análises no

chamado dia 1 (D1).

Características Sensoriais

As formulações foram avaliadas quanto ao seu aspecto, cor e odor. Os resultados

estão apresentados na Tabela 14 e na Figura 21. Todas as formulações apresentaram aspecto

homogêneo, uma leve coloração amarelada e odor característico da mistura de papaína e

polissorbato 80.

Tabela 14: Características sensoriais dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1 .

Características Preparações

Aspecto Cor Odor

P1 Ho A C

P2 Ho A C

P3 Ho A C

P4 Ho A C

P5 Ho A C

P6 Ho A C

P7 Ho A C

P8 Ho A C

P9 Ho A C

Legenda: Ho – Homogêneo; A – Amarelado; C – Característico

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76

Estudos anteriores com géis de papaína a 4,0% (p/p) relatam que as preparações

apresentavam aspecto heterogêneo, com precipitados, desde o momento de sua preparação.

indicando a dificuldade de solubilizar a papaína em géis de carbômero 940 (Miura, 2012),

Todas as preparações desenvolvidas nesse estudo apresentaram-se homogêneas, sem a

presença de qualquer tipo de precipitado (Figura 21). A inclusão de polissorbato 80 nas

formulações como agente solubilizante, em valores acima da concentração micelar crítica

para os sistemas com ou sem L-cisteína, foi eficiente para a obtenção de preparações dentro

das condições tecnicamente exigidas.

P1 P2 P3

P4 P5 P6

P7 P8 P9

Figura 21: Diapositivos de amostras dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1

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77

Avaliação de pH

Os valores de pH das preparações estão apresentados na Tabela 15. Observa-se que

ocorreu uma leve queda nos valores de pH quando comparado com o gel base (pH 6,00), isso

ocorre pela adição da papaína e da cisteína que são levemente ácidas. Ao analisar os valores

obtidos para pH, não foram verificadas diferenças estatísticas entre os valores de pH, ao nível

de significância de 0,5, das preparações.

Tabela 15: Valores de pH dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1

Preparações (% p/p) Valores de pH*

P1 (0,000% Cys / 0,4% P80) 5,89 (±0,34)

P2 (0,000% Cys / 0,7% P80) 5,98 (±0,40)

P3 (0,000% Cys / 1,0% P80) 5,90 (±0,37)

P4 (0,025% Cys / 0,4% P80) 5,84 (±0,23)

P5 (0,025% Cys / 0,7% P80) 5,84 (±0,10)

P6 (0,025% Cys / 1,0% P80) 5,84 (±0,12)

P7 (0,050% Cys / 0,4% P80) 5,81 (±0,23)

P8 (0,050% Cys / 0,7% P80) 5,77 (±0,08)

P9 (0,050% Cys / 1,0% P80) 5,72 (±0,03)

Legenda; Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80 *Média de três determinações para cada concentração com desvio padrão

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78

Comportamento Reológico

As 9 formulações foram analisadas quanto ao seu comportamento reológico em

intervalos de velocidade de 0,1 a 512 RPM utilizando o Reômetro Rotacional Rotovisco de

cilindros concêntricos. Os resultados estão apresentados na Figura 22 e na Tabela 16.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

-1,0

5

-0,7

5

-0,4

5

-0,1

5

-0,0

5

0,1

5

0,2

5

0,4

5

0,5

5

0,7

6

0,8

5

1,0

6

1,1

5

1,3

6

1,4

5

1,6

6

1,7

6

2,0

6

2,3

6

2,6

6

log taxa cisalhamento

log

vis

cosi

dade

abs

olu

ta

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Figura 22: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta x taxa de cisalhamento de géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1

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79

Tabela 16: Valores de Viscosidade Absoluta em função da velocidade e taxa de cisalhamento dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1

ηηηη (Viscosidade Absoluta – mPa.s) Velocidade (RPM)

γγγγ (Taxa de cisalhamento – s-1) P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

0,10 0,089 6337,079 6759,551 7604,494 6759,551 8449,438 5914,607 5914,607 5914,607 7182,022

0,20 0,178 3379,775 3379,775 3168,539 3379,775 4224,719 2957,303 2957,303 2957,303 3168,539

0,40 0,356 1584,270 1689,888 1584,270 1689,888 2112,360 1478,652 1478,652 1478,652 1478,652

0,80 0,712 792,135 818,539 739,326 844,944 924,157 739,326 739,326 739,326 739,326

1,00 0,890 633,708 549,213 633,708 971,685 675,955 633,708 823,820 697,079 591,461

1,60 1,424 382,865 396,067 396,067 448,876 462,079 369,663 369,663 369,663 369,663

2,00 1,780 295,730 295,730 327,416 485,843 359,101 316,854 369,663 337,978 295,730

3,20 2,848 184,831 204,635 198,034 217,837 211,236 184,831 184,831 184,831 184,831

4,00 3,560 147,865 153,146 168,989 253,483 174,270 158,427 147,865 168,989 147,865

6,40 5,696 95,716 99,017 85,815 105,618 105,618 89,115 82,514 85,815 82,514

8,00 7,120 73,933 76,573 68,652 126,742 89,775 79,213 79,213 84,494 73,933

12,80 11,392 44,558 46,208 46,208 47,858 49,508 41,257 41,257 41,257 41,257

16,00 14,240 36,966 38,287 39,607 63,371 39,607 39,607 39,607 40,927 36,966

25,60 22,784 22,279 23,104 23,104 26,404 24,754 19,803 20,629 20,629 20,629

32,00 28,480 18,483 18,483 19,803 31,685 19,803 19,803 18,483 19,803 17,823

51,20 45,568 10,727 12,377 8,251 14,027 9,077 8,251 11,552 8,251 8,664

64,00 56,960 8,581 8,912 9,902 16,503 3,301 9,242 9,242 9,902 8,581

128,00 113,920 4,621 4,951 4,951 7,921 4,951 4,786 3,961 4,951 4,951

256,00 227,840 2,475 1,568 1,815 1,980 1,898 1,733 1,485 1,733 1,815

512,00 455,680 1,238 1,279 1,238 1,320 1,155 1,238 1,444 1,238 1,155

.

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80

A partir da visualização da Figura 22 pode-se dizer que todas as amostras

apresentaram comportamento pseudoplástico, pois a viscosidade absoluta diminui

gradativamente com o aumento da velocidade de rotação e, consequentemente, da taxa de

cisalhamento. Este comportamento é o desejável quanto à preparação semi-sólida de uso em

feridas, pois se almeja que o produto espalhe-se facilmente sem escorrer.

Avaliação do potencial zeta

Os valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1 estão

registrados na Tabela 17 e na Figura 23. Observa-se que os valores de potencial zeta de todas

as preparações estão acima de |30| mV indicando que estes géis são termodinamicamente

estáveis.

Tabela 17: Valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1

Preparações (% p/p) Potencial Zeta (mV)*

P1 (0,000% Cys / 0,4% P80) -42,25 (±0,64)

P2 (0,000% Cys / 0,7% P80) -37,00 (±7,50)

P3 (0,000% Cys / 1,0% P80) -39,80 (±5,37)

P4 (0,025% Cys / 0,4% P80) -43,40 (±5,80)

P5 (0,025% Cys / 0,7% P80) -55,00 (±2,12)

P6 (0,025% Cys / 1,0% P80) -49,95 (±5,59)

P7 (0,050% Cys / 0,4% P80) -49,30 (±0,71)

P8 (0,050% Cys / 0,7% P80) -49,45 (±0,35)

P9 (0,050% Cys / 1,0% P80) -52,50 (±0,57)

Legenda; Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80 *Média de seis determinações para cada concentração com desvio padrão

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81

P1

P7 P8P9

P5* P6

P2* P3P4

-65,00

-55,00

-45,00

-35,00

-25,00

-15,00

-5,00

Po

ten

cial

Zet

a (m

V)

Figura 23: Histograma dos valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1

Os géis P2 e P5 diferem estatisticamente dos demais e entre si, em nível de

significância de 0,05. A preparação P2 em sua composição não possui cisteína e contem 0,7%

(p/p) de polissorbato 80, enquanto P5 é composto por 0,025% (p/p) de cisteína e 0,7% (p/p)

de polissorbato 80.

Concentração de Papaína ativa a partir da avaliação da Atividade Proteolítica

Curva de Calibração

Os resultados obtidos na curva de calibração da papaína padrão secundário 30.000

USP-U/MG (Merk), são representados na Tabela 18 e Figura 24.

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82

Tabela 18: Resultados experimentais obtidos na curva de calibração da papaína padrão

secundários 30.000 USP-U/MG.

Concentração

(USP-U/mg)

Velocidade* (unidades

de fluorescência/min) CV%

0,45 86,69 (±6,16) 7,11

0,75 147,95 (±24,41) 16,50

1,50 307,90 (± 34,74) 11,28

3,00 679,95 (± 84,49) 12,43

3,75 878,92 (± 93,82) 10,67

*Média de três determinações para cada concentração com desvio padrão

Curva de Calibração

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00

Concentração (USP-U/mg)

Velocidade(Fluorescência/min)

Figura 24: Curva de Calibração da papaína 30.000 USP-U/mg

A equação da reta obtida a partir da curva de calibração (equação 7) indica que o

valor do coeficiente de correlação linear (R2) é 0,9985.

Equação 7:

y = 240,47x - 34,213 R2 = 0,9985

Onde: y = velocidade do aumento de unidade de fluorescência por minuto; x = concentração de papaína em USP-U por mg; R2= coeficiente de correlação linear

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83

A partir dos dados representado na Tabela 18, Figura 24 e Equação 7, pode-se

observar a proporcionalidade entre a concentração de papaína padrão secundário (30.000USP-

U/mg) e o aumento da velocidade na reação de formação de composto fluorescente. O

coeficiente de correlação linear (R2) foi igual a 0,9985; o que corresponde ao valor de

coeficiente de correlação (R) igual a 0,9992, atendendo ao critério mínimo de aceitação de

valor de R>0,99. A obtenção deste valor demonstra linearidade do método analítico

empregado, sendo que o conceito de linearidade encontra-se na Resolução nº 899 da ANVISA

(BRASIL, 2003) descrito como “a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar

que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra,

dentro de um intervalo especificado”.

Os nove dos géis de papaína a 4,0% (p/p) (P1 a P9) foram avaliados quanto a sua

atividade proteolítica usando-se a metodologia desenvolvida por Miura (2012).

Os valores da concentração de papaína ativa dos géis de papaína a 4,0% (p/p) obtidos

a partir da avaliação da atividade proteolítica no decorrer das primeiras 24 horas (D1) estão

apresentados na Tabela 19 e Figura 25.

Tabela 19: Valores de unidade de fluorescência e concentração de papaína ativa dos géis de

papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1

Preparações (% p/p) Unidade de Fluorescência/min

Concentração de papaína ativa (USP-U/mg)

Concentração de papaína

percentual (%)

P1 (0,000% Cys / 0,4% P80) 33,29 224,55 (±7,36) 93,56 P2 (0,000% Cys / 0,7% P80) 32,47 221,83 (±19,6) 92,43 P3 (0,000% Cys / 1,0% P80) 46,39 268,15 (±0,38) 111,73 P4 (0,025% Cys / 0,4% P80) 42,28 254,46 (±32,58) 106,03 P5 (0,025% Cys / 0,7% P80) 33,63 225,68 (±15,83) 94,04 P6 (0,025% Cys / 1,0% P80) 31,01 216,99 (±8,94) 90,41 P7 (0,050% Cys / 0,4% P80) 35,84 233,04 (±25,48) 97,10 P8 (0,050% Cys / 0,7% P80) 37,56 238,76 (±14,51) 99,48

P9 (0,050% Cys / 1,0% P80) 37,08 237,18 (±27,24) 98,82 Legenda; Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80

*Média de 2 lotes com 2 leituras para cada concentração com desvio padrão

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84

150,00

170,00

190,00

210,00

230,00

250,00

270,00

290,00

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9Formulações

Co

ncn

etr

açã

o d

e P

ap

aín

a (

%, p

/p)

Figura 25: Concentração de papaína ativa dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9, em D1

Os resultados de concentração de papaína ativa para as nove preparações em D1

indicam que as todas as amostra mantiveram a concentração de papaína ativa entre 90 e 110%

após 24 horas de preparo. O tratamento de médias para avaliação de significância (teste de

Tukey) realizada para os valores de papaína ativa obtidos indicou que as amostra não

diferiram ao nível de 5% de probabilidade. Para uma avaliação mais aprofundada sobre a

influência de L-cisteína e de polissorbato 80 sobre a atividade da papaína faz-se necessário

estudar os resultados obtidos por meio do estudo de correlações pela metodologia de

superfície de resposta decorrente do planejamento experimental 33. Estes resultados serão

apresentados e avaliados em conjunto com os dados do estudo de estabilidade.

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85

5.2.2 Estudo de estabilidade de géis de papaína a 4,0 % (p/p)

O estudo de estabilidade foi realizado em preparações planejadas a partir um desenho

experimental fatorial de 33 onde as variáveis independentes foram à concentração de cisteína e

de polissorbato e o tempo de armazenagem. Os noves géis foram avaliados em cinco tempos

diferentes (D1, D7, D15, D23 e D30). As amostras foram armazenadas a temperatura de

5°C±2 em frascos de vidro.

Características Sensoriais

A avaliação sensorial permitiu observar que não houve modificações significativas no

decorrer de 30 dias para as amostras em estudo (Tabela 20 e Figura 26). Este comportamento

é semelhante ao observado por Miura (2012) no estudo dos géis de mesma concentração de

papaína.

Tempo em dias

Pre

para

ções

D1 D7 D15 D23 D30

P1

P2

P3

Figura 26: Diapositivos de amostras dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias (continua)

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86

Tempo em dias

Pre

para

ções

D1 D7 D15 D23 D30

P4

P5

P6

P7

P8

P9

Figura 26: Diapositivos de amostras dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias (conclusão)

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87

Tabela 20: Avaliação das características sensoriais das amostras dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias

D1 D7 D15 D23 D30

Características Características Características Características Características Preparações

Aspecto Cor Odor Aspecto Cor Odor Aspecto Cor Odor Aspecto Cor Odor Aspecto Cor Odor

P1 Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C

P2 Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C

P3 Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C

P4 Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C

P5 Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C

P6 Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C

P7 Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C

P8 Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C

P9 Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C Ho A C

Legenda: Ho – Homogêneo; A – Amarelado; C – característico; LM – Levemente Modificado.

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Avaliação de pH

Os resultados obtidos na avaliação do pH nos cinco tempos de análise para as

amostras dos géis de papaína a 4,0% (p/p), estão apresentados na Tabela 21. Esta tabela

também apresenta os percentuais de variação do pH. Os dados encontrados em todas as

análises encontram-se dentro dos valores ótimos para a atividade enzimática da papaína (pH

de 5,0 a 7,0) e dentro da faixa de pH da pele. A pele íntegra é levemente ácida podendo seu

pH variar entre 4,6 a 5,8, enquanto a pele lesada, apresenta uma redução no pH devido a

natureza dos componentes presentes na lesão (LEONARDI et al., 2002). Não foram

verificadas variações significantes nos valores de pH (p=0,05).

Tabela 21: Valores de pH e seus percentuais de variação dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias

Valores de pH* Preparações (% p/p)

D1 D7 D15 D23 D30

P1 (0,000% Cys / 0,4% P80) 5,89 6,01 5,90 5,59 5,72 % variação -1,95 -0,17 5,09 2,97

P2 (0,000% Cys / 0,7% P80) 5,98 5,96 5,88 5,65 5,66 % variação 0,42 1,67 5,52 5,35

P3 (0,000% Cys / 1,0% P80) 5,90 5,96 5,86 5,66 5,67 % variação -1,02 0,76 4,07 3,98

P4 (0,025% Cys / 0,4% P80) 5,84 5,93 5,80 5,65 5,59 % variação -1,63 0,69 3,17 4,28

P5 (0,025% Cys / 0,7% P80) 5,84 6,01 5,85 5,59 5,62 % variação -2,83 -0,17 4,37 3,77

P6 (0,025% Cys / 1,0% P80) 5,84 5,89 5,72 5,62 5,59 % variação -0,86 2,06 3,77 4,20

P7 (0,050% Cys / 0,4% P80) 5,81 5,85 5,74 5,61 5,60 % variação -0,69 1,12 3,36 3,53

P8 (0,050% Cys / 0,7% P80) 5,77 5,80 5,70 5,66 5,60 % variação -0,61 1,21 1,91 2,86

P9 (0,050% Cys / 1,0% P80) 5,72 5,73 5,70 5,64 5,55 % variação -0,09 0,44 1,49 2,97

Legenda; Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80 *Média de duas determinações para cada concentração com % de variação

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89

Comportamento Reológico

Os reogramas das nove preparações dos géis de papaína a 4,0% (p/p) nas cinco

avaliações (D1; D7; D15; D23 E D30) estão expostos nas Figuras 27 a 31.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

-1,0

5

-0,7

5

-0,4

5

-0,1

5

-0,0

5

0,1

5

0,2

5

0,4

5

0,5

5

0,7

6

0,8

5

1,0

6

1,1

5

1,3

6

1,4

5

1,6

6

1,7

6

2,0

6

2,3

6

2,6

6

log taxa cisalhamento

log

vis

cosi

dade

abs

olu

ta

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Figura 27: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

-1,0

5

-0,7

5

-0,4

5

-0,1

5

-0,0

5

0,1

5

0,2

5

0,4

5

0,5

5

0,7

6

0,8

5

1,0

6

1,1

5

1,3

6

1,4

5

1,6

6

1,7

6

2,0

6

2,3

6

2,6

6

log taxa cisalhamento

log

vis

cosi

dad

e ab

solu

ta

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Figura 28: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D7

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90

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

-1,0

5

-0,7

5

-0,4

5

-0,1

5

-0,0

5

0,1

5

0,2

5

0,4

5

0,5

5

0,7

6

0,8

5

1,0

6

1,1

5

1,3

6

1,4

5

1,6

6

1,7

6

2,0

6

2,3

6

2,6

6

log tx cisalhamento

log

vis

cosi

da

de

ab

solu

ta

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Figura 29: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D15

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

-1,0

5

-0,7

5

-0,4

5

-0,1

5

-0,0

5

0,1

5

0,2

5

0,4

5

0,5

5

0,7

6

0,8

5

1,0

6

1,1

5

1,3

6

1,4

5

1,6

6

1,7

6

2,0

6

2,3

6

2,6

6

log taxa cisalhamento

log

visc

osid

ade

abso

luta

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Figura 30: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D23

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

-1,0

5

-0,7

5

-0,4

5

-0,1

5

-0,0

5

0,15

0,25

0,45

0,55

0,76

0,85

1,06

1,15

1,36

1,45

1,66

1,76

2,06

2,36

2,66

log taxa cisalhamento

log

visc

osid

ade

abso

luta

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Figura 31: Gráfico logarítmico da viscosidade absoluta em função da taxa de cisalhamento dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em D30

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91

A comparação dos reogramas permite concluir que com o passar do tempo de 30 dias

as 09 formulações mantiveram o comportamento pseudoplástico.

Foi realizada uma comparação estatística entre as preparações em função do tempo,

usando-se os valores logarítimicos da viscosidade absoluta a uma velocidade de 0,4 RPM, que

corresponde a uma taxa de cisalhamento igual a 0,356 e um valor logarítmico de taxa de

cisalhamento de -0,44855. Os dados estão demonstrados na Tabela 22. As variações de

viscosidade absoluta nesta taxa de cisalhamento, não apresentam diferenças significativas em

um intervalo de confiança de 95% entre as formulações com o passar de 30 dias.

Tabela 22: Valores logarítmicos da viscosidade absoluta na velocidade de 0,4 RPM dos géis

de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias

log viscosidade absoluta Formulações

D1 D7 D15 D23 D30

P1 3,1998 3,1998 3,1377 3,1377 3,2790

P2 3,2279 3,1699 3,1699 3,1377 3,3025

P3 3,1998 3,1699 3,1541 3,1541 3,2668

P4 3,2279 3,1699 3,2141 3,1699 3,2790

P5 3,3248 3,2790 3,1699 3,2141 3,2542

P6 3,1699 3,2668 3,1699 3,1541 3,2790

P7 3,1699 3,3460 3,3248 3,1541 3,2542

P8 3,1699 3,2279 3,1699 3,3138 3,2668

P9 3,1699 3,2141 3,1699 3,2412 3,2909

Avaliação do potencial zeta

Os valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p) P1 a P9 nos tempos de

1 dia (D1), 7 dias (D7); 15 dias (D15); 23 dias (D23) e 30 dias (D30) estão apresentados na

Tabela 23 e Figura 32.

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92

Tabela 23: Valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias

Potencial Zeta (mV)* Preparações (% p/p)

D1 D7 D15 D23 D30

P1 (0,000% Cys / 0,4% P80) -42,25 (±0,64) -51,35 (±3,75) -49,20 (±4,10) -51,40 (±0,85) -45,60 (±3,68)

P2 (0,000% Cys / 0,7% P80) -37,00 (±7,50) -51,20 (±0,28) -49,25 (±3,04) -50,05 (±0,21) -45,50 (±1,84)

P3 (0,000% Cys / 1,0% P80) -39,80 (±5,37) -52,25 (±2,05) -52,85 (±3,18) -49,00 (±0,99) -43,85 (±0,07)

P4 (0,025% Cys / 0,4% P80) -43,40 (±5,80) -53,00 (±1,27) -49,35 (±3,75) -51,15 (±1,48) -45,35 (±0,35)

P5 (0,025% Cys / 0,7% P80) -55,00 (±2,12) -54,50 (±3,11) -48,55 (±1,41) -50,15 (±0,07) -45,45 (±1,06)

P6 (0,025% Cys / 1,0% P80) -49,95 (±5,59) -53,30 (±0,42) -50,00 (±2,26) -49,00 (±3,82) -45,10 (±3,25)

P7 (0,050% Cys / 0,4% P80) -49,30 (±0,71) -52,50 (±0,00) -51,25 (±1,98) -51,05 (±0,21) -44,15 (±4,03)

P8 (0,050% Cys / 0,7% P80) -49,45 (±0,35) -52,00 (±0,14) -50,50 (±2,40) -48,90 (±1,48) -44,65 (±2,47)

P9 (0,050% Cys / 1,0% P80) -52,50 (±0,57) -46,05 (±0,21) -49,20 (±3,11) -49,75 (±1,63) -43,00 (±4,81)

Legenda; Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80 *Média de seis determinações para cada concentração com desvio padrão

P9P8P7P6P5

P4P1 P2 P3

-65,00

-60,00

-55,00

-50,00

-45,00

-40,00

-35,00

-30,00

-25,00

-20,00

-15,00

-10,00

-5,00

0,00

Formulações

Pot

enci

al Z

eta

(mV

)

D1 D7 D15 D23 D30

Figura 32: Histograma dos valores de potencial zeta dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias.

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93

Todas as amostras analisadas em todos os tempos estudados apresentaram valores de

potencial zeta acima de |30| mV indicando que estes géis são termodinamicamente estáveis

com o passar do tempo. Observa-se que existem pequenas variações de valores.

A avaliação estatística dos valores de potencial zeta analisados para cada amostras

individualmente no decorrer dos 30 dias indicou que P1; P2; P4; P6; P7 e P9 não apresentam

diferenças significativas (p=0,05) em função do tempo. Existem valores com diferenças

significativas em P3, P5 e P8 para alguns tempos de observação. Podem-se observar mais

claramente os resultados dos testes tratamento de médias para avaliação de significância (teste

de Tukey) na Tabela 24.

Tabela 24: Resultados do tratamento de médias para avaliação de significância (teste de Tukey) para

valores de potencial zeta das amostras individuais no decorrer dos 5 tempos para cada amostra

Teste de Tukey Preparações

D1 D7 D15 D23 D30

P1 a a a a a

P2 a a a a a

P3 b a a ab ab

P4 a a a a a

P5 a a ab ab b

P6 a a a a a

P7 a a a a a

P8 a a a ab b

P9 a a a a a

Legenda: As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

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94

Concentração de Papaína ativa a partir da avaliação da Atividade Proteolítica

A espectroscopia de fluorescência foi utilizada no presente estudo para determinação

da velocidade de fluorescência da reação de hidrólise com o substrato Benzoil-L-arginina-4-

metilcumarina-7-amina dando origem ao produto 7-amino-4-metilcumarina. A linearidade da

fluorescência em relação ao tempo de incubação é proporcional a concentração de papaína

ativa. Os valores encontrados para os nove géis em estudo estão na Tabela 25.

Tabela 25: Valores de unidade de fluorescência por minuto para os géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 nos cinco tempos de análise

Unidade de Fluorescência/min Preparações (% p/p)

D1 D7 D15 D23 D30

P1 (0,000% Cys / 0,4% P80) 33,29 22,77 24,65 23,58 21,12

P2 (0,000% Cys / 0,7% P80) 32,47 24,07 20,38 15,72 14,81

P3 (0,000% Cys / 1,0% P80) 46,39 24,97 19,97 13,44 15,15

P4 (0,025% Cys / 0,4% P80) 42,28 38,20 28,80 27,98 25,59

P5 (0,025% Cys / 0,7% P80) 33,63 33,62 26,37 23,09 23,16

P6 (0,025% Cys / 1,0% P80) 31,01 24,67 21,72 19,64 11,60

P7 (0,050% Cys / 0,4% P80) 35,84 24,58 21,58 17,27 16,53

P8 (0,050% Cys / 0,7% P80) 37,56 34,01 28,73 25,30 19,48

P9 (0,050% Cys / 1,0% P80) 37,08 36,16 34,02 28,77 23,28

Legenda; Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80 * Média de 2 lotes com 2 leituras para cada concentração

Os resultados de fluorescência foram transformados em concentração de papaína ativa

no gel e são apresentados na Tabela 26 e na Figura 33. Os valores percentuais de papaína

ativa foram determinados para cada preparação estudada e também estão expostos na Tabela

26. Procedeu-se ao cálculo da taxa de redução percentual da concentração de papaína ativa

(TRP) utilizando-se a equação 2; os valores obtidos estão dispostos na Tabela 27. O gráfico

de TRP pelo tempo de estudo para todas as amostras está na Figura 34, possibilitando um

melhor entendimento dessa redução.

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95

Tabela 26: Valores de concentração absoluta e de concentração percentual de papaína ativa

dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias

Concentração absoluta (USP-U/mg) e de concentração percentual* Preparação

D1 D7 D15 D23 D30

P1 224,55 189,56 195,83 192,27 184,07

% 93,56 78,98 81,59 80,11 76,69

P2 221,83 193,90 181,60 166,10 163,09

% 92,43 80,79 75,67 69,21 67,95

P3 268,15 196,87 180,26 158,53 164,21

% 111,73 82,03 75,11 66,06 68,42

P4 254,46 240,90 209,63 206,90 198,95

% 106,03 100,38 87,35 86,21 82,90

P5 225,68 225,65 201,55 190,62 190,85

% 94,04 94,02 83,98 79,43 79,52

P6 216,99 195,88 186,08 179,16 152,41

% 90,41 81,62 77,53 74,65 63,50

P7 233,04 195,58 185,60 171,26 168,80

% 97,10 81,49 77,33 71,36 70,33

P8 238,76 226,97 209,38 197,99 178,63

% 99,48 94,57 87,24 82,50 74,43

P9 237,18 234,12 227,00 209,53 191,25

% 98,82 97,55 94,58 87,31 79,69

* Média de 2 lotes com 2 leituras para cada concentração

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96

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9Formulações

Concentração de Papaína ativa no gel (USP-U/mg)

D1 D7 D15 D23 D30 Figura 33: Histograma dos valores da concentração de papaína ativa dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9

em 30 dias

Os dados apresentados na Tabela 26 indicam que todos os géis estudados apresentam

redução dos valores de concentração de papaína ativa no decorrer de 30 dias. Esta observação

fica mais evidente ao analisar-se o gráfico da Figura 33, onde é possível perceber que os

valores obtidos em D1 são muito maiores daqueles encontrados para as outras avaliações.

Ainda na Tabela 26, estão apontados os valores de concentração percentual das amostras.

Nela fica claro que em 30 dias todas as preparações encontram-se fora das indicações

farmacopeicas para medicamentos, pois estão com percentuais de ativo em concentrações

abaixo de 90%.

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97

Os valores da TRP (Tabela 27 e Figura 34) permitem analisar as diferenças entre as

preparações estudadas por meio da indicação daquelas onde mais rapidamente ocorreu a perda

da atividade da papaína. Os maiores valores de TRP foram os observados para a preparação

P3 em todos os tempos de estudo. As maiores taxas de redução foram encontradas para as

análises em D7. As menores oscilações nos valores da taxa de redução foram obtidas pelos

géis P5, P8 e P9. Portanto a partir da observação dos valores de representados pela TRP,

pode-se sugerir que há uma interação entre a cisteína e o polissorbato 80 na manutenção da

atividade proteolítica. Para melhor entendimento desta possível interação optou-se em realizar

análise do desenho experimental 33.

Tabela 27: Valores da taxa de redução percentual de papaína ativa (TRP) dos géis de papaína a 4,0% (p/p), P1 a P9 em 30 dias

TRP* Preparações (% p/p)

D7 D15 D23 D30

P1 (0,000% Cys / 0,4% P80) -2,60 -0,91 -0,63 -0,62

P2 (0,000% Cys / 0,7% P80) -2,10 -1,30 -1,09 -0,91

P3 (0,000% Cys / 1,0% P80) -4,43 -2,34 -1,78 -1,34

P4 (0,025% Cys / 0,4% P80) -0,89 -1,26 -0,81 -0,75

P5 (0,025% Cys / 0,7% P80) 0,00 -0,76 -0,68 -0,53

P6 (0,025% Cys / 1,0% P80) -1,62 -1,02 -0,76 -1,03

P7 (0,050% Cys / 0,4% P80) -2,68 -1,45 -1,15 -0,95

P8 (0,050% Cys / 0,7% P80) -0,82 -0,88 -0,74 -0,87

P9 (0,050% Cys / 1,0% P80) -0,22 -0,31 -0,51 -0,67

Legenda; Cys = L-Cisteína; P80 = Polissorbato 80

-5

-4

-3

-2

-1

0D1 D7 D15 D23 D30

Tempo (em dias)TR(%)

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9

Figura 34: Taxa de redução percentual da atividade proteolítica em 30 dias

TRP

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98

5.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A avaliação das interações entre os adjuvantes sobre a concentração de papaína ativa

dos géis foi estudada a partir um desenho experimental 33, tendo como variáveis

independentes as concentrações de polissorbato 80 e de L-cisteína e o tempo, assim optando-

se por estabelecer um projeto de espaço único que abrange várias interações, ou como

combinação dessas variáveis, tais como componentes de um modelo multivariado, conforme

recomenda a norma Q8(R2). A variável dependente foi a concentração de papaína ativa. Os

cálculos foram realizados com o uso do programa Statistica®, versão 7.0.

Para a determinação do melhor modelo investigou-se o uso ou não de equação

polinomial, bem como se o modelo estaria mais adequado considerando a inexistência de

interações entre os componentes (cisteína, tensoativo e tempo), ou interação de forma linear,

ou ainda interações lineares e quadráticas concomitantes.

A primeira etapa do estudo estatístico foi a escolha do melhor modelo que

representasse o fenômeno que estava sendo avaliado. Para tal procedeu-se a análise dos

histogramas de resíduos brutos e de valores preditos (Figuras 35 e 36), bem como do gráfico

de valores preditos por valores observados (Figura 37), do gráfico normal probabilístico dos

resíduos brutos (Figura 38) e gráfico dos resíduos brutos x resíduos estimados segundo

Student suprimidos (Figura 39).

-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

X ≤ Elementos de Fronteira

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Fre

qu

ênci

a

Figura 35: Histograma de resíduos brutos pelo modelo

140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270

X ≤ Elementos de Fronteira

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Fre

qu

ênci

a

Figura 36: Histograma de valores preditos pelo

modelo

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99

120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

Valores Observados

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

260

270V

alo

res

pre

dito

s

Figura 37: Gráfico de valores preditos por valores

observados

-60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40

Residuos

-3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Val

or

no

rmal

esp

erad

o

0,01

0,05

0,15

0,35

0,55

0,75

0,95

0,99

Figura 38: Gráfico normal probabilístico dos resíduos

brutos

-60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40

Residuos Brutos

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

Res

ídu

os

estim

ado

s se

gu

nd

o S

tud

ent

sup

rimid

os

Figura 39: Gráfico dos resíduos brutos x resíduos

estimados segundo Student suprimidos

A partir da visualização das figuras acima se pode concluir que o modelo que melhor

demonstrava a influência dos adjuvantes técnicos e do tempo sobre concentração de papaína

ativa em gel, era aquele que avaliava as interações lineares e quadráticas concomitantemente

sem usar o escalonamento centralizado de polinômios.

Este foi considerado o melhor modelo, pois não são observadas lacunas no eixo X em

nenhum dos histogramas (de resíduos brutos e de valores preditos). Além disso quando se

observa a reta de valores preditos por valores observados pode-se afirmar que o modelo

possui boa qualidade de ajuste, já que prevê corretamente boa parte das vezes e, quando

comete um erro, não se distancia muito da reta identidade. Nota-se, pela visualização do

gráfico de probabilidade normal dos resíduos brutos que há leve fuga de normalidade com

possível presença de outliers1. Mas, em um aspecto geral pode-se ver que não será rejeitada a

suposição de normalidade. (COMPARINI, 2015)

1 Outliers: valores fora da normalidade, longe da reta indicativa de normalidade.

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100

A Tabela 28 apresenta a estimativa de efeito para a concentração de papaína ativa

significantes que, segundo o modelo, influenciam na manutenção da atividade proteolítica.

Esta tabela final é fruto da exclusão das interações com valores de efeito de menor relevância

(abaixo de 10), que representavam menos que 5% em um nível de significância de 0,05. Cabe

ressaltar que os dados foram analisados para que essa exclusão não trouxesse prejuízo ao

modelo, como por exemplo, fornecendo lacunas nos histogramas de valores residuais e

preditos.

Tabela 28: Estimativa de efeito para a concentração de papaína ativa

Estimativas por intervalo (95%) Fatores Efeitos

Erro

Padrão t(41) p- valor

Limite Inferior Limite Superior Média 199,19 9,40 21,18 0,00 180,20 218,19

(1) Polissorbato 80 (L) -37,88 10,39 -3,65 0,00 -58,87 -16,89 Polissorbato 80 (Q) -10,16 23,03 -0,44 0,66 -56,66 36,34

(2) Cisteína (L) 32,00 12,85 2,49 0,02 6,05 57,94 Cisteína (Q) -10,71 18,11 -0,59 0,56 -47,28 25,87

(3) Tempo (L) -51,23 9,97 -5,14 0,00 -71,37 -31,09 Tempo (Q) 14,23 17,31 0,82 0,42 -20,74 49,20 1L por 2Q 50,58 12,72 3,98 0,00 24,88 76,27 1Q por 2L -15,78 12,21 -1,29 0,20 -40,45 8,88 1Q por 2Q 15,57 22,18 0,70 0,49 -29,22 60,37 1Q por 3L -11,21 12,21 -0,92 0,36 -35,88 13,45 1Q por 3Q 10,02 21,18 0,47 0,64 -32,76 52,80 2L por 3Q -17,86 12,15 -1,47 0,15 -42,39 6,67

A Tabela 28 que apresenta os efeitos dos fatores sobre a atividade proteolítica da

papaína e indica que o tempo, a concentração de cisteína e de polissorbato 80 são

estatisticamente significativos, a 5% de significância. Os resultados mostram que a

concentração de papaína ativa foi afetada negativamente pelo tempo (p = 0,00) e pela

presença de polissorbato 80 (p = 0,00) enquanto a L-cisteína interfere positivamente em sua

atividade (p = 0,02). O diagrama de Pareto (Figura 40) demonstra pelos valores de t (41), em

ordem decrescente, quais os efeitos e interações são significativas a um coeficiente de 95%. A

partir destes dados pode-se perceber que o fator de maior relevância corresponde ao tempo

(efeito = -51,23) em sua forma linear, o qual influencia negativamente a concentração de

papaína ativa. A interação do tensoativo linear com a cisteína na forma quadrática influencia

positivamente a atividade proteolítica (efeito = 50,58). Em contrapartida, o fator de terceira

maior relevância é o tensoativo linear, visto isoladamente, que influencia de forma negativa a

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101

atividade (efeito = -37,88). A L-cisteína linear é um fator que influencia favoravelmente a

concentração de papaína ativa (efeito = 32,00). Os demais fatores são de menor relevância

uma vez que se encontram fora do limite de coeficiente de 95%, tanto superior quanto

inferior.

-0,441386

0,4731011

-0,59114

0,7020703

0,8217801

-0,918235

-1,29234

-1,47039

2,490308

-3,64542

3,975538

-5,13787

p=0,05

Estimativa dos Efeitos Padronizados (Valores Absolutos)

Tensoativo (Q)

1Q por 3Q

Cisteína (Q)

1Q por 2Q

Tempo (Q)

1Q por 3L

1Q por 2L

2L por 3Q

(2) Cisteína (L)

(1) Tensoativo (L)

1L por 2Q

(3) Tempo (L)

Figura 40: Diagrama de Pareto dos efeitos padronizados.

Papaína ativa(USP-U/mg)

280 260 240 220 200 180

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1

Polissorbato 80(%; p/p)

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Cis

teín

a (%

; p/

p)

Figura 41: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em

função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80, fixando o Tempo em D1

A Figura 41 apresenta os gráficos de superfície de resposta e curva de contorno para a

concentração da papaína ativa em função da concentração de L-cisteína e de polissorbato 80,

fixando-se o tempo em D1. Estes gráficos explicam melhor os efeitos das variáveis

independentes sobre a atividade da papaína e indicam que os melhores resultados são obtidos

em duas regiões. A área que representa os valores mais altos de papaína ativa é fruto da

presença dos maiores valores de L-cisteína e polissorbato 80. A outra região indica valores

medianos de L-cisteína (0,020 a 0,030%) associados a baixas concentrações de polissorbato

80 (0,3%). Também é possível afirmar que altas concentrações de cisteína (acima de 0,050%)

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102

e baixas concentrações de polissorbato, próximas da concentração micelar crítica,

desfavorecem a atividade proteolítica.

Papaína ativa(USP-U/mg)

260 240 220 200 180

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1

Polissorbato 80(%; p/p)

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Cis

teín

a (%

; p/

p)

Figura 42: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em

função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo em D7

Papaína ativa(USP-U/mg)

240 220 200 180 160

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1

Polissorbato 80(%; p/p)

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Cis

teín

a (%

; p/

p)

Figura 43: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em

função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo em D15

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1

Polissorbato 80(%; p/p)

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Cis

teín

a (

%; p

/p)

Figura 44: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em

função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo em D23

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103

Papaína ativa(USP-U/mg)

220 200 180 160 140

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1

Polissorbato 80(%; p/p)

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

Cis

teín

a (%

; p

/p)

Figura 45: Gráficos de Superfície de resposta e curva de contorno para a concentração da papaína ativa em

função da concentração de Cisteína e de Polissorbato 80 fixando o Tempo em D30

As Figuras 42 a 45 apresentam os gráficos de superfície de resposta e curva de

contorno para a concentração da papaína ativa em função da concentração de cisteína e de

polissorbato 80, fixando-se os tempos em D7, D15, D23 e D30, respectivamente. As áreas

observadas em D1 como sendo as que apresentam as melhores condições para a atividade da

enzima estão presentes nestes gráficos, mas as concentrações de papaína ativa obtidos são de

menor valor.

Com a avaliação comparativa de todos os gráficos fica evidente que o tempo é o fator

de maior influência sobre a manutenção da atividade proteolítica e, conseqüentemente, da

concentração de papaína ativa. A presença da cisteína e polissorbato 80 nos limites superiores

que foram estudados, 0,06% e 1,1% respectivamente, usados isoladamente nas preparações

irão agir de forma prejudicial ao sistema. Porém quando associados, há uma interação desses

componentes que contribui para a manutenção da concentração ativa de papaína.

Nota-se que há uma demonstração do quanto é sensível a interação entre a cisteína e o

polissorbato 80 na manutenção da atividade da papaína, sugerindo que os melhores resultados

ocorrem quando os dois adjuvantes encontram-se na proporção de 1:15.

Os resultados das análises dos gráficos de superfície e contorno indicam que novos

estudos devem ser realizados de maneira a avaliar o efeito de maiores concentrações de L-

cisteína e polissorbato 80 sobre a atividade da papaína. Existe um grande saldo positivo no

estudo de superfície resposta realizado, pois conseguiu-se provar a grande importância da

presença da L-cisteína na manutenção da atividade, mesmo que este adjuvante não favoreça

os melhores valores de atividade em D1. Foi possível, então, ampliar as observações feitas por

Miura (2012) em seus primeiros trabalhos.

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104

6. CONCLUSÕES

O presente trabalho dedicou-se ao desenvolvimento e caracterização de géis de

papaína a 4% (p/p) destinados ao tratamento de lesões tissulares utilizando polissorbato 80

como agente solubilizante. Para o emprego deste tensoativo realizou-se o estudo da

concentração micelar crítica de modo a estabelecer em que faixa de concentração que o

insumo deveria ser utilizado. Os resultados apontam que este objetivo foi atingido, pois todas

as preparações estudadas apresentaram aspecto homogêneo, sem a presença de precipitados

mesmo na presença de L-cisteína e durante o estudo de estabilidade. Os estudos do potencial

zeta das preparações indicaram que as preparações são termodinamicamente estáveis e as

análises feitas durante o estudo de estabilidade confirmaram a estabilidade do sistema durante

a armazenagem das amostras sob refrigeração no período de 30 dias.

O estudo de géis de papaína a 4% (p/p) usando-se polissorbato 80 também contou com

a avaliação da interferência da L-cisteína sobre os produtos e na atividade enzimática da

papaína. A inclusão deste aminoácido nas preparações modifica os valores da concentração

micelar critica e de potencial zeta do sistema.

Como fruto dos achados iniciais procedeu-se um planejamento da composição das

formulações que participariam do estudo de estabilidade tendo como base um desenho

experimental de 33. As variáveis independentes consideradas foram concentração de L-

cisteína (valores entre 0,000 e 0,050% p/p); concentração de polissorbato 80 (valores entre

0,400 e 1,000% p/p) e o tempo de estudo. A avaliação das características das amostras nos 30

dias de estudo permitiu concluir que a estratégia tentada foi eficiente para obter-se

preparações homogêneas e estáveis quanto a suas características sensoriais e físico-químicas,

mas não conseguiu evitar a perda a atividade da papaína com o tempo. A preparação com

maiores valores de papaína ativa em D1, o gel P3, que apresentava na formulação 1,0% (p/p)

de polissorbato 80, sem L-cisteína, foi a preparação que teve maior taxa de redução de

atividade em 07 dias, sugerindo que a ausência deste aminoácido influencia na perda da

atividade.

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105

As avaliações estatísticas decorrentes do desenho experimental fatorial possibilitaram

estudar a influencia das variáveis independentes, concentração de polissorbato 80, de L-

cisteína e o tempo, sobre a concentração de papaína ativa nos géis. O efeito do tempo sobre a

atividade enzimática mostrou-se muito grande, possivelmente o sistema aquoso do gel

desfavorece a estabilidade do sítio ativo da enzima. O efeito da L-cisteína foi favorável à

proteção da enzima com o tempo, mas sua ação isolada não foi suficiente para sobrepor a ação

do tempo. Observa-se que o efeito associado da presença de polissorbato 80 e L-cisteína

conseguiram contrapor-se, em parte, ao efeito do tempo. A análise dos gráficos de superfície

de resposta indicou que as melhores condições para obterem-se géis de papaína 4% (p/p) com

os maiores valores de papaína ativa as concentrações dos dois adjuvantes devem estar nos

seus maiores valores (L-Citeína 0,05% e Polissorbato 80 1,00%).

Sugestões para pesquisas futuras

• Estudar formulações semi-sólidas de papaína em concentrações maiores de polissorbato

80 e L-cisteína.

• Verificar outras bases não aquosas para a manutenção da atividade da papaína.

• Testar outros adjuvantes que favoreçam a manutenção do sítio ativo da papaína

reduzido.

• Pesquisar novos tensoativos e agentes solubilizantes

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106

7. REFERÊNCIAS

ARNON, R. Papain. Methods in Enzymology. v. 19, p. 226-244, 1970.

ATTWOOD, D., ELWORTHY, P.H. LAWRENCE, M.J. J. Pharm. Pharmacol. 41. 585. 1989. apud SINKO. P.J. Físico-Farmácia e Ciências Farmacêuticas. Artmed. 5 ed. 2008.

ATTWOOD, D. et al. Solubilization of Indomethacin by Polysorbate 80 in Mixed Water-Sorbitol Solvents. J. Pharm. Pharmacol. 41. 83. 1989. apud SINKO. P.J. Físico-Farmácia e Ciências Farmacêuticas. Artmed. 5 ed. 2008.

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