Enzimas

• Catálise é fundamental para a vida

• Enzimas catalisadores biológicos

• Reduzem a energia de ativação das reações

• Alta especificidade

• Importância clínica e industrial

Cinética enzimática

- Quantidade de produto formado

- Quantidade de substrato transformado (por unidade de tempo)

- Métodos de detecção geralmente espectroscópicos

Pode ser medida por:

• Estudo da velocidade das reações

Cinética enzimática

•Fatores que afetam a velocidade das reações:

- Concentração da enzima

- Estrutura da enzima

- Concentração de substrato

- Moduladores (inibidores, ativadores)

Cinética enzimática

• Importância dos estudos cinéticos:

- Informações sobre o mecanismo enzimático

- Prever a atividade da enzima em diferentes [S]

- Mecanismos de regulação e inibição

- Comparar eficiências de catálise

Efeito do pH e temperatura

Aminoácidos sítio ativo

Enzima desnaturada

Enzima nativa

Sítio ativo

Temperatura

Vel

ocid

ade

da

rea ç

ã oV

eloc

idad

e d

a re

a çã o

Vel

ocid

ade

da

rea ç

ã oPepsina Amilase Fosfatase

alqualina

• Enzima simples – 1 sítio, 1 substrato

Efeito da concentração de substrato

k1

k-1

k2E + S ES E + P

k-2

• Como estudar o efeito da [S] se S é consumido na

reação?• Determinação da velocidade inicial (Vo)

Tempos curtos de reação e [S] >> [E]

[S] constante

Efeito da Concentração de Substrato

k1

k-1

k2E + S ES E + P

V0 = k2 [ES], passo limitante

[S]

Vo Vmax

Em Vo k-2 é insignificante e pode ser negligênciada

Conceito do Estado Estacionário

k1

k-1

k2E + S ES E + P

•No estado estacionário [ES] constante

•Determinação de Vo = cinética do estado

estacionário

Km + [S]

Vmax[S]Vo =

Cinética Michaelis-Menten

Relação [S] vs velocidade de reação

Km + [S]

Vmax[S]Vo =

Note que quando, Vo = Vmax/2, Km = [S]

Cinética Michaelis-Menten

Km + [S]

Vmax[S]Vo =

O gráfico duplo-recíproco

Km1 =Vo Vmax

1 [S]

+ 1 Vmax

Inclinação Quando x = 0

1/Vo = 1/Vmax

Quando y = 0

1/[S] = -1/Km

O significado de Km e Vmax

k1

k-1

k2E + S ES E + P

K-1 + K2Km = Se K2 << K-1 , Km = K-1/K1

K1

Se k2 limitante, Vmax = k2[Et]

Em algumas situações K2 é importante !!!

• Para algumas enzimas outros passos podem ser limitantes

k1

k-1

k2E + S ES EP E + P

k3

k-2

Se k3 limitante, Vmax = k3[Et]

O significado de Km e Vmax

Constante catalítica (Kcat)

Kcat = constante do passo limitante, se K2 limitante Kcat = K2

Constante catalítica Kcat

•Número de renovação

Número de S transformado em P por 1 molécula de

enzima

Enzima Substrato Kcat (s-1)

Proteína RecA (ATPase)

Anidrase carbônica

Fumarase

Catalase H2O2

HCO3-

Fumarato

ATP

40.000.000

400.000

800

0,4

Constante catalítica Kcat• CConstante específica: Relação Kcat / Km

Enzima

Anidrase carbônica

Acetilcolinesterase

-Lactamase

Substrato Kcat (s-1)

HCO3-

CO2

Aceticolina

FumaratoMalato

1,4 x 104

1 x 106

4 x 105

8 x 108

9 x 102

2,0 x 103

Km (M)

Kcat/Km (M-1s-1)

Benzilpenicilina

9 x 10-5 1,6 x 108

8,3 x 107

1,5 x 107

1,2 x 10-2

2,6 x 10-2

5 x 10-6

2,5 x 10-5

1,6 x 108

3,6 x 107

2 x 10-5 1 x 108

Fumarase

Cinética de enzimas com mais de um substrato

ATP + Glucose ADP + glucose-6Phexoquinase

Hexoquinase (cérebro)

Hexoquinase IV (fígado)

Enzima Substrato Km (mM)

ATPD-Glucose

D-Glucose

0,40,05

10

Concentração de glucose no plasma 4-5mM

a) Reação enzimática envolvendo um complexo ternário

Ordem ao acaso:

Ordenado:

b) Reação enzimática na qual não se forma o complexo ternário

Cinética de enzimas com mais de um substrato

Aumentando

A intersecção das linhas indica que um complexo ternário está sendo formado.

Gráfico duplo recíproco para complexo ternário

• Diferentes [S2] em resposta a variações na [S1]

Aumentando

As linhas paralelas indicam

um mecanismo pingue-pongue

Gráfico duplo recíproco para mecanismo ping-pong

•Diferentes [S2] em resposta a variações na [S1]

Inibição enzimática

• Inibidores : reduzem velocidade de reação

- Grande importância prática

- Grupos de inibidores :

- Irreversíveis- Reversíveis (competitivo, incompetitivo, misto)

Inibição competitiva

Km + [S]

Vmax[S]Vo = = 1 + [I]

Ki

Vmax, Et = ES, se [S] >> [I], toda enzima ES, Vmax não

altera

Km aparente

Gráfico duplo-recíproco para inibição competitiva

Inclinação

Sem inibidor

Intoxicação por Metanol

MetanolÁlcool

desidrogenase

Causa lesãotecidual

cegueria

Etanol

URINA formaldeído/

acetaldeído

Uso prático da inibição competitiva

Inibição incompetitiva

Vmax, Et = ES, mesmo se [S] >> [I], Vmax altera pois parte

da enzima está na forma improdutiva ESI

Km + ’[S]

Vmax[S]Vo =

’ = 1 + [I]

Ki’

Note que quando Km >> [S], o inibidor é pouco efetivo

Gráfico duplo-recíproco para inibição incompetitiva

Inibição mista

Km + ’[S]

Vmax[S]Vo =

Este tipo de inibidor é eficaz em qualquer [S]

Sem inibidor

Gráfico duplo-recíproco para inibição mista

Enzimas regulatórias

• Enzimas chave do metabolismo são controladas

- Enzimas regulatórias, cinética distinta

• Principais mecanismos:

- Alostérica (homotrópica ou heterotrópica)

- Covalente

- Localização celular

- Proteólise

Enzimas alostéricas homotrópicas

• Homotrópicas

- O substrato é o modulador

- A ligação de um substrato altera a conformação de outro sítio

ativo

•

Cinética de enzimas alostéricas homotrópicas

Vo

( [P

] / t

emp

o )

[S]

Vmax

Ligação de substrato aumenta a afinidade dos outros sítiosBaixa

afinidade

K0,5

Enzimas alostéricas heterotrópicas

• Heterotrópicas:

- Outro composto age como modulador

Modulador positivo

Substrato

Enzima menos ativa

Enzima mais ativa

Complexo

enzima-substrato ativo

Modulador positivo

Substrato

Enzima menos ativa

Enzima mais ativa

Complexo

enzima-substrato ativo

Cinética de enzimas alostéricas heterotrópicas

K0,5 alterado Vmax alterada

Pontos importantes da aula !!!

• Enzimas simples apresentam uma cinética padrão

• Alguns fatores podem alterar a velocidade de reações

• Cinética como ferramenta no estudo de enzimas

• Enzimas regulatórias apresentam cinética complexa