54

desses tratamentos resolveu completamente o problema. Vá-rios outros tratamentos estão sendo testados, incluindo-se ouso de outros agentes esterilizantes e de antibióticos. Estãotambém sendo feitas observações sobre o efeito da esterílíza-ção na viabilidade dos micrósporos, usando-se a técnica defluorescência descrita por Heslop-Harrison & Heslop-Harri-son (1970).

Apesar dos problemas de contaminação, foi possível aobtenção de alguns calos no meio de Genovesi & Collins(1982) e a regeneração de uma planta no meio de regenera-ção descrito por Petolino & Jones (1986). Essa linhagem, iden-tificada como responsiva à cultura de ameras, está sendo uti-lizada em alguns ensaios, visando a otimízação da produçãode calos e a regeneração de plantas e na identificação de fa-tores ou processos envolvidos na capacidade androgenéticado milho. - Certos Henrique Siqueim de Carvalho, PauJaCtls-tina Ângelo, Menoet Xsviet dos Santos, Ricardo Magnava-ca, Elto Eugenio Gomes e Gama, Álvaro Elcutério da Silva.

EMBRIOO:SNESE SOMÁTICAE REGENERAÇÃODE GENÓTlPOS lROPICAIS DE MILHO

O estabelecimento de sistemas para a produção de ca-los embriogênicos friáveis e regeneração de plantas a partirde células somáticas constituiu um pré-requísito de funda-mental importância para os programas de melhoramentode milho que visam a obtenção de plantas transgênicas.

No entanto, apesar de ser grande o número de genótí-pos de milho capazes de formar calos e regenerar plantas,a maioria dos genótipos produz apenas calos duros e com-pactos do tipo I. Ainda são raros os genótiposque produzemcalos ftiáveis e altamente embriogênicos do tipo Il, mais ade-quados a culturas de células em suspensão e de protoplastosutilizados na transformação de plantas.

Com o objetivo de aumentar o número de genótíposde milho capazes de formar calos do tipo II e com alta capa-cidade de regeneração de plantas, iniciou-se um trabalhode identificação e seleção de novos genótípos de origem tro-pical Complementarmente, fez-se um estudo para a otimiza-ção dos meios de cultura.

O trabalho teve início em julho!90 e, até o momento,já foram testados 115 genótípos, sendo 110 linhagens, três va-riedades e dois híbridos, usados no programa de melhora-mento do CNPMS/EMBRAP A Usaram-se como explantesembriões imaturos com 12 a 15 dias de idade e meio de ma-nutenção contendo sais N6, sacarose, aminoácidos, vitaminas,mío-ínosítol e as doses de 8,8 uM de 2,4-D e 15, 30 e 60uM de dicamba. 'Iestou-se também o uso de nitrato de pra-ta a 5mg/l, objetivando aumentar a formação de calos friá-veis. Para a regeneração, colocaram-se os calos em um meiocom sais MS, sacarose, mio-inositol, vitaminas e 13,3 uM debenzilaminopurina (BAP) por tês dias. Em alguns genótípos,para acelerar o enraizamento, os calos eram transferidos pa-

ra outro meio contendo carvão ativado a 5g/l, durante cin-co dias. Durante a manutenção, os calos permaneciam a2f,OC, em condição de penumbra. Após a regeneração, asplântulas com 10 a 15 cm de altura eram transferidas paravasos em casa de vegetação, com nebulização intermitentedurante os dez primeiros dias.

Foram selecionados cinco genótipos superiores aos de-mais, capazes de serem mantidos por longo tempo em cultu-ra (os gcnótipos mais antigos têm 21 meses de cultivo) e comalta capacidade de regeneração de plantas. A maioria dosgenótipos formou calos predominantemente compactos, cin-co apresentaram calos mucilaginosos e apenas três genótí-pos apresentaram calos com setores fríãveís. Observou-se,no entanto, que a formação de setores friáveis, além de de-pender do gcnótipo utilizado, dependia também do tempoem que os calos permaneciam no mesmo meio. O subcultí-vo por períodos inferiores a 15 dias aumentava a formaçãode setores do tipo H, o inverso acontecia quando os caloseram mantidos no mesmo meio por períodos superiores a21 dias; Verificou-se, também, que, embora o 2,4-0 tenhapromovido bons resultados, o dicamba a 30 uM foi menosespecífico c proporcionou melhor desenvolvimento para ummaior número de genótipos. Não se observou índução de ca-los do tipo li pela adição de nitrato de prata ao meio. O usodo nitrato de prata, além de reduzir o crescimento de 17dos 27 genótipos testados, não apresentou efeito aparenteem nove genótipos e em apenas um houve aumento na velo-cidade de crescimento dos calos. - c.arlos Henrique Siquei-ra de c.arvalho, ManoeI Xsviet dos Santos, Ric.ardo Magna-vaca, Elto Eugenio Gomes e Gama, Maria José Vilaça de\ásconcelos.

ENZIMAS DO METABOliSMO DE CARBONO ENITROGOOO EM MILHO

É geralmente aceito que a assimilação de amônia pe-las plantas acontece pela rota enzimática glutamina sínteta-se (OS)/ glutamato síntase (GOGA'J) e que a enzima gluta-mato desidrogenase (GDH) tem importância secundária nes-se processo. Por outro lado, em plantas C4, como o milho,a assimilação fotossintética de carbono acontece com a parti-cipação das enzimas fosfoenolpiruvato carboxilase (pEPC),piruvato -ortofosfato dikinase (PPDK) e nõulose-l, 5-bifosfa-to carboxiJase (Rubisco). Como essas enzimas aparentemen-te controlam mecanismos chaves no processo de produçãode biomassa, tem sido sugerido que suas atividades e/ou con-teúdos possam ser utilizados como critérios bioquímicos pa-ra a seleção de plantas mais produtivas ou mais eficientesno uso desses dois nutrientes.

O objetivo principal deste experimento foí, portanto,averiguar a existência de possfveís correlações entre essasenzimas e a produção de biomassa em sete cultivares demilho. Na seleção desses materíaís, procurou-se utilizar genó-

tipos que, em ensaios de campo, mostraram respostas dife-renciadas para a adubação com nitrogênio. As cnzimas dometabolismo do carbono foram quantífícadas pela técnicade Single Radial Immunodiffusion -SRID e as do metabolis-mo de nitrogênio por SDS-PAGE e \\éstern Blot, utilizan-do-se antícorpos policlonais específicos. As plantas desenvol-veram-se em vasos com vermicuJita e foram fertilizadas a ca-da 4S horas com uma solução completa de Amon & Hoa-gland, menos nitrogênio. Para este nutriente, as plantas fo-ram divididas em dois grupos, sendo que um recebeu 1,6mM (insuficiência) e o outro 16 mM de nitrogênio como ni-tra to (suficiência).

As quantífícações enzimátícas foram realizadas quan-do as plantas estavam com 21 dias após a germinação e osdados obtidos para as enzímas do metablismo do carbonoaparecem na 1àbela 49. Observa-se que os níveis enzimáti-cos aumentaram consideravelmente em função do aumento no

TABELA 49. Ouantiãcação das enzimas Rubisco, PEPC e PPDK pelatécnica de Single Radial Immunodittusion - mg/g de pesofresco. CNPMS, Sete Lagoas, MLi, 19'12

NO~Cultivar % de

1,6mM 16mM aumento

RubiscoMG-2 7,50 11,67 56BR 201-M 7,50 10,93 46BR 201-F 6,72 11,86 77GCB 5,34 15,2.'; 185BR 451 6,67 9,36 40SE-1 8,63 9,22 6SE-2 3,87 8,82 128

PEPCMG-2 1,02 2,70 165BR 201-M 0,89 3,16 255BR 201-F 0,13 2,65 1900GCB 0,52 3,53 578BR 451 1,14 2,33 104SE-1, 0,94 1,57 67SE-2 0,52 1,74 235

PPDKMG-2 0,60 0,88 47BR 201-M 0,52 0,98 88BR 201-F 0,38 1,OS 176GCB 0,41 1,62 295BR 451 0,50 1,03 106SE-1 0,63 1,25 98SE-2 0,28 0,83 196

nível ae nitrogênio, com exceção da Rubisco para a cultivarSE-1. Estudos de correlações mostraram que esses níveis en-zimáticosestavam associados entre si e também com as pro-dutividades de biomassa. Os dados da 1àbela 50 mostram apercentagem dessas enzimas em relação à quantidade deproteína solúvel nas folhas. Observa-se que geralmente hou-ve uma diluição nos níveis de Rubisco (exceção para SE-2)

55

e de PPDK (exceção para o 451 e SE-2)quando as plantascresceram no nível mais alto de nitrogênio, indicando que,quando havia mais nitrogênio para a síntese de novas prote-ínas, esses materiais investiram menos que proporcionalmen-te na síntese dessas enzimas. Por outro lado, observa-se quequatro cultivares (201-F, GCB, 451 e SE-2) investiram prefe-rencialmente na síntese de PEPC quando havia suficiênciade N no meio de crescimento. Esse fato é interessante, poisessas cultivares, em condições de campo, são consideradascomo responsivas à ad ubação com nitrogênio.

TABELA 50. Percentagem de Rubisco, PEPC e PPDK em relação 11proteína I.DWI)'. CNPMS, Sete Lagoas. MG, 1991.

Rubisco PEPC PPDKCultivar mM NO; mMNO; mM NO~

1,6· 16,0 1,6 16,0 1,6 16,0

M(J·2 32,3 15,~ ~,~ 3,6 2,6 1,2IlRlOI·M 40.3 1;.0 4,7 3,6 2,6 1,213R 201·1' 52,3 11,2 1,0 2,6 3,0 0,9OCIl 36,6 22,9 3,6 5,3 2,8 2,4

IlR~51 29,9 25,S 5,1 6,3 2,2 2,8

SE· I 31,2 18,0 3.4 3,0 2,3 2,4SE-2 14,5 17.3 1,9 3,9 1,0 1,9

Dados encontrados na literatura mostram que a quan-tidade de nitrogênio disponível para síntese protéica regulao conteúdo de PEPC em folhas fotossinteticamente ativas eque esse controle acontece em nível de mRNA

A Figura 31 mostra que, no nível de 1,6 mM de nitra-to, a linhagem SE-2 tinha um pico para GSI maior que GSII,sendo que uma situação inversa foi observada para a linha-

SE-Zos,GSlI

FIGURA 31. Densitometria das bandas de GSI e GSII, obtidas porSDS-PAGFJV\btem BIot, das aI11ivaresSE-2 e SE-I, cul-tivadas em presença de .1,6 mM NO). CNPMS, Sete La-goas, MG, 1991

56

gem SE-1. Por outro lado, a Figura 32 mostra que, quandoa linhagem SE-2 desenvolveu-se em presença de 16 mM denitrato, o pico para OSIJ foi maior que para OSl.

Essas observações são interessantes, pois a literaturatem reportado que esse aumento nos níveis de OSI geral-mente acontece quando a planta entra em processo de se-nescêncía e esses dados estariam, então, indicando que a li-nhagem SE-2, em comparação com a SE-l, seria menos ca-paz de crescer adequadamente em presença de baixos níveisde nitrato. Note-se, entretanto, quando a linhagem SE-2 de-senvolveu-se no maior nível de nitrato, que o pico de GSIIficou maior que o de OSI, indicando, nesse caso, que essasplantas não estavam entrando em processo de scnescênciapor estres.sc de nitrato.

Coletivamente, esses dados sugerem que as cultivaresque aparentemente são mais responsivas à adubação comnitrogênio, no nível de suficiência desse nutriente, investemde maneira preferencial na síntese de PEPC e mostram maio-res quantidades de GSII que OSI, enquanto que, no nívelmais baixo desse nutriente, apresentam altas proporções deRubísco, A cultivar SE-2 que, no campo, mostra sintomasvisuais de deficiência de nitrogênio, quando cultivada em pre-sença de 16 Kg/ha de N, mostrou teores de OSI maiores queGSII, no nível de insuficiência de N, o que, provavelmente,indica que essas plantas já estavam em processo de senescên-cia. - Antonio Álvaro Cotcete Purcino, Hidco Sasakawa, 1àt-suo Sugiyama.

GSll

GSlI

J.6 mU NO] L6 mMJ«),i

FlOURA 32 Densitometria das bandas de GSI e GSII, obtidas porSDS-PAGE/W:stem 8101, da cultivar SE-2, cultivada emdois nlveis de NO~. CNI'MS, Sete Lagoas, MG, 19'11.

MARCAÇÃO DE FRAGMENTOS DE DNACOM DIGOXIGENIN

Visando a utilização de sondas não radiativas de DNAna técnica de Restriction Fragment Lcngth Polymorphism(RFLP), testou-se uma metodologia de marcação de frag-

mentos de DNA com digoxigenin, um ester6ide que podeser unido quimicamente à uridina nucleosideo trifosfato. Pa-ra a marcação, utilizou-se o plasmídeo pUC 8, que possui2655 pares de base (pb), contendo um fragmento de DNAde <)00 pb, correspondente à região codificadora do geneda gama-zeína, uma proteína de reserva encontrada no en-dosperma de grãos de milho. Esse fragmento foi extraídodo plasmídeo pue 8 pela ação das enzimas de restrição EcoRI e Sal I, sendo que a marcação foi efetuada com digoxige-nin II-dUTP, pelo processo de nick-translation, O funciona-mento dos istema de marcação com digoxigenin consiste nauníízaçào de anticorpos produzidos contra digoxigenin, conju-gados com a enzima fosfatase alcalina, a qual reage com asubstância quimioluminescente AMPPD (AMPPD: 3-(2'-es-piroadamantano) - 4-methoxi-4- (3"-fosforiloxi) fenil- 1,2-dio-xetano dissódico), causando emissão de luz que é capaz deimpressionar filmes de raio-x, A sonda marcada foi testadahíbridando-a contra diferentes concentrações (80 a 2,5 nano-gramas) do fragmento de gama-zeína ímobüízado em' mem-brana de nyíon, O resultado apresentado na Figura 33 mos-tra que o processo é bastante sensível, uma vez que a son-da detectou até 2,5 nanogramas do fragmento-alvo, possibili-tando com isto a substituição do uso de sondas marcadascom nucleotídeos radiativos em técnicas de biologia molecu-lar. - Cláudio Brondani, Edilson Paiva.

CONCENTRAÇÕES DO FRAGMENTO (nanogramas)80 ~ W ro 5 ~

FlGURA 33. Dot-blot indicando a reação de uma sonda de DNA (cor-respondente ao fragmento com o gene da gama-zeína)marcada com digaxigenin ll-dUP'I: contra diferentes con-cenrrações do fragmento, 'imobilizado em membrana denylon. CNPMS, Sete Lagoas, MG, 1992