MARIA EMMA CONTIN OLIVEIRA DE ANTONIO

PERMEAO CUTNEA IN VITRO COMO FERRAMENTA AUXILIAR PARA O ESTUDO DE FORMULAES SEMI-SLIDAS DE CETOCONAZOL PARA APLICAES TPICAS

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas PPGCF do Setor de Cincias da Sade, do Departamento de Farmcia da Universidade Federal do Paran UFPR como requisito parcial obteno do grau de Mestre em Cincias Farmacuticas Orientadora: Profa. Dra. Mayumi Eliza O. Sato

CURITIBA 2007

Mayumi, pelo companheirismo de sempre. Ao meu marido Eliseu pela pacincia e dedicao. Aos meus filhos, Fernanda, Lucas e Ricardo, pelas horas em que eu no estive presente. Dedico.

AGRADECIMENTOSAgradeo a Deus, pela presena constante. Ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas, em especial as professoras. Dra. Almeriane Maria Weffort Santos e Dra Mrcia do Rocio Duarte, prezadas coordenadora e vice-coordenadora do mesmo, pela oportunidade proporcionada viabilizando este trabalho de pesquisa, e a sra. Regina Montrezol, secretaria do Programa, sempre pronta a atender com carinho todas as solicitaes feitas. Profa. Dra. Mayumi Eliza Otsuka Sato, pelos conhecimentos, dedicao e amizade transmitidos durante toda a orientao deste trabalho. Ao Prof. Dr. Aguinaldo Jos do Nascimento, pela bondade e pelos preciosos esclarecimentos prestados. Aos Profs.drs. Letcia Carpentieri e Itamar Francisco Andreazza pelo carinho e estmulo a mim demonstrado. Farmacutica Maria da Graa Teixeira de Toledo pela alegria, amizade e ajuda nas anlises. s estagirias, Fernanda Venncio da Silva e Sulyn Fderle, pela amizade e pelo apoio na execuo das tarefas. Aos meus pais, Agostinho Alves de Oliveira e Elizabeth Contin de Oliveira, pelo que me proporcionaram estes anos todos. minha irm Maria Ester de Oliveira Kloss, pelo incentivo e auxlio. Ao meu marido, Eliseu Ricardo de Antonio, e meus filhos, Fernanda Oliveira de Antonio, Lucas Oliveira de Antonio e Ricardo Oliveira de Antonio, pelo amor e dedicao demonstrados a todo o momento. A todos que direta e indiretamente colaboraram na execuo deste trabalho.

RESUMOOs antifngicos imidazlicos, por seu largo espectro de ao e baixa toxicidade so usados em grande nmero de formulaes para uso tpico e sistmico. Os produtos dermatolgicos utilizando veculos emulsionados, so eficazes como carreadores de frmacos antifngicos, e de boa aceitao pela populao. O cetoconazol um imidazlico utilizado em grande nmero de formulaes do mercado, e foi o frmaco selecionado para este trabalho, por possuir um medicamento de referncia, Nizoral, e medicamentos genricos na forma farmacutica emulso para uso tpico, todos devidamente registrados e de acordo com os critrios e atribuies previstos na legislao brasileira. Estas formulaes foram objetos deste estudo, cuja proposta foi reproduzir os parmetros organolpticos e fsicos do medicamento de referncia, em formulaes simuladas no laboratrio, e nestas e nas formulaes genricas selecionadas, tentar elucidar questes como modo de elaborao e incorporao do frmaco, e a relao destas variveis tecnolgicas, com os diferentes excipientes disponveis e normalmente utilizados no preparo de formas farmacuticas emulsionadas. Por metodologia in vitro, foi avaliada a permeao cutnea das formulaes mencionadas, e para sua realizao utilizaram-se clulas de difuso, onde no compartimento doador trabalhou-se com duas tomadas de amostra (2,0g e 0,2g). A membrana permeante foi a pele de orelhas de porco, e a soluo receptora, tampo fosfato pH 7,4 adicionado de etanol 10%. As coletas para o estudo de permeao cutnea foram feitas em tempos especficos. Nos intervalos de 1h, 3h, 6h, 12h e 24h, foram coletadas as membranas expostas permeao, para a verificao da reteno cutnea. As anlises foram realizadas por CLAE com deteco no UV, no comprimento de onda de 225nm, utilizando como fase mvel, metanol e soluo de acetato de amnio 0,5% (20:80). Das consideraes feitas e das observaes prticas, pde-se concluir que embora em conformidade com as normas vigentes, os medicamentos genricos possuem diferentes comportamentos, decorrentes das diversas variveis tecnolgicas a que se submetem, e tais diferenas, podem acarretar comprometimento na eficcia do produto, fatos que devem ser comprovados com testes clnicos. Sugere-se a criao de procedimentos de controle de qualidade especficos para os semi-slidos, considerando o enorme potencial cutneo como via de liberao para novos medicamentos. Palavras-chave: Cetoconazol; Absoro cutnea; Estudo in vitro de permeao cutnea; Medicamentos Genricos.

ABSTRACTThe imidazolic anti-fungals, due to their large spectrum of action and low toxicity, are used in great number of formulations for topical and systemic use. The dermatologic products using emulsified vehicles are effective as carriers for antifungal medicines, and highly accepted by population. The cetoconazol is an imidazolic compound used in great number of market formulations, and it was the selected drug in this work, for its presence in the reference medicine Nizoral, a generic pharmaceutical form of emulsion for topical use, all properly registered and in agreement with the criteria and attributions foreseen in the Brazilian legislation. The aim of this study was to reproduce the physical and organoleptic parameters of the reference medicine and in simulated formulations, and to try to elucidate subjects such as ways of medicine elaboration and incorporation, and the relationship of these varied technological variables with the different available excipients normally used in the preparation of emulsified pharmaceutical products. The evaluation of the mentioned formulations was investigated by using an in vitro skin permeation method, and in order to do this, diffusion cells was used, so the donor compartment was filled out with two samples (2,0g and 0,2g). The permeant-membrane used was the pig ear skins, and the receptor solution was the phosphate buffer solution, pH 7.4, added with 10 % ethanol. At pre-established time intervals samples of the medium were collected for the study of cutaneous permeation. At intervals of 1, 3, 6, 12 and 24 hr, the exposed membranes were removed, to monitor skin penetration. The analyses were carried out by HPLC with UV detection at 225 nm wavelength, using methanol and 0.5 % ammonium acetate solution (20:80) as mobile phase. From the considerations and practical observations it can be concluded that, although in accordance with the effective norms, the generic medicines possess different behaviors, as a result of submission to several technological variables, and these differences can compromise the effectiveness of the product, facts that should be proven with clinic tests. It is suggested the creation of specific quality control procedures for the semisolids, considering the skin as having enormous potential as route for new medicines. Keywords: Ketoconazole; Skin absorption; In vitro study of absorption; Generic medicine. Percutaneous

LISTA DE FIGURAS

Figura 01

Esquema representativo das vias de penetrao do frmaco atravs do estrato crneo (via transcelular e via 26 intercelular) Fora de cisalhamento aplicada sobre um fludo Curva de fluxo de fludos no propriedades dependentes do tempo Estrutura molecular do cetoconazol newtonianos de 41 44 49

Figura 02 Figura 03 Figura 04 Figura 05

Esquema da clula de difuso (Microette Plus-Hanson Research ) empregada nos estudos de liberao e 59 permeao cutnea in vitro Orelhas de porco prontas para dissecao (a) e (b) e aps 80 dissecao (c) Orelhas de porco prontas para o estudo do in vitro de 81 permeao cutnea Sistema de difuso contendo 6 clulas Perfil cromatogrfico cetoconazol caracterstico para o frmaco 81 86

Figura 06 Figura 07 Figura 08 Figura 09 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18 Figura 19

Cromatogramas ilustrando a curva analtica de calibrao 87 do cetoconazol em metanol Curva analtica de calibrao do cetoconazol Curva de fluxo da formulao de referncia (E) Curva da viscosidade da formulao de referncia (E) 88 97 97

Cromatograma do cetoconazol padro em soluo 105 receptora Cromatogramas das concentraes utilizadas na curva 106 analtica do cetoconazol em soluo receptora Curva analtica do cetoconazol em soluo receptora 107

Estudo in vitro de permeao cutnea da formulao (E) 108 nas 24h Estudo in vitro de permeao cutnea do cetoconazol na 109 formulao (A1) nas 24h Estudo in vitro de reteno cutnea do cetoconazol na 112 formulao (A1) nas 24h

Figura 20 Figura 21

Estudo in vitro de reteno cutnea do cetoconazol da 112 formulao (E) nas 24h Cromatogramas caractersticos da reteno cutnea do cetoconazol nas formulaes no-inicas simuladas no 113 laboratrio Cromatogramas caractersticos da reteno cutnea das 117 especialidades farmacuticas do comrcio Comparativo entre a quantidade retida e a no retida de 120 cetoconazol na formulao(E)-amostra 1-24h (%) Comparativo entre a quantidade retida e a no retida de 120 cetoconazol na formulao(E)-amostra 2 24h (%) Perfil de reteno cutnea (%) nas tomadas de amostra 1 121 e 2-formulao (E) Perfil de reteno cutnea (%) nas tomadas de amostra 1 121 e 2-formulao (A1) Clculo da equao da reta para a obteno do tempo 122 de meia-vida da formulao (E)-tomada de amostra 1 Clculo da equao da reta para a obteno do tempo 123 de meia-vida da formulao (E) tomada de amostra 2 Valores de t para todas as formulaes na tomada de 124 amostra 1 nas 24h Valores de t para todas as formulaes na tomada de 124 amostra 2 nas 24h Valores de t para todas as formulaes em estudo na 126 tomada de amostra 1 nas 24h (exceto G) Valores de t para todas as formulaes em estudo na 126 tomada de amostra 2 nas 24h (exceto G) Interferncia da tomada de amostra no tempo de meia127 vida Interferncia dos emolientes no tempo de meia-vida 127 Interferncia dos emolientes, tomada de amostra e tempo 128 de meia-vida Interferncia do modo de elaborao das emulses no 128 tempo de meia-vida Interferncia do modo de elaborao e tomada de 129 amostra no tempo de meia-vida Interferncia do modo de incorporao do frmaco no 129 tempo de meia-vida

Figura 22 Figura 23 Figura 24 Figura 25 Figura 26 Figura 27 Figura 28 Figura 29 Figura 30 Figura 31 Figura 32 Figura 33 Figura 34 Figura 35 Figura 36 Figura 37 Figura 38

Figura 39 Figura 40 Figura 41

Interferncia do modo de incorporao e tomada de 130 amostra no tempo de meia-vida Valor Total (VT) da reteno cutnea mdia (g/cm2) Anlise por regresso linear da formulao (A1) em relao formulao (E) (g/cm2) 131 132

LISTA DE TABELASTabela 01 Tabela 02 Tabela 03 Tabela 04 Tabela 05 Tabela 06 Tabela 07 Tabela 08 Tabela 09 Tabela 10 Tabela 11 Tabela 12 Tabela 13 Tabela 14 Tabela 15 Tabela 16 Tabela 17a Tabela 17b Curva analtica do cetoconazol em metanol Composio das especialidades farmaceuticas. Composio das especialidades farmacuticas (F), (G), (I) Formulaes no-inicas segundo o sistema EHL. Efeito dos emolientes na formulao contendo o frmaco solubilizado Formulaes emulsionante no-inicas contendo no-inica 76 cera auto 77 78 79 86 e 95 96 98 70 71 72 75

Componentes da Soluo Receptora (SR) Curva analtica do cetoconazol em soluo receptora Anlise por CLAE da soluo padro do cetoconazol Determinao das caractersticas fsico-qumicas da formulao (E) organolpticas

Estudo do comportamento reolgico da formulao (E) Parmetros de qualidade das formulaes genricas

Composio da formulao base no inica pelo 100 sistema EHL Composio da formulao base no-inica contendo 101 cera auto emulsionante Parmetros de qualidade das formulaes no inicas simuladas no laboratrio 102 104 Teor em cetoconazol nas formulaes Resultados do estudo de reteno cutnea do 110 cetoconazol nas formulaes simuladas no laboratrio Resultados do estudo de reteno cutnea do cetoconazol na formulao de referncia (E) e nas formulaes simuladas no laboratrio

111

Tabela 18a

Resultados do estudo de reteno cutnea do cetoconazol nas especialidades farmacuticas genricas do comrcio 116

Tabela 18b

Tabela 19a Tabela 19b Tabela 20 Tabela 21 Tabela 22 Tabela 23 Tabela 24

Resultados do estudo de reteno cutnea do cetoconazol nas especialidades farmacuticas genricas do comrcio 116 Resultados do estudo das formulaes aps o trmino do estudo in vitro (%) 119 Resultados do estudo das formulaes aps o trmino do estudo in vitro (%) Valores dos t (1) e t (2) para todas as formulaes Valores dos t (1) e t (2) para todas as formulaes exceto (G) Mdia s das retenes cutneas nas tomadas de amostras 1 e 2 Anlise da reteno cutnea por regresso linear Porcentuais de reteno cutnea do cetoconazol na pele nas diversas formulaes 119 123 125 131 133 134

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLASA/O CLAE EHL O/A OECD ppm UV gua em leo Cromatografia lquida de alta eficincia Equilbrio hidrfilo-lipfilo leo em gua Organization for Economic Co-Operation and development Partes por milho Ultravioleta

SUMRIO 1 2 33.13.2 3.2.1 3.2.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.4 3.4.1

INTRODUO OBJETIVOS REVISO DA LITERATURAPELEBIOQUMICA DA PELE Queratinizao Lipdios da Superfcie da Pele FUNO BARREIRA E A PERMEABILIDADE CUTNEA Passos Importantes na Absoro Percutnea Interferentes na Absoro Cutnea FORMAS FARMACUTICAS SEMI-SLIDAS DE USO TPICO Emulses

17 20 21 21 22 22 23 24 26 28 34 34 39 40 40 45 47 47 48 50

3.4.1.1 Sistema EHL 3.4.1.2 Estabilidade das emulses 3.4.1.3 Reologia das emulses 3.5 3.6 3.6.1 3.6.2 3.6.3 3.6.4 3.7 3.7.1 3.7.2 3.7.3 3.7.4 MEDICAMENTOS GENRICOS E MEDICAMENTO REFERNCIA AGENTES ANTIFNGICOS Imidazis Cetoconazol Farmacodinmica e Farmacocintica

Determinao Analtica do Cetoconazol em Preparaes 51 Famacuticas

ESTUDOS DE PERMEAO E RETENO CUTNEA IN VITRO

54

Mtodos de Estudo da Permeao e Reteno Cutnea de 54 Frmacos Fundamentos da Permeao Cutnea In vitro 56 Aparelhos utilizados nos Estudo de Permeao Cutnea In vitro 58 Membranas e Solues Receptoras Utilizadas no Estudo de 60 Permeao Cutnea In vitro, em Clulas Tipo Franz

4 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.2 4.2.1

MATERIAL E MTODOS MATERIAIS Frmacos e Medicamentos em Estudo Matrias- primas e Reagentes Equipamentos e Utenslios MTODOS Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)

66 66 66 66 67 68 68 68 69 69 71

4.2.1.1 Condies cromatogrficas 4.2.1.2 Fase Mvel 4.2.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.4 4.4.1 4.4.1.1 4.4.2 4.5 4.5.1 4.5.2 4.5.3 4.5.4 4.5.5 4.6 Construo da curva analtica do cetoconazol por CLAE COMPOSIO FARMACUTICAS. QUALITATIVA DAS ESPECIALIDADES

Preparo das Formulaes para a determinao do Teor em 72 Cetoconazol Determinao das Caractersticas Organolpticas e Fsico- 73 qumicas. Estudo do Comportamento Reolgico DESENVOLVIMENTO DAS FORMULAES SIMULADAS NO LABORATRIO NO-INICAS 73 74

Desenvolvimento de Formulaes No-Inicas pelo sistema 74 EHL Desenvolvimento de diferentes emolientes formulaes no-inicas contendo 75 76

Formulaes No-Inicas contendo Cera Auto Emulsionante ESTUDO DA PERMEAO CETOCONAZOL. Escolha da Soluo Receptora Elaborao da Curva Analtica Preparo das Membranas Permeantes. Ensaio de Permeao Cutnea In vitro do cetoconazol Estudo de Reteno Cutnea In vitro do Cetoconazol ANLISE ESTATSTICA CUTNEA IN VITRO

DO 78 78 79 79 81 82 84 85

5

RESULTADOS E DISCUSSO

5.15.2 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.4

MTODO ANALTICOCURVA ANALTICA DO CETOCONAZOL POR CLAE ANLISE PRELIMINAR DAS ESPECIALIDADES FARMACUTICAS Composio Geral Modo de Elaborao Incorporao do Frmaco Cetoconazol Elementos Oleosos das Formulaes

85 85 89 89 90 91 92

AVALIAO DOS PARAMETROS DE QUALIDADE DA FORMULAO DE REFERENCIA (E) DAS DEMAIS ESPECIALIDADES 94 FARMACUTICAS DO COMRCIO Teor em Cetoconazol Caractersticas Organolpticas e Formulao de Referncia (E) e Farmacuticas do Comrcio Fsico-qumicas da das Especialidades 94

5.4.1 5.4.2

94

5.4.3

Estudo do Comportamento Reolgico da Formulao de Referencia (E) e das Especialidades Farmacuticas do 96 Comrcio SELEO DAS EMULSES NO INICAS SIMULADAS NO 100 LABORATRIO Avaliao dos Parmetros de Qualidade das Formulaes 102 No-Inicas Simuladas no Laboratrio Comparativo dos Teores de Cetoconazol Obtidos por CLAE 103 Para Todas as Formulaes

5.5 5.5.1 5.5.2 5.6 5.6.1 5.6.2 5.7 5.7.1 5.7.2 5.7.3 5.8 5.8.1 5.8.2

ESTUDO IN VITRO DE PERMEAO E RETENO CUTNEA

105

Elaborao da Curva Analtica do Cetoconazol em Soluo 105 Receptora Membrana Permeante ESTUDO IN VITRO DE PERMEAO CUTNEA Anlise da Soluo Receptora Anlise da Membrana Permeante Anlise das Formulaes Aps o Trmino do Estudo In vitro ANLISE ESTATSTICA DOS RESULTADOS DE RETENO CUTNEA Clculo da Cintica de Reteno Cutnea 106 108 108 110 118 122 122

Anlise da Quantidade Total de Frmaco Retido na Pele nas 130 24h

5.8.3

Clculo do Porcentual de Reteno Cutnea por Regresso Linear das Diferentes Formulaes em Funo da Referncia 132 (E) 135 137

6 CONCLUSES REFERNCIAS

1 INTRODUOEstudos in vitro de liberao e absoro cutnea, so extremamente importantes na otimizao das tcnicas de elaborao e da escolha adequada dos componentes das formas farmacuticas de liberao drmica (CHIEN, 2005). No possuem interferentes como nos mtodos in vivo (BARRY, 1983) e freqentemente so realizados para a verificao do comportamento de diferentes veculos das formulaes (LEVEQUE et al., 2003, PERSHING; CORLETT; JORGENSEN, 1993). As vantagens dos mtodos in vitro sobre os in vivo so que nos primeiros podem ser controladas as condies de estudo, no havendo os interferentes biolgicos; alm de no serem dispendiosos e facilmente realizveis (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2007, CHIEN, 2005). Nos estudos in vitro podem-se usar tanto peles humanas como as de espcies animais, sendo a pele de orelha de porco muito utilizada, por possuir caractersticas semelhantes s da pele humana (ANDEGA; KANIKKANNAN; SINGH, 2001, AULTON, 2005). Em produtos dermatolgicos, onde desejvel que o frmaco administrado tenha pequeno fluxo e alta retentividade atravs das membranas (TOUITOU; MEIDAN; HORWITZ, 1998), estes estudos in vitro so realizados de modo que o frmaco seja liberado da formulao onde est veiculado, e se difunda atravs de uma membrana para uma soluo receptora, a qual deve garantir condies termodinmicas favorveis ao frmaco (LPEZ et al., 1998, OECD, 2004). Os estudos in vitro so uma ferramenta muito valiosa e determinante na avaliao do comportamento de formulaes semi-slidas de uso tpico, diante das inmeras variveis que comprometem o processo de fabricao. Atravs deles se obtm dados que possibilitam um maior entendimento dos fatos ocorridos, desde a aplicao na pele, liberao do frmaco da forma farmacutica, reteno e absoro cutnea. (CAMPOS, 1994, NOKHODCHI et al., 2003).

18

Para este trabalho, o frmaco selecionado foi o cetoconazol, um antifngico imidazlico com largo espectro de ao e alguma atividade antibacteriana (FITZPATRICK et al., 1997, FUCHS; WANNMACHER, 1998, KOROLKOVAS, 1998). Justifica-se a nfase s formulaes tpicas com cetoconazol, por serem eficazes em muitos tratamentos de micoses superficiais de pele e mucosas, sem significantes efeitos adversos. O frmaco cetoconazol pela rota oral, ao contrrio, pode provocar efeitos indesejveis como hepatoxicidade e interferncia no metabolismo da testosterona (KOROLKOVAS, 1998, LOW; WANGBOONSKUL, 1999; ROYCHOWDHURY; DAS, 1996). As formulaes emulsionadas oferecem boa aderncia pele e normalmente apresentam comportamento reolgico caracterstico do tipo pseudoplstico que faz com que se deformem e fluam com facilidade quando aplicadas superfcie cutnea, sendo as mais utilizadas como veculo dermatolgico (LABA, 1993). No Brasil o Nizoral descrito como medicamento referncia para o frmaco cetoconazol (BRASIL, 2007), sendo o creme dermatolgico utilizado pela via tpica. Vrios medicamentos genricos so disponveis no mercado brasileiro para uso tpico, na mesma concentrao e forma farmacutica que o medicamento de referncia (BRASIL, 2007). Segundo a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) (BRASIL, 2003), os medicamentos genricos de aplicao (Guia tpica esto e dispensados substituio de de estudos estudos de de bioequivalncia para iseno

bioequivalncia), bastando a comprovao da equivalncia farmacutica para manter a intercambialidade destes com o medicamento de referncia (BRASIL, 2003). No h ainda mtodo analtico reconhecido oficialmente, para a quantificao do cetoconazol em emulses, embora diferentes tcnicas analticas sejam propostas na literatura cientfica para este fim (KEDORHACKMAN et al., 2006, VELIKINAC et al., 2004).

19

A adequada elaborao e utilizao das bases dermatolgicas, a verificao da interferncia dos componentes nelas utilizados, em especial os emolientes e emulsionantes, a forma de incorporao do frmaco e a importncia dos testes in vitro na verificao da liberao e permeao de frmacos de uso tpico, levaram escolha do objeto de estudo deste trabalho onde formulaes contendo o antifngico cetoconazol simuladas no laboratrio e outras especialidades farmacuticas contendo o frmaco cetoconazol, referncia. As anlises realizadas tiveram como objetivo, alm de demonstrar diferenas no comportamento quanto liberao e reteno cutnea do frmaco cetoconazol, realar a importncia dos estudos in vitro como suporte na pesquisa e controle de qualidade de formulaes de uso tpico contendo este frmaco, para as quais no h exigncia de estudos biofarmacuticos por parte da ANVISA. foram analisadas comparativamente ao medicamento

2 OBJETIVOS2.1 OBJETIVO GERALEste estudo teve como objetivo averiguar o comportamento

decorrente das variveis tecnolgicas a que so submetidas as formulaes farmacuticas semi-slidas de uso tpico, e o comprometimento destas com a eficcia do produto final. Para tanto se avaliou a liberao e absoro percutnea do cetoconazol em estudo in vitro, nas formulaes simuladas no laboratrio e nas especialidades farmacuticas disponveis no mercado brasileiro. 2.1.1 Objetivos Especficos a) selecionar mtodo analtico para a quantificao do cetoconazol em formas farmacuticas emulsionadas; b) analisar o medicamento de referncia (Nizoral), as especialidades farmacuticas contendo o frmaco cetoconazol e as formulaes desenvolvidas no laboratrio com relao aos aspectos organolpticos, teor do frmaco, pH e viscosidade; c) realizar para cada formulao, dois ensaios por metodologia in vitro de liberao, reteno e absoro cutnea do cetoconazol, tomando como variveis as tomadas de amostra; d) verificar a interferncia dos emolientes e emulsionantes, modo de elaborao e modo de incorporao do frmaco, por meio dos estudos in vitro de permeao e reteno cutnea.

3 REVISO DE LITERATURAA estrutura adotada para o referencial terico segue um

encaminhamento lgico para possibilitar o entendimento das variveis que compem o processo de absoro cutnea. Desta forma, suas relaes com o tema proposto visam: a) possibilitar a compreenso, sobre caractersticas e funes da pele, e fatores que interferem na absoro cutnea; b) conhecer sobre os medicamentos antifngicos tpicos, em especial com cetoconazol; propor formulaes e analis-las em funo de um medicamento de referncia; c) conhecer sobre as metodologias in vitro de permeao cutnea, e possibilitar as anlises dos medicamentos simulados e referncia do comrcio, em confronto com a legislao para genricos vigente no Pas.

3.1

PELEA pele o mais extenso rgo do corpo humano, aproximadamente

5% do peso total e o principal meio de comunicao com o exterior. Em um indivduo adulto de peso e altura mdios, a superfcie da pele de 2m2, seu peso correspondente a 4,2 kg, e recebe cerca de um tero do sangue circulante no corpo. Constitui um limite anatmico e uma barreira de proteo contra ataques fsicos, qumicos e contra microorganismos, imprescindvel existncia de vida, alm de outras caractersticas peculiares que variam com sua localizao e funo especficas (CHIEN, 2005, FITZPATRICK, 1997). Microscopicamente a pele um rgo composto de multicamadas, mas geralmente descrito por trs camadas, que num corte perpendicular visto de fora para dentro, so: epiderme, derme e hipoderme.

22

3.2 BIOQUMICA DA PELEO pH da superfcie cutnea para muitos autores, um importante indicador funcional da pele e sua determinao na superfcie cutnea, modernamente por metodologias cada vez menos invasivas de estudo cutneo, tm motivado muitos pesquisadores. Um exemplo de moderno equipamento o Phmeter que avalia o pH superficial da pele, por potenciometria direta, isto , por meio de um eletrodo especial, o qual permite sensibilidade de determinao da ordem de 0,1 unidades de pH (LEONARDI; GASPAR; CAMPOS, 2002, RIEGER, 2000). O pH da superfcie cutnea devido produo de cido ltico, conferindo superfcie da mesma, o que se convencionou chamar de manto cido cutneo. Desta maneira, a pele apresenta pH levemente cido (4,6 5,8), o que contribui para aes bactericida e fungicida em sua superfcie. A proteinase, ativa no pH fisiolgico da pele pode participar modulando a resposta inflamatria nas injrias celulares (LEONARDI; GASPAR; CAMPOS, 2002, RIEGER, 2000). As secrees cutneas apresentam aprecivel capacidade tamponante, fato importante, uma vez que o pH da pele freqentemente alterado em conseqncia da utilizao de produtos tpicos inadequados, deixando-a exposta a agentes agressores especialmente microorganismos (LEONARDI; GASPAR; CAMPOS, 2002, RIEGER, 2000). Alguns processos importantes esto envolvidos na manuteno do equilbrio da superfcie cutnea, como: 3.2.1 Queratinizao o processo pelo qual se formam as protenas caractersticas dos plos, das unhas e da epiderme, e consiste na oxidao de duas molculas de cistena para constituir uma de cistina (CHIEN, 2005).

23

Testes histoqumicos indicam que na regio da camada granular da pele humana normal, h um sistema de alta energia, responsvel pela sntese de queratina a partir de polipeptdios no citoplasma das clulas epidrmicas. Por intermdio da queratinizao a epiderme consegue exercer suas principais funes: construir uma camada crnea resistente e impermevel e produzir uma camada de Malpighi com grande coeso assegurada por desmossomas, elasticidade uma vez que a pr-queratina pobre em enxofre (CHIEN, 2005). Cornificao: o processo onde as clulas vivas so convertidas em material crneo. a modificao que ocorre em plos, unhas e clulas epidrmicas, associada a morte celular e perda de suas organelas. 3.2.2 Lipdios da Superfcie da Pele O contedo lipdico extracelular (sebo), produto das glndulas sebceas, basicamente uma mistura de lipdios polares denominados triglicerdios, cidos graxos livres, ceras, esteris (colesterol), esqualeno e parafinas. As ceramidas representam at 50% deste contedo. Os cidos graxos livres conferem ao sebo, atividades bactericidas e fungicidas. A pele contm dois cidos graxos insaturados essenciais, o cido linolico e o cido araquidnico. cido linolico tem sido relatado em vrios trabalhos como importante na regulao das funes barreira da pele. cido araquidnico pode contribuir no guarnecimento de prostaglandinas (FORSLIND et al.,1997). Mais de um tero dos lipdios do estrato crneo tem comprimento de cadeia maior que 22 carbonos, enquanto nas membranas celulares h a predominncia de lipdios com 16 a 18 carbonos (CHIEN, 2005). Segundo Forslind et al. (1997), o sebo produzido em maior quantidade na testa, menor no tronco e em quantidades mnimas nas extremidades e fatores como a idade, mudanas significativas de estao e de clima, afetam a taxa de produo e o contedo dos lipdios da superfcie cutnea.

24

3.3

FUNO BARREIRA E A PERMEABILIDADE CUTNEAA pele desempenha muitas e variadas funes, mas em relao

permeao cutnea humana a funo mais importante a de proteo (FORSLIND et al., 1997). O local da pele conhecido como zona barreira, representada por trs distintas camadas o estrato crneo, epiderme vivel, e derme alm da rede de capilares sanguneos, folculos pilosos, glndulas sebceas, e sudorparas (CHIEN, 2005), o responsvel pela proteo da pele, agindo como barreira contra agentes externos como descrito a seguir: a) Barreira microbiolgica: o estrato crneo a primeira barreira para microorganismos, e muito embora o manto cido (produzido pelas secrees ecrinas e sebceas a pH 4,2-5,6) no seja muitas vezes suficiente para defender a pele contra as bactrias, existem ainda secrees pelas glndulas da pele de cidos graxos de cadeia curta, os quais inibem o crescimento de fungos e bactrias (AULTON, 1988); b) Barreira qumica: uma importante funo da pele humana barrar a entrada de molculas indesejveis de fora para dentro, enquanto controla a perda de gua, eletrlitos e outros constituintes endgenos. O estrato crneo praticamente impermevel a todas as substncias qumicas no gasosas agindo assim como passo limitante para a absoro percutnea (AULTON, 1988); c) Barreira radiao: para a pele exposta luz do sol, a radiao ultravioleta 290-400nm a mais danosa, e desta exposio trs principais reaes agudas so percebidas, eritema, pigmentao (produo de melanina como resultado da estimulao dos melancitos) e engrossamento da epiderme. Reaes crnicas exposio desta radiao incluem envelhecimento e cnceres de pele (AULTON, 1988);

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d) Barreira ao calor e regulador trmico: a pele (estrato crneo), por sua extenso por todo o corpo, o primeiro rgo responsvel pela manuteno da temperatura do corpo em 37C, tendo papel importante a circulao perifrica, as glndulas e demais constituintes (AULTON, 1988); e) Barreira eltrica e mecnica: a pele possui uma resistncia e impedncia muito maior que outros tecidos biolgicos, e exerce proteo contra agresses mecnicas, atravs de engrossamentos e calosidades (AULTON, 1988). A denominao permeao percutnea de substncias em um sistema transdrmico ou em preparaes dermatolgicas, representa o caminho destas atravs das camadas da pele at a corrente linftica e sangnea, que lhes transportaro at os rgos os quais as retero de acordo com suas respectivas afinidades (JATO, 1997). Em preparaes dermatolgicas, embora seja importante que o frmaco penetre alm da superfcie, normalmente no se deseja que o medicamento penetre na circulao sistmica (JATO, 1997). Em mdia, na superfcie cutnea existem 40-70 folculos pilosos e 200-250 ductos sebceos por metro quadrado de rea de pele e por eles a absoro cutnea muito intensa (CHIEN, 2005, JATO, 1997), entretanto, estes apndices da pele representam apenas 0,1% da superfcie cutnea total, e desta maneira, a absoro percutnea pela via transepidrmica se torna a principal via de permeao de absoro de frmacos (ANSEL; POPOVICH; ALLEN, 2000). As vias seguidas pelo frmaco na permeao percutnea so descritas e ilustradas na Figura 1: a) por difuso atravs das clulas penetrao transcelular (atravs dos cornecitos e matriz lipdica intercelular);

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b) por difuso entre as clulas penetrao intercelular (por entre os cornecitos e pela matriz lipdica); c) por difuso atravs dos folculos pilosos, glndulas sudorparas e sebceas, e anexos pilosebceos penetrao transanexal (ANSEL; POPOVICH; ALLEN, 2000). Em quaisquer dos caminhos que a permeao possa ocorrer, a estrutura do estrato crneo obriga o frmaco a se difundir atravs das bicamadas lipdicas intercelulares (ROUGIER, 1983).

Figura 1

Esquema representativo das vias de penetrao do frmaco atravs do estrato crneo (via transcelular e via intercecular)

Fonte:

MARTINS; VEIGA (2002)

3.3.1 Passos Importantes na Absoro Percutnea Na absoro cutnea, interferem os seguintes fatores: a) liberao do frmaco do veculo;

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b) penetrao atravs das barreiras da pele; c) ativao da resposta farmacolgica. Estes passos determinantes para a absoro cutnea so afetados por fatores como tipo, condio e a presena de umidade na pele (ANSEL; POPOVICH; ALLEN, 2000) a natureza do frmaco (propriedades fsicas e qumicas) e do veculo utilizado (CAMPOS, 1994, JATO, 1997). As partculas do frmaco inicialmente precisam ser solubilizadas para que ento possam sofrer partio e se difundir passivamente para a interface veculo/estrato crneo. Algumas substncias podem se ligar ou ficar retidas em determinados locais deste, ou ento sofrer nova partio para uma segunda interface estrato crneo/epiderme vivel (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2007). O processo de difuso ocorre espontaneamente sendo acompanhado de perda de energia livre (G) do sistema. A difuso pode ser definida como, a transferncia espontnea de um componente de uma regio com alto potencial qumico, para uma regio com potencial mais baixo, sendo o gradiente de concentrao a fora condutora neste processo (AULTON, 2005). As leis que descrevem o fenmeno de difuso, normalmente so expressas em termos de gradientes de concentrao como, por exemplo, a primeira Lei de Fick, que indica que a taxa de difuso proporcional ao gradiente de concentrao, conforme a eq. (1): J = dm/ dt = - D dC /dx Onde: O fluxo J do frmaco expresso em termos de quantidade (dm) transportada em determinado tempo (dt) atravs de um plano por unidade de rea (dC/dx) fornece o gradiente de concentrao D que o coeficiente de difuso expresso em unidades de rea por unidade de tempo (AULTON, 2005). (1)

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A segunda Lei de Fick geralmente empregada em experimentos onde se emprega uma e membrana no outro permeante separando dois a compartimentos, tendo-se num deles a maior concentrao do frmaco (compartimento doador) (compartimento receptor) concentrao zero (sink conditions) mantendo assim o gradiente de concentrao, a quantidade acumulada do frmaco (m) que passa atravs da membrana, por unidade de rea e como funo do tempo at alcanar o estado de equilbrio pode ser expressa na eq. (2) a seguir: (dm/dt) = DC0K / h Onde: C0 a concentrao constante do frmaco na soluo doadora, K o coeficiente de partio do soluto entre o veculo e a membrana, h a espessura da membrana. Quando plotados em um grfico o tempo de absoro (t) e a quantidade acumulada absorvida (m) por unidade de rea de membrana como funo do tempo, o equilbrio verificado quando o grfico se torna linear, e os dados desta poro linear, extrapolados, de modo a obter o intercepto da curva quando m = 0 fornecem o lag time (tempo que leva para comear a ocorrer a absoro) (AULTON, 2005). 3.3.2 Interferentes da Absoro Percutnea Pelo fato da pele ser composta de complexas e heterogneas camadas laminares, onde cada lmina contribui com uma resistncia difusional especfica, e por fatores inerentes ao frmaco alm de outras variveis envolvidas no processo, o processo de absoro percutnea pode ser favorecido ou no por situaes especficas, e algumas destas caractersticas so relatadas a seguir. (2)

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Sendo o fluxo do soluto proporcional ao gradiente de concentrao atravs membranas, ento para um mximo de fluxo necessrio que a soluo doadora seja saturada, e isto pode ser conseguido otimizando-se a solubilidade do frmaco atravs da melhor composio do veculo, e da escolha da soluo no compartimento receptor pela experimentao com uma srie de solventes apropriados (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2007, AULTON, 2005, JATO,1997, MARTINS; VEIGA, 2002). O coeficiente de partio fator importante para estabelecer o fluxo do frmaco atravs da membrana. Quando a membrana a maior fonte de resistncia difusional no processo, a magnitude do coeficiente de partio muito importante, e isto freqentemente ocorre na permeao percutnea, quando a impermeabilidade do estrato cneo o passo limitante na absoro, sendo ento o coeficiente de partio estrato crneo/veculo crucialmente importante para o estabelecimento da alta concentrao inicial do frmaco na primeira camada da membrana (ALLEN, POPOVICH, ANSEL, 2007; AULTON, 2005; JATO,1997); Embora a concentrao diferencial do frmaco entre as duas fases, doadora e receptora, seja a fora condutora para o processo de difuso, o gradiente qumico potencial ou gradiente de atividade o parmetro fundamental. A atividade termodinmica do frmaco na fase doadora ou a membrana pode ser radicalmente alterada por mudanas no pH, formao de complexos ou a presena de tensoativos, ou cosolventes. Tais fatores tambm modificam o coeficiente de partio efetivo (AULTON, 2005). cidos e bases fracas se dissociam em diferentes graus dependendo do pH do meio e do seu pKa ou pKb, e o lado onde a proporo do frmaco no ionizado for maior (somente as molculas no ionizadas do frmaco passam facilmente atravs das membranas lipdicas) ir determinar o gradiente efetivo atravs da membrana (AULTON, 2005, LEONARDI; GASPAR; CAMPOS, 2002). Misturas cosolventes polares tais como propilenoglicol e gua podem produzir solues saturadas e maximizar o gradiente de concentrao atravs do estrato crneo. No entanto o coeficiente de partio de um

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frmaco entre o veculo e estrato crneo diminui, com a solubilidade do frmaco na mistura solvente. Este dado importante, quando no se deseja a promoo da penetrao do frmaco, ento na formulao deve-se proceder a solubilizao deste no veculo at prximo da saturao (AULTON, 2005). O efeito do uso dos tensoativos na pele relatado como sendo no abaixamento da tenso interfacial e mudanas na conformao protica do estrato crneo. A formao de complexos afeta a permeao do frmaco de maneira semelhante a solubilizao micelar. Quando o complexo se forma ocorre mudanas na aparente solubilidade e aparente coeficiente de partio do frmaco (AULTON, 2005); O manto superficial (0,4-10m) dificilmente afeta a absoro percutnea. Os apndices podem ser uma rota importante apenas para ons e molculas grandes polares (pesos moleculares acima de 500 Daltons) os quais tm dificuldade de atravessar o estrato crneo intacto. Pela via epidrmica, as molculas penetram pelo estrato crneo ou intercelularmente ou transcelularmente. Na queratina intracelular presente na formao em mosaico das regies polar e no polar, frmacos se dissolvem e se difundem de acordo com suas afinidades qumicas. Os lipdios neutros da via intercelular provm uma rota alternativa (AULTON, 2005, JATO, 1997). O dinmico processo de absoro percutnea sofre variaes de fatores biolgicos tais como idade e a condio e a localizao da pele. A literatura relata que peles do feto e de tecido jovem so mais permeveis que as de tecido adulto. A condio da pele importante uma vez que muitos solventes rompem ou modificam a complexa estrutura da camada crnea intacta. Em estados doentis onde h a caracterizao de modificao na camada crnea, uma maior permeao percutnea verificada. A espessura e a natureza da camada crnea promovem variaes na permeabilidade cutnea, assim como a densidade dos apndices cutneos.Peles de diferentes animais diferem largamente na espessura, densidade de glndulas e de folculos pilosos e ainda no suprimento sanguneo, entre outros fatores, os afetam as rotas de

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penetrao

e

a

resistncia

permeao.

Estudos

comparativos

demonstraram que as peles de macacos e porcos so mais prximas humana sendo embora mais permeveis que esta, a pele de ratos sem pelos tem algumas caractersticas similares humana, sendo tambm mais permeveis que esta (AULTON, 2005). As interaes frmaco/pele e a hidratao da pele so fatores importantes na absoro percutnea. Quando a gua satura a pele, sua permeabilidade aumenta acentuadamente. Muitos compostos podem possibilitar esta funo, como cidos graxos livres, pirrolidonas, uria, sdio, clcio, potssio, lactato, complexos entre protena-acar ou misturas destes compostos. Pode ser particularmente importante, a interao do frmaco com a pele, resultando em reservatrio do frmaco na camada crnea, como acontece com os filtros solares e produtos tpicos contendo esterides (AULTON, 2005, MARTINS; VEIGA, 2002). Igualmente importantes so as interaes veculo/pele. O veculo pode modificar o estado e a permeabilidade da pele: alterando sua hidratao, veculos oclusivos como leos e gorduras reduzem ou previnindo a perda de gua, aumentando a umidade da pele e assim promovem a penetrao; grande variao na temperatura pode aumentar a taxa de penetrao na pele humana at dez vezes, veculos oclusivos aumentam a temperatura da pele em alguns graus, se mas seu efeito ao sobre a permeabilidade cutnea pequeno comparado efeito da

hidratao; uso de promotores de absoro (meios qumicos), substncias que podem temporariamente diminuir a impermeabilidade da pele, e sendo seguros e no txicos, podem ser usados clinicamente para aumentar a penetrao de frmacos (FEMENA-FONT et al., 2005). Um promotor de penetrao cutnea ideal, segundo Femena- Font al. (2005), logo aps sua remoo deve permitir a rpida recuperao da propriedade barreira da pele; deve ter outros atributos como, ser compatvel com o frmaco e demais excipientes; ser um bom solvente para o frmaco aumentando a efetiva concentrao do frmaco no veculo e deve possibilitar boa espalhabilidade da formulao e agradvel sensao na pele; deve

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possibilitar sua incorporao em todas os tipos de preparaes usadas topicamente alm de no possuir cheiro, odor, cor e ser economicamente vivel, alguns exemplos de promotores com estas caractersticas so o miristato de isopropila, steres do cido nicotnico; fosfolipdios hidrogenados de soja; leos essenciais, etanol; n-octanol e decanol e terpenos (NOKHODCHI, 2003). Dificilmente uma s substncia possuir todas estas propriedades desejadas (AULTON, 2005, MARTINS; VEIGA, 2002). Por segurana e eficincia o melhor promotor de penetrao a gua. Todas as substncias penetram melhor atravs da pele hidratada que da pele seca, ento qualquer substncia qumica inativa, no txica que promova hidratao da camada crnea pode ser considerada como um promotor de penetrao. Os mais efetivos promotores de absoro so os solventes aprticos como o dimetilsulfxido (DMSO), dimetilformamida (DMF) e dimetilacetamida (DMA), possuindo vrios dos atributos mencionados para um promotor ideal. As pirrolidonas podem ser usadas com uma srie de frmacos para promover a penetrao e tambm estabelecer um reservatrio do frmaco no estrato crneo e unhas. Os agentes de superfcie podem promover a absoro pelos apndices por reduzir a tenso superficial. Os tensoativos, especialmente os aninicos alteram a conformao em hlice das protenas do estrato crneo. Estudos de Nokhodchi et al. (2003), relatam que tanto os tensoativos aninicos quanto os no inicos tm o poder de aumentar a penetrao de alguns frmacos pouco solveis em gua e que a concentrao destes tem importante papel na solubilidade aparente do frmaco. O Tween 80, segundo os resultados destes estudos, aumenta a capacidade de penetrao do lorazepam via ambos o mecanismo molecular hidroflico e o lipoflico, pois sua estrutura lhe confere ambas as caractersticas lipoflicas e hidroflicas na molcula o que permite uma maior partio entre os lipdios e protenas. Derivados de longas cadeias dos sulfxidos tais como o decilmetilsulfxido, em baixas concentraes, provavelmente exercem seu efeito como promotores.

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Baixas concentraes de propilenoglicol e lcool no so potentes promotores. Em estudos de Fang et al. (2003), o frmaco lipoflico flurbiprofeno foi veiculado num hidrogel formado com polmeros de celulose, e nestes, a presena de propilenoglicol proporcionou maior solubilizao do frmaco no veculo, e embora tenha havido retardamento no incio do fluxo, no houve alterao da taxa de liberao do frmaco para a pele. Em estudo de outros autores, o propilenoglicol quando em combinao com o cido olico e/ou lcool olico, mostra eficiente ao promotora da permeao cutnea, para algumas molculas (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2007, AULTON, 2005, MARTINS; VEIGA, 2002). As interaes fmaco/veculo so tambm muito importantes na absoro percutnea, quando a impermeabilidade do estrato crneo no o fator determinante, e sim a liberao do frmaco no veculo, o passo limitante para a penetrao cutnea. Isto acontece quando a difuso do frmaco no veculo excepcionalmente baixa ou quando o veculo possui a capacidade de controlar a liberao do frmaco (sistemas de liberao de frmacos com taxa controlada) (AULTON, 2005).

34

3.4

FORMAS FARMACUTICAS SEMI-SLIDAS DE USO TPICOEm geral, os medicamentos destinados pele, podem ser de

aplicao tpica ou sistmica. As formas farmacuticas semi-slidas de uso tpico so preparaes destinadas a uma ao sobre a pele e mucosas, acessveis ao meio externo. Os medicamentos sistmicos so administrados pela via oral, medicamentos injetveis, ou atravs de sistemas transdrmicos e se distribuem por todo o organismo. Os frmacos contidos em uma formulao tpica so incorporados aos excipientes e assim, conforme as combinaes entre eles, as preparaes tpicas apresentam composio e consistncia diversas. Os excipientes determinam a natureza, a consistncia e tambm o grau de penetrabilidade. As formas farmacuticas dermatolgicas usadas com maior freqncia so pomadas, cremes, loes e solues tpicas, embora outras formas farmacuticas como pastas, linimentos; ps; gis; tinturas; e aerossis sejam tambm usadas, mas em menor proporo (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2007). Entre as formas farmacuticas semi-slidas descritas na literatura, merecem destaque os cremes, em especial os do tipo O/A, por apresentarem facilidade de aplicao, espalhabilidade sobre a pele e facilidade de veiculao de frmacos. Os cremes constituem formas farmacuticas semi-slidas obtidas por emulso. Sua natureza anfiflica e similaridade com a epiderme humana permitem elevada eficincia na veiculao de frmacos (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2007, AULTON, 2005;). 3.4.1 Emulses Pela emulsificao, h a possibilidade de misturas estveis e homogneas de dois lquidos imiscveis ou relativamente imiscveis entre si.

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Tem-se uma emulso quando um lquido estiver dividido (fase interna, dispersa ou descontnua) em pequenssimos glbulos no seio de outro (fase externa, dispersante ou contnua). As emulses so classificadas de acordo com a natureza lipoflica (ou hidrofbica) da fase dispersante em sistemas leo em gua (O/A) ou sistemas gua em leo (A/O), e ainda de acordo com a sua utilizao, em de uso interno ou externo: a) para uso interno: as emulses administradas por via oral so exclusivamente do tipo O/A; b) para uso externo: podem ser tanto O/A quanto A/O, dependendo da natureza do frmaco a ser incorporado, da via de administrao, tipo de emolientes na formulao e condio da superfcie cutnea (ANSEL; POPOVICH; ALLEN, 2000). A miscibilidade ou a solubilidade em leo e em gua do frmaco que vai ser usado numa preparao emulsificada, fator determinante para a escolha do veculo adequado, sendo os frmacos quando incorporados na fase interna da emulso, menos irritantes para a pele (LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001). A fase aquosa em geral gua destilada ou deionizada, j que a presena de sais de clcio na gua dura seriam elementos desestabilizadores da emulso. Nesta fase podem ser incorporados os elementos hidrossolves; frmacos, conservantes, tampes, corretivos de pH, antioxidantes, conservantes, sequestrantes, corantes, edulcorantes, aromatizantes (LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001); A fase oleosa composta de componentes oleosos ou emolientes e responsvel por caractersticas importantes da emulso que podem ser moduladas conforme a natureza do elemento oleoso escolhido. Esta escolha pode ser baseada em vrios critrios, como propriedades fsico-qumicas (estabilidade frente a cidos e bases, ponto de fuso,

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polaridade), e estrutura qumica do emoliente, a qual responsvel pela grande maioria das propriedades que as emulses apresentam ao serem aplicadas pele (espalhabilidade, grau de absoro, da emolincia, umidade e lubrificao, toxicidade, viscosidade, controle

comedogenicidade), e permite ainda predizer sobre a estabilidade das mesmas frente hidrlise cida e alcalina. Alguns exemplos so steres de cidos e lcoois graxos; leos de origem vegetal como os de ssamo, arroz, semente de algodo; hidrocarbonetos derivados do petrleo e triglicerdios de origem animal. Pela anlise preliminar e seleo dos emolientes podemse influenciar os parmetros tecnolgicos, sensoriais e mercadolgicos, de maneira controlada (SANCTIS, 2000). As caractersticas impostas emulso pela utilizao de um ou combinao de emolientes especficos, interferem no processo de permeao cutnea do frmaco nela veiculado (AULTON, 2005). O agente emulsivo, alm de facilitar a obteno da fase dispersa, contribui para a estabilizao termodinmica da emulso por provocar modificaes nas propriedades reolgicas da mesma (JATO, 1997) So substncias que reduzem a tenso interfacial entre a gua e o leo, e assim reduzem a energia que necessria para dispender um lquido no outro. Os tensoativos so substncias formadoras de filme em volta de cada gotcula da fase dispersa, de modo a originar uma barreira (mecnica) que evite a coalescncia das gotculas quando contatam umas com as outras (JATO,1997, LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001). Os filmes formados, dependendo da natureza do agente emulsivo podem ser representados por uma camada monomolecular, multimolecular ou partculas slidas finamente divididas (JATO, 1997). Os agentes emulsivos sintticos em relao estrutura molecular e a natureza de seus grupos polares podem ser classificados em tensoativos anfteros, aninicos, catinicos e no-inicos. Estes agentes contm grupos lipfilos e hidrfilos sendo que a parte lipfila, geralmente a responsvel pela atividade superficial Os agentes emulsivos no-inicos no tm tendncia a se ionizar, e dependendo de sua natureza podem formar

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emulso O/A ou A/O (LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001). Em soluo aquosa possuem grupo polarizado, mas no ionizvel. A poro hidroflica pode ser um lcool, glicerol, sorbitol, poliglicol, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, amidoglicol e alcanolamidas. A parte hidrofbica pode ser representada por um grupo alquil ou grupo alquil aril. Os no-inicos so os mais empregados em emulses destinadas ao uso tpico. Os lcoois e steres polioxietilnicos onde a frao lipoflica representada pelos cidos, esterico; palmtico; olico e ricinolico so os mais empregados atualmente e considerados os menos irritantes para a pele, pois no desnaturam as protenas. Exemplos importantes so os steres de glicerol, steres de glicis, steres de polietilenoglicis, steres de sorbitano e lcoois graxos etoxilados. Os derivados de lanolina, fraes ricas em esteris etoxilados, so emulsionantes primrios muito complexos, mas com boas propriedades eudrmicas. Estes tensoativos so eficazes na faixa de pH de 3-10 (ANSEL; POPOVICH; ALLEN, 2000). A relao do volume da fase interna com o da fase externa, e a natureza inica so caractersticas importantes e primordiais na escolha do tensoativo na elaborao da emulso desejada (JATO, 1997, SANCTIS, 2000); Alm das substncias mencionadas, outros componentes so utilizados como reguladores da viscosidade entre estes esto os polmeros hidrfilos e hidrocolides derivados da celulose (quando a fase externa for aquosa) e lanolina e substncias com caractersticas plsticas, (quando a fase externa for oleosa) (LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001). Os emulsificantes auxiliares so denominados espessantes, normalmente hidroflicos, evitam a coalescncia das emulses por aumentar a viscosidade da fase externa (goma xantana, caraia, arbica, polmeros carboxivinlicos, derivados de celulose, e outros) (LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001). Os umectantes so substncias utilizadas para impedir ou retardar a formao de cristais devido evaporao ou secagem completa da fase aquosa. Exemplos de umectantes mais empregados so a glicerina, o propilenoglicol e o sorbitol (LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001).

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Os

silicones,

os

polissiloxanos,

possuem

inrcia

qumica,

muito

especialmente em relao oxidao. A elevao de temperatura afeta pouco, a sua viscosidade. Fixam-se superfcie de diversos materiais, tornando-os hidrofbicos (o grupo siloxano se orienta para a superfcie contactante, e os radicais orgnicos hidrofbicos se voltam para o exterior). O aquecimento exalta a hidrorepelncia, pois ao serem aquecidas as molculas dos silicones desdobram-se, criando mais pontos de apoio na superfcie de contacto. So destitudos de toxicidade e a aplicao cutnea mesmo prolongada no produz irritao (LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001). Entre os antioxidantes e conservantes (preservantes), os mais utilizados nas preparaes semi-slidas para uso tpico so os que atuam por mecanismos preventivos impedindo a auto-oxidao na presena de metais. Entre estes, o butilhidroxitouleno (BHT) recomendado como uma alternativa ao tocoferol numa concentrao de 10 ppm para estabilizar a parafina lquida Os steres do cido glico so muito utilizados (propil, octil e dodecil ster) para leos fixos em concentraes acima de 0,001% e para leos essenciais em concentraes acima de 0,1%.(AULTON, 1988). Os steres do cido para-hidroxibenzico (metil, etil, propil e butil) e seus sais largamente usados para a conservao das emulses, nas concentraes de 0,1 0,2%. O metabissulfito de sdio possui efeito antioxidante e inibidor sobre a proliferao de microorganismos, mais efetivo na faixa de pH 7-9. Ainda utilizado o clorocresol, em concentraes em torno de 0,1%, com atividade reduzida na presena de leos fixos de origem animal ou vegetal, e em pH alcalino; o fenoxietanol (0,5-1,0%), que devido a sua inefetividade frente a bactricas Gram-negativas, geralmente associado a outros preservantes como os steres do cido para-hidrobenzico; o bronopol (0,02%), geralmente em combinao com outros preservantes; os compostos quaternrios de amnio, usados principalmente como antispticos para administrao tpica, e a cetrimida, utilizado como agente emulsificante primrio.

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Normalmente alm da estabilizao do frmaco, o uso destes agentes potencializa a ao conservante por promover a quelao dos metais essenciais ao crescimento dos microorganismos, sendo o cido ctrico, o agente sequestrante de metais mais usados na proteo dos leos devido sua inocuidade e o EDTA (cido etilenodiaminotetractico e seu sal sdico), desprovido de toxicidade largamente aplicado na proteo de preparaes farmacuticas (LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001). 3.4.1.1 Sistema EHL Os emulsificantes geralmente possuem uma parte hidrfila e uma lipfila, com predominncia de uma delas (fato que influencia o tipo de emulso formada). Segundo o equilbrio hidrfilo-lipfilo (EHL), para cada substncia se atribui um nmero ou valor de EHL, que indica a polaridade da substncia. Os valores usuais so de 1-20, embora cheguem a 40. Os nmeros mais elevados correspondem aos elementos altamente polares ou hidroflicos, e os mais baixos aos menos polares ou lipoflicos (LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001). No sistema EHL tambm se atribui um valor de EHL aos leos e substncias semelhantes, e quando da elaborao da emulso, escolhemse os emulsificantes que possuam o valor de EHL mais prximo ao valor da fase oleosa da emulso pretendida. Os agentes emulsificantes so compostos tensoativos com valores de EHL de 3 a 6, e numa emulso reduzem a tenso interfacial entre o leo e a gua, minimizando a energia superficial pela formao de glbulos (so altamente lipoflicos). Estes valores de EHL so utilizados para os clculos da porcentagem necessria do emulsificante, sendo muitas vezes utilizada uma mistura deles com timos resultados (ANSEL; POPOVICH; ALLEN, 2000; LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001).

40

3.4.1.2 Estabilidade das emulses As emulses so termodinamicamente instveis, possuindo um tempo de vida limitado e a instabilidade destas formulaes farmacuticas pode ser detectada em alguns casos por uma mudana na aparncia fsica, na cor, no odor e na textura, enquanto em outros casos, podem ocorrer alteraes qumicas que no so evidentes e que s podem ser verificadas por anlises qumicas (LACHMAN; LIEBERMAN; KANIG, 2001). Os dados obtidos pelo estudo da estabilidade de uma formulao, levam a previso do prazo de validade esperado para o produto e se necessrio a um novo procedimento para a formulao (TADROS, 2004, VOIGT, 1982). Uma emulso considerada estvel quando mantm os constituintes da fase oleosa dispersa na fase dispersante, ou vice-versa, mesmo, quando submetida a tenses decorrentes de temperatura, agitao e gravidade. Durante o desenvolvimento da uma formulao para abreviar os conhecimentos sobre a compatibilidade da formulao, sobre a embalagem e prazo de validade do produto pronto, se faz uso de condies exageradas de temperatura, umidade, luz e outros, para avaliar a estabilidade das formulaes farmacuticas (TADROS, 2004). 3.4.1.3 Reologia das emulses Reologia o estudo da deformao e fluidez dos materiais sob a influncia de foras externas. Tecnicamente definida como a resistncia ao fluxo ou ao movimento (CHIEN, 2005). As propriedades reolgicas de produtos farmacuticos so sempre de fundamental importncia, seja na elaborao, no desenvolvimento ou na avaliao de formas farmacuticas (AULTON, 2005). Na elaborao de produtos farmacuticos semi-slidos, se faz necessrio a padronizao do desenvolvimento e da produo, a fim de se obter e conquistar a credibilidade dos consumidores, e caracterstica muito

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importante para aceitao neste tipo de produto a observao da aparncia (principalmente a consistncia). Estes mesmos produtos precisam ter garantido sua qualidade e estabilidade quando transportados de um local a outro, e para isto so submetidos a mtodos de anlise para detectar mudanas devido ao estresse mecnico, e s flutuaes de temperatura (BRUMMER; GODERSKY, 1999). A viscosidade de materiais no-newtonianos determinada pelo viscosmetro rotacional, capaz de produzir diferentes velocidades de cisalhamento, medir a tenso de cisalhamento e criar um grfico com os resultados obtidos (AULTON, 2005). As medidas reolgicas provm informaes sobre a estabilidade fsica e a consistncia da emulso. essencial realizar as medidas reolgicas como funo da temperatura (TADROS, 2004). Diferentes foras agem sobre os materiais, em funo das condies de estocagem, processamento ou condies de aplicao e a resultante destas foras, pode modificar o comportamento reolgico destes materiais. Considerando-se um fludo contido entre duas placas planas paralelas de rea A, separadas por uma distncia y, uma fora F aplicada na parte superior, movimentando a placa a uma velocidade v, constante em relao placa inferior, que mantida fixa (Figura 2).

Figura 2 Fora sobre um fludo

de

cisalhamento

aplicada

Fonte:http://www.deq.ufpe.br/disciplinas/MecFluidos/REOGIA_ DE_FLUIDOS.pdf

42

Somente poucos materiais seguem a lei de Newton, isto , exibem uma direta proporcionalidade entre a tenso () e a taxa de cisalhamento () segundo mostra a eq. (3), conhecida como equao de Newton, onde () definida como viscosidade absoluta, dinmica (constante), isto inclui lquidos de baixo peso molecular (gua, glicerina, clorofrmio); solues verdadeiras (xaropes); e sistemas coloidais polimricos muito diludos.

= .As dimenses de viscosidade () so:

(3)

Pascal/(1/segundo) = Pascal . s (Pa.s), onde: 1 Pascal (Pa) = 10 dyn./cm2 , 1 Pa.s= 10 poise, 100cP = 1 poise 1 cP = 1 m Pa.s sendo 1cP = 1centi-poise, 1000 m Pa s = 1 Pa.s

Na representao grfica, a curva de fluxo ou reograma em coordenadas cartesianas dos fludos newtonianos, mostra uma relao linear e passa pela origem, sendo a sua inclinao, igual a viscosidade nica do fludo. Outra forma de analisar o comportamento do fludo verificando a relao entre a viscosidade e a taxa de cisalhamento (curva da viscosidade). Para o fludo newtoniano, esta relao uma reta paralela aos eixos das taxas de cisalhamentos (viscosidade constante) (LABA, 1993, TADROS, 2004). Todo fludo cuja relao entre a tenso de cisalhamento e a taxa de cisalhamento, no constante, denominado de no newtoniano, considerando ainda a temperatura e a presso constantes e o escoamento laminar. Estes fludos so classificados de acordo com o aspecto da curva de fluxo e a correlao com algum modelo ou equao matemtica. A viscosidade destes fludos no nica, e varia com a magnitude da taxa de cisalhamento, eq. (4), e denominada viscosidade aparente (a). Esta viscosidade s vlida para uma determinada taxa de cisalhamento,

43

portanto sempre que citada, deve vir acompanhada da taxa de cisalhamento correspondente,

a=./

(4)

A maioria das preparaes farmacuticas possui comportamento noNewtoniano (AULTON 1988, BRUMMER; GODERSKY, 1998, LABA, 1993). Grande nmero de fludos no-newtonianos se comporta como pseudoplstico, sendo as emulses, disperses e suspenses, exemplos deste comportamento. Nos fludos com comportamento pseudoplstico, h um decrscimo da viscosidade em decorrncia do aumento da taxa de cisalhamento, comportamento tambm referido como shear thinning, ou afinamento, significa que a resistncia do material ao fluxo decresce e a energia requerida para manter este fluxo diminui, quando as taxas de cisalhamento aumentam. Em alguns casos, h aumento da viscosidade, quando as taxas de cisalhamento aumentam, comportamento tpico de pastas as quais contenham plasticizantes, ou estruturas contendo polmeros no inicos. Nestes casos o comportamento dito dilatante (AULTON, 1988, BRUMMER; GODERSKY, 1999, LABA, 1993). H materiais que apresentam uma dependncia da tenso de cisalhamento com o tempo, para uma taxa de cisalhamento constante. A mecnica dos fludos classifica estes fludos em reopticos e tixotrpicos, conforme mostra a figura 3. So reopticos quando a tenso cisalhante ou a viscosidade aumenta com o tempo, mantendo-se a mesma taxa de deformao. So tixotrpicos os fludos que apresentam diminuio da taxa cisalhante ou da viscosidade, com o tempo de aplicao de certa taxa de cisalhamento. Ambos os fenmenos so reversveis, sendo a reopexia um fenmeno raro de acontecer (AULTON, 2005; LABA, 1993).

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Figura 3

Curva de fluxo de fludos no newtonianos de propriedades dependentes do tempo

Fonte:http://www.setor1.com.br/analises/reologia/ cuva inde htm

A tixotropia o mais comum dos dois fenmenos, e se observa quando pela retirada da fora aplicada sobre o material as condies iniciais vo sendo restabelecidas em certo espao de tempo, que pode durar desde alguns segundos at meses. O fluxo tixotrpico de grande utilidade nas emulses, trata-se de uma transformao gel-sol reversvel. A matriz rgida que serve para a estabilizao da emulso (forma gel) quando submetida a tenso (por agitao por exemplo), sofre amolecimento (forma sol), com as caractersticas de uma forma farmacutica lquida, para facilidade de uso. (ANSEL; POPOVICH; ALLEN, 2000). Para verificar graficamente a existncia de tixotropia, determina-se a velocidade de cisalhamento em ciclos nos quais se aumenta e diminui a tenso de cisalhamento. Se as curvas obtidas em cada direo forem diferentes, se obtm uma rea de histerese, que caracteriza bem o fluxo tixotrpico (ANSEL; POPOVICH; ALLEN, 2000).

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3.5 MEDICAMENTOS GENRICOS E MEDICAMENTO REFERNCIA A ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, instituio regulatria vinculada ao Ministrio da Sade, entre outras atribuies tem como finalidade a proteo da sade da populao, por intermdio do controle sanitrio da produo e da comercializao de produtos e servios submetidos vigilncia sanitria, inclusive dos ambientes, dos processos, dos insumos e das tecnologias a eles relacionados. O medicamento genrico est inserido na Poltica Nacional de Medicamentos atravs da Diretriz do Uso Racional de Medicamentos. A promulgao de Lei n 9787 em 10 de fevereiro de 1999 (BRASIL, 1999), que estabeleceu o medicamento genrico, foi o incio das inmeras atribuies tomadas pelo Ministrio da Sade e pela ANVISA para atender esta diretriz e aumentar o acesso da populao a medicamentos eficazes, seguros e de qualidade, a preos reduzidos. A regulamentao desta lei se deu em agosto de 1999 atravs da RDC n 391 (BRASIL, 1999), que estabeleceu o regulamento tcnico para o registro de medicamentos genricos, tendo como base as normas adotadas por pases EUA, Canad, e a Comunidade Europia. Desde ento novas resolues vo sendo institudas pela necessidade de complementao e melhoria das aes fiscalizadoras, sendo a RDC n 16 de 2 de maro de 2007, vigente atualmente no Pas (BRASIL, 2007; STORPIRTIS, 1999). Os medicamentos genricos contm em sua embalagem, logo abaixo do nome do frmaco que os identifica, a frase "Medicamento Genrico e so identificados por uma grande letra "G" azul impressa sobre uma tarja amarela, situada na parte inferior das embalagens do produto. o que estabelece a Resoluo RDC n 333, de 19 de novembro de 2003 (BRASIL, 2003). As bases tcnico-cientficas da intercambiabilidade tm como suporte as definies da Lei 9.787 (BRASIL, 1999), e da Resoluo RDC n 16 (BRASIL,

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2007), que entre outras atribuies traz a definio de medicamento genrico e medicamento de referncia Medicamento referncia: produto inovador registrado no rgo federal responsvel pela vigilncia sanitria e comercializado no Pas, cuja eficcia, segurana e qualidade foram comprovadas cientificamente junto ao rgo federal competente, por ocasio do registro. Medicamento genrico: medicamento similar ao medicamento de referncia ou inovador, que se pretende ser com este intercambivel, geralmente produzido aps expirao ou renncia da proteo patentria ou de outros direitos de exclusividade, comprovada a sua eficcia, segurana e qualidade, e designado pela DCB (Denominao Comum Brasileira) ou na sua ausncia, pela DCI (Denominao Comum Internacional). As formulaes de uso tpico esto dispensadas de estudos de bioequivalncia segundo a ANVISA, RDC N 897 de maio de 2003: Guia para iseno e substituio de estudos de bioequivalncia, (BRASIL, 2003). O antifngico tpico com o cetoconazol, consta da lista de indicaes teraputicas do rgo de Vigilncia Sanitria segundo a ANVISA, RDC n 84, 2002, (BRASIL, 2002) e topicamente o cetoconazol tem sido usado em formulaes a 2%, sendo aplicado no tratamento de infeces superficiais de pele e mucosas (REYNOLDS, 1989). O Nizoral (Janssen- Cilag) o medicamento de referncia para o cetoconazol sendo Nizoral creme (20mg/g) a especialidade farmacutica tpica de referncia contendo o cetoconazol, do mercado, e neste trabalho foi utilizado e denominado formulao (E).

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3.6 AGENTES ANTIFNGICOSA grande semelhana estrutural das clulas fngicas com as dos mamferos e a resistncia de suas paredes justificam o fato dos antifngicos atualmente disponveis serem poucos e consideravelmente mais txicos que os agentes antibacterianos (TRABULSI, et al.,1999). Cada vez mais aumenta a resistncia dos fungos aos agentes teraputicos disponveis, conseqentemente, h um aumento cada vez maior da incidncia das infeces micticas. Este aumento atribudo maior expectativa de vida, quimioterapia oncolgica, ao maior uso de tratamentos por via parenteral, transplantes de rgos, crescimento da populao imunocomprometida e uso cada vez mais freqente de antifngicos como profilaxia e tratamento emprico (FITZPATRICK et al., 1997, FUCHS; WANNMACHER, 1998). Os agentes antifngicos mais antigos como os cidos undecilnico, benzico e saliclico esto caindo em desuso, mas as vezes so usados em combinao com outros antifngicos tpicos, com o objetivo de aumentar a penetrao cutnea (TRABULSI, et al.,1999). 3.6.1 Imidazis At 1970, poucos agentes antifngicos eram conhecidos, e

apresentavam muitas restries em seus usos, devido a toxicidade, estreito espectro de atividade, baixa atividade farmacolgica e dificuldades na administrao parenteral. Esta nova classe de agentes antifngicos imidazlicos foi introduzida na teraputica, por sua versatilidade de administrao, baixa toxicidade e abrangente espectro de atividade, sendo pouco freqente, os fungos desenvolverem resistncia a estes agentes (FITZPATRICK et al., 1997, KEDOR-HACKMANN; NERY; SANTORO, 1994). Os agentes imidazlicos possuem atividade espectro similar, so ativos contra todos os fungos causadores de infeces superficiais de pele e

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mucosas. So muito eficazes poucos txicos e com baixos nveis de resistncia (FUCHS; WANNMACHER, 1998). A ao principal de um frmaco imidazlico localizada ao nvel de membrana celular. A via citocromo P-450, dependente de C14 lanosterol dimetilase, inibida, e esta a responsvel pela produo de ergosterol que componente necessrio na constituio da parede celular do fungo (PERSHING; CORLETT; JORGENSEN, 1993). A terapia com frmacos imidazlicos comercialmente disponvel para uma variedade de rotas de administrao: parenteral, intravenosa, oral ou tpica. Os vrios imidazis e rotas de administrao, no entanto tem diferentes indicaes e toxicidades, dependendo da severidade e do tipo de dermatfito. A maioria das micoses superficiais mucocutneas pode ser tratada com medicamentos tpicos, sendo necessrios produtos sistmicos, somente em algumas situaes (PERSHING; CORLETT; JORGENSEN, 1993). Atualmente existem umas sries de imidazis substitudos como o tiabendazol, miconazol, clotrimazol, econazol e sulconazol e no Brasil so mais usados o clotrimazol, miconazol, econazol, tioconazol, isoconazol, oxiconazol e cetoconazol (FUCHS; WANNMACHER, 1998). Os compostos imidazlicos, so os de escolha nas micoses cutneas e de mucosas, mas uma efetiva terapia requer que o substncia ativa seja liberado no stio de infeco numa adequada concentrao para produzir um efeito farmacolgico (FUCHS; WANNMACHER, 1998). 3.6.2 Cetoconazol O cetoconazol apresenta-se como um p branco ou quase branco, praticamente insolvel na gua, facilmente solvel no cloreto de metileno, solvel no metanol e ligeiramente solvel no lcool, com ponto de fuso entre 148C e 152C, peso molecular 531,43 (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2006).

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A designao comum do cetoconazol (+)-cis-1-acetil-4-[4-[[2-(2,4diclorofenil)-2-(1H-imidazol-1ilmetil)-1,3-dioxolan-4-il] metoxi] fenil] piperazina (MECK INDEX, 1989). O frmaco puro deve conter no mnimo 98% e no mximo 102% (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2006) de C26H28Cl2N4O4. Sua estrutura (Figura 4) apresenta dois grupos bsicos, a piperazina e o imidazol com valores de pKa de 2,94 e 6,51, respectivamente.

N

N CH O H 3C C N NO O2

Cl Cl

CH

2

O

Figura 4 Estrutura molecular do cetoconazol

A solubilidade em gua e a atividade antimictica so dependentes da porcentagem de protonao do grupo piperazina. Esta decresce drasticamente quando o pH do meio maior que o ponto isoeltrico do grupo piperaznico Sendo uma base fraca, escassamente solvel em gua (4,5g/mL), com habilidade para permear a mucosa do intestino desde a parte apical at a basolateral (log P=4,3) classificada como frmaco pertencente classe II no Sistema de Classificao Biofarmacutica (BCS). Frmacos pertencentes classe II so ditos de alta permeabilidade, mas com solubilidade insuficiente em meio aquoso, para que a dose total seja dissolvida no trato gastrointestinal, sob condies normais (GALIA et al.; 1998). Vrios estudos foram realizados para o cetoconazol para a verificao das variaes das suas propriedades fisico-qumicas em relao ao efeito da recristalizao e nestes, a observao de formas polimorfas pela fuso e a

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verificao da recristalizao devido ao uso de solventes de uso rotineiro na indstria farmacutica, foram evidenciadas por tcnicas termoanalticas como a calorimetria diferencial exploratria (DSC), por difrao de raios X. espectroscopia por Infravermelho e por CLAE (VISERAS; SALEM; RODRIGUEZGALAM, 1995). Os resultados destas mostraram mudanas nos eventos trmicos de temperatura e no comportamento das raias das diferentes recristalizaes frente as anlise de DSC e difrao de raios X. A espectroscopia por Infravermelho indicou no haver mudanas na estrutura qumica do cetoconazol. A CLAE mostrou decrscimo na solubilidade e nenhuma degradao foi RODRIGUEZ-GALAM, 1995). 3.6.3 Farmacodinmica e Farmacocintica O cetoconazol um antifngico de amplo espectro com ao sistmica e tpica, antiadrenal e antineoplsico. fungisttico, mas dependendo da concentrao pode ser fungicida (KOROLKOVAS, 1998). Tem atividade in vitro contra a maioria dos dermatfitos como Blastomices dermatitidis, Candida sp, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Phialofora sp, Trichophyton sp, Epidermophyton sp e Microsporum sp. ativo tambm contra Pityrosporum orbiculare (antigamente com o nome de Malassezia furfur) e Cryptococcus neoformans (FUCHS; WANNAMACHER, 1998, ZECEVIC; TOSKIC-RADOJICIC, 1993). O cetoconazol possui uma farmacocintica reportada como bifsica, com um respectivamente t (tempo de meia-vida) inicial de 2 horas e um t terminal de 8 horas. Em humanos a dose oral usual (1-6 meses) 200 mg. O t mdio de eliminao relatado 3,3 h, sendo apenas 0,22% do frmaco excretado na urina de forma inalterada, sugerindo um quase completo metabolismo. relatado ainda que o cetoconazol possa ser retido e acumulado principalmente nas camadas da pele e ser seguro clinicamente relatada (VISERAS; SALEM;

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(FUCHS; WANNMACHER, 1998, REYNOLDS, 1989, RICHARDSON; GANGOLLI, 1994). 3.6.4 Determinao Farmacuticas A literatura oficial (UNITED STATES PHARMACOPOEIA, 2006), descreve mtodos analticos para a determinao quantitativa do cetoconazol em comprimidos e suspenses orais, mas nenhum mtodo validado foi encontrado para a determinao em formas farmacuticas emulsionadas (KEDOR-HACKMANN et al., 2006). Alguns dos mtodos analticos recomendados pela literatura cientfica para a determinao quantitativa do cetoconazol em formas farmacuticas e materiais biolgicos no so: espectrofotometria (UV) na luz visvel e espectrofotometria ultravioleta (KEDOR-HACKMANN; NERY; Analtica do Cetoconazol em Preparaes

SANTORO, 1994), espectrofluorometria (PASCUCCI; BENNETT; NARANG, 1983); cromatografia em camada delgada (ROYCHOWDTHURY; DAS, 1996), cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) com vrios sistemas de deteco tal como UV (ABDEL-MOETY et al. 2002, VELIKINAC et al. 2004), com arranjo de diodos, deteco eletroqumica, tcnicas voltamtricas e polarigrficas (KEDOR-HACKMANN et al., 2006). A tcnica por CLAE desenvolvida por (PASCUCCI; BENNETT; NARANG, 1983), se mostrou sensvel, rpida e reprodutvel, oferecendo vantagens sobre os mtodos microbiolgicos. A deteco fluoromtrica oferece um aumento na sensibilidade, quando da quantificao do cetoconazol em fludos biolgicos por CLAE. Para a determinao de alguns antifngicos derivados dos azis como clotrimazol, cetoconazol e fluconazol em suas formas puras e em formulaes farmacuticas, o mtodo por CLAE, tem sido aplicado com sucesso como um mtodo indicador da estabilidade (PIETRA et al., 1992, ROYCHOWDTHURY; DAS, 1996). A determinao quantitativa do cetoconazol em preparaes farmacuticas comerciais (comprimidos e cremes) foi realizada por tcnicas

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de espectrofotometria no ultravioleta e cromatografia de alta eficincia na extrao, onde os resultados entre os dois mtodos no foram compatveis, mas foi demonstrada a maior acuracidade do mtodo por CLAE, pelos resultados de recuperao do frmaco, mostrando que este poderia ser uma alternativa para os mtodos espectrofotomtricos (KEDOR-HACKMANN; NERY; SANTORO, 1994). Muitos mtodos envolvendo uma variedade de diferentes tcnicas analticas tm sido publicados para o doseamento do cetoconazol. Muito poucos destes se referem a quantificao do cetoconazol em preparaes farmacuticas, e no mencionado corretamente a interferncia dos excipientes ou outros componentes residuais das formulaes. Quatro impurezas so relatadas como associadas ao cetoconazol e suas respectivas estruturas so relatadas nestes estudos, onde o cetoconazol quantificado sem a interferncia das mesmas utilizando como fase estacionria o octadecilsilano e fase mvel soluo tampo fosfato em um adequado pH contendo ainda acetonitrila. A dietilamina, por ser uma amina de baixo peso molecular, foi empregada para mascarar os grupos silanis residuais. A metodologia foi seletiva e capaz de quantificar o cetoconazol em baixas concentraes em vrias preparaes farmacuticas (comprimidos, cremes e xampus), sem a interferncia das impurezas e dos excipientes das formulaes, sendo o pH fator importante na separao do cetoconazol, ocorrendo tima separao a pH 4,0 (LOW; WANGBOONSKUL, 1999). O cetoconazol tambm tem sido determinado por CLAE na presena de seus produtos de degradao cida e sem a interferncia dos excipientes nos trabalhos de Velikinac et al. (2004), onde utilizado metanol e soluo de acetado de amnio 0,5% (80:20) como fase mvel. Este estudo realiza metodologias por CLAE e eletroforese caplilar, comparando os resultados, onde CLAE mostrou-se mais sensvel e especfico para a quantificao do cetoconazol em formas farmacuticas emulsionadas A eletroforese capilar pode ser usada para a separao de misturas de antifngicos imidazlicos ou separao de enantimeros.

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Nos trabalhos de Kedor-Hackmann et al. (2006) foi realizada a determinao espectrofotomtrica do cetoconazol em emulses utilizando a primeira derivada no UV comparativamente a determinao por CLAE. Neste ltimo, a fase mvel utilizada foi uma mistura de trietilamina em metanol (1:500 v/v): soluo de acetato de amnio em gua (1:200 p/v), 75:25v/v. As condies de anlise foram fluxo de 1,0mL por minuto, tempo de corrida 6 minutos, temperatura ambiente (24C2C), com deteco no UV com comprimento de onda 225nm.

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3.7

ESTUDOS DE PERMEAO E RETENO CUTNEA IN VITROA seguir, so apresentados os mtodos de estudo de permeao e

reteno cutnea. 3.7.1 Mtodos de Estudo da Permeao e Reteno Cutnea de Frmacos Estudos sobre a penetrao cutnea de frmacos so extremamente importantes na otimizao da elaborao de formas farmacuticas de liberao, drmicas e transdrmicas (LEVEQUE et al., 2003). Mtodos para quantificar a liberao e absoro de frmacos atravs da pele podem ser divididos em duas categorias: in vivo e in vitro. Mtodos in vivo tm sido freqentemente usados com propsitos regulatrios, e se desenvolvem com experimentos com animais. Eles tm algumas vantagens sobre os mtodos in vitro, que incluem a gerao de uma cintica sistmica e informaes sobre o metabolismo. As desvantagens so o uso de animais vivos, a diferena de permeabilidade existente entre as peles das diversas espcies de animais (a pele de animal normalmente mais permevel que a humana, e desta maneira pode-se superestimar os resultados para permeao cutnea humana), a necessidade de um material radio-marcado para facilitar a obteno dos resultados (CHIEN, 2005). As caractersticas in vivo, nem sempre sero satisfatoriamente reproduzidas, todavia sabendo-se que o passo limitante para a permeao cutnea in vivo a difuso atravs do estrato crneo, uma metodologia in vitro bem fundamentada poder produzir resultados bastante coerentes com os in vivo (BARRY, 1983, FRANZ, 1975, 1978). As vantagens dos mtodos in vitro sobre os mtodos in vivo so que os primeiros podem ser usados igualmente bem com peles humanas e com as de espcies animais (porcos, macacos, ratos ou camundongos, sem plos); podem-se fazer muitas replicatas das anlises, no se utilizando animais

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vivos, podem-se administrar as condies do estudo especialmente a temperatura, e vrias formas fsicas podem ser investigadas, alm disso, so facilmente realizveis e no so dispendiosos. Como limitaes, haveria a dificuldade de obteno das membranas (usando pele humana), de armazenagem, custos e variabilidade da permeao, as condies da circulao sangunea podem no ser reproduzidas totalmente (no levam em conta o metabolismo cutneo), o transporte de molculas de baixa solubilidade aquosa no possvel (a menos que um solvente como, por exemplo, o etanol seja adicionado para aumentar a solubilidade em gua), no leva em conta o efeito de possveis degradaes e separaes do estrato crneo do resto da epiderme e nem a ocorrncia de mudanas fisiolgicas e anatmicas, inevitveis, devido ausncia da circulao sangnea (ALLEN; PROPOVICH; ANSEL, 2007, CHIEN, 2005, VENTER et al., 2001). Segundo Barry (1983), a pele retirada de animais pode variar em qualidade e permeabiliade, caractersticas verificadas em estudos onde quantificaram experimentalmente as diferenas entre as peles humanas tanto in vitro quanto in vivo, em relao penetrabilidade do soluto. A variao intraespcie humana calculada por meio do coeficiente de variao, em teste in vivo foi de cerca de 30% e a interespcie 45%. Os parmetros in vitro mostraram 45% para a intraespcie e 65% para interespcie. A absoro cutnea primeiramente um processo passivo, e os estudos realizados em adequadas condies in vitro tm produzido resultados que confirmam a aplicabilidade do estudo, para grande quantidade de substncias qumicas (CHIEN, 2005; WESTER, R. C.; MAIBACH, 1989). Estas prticas so teis, por exemplo, para prover informaes sobre as diferenas na liberao de determinado frmaco quando em diferentes veculos (OECD, 2002; OECD, 2004). So teis para avaliar parmetros fsicoqumicos tais como o coeficiente de partio, o fluxo e coeficiente de difuso dos frmacos (BARRY, 1983).

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3.7.2 Fundamentos da Permeao Cutnea In vitro Em produtos dermatolgicos desejvel que o frmaco administrado tenha pequeno fluxo e alta retentividade nas membranas. Ao contrrio, nos produtos transdrmicos, o efeito desejvel sistmico e, portanto, esperamse baixa retentividade do frmaco nas membranas e um grande fluxo atravs das mesmas (TOUITOU; MEIDAN; HORWITZ, 1998). Uma terapia efetiva nas enfermidades cutneas requer que o agente ativo seja liberado no stio de infeco, em concentraes adequadas para produzir o efeito farmacolgico. No caso de infeces superficiais da pele, onde o agente patognico reside sobre ou entre as camadas mais externas da pele, o produto teraputico deve ser liberado no estrato crneo em concentraes adequadas para inibir o crescimento do agente patognico (PERSHING; CORLETT; JORGENSEN, 1993). Para produtos dermatolgicos, estes estudos so realizados de modo que o frmaco seja liberado da formulao onde est veiculado, e se difunda atravs de uma membrana que pode ser de origem natural (humana ou animal) ou artificial, para uma soluo receptora (OECD, 2004). A pele humana obtida de cirurgias de mama, ou a partir de cadveres, tem sido utilizada, mas muitos pesquisadores tm realizado seus estudos usando peles animais como MEIDAN; HORWITZ, 1998). O coeficiente de partio (log P) geralmente usado para predizer a penetrao no estrato crneo. Considera-se log P entre 2 e 3 como timo para liberao tpica, no entanto, tais consideraes se referem mais a pequenas molculas, com menos cadeias de grupos polares (ABDULMAJED; HEARD, 2004). No estudo de permeao cutnea in vitro, as condies termodinmicas devem ser mantidas para que o processo ocorra com eficincia. O veculo doador deve manter a membrana exposta a uma constante concentrao do permeante, e a fase receptora cujas amostras modelo, sendo a de porco, estruturalmente mais prxima da humana, um das mais usadas (TOUITOU;

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so colhidas em intervalos de tempo pr-determinados, deve garantir condies termodinmicas favorveis ao frmaco. Efetua-se ento a determinao analtica da concentrao do frmaco liberado (OECD, 2004 PHARMACOPEIAL FORUM, 2006). Todos estes pontos devem ser examinados, com bastante cuidado quando os experimentos so realizados com substncias com limitada solubilidade em gua (LPEZ et al., 1998). A liberao do frmaco a partir do medicamento e a partio deste para a membrana so verificadas pela quantificao do frmaco restante na formulao aps o intervalo total do estudo de permeao e pela anlise feita na pele aps o estudo in vitro (CHIEN, 2005). A determinao da concentrao do frmaco na pele, ao final do perodo de exposio, requer a remoo do excesso de formulao, seguido de extrao em um adequado solvente. Usando ento uma tcnica analtica sensvel como CLAE, se quantifica o frmaco extrado. A quantidade de frmaco retido nas camadas da pele igual quantidade inicial menos a quantidade final de frmaco presente (TOUITOU; MEIDAN; HORWITZ, 1998). Vrios compostos de aplicao tpica exibindo uma larga variedade de propriedades fsico-qumicas e estruturas qumicas foram examinados por Reifenrath et al. (1994), quanto penetrao na pele, demonstrando a capacidade barreira da pele total e no somente do estrato crneo e das camadas epidmicas, para as substncias aplicadas topicamente, e sendo os estudos destes autores citados nos trabalhos de Touitou; Meidan e Horwitz, (1998). Embora estas determinaes na pele total sejam fceis e rapidamente realizadas, elas tm a desvantagem de no fornecer dados sobre a real localizao do frmaco. A camada crnea, a camada mais externa da pele pode ser separada do resto da epiderme + derme por processos especiais. Desta maneira pode-se refinar os resultados, aplicando vrias e distintas extraes nas diferentes camadas de pele separadas. A rea mais externa da pele (camada crnea) que ficou exposta a permeao, pode sofrer o processo chamado de tape-stripping, ou seja, nela so passados fitas adesivas cujas caractersticas e nmero de extraes

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variam de acordo com as diversas tcnicas, e so padronizados para cada frmaco. Estas fitas adesivas so recohidas em um solvente capaz de solubilizar o frmaco, e as solues obtidas so analisadas por mtodo analtico, normalmente por CLAE (TOUITOU; MEIDAN; HORWITZ, 1998). Este mtodo tem como limitao no remover totalmente o estrato crneo (OTTO et al., 2005). Nos estudos in vitro, aps a remoo do estrato crneo, a pele restante, o conjunto epiderme sem estrato crneo + derme picotada e submetida extrao do frmaco retido, com o uso de solventes adequados. A penetrao atravs da camada barreira geralmente tambm quantificada por amostragens da soluo receptora em intervalos de tempo durante o perodo total de estudo, ento todas as solues so analisadas por mtodos analticos sensveis (BARRY, 1983). Vrias tcnicas analticas podem ser usadas para medir a concentrao do permeante, mas cintilografia, cromatografia gasosa e cromatografia lquida de alta eficincia, so as mais utilizadas devido sensibilidade destes mtodos, os quais monitoram a liberao do frmaco em estudo, na soluo receptora, ou a taxa de perda do frmaco a partir da fase doadora. 3.7.3 Aparelhos Utilizados nos Estudos de Permeao Cutnea In vitro Para avaliao da liberao de frmacos de sistemas transdrmicos in vitro, a literatura oficial (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2006) disponibiliza e fornece as especificaes respectivas de vrios aparatos, a saber: a) Aparato 5 com p e disco; b) Aparato 6 - com cilindro rotatrio; c) Aparato 7 com suportes recprocos; d) Aparato 8 clulas de difuso. Para a avaliao das formas farmacuticas emulsionadas de uso dermatolgico, a literatura cientfica relata o uso estudos de permeao e

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reteno cutnea, in vitro, utilizando a clula de difuso ou de Franz (FRANZ, 1975, 1978), esquematizada na Figura 5, e que se baseia em dois sistemas de funcionamento: de fluxo contnuo (aonde a soluo receptora continuamente vai sendo bombeada), e de fluxo esttico (aonde a soluo receptora constante durante todo o experimento). O sistema de difuso de Franz bastante utilizado devido ao seu baixo custo, boa reprodutibilidade dos resultados e realizao em pequeno espao de tempo, comparativamente a outras tcnicas (LEVEQUE et al., 2003).

Figura 5 Esquema da clula de difuso (Microette PlusHanson Research ) empregada nos estudos de liberao e permeao cutnea in vitro Qualquer que seja a clula de difuso escolhida, ela consistir de um compartimento doador e um compartimento receptor entre os quais a pele posicionada. Cada aparelho tem certo nmero de clulas de difuso, e estas tm todas, uma igual superfcie de rea (numa faixa de 0,3 a 5cm2). A pele preparada posicionada na clula de modo que o estrato crneo fique para cima. O sistema deve possibilitar agitao constante, temperatura controlada e facilidade de amostragens da soluo receptora (OECD, 2004).

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3.7.4 Membranas

e

Solues

Receptoras

Utilizadas

nos

Estudos

de

Permeao Cutnea in vitro, em Clulas Tipo Franz Os estudos de liberao e permeao cutnea in vitro tm seus resultados mais prximos dos obtidos in vivo quando se utilizam membranas permeantes. A investigao da permeabilidade da membrana freqentemente realizada por metodologias in vitro, que tm sido estabelecidas como teis ferramentas para a estimativa da penetrao cutnea de frmacos, especialmente devido dificuldade em realiz-las em estudos in vivo, e j em 1975, estudos de Franz sobre absoro percutnea in vitro de doze compostos orgnicos utilizando pele humana, obtiveram boa correlao nos resultados em comparao com os testes in vivo. Segundo este autor, a permeao cutnea realizada com pele humana armazenada por um perodo de 3 meses em congelador, no alterou as caractersticas de permeao cutnea desta, em relao aos mesmos compostos orgnicos (FRANZ, 1975). Nos trabalhos de Bronaugh e Franz (1986), com pele humana, trs frmacos (cafena, cido benzico e testosterona), foram analisados em estudos de absoro cutnea in vitro e in vivo quando solubilizados em trs diferentes veculos (vaselina slida, gel de etilenoglicol e gel hidroflico) e nas condies do experimento, a cafena penetrou mais rapidamente, quando veiculada na vaselina slida, e a maior absoro do frmaco testosterona foi quando veiculado em gel hidroflico, o cido benzico mostrou resultados de difcil interpretao. Os autores Toruan-Purba; Tabibi e Mendes (1993), estudaram a permeao cutnea tentando buscar membranas animais, como alternativas para as membranas naturais humanas. A membrana natural de cobra foi utilizada (Elaphe obsoleta), mostrando vantagens na utilizao sobre a pele retirada de cadveres humanos, pela fcil obteno e por no haver necessidade de sacrificar o animal.

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A membrana artificial de silicone foi utilizada no estudo de permeao cutnea das solues saturadas dos frmacos cianofenol e cianonaftaleno solubilizados em diferentes veculos (gua, etanol e polietilenoglicol 400).Os resultados demonstraram que os veculos podem ter um importante grau de penetrao por si s, e ainda podem afetar o grau de permeao dos frmacos neles solubilizados. gua destilada foi usada como soluo receptora sendo freqentemente agitada e mantida a 25C (WATKINSON et al., 1995). Derivados sintticos da capsaicina, a nonivamida (NVA) e o acetato de nonivamida sdica (SNA) foram analisados em estudo de permeao utilizando diferentes