CINÉTICA ENZIMÁTICA

1 – INTRODUÇÃOO conhecimento das propriedades cinéticas das enzimas é importante para compreender as transformações que ocorrem no interior das células que participam dos processos fermentativos e também dos reatores enzimáticos.

2 – APLICAÇÕES INDUSTRIAISTabela 1: Enzimas aplicadas na indústria

ENZIMAAPLICAÇÃO

Proteases *Fabricação de aspartame*Obtenção de insulina humana a partir de insulina suína

Amilase (Bacillus subtilis) *Indústria de fermentação alcoólica *Produção de glicose

Tripsina (pâncreas animal) Amolecimento de carnes

Papaína (mamão) e Bromelina (abacaxi)

*Auxiliar digestivo *Amolecimento de carnes

Pepsina (estômago animal) Auxiliar digestivo

Renina (estômago de bezerros) Fabricação de queijo

Pectinase (Aspergilus niger) Retirada de pectina na clarificação de sucos de frutas

Enzimas são proteínas (seqüência de aminoácidos) com peso molecular muito grande, e com propriedades catalíticas. Na maioria das vezes são proteínas globulares. É mostrado na tabela 2 uma comparação entre as características das enzimas e dos catalisadores inorgânicos.

Tabela 2: Comparação entre as enzimas e os catalisadores inorgânicos.

CARACTERÍSTICAENZIMAS CATALISADORES

QUÍMICOS

1 – Especificidade ao substrato Alta Baixa

2 – Natureza da estrutura Complexa Simples

3 – Sensibilidade à temperatura Alta Baixa

4 – Condições de reação (T, P e pH) Suaves Drásticas (geralmente)

5 – Custo de obtenção (isolamento e purificação) Alto Moderado

6 – Natureza do processo Batelada/contínuo

Batelada/contínuo

7 – Consumo de energia Baixo Alto

8 – Formação de subprodutos Baixa Alta

9 – Reutilização do catalisador Simples/cara Simples

10 – Atividade catalítica (temperatura ambiente) Alta Baixa

11- Presença de cofatores Sim Não

12 – Energia de ativação Baixa Alta

13 – Velocidade de reação Alta Baixa

• A característica mais importante das enzimas éa elevada especificidade. Muitas enzimas possuem um grupo limitado de substratos, mas outras possuem uma especificidade absoluta para um único substrato como mostrado na Figura 1:

Sítio ativo

Substrato Produtos

Enzima Enzima

E + S ES E + P

• Como exemplo de especificidade enzimática pode ser tomado a hidrólise enzimática do amido:

• α-amilase atua na amilose rompendo a ligação α-1,4 produzindo maltose e glicose.

• α-glicosidase atua na α-1,6 produzindo amilose.• Com a atuação das duas enzimas no amido é

produzido maltose e a glicose.• Amiloglicosidase ( ou glicoamilase ) atua na α-

1,6 e α-1,4 de forma a produzir também maltose e glicose a partir do amido.

3 – NOMENCLATURA• nome do substrato • ou + sufixo ase• reação que catalisa • protease (hidrolisa proteínas)• álcool desidrogenase (catalisa a

desidrogenação de um álcool)• outras apresentam terminações ina

(tripsina, renina, bromelina etc)

• 4 – COMPLEXO ENZIMA SUBSTRATO•

E + S ES E + P• Cinética da reação enzimática com

formação de um substrato• Medindo as concentrações do produto (P)

e do substrato (S) expressos na reação acima, podemos obter a figura seguinte:

[P]

e

[S]

Tempo

Produto

Substrato

5 – INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE ENZIMA

[P][E]1[E]2

[E]1>[E]2>[E]3>[E]4

[E]3[E]4

Tempo

• 6 – INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO• O modelo cinético de Michaelis e Menten é utilizado para explicar

matematicamente a influência da concentração do substrato na cinética da reação enzimática. Essa teoria admite que inicialmente, a enzima e o substrato reagem reversívelmente, formando um composto intermediário denominado “complexo enzima-substrato”que por sua vez decompõe ou regenera a enzima e forma os produto da reação.

• k1• E + S ES• k2

• k3• ES E + P • V• onde k1 = constante de vel. de formação do complexo• k2 = constante de vel. de dissociação do complexo• k3 = constante de velocidade de decomposição do complexo

formando os produtos da reação• V = velocidade de formação dos produtos

• Consideremos um caso simples, caracterizado pelas seguintes hipóteses:

• a) Complexo ES (1mol de enzima para 1 mol de substrato)

• b) O complexo formado se decompõe, sem reagir com outras substâncias existentes no sistema

• c) Fazendo X = ES logo a variação da concentração de X com o tempo (dX/dt) será:

• dX/dt = k1.E.S – k2X – k3X eq. 01• fazendo Et = E + X logo E = Et – X• fazendo St = S + X logo S = St – X• onde St = quantidade de substrato total adicionada ao

sistema• S = quantidade de substrato não associada ao

complexo ES• Et = quantidade de enzima total adicionada ao

sistema• E = quantidade de enzima não associada ao

complexo ES

• Substituindo os valores de En e de Sn na eq. 01 vem:

• eq. 02• supondo que as concentrações de substrato são

muito maiores que as de enzima e portanto muito maiores que as do complexo, o que écomum na prática

• ES<<S>>E• Então pela eq. 02 vem:• eq. 03

XkXkXtSXtEkdtdX

32))((1 −−−−=

XkktSXtEkdtdX )32()(1 +−−=

• Supondo, ainda que boa parte da reação se desenvolve mantendo-se constante a concentração do complexo no tempo (estado estacionário) ou seja dX/dt = 0

XkkXESk tt )()( 321 +=−

32

)(1kk

XtEtSkX+

−=

mkXtStEtS

kkkXtEtSX −

=+

−=

1/)32()(

1k÷

• onde = constante de Michaelis e • Menten que pode indicar o grau de

afinidade da enzima pelo substrato, ou seja, quanto maior a afinidade da enzima pelo substrato menor é o valor de km

• isolando X

132

kkk

mk +=

mktEtS

mkXtSX =+

mktEtS

mktSX =⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+1

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

=

mktSmk

tEtSX1

1.

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +=

mktSmkmk

tEtSX 1.

( )tSmkmk

mktEtSX

+= .

tSmktEtSX

+=

• fazendo St = S e Et = E vem,

SmkSEX+

= eq. 04

Sabendo que a velocidade da reação enzimática é

V = K3X eq. 05Substituindo a eq. 04 na eq. 05 vem,

SmkESkV+

= 3

Fazendo K3E = Vmax = Velocidade máxima de formação de produtos correspondente a situação em que toda enzima se encontra na forma ES vem:

SmkSVV+

= max eq. 06

Esta equação é chamada equação de Michaelis e Menten.

SmkSVV+

= max

Vmax

Vmax/2 (1)

(2) (3)

Na região (1) do gráfico a velocidade da reação é uma função crescente da concentração do substrato, até um determinado valor desta concentração (ponto 2) que a partir do qual a velocidade se mantém constante (região 3).O tipo desta curva é análogo aos fenômenos de saturação que pode ser melhor compreendido analisando o próximo gráfico.

Situação antes do Equilíbrio Situação no Equilíbrio % da Vmax

E S E + S ⇔ ES

25%

50%

75%

100%

100%

• Quando a concentração do substrato é tal que a velocidade de reação é metade da velocidade máxima teremos:

[S]K[S]

21

m +=

Km + [S] = 2[S]Km = [S]

Como se sabe o valor de Km éinversamente proporcional a afinidade da enzima pelo substrato. Desta forma podemos comparar a afinidade da Enzima1 com a da Enzima2 no gráfico:

Vmax

Vmax/2

S Km1 Km2

Km2 > Km1 portanto a afinidade da enzima1 pelo

substrato S é maior que a da enzima2

Enzima1

Enzima2

• Uma forma precisa de determinar Vmax e km a partir de dados experimentais é o método chamado Lineweaver-Burk, resultado da inversão da equação 4 de Michaelis e Menten.

• eq. 07SV

mkVV

1.maxmax

11+=

• que trata-se da equação de uma reta representada pela figura a seguir.

1/v

1/vMAX

km/Vmáx

1/S

• ATIVIDADE ENZIMÁTICA• A velocidade da reação pode também ser

expressa em termos de sua atividade enzimática. Que é a quantidade de produto formado em um certo tempo pela quantidade de enzima utilizada. A atividade de uma enzima édefinida especificamente para cada caso estudado.

• A CONSTANTE CATALÍTICA é definida para se estudar a eficiência da catálise enzimática.

[E]Vk max

cat =

• kcat equivale ao número máximo de moléculas de substrato que um centro ativo converte em produto por segundo. Como exemplo, podemos tomar a enzima catalase com kcat = 107 s-1, portanto esta enzima é capaz de originar 10 000 000moléculas de produto por segundo.

• 7 – INFLUÊNCIA DA PRESENÇA DE UM INIBIDOR• A inibição enzimática pode ser reversível ou irreversível• O inibidor irreversível forma um complexo estável com a

enzima não podendo ser removido para recuperar a enzima ativa.

• Exemplo: metais pesado (Hg), agentes complexantes de metais (CN)

• A inibição reversível é caracterizada por uma constante de equilíbrio ki, que é medida pela afinidade do inibidor com a enzima.

• Três formas simples de inibição podem ser descritas:• Pelo substrato (reversível)• Competitiva (reversível)• Não competitiva (irreversível)

• 7.1 – INIBIÇÃO PELO EXCESSO DE SUBSTRATO (reversível)• k1• E + S ES• k2

• k3• ES + S ES2 (Complexo não reativo)• k4• k5• ES E + P• V•

S

Vmax

V

ikSSmk

SVV 2max

++

=

eq. 08

onde ki é a constante de inibição; Para encontrar as constantes faz-se a inversão segundo Lineweaver-Burk

SiKVSV

mkVV max

11.maxmax

11++=

Km/vmax

1/S-1/km

1/V

Eq. 9

1ª Hipótese:para valores de S<<ki a eq. 09 se reduz em,

SVmk

VV1.

maxmax

11+=

SiKVSV

mkVV max

11.maxmax

11++=

1/vmaxKi

S

1/Vmax

1/V

Eq. 9

2ª Hipótese:para valores de S>>km a eq. 09 se reduz em,

SiKVVV max

1

max

11+=

Os valores de Vmax determinados em ambos os gráficos devem ser próximos.

• Diz-se que um inibidor competitivo reage com a enzima como se fosse um outro substrato.

• Indicando-se com Ι a fórmula molecular de um inibidor competitivo, a teoria de Michaelis e Menten fornece:

• k1 k3• E + S ES ES E + P• k2 V• k4• E + Ι EΙ EΙ E + P’• k5 k6

• O complexo EΙ (Enzima-Inibidor) pode ou não formar produto, porém quando o inibidor forma o complexo EΙ fica impedindo que o substrato S entre em contato com a enzima E.

• A velocidade de formação do produto desejado será, então:

• eq. 10 Sikmk

SVVi+Ι+

=)/1(max

onde km = (k2+k3)/k1 = cte de Michaelis e MentenΙ = concentração do Inibidorki = (k5+k6)/k4

Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burk

SVikmk

ViV1.

max

)/1(

max

11 Ι++= Eq.11

)/1(1

ikmk Ι+−

-1/km 1/S

1/V

1/Vmax

I2>I1 I1I=0

• Fazendo a relação entre Velocidade segundo Michaelis e Menten e a Velocidade de inibição competitiva vem;

iKSmkmk

iVV

)(1

+Ι

+= Eq.12

• Esta relação trata-se de uma representação matemática da influência das concentrações de substrato e de inibidor na inibição competitiva, da seguinte forma:

S>>i

S1

S2<S1

I

V/VI

1

Ou seja, com o aumento da concentração de substrato em relação a concentração do inibidor diminui a influência do inibidor na cinética enzimática.

• INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA (irreversível)• Consideremos o caso em que o inibidor,

presente no sistema na concentração Ι, bloqueia irreversivelmente uma concentração αΙde enzima. Teremos então:

k1 k3

• E + S ES E + P• k2 Vi• k4• E+Ι EΙ

SmKSkViV+

Ια−= )3max(

A velocidade de formação do produto desejado será:

onde Ι = Concentração do inibidorαΙ = porção de enzima bloqueada irreversivelmente

eq. 13

Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burkvem:

SkVkViV.

3max3max Ια−+

Ια−= eq. 14mk 111

Ια− 3max

1kV

I=0

I1

I2>I11/Vi

1/S-1/km