Introduccedilatildeo

A invertase (EC 32126) ou 1048645-D-fructo-furanosidio-frutohidrolase ousacarase eacute a enzima responsaacutevel pela liberaccedilatildeo do resiacuteduo L-Dfructofuranosidionatildeo-redutor a partir da moleacutecula de dissacariacutedeo (Gracida-Rodriacuteguez et al 2005) Seu substrato preferencial eacute a sacarose resultandona sua hidroacutelise uma moleacutecula de glicose e outra de frutose poreacutemtambeacutem pode hidrolisar ramonose e estaquiose (Fiedurek et al 2000)Historicamente esta enzima tem grande importacircncia uma vez que foi aprimeira proteiacutena a ser identificada como um biocatalisador Tambeacutem foi apartir de estudos com invertase que foram construiacutedos os princiacutepiosfundamentais da enzimologia como a hipoacutetese de chave-fechadura paraatividade enzimaacutetica (Brown 1902) a equaccedilatildeo de Michaelis-Menten(Michaelis amp Menten 1913) o conceito de ponto isoeleacutetrico (Michaelis ampDavidsohn 1911 Michaelis amp Rothstein 1920) e a hipoacutetese de Briggs ampHaldane (1925) em que o complexo formado entre enzima e substrato natildeorepresenta um equiliacutebrio mas sim um estado estacionaacuterioA invertase estaacute presente em diversas frutas e tubeacuterculos como porexemplo mamatildeo manga banana peras maccedilatildes batatas entre outrastendo grande participaccedilatildeo nos seus processos de amadurecimento eapodrecimento (Chapper et al 2004 Torija et al 1998)

Apresentaccedilatildeo

As enzimas satildeo biomoleacuteculas responsaacuteveis pela cataacutelise de diferentesreaccedilotildees em sistemas bioloacutegicos Atraveacutes da diminuiccedilatildeo da energia deativaccedilatildeo reacional elas possibilitam que a vida possa ocorrer em condiccedilotildeesamenas de temperatura e pressatildeo Industrialmente esse fato vem despertandomuito interesse pois permite a economia de energia a ser aportadaaos processos de conversatildeo gera menos co-produtos e resiacuteduos sendoparte de um sistema ambientalmente amigaacutevel

Cineacutetica enzimaacutetica

Enzimas satildeo proteiacutenas que catalisam reaccedilotildees que sob condiccedilotildees naturais seriam muito lentas O aumento da velocidade de uma reaccedilatildeo se deve agrave diminuiccedilatildeo de energia livre de ativaccedilatildeo A cineacutetica enzimaacutetica tem por objetivo a compreensatildeo do mecanismo de accedilatildeo das diferentes enzimas e da velocidade das reaccedilotildees por elas catalisadas Este estudo tambeacutem avalia as alteraccedilotildees na velocidade da reaccedilatildeo em resposta a modificaccedilotildees de paracircmetros experimentais como a concentraccedilatildeo de substrato o tempo de incubaccedilatildeo a temperatura de incubaccedilatildeo ou a variaccedilatildeo do pH

Accedilatildeo enzimaacutetica da invertase

A enzima sacarase ou invertase (β-fructofuranosidase) eacute uma enzima que catalisa a hidroacutelise da sacarose (accediluacutecar natildeo redutor) em glucose e frutose (dois accediluacutecares redutores capazes de reduzir os iotildees feacuterrico ou cuacuteprico presente no reagente de Fehling)

Sacarose + H2O Glucose + Frutose

Por definiccedilatildeo 1 unidade (U) de invertase hidrolisa 1 micromol de sacarose a glucose e frutose por minuto a pH 46 (25ordmC) A reaccedilatildeo pode seguir-se facilmente determinando a quantidade de accediluacutecares redutores libertados por accedilatildeo da enzima utilizando por exemplo a reaccedilatildeo do aacutecido 35-dinitrosaliciacutelico (DNS)

Materiais usados

Sacarose 02 M

Invertase em tampatildeo acetato de soacutedio 005 M pH 47Tampatildeo acetato de soacutedio 005 M pH 47Reagente 35 dinitro saliciacutelico (DNS) em meio alcalinoBanho-maria a 37degEspectrofotocircmetro

PREPARO DOS REAGENTES

1 Soluccedilatildeo de enzima invertase (01 mg proteiacutenamL) isolamento a partir de leveduras Pesar 50 mg de leveduras secas (fermento de patildeo) suspender em 250 mL de bicarbonato de soacutedio 015 molL e manter em banho-maria a 37ordmC durante 6 horas com agitaccedilatildeo ocasional Centrifugar o sobrenadante por 20 min a 3500 rpm Coletar o sobrenadante o qual conteacutem a enzima ativa Conservar a temperatura de 4ordmC Normalmente a concentraccedilatildeo de enzimas para os ensaios eacute de 01 mg proteiacutenamL

2 Substrato Sacarose 02 molL (68 g para 1L de aacutegua balatildeo volumeacutetrico) usar esta soluccedilatildeo para obter as soluccedilotildees mais diluiacutedas

3 Soluccedilatildeo tampatildeo acetato 005 molL pH 47 Acetato de soacutedio 005 molL(A) aacutecido aceacutetico 005 molL (B) Misturar 150 mL da soluccedilatildeo A e 300 mL da soluccedilatildeo B

4 Soluccedilatildeo alcalina de 35-dinitro-salicilato dissolver sob aquecimento 5g de aacutecido 35-dinitro-saliciacutelico em 100 mL de NaOH 2 molL Separadamente dissolver sob aquecimento 150 g de tartarato duplo de soacutedio e potaacutessio em 250 mL de aacutegua destilada Misturar as duas soluccedilotildees e completar o volume para 500 mL com aacutegua destilada

Adicionar os reagentes conforme a tabela

Reagentes (ml)Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo

1 2 3 4 5Tampatildeo acetato (50

mM pH 47)1 1 1 1 1

Agua 1 08 08 08 08Sacarose (02M) 05 05 05 05 05

Soluccedilatildeo de enzima (005 mgml)

- 02 02 02 02

Metodologia

Identificar os tubos o primeiro com a letra 1B o segundo com o nuacutemero 2 o terceiro com nuacutemero 3 e assim por diante ateacute o nuacutemero 5

Adicionar Tampatildeo acetato aos tubos de ensaio 1ml em cada tubo

Adicionar aacutegua aos tubos de ensaio No tubo B foi adicionado 1ml de aacutegua no tubo 2 foi adicionado 08ml no tubo seguinte 08ml o tubo 3 adicionou-se 08ml no tubo 4 foi adicionado 08ml e no ultimo

Em seguida adicionou-se Sacarose em cada um dos tubos No tubo 1 B foi adicionado 05ml no 2 foi 05ml no 3 foi 05ml no 4 foi 05ml e no tubo 5 foi adicionado 05 de glicose

Em seguida adicionou-se soluccedilatildeo enzima com exceccedilatildeo do tubo nuacutemero 1B 2 foi adicionado 08ml no tubo seguinte 02ml o tubo 3 adicionou-se 02ml no tubo 4 foi adicionado 02ml e no ultimo

Os tubos 3 4 e 5 foram levados a o banho-maria ao a 25 0C onde ficaratildeo por cerca de 5 mim logo apoacutes o banho foram incubados por tempos diferentes durante 5 min (tubo 3) 10 min (tubo 4) 15 min (tubo 5)

Em quanto isso foi adicionado 10 mL de soluccedilatildeo de 35-dinitrosalicilato aos tubos 1 e 2

Imediatamente apoacutes a retirada do tubo do banho-maria foi adicionado 10 mL de

soluccedilatildeo de 35-dinitrosalicilato

Ao teacutermino da incubaccedilatildeo do tubo 5 todos os tubos aqueceram em banho fervente

durante cinco minutos logo apoacutes deixamos resfriar por 5 min

Adicionamos 65 mL de aacutegua destilada a cada tubo

A uma mudanccedila de coloraccedilatildeo nos tubos que foram adicionados DNS juntamente

com a enzima com a sacarose ficando com uma cor amarelada Tubos 4 e 5 porem

o tubo 1 natildeo muda de cor poacutes natildeo foi adicionado a enzima

Depois foi medida a absorbacircncia dos tubos no comprimento de onda de 540nm tubo

1B Foram encontrados os seguintes valores de absorbacircncia

Tubos 1 2 3 4 5

Valores de

absorbacircncia

540 1175 0552 0602

• Sacarose 02 M
• Tubos

Accedilatildeo enzimaacutetica da invertase

A enzima sacarase ou invertase (β-fructofuranosidase) eacute uma enzima que catalisa a hidroacutelise da sacarose (accediluacutecar natildeo redutor) em glucose e frutose (dois accediluacutecares redutores capazes de reduzir os iotildees feacuterrico ou cuacuteprico presente no reagente de Fehling)

Sacarose + H2O Glucose + Frutose

Por definiccedilatildeo 1 unidade (U) de invertase hidrolisa 1 micromol de sacarose a glucose e frutose por minuto a pH 46 (25ordmC) A reaccedilatildeo pode seguir-se facilmente determinando a quantidade de accediluacutecares redutores libertados por accedilatildeo da enzima utilizando por exemplo a reaccedilatildeo do aacutecido 35-dinitrosaliciacutelico (DNS)

Materiais usados

Sacarose 02 M

Invertase em tampatildeo acetato de soacutedio 005 M pH 47Tampatildeo acetato de soacutedio 005 M pH 47Reagente 35 dinitro saliciacutelico (DNS) em meio alcalinoBanho-maria a 37degEspectrofotocircmetro

PREPARO DOS REAGENTES

1 Soluccedilatildeo de enzima invertase (01 mg proteiacutenamL) isolamento a partir de leveduras Pesar 50 mg de leveduras secas (fermento de patildeo) suspender em 250 mL de bicarbonato de soacutedio 015 molL e manter em banho-maria a 37ordmC durante 6 horas com agitaccedilatildeo ocasional Centrifugar o sobrenadante por 20 min a 3500 rpm Coletar o sobrenadante o qual conteacutem a enzima ativa Conservar a temperatura de 4ordmC Normalmente a concentraccedilatildeo de enzimas para os ensaios eacute de 01 mg proteiacutenamL

2 Substrato Sacarose 02 molL (68 g para 1L de aacutegua balatildeo volumeacutetrico) usar esta soluccedilatildeo para obter as soluccedilotildees mais diluiacutedas

3 Soluccedilatildeo tampatildeo acetato 005 molL pH 47 Acetato de soacutedio 005 molL(A) aacutecido aceacutetico 005 molL (B) Misturar 150 mL da soluccedilatildeo A e 300 mL da soluccedilatildeo B

4 Soluccedilatildeo alcalina de 35-dinitro-salicilato dissolver sob aquecimento 5g de aacutecido 35-dinitro-saliciacutelico em 100 mL de NaOH 2 molL Separadamente dissolver sob aquecimento 150 g de tartarato duplo de soacutedio e potaacutessio em 250 mL de aacutegua destilada Misturar as duas soluccedilotildees e completar o volume para 500 mL com aacutegua destilada

Adicionar os reagentes conforme a tabela

Reagentes (ml)Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo

1 2 3 4 5Tampatildeo acetato (50

mM pH 47)1 1 1 1 1

Agua 1 08 08 08 08Sacarose (02M) 05 05 05 05 05

Soluccedilatildeo de enzima (005 mgml)

- 02 02 02 02

Metodologia

Identificar os tubos o primeiro com a letra 1B o segundo com o nuacutemero 2 o terceiro com nuacutemero 3 e assim por diante ateacute o nuacutemero 5

Adicionar Tampatildeo acetato aos tubos de ensaio 1ml em cada tubo

Adicionar aacutegua aos tubos de ensaio No tubo B foi adicionado 1ml de aacutegua no tubo 2 foi adicionado 08ml no tubo seguinte 08ml o tubo 3 adicionou-se 08ml no tubo 4 foi adicionado 08ml e no ultimo

Em seguida adicionou-se Sacarose em cada um dos tubos No tubo 1 B foi adicionado 05ml no 2 foi 05ml no 3 foi 05ml no 4 foi 05ml e no tubo 5 foi adicionado 05 de glicose

Em seguida adicionou-se soluccedilatildeo enzima com exceccedilatildeo do tubo nuacutemero 1B 2 foi adicionado 08ml no tubo seguinte 02ml o tubo 3 adicionou-se 02ml no tubo 4 foi adicionado 02ml e no ultimo

Os tubos 3 4 e 5 foram levados a o banho-maria ao a 25 0C onde ficaratildeo por cerca de 5 mim logo apoacutes o banho foram incubados por tempos diferentes durante 5 min (tubo 3) 10 min (tubo 4) 15 min (tubo 5)

Em quanto isso foi adicionado 10 mL de soluccedilatildeo de 35-dinitrosalicilato aos tubos 1 e 2

Imediatamente apoacutes a retirada do tubo do banho-maria foi adicionado 10 mL de

soluccedilatildeo de 35-dinitrosalicilato

Ao teacutermino da incubaccedilatildeo do tubo 5 todos os tubos aqueceram em banho fervente

durante cinco minutos logo apoacutes deixamos resfriar por 5 min

Adicionamos 65 mL de aacutegua destilada a cada tubo

A uma mudanccedila de coloraccedilatildeo nos tubos que foram adicionados DNS juntamente

com a enzima com a sacarose ficando com uma cor amarelada Tubos 4 e 5 porem

o tubo 1 natildeo muda de cor poacutes natildeo foi adicionado a enzima

Depois foi medida a absorbacircncia dos tubos no comprimento de onda de 540nm tubo

1B Foram encontrados os seguintes valores de absorbacircncia

Tubos 1 2 3 4 5

Valores de

absorbacircncia

540 1175 0552 0602

• Sacarose 02 M
• Tubos

4 Soluccedilatildeo alcalina de 35-dinitro-salicilato dissolver sob aquecimento 5g de aacutecido 35-dinitro-saliciacutelico em 100 mL de NaOH 2 molL Separadamente dissolver sob aquecimento 150 g de tartarato duplo de soacutedio e potaacutessio em 250 mL de aacutegua destilada Misturar as duas soluccedilotildees e completar o volume para 500 mL com aacutegua destilada

Adicionar os reagentes conforme a tabela

Reagentes (ml)Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo

1 2 3 4 5Tampatildeo acetato (50

mM pH 47)1 1 1 1 1

Agua 1 08 08 08 08Sacarose (02M) 05 05 05 05 05

Soluccedilatildeo de enzima (005 mgml)

- 02 02 02 02

Metodologia

Identificar os tubos o primeiro com a letra 1B o segundo com o nuacutemero 2 o terceiro com nuacutemero 3 e assim por diante ateacute o nuacutemero 5

Adicionar Tampatildeo acetato aos tubos de ensaio 1ml em cada tubo

Adicionar aacutegua aos tubos de ensaio No tubo B foi adicionado 1ml de aacutegua no tubo 2 foi adicionado 08ml no tubo seguinte 08ml o tubo 3 adicionou-se 08ml no tubo 4 foi adicionado 08ml e no ultimo

Em seguida adicionou-se Sacarose em cada um dos tubos No tubo 1 B foi adicionado 05ml no 2 foi 05ml no 3 foi 05ml no 4 foi 05ml e no tubo 5 foi adicionado 05 de glicose

Em seguida adicionou-se soluccedilatildeo enzima com exceccedilatildeo do tubo nuacutemero 1B 2 foi adicionado 08ml no tubo seguinte 02ml o tubo 3 adicionou-se 02ml no tubo 4 foi adicionado 02ml e no ultimo

Os tubos 3 4 e 5 foram levados a o banho-maria ao a 25 0C onde ficaratildeo por cerca de 5 mim logo apoacutes o banho foram incubados por tempos diferentes durante 5 min (tubo 3) 10 min (tubo 4) 15 min (tubo 5)

Em quanto isso foi adicionado 10 mL de soluccedilatildeo de 35-dinitrosalicilato aos tubos 1 e 2

Imediatamente apoacutes a retirada do tubo do banho-maria foi adicionado 10 mL de

soluccedilatildeo de 35-dinitrosalicilato

Ao teacutermino da incubaccedilatildeo do tubo 5 todos os tubos aqueceram em banho fervente

durante cinco minutos logo apoacutes deixamos resfriar por 5 min

Adicionamos 65 mL de aacutegua destilada a cada tubo

A uma mudanccedila de coloraccedilatildeo nos tubos que foram adicionados DNS juntamente

com a enzima com a sacarose ficando com uma cor amarelada Tubos 4 e 5 porem

o tubo 1 natildeo muda de cor poacutes natildeo foi adicionado a enzima

Depois foi medida a absorbacircncia dos tubos no comprimento de onda de 540nm tubo

1B Foram encontrados os seguintes valores de absorbacircncia

Tubos 1 2 3 4 5

Valores de

absorbacircncia

540 1175 0552 0602

• Sacarose 02 M
• Tubos

Em quanto isso foi adicionado 10 mL de soluccedilatildeo de 35-dinitrosalicilato aos tubos 1 e 2

Imediatamente apoacutes a retirada do tubo do banho-maria foi adicionado 10 mL de

soluccedilatildeo de 35-dinitrosalicilato

Ao teacutermino da incubaccedilatildeo do tubo 5 todos os tubos aqueceram em banho fervente

durante cinco minutos logo apoacutes deixamos resfriar por 5 min

Adicionamos 65 mL de aacutegua destilada a cada tubo

A uma mudanccedila de coloraccedilatildeo nos tubos que foram adicionados DNS juntamente

com a enzima com a sacarose ficando com uma cor amarelada Tubos 4 e 5 porem

o tubo 1 natildeo muda de cor poacutes natildeo foi adicionado a enzima

Depois foi medida a absorbacircncia dos tubos no comprimento de onda de 540nm tubo

1B Foram encontrados os seguintes valores de absorbacircncia

Tubos 1 2 3 4 5

Valores de

absorbacircncia

540 1175 0552 0602

• Sacarose 02 M
• Tubos

• Sacarose 02 M
• Tubos