CINTHIA CAROLINNE DE SOUZA FERREIRA...5. Cultivo in vitro de gérbera e palma. I. Paz, Cristiane...
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA (UNEB) Pró-reitora de Pesquisa e Ensino de Pós-Graduação (PPG) Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS) Programa de Pós-Graduação em Agronomia: Horticultura Irrigada (PPGHI) CINTHIA CAROLINNE DE SOUZA FERREIRA REDUÇÃO DE CUSTOS E OTIMIZAÇÃO DA CULTURA DE TECIDOS PELA SUBSTITUIÇÃO DE KNO 3 P.A. POR FERTILIZANTE COMERCIAL NO MEIO DE CULTURA JUAZEIRO-BA 2019
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA (UNEB)
Pró-reitora de Pesquisa e Ensino de Pós-Graduação (PPG)
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS)
Programa de Pós-Graduação em Agronomia: Horticultura Irrigada (PPGHI)
CINTHIA CAROLINNE DE SOUZA FERREIRA
REDUÇÃO DE CUSTOS E OTIMIZAÇÃO DA CULTURA DE TECIDOS PELA
SUBSTITUIÇÃO DE KNO3 P.A. POR FERTILIZANTE COMERCIAL NO MEIO DE
CULTURA
JUAZEIRO-BA
2019
UNIVERSIDADE DO ESTADO DA BAHIA (UNEB)
Pró-reitora de Pesquisa e Ensino de Pós-Graduação (PPG)
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais (DTCS)
Programa de Pós-Graduação em Agronomia: Horticultura Irrigada (PPGHI)
CINTHIA CAROLINNE DE SOUZA FERREIRA
REDUÇÃO DE CUSTOS E OTIMIZAÇÃO DA CULTURA DE TECIDOS PELA
SUBSTITUIÇÃO DE KNO3 P.A. POR FERTILIZANTE COMERCIAL NO MEIO DE
CULTURA
Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-
Graduação em Agronomia: Horticultura Irrigada da
Universidade do Estado da Bahia (PPGHI -
UNEB/DTCS), como requisito para a obtenção do
título de Mestre em Agronomia, Área de
Concentração: Horticultura Irrigada.
Orientadora: Cristiane Domingos da Paz
JUAZEIRO-BA
2019
F383r Ferreira, Cinthia Carolinne de Souza
Redução de custos e otimização da cultura de tecidos pela
substituição de KNO3 P.A. por fertilizante comercial no meio de cultura /
Cinthia Carolinne de Souza Ferreira. Juazeiro, 2019.
70 fls : il.
Orientador(a): Cristiane Domingos da Paz.
Coorientador(a): Juliana Martins Ribeiro.
Inclui Referências
Dissertação (Mestrado Acadêmico) - Universidade do Estado da Bahia.
Departamento de Tecnologia e Ciências Sociais. Programa de Pós-Graduação
em Horticultura Irrigada - PPGHortI, 2019.
1. Redução de custo na micropropagação. 2. Meio de cultura.
3. Reagente P.A. (Nitrato de Potássio). 4. Fertilizante comercial.
5. Cultivo in vitro de gérbera e palma. I. Paz, Cristiane Domingos da. II.
Ribeiro, Juliana Martins. III. Universidade do Estado da Bahia. Departamento
de Tecnologia e Ciências Sociais. IV. Título.
CDD: 630
DEDICATÓRIA
“Dedico este trabalho a Deus, o autor de
grandes maravilhas em minha vida, aos meus
pais, Washington Luiz e Elizabete e a minha
dádiva divina, meu filho Nathan Guilherme”.
AGRADECIMENTOS
A Deus que com seu amor sublime nos concede o dom da vida, por semear sonhos e
nos dar força e sabedoria para torná-los realidade. A ti Senhor, meu coração será sempre
grato, por tudo que fez, faz e irá fazer em meu viver.
A Washington Luís Ferreira e Elizabete de Souza, meus pais, meus exemplos de vida
lutas e conquistas, por todo amor, cuidado, dedicação, orientação e pela formação do meu
caráter. Ao meu irmão e amigo André Luiz (in memonrian) por seu carinho.
Agradeço aquele que me ensinou o verdadeiro sentido da palavra FORÇA, me fez
sonhar muito mais alto, que me alegra todo dia, meu presente de Deus, meu filho, meu Gui!
Agradeço carinhosamente a Adan Hitler pelo incentivo e apoio durante esse processo
de aprendizagem.
A minha Fé-milia pelo afeto, compreensão, pelo testemunho de cada um, as Marias
(tias) por todas as orações e por todo apoio em cada decisão por mim tomada.
Agradeço a minha orientadora Cristiane Domingo da Paz por seu companheirismo,
apoio, confiança, conhecimentos transmitidos e amizade.
A minha coorientadora Dr.ª Juliana Ribeiro pelo auxílio, confiança e por sempre ter
se colocado à disposição para me auxiliar no que fosse necessário.
Agradeço em especial a Prof.ª Dr.ª e amiga Joselita Cardoso que me acolheu e
instruiu, dividiu comigo o seu conhecimento e tempo.
Ao grupo do laboratório de Biotecnologia da UNEB e meus amigos: Alessandro
Lucas, Jaine, Jeferson, Lene, Dora e todos que me auxiliaram na execução das atividades, por
toda força histórias e sentimentos compartilhados.
Ao Prof. Jairton Fraga Araújo e Carla Roane de Souza Santana pelo auxilio e
disposição durante as avaliações no CAERDS.
A UNEB/DTCS por toda a infraestrutura e serviços técnicos, e o grupo PPGHI por
me proporcionar momentos inesquecíveis e por ter possibilitado estreitar laços de amizade
com pessoas maravilhosas. Em especial ao corpo docente.
A Capes pela concessão da bolsa.
A todos que participaram direta ou indiretamente para realização dessa conquista. O
mérito é nosso!
SUMÁRIO
RESUMO GERAL ................................................................................................................... 9
COST REDUCTION AND TISSUE CULTURE OPTIMIZATION FOR THE
REPLACEMENT OF KNO3 P.A. BY COMMERCIAL FERTILIZER IN THE
CULTURE ENVIRONMENT .............................................................................................. 10
GENERAL ABSTRACT ....................................................................................................... 10
INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 11
REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................. 13
Cultura de tecidos ................................................................................................................... 13
Meio de Cultura ...................................................................................................................... 14
Compostos nitrogenados do meio MS .................................................................................. 15
Gérbera jamessoni ................................................................................................................... 16
Cactáceas / Palma Orelha de Elefante .................................................................................. 18
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 20
CAPITULO I .......................................................................................................................... 36
REDUÇÃO DE CUSTOS NA MICROPROPAGAÇÃO DE GÉRBERA HÍBRIDA COM
A UTILIZAÇÃO DO FERTILIZANTE NITRATO DE POTÁSSIO............................... 36
RESUMO ................................................................................................................................ 37
ABSTRACT ............................................................................................................................ 38
INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 39
MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 40
Material vegetal e meio de cultura ........................................................................................ 40
Determinação dos tratamentos e desenvolvimento in vitro ................................................ 40
Desenvolvimento ex vitro ....................................................................................................... 41
Coleta de dados e análise estatística ..................................................................................... 42
RESULTADOS ....................................................................................................................... 42
Crescimento e desenvolvimento in vitro ............................................................................... 42
Crescimento e desenvolvimento ex vitro .............................................................................. 44
DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 48
Efeitos da substituição e redução do KNO3 no desenvolvimento in vitro e ex vitro .......... 48
Viabilidade da substituição do reagente KNO3 P.A. .......................................................... 49
CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 50
AGRADECIMENTOS ........................................................................................................... 50
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 50
CAPITULO II ......................................................................................................................... 55
DESENVOLVIMENTO DA PALMA IN VITRO EM RESPOSTA À SUBSTITUIÇÃO
DE NITRATO DE POTÁSSIO (P.A.) POR FERTILIZANTE COMERCIAL KNO3 ... 55
RESUMO ................................................................................................................................ 56
ABSTRACT ............................................................................................................................ 57
INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 58
MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 59
RESULTADOS ....................................................................................................................... 60
DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 64
CONCLUSÃO ........................................................................................................................ 66
AGRADECIMENTOS ........................................................................................................... 67
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 67
9
REDUÇÃO DE CUSTOS E OTIMIZAÇÃO DA CULTURA DE TECIDOS
PELA SUBSTITUIÇÃO DE KNO3 P.A. POR FERTILIZANTE COMERCIAL NO
MEIO DE CULTURA.
RESUMO GERAL
O cultivo in vitro é o estabelecimento de plantas ou explantes em meio nutritivo
específico, livre de contaminantes, em condição ambiental controlada e asséptica,
possibilitando a produção de mudas clonais sadias em grande escala e menor tempo de
produção. O elevado custo operacional pode limitar a aplicação da técnica às espécies que não
se propagam por meios convencionais. Contudo, existem alternativas que permitem a
substituição dos constituintes dos meios de cultura tornando a técnica menos dispendiosa.
Assim, o trabalho teve como objetivo a redução dos custos operacionais da técnica do cultivo
in vitro de gérbera e palma forrageira pela substituição do reagente nitrato de potássio P.A.
por um fertilizante comercial para obtenção de meio de cultura sem contaminantes e efeito
fitotóxico às culturas inoculadas. Dois experimentos foram conduzidos visando à avaliação do
comportamento de explantes de gérbera DTCS e da palma forrageira cv. orelha de elefante
mexicana em fase de enraizamento submetidas às diferentes dosagens do fertilizante NKS em
condições in vitro e desenvolvimento ex vitro. As variáveis analisadas em ambos
experimentos foram comprimento e número de raízes e folhas, valor médio da biomassa
fresca e absorção de macronutrientes. Os resultados comprovaram a viabilidade da
substituição do reagente KNO3 P.A. pelo fertilizante comercial, contribuindo para a redução
dos custos no preparo do meio de cultura e facilitando sua aquisição, uma vez que a compra
do fertilizante comercial não depende dos trâmites burocráticos.
Palavras-chave: Meio de cultura; Macronutirentes; Gérbera; Palma orelha de elefante;
Viabilidade econômica.
10
COST REDUCTION AND TISSUE CULTURE OPTIMIZATION FOR THE
REPLACEMENT OF KNO3 P.A. BY COMMERCIAL FERTILIZER IN THE
CULTURE ENVIRONMENT
GENERAL ABSTRACT
In vitro cultivation is the establishment of plants and explants in a nutrient
environment, free of contaminants, in a controlled and aseptic environmental condition
promoting the production of healthy clonal seedlings in a large scale and a shorter production
time. The high operating cost can limit the technique application of the species that do not
propagate by conventional means. However, there are alternatives that allow the replacement
of the constituents of the culture media making the technique cheaper. Thus, the objective of
the work was to reduce the operational costs of the in vitro culture technique of gerbera and
palma forrageira by replacing the potassium nitrate reagent P.A. by a commercial fertilizer to
obtain a culture medium without contaminants and effect phytotoxic on cultures. Two
experiments were carried out in order to evaluate the behavior of gerbera and palma forrageira
explants in the rooting phase submitted to the different dosages of the NKS fertilizer under in
vitro conditions and ex vitro development. The variables analyzed in both experiments were
length and number of roots and leaves, mean value of fresh biomassand absorption of
macronutrients. The results showed the viability of replacing the KNO3 P.A. reagent with the
commercial fertilizer, contributing to the reduction of costs in the preparation of the culture
medium and facilitating its acquisition, since the purchase of commercial fertilizer does not
depend on bureaucratic procedures.
Keywords: Culture medium; Economic viability; Macronutirentes; Gerbera; Palma Orelha de
Elefante
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INTRODUÇÃO
O cultivo in vitro é o estabelecimento de plantas ou explantes em meio nutritivo
específico, livre de contaminantes, em condição ambiental controlada e asséptica. Essa
técnica permite a propagação de espécies vegetais de grande interesse econômico, por meio
da micropropagação, que produz mudas clonais sadias, em grande escala e menor tempo de
produção que viabilizam a programação de cronogramas de produção com plantas uniformes
e de elevada produtividade (Ribeiro & Teixeira, 2016, Pais et al., 2016, Oliveira-Cauduro et
al., 2017).
Algumas culturas economicamente importantes, como a gérbera (Gerbera jamesonii
Bolus ex Hook), quando propagada por métodos convencionais (sementes ou touceiras)
apresenta baixa produtividade e elevada ocorrência de problemas fitossanitários. A alternativa
mais promissora para obtenção de mudas comerciais isenta de doenças sistêmicas é por meio
da micropropagação (Cardoso & Silva, 2013). Atualmente, esse é o método que potencializa a
propagação clonal e acelera o melhoramento das espécies vegetais, permitindo a regeneração
de plantas transformadas geneticamente (transgênicas), sendo, portanto, uma ferramenta
biotecnológica promissora (Santos et al., 2015a).
Entretanto, alguns entraves restringem a sua execução e impede sua difusão, como o
elevado custo operacional, o que limita a aplicação da técnica às espécies que não se
propagam facilmente por meios convencionais. Assim, a redução de custo baseada na
substituição ou combinação de práticas convencionais por métodos alternativos, a fim de
otimizar a técnica do cultivo in vitro, tem sido o desafio do século XXI (Weber et al., 2015,
Cardoso et al., 2018).
A assepsia é a etapa que mais encarece o cultivo in vitro e normalmente, nos
laboratórios de biotecnologia, o autoclave é o principal equipamento de esterilização,
resultando no aumento do consumo de energia e tempo de ação, elevando o custo e o tempo
de execução. Dessa forma, protocolos que inibem e /ou eliminem esses patógenos sem
interferir nos constituintes do meio e nas características fisiológicas do explante, devem ser
elaborados e testados quanto à sua viabilidade (García et al., 2015, Silva et al., 2015). Nesse
sentido, métodos alternativos, como a esterilização química, têm se mostrado promissores na
esterilização do meio nutritivo, vidrarias e água utilizada nos procedimentos (Teixeira et al.,
2005; Pinho et al., 2006; Teixeira et al., 2008; Cardoso, 2009; Cardoso & Silva, 2012; Deein
et al., 2013; Pais et al., 2016).
12
Outro fator limitante da execução da técnica é a aquisição de reagentes P.A. no
preparo dos meios de cultura, fornecedores de substâncias essenciais para o desenvolvimento
in vitro. Além do custo elevado, a aquisição desses produtos, como o nitrato de potássio
(KNO3) e o nitrato de amônio (NH4NO3), depende de trâmites burocráticos, devido as suas
características inflamáveis e/ou explosivas, por serem produtos controlados pelo Ministério da
Defesa.
Portanto, a substituição de reagentes P.A. por fertilizantes comerciais, compostos por
nitrogênio (N), fósforo (P), potássio (K) e outros macros e micronutrientes em diferentes
concentrações (Su et al., 2012), utilizados no preparo do meio de cultivo da micropropagação
de plantas, surgem como novas alternativas para reduzir custos, eliminar os processos
burocráticos para aquisição dos reagentes e tornar a prática do cultivo in vitro mais acessível.
Assim, o presente trabalho teve como objetivo a redução dos custos operacionais da técnica
do cultivo in vitro enfatizando o uso de fertilizante comercial para obtenção de meio de
cultura sem contaminantes e efeito fitotóxico às culturas inoculadas.
13
REVISÃO DE LITERATURA
Cultura de tecidos
A micropropagação compreende o conjunto de técnicas de cultura de tecidos
utilizadas para a multiplicação de plantas a partir de pequenos explantes. A prática de
propagação clonal possibilita a produção de um maior número de plantas em espaço físico e
temporal reduzido, originando plantas geneticamente idênticas à matriz doadora, mantendo a
identidade genética do material propagado (Dias et al., 2011; Rocha et al., 2018; Paranatinga
et al., 2018).
Por meio desta técnica é possível a propagação de espécies e/ou variedades de
interesse, através da totipotência celular. Essa característica possibilita a regeneração do
fenótipo do organismo completo e diferenciado, resultante de uma célula. Assim, a cultura de
tecidos vegetais é uma ferramenta promissora na área da biotecnologia (Termignone, 2012;
Souza et al., 2018);
A finalidade inicial da técnica do cultivo in vitro é conduzir o crescimento e o
desenvolvimento do explante manipulado, sendo disponibilizados nutrientes apropriados em
um meio de cultura contendo água e sais. O meio de cultivo mais utilizado é o MS
(Murashige & Skoog, 1962), que é constituído de macronutrientes, micronutrientes,
componentes orgânicos (sacarose e inositol) e vitaminas de White (White, 1943). A depender
da necessidade da espécie e suas exigências da concentração dos constituintes do meio
nutritivo, podem ainda ser introduzidos reguladores vegetais de crescimento. Outro
componente, o ágar-ágar (polissacarídeo produzido por algas - Gelidium amansii), é o agente
solidificante comumente utilizado no meio de cultivo (Cid, 2001). O bom estabelecimento e
desenvolvimento do material inoculado também está relacionado com o controle da
temperatura, iluminação e contaminação dos explantes (Souza & Pereira, 2007, Castillo,
2008).
A execução de procedimentos requer tempo e elevam os custos das mudas
produzidas por micropropagação (Cardoso, 2009). Inúmeros fatores podem influenciar os
custos operacionais da cultura de tecidos, sendo a contaminação microbiana, responsável por
perdas severas em biofábricas e laboratórios de pesquisa (Panicker et al., 2007).
Para o controle de contaminantes algumas técnicas podem ser adotadas, dentre elas a
autoclavagem, procedimento que utiliza altas temperaturas na esterilização do material
(Torres et al., 1998). Entretanto esse método aumenta os custos de produção das mudas
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micropropagadas, pela demanda do elevado consumo energético das autoclaves e degradação
dos constituintes do meio devido ao aquecimento (Ribeiro, 2006; Weber et al., 2015), e tais
fatores podem comprometer a qualidade e o desenvolvimento das mudas. Assim, para reduzir
custos relacionados ao processo de esterilização térmica métodos alternativos têm obtido
êxito na desinfestação do meio nutritivo, sendo uma alternativa viável e eficiente (Yanagawa
et al., 1995; Passos et al., 2004; Teixeira et al., 2005a; Teixeira et al., 2006; Pais et al., 2016).
Outra forma de minimizar os custos de produção da técnica é a partir da otimização
da confecção do meio de cultura, por meio da redução e/ou substituição de substâncias puras
para análise, produtos (P.A.), ou seja com elevado grau de pureza, por outros mais acessíveis,
com menor valor de compra e facilmente disponível no mercado ( Ribeiro et al., 2002; Sousa
et al., 2006; Ribeiro & Teixeira , 2008; Villa et al., 2009, Sasamori et al., 2016; Moreira et
al., 2017).
Apesar dos entraves pelo uso da técnica, a micropropagação é a ferramenta
biotecnológica essencial mais importante para o aumento da produção de culturas
economicamente importantes (Cardoso & Inthurn, 2018).
Meio de Cultura
O meio de cultura fornece substâncias essenciais que promovem o crescimento e
desenvolvimento dos explantes inoculados, mantendo as vias metabólicas e bioquímicas do
vegetal, proporcionando bom desempenho à planta em condições ex vitro (Kerbauy, 1995;
Caldas et al., 1998).
Além da fonte nutricional, a solução que compõe o meio de cultura influencia no
crescimento celular e na morfogênese. Os solutos atuam no potencial osmótico, podendo
ativar ou inativar as vias metabólicas, interferindo no desenvolvimento do embrião e /ou
mudas (George et al., 2008; Marino et al., 2010; Costa et al., 2017). Dessa forma, toda
modificação em relação à concentração dos solutos deve promover o melhor desenvolvimento
do material inoculado (Morais et al., 2012; Scheffer et al., 2018).
A composição do meio de cultivo é um dos fatores mais importantes para o
crescimento in vitro. Constitui-se basicamente de macronutrientes, micronutrientes, vitaminas
de White, aminoácidos, carboidratos e agente solidificante (White, 1943, Faria et al., 2002;
Villa et al., 2009; Su et al., 2012; Barrueto & Teixeira, 2014; Schneiders et al., 2015; Lucena
et al., 2015). A depender da fase de desenvolvimento e objetivo do cultivo in vitro, o meio
15
pode ainda ser suplementado com reguladores de crescimento (auxinas e citocininas) (Davide
& Melo, 2012; Oliveira et al., 2013; Miranda et al., 2016).
O crescimento do explante in vitro depende das exigências nutricionais de cada
espécie vegetal (Schmildt et al., 2015). Dentre os diferentes meios nutritivos, o MS
(Murashige & Skoog, 1962) é normalmente utilizado na micropropagação de diversas
espécies vegetais (Rezende et al., 2008; Yeung et al., 2015; Palaoro et al., 2018).
Visando a otimização e redução de custos na micropropagação, a formulação de
novos protocolos do meio de cultura é uma alternativa promissora, considerando a
especificidade nutricional de cada planta (Ferreira et al., 2016). Normalmente se utiliza o
meio MS em 100%, entretanto essa concentração de sais nem sempre é favorável para o
desenvolvimento in vitro de algumas culturas (Grattapaglia & Machado, 1998; Islam et al.,
2004; Shahzad et al., 2017).
Em algumas culturas o meio MS modificado (com redução de 50% dos
macronutrientes) e simplificado (com adição de substâncias químicas similares) é suficiente
para o crescimento de algumas culturas, favorecendo a obtenção de plantas com qualidade e
com custo de produção reduzido (George & Sherrington, 1984; Malty et al., 2006; George et
al., 2008; Sridhar & Aswath, 2014). Modificações e/ou diluições dos sais inorgânicos do
meio MS, têm apresentado bons resultados no cultivo in vitro de diversas espécies vegetais
(Kazue et al., 2014; Sasamori et al., 2016).
Compostos nitrogenados do meio MS
O nitrato de amônio (NH4NO3) e o nitrato de potássio (KNO3) são os compostos
nitrogenados que constituem/compõem o meio MS (Murashige & Skoog, 1962). O KNO3
(P.A) apresenta-se em quantidades superiores aos demais reagentes na formulação de sais de
MS (Nagao et al., 1994). Entretanto, a sua obtenção no Brasil depende de processos
burocráticos. Devido às suas características inflamáveis e/ou explosivas sua aquisição
depende de autorização do Ministério da Defesa (Portaria Nº42).
Além dos trâmites burocráticos para aquisição dos produtos, os reagentes
nitrogenados P.A. apresentam custo elevado. Para viabilizar e reduzir custos no preparo do
meio de cultura, a redução e/ou uso de outras fontes nitrogenadas facilmente disponíveis no
mercado e com valor mais acessível tem sido uma alternativa promissora (Silva et al., 2001;
Barros et al., 2018).
16
O fornecimento do nitrogênio (N), assim como de outros saís no meio MS é
excessivo. Dessa forma, para aperfeiçoar a técnica, têm sido realizadas modificações em
relação à quantificação desses compostos (George & Sherrington, 1984), considerando a
exigência nutricional de cada material vegetal inoculado.
Os compostos nitrogenados apresentam-se na forma de cátion (amônio) e ânion
(nitrito e nitrato) (Caldas et al., 1998). Quando disponibilizado somente na forma de amônio
(NH+4
), os explantes apresentam sinais de toxidez e suas atividades metabólicas são inibidas
(Gamborg & Shyluk, 1970). Elevada concentração de N pode ser altamente prejudicial para
algumas culturas (Pasqual et al., 1997). Porém, quando o amônio é aplicado combinado com
o nitrato, mesmo em baixa concentração, promove o crescimento de plantas in vitro (Caldas
& Caldas, 1976). Quando em excesso o nitrato (NO-3
) prejudica a morfogênese e o
crescimento dos explantes, uma vez que esse é um constituinte de aminoácidos, proteínas e
enzimas.
Como principal macronutriente para o estabelecimento de culturas in vitro, o N nas
suas duas formas é considerado um componente importante nos processos de
desenvolvimento do explante (Sakuta, 1987). A interação do carbono e nitrogênio na forma
de nitrato contribui para o desempenho fisiológico da planta (Stitt, 1999), enquanto a
deficiência do N inibe o crescimento da parte aérea e promove o desenvolvimento radicular
(Scheible et al., 1997).
Explantes inoculados em meio de cultura com baixas concentrações de nitrogênio
têm o crescimento das raízes estimulado. Entretanto o aumento da ramificação radicular
ocorre com a redução do NH4NO3, apresentando melhores respostas quando se aumenta a
concentração de KNO3 (Grime et al., 1991; Marschner, 1995; Almeidal, 2010). Dessa forma,
o KNO3 é um importante componente do meio de cultura, cujo nitrogênio controla o
desenvolvimento das raízes e o potássio regula o potencial osmótico (Malavolta et al., 1997;
Ribeiro & Teixeira, 2008; Taiz & Zeiger, 2013).
Gérbera jamessoni
O primeiro relato oficial da espécie, Gerbera jamesonii Bolus ex Hook, também
conhecida por Transvaal Daisy ou Barberton Daisy, foi feito por Hooker (1989). Classificada
como uma espécie originária da Ásia, África do Sul e Tasmânia (Radice & Marconi, 1998;
Ludwig et al., 2010), pertence à ordem Estelares, família Asteraceae (compositae), tribo
Mustisieae, subtribo Mistissima . O gênero compreende cerca de 30 espécies, distribuídas
17
pela África, Madagascar e Ásia tropical (Hansen,1985; Barroso, 1991; Elomaa & Teeri, 2001;
Rojas et al., 2018).
Dentre as espécies ornamentais, a gérbera é caracterizada como uma planta
herbácea, de aproximadamente 45 cm de altura, caule subterrâneo e rizoma simpodial, que
emite brotos aéreos foliares e floríferos. Essas são classificadas em dois grupos distintos: as
gérberas de vaso, que apresentam escapos curtos, e as de corte, com escapos longos
(Bhargava et al., 2013).
Em relação à nutrição, são moderadamente exigentes, com seu desenvolvimento
diretamente influenciado pela deficiência (ocorre o amarelecimento das folhas) e o excesso de
macronutrientes (acelera o crescimento vegetativo e atrasa no florescimento) (Jeong et al.,
2009). O conhecimento da exigência nutricional em cada fase fenológica, garante a qualidade
e produtividade da espécie (Guerrero et al., 2012; Ludwig et al., 2013; Santos et al., 2015b ;
Ludwig et al., 2018).
A gérbera se destaca entre as 10 espécies florais mais cultivadas mundialmente
Frómeta et al., 2017), comercializada tanto como flor de vaso como de corte. Contudo, o
domínio do comércio internacional é compreendido pelas flores de corte, sendo produzida
principalmente na Europa seguida de outros países como Holanda, Alemanha, França, Itália,
Israel, Colômbia e Estados Unidos (Rashmi et al., 2018). No Brasil, é uma das principais
plantas ornamentais de maior importância comercial (Souza et al., 2018).
A propagação da gérbera pode ser sexualmente ou assexuadamente, através da
divisão da planta adulta ou micropropagação (Soroa, 2005; Kanwar & Kumar, 2008). A
propagação por sementes é menos utilizada para a produção de flores de corte, por exigir um
maior investimento de recursos e trabalho, sendo um processo lento e que traz maiores
probabilidades de se perder características desejáveis devido à segregação genética (Sachiva,
1975).
Após a hibridação é necessário aproximadamente 18 dias para ocorrer a formação de
semente (Souza et al., 2005). Quando propagadas por sementes a germinação ocorre entre
sete a quatorze dias após a semeadura. As plântulas devem ser transplantadas quando
possuírem de quatro a cinco folhas. A etapa de crescimento vegetativo se prolonga por dois a
três meses. Aproximadamente no 5° dia após o plantio inicia-se a floração, produzindo de 3 a
6 flores no primeiro ano, e já no segundo e terceiro ano a produção se eleva para 6 a 18 flores
por ano (Bellé, 1998).
18
Semelhante ao método de reprodução sexuada, a propagação vegetativa da gérbera,
por divisão de touceiras, é um processo lento, não garante ao produtor mudas sadias nem
uniformes (Peper et al., 1971; Aswath & Choudary, 2001). Essa técnica compromete a
produção, elevando o custo, e consequentemente causando prejuízos na comercialização. Em
função dessa limitação, estudos sobre a micropropagação de gérbera foram elaborados e
testados a fim de estabelecer protocolos, meios de cultura e diferentes explantes (Pierik et al.,
1973; Huang & Chu, 1985; Laliberté et al., 1985; Jerzy & Lubomski, 1991; Reynoird et al.,
1993; Severin et al., 2000).
Devido às limitações de propagação por métodos convencionais a micropropagação é
a técnica mais utilizada para propagação de gérbera. A multiplicação das cultivares consiste
de cruzamentos, seleção e genótipos propagados por meio da cultura de tecidos (Nagaraju et
al., 1998; Aswath & Choudhary, 2001; Bhatia et al., 2009). A técnica promove o
aperfeiçoamento dos atributos qualitativos da cultura por meio dos programas de
melhoramento genético. Assim, pelo cultivo in vitro (inoculação de explante e subcultura com
frequência), é possível a obtenção de plantas homogêneas em grande escala em menor espaço
e tempo (Rashmi et al., 2018), suprindo a demanda comercial e exigências do consumidor.
Embora seja a técnica mais apropriada para atender a demanda comercial da
agroindústria, a micropropagação é uma técnica onerosa, sendo necessários protocolos
alternativos que estão sendo desenvolvidos e testados a fim de otimizar e reduzir custos. Os
métodos envolvem desde técnicas alternativas de esterilização (Pais et al., 2016) bem como
formas de redução e/ou substituição de saís inorganicos do meio de cultura para
estabelecimento in vitro da gérbera (Sousa et al., 2006; Cardoso et al., 2013).
Cactáceas / Palma Orelha de Elefante
A família das cactáceas é oriunda do México, habitando principalmente em áreas
áridas e semiáridas (Anaya, 2001; Hoffmann, 1995). Existem 2.000 espécies pertencentes aos
178 gêneros de Palma forrageira (Marques et al., 2017), conjunto de plantas suculentas,
comumente recobertas por espinhos (Menezes & Ribeiro, 2015).
O cultivo da palma tem se tornado crescente devido ao seu elevado potencial
forrageiro e às características ornamentais que essas plantas possuem, como formas e
tamanhos variados. Todavia, o seu uso é mais expressivo nas regiões áridas e semiáridas
(Santana et al., 2015; Zingale, 2016; Carvalho et al., 2018), onde a palma forrageira é um
recurso importante na nutrição animal.
19
Das espécies mais cultivadas no Nordeste brasileiro, principalmente no Vale do São
Francisco, destaca-se a Opuntia ficus-indica Mill e a Nopalea cochenillifera Salm Dyck,
devido às suas características morfológicas. Todavia, novas variedades com maior valor
nutritivo e resistência a pragas e doenças estão sendo implantadas nos sistemas de produção
(Cavalcanti et al., 2008), uma vez que a incidência de doenças é o fator que acomete a cultura
causando prejuízos severos aos produtores do semiárido brasileiro.
A cochonilha do carmim, gênero Dactylopius sp , é a principal praga que prejudica o
cultivo de palma no Nordeste. Dissemina-se facilmente e quando não controlada pode
dizimar a produção do palmal (Santos et al., 2006; Chiacchio, 2008; Lopes et al., 2009;
Lopes et al 2010; Chagas et al., 2018). No processo de alimentação, as cochonilhas retiram o
nutriente e injetam toxinas nas raquetes e, dessa forma, reduzem a taxa fotossintética,
podendo levar a morte das plantas (Vasconcelos et al., 2009, Santos et al., 2015a).
Das variedades resistentes estudadas a miúda, orelha-de-elefante e algerian
apresentam elevada resistência a esse inseto. Dessas, a cultivar Orelha-de-elefante (Opuntia
stricta Haw), se destaca com elevada produtividade, baixa exigência nutricional, tolerância à
seca e resistência à cochonilha do carmim (Lopes et al., 2010 ; Silva, 2017; Santos et al.,
2018), apresentando elevado potencial agronômico como palma forrageira no semiárido
brasileiro (Nobel, 1983; Vasconcelos et al., 2009).
Diante da sua importância econômica, os métodos convencionais de propagação não
atendem à demanda comercial mundial dessa cultura (Bhau, 1999; Bhau & Wakhlu, 2015). A
produção de mudas por meio da micropropagação possibilita a obtenção de propágulos
resistentes a pragas em grande escala (Frota et al., 2004), potencializando a propagação
clonal, acelerando o processo de melhoramento genético das espécies vegetais e agregando
valor à cultura (Gava & Lopes, 2012).
Para completar todas as etapas da multiplicação in vitro de palma forrageira orelha
de Elefante se faz necessário aproximadamente oito meses (Santos et al., 2015a). Explantes
são inoculados em meio de cultura MS suplementado com reguladores vegetais, 1,5 mg L-1
e
0,0625 mg L-1
de benzilaminopurina e ácido naftalenoacético, respectivamente (Escobar et
al., 1986). Embora o cultivo in vitro seja uma ferramenta biotecnológica promissora, ainda é
escassa a produção de mudas de palma forrageira por este método (Ribeiro & Teixeira, 2016).
20
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36
CAPITULO I
Formato – Scientia Horticultureae
REDUÇÃO DE CUSTOS NA MICROPROPAGAÇÃO DE GÉRBERA HÍBRIDA COM
A UTILIZAÇÃO DO FERTILIZANTE NITRATO DE POTÁSSIO
37
RESUMO
Diante de entraves burocráticos e elevado custo de aquisição do nitrato do potássio (KNO3)
com alto grau de pureza (P.A.), conduziu-se este trabalho com o objetivo de verificar a
possibilidade de substituição do reagente P.A. por fertilizante mineral comercial de
composição química similar, baixo custo e fácil aquisição. Foram avaliadas as concentrações
(g L-1
): T1: 1,9 (controle utilizando reagente P.A.); T2: 0,0; T3: 0,5, T4: 1,0; T5: 1,5; T6: 2,0
e T7: 2,5 (fertilizante). Na fase de enraizamento, após 35 dias de cultivo em sala de
crescimento, foram avaliados o comprimento médio da raiz, o comprimento médio da parte
aérea, o número de folhas e o valor médio da biomassa fresca da Gérbera híbrida DTCS.
Destacou-se a concentração de 0,5 g L-1
de fertilizante gerando resultados iguais ou superiores
aos do tratamento controle em todas as variáveis citadas em condições in vitro. Na etapa de
avaliação ex vitro, mudas oriundas de cultivo in vitro com o fertilizante comercial foram
aclimatizadas e posteriormente transplantadas para viveiro telado tendo o seu
desenvolvimento sido acompanhado até a floração. Ex vitro avaliou-se comprimento o médio
da raiz, número médio de raízes, o comprimento médio da parte aérea, o número de folhas,
área foliar, valor médio da biomassa fresca e a absorção de macronutrientes. Não foram
observadas alterações morfológicas nas condições testadas. Diante dos resultados citados,
comprovou-se a viabilidade da substituição do reagente KNO3 (P.A.) por fertilizante
comercial NKS no cultivo in vitro de gérbera, em menor proporção, agregando redução de
custo, aproximadamente 99,09%, à técnica e agilidade na aquisição do produto.
Palavras-chave: Cultura de tecidos; Macronutrientes; Redução de custos; Trâmites
burocráticos.
38
ABSTRACT
Due to bureaucratic obstacles and high cost of acquisition of potassium nitrate (KNO3) with
high purity (P.A.), this work was carried out to verify the possibility of substitution of the
P.A. reagent by commercial mineral fertilizer of similar chemical composition , low cost and
easy acquisition. Concentrations (g L-1
): T1: 1.9 (control using reagent P.A.); T2: 0.0; T3: 0.5,
T4: 1.0; T5: 1.5; T6: 2.0 and T7: 2.5 (fertilizer). In the rooting phase, the average root length,
average shoot length, number of leaves and the mean value of the fresh biomass of the DTCS
hybrid Gerbera were evaluated after 35 days of growing in a growth room. The concentration
of 0.5 g L-1
of fertilizer was observed, yielding results equal to or greater than the control
treatment in all the variables mentioned under in vitro conditions. In the ex vitro evaluation
stage, seedlings from in vitro cultivation with the commercial fertilizer were acclimatized and
later transplanted to the screened nursery, whose development was monitored until flowering.
Ex vitro the mean root length, mean number of roots, average shoot length, leaf number, leaf
area, mean value of fresh biomass and macronutrient uptake were evaluated. No
morphological changes were observed under the conditions tested. In view of the
aforementioned results, the feasibility of replacing the KNO3 (P.A.) reagent by NKS
commercial fertilizer in the in vitro cultivation of gerbera was verified, to a lesser extent,
adding cost reduction, approximately 99.09%, to the technique and agility in the acquisition
of product.
Keywords: Bureaucratic procedures ; Culture of tissues; Macronutrients; Reduction of costs.
39
INTRODUÇÃO
O cultivo in vitro é uma técnica utilizada na propagação de plantas economicamente
importantes, inclusive aquelas que apresentam limitações quando propagadas pelos métodos
convencionais. Em comparação aos métodos tradicionais, oferece as vantagens da produção
em massa de mudas sadias e uniformes em curto período de tempo e em espaço reduzido
(Borges et al., 2016; Silva et al., 2017; Oliveira et al., 2018). Dentre as culturas beneficiadas
pela técnica de micropropagação, destaca-se a gérbera, importante na floricultura, seja como
flor de vaso ou corte, devido à sua diversidade de cores e formas, estando entre as cinco
principais flores comercializadas mundialmente (Bhatia et al., 2009; Longchar e Keditsu,
2013; Ludwig et al., 2014; Santos et al., 2015, Piroli, 2018).
Apesar das vantagens que oferece quanto à obtenção do produto final, a propagação
in vitro é um método considerado dispendioso, principalmente quando se trata dos
constituintes do meio de cultura. Na micropropagação de gérbera, o meio MS (Murashige e
Skoog, 1962) adicionado às vitaminas de White (White, 1943), é o mais utilizado, e a sua
principal característica é a elevada concentração de sais.
Os reagentes utilizados na confecção do meio de cultura são substancias puras para
análise (P.A.), ou seja, com elevado teor de pureza. Além de apresentarem elevado custo,
alguns são de difícil aquisição (Ribeiro e Teixeira, 2008) como o nitrato de potássio (KNO3),
requerido em quantidade superior aos demais reagentes na formulação de sais de MS. Devido
as suas características inflamáveis e/ou explosivas quando em contato com outras substâncias,
a sua aquisição no Brasil, depende de autorização do Ministério da Defesa.
A substituição, redução ou retirada de alguns sais inorgânicos do meio de cultura tem
sido uma alternativa para minimizar o custo de produção (Chee & Pool 1987; Ribeiro e
Teixeira, 2008). Fertilizantes químicos com composição similar a dos constituintes P.A são
facilmente encontrados no comércio e podem ser usados, desde que sejam adotadas técnicas
eficientes de esterilização para evitar a contaminação do meio e não causem efeito tóxico no
material inoculado (Ribeiro et al., 2015). Nessa perspectiva, Ribeiro e Teixeira (2008)
avaliaram a substituição de KNO3 por salitre potássico no meio de cultura e verificaram o
aumento da biomassa de ginseng (Pfaffia glomerata).
Em relação aos constituintes de KNO3 nas células, o nitrogênio faz parte das
proteínas e ácidos nucléicos, é um elemento essencial responsável por processos metabólicos
e bioquímicos, atuando em sinergia com as moléculas de carbono, estimulando o crescimento
40
do explante no meio de cultura (Ncube et al., 2014). O potássio não apresenta funções
estruturais orgânicas, mas age na osmorregulação e manutenção do equilíbrio eletroquímico,
controlando as atividades enzimáticas, dessa forma, influenciando diretamente no crescimento
das plantas (Marschner, 1995).
Portanto, tendo em vista a importância nutricional do nitrato de potássio no
desenvolvimento in vitro de plantas, avaliou-se a substituição do KNO3 (P.A.) por fertilizante
comercial de composição química similar, visando redução de custos e processos burocráticos
na micropropagação de gérbera.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi desenvolvido na Universidade do Estado da Bahia (UNEB),
Campus III, no Laboratório de Biotecnologia (9° 24’ S de latitude, 40° 30’ W de longitude e
368 m de altitude), realizado em duas etapas, sendo a primeira referente ao desenvolvimento
das plantas de gérbera híbrida in vitro na fase de enraizamento e a segunda, a aclimatização e
pós-aclimatização das mudas obtidas.
Material vegetal e meio de cultura
O material vegetal utilizado como fonte de explantes originou-se de cultura estoque
do hibrido experimental de gérbera DTCS, mantidos em meio de proliferação composto por
sais inorgânicos de MS (Murashige e Skoog, 1962), vitaminas de White (1943), 2 ml L-1
de
BAP (6-Benzilaminopurina), 30 g L-1
de sacarose, 7 g L-1
de ágar e 100 mg L-1
de i-inositol
distribuído em frascos de vidro de 25 x 150 mm. O pH foi de 5,7 ± 1 e o meio esterilizado por
autoclavagem (121 °C e 1 kg cm2,
durante 20 minutos). A cultura foi mantida em sala de
crescimento com fotoperíodo de 16 horas e irradiância de 50-60 µmol m-2
s-1
e temperatura de
27 ± 2 °C).
Determinação dos tratamentos e desenvolvimento in vitro
Utilizou-se o fertilizante nitrato de potássio marca Dripsol®
NKS em substituição ao
reagente nitrato de potássio puro para análise (KNO3 P.A) no meio de cultura de
micropropagação de gérbera. O experimento foi realizado na fase de enraizamento e
composto de sete tratamentos. O controle foi constituído dos sais de MS que contém 1,9 g L-1
de KNO3 P.A, e nos demais tratamentos o nitrato de potássio do meio MS foi substituído pelo
41
fertilizante nas concentrações (g L-1
): 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5. O meio nutritivo foi acrescido
das vitaminas de White, 100 mg L-1
de i-inositol, 30 g L-1
de sacarose e 7 g L-1
de ágar. O pH
do meio foi ajustado para 5,7 ± 1, e o meio foi autoclavado por 121 °C durante 20 minutos.
As brotações axilares, padronizadas com três folhas foram introduzidas no meio de cultura e
mantidas em sala de crescimento com temperatura de 26 + 1 °C, fotoperíodo de 16 h e
irradiância de 19 mol m-2
s-1
.
Desenvolvimento ex vitro
Após 35 dias no meio de enraizamento, as plantas foram transplantadas para
recipientes descartáveis de 200 mL, preenchidos com substrato comercial Tropstrat® (Figuras
1a) e cobertos com copos transparentes por sete dias para a manutenção da umidade (Figura 1
b). As plantas foram mantidas em casa de vegetação com 75% de sombreamento e sistema de
nebulização ligado por 3 minutos no intervalo de 15 minutos( Figura 1c e 1d).
Visando a observação de possíveis alterações morfológicas da planta adulta, como
diferenças na formação da área foliar, dez amostras de cada tratamento foram retiradas para
plantio em vasos de 5 L preenchidos com substrato comercial submetidas à fertirrigação
(Figura 1f), conforme as necessidades nutricionais da fase fisiológica da cultura de acordo
com a metodologia de Santos et al. (2016). As demais plantas foram utilizadas para avaliação
da concentração de macronutrientes nas folhas segundo a metodologia descrita por Silva
(2009).
Figura1. Estabelecimento ex vitro da gérbera, oriundas do cultivo in vitro com meio
confeccionado com diferentes concentrações de fertilizante comercial e reagente PA; a-
Transplantio das plantas; b- Manutenção da umidade; c- Adaptação das plantas; d- Plantas após
sete dias em condições de sombreamento e nebulização; e- Mudas de gérbera após 35 dias do
transplantio; f-Plantas em vaso para observações morfológicas (Foto: Ferreira, C. C. S, 2018).
a b c
d e f
42
Coleta de dados e análise estatística
A resposta das plantas às diferentes concentrações e fontes de KNO3, após a fase de
enraizamento in vitro, foi avaliada em relação ao número médio de folhas, comprimento
médio da parte aérea, comprimento médio das raízes e biomassa fresca. No estabelecimento
ex vitro, foram avaliados número de folhas, comprimento médio da parte aérea e das raízes,
número médio de raízes, biomassa fresca, absorção de macronutrientes e observação visual de
alterações morfológicas.
No desenvolvimento in vitro e ex vitro, o experimento foi conduzido no
delineamento inteiramente casualizado com cinco repetições e cinco parcelas, constituídas por
uma planta por recipiente, totalizando vinte e cinco amostras experimentais por tratamento.
Os resultados foram submetidos à análise de variância e quando significativos (p ≥ 0,05), as
médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância, utilizando-se o software
Statistica v.8.0. O experimento foi repetido nas mesmas condições, para confirmação dos
resultados.
RESULTADOS
Crescimento e desenvolvimento in vitro
As concentrações do KNO3, do produto comercial influenciaram o crescimento in
vitro das brotações axilares de gérbera com diferenças significativas nas variáveis:
comprimento médio de raiz, comprimento médio da parte aérea, número de folhas e massa
média da biomassa fresca. De acordo com a análise de variância, foi observado efeito
significativo dos tratamentos a 1 % e 5 % de significância (Tabela 1).
Tabela 1. Resumo da análise da variância dos explante de gérbera híbrida inoculadas em meio e
cultura na fase de enraizamento, com diferentes concentrações de nitrato de potássio.
GL- Grau de Liberdade; QM - quadrado médio; ** e * significativo a 1% e 5% de significância,
respectivamente, pelo teste F; CMR - comprimento médio da raiz (cm); CMPA-comprimento médio da parte
aérea (cm); NMF– número médio de folhas; MMBF-massa média da biomassa fresca(g).
GL QM F
Fontes de CMR CMPA NMF VMBF CMR CMPA NMF PMBF
Variação
Tratamento 6 4,15 0,68 2,42 0,1 7,68** 4,19** 2,95* 10,74**
Resíduo 28 0,54 0,16 0,81 0,009
MMBF
43
Em relação ao comprimento médio das raízes (CMR), as plantas que se
desenvolveram em meio contendo fertilizante nas concentrações de 0 a 2 g L-1
não diferiram
significativamente daquelas mantidas no meio com o KNO3 (P.A), o tratamento controle
(Tabela 2). Entretanto, houve redução nesta variável com a concentração de 2,5 g L-1
do
fertilizante. Por outro lado, o comprimento médio da parte aérea (CMPA) e o número médio
de folhas (NMF) das plantas crescidas no meio com o fertilizante, em todas as concentrações
testadas, não diferiram significativamente do tratamento controle.
Tabela 2- Aspectos do desenvolvimento in vitro de explantes de gérbera hibrida F1 vermelha
após 35 dias em diferentes fontes e concentração de KNO3.
Concentração KNO3 g L-1
CMR (cm) CMPA (cm) NMF MMBF(g)
1,9 (Controle) 4,68 a 3,16 ab 6,84 ab 0,46 ab
0,0 4,72 a 2,80 ab 6,40 b 0,38 bc
0,5 5,15 a 3,50 a 8,36 a 0,65 a
1,0 5,80 a 2,96 ab 7,40 ab 0,39 bc
1,5 5,56 a 2,72 ab 7,76 ab 0,24 c
2,0 4,68 a 2,53 b 6,92 ab 0,24 c
2,5 2,99 b 2,43 b 6,60 ab 0,29 c
CV 15,34 14,08 12,60 26,26
DMS 5% 1,48 0,81 1,82 0,198 Os dados acompanhados por uma mesma letra são estatisticamente iguais segundo o Teste de Tukey, com 5% de
significância; CMR - comprimento médio da raiz (cm); CMPA-comprimento médio da parte aérea (cm); NMF –
número médio de folhas; MMBF - massa média da biomassa fresca; CV-coeficiente de variação; DMS-
Diferença Mínima Significativa. Os valores são médios de 25 repetições com um explantes por tratamento. Os
dados foram obtidos 35 dias após a inoculação em meio de cultura.
A massa média da biomassa fresca (MMBF) nas plantas cultivadas no meio contendo
de 0 a 1,0 g L-1
do fertilizante, não diferiu significativamente daquelas obtidas no meio
contendo reagente P.A. Entretanto, entre as diferentes concentrações do fertilizante (0 a 2,5 g
L-1
) observou-se maior massa da biomassa fresca com a utilização de 0,5 g L-1
.
Na Figura 2 são apresentadas plantas de cada um dos tratamentos, evidenciando não
terem ocorrido alterações morfológicas visuais ou clorose decorrentes da utilização do
fertilizante comercial em substituição ao KNO3 (P.A.).
44
Crescimento e desenvolvimento ex vitro
Após a aclimatização, apenas as variáveis comprimento médio da parte aérea (CMPA)
e a área foliar (AF) não apresentaram diferenças significativas (Tabela 3). As plantas
cultivadas in vitro em diferentes concentrações do fertilizante KNO3 se adaptaram bem ao
ambiente e visualmente apresentaram desenvolvimento semelhante nos diferentes tratamentos
avaliados (Figura 3)
1,0 0,5 0,0 1,5
Figura. 2. Representação visual do desenvolvimento
de plantas de gérbera cultivadas em diferentes
concentrações de KNO3, 1,9 gL-1
proveniente do
reagente P.A. e 0,0 á 2,5 gL-1
oriundo do fertilizante
comercial.
após o enraizamento in vitro. (Foto: Ferreira, C. C.
S, 2018).
0,5 gL-1
0,0 gL-1
1,9 gL-1
1,0 gL-1
1,5 gL-1
2,0 gL-1
2,5 gL-1
45
Tabela 3- Análise da variância das variáveis avaliadas nas plantas nos tratamentos ex vitro.
GL – grau de liberdade; QM - quadrado médio; ** e * significativo a 1% e 5% de significância, respectivamente, pelo teste F; NS – não sifnificativo; CMR - comprimento
médio da raiz (cm); NMR- número de raízes; CMPA-comprimento médio da parte aérea (cm); NMF – número médio de folhas; AF- área foliar; MMBF- massa média da
biomassa fresca (g).
GL QM
F
Fontes de
Variação CMR NMR CMPA NMF AF PMBF CMR NMR CMPA NMF AF MMBF
Tratamento 6 4,76 1,29 2,88 5,08 2,23 1,01 8,00** 3,69** 2,41 NS 8,66** 1,99 NS 3,77**
Resíduo 28 0,59 1,19 0,58 1,12 0,26
Figura 3. Aspectos morfológicos da gérbera
híbrida DTCS após 35 dias de aclimatização
em condições controladas de sombreamento e
irrigação (Foto: Ferreira, C. C. S, 2018).
46
Em relação ao comprimento médio das raízes (CMR), as plantas obtidas nas
concentrações de 0,5; 2,0 e 2,5 g L-1
do fertilizante tiveram valores menores que o observado
no tratamento controle. O número médio de raízes (NMR) e a biomassa fresca diferiram
significativamente entre plantas obtidas nas diferentes concentrações do fertilizante, mas, não
em relação as do controle. As plantas que se desenvolveram em meio sem KNO3 tiveram
número médio de folhas (NMF) menor que as dos demais tratamentos (Tabela 4).
Tabela 4 – Efeito dos diferentes tratamentos sobre as variáveis avaliadas após a aclimatização
das plantas.
Os dados acompanhados por uma mesma letra são estatisticamente iguais segundo o Teste de Tukey, com 5%
de significância; CMR - comprimento médio da raiz (cm); NMR- número de raízes; CMPA-comprimento
médio da parte aérea (cm); NMF – número médio de folhas; AF- área foliar; MMBF – massa média da
biomassa fresca; CV-coeficiente de variação; DMS- Diferença Mínima Significativa.
O acúmulo de macronutrientes nas folhas das plantas nos diferentes tratamentos
testados apresentou a marcha de absorção da gérbera, em sequência decrescente: K> N> Ca>
Mg> P (Tabela 5). Esses foram dados coletados durante o seu crescimento vegetativo, 35 dias
pós-aclimatização. As quantidades de cálcio, fósforo e magnésio absorvidos pelas folhas de
gérbera híbrida não foram influenciadas pela ausência, escassez e/ou excesso de KNO3 no
meio de cultura.
KNO3 g L-1
CMR (cm) NMR (cm) CMPA (cm) NMF AF (cm2)
MMBF (g)
1,9 (Controle) 10,19 a 5,84 ab 7,89a 7,40 a 5,42a 2,68 ab
0,0 9,38 ab 5,32ab 7,48 a 5,36 b 5,21 a 2,54 ab
0,5 8,18 b 6,48 a 8,07 a 8,40 a 5,00 a 2,77 a
1,0 9,30 ab 6,04 ab 8,50 a 7,68 a 5,50 a 2,97 a
1,5 10,53 a 5,72 ab 6,84 a 7,56 a 4,64 a 2,18 ab
2,0 8,49 b 5,12 b 6,73 a 8,28 a 3,95 a 2,02 ab
2,5 8,00 b 5,12 b 6,50 a 7,16 a 3,87 a 1,72 b
CV 8,43 10,45 14,69 10,34 22,07 21,45
DMS 5% 1,54 1,18 2,19 1,53 2,12 1,03
47
Tabela 5. Absorção nutricional pelas folhas de gérbera hibrida, crescidas em meio de
cultura, constituído de KNO3 (P.A) e fertilizante químico com mesma composição, após 35
dias de aclimatização.
Após o transplantio para vasos não se observou diferenças morfológicas nas plantas. Em
todos os tratamentos, o crescimento ocorreu de forma similar, a partir do 60 dias, os primeiros
botões florais foram imitidos (as plantas inoculadas em meio de cultura suplementado com 0,5
gL -1
de KNO3) (figura 4).A flor apresentou-se completamente aberta sete dias após a emissão do
botão, sem alterações na sua formação.
Figura 4 – Desenvolvimento fisiológico na fase reprodutiva da gérbera híbrida proveniente
do meio de cultura confeccionado com KNO3 oriundo do fertilizante comercial na menor
proporção testada 0,5 g L-1
(Foto Ferreira, C. C. S 2018).
Concentração
KNO3 g L-1
Acúmulo de macronutrientes nas folhas (g Kg-1
)
Ca+2
Mg+2
K+
P
N(total) NH+4
NO-3
1,9 (Controle) 1,50 0,25 11,10 0,03 5,40 0,62 4,78
0,0 1,90 0,40 4,80 0,02 5,38 0,99 4,39
0,5 1,65 0,20 5,35 0,03 3,83 0,84 2,99
1,0 1,85 0,35 7,00 0,04 3,97 0,70 3,27
1,5 2,00 0,30 11,90 0,04 3,97 0,93 3,03
2,0 2,60 0,30 10,80 0,04 3,73 0,70 3,03
2,5 2,30 0,25 7,80 0,04 2,80 0,70 2,10
48
DISCUSSÃO
Efeitos da substituição e redução do KNO3 no desenvolvimento in vitro e ex vitro
A nutrição mineral e orgânica é fundamental no estabelecimento in vitro das plantas,
cada espécie possui necessidades nutricionais específicas, todavia, ainda são escassos estudos
relacionados à contribuição de cada macro e micronutriente atuando neste processo. A
maioria dos estudos em relação ao efeito fisiológico e nutricional está direcionada a plantas
desenvolvidas em condições de campo (Poothong e Reed, 2014).
Nos resultados observados neste trabalho, as concentrações de KNO3 e, mesmo a sua
ausência no meio de cultura MS, tiveram pouca influência no desenvolvimento in vitro da
gérbera, na fase de enraizamento. Embora o aumento da concentração de KNO3 no meio de
cultura reduziu comprimento médio da raiz e a biomassa fresca. Vale ressaltar que o meio
possui em sua formulação outra fonte de N e K; o nitrato de amônio (NH3NH4).
Provavelmente a gérbera nesta fase de desenvolvimento apresente baixa demanda desses
macronutrientes, mantendo o seu crescimento nessas condições. Outra hipótese é que os
explantes utilizados, provenientes de sucessivas multiplicações, foram inoculados com sua
parte estrutural bem desenvolvida.
De forma semelhante, Greenway et al. (2012) em experimento com diferentes meios
de cultura na micropagação de várias espécies, nos quais a concentração de KNO3 variava de
1,9 a 2,5 g L-1
, relataram que na gérbera, os meios: MS (1,9 g L-1
KNO3), B5 (2,5 g L-1
KNO3), BDS e BABI (2,5 g L-1
KNO3) não proporcionaram diferenças significativas no
desenvolvimento das plantas.
Assim como a gébera, outras culturas micropropagadas em meio MS, caracterizado
por sua elevada concentração de sais inorgânicos, principalmente das fontes nitrogenadas,
reduções nas concentrações de nitrato favoreceram o desenvolvimento dos explantes ,
corroborando com os resultados obtidos pela gérbera , nas condilçoes desse trabalho. A
redução dos compostos nitrogenados do meio MS promoveu o melhor crescimento in vitro de
orquídeas (Cattleya loddigesii) (Rodrigues et al., 2011). Sasamori et al, (2016) obtiveram
resultados semelhantes testando diferentes concentrações de sais (25%, 50% e 100%) e
compostos nitrogenados (25%, 50% e 100%) no desenvolvimento in vitro e ex vitro de
bromélias (Vriesea incurvata). No cultivo in vitro de Coffea arabica L. cv Rubi, Sousa et al.,
(2002), a redução da concentração de nitrato de amônio e nitrato de potássio (NH4NO3 em
50% e KNO3 75%, respectivamente), foi suficiente para o crescimento do explante. Dessa
49
forma o ajuste das concentrações de sais do meio MS além de aperfeiçoar a qualidade das
mudas produzidas, permite reduzir custos com a propagação in vitro (Sousa et al., 2006).
Kanwar e Kumar (2008) ressaltam que o suprimento nutricional é fundamental no
desenvolvimento in vitro da gérbera. Devido à estrutura sensível dos seus tecidos, a planta se
torna vulnerável ao estresse hídrico durante a aclimatização reduzindo a sobrevivência das
mudas. Assim, qualquer alteração realizada durante o enraizamento in vitro, deve ser avaliada
em condições ex vitro. A substituição e redução do KNO3 não interferiram no estabelecimento
ex vitro da gérbera, mantendo 100% de sobrevivência das mudas aclimatizadas. Cardoso et al.
(2013b) obtiveram a mesma resposta na aclimatização de gérbera, sem adição de sacarose no
meio de cultura na fase de enraizamento.
A necessidade mineral esta associada à fase de desenvolvimento (vegetativo e
reprodutivo) da planta, mas é necessário armazenar esses nutrientes inorgânicos, nitrogênio,
potássio, fósforo e outros elementos essenciais, nos vacúolos das células vegetais, para
atender a demanda requerida durante o seu crescimento. A marcha de absorção de nutrientes
nas folhas da gérbera em diferentes concentrações de KNO3 do presente trabalho ocorreu na
mesma ordem decrescente (K> N> Ca> Mg> P> S) descrita por outros autores ( Guerrero et
al., 2012; Ludwing et al., 2013 ; Ludwing, 2018).
O conhecimento do comportamento da absorção é importante para evitar problemas
relacionados à salinidade ou deficiência nutricional, promovendo o fornecimento satisfatório
de nutrientes (Malavolta et al., 1997). Na cultura da gérbera, K e N, são nutrientes mais
requeridos e mais aplicados e são absorvidos em maior quantidade na fase de crescimento
vegetativo, onde a planta forma sua massa foliar e suas reservas. Independente da
concentração de macronutrientes absorvidos, os explantes de gérbera se desenvolveram em
meio de cultura, mantendo o desenvolvimento normal durante a aclimatização e seu
estabelecimento em vaso.
Viabilidade da substituição do reagente KNO3 P.A.
No meio MS a concentração de KNO3 é de 1,9 g L-1
, contudo nas condições deste
experimento, as concentrações de 0,5 a 1,5 g L-1
do fertilizante, adicionadas ao meio de cultura,
proporcionaram bom desenvolvimento das plantas in vitro, sendo esse comportamento também
observado no crescimento ex vitro. Dessa forma, visando à redução de custos na
micropropagação, é recomendável a utilização da menor quantidade do fertilizante para suprir as
necessidades nutricionais da cultura da gérbera in vitro sem alterar o comportamento fisiológico
50
em condições de aclimatização e pós-aclimatização. A utilização de baixas concentrações, não
interfere na absorção dos reguladores de processos metabólicos, como nitrogênio, fósforo,
potássio, cálcio e magnésio (Marschener, 1995; Taiz e Zeiger, 2004).
A aquisição do nitrato de potássio (KNO3) P.A no Brasil depende da autorização
do Exército (Portaria No
42 - Colog, de 28 de março de 2018. EB: 64474.002159/2018-11,
Art.68º) e sua composição (13% de N e 44% de K2O) se assemelha ao fertilizante comercial
Dripsol® NKS, exceto pela presença de enxofre (S) (12% de N, 45% de K2O e 1,2% de S).
Portanto, esse fertilizante é uma alternativa viável para o fornecimento de potássio e nitrogênio,
em substituição ao reagente P.A..
CONCLUSÕES
A concentração de 0,5 g L-1
do fertilizante proporcionou desenvolvimento in vitro
similar ao KNO3 (P.A.);
A substituição do KNO3 (P.A.) pelo fertilizante comercial NKS constitui-se em
alternativa para a redução de 99,09% do custo de aquisição do regente.
AGRADECIMENTOS
A Capes pela bolsa de mestrado, à UNEB/DTCS Campus III e à EMBRAPA
Semiárido pelo apoio no desenvolvimento e condução do experimento.
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55
CAPITULO II
FORMATO: CIÊNC. AGROTEC. LAVRAS
DESENVOLVIMENTO DA PALMA IN VITRO EM RESPOSTA À SUBSTITUIÇÃO
DE NITRATO DE POTÁSSIO (P.A.) POR FERTILIZANTE COMERCIAL KNO3
56
RESUMO
Na micropropagação, o nitrato de potássio (KNO3), reagente puro para análise (P.A.), utilizado
no preparo dos meios de cultura, possui custo elevado e a sua aquisição depende de trâmites
burocráticos, por se tratar de substância controlada pelo Exército Brasileiro. O objetivo deste
trabalho foi avaliar o efeito da substituição do KNO3 P.A. por fertilizante comercial (com fonte
de KNO3), encontrado livremente no comércio, na micropropagação de palma (Opuntia stricta
Haw.) cv. Orelha de Elefante. Os tratamentos foram de seis concentrações do fertilizante (0; 0,5;
1; 1,5; 2 e 2,5 g L-1
) e um controle constituído de 1,9 g L-1
de reagente KNO3, conforme
mostrado nos sais MS. Avaliou-se a sobrevivência, tamanho e número de brotações do explante,
e o valor da biomassa fresca. Após a aclimatização das mudas avaliou-se a sobrevivência,
número de brotações, comprimento da parte aérea, número de raízes, formação da raquete, massa
média da biomassa fresca, absorção de macronutrientes e alterações morfológicas das mudas. Os
explantes inoculados em meio com fertilizantes nas concentrações de 0,0; 2,0 e 2,5 g L-¹ não se
desenvolveram. A resposta dos explantes nas concentrações de 0,5 e 1,5 g L-1
do fertilizante
foram iguais aos desenvolvidos em meio contendo KNO3, e na concentração de 1,0 g L-1
, em
todas as variáveis, as médias foram superiores que as do controle. Dessa forma, constatou-se a
viabilidade do uso do fertilizante no cultivo in vitro da palma, o que propiciou a eliminação dos
entraves burocráticos e redução no custo de 99,12% na compra do produto.
Termos para indexação: macronutrientes; micropropagação; redução de custos.
57
ABSTRACT
In micropropagation, potassium nitrate (KNO 3), an ACS reagent grade chemical, used in the
preparation of growing mediums is expensive and its procurement depends on bureaucratic
procedures, as it is controlled by the Brazilian Army. The goal of this work was to assess the
effect of replacing the ACS KNO3 for a commercially available fertilizer (KNO3- based) on
themicropropagation of the prickly pear (Opuntia stricta Haw.). Treatments used six different
fertilizer concentrations (0, 0.5, 1, 1.5, 2 and 2.5 g L -1
) and a control consisting of 1.9 g L -1
KNO3, as shown in the MS salts. The survival, size and number of sprouts and the value of
fresh biomass were evaluated. After seedling acclimation, we assessed the survival, number
of sprouts, length, and number of roots, racket formation, average fresh biomass mass,
macronutrient absorption and morphological changes of the seedlings. Explants inoculated
with fertilizers at concentrations of 0.0; 2.0 and 2.5 g L -
¹ did not grow. The response of
explants at concentrations of 0.5 and 1.5 g L -1 of the fertilizer were the same as those
developed in a KNO3 medium, and at a concentration of 1.0 g L -1
, in all variables, the means
were higher than those of the control medium. Therefore, it showed the feasibility of using
fertilizers in the in vitro cultivation of the prickly pear, which may remove bureaucratic
barriers and reduce product costs by 99.12%.
Index Terms: macronutrients; micropropagation; cost savings.
58
INTRODUÇÃO
O cultivo de cactáceas tem se tornado crescente devido ao seu elevado potencial
forrageiro e às características ornamentais que essas plantas possuem, como formas e
tamanhos variados. A palma (Opuntia stricta Haw.) cv. Orelha de Elefante Mexicana se
destaca entre as espécies, devido a sua elevada produtividade, baixa exigência nutricional,
tolerância à seca e resistência à cochonilha-do-carmim (Dactylopius opuntiae Cockerel),
principal causadora de danos às cactáceas (Vasconcelos et al. 2009; Lopes et al. 2010; Silva et
al. 2015). A sua utilização é mais expressiva nas regiões áridas e semiáridas (Zingale, 2016),
onde a palma forrageira representa um recurso importante na nutrição animal. Todavia, os
métodos convencionais de propagação são insuficientes em suprir a demanda comercial por
mudas nestas regiões. (Bhau, 1999; Bhau, 2015). Assim, a micropropagação surge como
alternativa na obtenção de propágulos resistentes a pragas em larga escala.
O cultivo in vitro potencializa a propagação clonal e acelera o processo de
melhoramento genético das espécies vegetais, agregando valor às culturas (Gava e Lopes,
2012). Entretanto, a micropropagação tem custo elevado devido ao material utilizado no
preparo dos meios de cultura e a necessidade de equipamentos e instalações apropriadas para
realização da técnica (Cardoso et al. 2013; Weber et al. 2015). No sentido de minimizar os
custos, pesquisas vêm sendo realizadas com protocolos de esterilização alternativos como a
esterilização química (Cardoso e Silva, 2012; Deein et al. 2013; Pais et al. 2016), a retirada ou
redução dos sais inorgânicos (Chee e Pool, 1987; Ribeiro e Teixeira, 2008), e a substituição
de reagentes de difícil aquisição por outros mais acessíveis, encontrados no livre comércio.
Entre os reagentes que compõem os meios de cultura, o nitrato de potássio (KNO3),
macronutriente com elevado grau de pureza para análise (P.A.), é utilizado em maior
proporção e, além do preço elevado, sua venda é controlada pelo Exército. Este reagente é
fundamental no processo de indução e diferenciação da parte aérea da planta exercendo
função estrutural e de ativação enzimática, atuando como osmorregulador (Malavolta et al.
1997; Taiz e Zeiger, 2013). A substituição do KNO3 P.A. por produtos de fácil aquisição e
menor custo tende a ser uma alternativa promissora para viabilizar a produção de mudas
micropropagadas, desde que seja avaliado seu efeito tóxico no explante (Ribeiro et al. 2015).
Visando à redução dos custos na aquisição de componentes do meio de cultura e
eliminação dos trâmites burocráticos para liberação de compra de reagentes, este trabalho teve
59
como objetivo avaliar a substituição do KNO3 P.A. por fertilizante comercial e o seu efeito no
desenvolvimento in vitro e ex vitro da palma cv. Orelha de Elefante Mexicana.
MATERIAL E MÉTODOS
O material vegetal da palma utilizado como doador de explantes foi proveniente de
cultura estoque do laboratório de Biotecnologia da Embrapa Semiárido, Petrolina, PE. O
desenvolvimento in vitro foi avaliado em diferentes concentrações do fertilizante granular
KNO3, marca Dripsol, no meio de cultura, em substituição ao reagente P.A..
Utilizou-se as concentrações 0,0; 0,5, 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 g L-1
do fertilizante e o
controle com reagente KNO3 P.A. (1,9 g L-1
), constituindo sete tratamentos. As diferentes
concentrações avaliadas nos tratamentos foram estimadas a partir de cálculos da formulação
química em proporção ao reagente P.A..
O meio nutritivo foi constituído dos sais inorgânicos de MS (Murashige e Skoog,
1962), e de vitaminas de White (White, 1943). O meio foi complementado com 0,1 g de
inositol, 30 g L-1
de sacarose, 1,5 mg L-1
de 6 benzilaminopurina (BAP), 0,0625 mg L-1
de
ácido naftaleno acético (ANA) e 5 g L-1
de ágar como agente geleificante. O pH foi ajustado
para 5,9 ± 1 e o meio esterilizado por autoclavagem (121 ºC, 1,05 kg cm², por 20 minutos).
Após o preparo, 20 mL do meio de cultura foi distribuídos em recipientes de vidro (50 mm x
200 mm).
Segmentos transversais de aproximadamente três milímetros foram colocados no
meio de cultura e mantidos na sala de crescimento no Laboratório de Biotecnologia da
Universidade do Estado da Bahia (09º 25’ 43.6” S, 40º 32’ 14” W, 384 m), com temperatura
de 27 + 1 0C, fotoperíodo de 16 horas e irradiância de 19 mol m
-2 s
-1.
O desenvolvimento in vitro foi avaliado pela contagem do número médio de
brotações, número médio de brotações maiores ou iguais a dois centímetros e da determinação
do valor médio da biomassa fresca. Na aclimatização, as plantas desenvolvidas in vitro foram
transplantadas para copos descartáveis (200 mL) preenchidos com substrato comercial,
identificados conforme os tratamentos, e mantidas em casa de vegetação com 75% de
sombreamento. A irrigação manual ocorreu a cada quatro dias. No 35º dia as plantas foram
avaliadas com relação ao número médio de brotações, comprimento médio de raiz e parte
aérea, formação de cladódio (raquete), valor médio da biomassa fresca. Na quantificação da
absorção de macronutrientes realizada de acordo com a metodologia de Silva et al. (2009),
tornou-se uma amostra composta em cada tratamento. As mudas foram acondicionadas em
60
vasos plásticos de cinco litros, preenchidos com substrato comercial para observação das
características morfológicas da planta adulta, e supostas alterações em decorrência das
diferentes dosagens de nitrato de potássio aplicadas.
O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado com sete
tratamentos, cinco repetições e três parcelas experimentais. Os dados de contagem foram
transformados em √x + 0,5 de forma a atender os pressupostos estatísticos, submetidos à
análise de variância, e quando significativos (P<0,05) as médias foram comparadas pelo teste
de Tukey a 5% de significância, utilizando-se o software Statistica v.8.0.
RESULTADOS
Os explantes de palma cv. Orelha de Elefante em meio contendo fertilizante nas
concentrações 0,0; 2,0; e 2,5 g L-1
não sobreviveram. Portanto as avaliações foram realizadas
nas palmas obtidas nos tratamento 0,5; 1,0 e 1,5 g L-1
do fertilizante comercial e comparada
aos explantes desenvolvidos em meio contendo reagente P.A (1,9 g L-1
), tratamento controle.
De acordo com a análise de variância, foi observado efeito significativo dos
tratamentos nas variáveis analisadas in vitro (Quadro 1).
Quadro 1 – Análise de variância das plantas de palma cv. Orelha de Elefante desenvolvidas
em meio de cultura com diferentes concentrações de KNO3.
GL- grau de liberdade; QM - quadrado médio; ** significativo a 1%; * significativo a 5%; NMB- número médio
de brotações (cm); NMB ≥ 2 cm – número médio de brotações maiores ou iguais que dois cm; VMBF –valor
médio da biomassa fresca .
Os tratamentos com meio de cultura contendo 0,5 e 1,0 g L-1
do fertilizante comercial
tiveram maior produção de brotações e de brotações ≥ 2 cm que o controle (KNO3; P.A). Em
relação ao valor médio da biomassa fresca, o tratamento controle 1,0 g L-1
proporcionou o
maior valor, e os demais tratamentos não diferiram do controle (Tabela 1).
Causas de Variação GL QM F
Tratamentos 3 NMB NMB>2cm PMBF NMB NMB≥2cm VMBF
Resíduo 24 2,93 2,6 7,8 12,46** 18,34** 10,62**
61
Tabela 1 – Características avaliadas no desenvolvimento in vitro de palma cv. Orelha de
Elefante.
Médias acompanhadas por uma mesma letra não difere estatisticamente entre si segundo o Teste de Tukey a 5%
de probabilidade; MS- Meio de cultura (Murashige e Skoog); NMB- número médio de brotos (cm); NMB ≥ 2
cm, número médio de brotações maiores ou iguais a dois cm; VMBF – valor médio da biomassa fresca. CV –
coeficiente de variação.
De modo geral, as doses do fertilizante utilizadas no preparo do meio de cultura
promoveram respostas dos explantes de palma igual ou superior aos desenvolvidos em meio
contendo reagente P.A. Contudo, vale salientar que a utilização da concentração de 1,0 g L-1
de fertilizante, resultou em maiores valores de todas as variáveis avaliadas.
Na figura 1, observa-se o desenvolvimento de palma cv. Orelha de Elefante após 180
dias de cultivo in vitro em meio de cultura com doses distintas de nitrato de potássio, sendo
tratamento controle, constituído de 1,9 g L-1
de KNO3 P.A. , e doses de 0,5, 1,0 e 1,5 de
fertilizante comercial.
Figura1. Palma c.v. Orelha de Elefante após 180 dias desenvolvidas no meio de cultura com
duas fontes de nitrato de potássio, 1a - tratamento controle, constituído de 1,9 g L-1
de KNO3
P.A , 1b, 1c, e 1D - 0,5, 1,0 e 1,5 g L-1
de fertilizante comercial respectivamente (Foto:
Ferreira, C. C. S, 2018).
Concentração de
KNO3 g L-1
Culturas sobreviventes % NMB NMB ≥ 2 VMBF
1,9 (MS) 100 2,05b
1,33b 1,56b
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
0,5 100 3,06a 2,31a 1,81b
1,0 100 3,04a 2,49a 3,91a
1,5 100 1,83b 1,37b 2,56b
2,0 0,0 0,0 0,0 0,0
2,5 0,0 0,0 0,0 0,0
CV 19,43 20,05 34,81
1a
a
1d
a
1c
a
1b
a
62
Decorridos 35 dias após a aclimatização, a análise de variância mostrou efeito
significativo apenas nas variáveis NMB – número médio de brotações (cm) e VMBF- valor
médio da biomassa fresca (Quadro 2).
Quadro 2 – ANOVA, variáveis avaliadas no estabelecimento ex vitro da palma orelha de
elefante desenvolvidas em meio de cultura com diferentes concentrações de KNO3
GL- grau de liberdade; QM - quadrado médio; ** significativo a 1%; * significativo a 5%; NS- não significativo;
NMB- número médio de brotações (cm); CMPA- comprimento médio da parte aérea; FMR – formação média
da raquete/cladódio; CMR – comprimento médio da Raiz; VMBF – valor médio da biomassa fresca.
As plantas apresentaram as mesmas respostas nas diferentes concentrações de
fertilizante KNO3 em relação ao comprimento médio da parte aérea, comprimento médio das
raízes (CMR) e formação média da raquete/ cladódio (FMR). Quanto ao número médio de
brotações (NMB) e valor médio da biomassa fresca (VMBF), as concentrações de 0,5 e 1,0 g
L-1
promoveram maiores valores quando comparados com aqueles obtidos nos meios de 1,9
(tratamento controle) e 1,0 g L-1
(Tabela 2).
Tabela 2 – Características analisadas no desenvolvimento ex vitro de palma cv Orelha de Elefante.
Médias acompanhadas por uma mesma letra não difere estatisticamente entre si segundo o Teste de Tukey a 5% de
probabilidade; NMB- número médio de brotações (cm); CMPA- comprimento médio da parte aérea FMR – formação
média da raquete/cladódio; CMR – comprimento médio da Raiz; VMBF – valor médio da biomassa fresca. CV –
coeficiente de variação.
Causas de
Variação GL QM F
Tratamentos 3 NMB CMPA FMR CMR VMBF NMB CMPA FMR CMR VMBF
Resíduo 24 1,14 9,82 0,26 4 277,82 7,24** 1,39 NS
0,80 NS
1,47 NS
15,60**
KNO3 Culturas sobreviventes NMB CMPA FMR CMR VMBF
gL-1
% Cm Cm Cm G
1,9 (MS) 100 1,84b 11,9a 2,43a 5,50a 15,96b
0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
0,5 100 2,62a 10,44a 2,19a 6,50a 28,34a
1,0 100 2,41a 9,34a 1,97a 4,68a 25,89a
1,5 100 1,82b 9,60a 2,30a 5,27a 16,75b
2,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
2,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
CV 18,28 25,75 25,85 30,08 19,41
63
Durante o período de aclimatização, as plantas se adaptaram ao ambiente e
apresentaram um desenvolvimento semelhante, embora as mudas tenham se originado de
micropropagação em meios de cultura com diferentes concentrações de KNO3. A palma
cresceu de forma uniforme e, no 20º dia, a formação da raquete se tornou expressiva nas
plantas dos diferentes tratamentos avaliados, não apresentando nenhuma anormalidade
morfológica durante seu estabelecimento em vaso (Figura 2).
Figura 2 – Mudas oriundas do cultivo in vitro no processo de aclimatização após 20 dias do
transplantio. 2a - T1=1,9 g L-1
de KNO3; T3. T4 e T5=0,5 1,0 e 1,5 g L-1
de fertilizante
respectivamente; 2b- Inicio da formação da raquete; 2.c – aspecto morfológico da palma
orelha de elefante após 35 dias em condições de aclimatização; 2.d – Aspectos das mudas em
condições de vaso, 60 dias pós-aclimatização. (Foto: Ferreira, C. C. S, 2018).
Por meio da análise foliar foi realizada a quantificação da absorção de
macronutrientes, em função das diferentes concentrações e fonte de KNO3 (Quadro 3). A
marcha de absorção nutricional nas condições do experimento foi na ordem crescente P<
Mg< Ca< N< K.
Quadro 3. Influência das diferentes fontes e concentrações de nitrato de potássio, na absorção
nutricional da palma cv. Orelha de Elefante micropropagadas in vitro.
Concentrações
KNO3
Ca+2
(g kg-1
)
Mg+2
(g kg-1
)
K+
(g kg-1
)
P
(g kg-1
)
NH+4
(g kg-1
)
NO-3
(g kg-1
) N total (g kg
-1)
1,9 (P.A) 1,43 0,24 9,10 0,004 0,46 4,72 5,18
0,5 Fertilizante 1,32 0,24 10,10 0,002 0,58 4,83 5,41
1,0 Fertilizante 1,15 0,19 11,02 0,002 0,55 2,97 3,52
1,5 Fertilizante 1,11 0,16 10,01 0,002 0,51 2,83 3,34
a c b d
64
DISCUSSÃO
O nitrogênio apresenta-se exclusivamente em forma de cátion e ânion (amônio e
nitrato, respectivamente) sendo fundamental na realização de atividades metabólicas das
plantas e na absorção de outros nutrientes do meio (Nagao et al. 1994; Rezende et al. 2008).
Também infuencia diretamente no desenvolvimento das plantas e quando em excesso ou na
ausência é altamente prejudicial. (Sakuta et al. 1987; Cazzeta et al. 1999; Sasamori et al.
2016). Dessa forma, a morte dos explantes de palma orelha de elefante, cultivados em meio
de cultura com 0 ; 2,0 e 2,5 g L-1
, pode ter sido causada pela ausência bem como o excesso de
nitrogênio na forma de nitrato, proveniente do fertilizante comercial utilizado.
Todavia, as concentrações de 0,5 a 1,0 g L-1
do fertilizante, adicionadas ao meio de
cultura, proporcionaram bom desenvolvimento das plantas de palma cv. Orelha de Elefante in
vitro devido a sua baixa exigência nutricional, corroborando com informações nutricionais
desta espécie avaliada por Lopes et al. (2010), sendo este comportamento também observado
no crescimento ex vitro. Dessa forma, visando à redução de custos na micropropagação, é
recomendável a utilização da menor quantidade do fertilizante, que supre as necessidades
nutricionais da cultura da palma orelha de elefante in vitro sem alterar o comportamento
fisiológico em condições de aclimatização e pós-aclimatização. A utilização de baixas
concentrações, não altera o processo de absorção dos macronutrientes como nitrogênio,
fósforo, potássio, cálcio, magnésio, sem interferência nos processos metabólicos, (Taiz e
Zeiger, 2013).
Considerando a elevada proporção do KNO3 no meio de cultura MS, o custo elevado
e a dificuldade de aquisição dos sais nitrogenados, alguns trabalhos estão sendo elaborados, a
fim de determinar métodos alternativos que viabilizem a técnica da micropropagação. Kurita
et al. (2014) e Sasamori et al. (2016), obtiveram o bom desenvolvimento de bromélias,
quando reduziram as quantidades de sais e compostos nitrogenados do meio MS, no cultivo in
vitro. Sousa et al. (2006) testaram a redução do nitrato de amônio e nitrato de potássio, na
micropropagação de café (Coffea arabica L. cv Rubi), e os melhores resultados foram obtidos
em explantes inoculados em meio com 50% de nitrato de amônio e 75% de nitrato de
potássio. Resultados semelhantes foram obtidos por Rezende et al. (2008), em café na mesma
cv. Rubi, cultivado in vitro, no qual o maior crescimento da parte aérea ocorreu com as
menores concentrações de nitrato de potássio e esse padrão de desenvolvimento se manteve
nas plantas quando aclimatizadas. A influência da redução da concentração do nitrato de
65
potássio do meio MS, no cultivo in vitro dessas culturas se assemelha com os resultados
obtidos na palma cv Orelha de Elefante. Nas condições testadas nesse trabalho, as menores
proporções 0,5 e 1,0 g L -1
de KNO3, correspondente a redução de 26,3 e 52,6%
respectivamente, promoveu o maior crescimento da planta tanto em condições in vitro como
ex vitro. Os resultados obtidos comprovam que a diminuição de nitrato de potássio
proporciona maior desenvolvimento da palma, confirmando que o ajuste das concentrações de
sais do meio MS melhora a qualidade das mudas produzidas e ainda permite reduzir custos
com a propagação in vitro.
Além da redução dos sais inorgânicos, a substituição por produtos mais acessíveis,
dispensando trâmites burocráticos, e de menor custo, pode ser uma alternativa promissora.
Villa et al. (2009), verificaram a possibilidade da inserção de ureia nas proporções de 0; 20;
40; 60; 80 e 100%, comparadas ao nitrato de amônio P.A. na micropropagação de amoreira-
preta (Rubus sp) cv Tupy. Na ausência do sal, as plantas obtiveram maior número de folhas,
todavia, as plantas desenvolvidas em meio com quantidades de uréia superiores a 20%
tiveram a altura das plantas, número de folhas e biomassa fresca reduzidas, devido à
fitotoxidez gerada. Na micropropagação do abacaxizeiro cv. Pérola, a utilização da ureia, na
concentração de 40%, substituindo o nitrato de amônio P.A., confirmou a viabilidade da
substituição parcial ou total do reagente, promovendo o melhor desenvolvimento das plantas
em meio de cultura sólido (Moreira et al., 2007). Esta resposta é associada a especificidade
nutrucional e a fase fenológica de cada espécie vegetal, na ausência do nitrato de potássio. Os
explantes de palma orelha de elefante não sobreviveram, assim como em outras espécies
vegetais, a exemplo da arruda do campo (Hypericum teretiusculum A.St.-Hil), em que a
redução dos compostos nitrogenados do meio MS diminuiu o seu desenvolvimento (Souza et
al., 2018).
Ribeiro e Teixeira (2008) testaram a redução e substituição do KNO3 P.A. por outro
fertilizante, o salitre potássico, no cultivo in vitro do ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata),
obtendo o aumento da sua biomassa. Neste trabalho, resultados similares foram obtidos no
cultivo in vitro e ex vitro da Palma cv. Orelha de Elefante, uma vez que as mudas desta
cultivar apresentaram um bom desenvolvimento durante e após a aclimatização, mantendo um
padrão e uniformidade no crescimento.
Em relação à marcha de absorção de nutrientes na palma, Santos et al. (1990),
encontrou no final do ciclo de produção em ordem crescente: N< P< K< Ca. Quando
propagadas em meio de cultura com diferentes proporções de KNO3 (Reagente P.A. e
66
fertilizante granular), a marcha de absorção foi em ordem crescente: P< Mg < Ca< N< K. Esta
diferença de absorção pode estar relacionada a diferenças na exigência nutricional em
distintas fases fisiológicas da palma. As amostras das plantas neste trabalho foram coletadas
no 35º dia em condições de aclimatização.
Considerando o desenvolvimento da palma cv. orelha de elefante, nas condições
propostas para este trabalho, a alteração do reagente P.A. por um fertilizante comercial é uma
alternativa promissora, uma vez que a aquisição do nitrato de potássio (KNO3) P.A., no
Brasil, depende da autorização do exército (Portaria No 42). Outra característica que
potencializa o uso do fertilizante comercial, como uma alternativa viável para o fornecimento
de potássio e nitrogênio, em substituição do reagente P.A., é a composição química similar
(45% de K2O, 12% de N e 1,2% S) e do reagente P.A (44% de K2O e 13% de N).
Assim a substituição do KNO3 (P.A.) minimiza consideravelmente o custo para
confecção do meio de cultura, considerando que o preço atual do fertilizante é de
aproximadamente R$ 170,20, o saco com 25 Kg e o reagente P.A R$ 780,00 de 1 Kg. A
substituição resultou não apenas na redução de 99,12% no custo com a aquisição do
fertilizante, mas também na eliminação de problemas relacionados à sua aquisição, pois a
compra do fertilizante não precisa da autorização do exército. Quando comparados ao
protocolo do meio MS, uma menor proporção do fertilizante comercial (0,5 a 1,5 g L -1
) foi
suficiente para obtenção do desenvolvimento in vitro e manutenção do crescimento ex vitro
da palma cv. Orelha de Elefante.
CONCLUSÃO
A concentração de 1,0 g L-¹ do fertilizante nitrato de potássio promoveu a
melhor resposta da palma orelha de elefante cultivada in vitro e ex vitro em relação ao
reagente P.A..
A substituição do reagente P.A. nitrato do potássio (KNO3) por fertilizante comercial
de composição semelhante, é uma alternativa promissora para micropropagação de palma cv.
Orelha de Elefante, reduzindo o custo na aquisição deste reagente em 99,12 % e eliminando
os trâmites burocráticos.
67
AGRADECIMENTOS
A Capes pela bolsa de mestrado, à UNEB/DTCS Campus III e à EMBRAPA pelo
apoio no desenvolvimento e condução do experimento.
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