Universidade Federal do Rio de Janeiro

CITOCINAS NA PANCREATITE AGUDA CAUSADA POR ISQUEMIA-REPERFUSÃO EM RATOS

Simone de Oliveira Coelho

2011

CITOCINAS NA PANCREATITE AGUDA CAUSADA POR ISQUEMIA-REPERFUSÃO EM RATOS

Simone de Oliveira Coelho

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Ciências

Cirúrgicas, da Universidade Federal do Rio

de Janeiro, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do título de Mestre

em Medicina (Ciências Cirúrgicas)

Orientadores: Professor Alberto Schanaider

Professor Juan Miguel Renteria

Rio de Janeiro Dezembro - 2011

CITOCINAS NA PANCREATITE AGUDA CAUSADA POR ISQUEMIA-REPERFUSÃO EM RATOS

Simone de Oliveira Coelho

Orientadores: Professor Alberto Schanaider Professor Juan Renteria

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

Cirúrgicas, da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ,

como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Cirúrgicas.

Aprovada por: ____________________________________ Presidente, Prof. ____________________________________ Prof. ____________________________________ Prof.

Rio de Janeiro Dezembro - 2011

Coelho, Simone de Oliveira

Citocinas na pancreatite aguda causada por isquemia-reperfusão em ratos / Simone de Oliveira Coelho. -- Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2011.

xii, 46 f. : il. ; 31 cm. Orientadores: Alberto Schanaider e Juan Miguel Renteria

Dissertação (mestrado) – UFRJ / Faculdade de Medicina / Programa de Pós-graduação em Medicina, Ciências Cirúrgicas, 2011.

Referências bibliográficas: f. 35-40. 1. Traumatismo por Reperfusão . 2. Pancreatite - fisiopatologia. 3. Citocinas. 4. Ratos Wistar . 5. Ciências Cirúrgicas - Tese. I. Schanaider, Alberto. II. Renteria, Juan Miguel. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, FM, Programa de Pós-graduação em Medicina, Ciências Cirúrgicas. IV. Título.

RESUMO

CITOCINAS NA PANCREATITE AGUDA CAUSADA POR ISQUEMIA -REPERFUSÃO EM RATOS

Simone de Oliveira Coelho

Orientadores: Professor Alberto Schanaider Professor Juan Renteria

Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Cirúrgicas, da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Medicina (Ciências Cirúrgicas). Introdução: A fisiopatologia da pancreatite aguda ainda gera controvérsias. A produção de citocinas pró-inflamatórias exerce um papel primordial, pois desencadeia o aparecimento de lesão tecidual pancreática. Porém, estes mediadores raramente são correlacionados com modelos de isquemia e reperfusão. Objetivo: Este estudo teve como objetivo investigar o papel das citocinas como marcadores inflamatórios da pancreatite aguda conseqüente a isquemia e reperfusão, em ratos. Métodos: Ratos Wistar (n=56) foram distribuídos, aleatoriamente, em sete grupos: Controle; Simulação 24h (dissecção da artéria esplênica e óbito após 24 horas); Simulação 72h (dissecção da artéria esplênica e óbito após 72 horas); Grupo 15’/24h (oclusão da artéria esplênica por 15 minutos com óbito após 24 horas); Grupo 15’/72h (oclusão da artéria esplênica por 15 minutos com óbito após 72 horas); Grupo 180’/24h (oclusão da artéria esplênica por 180 minutos com óbito após 24 horas) e Grupo 180’/72h (oclusão da artéria esplênica por 180 minutos com óbito após 72 horas). O tecido pancreático foi submetido a um estudo histopatológico. Foram mensuradas, no plasma, a amilase e a proteína C reativa (PCR). No sobrenadante de cultura do tecido pancreático efetuaram-se as dosagens do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), da interleucina 1 beta (IL-1β) e da interleucina 6 (IL-6). Resultados: Em quase todos os animais, a isquemia produziu pancreatite aguda branda. Em relação à análise histopatológica, não houve diferença significante entre os grupos 24 e 72 horas de reperfusão, apesar de, isoladamente, o edema ter sido maior para os grupos com 180 minutos. As concentrações da amilase aumentaram nas primeiras 24 horas após isquemia de 180 minutos. O mesmo se observou quanto à proteína C reativa e a IL-6, que permaneceram elevadas por 72 horas, independente do tempo de isquemia. As concentrações de IL-1 e TNF-α foram maiores nos grupos com 180 minutos de isquemia e 72 horas de reperfusão. Conclusão: Em ratos, as concentrações da IL-1β e do TNF-α atuaram como marcadores da pancreatite aguda branda, principalmente quando induzida por tempos de isquemia e reperfusão mais prolongados.

Palavras-chave: Reperfusão, Citocinas, Pancreatite, Ratos

Rio de Janeiro

Dezembro - 2011

ABSTRACT

CITOKINES IN ISCHEMIC-REPERFUSION ACUTE PANCREATITI S IN RATS

Simone de Oliveira Coelho

Orientadores: Professor Alberto Schanaider Professor Juan Renteria

Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Cirúrgicas, da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Medicina (Ciências Cirúrgicas). Introduction: The pathophysioly of acute pancreatitis is still controversial. Proinflammatory cytokines production plays an essential role triggering the development of pancreatic tissue injury but such mediators are rarely correlated with ischemic/reperfusion models. Objective: This study aimed to investigate the role of the cytokines as inflammatory mediators in ischemic-reperfusion acute pancreatitis in rats. Methods: Wistar rats (n=56) were randomly assigned to seven groups: Control; Sham 24hrs (splenic artery dissection only and death after 24hr); Group Sham 72hrs (artery dissection only with death after 72 hours); Group 15’/24hrs (ischemia of splenic artery for 15minutes with death after 24 hours); Group 15’/72hrs (ischemia of splenic artery for 15minutes with death after 72 hours); Group 180’/24hrs (ischemia of splenic artery for 180 minutes with death after 24hours; and Group 180’/72hrs (ischemia of splenic artery for 180 minutes with death after 24 hours). Amylase and C-reative protein were measured in plasma. Supernatant of pancreatic tissue culture was examined for tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 1β (IL-1 β) and interleukin 6 (IL-6). Histopathologic study was also performed. Results: The ischemic process produced mild acute pancreatitis in almost all animals submitted to ischemia. There was no statistical difference between 24 and 72 hours reperfusion time groups of animals. However, as an isolated finding, edema was greater in groups with 180 minutes of ischemia. Amylase levels were higher in the first 24 hours after 180 minutes of ischemia. The same result could be seen with C-reactive protein and IL-6 levels which remained high up to 72 hours of ischemia, IL-1 and TNF-α levels were also higher in both 180 minutes and 72 hours of reperfusion groups of rats. Conclusion: In rats IL-1 and TNF-α levels play a role as markers of mild acute pancreatitis, mainly for a longer ischemic and reperfusion time.

. Key-words: Reperfusion, Cytokines, Pancreatitis, Rats

Rio de Janeiro December - 2011

DEDICATÓRIA

Dedico aos meus pais, eternos estimuladores.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Thales Penna de Carvalho, um amigo e companheiro de caminhada, sem

ele não teria finalizado esta Dissertação.

Agradeço ao Professor Alberto Schanaider, Titular do Departamento de Cirurgia

Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro e

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Cirúrgicas da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, por sua paciência e acolhimento como

orientador da minha dissertação de mestrado.

Agradeço ao Professor Juan Renteria, Adjunto do Departamento de Cirurgia da

Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pela orientação da minha

dissertação de mestrado.

Agradeço ao Professor Heitor Siffert Pereira de Souza, pelo importante auxílio e

incentivo no laboratório multidisciplinar de Pesquisa do Hospital Universitário Clementino

Fraga Filho. Agradeço a Alyson do Rosário Junior e Cesônia de Assis Martissuno, pelo

cuidado no preparo das peças cirúrgicas.

Agradeço a Professora Morgana Castello Branco, pelo incentivo e zelo, e pelo seu jeito

meigo no lidar com os alunos, além do auxilio na coleta, estudo e dosagem do material no

Laboratório de Imunologia Celular do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade

Federal do Rio de Janeiro.

Agradeço ao Professor Kalil Madi, pela avaliação histopatológica desta Dissertação e

pelo agradável almoço após um dia inteiro de trabalho.

Agradeço a todos do Serviço de Cirurgia Experimental, na ajuda, cuidado e trocas de

idéias, sem os quais não teria conseguido finalizar a dissertação de mestrado: Professor Paulo

César Silva, Professor Luiz Alfredo de Magalhães Vivas, Professor Manoel Luiz Ferreira,

Christiano Esposito, Lucas Cristo Conilo Miller, Camilo Abbud Aiex, Rubens Luiz Miranda e

Elmo Gaspar Marques.

Agradeço a Andrea Barbosa, do serviço de Anatomia Patológica da Clínica

Microimagem, pelas fotos das lâminas.

Agradeço a CAPES pelo financiamento para realização desta Dissertação de Mestrado.

Agradeço ao Professor Antonio Augusto Peixoto de Souza, chefe do Departamento de

Cirurgia Geral do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, pelo acolhimento dentro do

programa de Pós-graduação.

Agradeço aos Professores da Pós-Graduação pelos brilhantes ensinamentos, em

especial ao Professor Roberto Takashi Sudo, pelo intenso incentivo durante nosso projeto, e

Professor Joaquim Ribeiro Filho, que além de Professor, um verdadeiro membro da família.

Agradeço a Edson da Silva Salvador Junior, ex-residente de Cirurgia Geral do Hospital

Universitário Clementino Fraga Filho, pelo apoio e ajuda no início do meu projeto de

Dissertação.

Agradeço a Professora Elis Cristina Araújo Eleutério, do Instituto de Química do

Centro de Tecnologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pelas explicações e ajuda nas

dosagens realizadas em seu laboratório.

Agradeço aos graduandos e pós-graduandos do Instituto de Química, em especial a

Aline de Araújo Brasil e Frederico Augusto Vieira de Castro, na ajuda em todas as etapas

realizadas no laboratório.

Agradeço aos meus colegas de trabalho, pela força e por compensar os vários

momentos em que estive ausente: Ricardo Vianna de Carvalho, Francisca Norma Girão

Guttierrez, Arovel Moura Junior, Deborah Chagas Nunes, Andréa Baptista, Ruy Nogueira,

Roberta Nolasco, Tânia Carla Cortez e Jandira Souza.

Agradeço ao meu ex-chefe, Alberto Ribeiro Gonçalves, onde quer que ele esteja, pelo

grande ensinamento de ética, profissionalismo e cuidado com os colegas.

Agradeço ao meu marido Alexandre de Oliveira, pela enorme paciência pelos meus

momentos de tristeza e ausência diante das dificuldades para finalizar a dissertação de

mestrado.

Agradeço aos meus filhos Ana Luiza e Luiz Guilherme, pela alegria de simplesmente

estarem vivos.

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1

2.OBJETIVO ............................................................................................................................. 3

3.MÉTODOS ............................................................................................................................. 4

3.1- Amostra ........................................................................................................................... 4

3.2 - Desenho experimental ................................................................................................... 4

3.3 - Procedimento cirúrgico .................................................................................................. 5

3.4 - Preparo do tecido e do sangue ....................................................................................... 6

3.5 - Análise histopatológica .................................................................................................. 8

3.6 - Análise laboratorial sérica ............................................................................................. 8

3.7 - Preparo de cultura de tecidos e mensuração de citocinas .............................................. 9

3.8 - Análise estatística ........................................................................................................ 11

4. RESULTADOS.................................................................................................................... 13

4.1- Estudo histopatológico ................................................................................................ 13

4.2 - Análise laboratorial sérica .......................................................................................... 20

4.2.1 – Amilase ............................................................................................................. 20

4.2.2 - Proteina C reativa (PCR) ................................................................................... 21

4.2.3 - Interleucina 1 beta (IL-1β) ................................................................................ 22

4.2.4 - Interleucina 6 (IL-6) .......................................................................................... 23

4.2.5 - Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) .............................................................. 24

5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 25

6. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 34

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 35

8. ANEXOS .............................................................................................................................. 41

9. APÊNDICES ....................................................................................................................... 43

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

APACHE - Avaliação fisiológica aguda e crônica da sáude (Acute Physiology and Chronic

Health Evaluation)

BISAP – Índice de gravidade da pancreatite aguda à beira do leito (Bedside Index for Severity

in Acute Pancreatitis)

C - grupo Controle

CEUA - Comitê de Ética para Uso de Animais

ELISA – Ensaio imuno absorvente ligado à enzima (enzyme-linked immunosorbent sensitive

assay)

H&E - hematoxilina e eosina

IL-1β - interleucina 1 beta

IL-6 - interleucina 6

IL -8 – interleucina 8

PAF - fator ativador de plaquetas (platelet activating factor)

PCR - proteína C reativa (protein chain reaction )

S - grupo Simulação

SPF - livre de patógenos específicos (specific pathogen free)

TNF-α - fator de necrose tumoral alfa (tumor necrosis factor alpha)

LISTAS DE FIGURAS

Figura 1. Anatomia do pâncreas do rato........................................................................................ 6

Figura 2. Oclusão atraumática de ramo da artéria esplênica............................................................ 7

Figura 3 - Fotomicrografia do grupo Controle (HE 100X)............................................................. 14

Figura 4 - Fotomicrografia do grupo Simulação (S72h, HE, 40x).................................................. 14

Figura 5 - Fotomicrografia do grupo Simulação (S72h, HE, 400x)................................................ 15

Figura 6 - Fotomicrografia do grupo 4 (15’/24h, HE, 40x)............................................................ 15

Figura 7 - Fotomicrografia do grupo 4 (15’/24h, HE, 400x).......................................................... 16

Figura 8 - Fotomicrografia do grupo 5 (15’/72h, HE, 40x)............................................................ 16

Figura 9 - Fotomicrografia do grupo 5 (15’/72h, HE, 400x).......................................................... 17

Figura 10 - Fotomicrografia do grupo 6 (180’/24h, HE, 40x)........................................................ 17

Figura 11 - Fotomicrografia do grupo 6 (180’/24h, HE, 400x)...................................................... 18

Figura 12 - Fotomicrografia do grupo 7 (180’/72h, HE, 40x)........................................................ 18

Figura 13 - Fotomicrografia do grupo 7 (180’/72h, HE, 400x)...................................................... 19

Figura 14 - Resultado histopatológico, com avaliação do escore.................................................... 19

Figura 15- Box plot das concentrações da amilase nos diferentes grupos experimentais.................. 20

Figura 16- Box plot das concentrações da PtnC reativa nos diferentes grupos experimentais........... 21

Figura 17- Box plot das concentrações da IL1β nos diferentes grupos experimentais...................... 22

Figura 18- Box plot das concentrações da IL 6 nos diferentes grupos experimentais....................... 23

Figura 19- Box plot das concentrações do TNF α nos diferentes grupos experimentais................... 24

1- INTRODUÇÃO

A pancreatite aguda tem uma incidência anual de 5 a 80 casos por 100 mil pessoas1,2,3,4,

com uma mortalidade de 1 a 5 por 100mil pessoas2. Aproximadamente um terço dos pacientes

desenvolvem necrose pancreática, com uma mortalidade associada se aproximando de 30 por

cento2,3,4,5,6. Esta forma grave da doença é caracterizada por necrose pancreática, ativação de

citocinas, resposta inflamatória sistêmica e síndrome da falência de múltiplos órgãos2,7,8,9.

Apesar de novas ferramentas para o diagnóstico e o tratamento, esta afecção permanece com

altos índices de morbi-mortalidade10,11. O quadro clínico pode variar de uma apresentação leve

e autolimitada com recuperação de 80% dos pacientes, até quadros graves com necrose e ou

falência de múltiplos órgãos1,8,12,13,14,15. Um grande número de características clínicas e testes

de bioquímicos têm sido utilizados para determinar a gravidade da pancreatite aguda, a

exemplo daqueles encontrados na escala APACHE II (Avaliação fisiológica aguda e crônica da

sáude - The Acute Physiology and Chronic Health Evaluation), critério de Atlanta, escala de

Balthazar, escala de Ranson e mais recentemente o BISAP (Índice de gravidade da pancreatite

aguda à beira do leito - Bedside Index for Severity in Acute Pancreatitis), porém não há um

marcador laboratorial específico como fator preditivo da gravidade de pancreatite6,16-24. Nas

últimas décadas procurou-se desenvolver vários testes clínicos, bioquímicos e radiológicos,

isolados ou combinados em sistemas de pontuação, a fim de predizer a gravidade de um

episódio de pancreatite aguda e ou sua taxa de mortalidade6-11.

Os agentes etiológicos mais comuns da pancreatite aguda, que respondem por mais de

90% dos casos, são a doença litiásica biliar, a ingestão de álcool etílico e as dislipidemias,

dentre outros1, 6-11. A fisiopatologia envolve ativação precoce de tripsina no interior dos ácinos

que, por mecanismos ainda pouco esclarecidos, desencadeiam o processo inflamatório intra e

ou extrapancreático que culminará com o estabelecimento da pancreatite aguda1, 9.

O mecanismo de isquemia e reperfusão (I/R) tem sido pouco correlacionado à

pancreatite aguda, tanto como fator causal, como também nos processos fisiopatológicos de

pancreatites desencadeadas pelos mais diversos agentes etiológicos. O pâncreas é um órgão

susceptível a lesões por isquemia e reperfusão, e que podem ser desencadeadas após alterações

hemodinâmicas decorrentes da sepse ou da hipovolemia, do uso de aminas vasopressoras, de

cirurgias com clampeamento aórtico, portal ou do tronco celíaco, além do transplante

pancreático25,26.

2

A pancreatite aguda é um processo patológico dependente da autodigestão causada pela

ativação prematura de zimogênios a enzimas ativas. Alteração na perfusão deste órgão tem um

importante papel na fisiopatologia da pancreatite, quer seja nos quadros brandos, ou na

progressão para pancreatite necrotizante27. O processo isquêmico ou a hipoperfusão do

pâncreas induz à pancreatite aguda, com elevação de amilase, edema intersticial e infiltração

inflamatória celular25,27,28,30. Da mesma forma, graves lesões podem ser provocadas pela

reperfusão, através da ativação de leucócitos e a formação de radicais livres derivados do

oxigênio, concomitantemente à liberação de enzimas proteolíticas e citocinas pró-

inflamatórias27,30,31,32.

A ativação das enzimas pancreáticas causa o acionamento da cascata de fosfolipases,

elastases e outros mediadores com aumento da migração neutrofílica ao pâncreas. Em adição,

uma variedade de citocinas inflamatórias são liberadas, incluindo interleucina 1beta (IL-1 β),

interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), fator ativador de plaquetas (PAF) e fator de necrose

tumoral (TNF)33. A ativação de leucócitos e a liberação de citocinas pró-inflamatórias tais

como a IL-1β, a IL-6 e o TNF-α são considerados fatores etiológicos relevantes não só do dano

pancreático local, mas do desenvolvimento para um quadro de pancreatite grave3,11,25,34,35, de

síndrome da resposta inflamatória sistêmica e da falência de múltiplos órgãos4,25,36,37,38.

Neste contexto, marcadores da resposta inflamatória têm sido investigados na

pancreatite aguda, mas os exames laboratoriais e imunohistoquímicos não os enfatizam na

pancreatite aguda causada por isquemia e reperfusão. Assim, até o momento, são escassos os

estudos preditivos para a evolução ou gravidade da pancreatite aguda por I/R, e em especial

nos estágios iniciais desta doença16,22.

Vários modelos experimentais de pancreatite aguda foram desenvolvidos nas últimas

décadas e realizados em diferentes animais. Apresentam variados mecanismos fisiopatológicos

para indução da pancreatite aguda26. Neste estudo, buscou-se, uma adaptação destes modelos

experimentais, utilizando-se o rato e com ênfase no processo isquemia-reperfusão para

avaliação das citocinas pró-inflamatórias.

2. OBJETIVO Este estudo objetivou avaliar se citocinas pró-inflamatórias (IL-1 β, IL-6 e TNF-α)

poderiam atuar como marcadores biológicos capazes de determinar o grau de exposição à

isquemia e reperfusão na pancreatite aguda, em um modelo experimental de reperfusão

pancreática seletiva.

3. MÉTODOS

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética para Uso de Animais (CEUA),

sob o número 78/09, de acordo com as normas da lei 11.794, de 8 de outubro de 2008 e que

estabeleceu procedimentos para o uso científico de animais.

O modelo experimental foi desenvolvido e executado no Centro de Cirurgia

Experimental do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal

do Rio de Janeiro.

3.1 -Animais

Foram utilizados 56 ratos Wistar (Rattus norvegicus), isogênicos, SPF (livre de

patógenos específicos), fêmeas, com peso corporal de 180 a 250g, oriundos do Centro de

Cirurgia Experimental da Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Os animais foram alimentados com ração industrial balanceada e água ad libitum,

alojados em biotério dentro de gaiolas apropriadas, com temperatura controlada e iluminação

conforme ciclo circadiano.

3.2 - Desenho Experimental

Os animais foram distribuídos, aleatoriamente, em sete grupos com oito ratas cada:

Grupo 1 (Controle); apenas amostras de sangue e do pâncreas foram coletadas.

Grupo 2 (S/24h); Simulação 24h - Realizou-se laparotomia com dissecção do ramo

pancreático principal da artéria esplênica e óbito induzido sem dor, decorridas 24 horas.

Grupo 3 (S/72h); Simulação 72h - Realizou-se laparotomia com dissecção do ramo

pancreático principal da artéria esplênica e óbito induzido sem dor, decorridas 72 horas.

Grupo 4 (15’/24h) - Efetuou-se a interrupção do fluxo do ramo pancreático principal

da artéria esplênica, por 15 minutos e o óbito induzido sem dor ocorreu 24 horas após.

Grupo 5 (15’/72h) - Efetuou-se a interrupção do fluxo do ramo pancreático principal

da artéria esplênica, por 15minutos e o óbito induzido sem dor ocorreu 72 horas após.

Grupo 6 (180’/24h) - Efetuou-se a interrupção do fluxo do ramo pancreático principal

da artéria esplênica, por 180 minutos e o óbito induzido sem dor ocorreu 24 horas após.

5

Grupo 7 (180’/72h) - Efetuou-se a interrupção do fluxo do ramo pancreático principal

da artéria esplênica, por 180 minutos e o óbito induzido sem dor ocorreu 72 horas após.

3.3 - Procedimento cirúrgico

O procedimento cirúrgico foi realizado no Centro Cirúrgico do Centro de Cirurgia

Experimental da Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Todos os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal de quetamina

(25mg/kg) e xilazina (3mg/kg). Após efeito satisfatório das substâncias anestésicas, os ratos

foram posicionados em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica, com fixação das quatro

patas e submetidos à tricotomia da região abdominal. Procederam-se medidas de assepsia e

antissepsia.

Nos grupos 2 a 7 realizou-se uma laparotomia, por incisão mediana, medindo 4 cm,

distalmente ao apêndice xifóide. A veia cava inferior foi identificada por rechaço contralateral

de alças intestinais, e realizou-se a injeção de heparina sódica (1000UI/kg de peso) em veia

cava inferior. Esperou-se 20 minutos pelo tempo de latência da heparina, com tamponamento

do local de punção. Prosseguiu-se com a abertura da bolsa omental com exposição da porção

gastroesplênica do pâncreas, sob magnificação óptica de 3,5 vezes, seguida por incisão na

cápsula pancreática e por dissecção do ramo pancreático principal da artéria esplênica, após a

emergência da artéria polar superior (Figura 1). A interrupção do fluxo pancreático foi

realizada com microclampe arterial revestido por tubo plástico (B1A, ASSI, Nova Iorque,

EUA) (Figura 2), de acordo com os grupos (4 a 7) descritos anteriormente. Neste momento,

dava-se inicio a fase isquêmica do modelo, que poderia durar 15 (Grupos 4 e 5) ou 180

minutos (grupos 6 e 7), após o que seguiu-se a sutura da parede abdominal em 2 planos com

fio inabsorvível (algodão 3.0).

No pós-operatório, as ratas foram recolocadas em gaiolas individuais, sob analgesia

com dipirona (30 mg/kg) via oral, alimentadas com ração e água ad libitum.

Os animais foram induzidos ao óbito sem dor mediante sobredose anestésica decorridas

24 (Grupos 4 e 6) ou 72 horas (Grupos 5 e 7) após a reperfusão. Nestas ocasiões, o sangue foi

coletado através da punção da veia cava inferior e o pâncreas dissecado e retirado.

6

3.4 - Preparo do tecido e do sangue

A porção do pâncreas reperfundida foi retirada e dividida, com uma parte destinada a

histopatologia, fracionada longitudinalmente, e a outra encaminhada para a cultura de tecido

(para análise das citocinas TNF-α, IL1β e IL- 6 e definidas para cada estudo específico.

Figura 1 – Anatomia do pâncreas do rato. O pâncreas do rato é composto pelos lobos esplênico, gástrico e duodenal. A artéria esplênica bifurca-se em dois troncos principais. O cranial dá origem a um ramo esplênico superior que vasculariza o pólo superior do baço. Após a emergência deste, distribui-se em um ramo pancreático principal que vasculariza o lobo esplênico do pâncreas, parte superior do lobo gástrico do pâncreas, além do terço médio e inferior do baço. O tronco caudal, também denominado de artéria esplênica inferior, dá origem a um ramo para o lobo duodenal e outro que vasculariza a parte inferior do lobo gástrico do pâncreas e o polo inferior do baço. O sistema venoso acompanha a distribuição anatômica arterial. Adaptado e traduzido de Lambert52

Lobo duodenal Lobo gástrico

Baço

Lobo esplênico Vasos esplênicos superiores Vasos esplênicos

7

Figura 2 - Oclusão pouco traumática de ramo da artéria esplênica, com clipe microvascular, nos grupos 4 a 7. Após a abertura da bolsa omental, a arcada gastroepiploica foi rebatida inferiormente, identificando o segmento esplênico do pâncreas. O microclampe foi colocado, seletivamente, no ramo pancreático principal, após emergência do ramo esplênico superior. Nota-se a palidez do lobo esplênico do pâncreas (A) quando comparado ao lobo gástrico (B).

A

B

8

3.5 - Análise histopatológica

Um único patologista realizou a avaliação dos preparados histológicos, sem conhecer a

identificação dos grupos (cega) e esta foi conduzida no Laboratório Multidisciplinar de

Pesquisa do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho – Universidade Federal do Rio de

Janeiro,

Os fragmentos pancreáticos foram imersos em paraformaldeído a 4% tamponado com

fosfato sódico a 0,1M (pH 7,4), em um período de 12 horas em temperatura ambiente. Os

preparados histológicos com espessura de 4 µm, após serem colocados em lâminas e estocados

em temperatura ambiente, foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e estudados em

magnificações de 40, 100 e 400 vezes, com o microscópio óptico.

O edema/formação de fendas (interlobares, interlobulares, interacinares), o infiltrado

inflamatório (contagem de leucócitos), e a degranulação do zimogênio no interior das células

ductais foram graduados de 0 a 3, de acordo com a intensidade da lesão (respectivamente,

ausente, leve, moderada e intensa) e baseados na classificação de Simsek e Spormann

modificada10,29. A proporção núcleo versus zimogênio de 1:2 foi considerada compatível com a

normalidade (grau 0) e a gravidade da lesão classificada em leve, moderada e intensa (1 a 3),

respectivamente para as proporções 1:1, 2:1 e 1:0. Quando intensa, avaliou-se a formação de

pseudoductos ou túbulos. Atestaram-se, ainda, a presença ou ausência de necrose de gordura,

de necrose do parênquima, de hemorragia e de apoptose.

3.6 - Análise laboratorial sérica

As amostras de sangue foram centrifugadas na velocidade de 4000 rpm por 5 minutos e

o soro coletado com auxílio de pipeta eletrônica e armazenado a -80ºC para mensuração de

amilase sérica e proteína C reativa (PCR). Tais mensurações foram realizadas em laboratório

particular e especializado em bioquímica animal.

3. 6. 1- Atividade da amilase plasmática

Esta enzima foi quantificada no soro pela técnica bioquímica CNPG (a-(2-cloro-4-

nitrofenil)-b-1,4-galactopiranosilmaltoside) (Amilase CNPG Liquiform – LabtestR - Brasil)

9

3. 6. 2 - Atividade da proteína C reativa (PCR)

A atividade da PCR foi quantificada no soro pela técnica de nefelometria ou

turbidimetria, suspensão de partículas de látex sensibilizada com anticorpos anti – PCR

humana, azida sódica 0,95 g/L (Turb PCR ultra sensível – EbramR - Brasil).

3.7. Preparo de cultura de tecidos com mensuração de citocinas

O preparo de cultura de tecido e a mensuração de citocinas foram realizados no

laboratório de Imunologia Celular do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade

Federal do Rio de Janeiro.

Culturas de explante de pâncreas foram mantidas por 24 horas. Em todas as culturas foi

utilizado o meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco, Invitrogen,

USA), com 10mM HEPES (Promega, USA), penicilina G (100 KU/L) e estreptomicina

(100mg/L) (ambos Sigma, USA) por 24 horas, a 37ºC, em incubadora umidificada com

atmosfera de CO2 a 5%. Após a incubação por 24 horas, o sobrenadante foi coletado,

centrifugado e estocado a -20oC. As amostras dos sobrenadantes foram usadas para

mensuração das concentrações de citocinas inflamatórias pelo método de ensaio colorimétrico

imuno enzimático de ELISA (sensitive enzyme-linked immunosorbent assay) para TNF-α

(R&D System, MN, USA), para IL-1 β (PeproTech Inc., New Jersey, USA) e para e IL- 6

(Bender MedSystems – Vienna- Austria). Todas as amostras foram analisadas em duplicata. As

concentrações de citocinas nos sobrenadantes de cultura de órgãos foram expressas em pg/µg

de proteína.

O peso molhado das amostras foi correlacionado com as proteínas contidas no

homogenado de tecido. O conteúdo total de proteína das amostras de tecido foi estimado pelo

método Lowry. Cumpre esclarecer que, concentrações menores do que 5 pg/dL de citocinas

não são detectáveis pelos testes utilizados.

3.7.1- Dosagem de TNF- α

Foram colocados em cada poço de placa para ELISA, 100µL de anticorpo de captura

(seguindo instruções do kit fornecido pelo fabricante R&D System), em uma concentração de

1µg/ml e incubado em pernoite, à temperatura ambiente. Tal solução foi descartada e os poços

10

lavados 4 vezes com solução de lavagem (PBS/0,05% tween). A placa foi bloqueada através da

transferência de 300µL por poço de solução bloqueadora (PBS/0,05%tween/1%BSA).

Novamente, incubada por 1 hora, à temperatura ambiente. A solução foi novamente descartada

e os poços lavados com solução de lavagem por quatro vezes. O anticorpo recombinante foi

plaqueado em diluições seriadas, em duplicata, de modo a ficar com 100µL de volume em cada

poço. Foram colocadas 100µL de amostras em duplicata e a placa foi incubada por 2 horas, à

temperatura ambiente. Novamente, a solução foi descartada e os poços lavados por quatro

vezes com solução de lavagem. Foi adicionado 100µL de anticorpo de detecção por poço. A

placa foi incubada em pernoite, a -4ºC. Novamente, a solução foi descartada e a placa lavada

com solução de lavagem, por quatro vezes. Foi adicionado 100µL de estreptavidina HRP

(ZymedR - USA) e a placa foi incubada por 30 minutos. Descartada a solução, os poços foram

lavados (quatro vezes) e foi adicionado 100µL de substrato TMB (GenzymeR - USA) a cada

poço. A reação foi então interrompida com HCl 1N e lida a 450nM, por espectofotometria.

3.7.2 - Dosagem de IL-1β

Foram colocados em cada poço de placa para ELISA 100µL de anticorpo de captura

(seguindo instruções do kit fornecido pelo fabricante PeproTech Inc.) numa concentração de

2µg/ml, incubados em pernoite à temperatura ambiente. A solução foi descartada e os poços

lavados quatro vezes com solução de lavagem (PBS/0,05% tween). A placa foi bloqueada,

através da transferência de 300µL por poço de solução bloqueadora

(PBS/0,05%tween/1%BSA) e novamente incubada por 1 hora, à temperatura ambiente. A

solução foi descartada e os poços lavados com solução de lavagem por quatro vezes. O

anticorpo recombinante foi diluído na placa diluições seriadas em duplicata, de modo a ficar

com 100µL de volume em cada poço. Adicionou-se 100µL das amostras em duplicata e a placa

foi incubada por 2 horas à temperatura ambiente. Novamente, a solução foi descartada e os

poços lavados por quatro vezes com solução de lavagem. Foi adicionado 100µL por poço, de

anticorpo de detecção. A placa foi incubada por 2 horas à temperatura ambiente. Novamente, a

solução foi descartada e a placa lavada com solução de lavagem por quatro vezes. Foi

adicionada 100µL de streptavidina HRP (ZymedR – USA) e a placa foi incubada por 30

minutos. Descartada a solução, os poços foram lavados (quatro vezes) e foi adicionado 100µL

11

de substrato TMB (GenzymeR – USA) a cada poço. A reação foi interrompida com HCl 1N e

lida por espectofotometria.

3.7.3 -Dosagem de IL-6

Foram colocados em cada poço de placa para ELISA 50µL de anticorpo de captura

(seguindo instruções do kit fornecido pelo fabricante Bender MedSystems) numa concentração

de 5µg/ml e incubado em pernoite, à temperatura ambiente. A solução foi descartada e os

poços lavados três vezes com solução de lavagem (PBS/0,05%tween). A placa foi bloqueada,

através da transferência de 200µL por poço de solução bloqueadora fornecida pelo fabricante e

incubada por 1 hora à temperatura ambiente. A solução foi descartada e os poços lavados com

solução de lavagem por três vezes. O anticorpo recombinante foi diluído na placa em

duplicatas em diluições seriadas, de modo a ficar com 50µL de volume em cada poço. Foram

adicionados 50µL de amostra nos respectivos poços em duplicatas, conforme desenho das

placas. A placa foi incubada por 2 horas à temperatura ambiente. Novamente, a solução foi

descartada e os poços lavados com solução de lavagem, por três vezes. Foi adicionado 50µL

por poço de anticorpo de detecção. A placa foi incubada em pernoite a -4ºC. Novamente, a

solução foi descartada e a placa lavada com solução de lavagem, por três vezes. Foi adicionada

100µL de estreptavidina HRP e a placa foi incubada por 30 minutos. Descartada a solução, os

poços foram lavados (três vezes). Foi adicionado 100µl de TMB a cada poço e a placa foi

incubada por 30 minutos. A reação foi então interrompida com 50 µl HCl 1N e lida a 450nM

por espectofotometria.

3.8. Análise estatística

A análise estatística foi realizada no laboratório Multidisciplinar de Pesquisa do

Hospital Universitário Clementino Fraga Filho – UFRJ.

Os dados obtidos em cada etapa do projeto foram analisados com o auxílio de um

programa estatístico SPSS computadorizado (Versão 10.0.1, SPSS Inc., 1989-1999, USA). Os

resultados de diferentes grupos foram comparados pelo teste-t, ou por ANOVA com

comparações múltiplas pareadas através do teste Dunnett T3. A correlação entre os escores

12

histológicos e as concentrações de citocinas foi analisada através de variáveis numéricas

quantitativas pelo coeficiente de correlação Spearman rank. O nível de significância foi

estabelecido para valores de p < 0,05.

4- RESULTADOS

4.1- Estudo histopatológico

No grupo Controle atestou-se proporção núcleo:zimogênio de 1:2. Não foram

encontrados edema, necrose ou processo inflamatório (Figura 3). Nos grupos Simulação

(S/24hs e S/72h) identificaram-se lesões pancreáticas leves, com presença de proporção

núcleo:zimogênio (1:1 ), leve infiltrado intersticial e edema bem como substituição mínima do

estroma por tecido conjuntivo, (Figuras 4 e 5). Já os grupos 4 (Figuras 6 e 7) e 5 (Figuras 8 e

9), com 15 minutos de isquemia (15’/24hs e 15’/72hs) apresentaram pancreatite aguda com um

moderado aumento da proporção núcleo zimogênio (2:1), edema moderado com aumento dos

lóbulos e multiplicação das fendas dos espaços interlobulares, além de infiltrado

polimorfonuclear moderado, com estroma quase inaparente. Foi encontrada hemorragia em

dois casos do grupo 5 (15’/72hs) (Figuras 8 e 9). Os grupos 6 e 7, com 180 minutos de

isquemia (180’/24hs e 180’/72h), foram caracterizados por grande aumento da proporção

núcleo: zimogênio (principalmente 1:0, além de 2:1), e intenso edema e infiltrado inflamatório

(Figuras 10,11,12). A necrose (esteatonecrose) do parênquima com degranulação acentuada foi

encontrada somente em um caso do grupo 6 (Figura 13).

Ocorreu apoptose em cinco amostras no grupo 5 (15’/72h), em uma no grupo 6

(180’/24h) e em três no grupo 7 (180’/72h). Esta foi caracterizada pela presença, nas células

acinares, de núcleos condensados e pequenos, separados, por células intactas ao redor, por um

halo claro (Figura 14). Em dois ratos do grupo 7, foi encontrada a formação de complexos

tubulares.

Quando foi avaliado o escore histopatológico, houve diferença significante (p<0,05)

entre os grupos submetidos a isquemia quando comparados com os grupos Controle e

Simulação, porém não houve diferença entre os diferentes grupos submetidos à isquemia e

reperfusão.

14

Figura 3 – Fotomicrografia do grupo Controle (H&E 100X). Verifica-se a presença de proporção núcleo: zimogênio 1:2 (A), sem edema, necrose ou processo inflamatório.

Figura 4 – Fotomicrografia do grupo Simulação (S72h, H&E, 40X). Constatou-se mínima inflamação do interstício e leve infiltrado intersticial (A). Os aspectos encontrados foram semelhantes aos do grupo 2 (S24hs)

A

A

15

Figura 5 – Fotomicrografia do grupo Simulação (S72h, H&E, 400X). Detalhe da fotomicrografia anterior, com presença de mínima inflamação do interstício e degranulação mais difusa (1:1 difusamente) (A), maior número de fendas (grau 1) (B), leve infiltrado intersticial com substituição leve do estroma por tecido conjuntivo (C).

Figura 6 – Fotomicrografia do grupo 4 (15’/24h, H&E, 100X). Observou-se diminuição do zimogênio, causando pancreatite com infiltrado neutrofílico focal e aumento das fendas (A). Os achados foram semelhantes aos do grupo 5.

C

A

B

A

16

Figura 7 – Fotomicrografia do grupo 4 (15’/24h, H&E, 400X). Detalhe da diminuição do zimogênio (A), com infiltrado neutrofílico focal e aumento das fendas (B).

Figura 8 – Fotomicrografia do grupo 5 (15’/72h, H&E, 40X). Verificou-se a presença de hemorragia intersticial (A), diminuição dos ácinos (1:1 com áreas 2:1) (B), edema interlobular grau 2, sem apoptose.

A

B

A

B

17

Figura 9 – Fotomicrografia do grupo 5 (15’/72h, H&E, 400X). Detalhe da presença de hemorragia intersticial (A) e da diminuição dos ácinos (1:1 com áreas 2:1) (B).

Figura 10 – Fotomicrografia do grupo 6 (180’/24h, H&E, 40X). Constataram-se porção ácino:zimogênio 1:1 e em alguns pontos 2:1, necrose clássica de pancreatite caracterizada por esteatonecrose com leucócitos e infiltrado granulocítico (A). Houve redução do tamanho do lóbulo com aumento das fendas (grau 2) (B) .

A

B

A

B

18

Figura 11 – Fotomicrografia do grupo 6 (180’/24h, H&E, 400X). Detalhe da necrose clássica de pancreatite caracterizada por esteatonecrose com leucócitos e infiltrado granulocítico (A).

Figura 12 – Fotomicrografia do grupo 7 (180’/72h, H&E, 100X). Evidenciaram-se áreas de pancreatite (+) com pseudotúbulos, infiltrado intersticial leve e degranulação acentuada com apoptose (seta), entremeadas com área de parênquima normal (*). Os achados foram similares aos do grupo 6.

A

+

*

19

Figura 13 – Fotomicrografia do grupo 7 (180’/72h, HE, 400x). Detalhe da pancreatite com pseudotúbulos (A) e degranulação acentuada com apoptose (B). Figura 14. Resultado histopatológico, com avaliação do escore segundo Simsek - Spormann modificado. Houve diferença significante entre os grupos submetidos à isquemia quando comparados com os grupos Controle e Simulação. (* = diferença significante na comparação dos grupos 15/24h, 15/72h, 180/24h e 180/72h com os grupos Controle, Simulação 24h e 72h (p<0,05)

012345678

cont

role

S 24h

S 72h

15/2

4h15

/72h

180/

24h

180/

72h

Esc

ore

hist

opat

ológ

ico(

pts)

012345678

cont

role

S 24h

S 72h

15/2

4h15

/72h

180/

24h

180/

72h

Esc

ore

hist

opat

ológ

ico(

pts)

* * * *

A

B

20

4.2 - Análise laboratorial sérica

4.2.1- Amilase

A concentração de amilase elevou-se no grupo 6(180’/24h), o qual apresentou

diferença significante para os grupos Controle e Simulação 72 horas (S72 h) (Figura 15).

G= grupo; *p < 0,05

G= grupo; *p < 0,05 *G1 vs G6; *G3 vs G6

Figura 15- Box plot das concentrações da amilase sérica nos diferentes grupos experimentais. O box-plot separa os dados, por grupo, em quartis com o topo da caixa representando o percentil de 75% e a base, o percentil 25%. A linha dentro da caixa representa a mediana. Os limites da haste superior e inferior representam os valores máximo e mínimo. Houve elevação significante da concentração da amilase (*p < 0,05) no grupo 180’/24h, quando comparado aos grupos Controle e Simulação 72 horas (S72h).

G

*

5765556N =

180’/72h

180’/24h

15’/72h

15’/24h

S 72h

S 24h

controle

Am

ilase

(U

I/mL)

30

25

20

15

10

5

0

1,3

5765556N =

180’/72h

180’/24h

15’/72h

15’/24h

S 72h

S 24h

controle

Am

ilase

(U

I/mL)

30

25

20

15

10

5

0

1,3

*

G 1 2 3 4 5 6 7

21

4.2.2 - Proteina C reativa - PCR

As concentrações de PCR foram mais elevadas nas comparações entre os grupos 5

(15’/72hs) e 6 (180’/24hs) e os grupos Controle e Simulação (p < 0,05). Também se elevou no

grupo 7 (180’/72hs), apenas na confrontação com o grupo Controle (Figura 16).

Figura 16 - Box plot da concentração de proteína C reativa nos diversos grupos experimentais houve diferença significante (*p < 0,05) nas comparações dos grupos 15’/72h e 180’/24h versus os grupos Controle e S24 e S72 e também nas comparação do grupo 180’/72h versus o Controle (*p < 0,05).

6676666N =

180’/72h

180’/24h

15’/72h

15’/24h

S 72h

S 24h

controle

Pro

teín

a C

rea

tiva

(mg/

L)

5

4

3

2

1

0

1,2,3

1,2,3

1

6676666N =

180’/72h

180’/24h

15’/72h

15’/24h

S 72h

S 24h

controle

Pro

teín

a C

rea

tiva

(mg/

L)

5

4

3

2

1

0

1,2,3

1,2,3

1

*

*

*

G 1 2 3 4 5 6 7

22

4.2.3- Interleucina 1 beta (IL-1β)

As concentrações de IL-1β foram mais elevadas nas comparações entre os grupos 5

(15’/72hs), 6 (180’/24hs) e 7 (180’/72hs) com os grupos 1 (Controle) e 2 e 3 (S24h e S72h) (p

< 0,05). Também se elevaram no grupo 4 (15’/24h) apenas na confrontação com o grupo

Controle. Os grupos 5 e 7, com 72 horas de reperfusão (15’/72hs e 180’/72hs) apresentaram

diferenças significantes para o grupo 4 (15’/24hs). No grupo 7 (180’/72hs) obteve-se um

aumento significante dos níveis de IL-1β em comparação com o grupo 5 (15’/72hs). (Figura

17)

Figura 17 – Box plot da concentração de IL-1β nos diversos grupos experimentais. Houve diferença significante (*p < 0,05) nas comparações 15’/24h vs Controle; 15’/72h vs Controle, S24h, S72h e 15’/24h; 180’/24h vs Controle, S24h , S72h e 180’/72h vs Controle, S24h, S72h e 15’/24h e 15’/72h .

6675666N =

180’/72h

180’/24h

15’/72h

15’/24h

S72h

S 24h

controle

IL-1

β(p

g/m

L)

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

1

1,2

3,4

1,2,3

1,2,34,5

6675666N =

180’/72h

180’/24h

15’/72h

15’/24h

S72h

S 24h

controle

IL-1

β(p

g/m

L)

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

1

1,2

3,4

1,2,3

1,2,34,5

*

*

*

*

G 1 2 3 4 5 6 7

23

4.2.4 - Interleucina-6 (IL-6)

As concentrações de IL-6 foram mais elevadas nos grupos 6 e 7, com 180 minutos de

isquemia (180’/24hs e 180’/72hs) quando comparados aos grupos 1 e 2 (Controle e Simulação

24h). Também se elevaram no grupo 5 (15’/72h), apenas na comparação com o grupo

Controle. (Figura 18)

Figura 18 – Box plot da concentração de IL-6 nos diversos grupos experimentais. Houve elevação significante nas concentrações de IL-6 (*p < 0,05) no grupo 15’/72h quando comparado ao Controle. Também houve elevação significante nos grupos 180’/24h e 180’/72h quando comparados aos grupos C (Controle) e S24h (*p < 0,05).

1

1,2

1,2

7676576N =

180’/72h

180’/'24h

15’/72h

15’/24h

S 72h

S 24h

controle

IL-6

(pg

/mL)

4000

3000

2000

1000

0

1

1,2

1,2

7676576N =

180’/72h

180’/'24h

15’/72h

15’/24h

S 72h

S 24h

controle

IL-6

(pg

/mL)

4000

3000

2000

1000

0

*

*

*

G 1 2 3 4 5 6 7

24

4.2.5 - Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)

As concentrações de TNF-α elevaram-se nas comparações entre os grupos 5 (15’/72h),

6 (180’/24h) e 7 (180’/72h) e os grupos 1 (Controle) e 2 e 3 (S24h e S72h). Também se

elevaram no grupo 4 (15’/24h), apenas na confrontação com o grupo 1 (Controle). Os grupos 5

e 7, com 72 horas de reperfusão (15’/72hs e 180’/72hs) apresentaram diferenças significantes

para o grupo 4 (15’/24hs). No grupo 7 (180’/72hs) observou-se, ainda, aumento significante do

TNF-α em comparação com o grupo 6 (15’/72hs). (Figura 19)

Figura 19 – Box plot da concentração de TNF-α nos diversos grupos experimentais. Ocorreu elevação significante do TNF α (*p < 0,05) nos grupos 15’/24h, quando comparados ao Controle. Houve elevação significante (*p < 0,05) no grupo 15’/72h quando comparado aos grupos Controle, Simulação (24h e 72h) e 15’/24h. Da mesma forma houve elevação significante (*p < 0,05) no grupo 180’/24h quando comparado aos grupos Controle e Simulação (24h e 72h) e no grupo 180’/72h quando comparado aos grupos Controle, Simulação (24h e 72h) e 15minutos (15’/24h e 15’/72h).

7654321G

180’/72h

180’/24h

15’/72h

15’/24h

S 72h

S 24h

controle

TN

F-α

(pg/

mL)

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

1

1,2

3,4

1,2,3

1,2,34,5

7654321G

180’/72h

180’/24h

15’/72h

15’/24h

S 72h

S 24h

controle

TN

F-α

(pg/

mL)

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

7654321G

180’/72h

180’/24h

15’/72h

15’/24h

S 72h

S 24h

controle

TN

F-α

(pg/

mL)

1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

1

1,2

3,4

1,2,3

1,2,34,5

*

*

*

*

5.DISCUSSÃO A pancreatite aguda é definida pela presença de uma inflamação que ocorre no

pâncreas e que pode afetar tanto órgãos a distância, como também órgãos adjacentes39,40.

Os modelos cirúrgicos de pancreatite aguda foram, em sua maioria, desenvolvidos na

segunda metade do século XX e utilizavam animais maiores e mais dispendiosos, dificultando

sua reprodução26. Obviamente, um grande número de modelos animais já foram utilizados,

mas um modelo ideal deveria ser facilmente reprodutível e capaz de induzir graus diferentes

de pancreatite aguda, proporcional à intensidade do estímulo, de acordo com os objetivos do

experimento10,26,28,29,41, 43,49. Todavia, este modelo experimental ainda não existe, em face da

pouca uniformidade das amostras para um estudo comparativo e da heterogeneidade dos

resultados obtidos, por diversos autores26,41,42,46,47.

Vários modelos de pancreatite causada por desordens vasculares e ou I/R já foram

realizados: injeção de microesferas intravasculares, oclusão de capilares ou trombose de veias

pancreáticas combinada ou não com ligaduras dos ductos pancreáticos, oclusão de artéria

gastrointestinal combinada com administração de secretina, choque hipovolêmico causando

hipoperfusão pancreática, clampeamento das artérias pancreáticas seguida de reperfusão e

clampeamento da artéria pancreática inferior seguida de reperfusão26,28.

Existem outros modelos experimentais de pancreatite que promovem o processo

inflamatório, tais como: uso de secretagogos, ativadores do processo imune, através da

ligadura ductal biliopancreática, da administração intraductal pancreática de taurocolato de

sódio, álcool, ou ceruleína e de outros análogos da colecistoquinina, ou procedimentos

combinados. Contudo, tais modelos utilizam outras técnicas e que não se adéquam a um

estudo comparativo com a I/R pancreática, avaliada na presente pesquisa10,26,46. Além disto, a

maioria destas pesquisas resulta em pancreatite grave, com necrose e hemorragia, e a ausência

da previsibilidade do desfecho e reprodutibilidade das lesões, ou seja, sem modulação da

intensidade do dano, e portanto, representariam condições que não nos interessavam estudar.

Na presente dissertação, objetivou-se utilizar um modelo de pancreatite aguda reprodutível,

que simulasse o processo patológico da pancreatite aguda em seres humanos e que fosse capaz

de causar o menor grau de lesão em outras vísceras, minimizando o viés do experimento. A

I/R parcial agiu como única variável causal da lesão pancreática. Assim, o rato Wistar SPF foi

26

escolhido pelo seu porte, facilidade no manuseio, uniformidade da amostra, menor

susceptibilidade à infecção, baixo custo para criação e manutenção26,42.

Estudos experimentais mostraram que a lesão por isquemia-reperfusão (I/R) é,

isoladamente, capaz de desencadear pancreatite aguda no rato e, entre os diversos modelos

descritos na literatura, representa aquele em que a intensidade do estímulo, ou seja, o tempo de

isquemia, parece melhor estar relacionado a um maior dano pancreático26,42,44. Sabe-se,

também, que a reperfusão é mais danosa para o parênquima pancreático do que a isquemia,

apesar de alguns pesquisadores relatarem que a vasodilatação e o estímulo a um maior fluxo

sanguíneo para o pâncreas poderiam inibir os efeitos das lesões isquêmicas43,50.

Spormann e colaboradores demonstraram que períodos variados de isquemia (10 a 30

minutos), com clampeamento das artérias celíacas e da artéria mesentérica superior dos ratos,

poderiam produzir pancreatite mais severa, mas, devido a variações individuais do suprimento

sanguíneo pancreático e de diferente tolerância à isquemia, os desfechos são pouco

uniformes51. Modelos com oclusão do tronco celíaco ou múltiplas artérias, além de

ocasionarem isquemia total desta víscera podem comprometer a vascularização do fígado, do

estômago e do intestino delgado45. Modelos de isquemia total, em geral, são utilizados em

experimentos nos quais se procura reproduzir uma situação semelhante ao transplante de

pâncreas, ainda que enfoquem a relevância da reperfusão, diferem do objetivo do presente

estudo45, no qual se efetuou um modelo de isquemia e reperfusão seletiva não traumático, em

ratos. Esta foi comprovada através da inspeção, após o clampeamento do ramo arterial

pancreático principal, haja vista o aparecimento de uma área isquêmica no corpo e cauda do

pâncreas e também no baço, caracterizada por uma coloração vinhosa em contraste com a

coloração avermelhada compatível com uma perfusão normal28. Após a reperfusão, os tecidos

isquemiados retornaram a uma coloração compatível com a normalidade.

Em 2000, Tomaszewska e colaboradores descreveram, em ratos, um modelo de

pancreatite aguda de causa vascular mediante isquemia da artéria esplênica caudal por 30

minutos e observou a evolução em diferentes períodos, de uma hora até 28 dias, após a

reperfusão. Em suas conclusões, correlacionou o processo inflamatório com o desarranjo

funcional, representado pela elevação da amilase e da IL 1β44. Estes resultados vêm ao

encontro do que foi obtido, na Dissertação atual.

27

Alguns autores correlacionaram o tempo de isquemia com a gravidade das lesões

histológicas, mas geralmente o método compreendeu isquemias pancreáticas totais (Obermaier

e Renteria45,52). As diferenças no modelo experimental não permitem comparações uniformes

com o estudo empreendido nesta Dissertação.

Os resultados histopatológicos revelaram que o modelo causou dano nos grupos 4,5 ,6 e

7, ou seja, em todos animais submetidos à isquemia e reperfusão. Também foi constatado, a

priori, o agravamento das lesões pancreáticas com relação aos tempos de isquemia e de

reperfusão. Houve uma aparente piora da pancreatite nos grupos com 180 minutos se

comparado àqueles com 15 minutos de isquemia, bem como nos de 72 horas de reperfusão se

comparado as de 24 horas. Entretanto, a análise estatística não aferiu diferenças significantes

quanto aos parâmetros analisados comparativamente e deste modo, apenas se pode asseverar

que as lesões foram compatíveis com um processo pancreático agudo edematoso. Foram,

ainda, encontradas diminuição da proporção ácino: zimogênio, ou seja, uma redução da

liberação de zimogênio pelos ácinos; além do aumento da lobulação do tecido pancreático,

causado pela dissociação dos ácinos; e formação de complexos tubulares ou pseudotúbulos.

Esta formação de complexos tubulares demonstra lesão importante dos ácinos e são

caracterizados pela ausência de zimogênio no seu interior.

Dembiski e colaboradores, em um modelo de isquemia-reperfusão com clampeamento

da artéria pancreática inferior, por 30 minutos características morfológicas de dano

pancreático, tais como edema, vacuolização e necrose tiveram maior intensidade após um dia

de reperfusão. Hemorragia e infiltração inflamatória leucocitária tiveram maior expressão após

dois dias de reperfusão. Após três dias de reperfusão, os sinais histológicos de dano

pancreático apresentaram uma tendência à redução. Quarenta e oito horas após a reperfusão

houve a formação de complexos tubulares28,53. O grau máximo de necrose acinar foi

encontrado entre o 12 horas e o segundo dia de reperfusão. Em nossa pesquisa os achados

foram muito semelhantes, mas a presença de necrose ocorreu isoladamente com 72 horas, e em

apenas dois ratos do grupo 7 (180’/72h). Encontramos necrose de gordura em somente três

casos (grupos 180’/24hs e 180’/72hs). De acordo com Samuel e colaboradores, ao estudarem

pancreatite aguda em ratos e marsupiais não encontraram necrose de gordura em pâncreas nos

ratos, tendo concluído que tal fato se devia à pouca quantidade de tecido adiposo peri-

pancreático, nos ratos54.

28

Fujimoto, em um estudo em que realizou uma oclusão da artéria esplênica inferior por

60 minutos, encontrou, após 48hs de reperfusão, a presença de células acinares com núcleo

condensado e pequeno, separados de células intactas por um halo claro ao redor, indicando

apoptose das células acinares28. Estas alterações histológicas foram atenuadas após 72hs de

reperfusão. Foi encontrada pouca evidência de necrose nestes espécimes28. Em consonância

com estes resultados, atestou-se apoptose em nove animais dos grupos submetidos à isquemia,

com maior abundância naqueles com 72 horas de reperfusão, o que pode indicar um dano

maior correlacionado ao tempo de reperfusão. Uma possível interpretação dos mecanismos

da apoptose seria o desencadeamento desta pela liberação de radicais livres derivados do

oxigênio e de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α e IL-1β e que podem contribuir

para a lesão de reperfusão28.

Embora não se tenha obtido, após a análise histopatológica, diferenças significativas

entre os tempos estudados para a isquemia (15 e 180 minutos) e reperfusão (24 e 72 horas) ,

encontraram-se achados indicativos de um maior grau de lesão tecidual nos grupos com maior

tempo de isquemia e de reperfusão. Provavelmente, uma amostra maior consolidaria este viés

de gravidade da lesão pancreática. Enfatiza-se que a grande maioria dos modelos de pancreatite

aguda, mesmo em ratos, não aprofunda a análise da fisiopatologia da isquemia e reperfusão, na

pancreatite aguda.

O mecanismo fisiopatológico da pancreatite aguda ainda requer esclarecimentos,

mormente por não se conhecer de forma precisa, as razões que geram o processo inflamatório

pancreático e também determinam uma evolução para quadro mais grave. Na última década e

meia, os autores têm dedicado uma maior atenção ao papel exercido pelas citocinas pró-

inflamatórias na fisiopatologia da pancreatite, mas com pouca ênfase em modelos específico de

I/R1,3,9,11. Analisaram-se alguns marcadores já consagrados, porém com sensibilidade e

especificidade variável e imprecisão quanto às ações relacionadas ao processo de isquemia e

reperfusão.

A concentração sérica de amilase é amplamente reconhecida como marcador

diagnóstico da pancreatite aguda, ainda que não seja específica. A dosagem da amilase é

utilizada como rotina, na suspeição clínica de pancreatite aguda e sua elevação auxilia, na

investigação diagnóstica.24 Em ratos, a elevação precoce da amilase sérica aliada aos achados

histopatológicos representam parâmetros úteis para validação de um modelo de pancreatite

29

aguda.44 No estudo apresentado constatou-se elevação significante da amilase no grupo 6

(180’/24h) quando comparada ao resultado obtido nos grupos Controle (p=0,017) e Simulação

com 72 horas de reperfusão (S72h, p=0,017 ). É digno de nota que, no grupo 4 (15’24h),

apesar da ausência de diferença significante (p=0,187) com os demais grupos, observou-se

uma tendência ao aumento das concentrações de amilase, e que não pode ser comprovada, em

face do desvio padrão grande. Os resultados encontrados nos grupos 5 e 7, nos quais o óbito e

a dosagem ocorreram com 72h após o clampeamento, não diferiram daqueles dos grupos

Controle e Simulação, mas também se observou uma tendência a redução dos valores,

compatível com os aspectos laboratoriais desta enzima, encontrados em anima nobile. Assim,

apesar dos dados obtidos com esta enzima não serem novos, foram úteis para validar o modelo

de pancreatite aguda, ainda que não pudesse se correlacionar, especificamente, ao tempo de

isquemia ou ao intervalo de reperfusão.

Em modelo de reperfusão, em ratos, Tomaszewska e Dembinski, realizaram isquemia

pancreática por 30 minutos, através do clampeamento da artéria esplênica e encontraram

aumento de amilase sérica 12 horas após a reperfusão, com um pico de atividade após 24

horas, e que se manteve elevado até três dias após o desenvolvimento de pancreatite25,44. Os

resultados encontrados na presente Dissertação se assemelham aos destes autores, pois, o

intervalo de 24 horas, de fato, esteve relacionado às maiores elevações na concentração da

amilase. Apesar dos estudos demonstrarem, com freqüência este aumento da amilase em fases

precoces da pancreatite aguda, há resultados conflitantes. Fujimoto, em um modelo de

pancreatite de isquemia e reperfusão (isquemia de 60 minutos) em ratos, não observou um

aumento significante na atividade da amilase sérica. Porém, este autor atribuiu o resultado ao

clampeamento da artéria esplênica inferior e que comprometeu apenas 30% de todo o

parênquima pancreático28,

A proteína C reativa (PCR) é um reagente de fase aguda de processos inflamatórios

viscerais ou orgânicos. As concentrações de PCR tiveram diferença significativa nos grupos 5

(15’/72h) e 6 (180’/24h), quando comparadas àquelas dos grupos Controle e Simulação (p <

0,05). Também se elevou no grupo 7 (180’/72h), apenas na confrontação com o grupo

Controle. Tal resultado não teve correlação com os diferentes graus de isquemia e reperfusão

neste modelo experimental. Isto pode ser explicado pelo fato de não encontrarmos um grau

importante de necrose em nosso estudo, haja vista a proteína C reativa ser conhecida como

30

marcadora de gravidade, com expressão maior na necrose pancreática20,55-58. Esta enzima

também serviu para sinalizar que a presença de pancreatite aguda ocorreu em função de

períodos maiores de isquemia e de reperfusão, o que significa que não atuaria como um

marcador precoce desta afecção.

As citocinas são proteínas de baixo peso molecular produzidas durante a inflamação e

ou o estresse oxidativo. Os leucócitos ativados, componentes essenciais da cascata

inflamatória, são a principal fonte de citocinas3,36,59,60. A pancreatite aguda é caracterizada,

inicialmente, por edema intersticial com migração de macrófagos e neutrófilos para o tecido

pancreático. Este recrutamento leucocitário começa com adesão dos leucócitos circulantes ao

endotélio. Os macrófagos ativados liberam citocinas pró-inflamatórias, como IL-1, IL-6 e

TNF- α, em resposta ao dano pancreático local36,37,60. Neste contexto participam, também as

espécies reativas do oxigênio, geradas não só pelos polimorfonucleares que atuam no próprio

processo inflamatório, mas pela presença de mecanismos relacionados à isquemia e

reperfusão28,61.

A produção de IL-1β na pancreatite aguda é tanto pancreática quanto extra-pancreática,

e também induz a liberação de outras citocinas, a exemplo da IL-2 e moléculas de adesão

celular36,37. Existe uma correlação entre a produção de IL-1β e seus receptores específicos e a

severidade da pancreatite aguda. Quando o receptor de IL-1β é bloqueado durante a

pancreatite experimental, a inflamação e o dano pancreático e pulmonar são atenuados e a

sobrevida é aumentada; a pancreatite experimental é menos grave e a lesão pulmonar associada

e a mortalidade é diminuída34.

Na presente Dissertação, as concentrações de IL-1β foram mais elevadas nas

comparações entre os grupos 5 (15’/72hs), 6 (180’/24hs) e 7 (180’/72hs) com os grupos 1

(Controle) e 2 e 3 (S24h e S72h), com uma correlação ao maior tempo de isquemia e

reperfusão no tecido pancreático. Tomaszewska e Dembinski encontraram um aumento

máximo de IL-1β 24hs após reperfusão, com uma subsequente diminuição deste parâmetro até

o 28º dia, em que sua concentração estava ainda significativamente maior que o controle27,44.

Dembiski observou que após a fase aguda de pancreatite, após o segundo dia de reperfusão,

houve uma redução do dano pancreático e início do reparo pancreático. Isto foi expresso pela

diminuição da amilase plasmática e IL-1β e pelo aumento do fluxo pancreático e síntese de

DNA28,53. Observou-se, nos grupos experimentais, um aumento da concentração desta citocina,

31

nas primeiras 72 horas, muito embora esta elevação estivesse correlacionada, principalmente,

ao tempo de isquemia e não ao período de reperfusão.

A IL-6 é um indutor primário da produção hepática de proteínas da fase aguda e

produzida em uma grande variedade de células inclusive monócitos, macrófagos, endotélio e

músculo liso36. Concentrações séricas de IL-6 estão relacionadas com a gravidade da doença

em pacientes com pancreatite aguda, em especial nos primeiros dias de hospitalização, com

uma sensibilidade de 89 a 100%36,37,62. Segundo alguns autores, a IL-6 aumentaria

precocemente e poderia ser um marcador mais sensível de gravidade do que a proteína C

reativa36,37. Yonetci e colaboradores, em um modelo experimental em ratos, utilizando

taurocolato de sódio no ducto pancreático principal e injeção de ceruleína subcutânea, revelam

a correlação entre IL-6 sérica e a gravidade da pancreatite22. Zhou e colaboradores, em um

modelo em camundongos, observaram um aumento de IL-6 após 2 horas de indução de

pancreatite com ceruleína, com um pico em 4 horas9. Não obstante a elevação da IL-6 nos

grupos 6 e 7, com 180 minutos de isquemia, esta variação não se deu na comparação com o

grupo Simulação 72h. Assim, não foi possível atribuir a esta citocina um papel efetivo de

marcador da pancreatite aguda, mesmo no que tange aos aspectos da gravidade da mesma.

A TNF-α é uma citocina pró-inflamatória sintetizada pelos leucócitos, mas também por

células acinares no tecido pancreático36,37,60. Causa vasodilatação, aumenta a permeabilidade

microvascular, ativa os leucócitos, induz a liberação de outras citocinas e a expressão de

moléculas de adesão celular, promove a síntese do óxido nítrico, além de ocasionar alterações

relevantes da hemostasia com efeitos tornando pró-coagulante e pró-adesivo63. Experimentos

in vivo e in vitro sugerem que o TNF-α exerce um papel de gatilho, no agravamento da

pancreatite aguda, levando ao dano de órgãos extra ou peri-pancreáticos e também pode

induzir a produção e liberação de vários outros tipos de citocinas, com consequentes efeitos

deletérios diretos e indiretos para as células8. Concentrações de TNF-α no soro aumentam após

a indução de pancreatite aguda grave36,37. O TNF-α pode contribuir para a gravidade da

pancreatite pela indução de apoptose nas células acinares36,37,60, além de intensificar o estresse

oxidativo através da conversão da xantina desidrogenase em xantina oxidase, substrato

essencial para o estresse oxidativo que, junto com outras citocinas e espécies reativas ao

oxigênio.

32

As concentrações de TNF-α elevaram-se nas comparações entre os grupos 5 (15’/72h),

6 (180’/24h) e 7 (180’/72h) e os grupos 1 (Controle) e 2 e 3 (S24h e S72h). Também se

elevaram no grupo 4 (15’/24h), apenas na confrontação com o grupo 1 (Controle). Os grupos 5

e 7, com 72 horas de reperfusão (15’/72hs e 180’/72hs) apresentaram diferenças significantes

para o grupo 4 (15’/24hs). No grupo 7 (180’/72hs) observou-se, ainda, aumento significante do

TNF-α em comparação com o grupo 6 (15’/72hs), tal resultado no tecido pancreático

demonstrou que seus níveis são mais significantes nos grupos com 180 minutos de isquemia.

Esta liberação de citocinas poderia estar associada à resposta inflamatória sistêmica, conforme

postulam Gómez-Cambonero e colaboradores36. As concentrações do TNF-α e da IL-1β foram semelhantes, corroborando os achados

descritos por Norman60 e que aventou a hipótese de que estes mediadores seriam liberados

pelo infiltrado inflamatório do tecido pancreático, após maior tempo de isquemia. Este mesmo

autor, concluíu que as expressões de IL-1β e TNF-α coincidem com o desenvolvimento de

hiperamilasemia e com as evidências histológicas de pancreatite.

Coelho e colaboradores, em modelo de pancreatite aguda, utilizando taurocolato de

sódio no ducto pancreático principal em ratos, evidenciaram aumento de TNF-α, IL-6 e IL-10

no tecido pancreático, quando comparado com o controle7. Em nosso estudo, a IL-1β, TNF-α

se revelaram marcadores de isquemia e reperfusão no pâncreas, cujas liberações estiveram

associadas a um tempo maior de isquemia e também de reperfusão, no tecido pancreático,

condições estas deletérias para o quadro de pancreatite aguda. Ressalta-se que a ausência de

diferenças significantes na análise histopatológica entre os grupos com I/R não permite aferir a

correlação destes mediadores com a gravidade da lesão no pâncreas.

Considerando que o mecanismo de isquemia e reperfusão está relacionado à pancreatite

aguda e pode ser determinante para a intensidade do processo inflamatório, a dosagem destas

citocinas e sua correlação com os diferentes tempos de isquemia e reperfusão poderia ser útil

para um diagnóstico precoce ou para o prognóstico nos pacientes acometidos por esta doença.

Por suposto, para modificação da conduta terapêutica, com adoção de diferentes medidas para

se diminuir o dano pancreático, como hiper-hidratação, uso de drogas anti-oxidantes ou uso de

inibidores de citocinas. Os estudos por nós realizados em ratos, não determinaram uma

associação direta com a gravidade da doença, mas indicaram a possibilidade de se aventar que

a pancreatite decorreu de lesões isquêmicas ou de reperfusão mais prolongadas.

33

Dentre as perspectivas futuras, alguns autores sugerem aprofundar a investigação nas

lesões causadas por reperfusão com o uso de marcadores de estresse oxidativo, tais como

mieloperoxidase, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e proteína carbonilada. e suas

correlações com a precocidade e gravidade da doença2. Conjectura-se que os oxirradicais

seriam os maiores responsáveis pelo dano acinar, e pela ativação intracelular de proteases

teciduais.

6. CONCLUSÕES

A IL-1β e o TNF-α atuaram como marcadores de exposição à isquemia e reperfusão na

pancreatite aguda branda, no modelo experimental em ratos e a expressão mais acentuada

destas citocinas se correlacionou a agressão causada pela isquemia e reperfusão mais

prolongadas.

A IL-6, em ratos, não atuou como um marcador confiável na identificação da

pancreatite aguda causada por isquemia e reperfusão.

7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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8.ANEXOS

Anexo 1 A parte pré-textual desta Tese seguiu resolução específica do Conselho de Ensino para

Graduados e Pesquisa (CEPG), da Universidade Federal do Rio de Janeiro, no 02/2002. A parte textual seguiu as normas da ABNT. As referências bibliográficas foram baseadas nas diretrizes de Vancouver.

42

Anexo 2

9. APÊNDICES Apêndice 1

CLASSIFICAÇÃO DE SIMSEK E SPORMANN MODIFICADA

1) EDEMA Ausente (0) Leve (1) Moderado (2) Grave (3) 2) INFILTRAÇÃO INFLAMATÓRIA Ausente (0) Leve (1) Moderado (2) Grave (3) 3) NECROSE DE GORDURA Ausente (0) Presente (1) 4) NECROSE DE PARÊNQUIMA Ausente (0) Presente (1) 5) HEMORRAGIA Ausente (0) Presente (1) 6) PROPORÇÃO NÚCLEO: ZIMOGËNIO (DEGRANULAÇÃO DE ZIM OGÊNIO) 1:2 – NORMAL(0) 1:1 – LEVE (1) 2:1 – MODERADA (2) 1:0 – GRAVE (3)

44

Apêndice 2

APURAÇÃO DOS PARÂMETROS HISTOPATOLÓGICOS DEGRANULA-

ÇÃO DO ZIMOGÊNIO

EDE-MA

INFILTRADO INFLAMATÓ-RIO

NECRO-SE DE GORDU-RA

NECROSE DE PARÊNQUIMA

HEMORRA-GIA

TO-TAL

CONTROLE 76

0

77

0

79

0

45

0

29

0

78

0

21

0

S24h 19

1 1 2

28

1 1

42

1 1 2

44

1 1 2

53

1 1 2

54

0

59

1 1 2

68

1 1 2

S72h 49

1 1

50

1 1

48

1 1 2

32

1 1 1 3

24

1 1 2

17

3 3

33

1 1 2

16

1 1 2 1 5

15´/24h 80

1 2 2 5

72

1 2 2 5

71

1 2 2 5

43

1 2 2 5

67

1 2 2 5

36

2 1 3

45

35

2 1 3

27

2 2 4

15´/72h 66

2 2 1 5

65

2 2 1 5

64

1 1 2

23

1 2 1 4

38

1 2 2 5

62

3 2 5

63

3 1 4

56

2 2 1 5

180´/24h 18

2 2 2 1 1 8

51

1 3 4

52

2 3 5

58

1 3 1 5

60

1 3 4

34

3 1 4

75

1 1 2

74

2 3 1 6

180`/72h 30

1 1 2

46

1 2 3

55

3 3 3 9

61

1 1 2 4

69

3 3 2 8

31

1 2 1 4

47

3 3 1 7

70

3 1 2 6

46

Apêndice 2

RESULTADOS INDIVIDUAIS DOS PARÂMETROS LABORATORIAIS EM CADA GRUPO

Grupos tnf il-1 ß histo amilase pcr il-6 tnf il-1 ß histo amilase pcr il-6C 32,81 11,77 1,00 771,00 0,20 156,0 Média 34,26 19,84 0,33 830,43 0,20 254,8C 38,95 6,42 1,00 796,00 0,35 514,0 Mediana 35,88 16,57 0,00 796,00 0,20 212,50C 23,86 18,82 0,00 1111,00 0,30 269,0 Desvio Padrão 16,25 14,91 0,52 142,48 0,10 177,78C 9,43 16,00 0,00 678,00 0,10 130,0C 55,72 48,89 0,00 720,00 0,15 409,0C 44,79 17,14 0,00 873,00 0,20 51,0C 864,00 0,10C

S24 58,27 4,72 1,00 1068,00 0,30 168,0 Média 95,91 32,57 0,86 2550,86 0,26 433,43S24 88,57 37,83 1,00 864,00 0,20 1100,0 Mediana 87,64 37,81 1,00 1145,00 0,25 313,00S24 87,64 2,56 1,00 1145,00 0,20 313,0 Desvio Padrão 38,51 26,01 0,69 3940,48 0,08 361,24S24 152,20 37,78 1,00 1187,00 0,25 176,0S24 146,89 39,99 0,00 1399,00 0,30 369,0S24 60,78 72,52 0,00 720,00 0,15 756,0S24 76,99 2,00 11473,00 0,40 152,0S24S72 74,78 99,85 1,00 1102,00 0,25 888,0 Média 80,27 59,58 1,57 841,83 0,21 613,80S72 44,10 40,88 1,00 746,00 0,20 427,0 Mediana 79,15 54,65 1,00 822,00 0,18 538,00S72 83,51 60,29 2,00 678,00 0,15 766,0 Desvio Padrão 40,84 25,98 0,79 148,03 0,11 203,61S72 152,63 28,99 3,00 864,00 0,15 538,0S72 87,55 49,01 2,00 780,00 0,10 450,0S72 39,02 78,44 1,00 881,00 0,40S72 1,00S72

15'24h 123,86 20,78 5,00 8393,00 0,20 1000,0 Média 155,03 36,09 4,14 7936,67 0,23 1585,6715'24h 75,60 20,72 5,00 33852,00 0,15 Mediana 136,93 20,78 5,00 1564,00 0,20 1350,0015'24h 127,18 55,01 5,00 1967,00 0,15 1840,0 Desvio Padrão 64,17 21,87 1,46 13009,22 0,08 766,5815'24h 107,24 19,43 5,00 1161,00 0,35 3000,015'24h 206,60 64,50 5,00 1102,00 0,2015'24h 279,11 2,00 1145,00 0,30 974,015'24h 146,68 2,00 1200,015'24h 173,96 1500,015'72h 254,44 171,96 5,00 1467,00 0,15 3202,0 Média 351,51 122,65 4,86 1053,57 0,29 1910,2915'72h 61,52 5,00 924,00 0,30 Mediana 378,30 117,55 5,00 1119,00 0,30 1517,0015'72h 153,59 161,64 4,00 1119,00 0,30 2100,0 Desvio Padrão 165,12 39,12 1,21 249,31 0,07 1032,5815'72h 370,88 162,34 5,00 873,00 0,35 1517,015'72h 378,30 76,94 5,00 695,00 0,3015'72h 501,58 102,88 7,00 1119,00 0,35 1300,015'72h 425,64 89,03 3,00 1178,00 0,30 1000,015'72h 567,24 132,22 3400,015'72h 450,42 84,16 853,0180'24h 277,42 177,67 9,00 17160,00 0,20 1537,0 Média 637,86 282,90 5,50 3760,71 0,31 1520,67180'24h 776,94 260,26 4,00 975,00 0,30 2015,0 Mediana 721,02 248,97 5,00 1704,00 0,30 1373,00180'24h 721,02 176,15 6,00 1704,00 0,45 Desvio Padrão 306,91 116,48 1,87 5919,26 0,08 558,76180'24h 1093,73 465,61 5,00 1560,00 0,30 2351,0180'24h 852,38 237,68 4,00 1145,00 0,35 1012,0180'24h 454,01 380,00 5,00 1975,00 0,30 1000,0180'24h 289,53 1806,00 0,25 1209,0180'24h180'72h 617,60 1394,14 6,00 898,00 0,15 2524,0 Média 882,44 651,15 6,00 843,25 0,23 2056,57180'72h 1158,92 483,06 3,00 873,00 0,25 1140,0 Mediana 788,73 496,10 6,00 885,50 0,25 1889,00180'72h 545,30 436,63 9,00 1043,00 0,25 Desvio Padrão 326,40 374,52 2,28 288,84 0,05 965,26180'72h 650,57 666,48 4,00 1026,00 0,15 3489,0180'72h 926,89 417,44 8,00 1161,00 0,30 2987,0180'72h 1442,41 509,13 6,00 839,00 0,25 1008,0180'72h 1098,77 228,00 0,25 1889,0180'72h 619,02 678,00 0,25 1359,0