CITOCINAS NA PANCREATITE AGUDA CAUSADA POR ISQUEMIA ...

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Universidade Federal do Rio de Janeiro CITOCINAS NA PANCREATITE AGUDA CAUSADA POR ISQUEMIA-REPERFUSÃO EM RATOS Simone de Oliveira Coelho 2011
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tese 05 JAN 2012CITOCINAS NA PANCREATITE AGUDA CAUSADA POR ISQUEMIA-REPERFUSÃO EM RATOS
Simone de Oliveira Coelho
Simone de Oliveira Coelho
Cirúrgicas, da Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre
em Medicina (Ciências Cirúrgicas)
Orientadores: Professor Alberto Schanaider
Professor Juan Miguel Renteria
CITOCINAS NA PANCREATITE AGUDA CAUSADA POR ISQUEMIA-REPERFUSÃO EM RATOS
Simone de Oliveira Coelho
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Cirúrgicas, da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ,
como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Cirúrgicas.
Aprovada por: ____________________________________ Presidente, Prof. ____________________________________ Prof. ____________________________________ Prof.
Rio de Janeiro Dezembro - 2011
Coelho, Simone de Oliveira
Citocinas na pancreatite aguda causada por isquemia-reperfusão em ratos / Simone de Oliveira Coelho. -- Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2011.
xii, 46 f. : il. ; 31 cm. Orientadores: Alberto Schanaider e Juan Miguel Renteria
Dissertação (mestrado) – UFRJ / Faculdade de Medicina / Programa de Pós-graduação em Medicina, Ciências Cirúrgicas, 2011.
Referências bibliográficas: f. 35-40. 1. Traumatismo por Reperfusão . 2. Pancreatite - fisiopatologia. 3. Citocinas. 4. Ratos Wistar . 5. Ciências Cirúrgicas - Tese. I. Schanaider, Alberto. II. Renteria, Juan Miguel. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, FM, Programa de Pós-graduação em Medicina, Ciências Cirúrgicas. IV. Título.
RESUMO
CITOCINAS NA PANCREATITE AGUDA CAUSADA POR ISQUEMIA - REPERFUSÃO EM RATOS
Simone de Oliveira Coelho
Orientadores: Professor Alberto Schanaider Professor Juan Renteria
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Cirúrgicas, da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Medicina (Ciências Cirúrgicas). Introdução: A fisiopatologia da pancreatite aguda ainda gera controvérsias. A produção de citocinas pró-inflamatórias exerce um papel primordial, pois desencadeia o aparecimento de lesão tecidual pancreática. Porém, estes mediadores raramente são correlacionados com modelos de isquemia e reperfusão. Objetivo: Este estudo teve como objetivo investigar o papel das citocinas como marcadores inflamatórios da pancreatite aguda conseqüente a isquemia e reperfusão, em ratos. Métodos: Ratos Wistar (n=56) foram distribuídos, aleatoriamente, em sete grupos: Controle; Simulação 24h (dissecção da artéria esplênica e óbito após 24 horas); Simulação 72h (dissecção da artéria esplênica e óbito após 72 horas); Grupo 15’/24h (oclusão da artéria esplênica por 15 minutos com óbito após 24 horas); Grupo 15’/72h (oclusão da artéria esplênica por 15 minutos com óbito após 72 horas); Grupo 180’/24h (oclusão da artéria esplênica por 180 minutos com óbito após 24 horas) e Grupo 180’/72h (oclusão da artéria esplênica por 180 minutos com óbito após 72 horas). O tecido pancreático foi submetido a um estudo histopatológico. Foram mensuradas, no plasma, a amilase e a proteína C reativa (PCR). No sobrenadante de cultura do tecido pancreático efetuaram-se as dosagens do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), da interleucina 1 beta (IL- 1β) e da interleucina 6 (IL-6). Resultados: Em quase todos os animais, a isquemia produziu pancreatite aguda branda. Em relação à análise histopatológica, não houve diferença significante entre os grupos 24 e 72 horas de reperfusão, apesar de, isoladamente, o edema ter sido maior para os grupos com 180 minutos. As concentrações da amilase aumentaram nas primeiras 24 horas após isquemia de 180 minutos. O mesmo se observou quanto à proteína C reativa e a IL-6, que permaneceram elevadas por 72 horas, independente do tempo de isquemia. As concentrações de IL-1 e TNF-α foram maiores nos grupos com 180 minutos de isquemia e 72 horas de reperfusão. Conclusão: Em ratos, as concentrações da IL-1β e do TNF- α atuaram como marcadores da pancreatite aguda branda, principalmente quando induzida por tempos de isquemia e reperfusão mais prolongados.
Palavras-chave: Reperfusão, Citocinas, Pancreatite, Ratos
Rio de Janeiro
Simone de Oliveira Coelho
Orientadores: Professor Alberto Schanaider Professor Juan Renteria
Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Cirúrgicas, da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Medicina (Ciências Cirúrgicas). Introduction: The pathophysioly of acute pancreatitis is still controversial. Proinflammatory cytokines production plays an essential role triggering the development of pancreatic tissue injury but such mediators are rarely correlated with ischemic/reperfusion models. Objective: This study aimed to investigate the role of the cytokines as inflammatory mediators in ischemic-reperfusion acute pancreatitis in rats. Methods: Wistar rats (n=56) were randomly assigned to seven groups: Control; Sham 24hrs (splenic artery dissection only and death after 24hr); Group Sham 72hrs (artery dissection only with death after 72 hours); Group 15’/24hrs (ischemia of splenic artery for 15minutes with death after 24 hours); Group 15’/72hrs (ischemia of splenic artery for 15minutes with death after 72 hours); Group 180’/24hrs (ischemia of splenic artery for 180 minutes with death after 24hours; and Group 180’/72hrs (ischemia of splenic artery for 180 minutes with death after 24 hours). Amylase and C-reative protein were measured in plasma. Supernatant of pancreatic tissue culture was examined for tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 1β (IL-1 β) and interleukin 6 (IL-6). Histopathologic study was also performed. Results: The ischemic process produced mild acute pancreatitis in almost all animals submitted to ischemia. There was no statistical difference between 24 and 72 hours reperfusion time groups of animals. However, as an isolated finding, edema was greater in groups with 180 minutes of ischemia. Amylase levels were higher in the first 24 hours after 180 minutes of ischemia. The same result could be seen with C-reactive protein and IL-6 levels which remained high up to 72 hours of ischemia, IL-1 and TNF-α levels were also higher in both 180 minutes and 72 hours of reperfusion groups of rats. Conclusion: In rats IL-1 and TNF-α levels play a role as markers of mild acute pancreatitis, mainly for a longer ischemic and reperfusion time.
. Key-words: Reperfusion, Cytokines, Pancreatitis, Rats
Rio de Janeiro December - 2011
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Thales Penna de Carvalho, um amigo e companheiro de caminhada, sem
ele não teria finalizado esta Dissertação.
Agradeço ao Professor Alberto Schanaider, Titular do Departamento de Cirurgia
Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro e
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Cirúrgicas da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, por sua paciência e acolhimento como
orientador da minha dissertação de mestrado.
Agradeço ao Professor Juan Renteria, Adjunto do Departamento de Cirurgia da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pela orientação da minha
dissertação de mestrado.
Agradeço ao Professor Heitor Siffert Pereira de Souza, pelo importante auxílio e
incentivo no laboratório multidisciplinar de Pesquisa do Hospital Universitário Clementino
Fraga Filho. Agradeço a Alyson do Rosário Junior e Cesônia de Assis Martissuno, pelo
cuidado no preparo das peças cirúrgicas.
Agradeço a Professora Morgana Castello Branco, pelo incentivo e zelo, e pelo seu jeito
meigo no lidar com os alunos, além do auxilio na coleta, estudo e dosagem do material no
Laboratório de Imunologia Celular do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade
Federal do Rio de Janeiro.
Agradeço ao Professor Kalil Madi, pela avaliação histopatológica desta Dissertação e
pelo agradável almoço após um dia inteiro de trabalho.
Agradeço a todos do Serviço de Cirurgia Experimental, na ajuda, cuidado e trocas de
idéias, sem os quais não teria conseguido finalizar a dissertação de mestrado: Professor Paulo
César Silva, Professor Luiz Alfredo de Magalhães Vivas, Professor Manoel Luiz Ferreira,
Christiano Esposito, Lucas Cristo Conilo Miller, Camilo Abbud Aiex, Rubens Luiz Miranda e
Elmo Gaspar Marques.
Agradeço a Andrea Barbosa, do serviço de Anatomia Patológica da Clínica
Microimagem, pelas fotos das lâminas.
Agradeço a CAPES pelo financiamento para realização desta Dissertação de Mestrado.
Agradeço ao Professor Antonio Augusto Peixoto de Souza, chefe do Departamento de
Cirurgia Geral do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, pelo acolhimento dentro do
programa de Pós-graduação.
Agradeço aos Professores da Pós-Graduação pelos brilhantes ensinamentos, em
especial ao Professor Roberto Takashi Sudo, pelo intenso incentivo durante nosso projeto, e
Professor Joaquim Ribeiro Filho, que além de Professor, um verdadeiro membro da família.
Agradeço a Edson da Silva Salvador Junior, ex-residente de Cirurgia Geral do Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho, pelo apoio e ajuda no início do meu projeto de
Dissertação.
Agradeço a Professora Elis Cristina Araújo Eleutério, do Instituto de Química do
Centro de Tecnologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pelas explicações e ajuda nas
dosagens realizadas em seu laboratório.
Agradeço aos graduandos e pós-graduandos do Instituto de Química, em especial a
Aline de Araújo Brasil e Frederico Augusto Vieira de Castro, na ajuda em todas as etapas
realizadas no laboratório.
Agradeço aos meus colegas de trabalho, pela força e por compensar os vários
momentos em que estive ausente: Ricardo Vianna de Carvalho, Francisca Norma Girão
Guttierrez, Arovel Moura Junior, Deborah Chagas Nunes, Andréa Baptista, Ruy Nogueira,
Roberta Nolasco, Tânia Carla Cortez e Jandira Souza.
Agradeço ao meu ex-chefe, Alberto Ribeiro Gonçalves, onde quer que ele esteja, pelo
grande ensinamento de ética, profissionalismo e cuidado com os colegas.
Agradeço ao meu marido Alexandre de Oliveira, pela enorme paciência pelos meus
momentos de tristeza e ausência diante das dificuldades para finalizar a dissertação de
mestrado.
Agradeço aos meus filhos Ana Luiza e Luiz Guilherme, pela alegria de simplesmente
estarem vivos.
3.5 - Análise histopatológica .................................................................................................. 8
3.6 - Análise laboratorial sérica ............................................................................................. 8
3.7 - Preparo de cultura de tecidos e mensuração de citocinas .............................................. 9
3.8 - Análise estatística ........................................................................................................ 11
4.2.1 – Amilase ............................................................................................................. 20
4.2.4 - Interleucina 6 (IL-6) .......................................................................................... 23
4.2.5 - Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) .............................................................. 24
5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 25
6. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 34
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
APACHE - Avaliação fisiológica aguda e crônica da sáude (Acute Physiology and Chronic
Health Evaluation)
BISAP – Índice de gravidade da pancreatite aguda à beira do leito (Bedside Index for Severity
in Acute Pancreatitis)
C - grupo Controle
ELISA – Ensaio imuno absorvente ligado à enzima (enzyme-linked immunosorbent sensitive
assay)
IL-1β - interleucina 1 beta
PCR - proteína C reativa (protein chain reaction )
S - grupo Simulação
TNF-α - fator de necrose tumoral alfa (tumor necrosis factor alpha)
LISTAS DE FIGURAS
Figura 3 - Fotomicrografia do grupo Controle (HE 100X)............................................................. 14
Figura 4 - Fotomicrografia do grupo Simulação (S72h, HE, 40x).................................................. 14
Figura 5 - Fotomicrografia do grupo Simulação (S72h, HE, 400x)................................................ 15
Figura 6 - Fotomicrografia do grupo 4 (15’/24h, HE, 40x)............................................................ 15
Figura 7 - Fotomicrografia do grupo 4 (15’/24h, HE, 400x).......................................................... 16
Figura 8 - Fotomicrografia do grupo 5 (15’/72h, HE, 40x)............................................................ 16
Figura 9 - Fotomicrografia do grupo 5 (15’/72h, HE, 400x).......................................................... 17
Figura 10 - Fotomicrografia do grupo 6 (180’/24h, HE, 40x)........................................................ 17
Figura 11 - Fotomicrografia do grupo 6 (180’/24h, HE, 400x)...................................................... 18
Figura 12 - Fotomicrografia do grupo 7 (180’/72h, HE, 40x)........................................................ 18
Figura 13 - Fotomicrografia do grupo 7 (180’/72h, HE, 400x)...................................................... 19
Figura 14 - Resultado histopatológico, com avaliação do escore.................................................... 19
Figura 15- Box plot das concentrações da amilase nos diferentes grupos experimentais.................. 20
Figura 16- Box plot das concentrações da PtnC reativa nos diferentes grupos experimentais........... 21
Figura 17- Box plot das concentrações da IL1β nos diferentes grupos experimentais...................... 22
Figura 18- Box plot das concentrações da IL 6 nos diferentes grupos experimentais....................... 23
Figura 19- Box plot das concentrações do TNF α nos diferentes grupos experimentais................... 24
1- INTRODUÇÃO
A pancreatite aguda tem uma incidência anual de 5 a 80 casos por 100 mil pessoas1,2,3,4,
com uma mortalidade de 1 a 5 por 100mil pessoas2. Aproximadamente um terço dos pacientes
desenvolvem necrose pancreática, com uma mortalidade associada se aproximando de 30 por
cento2,3,4,5,6. Esta forma grave da doença é caracterizada por necrose pancreática, ativação de
citocinas, resposta inflamatória sistêmica e síndrome da falência de múltiplos órgãos2,7,8,9.
Apesar de novas ferramentas para o diagnóstico e o tratamento, esta afecção permanece com
altos índices de morbi-mortalidade10,11. O quadro clínico pode variar de uma apresentação leve
e autolimitada com recuperação de 80% dos pacientes, até quadros graves com necrose e ou
falência de múltiplos órgãos1,8,12,13,14,15. Um grande número de características clínicas e testes
de bioquímicos têm sido utilizados para determinar a gravidade da pancreatite aguda, a
exemplo daqueles encontrados na escala APACHE II (Avaliação fisiológica aguda e crônica da
sáude - The Acute Physiology and Chronic Health Evaluation), critério de Atlanta, escala de
Balthazar, escala de Ranson e mais recentemente o BISAP (Índice de gravidade da pancreatite
aguda à beira do leito - Bedside Index for Severity in Acute Pancreatitis), porém não há um
marcador laboratorial específico como fator preditivo da gravidade de pancreatite6,16-24. Nas
últimas décadas procurou-se desenvolver vários testes clínicos, bioquímicos e radiológicos,
isolados ou combinados em sistemas de pontuação, a fim de predizer a gravidade de um
episódio de pancreatite aguda e ou sua taxa de mortalidade6-11.
Os agentes etiológicos mais comuns da pancreatite aguda, que respondem por mais de
90% dos casos, são a doença litiásica biliar, a ingestão de álcool etílico e as dislipidemias,
dentre outros1, 6-11. A fisiopatologia envolve ativação precoce de tripsina no interior dos ácinos
que, por mecanismos ainda pouco esclarecidos, desencadeiam o processo inflamatório intra e
ou extrapancreático que culminará com o estabelecimento da pancreatite aguda1, 9.
O mecanismo de isquemia e reperfusão (I/R) tem sido pouco correlacionado à
pancreatite aguda, tanto como fator causal, como também nos processos fisiopatológicos de
pancreatites desencadeadas pelos mais diversos agentes etiológicos. O pâncreas é um órgão
susceptível a lesões por isquemia e reperfusão, e que podem ser desencadeadas após alterações
hemodinâmicas decorrentes da sepse ou da hipovolemia, do uso de aminas vasopressoras, de
cirurgias com clampeamento aórtico, portal ou do tronco celíaco, além do transplante
pancreático25,26.
2
A pancreatite aguda é um processo patológico dependente da autodigestão causada pela
ativação prematura de zimogênios a enzimas ativas. Alteração na perfusão deste órgão tem um
importante papel na fisiopatologia da pancreatite, quer seja nos quadros brandos, ou na
progressão para pancreatite necrotizante27. O processo isquêmico ou a hipoperfusão do
pâncreas induz à pancreatite aguda, com elevação de amilase, edema intersticial e infiltração
inflamatória celular25,27,28,30. Da mesma forma, graves lesões podem ser provocadas pela
reperfusão, através da ativação de leucócitos e a formação de radicais livres derivados do
oxigênio, concomitantemente à liberação de enzimas proteolíticas e citocinas pró-
inflamatórias27,30,31,32.
A ativação das enzimas pancreáticas causa o acionamento da cascata de fosfolipases,
elastases e outros mediadores com aumento da migração neutrofílica ao pâncreas. Em adição,
uma variedade de citocinas inflamatórias são liberadas, incluindo interleucina 1beta (IL-1 β),
interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), fator ativador de plaquetas (PAF) e fator de necrose
tumoral (TNF)33. A ativação de leucócitos e a liberação de citocinas pró-inflamatórias tais
como a IL-1β, a IL-6 e o TNF-α são considerados fatores etiológicos relevantes não só do dano
pancreático local, mas do desenvolvimento para um quadro de pancreatite grave3,11,25,34,35 , de
síndrome da resposta inflamatória sistêmica e da falência de múltiplos órgãos4,25,36,37,38.
Neste contexto, marcadores da resposta inflamatória têm sido investigados na
pancreatite aguda, mas os exames laboratoriais e imunohistoquímicos não os enfatizam na
pancreatite aguda causada por isquemia e reperfusão. Assim, até o momento, são escassos os
estudos preditivos para a evolução ou gravidade da pancreatite aguda por I/R, e em especial
nos estágios iniciais desta doença16,22 .
Vários modelos experimentais de pancreatite aguda foram desenvolvidos nas últimas
décadas e realizados em diferentes animais. Apresentam variados mecanismos fisiopatológicos
para indução da pancreatite aguda26. Neste estudo, buscou-se, uma adaptação destes modelos
experimentais, utilizando-se o rato e com ênfase no processo isquemia-reperfusão para
avaliação das citocinas pró-inflamatórias.
2. OBJETIVO Este estudo objetivou avaliar se citocinas pró-inflamatórias (IL-1 β, IL-6 e TNF-α)
poderiam atuar como marcadores biológicos capazes de determinar o grau de exposição à
isquemia e reperfusão na pancreatite aguda, em um modelo experimental de reperfusão
pancreática seletiva.
3. MÉTODOS
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética para Uso de Animais (CEUA),
sob o número 78/09, de acordo com as normas da lei 11.794, de 8 de outubro de 2008 e que
estabeleceu procedimentos para o uso científico de animais.
O modelo experimental foi desenvolvido e executado no Centro de Cirurgia
Experimental do Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal
do Rio de Janeiro.
3.1 -Animais
Foram utilizados 56 ratos Wistar (Rattus norvegicus), isogênicos, SPF (livre de
patógenos específicos), fêmeas, com peso corporal de 180 a 250g, oriundos do Centro de
Cirurgia Experimental da Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Os animais foram alimentados com ração industrial balanceada e água ad libitum,
alojados em biotério dentro de gaiolas apropriadas, com temperatura controlada e iluminação
conforme ciclo circadiano.
3.2 - Desenho Experimental
Os animais foram distribuídos, aleatoriamente, em sete grupos com oito ratas cada:
Grupo 1 (Controle); apenas amostras de sangue e do pâncreas foram coletadas.
Grupo 2 (S/24h); Simulação 24h - Realizou-se laparotomia com dissecção do ramo
pancreático principal da artéria esplênica e óbito induzido sem dor, decorridas 24 horas.
Grupo 3 (S/72h); Simulação 72h - Realizou-se laparotomia com dissecção do ramo
pancreático principal da artéria esplênica e óbito induzido sem dor, decorridas 72 horas.
Grupo 4 (15’/24h) - Efetuou-se a interrupção do fluxo do ramo pancreático principal
da artéria esplênica, por 15 minutos e o óbito induzido sem dor ocorreu 24 horas após.
Grupo 5 (15’/72h) - Efetuou-se a interrupção do fluxo do ramo pancreático principal
da artéria esplênica, por 15minutos e o óbito induzido sem dor ocorreu 72 horas após.
Grupo 6 (180’/24h) - Efetuou-se a interrupção do fluxo do ramo pancreático principal
da artéria esplênica, por 180 minutos e o óbito induzido sem dor ocorreu 24 horas após.
5
Grupo 7 (180’/72h) - Efetuou-se a interrupção do fluxo do ramo pancreático principal
da artéria esplênica, por 180 minutos e o óbito induzido sem dor ocorreu 72 horas após.
3.3 - Procedimento cirúrgico
O procedimento cirúrgico foi realizado no Centro Cirúrgico do Centro de Cirurgia
Experimental da Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Todos os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal de quetamina
(25mg/kg) e xilazina (3mg/kg). Após efeito satisfatório das substâncias anestésicas, os ratos
foram posicionados em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica, com fixação das quatro
patas e submetidos à tricotomia da região abdominal. Procederam-se medidas de assepsia e
antissepsia.
Nos grupos 2 a 7 realizou-se uma laparotomia, por incisão mediana, medindo 4 cm,
distalmente ao apêndice xifóide. A veia cava inferior foi identificada por rechaço contralateral
de alças intestinais, e realizou-se a injeção de heparina sódica (1000UI/kg de peso) em veia
cava inferior. Esperou-se 20 minutos pelo tempo de latência da heparina, com tamponamento
do local de punção. Prosseguiu-se com a abertura da bolsa omental com exposição da porção
gastroesplênica do pâncreas, sob magnificação óptica de 3,5 vezes, seguida por incisão na
cápsula pancreática e por dissecção do ramo pancreático principal da artéria esplênica, após a
emergência da artéria polar superior (Figura 1). A interrupção do fluxo pancreático foi
realizada com microclampe arterial revestido por tubo plástico (B1A, ASSI, Nova Iorque,
EUA) (Figura 2), de acordo com os grupos (4 a 7) descritos anteriormente. Neste momento,
dava-se inicio a fase isquêmica do modelo, que poderia durar 15 (Grupos 4 e 5) ou 180
minutos (grupos 6 e 7), após o que seguiu-se a sutura da parede abdominal em 2 planos com
fio inabsorvível (algodão 3.0).
No pós-operatório, as ratas foram recolocadas em gaiolas individuais, sob analgesia
com dipirona (30 mg/kg) via oral, alimentadas com ração e água ad libitum.
Os animais foram induzidos ao óbito sem dor mediante sobredose anestésica decorridas
24 (Grupos 4 e 6) ou 72 horas (Grupos 5 e 7) após a reperfusão. Nestas ocasiões, o sangue foi
coletado através da punção da veia cava inferior e o pâncreas dissecado e retirado.
6
3.4 - Preparo do tecido e do sangue
A porção do pâncreas reperfundida foi retirada e dividida, com uma parte destinada a
histopatologia, fracionada longitudinalmente, e a outra encaminhada para a cultura de tecido
(para análise das citocinas TNF-α, IL1β e IL- 6 e definidas para cada estudo específico.
Figura 1 – Anatomia do pâncreas do rato. O pâncreas do rato é composto pelos lobos esplênico, gástrico e duodenal. A artéria esplênica bifurca-se em dois troncos principais. O cranial dá origem a um ramo esplênico superior que vasculariza o pólo superior do baço. Após a emergência deste, distribui-se em um ramo pancreático principal que vasculariza o lobo esplênico do pâncreas, parte superior do lobo gástrico do pâncreas, além do terço médio e inferior do baço. O tronco caudal, também denominado de artéria esplênica inferior, dá origem a um ramo para o lobo duodenal e outro que vasculariza a parte inferior do lobo gástrico do pâncreas e o polo inferior do baço. O sistema venoso acompanha a distribuição anatômica arterial. Adaptado e traduzido de Lambert52
Lobo duodenal Lobo gástrico
7
Figura 2 - Oclusão pouco traumática de ramo da artéria esplênica, com clipe microvascular, nos grupos 4 a 7. Após a abertura da bolsa omental, a arcada gastroepiploica foi rebatida inferiormente, identificando o segmento esplênico do pâncreas. O microclampe foi colocado, seletivamente, no ramo pancreático principal, após emergência do ramo esplênico superior. Nota-se a palidez do lobo esplênico do pâncreas (A) quando comparado ao lobo gástrico (B).
A
B
8
Um único patologista realizou a avaliação dos preparados histológicos, sem conhecer a
identificação dos grupos (cega) e esta foi conduzida no Laboratório Multidisciplinar de
Pesquisa do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho – Universidade Federal do Rio de
Janeiro,
Os fragmentos pancreáticos foram imersos em paraformaldeído a 4% tamponado com
fosfato sódico a 0,1M (pH 7,4), em um período de 12 horas em temperatura ambiente. Os
preparados histológicos com espessura de 4 µm, após serem colocados em lâminas e estocados
em temperatura ambiente, foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e estudados em
magnificações de 40, 100 e 400 vezes, com o microscópio óptico.
O edema/formação de fendas (interlobares, interlobulares, interacinares), o infiltrado
inflamatório (contagem de leucócitos), e a degranulação do zimogênio no interior das células
ductais foram graduados de 0 a 3, de acordo com a intensidade da lesão (respectivamente,
ausente, leve, moderada e intensa) e baseados na classificação de Simsek e Spormann
modificada10,29. A proporção núcleo versus zimogênio de 1:2 foi considerada compatível com a
normalidade (grau 0) e a gravidade da lesão classificada em leve, moderada e intensa (1 a 3),
respectivamente para as proporções 1:1, 2:1 e 1:0. Quando intensa, avaliou-se a formação de
pseudoductos ou túbulos. Atestaram-se, ainda, a presença ou ausência de necrose de gordura,
de necrose do parênquima, de hemorragia e de apoptose.
3.6 - Análise laboratorial sérica
As amostras de sangue foram centrifugadas na velocidade de 4000 rpm por 5 minutos e
o soro coletado com auxílio de pipeta eletrônica e armazenado a -80ºC para mensuração de
amilase sérica e proteína C reativa (PCR). Tais mensurações foram realizadas em laboratório
particular e especializado em bioquímica animal.
3. 6. 1- Atividade da amilase plasmática
Esta enzima foi quantificada no soro pela técnica bioquímica CNPG (a-(2-cloro-4-
nitrofenil)-b-1,4-galactopiranosilmaltoside) (Amilase CNPG Liquiform – LabtestR - Brasil)
9
3. 6. 2 - Atividade da proteína C reativa (PCR)
A atividade da PCR foi quantificada no soro pela técnica de nefelometria ou
turbidimetria, suspensão de partículas de látex sensibilizada com anticorpos anti – PCR
humana, azida sódica 0,95 g/L (Turb PCR ultra sensível – EbramR - Brasil).
3.7. Preparo de cultura de tecidos com mensuração de citocinas
O preparo de cultura de tecido e a mensuração de citocinas foram realizados no
laboratório de Imunologia Celular do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade
Federal do Rio de Janeiro.
Culturas de explante de pâncreas foram mantidas por 24 horas. Em todas as culturas foi
utilizado o meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco, Invitrogen,
USA), com 10mM HEPES (Promega, USA), penicilina G (100 KU/L) e estreptomicina
(100mg/L) (ambos Sigma, USA) por 24 horas, a 37ºC, em incubadora umidificada com
atmosfera de CO2 a 5%. Após a incubação por 24 horas, o sobrenadante foi coletado,
centrifugado e estocado a -20oC. As amostras dos sobrenadantes foram usadas para
mensuração das concentrações de citocinas inflamatórias pelo método de ensaio colorimétrico
imuno enzimático de ELISA (sensitive enzyme-linked immunosorbent assay) para TNF-α
(R&D System, MN, USA), para IL-1 β (PeproTech Inc., New Jersey, USA) e para e IL- 6
(Bender MedSystems – Vienna- Austria). Todas as amostras foram analisadas em duplicata. As
concentrações de citocinas nos sobrenadantes de cultura de órgãos foram expressas em pg/µg
de proteína.
O peso molhado das amostras foi correlacionado com as proteínas contidas no
homogenado de tecido. O conteúdo total de proteína das amostras de tecido foi estimado pelo
método Lowry. Cumpre esclarecer que, concentrações menores do que 5 pg/dL de citocinas
não são detectáveis pelos testes utilizados.
3.7.1- Dosagem de TNF- α
Foram colocados em cada poço de placa para ELISA, 100µL de anticorpo de captura
(seguindo instruções do kit fornecido pelo fabricante R&D System), em uma concentração de
1µg/ml e incubado em pernoite, à temperatura ambiente. Tal solução foi descartada e os poços
10
lavados 4 vezes com solução de lavagem (PBS/0,05% tween). A placa foi bloqueada através da
transferência de 300µL por poço de solução bloqueadora (PBS/0,05%tween/1%BSA).
Novamente, incubada por 1 hora, à temperatura ambiente. A solução foi novamente descartada
e os poços lavados com solução de lavagem por quatro vezes. O anticorpo recombinante foi
plaqueado em diluições seriadas, em duplicata, de modo a ficar com 100µL de volume em cada
poço. Foram colocadas 100µL de amostras em duplicata e a placa foi incubada por 2 horas, à
temperatura ambiente. Novamente, a solução foi descartada e os poços lavados por quatro
vezes com solução de lavagem. Foi adicionado 100µL de anticorpo de detecção por poço. A
placa foi incubada em pernoite, a -4ºC. Novamente, a solução foi descartada e a placa lavada
com solução de lavagem, por quatro vezes. Foi adicionado 100µL de estreptavidina HRP
(ZymedR - USA) e a placa foi incubada por 30 minutos. Descartada a solução, os poços foram
lavados (quatro vezes) e foi adicionado 100µL de substrato TMB (GenzymeR - USA) a cada
poço. A reação foi então interrompida com HCl 1N e lida a 450nM, por espectofotometria.
3.7.2 - Dosagem de IL-1β
Foram colocados em cada poço de placa para ELISA 100µL de anticorpo de captura
(seguindo instruções do kit fornecido pelo fabricante PeproTech Inc.) numa concentração de
2µg/ml, incubados em pernoite à temperatura ambiente. A solução foi descartada e os poços
lavados quatro vezes com solução de lavagem (PBS/0,05% tween). A placa foi bloqueada,
através da transferência de 300µL por poço de solução bloqueadora
(PBS/0,05%tween/1%BSA) e novamente incubada por 1 hora, à temperatura ambiente. A
solução foi descartada e os poços lavados com solução de lavagem por quatro vezes. O
anticorpo recombinante foi diluído na placa diluições seriadas em duplicata, de modo a ficar
com 100µL de volume em cada poço. Adicionou-se 100µL das amostras em duplicata e a placa
foi incubada por 2 horas à temperatura ambiente. Novamente, a solução foi descartada e os
poços lavados por quatro vezes com solução de lavagem. Foi adicionado 100µL por poço, de
anticorpo de detecção. A placa foi incubada por 2 horas à temperatura ambiente. Novamente, a
solução foi descartada e a placa lavada com solução de lavagem por quatro vezes. Foi
adicionada 100µL de streptavidina HRP (ZymedR – USA) e a placa foi incubada por 30
minutos. Descartada a solução, os poços foram lavados (quatro vezes) e foi adicionado 100µL
11
de substrato TMB (GenzymeR – USA) a cada poço. A reação foi interrompida com HCl 1N e
lida por espectofotometria.
3.7.3 -Dosagem de IL-6
Foram colocados em cada poço de placa para ELISA 50µL de anticorpo de captura
(seguindo instruções do kit fornecido pelo fabricante Bender MedSystems) numa concentração
de 5µg/ml e incubado em pernoite, à temperatura ambiente. A solução foi descartada e os
poços lavados três vezes com solução de lavagem (PBS/0,05%tween). A placa foi bloqueada,
através da transferência de 200µL por poço de solução bloqueadora fornecida pelo fabricante e
incubada por 1 hora à temperatura ambiente. A solução foi descartada e os poços lavados com
solução de lavagem por três vezes. O anticorpo recombinante foi diluído na placa em
duplicatas em diluições seriadas, de modo a ficar com 50µL de volume em cada poço. Foram
adicionados 50µL de amostra nos respectivos poços em duplicatas, conforme desenho das
placas. A placa foi incubada por 2 horas à temperatura ambiente. Novamente, a solução foi
descartada e os poços lavados com solução de lavagem, por três vezes. Foi adicionado 50µL
por poço de anticorpo de detecção. A placa foi incubada em pernoite a -4ºC. Novamente, a
solução foi descartada e a placa lavada com solução de lavagem, por três vezes. Foi adicionada
100µL de estreptavidina HRP e a placa foi incubada por 30 minutos. Descartada a solução, os
poços foram lavados (três vezes). Foi adicionado 100µl de TMB a cada poço e a placa foi
incubada por 30 minutos. A reação foi então interrompida com 50 µl HCl 1N e lida a 450nM
por espectofotometria.
A análise estatística foi realizada no laboratório Multidisciplinar de Pesquisa do
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho – UFRJ.
Os dados obtidos em cada etapa do projeto foram analisados com o auxílio de um
programa estatístico SPSS computadorizado (Versão 10.0.1, SPSS Inc., 1989-1999, USA). Os
resultados de diferentes grupos foram comparados pelo teste-t, ou por ANOVA com
comparações múltiplas pareadas através do teste Dunnett T3. A correlação entre os escores
12
histológicos e as concentrações de citocinas foi analisada através de variáveis numéricas
quantitativas pelo coeficiente de correlação Spearman rank. O nível de significância foi
estabelecido para valores de p < 0,05.
4- RESULTADOS
No grupo Controle atestou-se proporção núcleo:zimogênio de 1:2. Não foram
encontrados edema, necrose ou processo inflamatório (Figura 3). Nos grupos Simulação
(S/24hs e S/72h) identificaram-se lesões pancreáticas leves, com presença de proporção
núcleo:zimogênio (1:1 ), leve infiltrado intersticial e edema bem como substituição mínima do
estroma por tecido conjuntivo, (Figuras 4 e 5). Já os grupos 4 (Figuras 6 e 7) e 5 (Figuras 8 e
9), com 15 minutos de isquemia (15’/24hs e 15’/72hs) apresentaram pancreatite aguda com um
moderado aumento da proporção núcleo zimogênio (2:1), edema moderado com aumento dos
lóbulos e multiplicação das fendas dos espaços interlobulares, além de infiltrado
polimorfonuclear moderado, com estroma quase inaparente. Foi encontrada hemorragia em
dois casos do grupo 5 (15’/72hs) (Figuras 8 e 9). Os grupos 6 e 7, com 180 minutos de
isquemia (180’/24hs e 180’/72h), foram caracterizados por grande aumento da proporção
núcleo: zimogênio (principalmente 1:0, além de 2:1), e intenso edema e infiltrado inflamatório
(Figuras 10,11,12). A necrose (esteatonecrose) do parênquima com degranulação acentuada foi
encontrada somente em um caso do grupo 6 (Figura 13).
Ocorreu apoptose em cinco amostras no grupo 5 (15’/72h), em uma no grupo 6
(180’/24h) e em três no grupo 7 (180’/72h). Esta foi caracterizada pela presença, nas células
acinares, de núcleos condensados e pequenos, separados, por células intactas ao redor, por um
halo claro (Figura 14). Em dois ratos do grupo 7, foi encontrada a formação de complexos
tubulares.
Quando foi avaliado o escore histopatológico, houve diferença significante (p<0,05)
entre os grupos submetidos a isquemia quando comparados com os grupos Controle e
Simulação, porém não houve diferença entre os diferentes grupos submetidos à isquemia e
reperfusão.
14
Figura 3 – Fotomicrografia do grupo Controle (H&E 100X). Verifica-se a presença de proporção núcleo: zimogênio 1:2 (A), sem edema, necrose ou processo inflamatório.
Figura 4 – Fotomicrografia do grupo Simulação (S72h, H&E, 40X). Constatou-se mínima inflamação do interstício e leve infiltrado intersticial (A). Os aspectos encontrados foram semelhantes aos do grupo 2 (S24hs)
A
A
15
Figura 5 – Fotomicrografia do grupo Simulação (S72h, H&E, 400X). Detalhe da fotomicrografia anterior, com presença de mínima inflamação do interstício e degranulação mais difusa (1:1 difusamente) (A), maior número de fendas (grau 1) (B), leve infiltrado intersticial com substituição leve do estroma por tecido conjuntivo (C).
Figura 6 – Fotomicrografia do grupo 4 (15’/24h, H&E, 100X). Observou-se diminuição do zimogênio, causando pancreatite com infiltrado neutrofílico focal e aumento das fendas (A). Os achados foram semelhantes aos do grupo 5.
C
A
B
A
16
Figura 7 – Fotomicrografia do grupo 4 (15’/24h, H&E, 400X). Detalhe da diminuição do zimogênio (A), com infiltrado neutrofílico focal e aumento das fendas (B).
Figura 8 – Fotomicrografia do grupo 5 (15’/72h, H&E, 40X). Verificou-se a presença de hemorragia intersticial (A), diminuição dos ácinos (1:1 com áreas 2:1) (B), edema interlobular grau 2, sem apoptose.
A
B
A
B
17
Figura 9 – Fotomicrografia do grupo 5 (15’/72h, H&E, 400X). Detalhe da presença de hemorragia intersticial (A) e da diminuição dos ácinos (1:1 com áreas 2:1) (B).
Figura 10 – Fotomicrografia do grupo 6 (180’/24h, H&E, 40X). Constataram-se porção ácino:zimogênio 1:1 e em alguns pontos 2:1, necrose clássica de pancreatite caracterizada por esteatonecrose com leucócitos e infiltrado granulocítico (A). Houve redução do tamanho do lóbulo com aumento das fendas (grau 2) (B) .
A
B
A
B
18
Figura 11 – Fotomicrografia do grupo 6 (180’/24h, H&E, 400X). Detalhe da necrose clássica de pancreatite caracterizada por esteatonecrose com leucócitos e infiltrado granulocítico (A).
Figura 12 – Fotomicrografia do grupo 7 (180’/72h, H&E, 100X). Evidenciaram-se áreas de pancreatite (+) com pseudotúbulos, infiltrado intersticial leve e degranulação acentuada com apoptose (seta), entremeadas com área de parênquima normal (*). Os achados foram similares aos do grupo 6.
A
19
Figura 13 – Fotomicrografia do grupo 7 (180’/72h, HE, 400x). Detalhe da pancreatite com pseudotúbulos (A) e degranulação acentuada com apoptose (B). Figura 14. Resultado histopatológico, com avaliação do escore segundo Simsek - Spormann modificado. Houve diferença significante entre os grupos submetidos à isquemia quando comparados com os grupos Controle e Simulação. (* = diferença significante na comparação dos grupos 15/24h, 15/72h, 180/24h e 180/72h com os grupos Controle, Simulação 24h e 72h (p<0,05)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
co nt
ro le
co nt
ro le
4.2.1- Amilase
A concentração de amilase elevou-se no grupo 6(180’/24h), o qual apresentou
diferença significante para os grupos Controle e Simulação 72 horas (S72 h) (Figura 15).
G= grupo; *p < 0,05
G= grupo; *p < 0,05 *G1 vs G6; *G3 vs G6
Figura 15- Box plot das concentrações da amilase sérica nos diferentes grupos experimentais. O box- plot separa os dados, por grupo, em quartis com o topo da caixa representando o percentil de 75% e a base, o percentil 25%. A linha dentro da caixa representa a mediana. Os limites da haste superior e inferior representam os valores máximo e mínimo. Houve elevação significante da concentração da amilase (*p < 0,05) no grupo 180’/24h, quando comparado aos grupos Controle e Simulação 72 horas (S72h).
G
21
4.2.2 - Proteina C reativa - PCR
As concentrações de PCR foram mais elevadas nas comparações entre os grupos 5
(15’/72hs) e 6 (180’/24hs) e os grupos Controle e Simulação (p < 0,05). Também se elevou no
grupo 7 (180’/72hs), apenas na confrontação com o grupo Controle (Figura 16).
Figura 16 - Box plot da concentração de proteína C reativa nos diversos grupos experimentais houve diferença significante (*p < 0,05) nas comparações dos grupos 15’/72h e 180’/24h versus os grupos Controle e S24 e S72 e também nas comparação do grupo 180’/72h versus o Controle (*p < 0,05).
6676666N =
22
4.2.3- Interleucina 1 beta (IL-1β)
As concentrações de IL-1β foram mais elevadas nas comparações entre os grupos 5
(15’/72hs), 6 (180’/24hs) e 7 (180’/72hs) com os grupos 1 (Controle) e 2 e 3 (S24h e S72h) (p
< 0,05). Também se elevaram no grupo 4 (15’/24h) apenas na confrontação com o grupo
Controle. Os grupos 5 e 7, com 72 horas de reperfusão (15’/72hs e 180’/72hs) apresentaram
diferenças significantes para o grupo 4 (15’/24hs). No grupo 7 (180’/72hs) obteve-se um
aumento significante dos níveis de IL-1β em comparação com o grupo 5 (15’/72hs). (Figura
17)
Figura 17 – Box plot da concentração de IL-1β nos diversos grupos experimentais. Houve diferença significante (*p < 0,05) nas comparações 15’/24h vs Controle; 15’/72h vs Controle, S24h, S72h e 15’/24h; 180’/24h vs Controle, S24h , S72h e 180’/72h vs Controle, S24h, S72h e 15’/24h e 15’/72h .
6675666N =
23
4.2.4 - Interleucina-6 (IL-6)
As concentrações de IL-6 foram mais elevadas nos grupos 6 e 7, com 180 minutos de
isquemia (180’/24hs e 180’/72hs) quando comparados aos grupos 1 e 2 (Controle e Simulação
24h). Também se elevaram no grupo 5 (15’/72h), apenas na comparação com o grupo
Controle. (Figura 18)
Figura 18 – Box plot da concentração de IL-6 nos diversos grupos experimentais. Houve elevação significante nas concentrações de IL-6 (*p < 0,05) no grupo 15’/72h quando comparado ao Controle. Também houve elevação significante nos grupos 180’/24h e 180’/72h quando comparados aos grupos C (Controle) e S24h (*p < 0,05).
1
1,2
1,2
7676576N =
24
4.2.5 - Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)
As concentrações de TNF-α elevaram-se nas comparações entre os grupos 5 (15’/72h),
6 (180’/24h) e 7 (180’/72h) e os grupos 1 (Controle) e 2 e 3 (S24h e S72h). Também se
elevaram no grupo 4 (15’/24h), apenas na confrontação com o grupo 1 (Controle). Os grupos 5
e 7, com 72 horas de reperfusão (15’/72hs e 180’/72hs) apresentaram diferenças significantes
para o grupo 4 (15’/24hs). No grupo 7 (180’/72hs) observou-se, ainda, aumento significante do
TNF-α em comparação com o grupo 6 (15’/72hs). (Figura 19)
Figura 19 – Box plot da concentração de TNF-α nos diversos grupos experimentais. Ocorreu elevação significante do TNF α (*p < 0,05) nos grupos 15’/24h, quando comparados ao Controle. Houve elevação significante (*p < 0,05) no grupo 15’/72h quando comparado aos grupos Controle, Simulação (24h e 72h) e 15’/24h. Da mesma forma houve elevação significante (*p < 0,05) no grupo 180’/24h quando comparado aos grupos Controle e Simulação (24h e 72h) e no grupo 180’/72h quando comparado aos grupos Controle, Simulação (24h e 72h) e 15minutos (15’/24h e 15’/72h).
7654321G
*
*
*
*
5.DISCUSSÃO A pancreatite aguda é definida pela presença de uma inflamação que ocorre no
pâncreas e que pode afetar tanto órgãos a distância, como também órgãos adjacentes39,40.
Os modelos cirúrgicos de pancreatite aguda foram, em sua maioria, desenvolvidos na
segunda metade do século XX e utilizavam animais maiores e mais dispendiosos, dificultando
sua reprodução26. Obviamente, um grande número de modelos animais já foram utilizados,
mas um modelo ideal deveria ser facilmente reprodutível e capaz de induzir graus diferentes
de pancreatite aguda, proporcional à intensidade do estímulo, de acordo com os objetivos do
experimento10,26,28,29,41, 43,49. Todavia, este modelo experimental ainda não existe, em face da
pouca uniformidade das amostras para um estudo comparativo e da heterogeneidade dos
resultados obtidos, por diversos autores26,41,42,46,47.
Vários modelos de pancreatite causada por desordens vasculares e ou I/R já foram
realizados: injeção de microesferas intravasculares, oclusão de capilares ou trombose de veias
pancreáticas combinada ou não com ligaduras dos ductos pancreáticos, oclusão de artéria
gastrointestinal combinada com administração de secretina, choque hipovolêmico causando
hipoperfusão pancreática, clampeamento das artérias pancreáticas seguida de reperfusão e
clampeamento da artéria pancreática inferior seguida de reperfusão26,28.
Existem outros modelos experimentais de pancreatite que promovem o processo
inflamatório, tais como: uso de secretagogos, ativadores do processo imune, através da
ligadura ductal biliopancreática, da administração intraductal pancreática de taurocolato de
sódio, álcool, ou ceruleína e de outros análogos da colecistoquinina, ou procedimentos
combinados. Contudo, tais modelos utilizam outras técnicas e que não se adéquam a um
estudo comparativo com a I/R pancreática, avaliada na presente pesquisa10,26,46. Além disto, a
maioria destas pesquisas resulta em pancreatite grave, com necrose e hemorragia, e a ausência
da previsibilidade do desfecho e reprodutibilidade das lesões, ou seja, sem modulação da
intensidade do dano, e portanto, representariam condições que não nos interessavam estudar.
Na presente dissertação, objetivou-se utilizar um modelo de pancreatite aguda reprodutível,
que simulasse o processo patológico da pancreatite aguda em seres humanos e que fosse capaz
de causar o menor grau de lesão em outras vísceras, minimizando o viés do experimento. A
I/R parcial agiu como única variável causal da lesão pancreática. Assim, o rato Wistar SPF foi
26
escolhido pelo seu porte, facilidade no manuseio, uniformidade da amostra, menor
susceptibilidade à infecção, baixo custo para criação e manutenção26,42.
Estudos experimentais mostraram que a lesão por isquemia-reperfusão (I/R) é,
isoladamente, capaz de desencadear pancreatite aguda no rato e, entre os diversos modelos
descritos na literatura, representa aquele em que a intensidade do estímulo, ou seja, o tempo de
isquemia, parece melhor estar relacionado a um maior dano pancreático26,42,44. Sabe-se,
também, que a reperfusão é mais danosa para o parênquima pancreático do que a isquemia,
apesar de alguns pesquisadores relatarem que a vasodilatação e o estímulo a um maior fluxo
sanguíneo para o pâncreas poderiam inibir os efeitos das lesões isquêmicas43,50.
Spormann e colaboradores demonstraram que períodos variados de isquemia (10 a 30
minutos), com clampeamento das artérias celíacas e da artéria mesentérica superior dos ratos,
poderiam produzir pancreatite mais severa, mas, devido a variações individuais do suprimento
sanguíneo pancreático e de diferente tolerância à isquemia, os desfechos são pouco
uniformes51. Modelos com oclusão do tronco celíaco ou múltiplas artérias, além de
ocasionarem isquemia total desta víscera podem comprometer a vascularização do fígado, do
estômago e do intestino delgado45. Modelos de isquemia total, em geral, são utilizados em
experimentos nos quais se procura reproduzir uma situação semelhante ao transplante de
pâncreas, ainda que enfoquem a relevância da reperfusão, diferem do objetivo do presente
estudo45, no qual se efetuou um modelo de isquemia e reperfusão seletiva não traumático, em
ratos. Esta foi comprovada através da inspeção, após o clampeamento do ramo arterial
pancreático principal, haja vista o aparecimento de uma área isquêmica no corpo e cauda do
pâncreas e também no baço, caracterizada por uma coloração vinhosa em contraste com a
coloração avermelhada compatível com uma perfusão normal28. Após a reperfusão, os tecidos
isquemiados retornaram a uma coloração compatível com a normalidade.
Em 2000, Tomaszewska e colaboradores descreveram, em ratos, um modelo de
pancreatite aguda de causa vascular mediante isquemia da artéria esplênica caudal por 30
minutos e observou a evolução em diferentes períodos, de uma hora até 28 dias, após a
reperfusão. Em suas conclusões, correlacionou o processo inflamatório com o desarranjo
funcional, representado pela elevação da amilase e da IL 1β44. Estes resultados vêm ao
encontro do que foi obtido, na Dissertação atual.
27
Alguns autores correlacionaram o tempo de isquemia com a gravidade das lesões
histológicas, mas geralmente o método compreendeu isquemias pancreáticas totais (Obermaier
e Renteria45,52). As diferenças no modelo experimental não permitem comparações uniformes
com o estudo empreendido nesta Dissertação.
Os resultados histopatológicos revelaram que o modelo causou dano nos grupos 4,5 ,6 e
7, ou seja, em todos animais submetidos à isquemia e reperfusão. Também foi constatado, a
priori, o agravamento das lesões pancreáticas com relação aos tempos de isquemia e de
reperfusão. Houve uma aparente piora da pancreatite nos grupos com 180 minutos se
comparado àqueles com 15 minutos de isquemia, bem como nos de 72 horas de reperfusão se
comparado as de 24 horas. Entretanto, a análise estatística não aferiu diferenças significantes
quanto aos parâmetros analisados comparativamente e deste modo, apenas se pode asseverar
que as lesões foram compatíveis com um processo pancreático agudo edematoso. Foram,
ainda, encontradas diminuição da proporção ácino: zimogênio, ou seja, uma redução da
liberação de zimogênio pelos ácinos; além do aumento da lobulação do tecido pancreático,
causado pela dissociação dos ácinos; e formação de complexos tubulares ou pseudotúbulos.
Esta formação de complexos tubulares demonstra lesão importante dos ácinos e são
caracterizados pela ausência de zimogênio no seu interior.
Dembiski e colaboradores, em um modelo de isquemia-reperfusão com clampeamento
da artéria pancreática inferior, por 30 minutos características morfológicas de dano
pancreático, tais como edema, vacuolização e necrose tiveram maior intensidade após um dia
de reperfusão. Hemorragia e infiltração inflamatória leucocitária tiveram maior expressão após
dois dias de reperfusão. Após três dias de reperfusão, os sinais histológicos de dano
pancreático apresentaram uma tendência à redução. Quarenta e oito horas após a reperfusão
houve a formação de complexos tubulares28,53. O grau máximo de necrose acinar foi
encontrado entre o 12 horas e o segundo dia de reperfusão. Em nossa pesquisa os achados
foram muito semelhantes, mas a presença de necrose ocorreu isoladamente com 72 horas, e em
apenas dois ratos do grupo 7 (180’/72h). Encontramos necrose de gordura em somente três
casos (grupos 180’/24hs e 180’/72hs). De acordo com Samuel e colaboradores, ao estudarem
pancreatite aguda em ratos e marsupiais não encontraram necrose de gordura em pâncreas nos
ratos, tendo concluído que tal fato se devia à pouca quantidade de tecido adiposo peri-
pancreático, nos ratos54.
28
Fujimoto, em um estudo em que realizou uma oclusão da artéria esplênica inferior por
60 minutos, encontrou, após 48hs de reperfusão, a presença de células acinares com núcleo
condensado e pequeno, separados de células intactas por um halo claro ao redor, indicando
apoptose das células acinares28. Estas alterações histológicas foram atenuadas após 72hs de
reperfusão. Foi encontrada pouca evidência de necrose nestes espécimes28. Em consonância
com estes resultados, atestou-se apoptose em nove animais dos grupos submetidos à isquemia,
com maior abundância naqueles com 72 horas de reperfusão, o que pode indicar um dano
maior correlacionado ao tempo de reperfusão. Uma possível interpretação dos mecanismos
da apoptose seria o desencadeamento desta pela liberação de radicais livres derivados do
oxigênio e de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α e IL-1β e que podem contribuir
para a lesão de reperfusão28.
Embora não se tenha obtido, após a análise histopatológica, diferenças significativas
entre os tempos estudados para a isquemia (15 e 180 minutos) e reperfusão (24 e 72 horas) ,
encontraram-se achados indicativos de um maior grau de lesão tecidual nos grupos com maior
tempo de isquemia e de reperfusão. Provavelmente, uma amostra maior consolidaria este viés
de gravidade da lesão pancreática. Enfatiza-se que a grande maioria dos modelos de pancreatite
aguda, mesmo em ratos, não aprofunda a análise da fisiopatologia da isquemia e reperfusão, na
pancreatite aguda.
O mecanismo fisiopatológico da pancreatite aguda ainda requer esclarecimentos,
mormente por não se conhecer de forma precisa, as razões que geram o processo inflamatório
pancreático e também determinam uma evolução para quadro mais grave. Na última década e
meia, os autores têm dedicado uma maior atenção ao papel exercido pelas citocinas pró-
inflamatórias na fisiopatologia da pancreatite, mas com pouca ênfase em modelos específico de
I/R1,3,9,11. Analisaram-se alguns marcadores já consagrados, porém com sensibilidade e
especificidade variável e imprecisão quanto às ações relacionadas ao processo de isquemia e
reperfusão.
A concentração sérica de amilase é amplamente reconhecida como marcador
diagnóstico da pancreatite aguda, ainda que não seja específica. A dosagem da amilase é
utilizada como rotina, na suspeição clínica de pancreatite aguda e sua elevação auxilia, na
investigação diagnóstica.24 Em ratos, a elevação precoce da amilase sérica aliada aos achados
histopatológicos representam parâmetros úteis para validação de um modelo de pancreatite
29
aguda.44 No estudo apresentado constatou-se elevação significante da amilase no grupo 6
(180’/24h) quando comparada ao resultado obtido nos grupos Controle (p=0,017) e Simulação
com 72 horas de reperfusão (S72h, p=0,017 ). É digno de nota que, no grupo 4 (15’24h),
apesar da ausência de diferença significante (p=0,187) com os demais grupos, observou-se
uma tendência ao aumento das concentrações de amilase, e que não pode ser comprovada, em
face do desvio padrão grande. Os resultados encontrados nos grupos 5 e 7, nos quais o óbito e
a dosagem ocorreram com 72h após o clampeamento, não diferiram daqueles dos grupos
Controle e Simulação, mas também se observou uma tendência a redução dos valores,
compatível com os aspectos laboratoriais desta enzima, encontrados em anima nobile. Assim,
apesar dos dados obtidos com esta enzima não serem novos, foram úteis para validar o modelo
de pancreatite aguda, ainda que não pudesse se correlacionar, especificamente, ao tempo de
isquemia ou ao intervalo de reperfusão.
Em modelo de reperfusão, em ratos, Tomaszewska e Dembinski, realizaram isquemia
pancreática por 30 minutos, através do clampeamento da artéria esplênica e encontraram
aumento de amilase sérica 12 horas após a reperfusão, com um pico de atividade após 24
horas, e que se manteve elevado até três dias após o desenvolvimento de pancreatite25,44. Os
resultados encontrados na presente Dissertação se assemelham aos destes autores, pois, o
intervalo de 24 horas, de fato, esteve relacionado às maiores elevações na concentração da
amilase. Apesar dos estudos demonstrarem, com freqüência este aumento da amilase em fases
precoces da pancreatite aguda, há resultados conflitantes. Fujimoto, em um modelo de
pancreatite de isquemia e reperfusão (isquemia de 60 minutos) em ratos, não observou um
aumento significante na atividade da amilase sérica. Porém, este autor atribuiu o resultado ao
clampeamento da artéria esplênica inferior e que comprometeu apenas 30% de todo o
parênquima pancreático28,
A proteína C reativa (PCR) é um reagente de fase aguda de processos inflamatórios
viscerais ou orgânicos. As concentrações de PCR tiveram diferença significativa nos grupos 5
(15’/72h) e 6 (180’/24h), quando comparadas àquelas dos grupos Controle e Simulação (p <
0,05). Também se elevou no grupo 7 (180’/72h), apenas na confrontação com o grupo
Controle. Tal resultado não teve correlação com os diferentes graus de isquemia e reperfusão
neste modelo experimental. Isto pode ser explicado pelo fato de não encontrarmos um grau
importante de necrose em nosso estudo, haja vista a proteína C reativa ser conhecida como
30
marcadora de gravidade, com expressão maior na necrose pancreática20,55-58. Esta enzima
também serviu para sinalizar que a presença de pancreatite aguda ocorreu em função de
períodos maiores de isquemia e de reperfusão, o que significa que não atuaria como um
marcador precoce desta afecção.
As citocinas são proteínas de baixo peso molecular produzidas durante a inflamação e
ou o estresse oxidativo. Os leucócitos ativados, componentes essenciais da cascata
inflamatória, são a principal fonte de citocinas3,36,59,60. A pancreatite aguda é caracterizada,
inicialmente, por edema intersticial com migração de macrófagos e neutrófilos para o tecido
pancreático. Este recrutamento leucocitário começa com adesão dos leucócitos circulantes ao
endotélio. Os macrófagos ativados liberam citocinas pró-inflamatórias, como IL-1, IL-6 e
TNF- α, em resposta ao dano pancreático local36,37,60. Neste contexto participam, também as
espécies reativas do oxigênio, geradas não só pelos polimorfonucleares que atuam no próprio
processo inflamatório, mas pela presença de mecanismos relacionados à isquemia e
reperfusão28,61.
A produção de IL-1β na pancreatite aguda é tanto pancreática quanto extra-pancreática,
e também induz a liberação de outras citocinas, a exemplo da IL-2 e moléculas de adesão
celular36,37. Existe uma correlação entre a produção de IL-1β e seus receptores específicos e a
severidade da pancreatite aguda. Quando o receptor de IL-1β é bloqueado durante a
pancreatite experimental, a inflamação e o dano pancreático e pulmonar são atenuados e a
sobrevida é aumentada; a pancreatite experimental é menos grave e a lesão pulmonar associada
e a mortalidade é diminuída34.
Na presente Dissertação, as concentrações de IL-1β foram mais elevadas nas
comparações entre os grupos 5 (15’/72hs), 6 (180’/24hs) e 7 (180’/72hs) com os grupos 1
(Controle) e 2 e 3 (S24h e S72h), com uma correlação ao maior tempo de isquemia e
reperfusão no tecido pancreático. Tomaszewska e Dembinski encontraram um aumento
máximo de IL-1β 24hs após reperfusão, com uma subsequente diminuição deste parâmetro até
o 28º dia, em que sua concentração estava ainda significativamente maior que o controle27,44.
Dembiski observou que após a fase aguda de pancreatite, após o segundo dia de reperfusão,
houve uma redução do dano pancreático e início do reparo pancreático. Isto foi expresso pela
diminuição da amilase plasmática e IL-1β e pelo aumento do fluxo pancreático e síntese de
DNA28,53. Observou-se, nos grupos experimentais, um aumento da concentração desta citocina,
31
nas primeiras 72 horas, muito embora esta elevação estivesse correlacionada, principalmente,
ao tempo de isquemia e não ao período de reperfusão.
A IL-6 é um indutor primário da produção hepática de proteínas da fase aguda e
produzida em uma grande variedade de células inclusive monócitos, macrófagos, endotélio e
músculo liso36. Concentrações séricas de IL-6 estão relacionadas com a gravidade da doença
em pacientes com pancreatite aguda, em especial nos primeiros dias de hospitalização, com
uma sensibilidade de 89 a 100%36,37,62. Segundo alguns autores, a IL-6 aumentaria
precocemente e poderia ser um marcador mais sensível de gravidade do que a proteína C
reativa36,37. Yonetci e colaboradores, em um modelo experimental em ratos, utilizando
taurocolato de sódio no ducto pancreático principal e injeção de ceruleína subcutânea, revelam
a correlação entre IL-6 sérica e a gravidade da pancreatite22. Zhou e colaboradores, em um
modelo em camundongos, observaram um aumento de IL-6 após 2 horas de indução de
pancreatite com ceruleína, com um pico em 4 horas9. Não obstante a elevação da IL-6 nos
grupos 6 e 7, com 180 minutos de isquemia, esta variação não se deu na comparação com o
grupo Simulação 72h. Assim, não foi possível atribuir a esta citocina um papel efetivo de
marcador da pancreatite aguda, mesmo no que tange aos aspectos da gravidade da mesma.
A TNF-α é uma citocina pró-inflamatória sintetizada pelos leucócitos, mas também por
células acinares no tecido pancreático36,37,60. Causa vasodilatação, aumenta a permeabilidade
microvascular, ativa os leucócitos, induz a liberação de outras citocinas e a expressão de
moléculas de adesão celular, promove a síntese do óxido nítrico, além de ocasionar alterações
relevantes da hemostasia com efeitos tornando pró-coagulante e pró-adesivo63. Experimentos
in vivo e in vitro sugerem que o TNF-α exerce um papel de gatilho, no agravamento da
pancreatite aguda, levando ao dano de órgãos extra ou peri-pancreáticos e também pode
induzir a produção e liberação de vários outros tipos de citocinas, com consequentes efeitos
deletérios diretos e indiretos para as células8. Concentrações de TNF-α no soro aumentam após
a indução de pancreatite aguda grave36,37. O TNF-α pode contribuir para a gravidade da
pancreatite pela indução de apoptose nas células acinares36,37,60, além de intensificar o estresse
oxidativo através da conversão da xantina desidrogenase em xantina oxidase, substrato
essencial para o estresse oxidativo que, junto com outras citocinas e espécies reativas ao
oxigênio.
32
As concentrações de TNF-α elevaram-se nas comparações entre os grupos 5 (15’/72h),
6 (180’/24h) e 7 (180’/72h) e os grupos 1 (Controle) e 2 e 3 (S24h e S72h). Também se
elevaram no grupo 4 (15’/24h), apenas na confrontação com o grupo 1 (Controle). Os grupos 5
e 7, com 72 horas de reperfusão (15’/72hs e 180’/72hs) apresentaram diferenças significantes
para o grupo 4 (15’/24hs). No grupo 7 (180’/72hs) observou-se, ainda, aumento significante do
TNF-α em comparação com o grupo 6 (15’/72hs), tal resultado no tecido pancreático
demonstrou que seus níveis são mais significantes nos grupos com 180 minutos de isquemia.
Esta liberação de citocinas poderia estar associada à resposta inflamatória sistêmica, conforme
postulam Gómez-Cambonero e colaboradores36. As concentrações do TNF-α e da IL-1β foram semelhantes, corroborando os achados
descritos por Norman60 e que aventou a hipótese de que estes mediadores seriam liberados
pelo infiltrado inflamatório do tecido pancreático, após maior tempo de isquemia. Este mesmo
autor, concluíu que as expressões de IL-1β e TNF-α coincidem com o desenvolvimento de
hiperamilasemia e com as evidências histológicas de pancreatite.
Coelho e colaboradores, em modelo de pancreatite aguda, utilizando taurocolato de
sódio no ducto pancreático principal em ratos, evidenciaram aumento de TNF-α, IL-6 e IL-10
no tecido pancreático, quando comparado com o controle7. Em nosso estudo, a IL-1β, TNF-α
se revelaram marcadores de isquemia e reperfusão no pâncreas, cujas liberações estiveram
associadas a um tempo maior de isquemia e também de reperfusão, no tecido pancreático,
condições estas deletérias para o quadro de pancreatite aguda. Ressalta-se que a ausência de
diferenças significantes na análise histopatológica entre os grupos com I/R não permite aferir a
correlação destes mediadores com a gravidade da lesão no pâncreas.
Considerando que o mecanismo de isquemia e reperfusão está relacionado à pancreatite
aguda e pode ser determinante para a intensidade do processo inflamatório, a dosagem destas
citocinas e sua correlação com os diferentes tempos de isquemia e reperfusão poderia ser útil
para um diagnóstico precoce ou para o prognóstico nos pacientes acometidos por esta doença.
Por suposto, para modificação da conduta terapêutica, com adoção de diferentes medidas para
se diminuir o dano pancreático, como hiper-hidratação, uso de drogas anti-oxidantes ou uso de
inibidores de citocinas. Os estudos por nós realizados em ratos, não determinaram uma
associação direta com a gravidade da doença, mas indicaram a possibilidade de se aventar que
a pancreatite decorreu de lesões isquêmicas ou de reperfusão mais prolongadas.
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Dentre as perspectivas futuras, alguns autores sugerem aprofundar a investigação nas
lesões causadas por reperfusão com o uso de marcadores de estresse oxidativo, tais como
mieloperoxidase, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e proteína carbonilada. e suas
correlações com a precocidade e gravidade da doença2. Conjectura-se que os oxirradicais
seriam os maiores responsáveis pelo dano acinar, e pela ativação intracelular de proteases
teciduais.
6. CONCLUSÕES
A IL-1β e o TNF-α atuaram como marcadores de exposição à isquemia e reperfusão na
pancreatite aguda branda, no modelo experimental em ratos e a expressão mais acentuada
destas citocinas se correlacionou a agressão causada pela isquemia e reperfusão mais
prolongadas.
A IL-6, em ratos, não atuou como um marcador confiável na identificação da
pancreatite aguda causada por isquemia e reperfusão.
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