1ª reunião em 10/12/1994 - Laboratório Fleury – INÍCIO

2ª reunião em 18/03/1995 - Laboratório Sergio Franco

3ª reunião em 05/08/1995 - Fundação Maria Cecília Souto Vidigal

4ª reunião em 09/02/1996 - Hemocentro de Botucatu – HC Faculdade de Medicina – UNESP

5ª reunião em 30 e 31/08/1996 - Hospital Israelita Albert Einstein

6ª reunião em 19/06/1997 - Hotel Casa Grande no Guarujá, I Congresso Ibero-Latino Americano de Citometria de Fluxo

7ª reunião em 24/03/2002 – II Simpósio Internacional de Citometria de Fluxo- Hospital Israelita Albert Einstein

8ª reunião em 16 a 18/04/2009 – III Simpósio Internacional de Citometria de Fluxo-Hospital Israelita Albert Einstein

HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE

FLUXO NO BRASIL

HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE

FLUXO NO BRASIL

HEMO 2009

1ª reunião do GBCFLUX : 24/abril/2010 - DASA

2ª reunião do GBCFLUX : 19/junho/2010 - Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo - SP

3ª reunião do GBCFLUX : Laboratório Fleury

CITOMETRIA DE FLUXO

HISTÓRICO E PRINCÍPIOS

CITOMETRIA DE FLUXO PARA CLÍNICOS

PROGRAMA EDUCACIONAL HEMO 2010

Mariester Malvezzi

Universidade Federal do Paraná

HC-UFPR

HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO

Inicia com a Microscopia no século XVII - Loewenhoek

Século XIX Corantes – Erlich – 1880-Fluoresceína

1934 Moldavan sugere um aparelho que conte células com um fotodetector que registra a passagem da célula.

Anos 40-50 Microscopia de fluorescência em lâmina

# - corantes para ácidos nucleicos de células neoplásicas

# - ligação de anticorpos a marcadores de fluorescência

1956 Coulter desenvolve um sistema que conta as células sanguíneas através de sinais elétricos, enquanto elas passam por um fluxo contínuo.

HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO

1965 Fulwyler – Lab Nac de Los Alamos desenvolve um

aparelho que separa eritrócitos, combinando a tecnologia

Coulter com a tecnologia do jato de tinta usada em

impressoras - vibração.

1967 Kamenstsky e Melamed colocam a célula em um

tubo capilar e a separam em fluxo.

1968 Wolfgang Gohde – Un. Munster+Partec

Impulszytophotometrie

1969 Van Dilla utiliza em um mesmo aparelho a

fluorescência + princípio de focalização hemodinâmica +

iluminação a laser.

HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO

1972 Herzenberg usou Anticorpos ligados à fluoresceína, BD e

cunhou o termo FACS Fluorescence Activated Cell Sorter

1975 Kohler e Milstein criam os primeiros anticorpos monoclonais,

através da fusão de material genético de células B antígeno-

específicas com células de mieloma múltiplo.

Após houve uma colaboração frenética entre cientistas e indústria

citômetros para pesquisa facilidade no uso citômetros mais

acessíveis para o laboratório clínico a partir de 1980.

1988 Conferência de Engenharia da Fundação Americana muda o

nome de Impulszytophotometrie para Citometria de Fluxo

CITÔMETROS

1968 1973

CITÔMETROS

FACSCan - 1974

EPICS – 1977/78

SHAPIRO, M.H. Practical Flow Cytometry, 3ed, New York, Wiley-Liss, 1995.

http://picf.ioc.fiocruz.br/apostila.docDr. Álvaro Luiz Bertho, PhD

HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO

ÁREAS DO CONHECIMENTO LIGADAS

À CITOMETRIA DE FLUXO

SISTEMA DE

FLUXO COULTER

LASER

SEPARAÇÃO CELULAR

ANTICORPO

MONOCLONALFLUOROCROMO

CITOQUÍMICA

COMPUTAÇÃO

PROGRAMAS

ANÁLISE

IMUNOFENOTIPAGEM

COMPARAÇÃO ENTRE IMUNOFLUORESCÊNCIA POR

MICROSCOPIA E CITOMETRIA DE FLUXO

MICROSCOPIA CITOMETRIA

* 100 - 1000 CÉLS/ EXAME * > 1 MILHÃO CÉLS/ EXAME

* 5 MINUTOS / TESTE * 1 MINUTO / TESTE

* SUBJETIVO * OBJETIVO

* POSITIVO/NEGATIVO * MULTIPARAMÉTRICO

* BAIXA REPRODUTIBILIDADE * ALTA REPRODUTIBILIDADE

* TRABALHOSO * AUTOMATIZADO

O QUE É?

Método de análise citológica através

de instrumento equipado com laser, que

permite a identificação, a caracterização, a

contagem e a separação física de células

em suspensão.

PROPRIEDADES

Permite avaliar um grande número

de células

Em curto período de tempo

Com grande sensibilidade e

especificidade

Proporcionando informação

multiparamétrica

1- Preparo da

amostra em

bancada -

Paineis

2- Passagem

da amostra

no citômetro

3- Análise dos

gráficos

FLUXO

1- Preparo

da amostra

em bancada

-Paineis

2- Passagem

da amostra

no citômetro

3- Análise dos

gráficos

FLUXO

É PRECISO SABER

O QUE É CD ?

NÃO É “COMPACT DISK”.

É “CLUSTER OF DIFFERENTIATION”.

PADRONIZA AS VÁRIAS ORIGENS DE CLONES

DE ANTICORPOS MONOCLONAIS UTILIZADOS

PELAS DIVERSAS EMPRESAS, AGRUPANDO-OS

NUM SÓ NÚMERO, SEGUIDO OU NÃO DE

LETRAS MINÚSCULAS.

O MESMO NOME DO CD DEFINE O ANTÍGENO.

Cada CD é ligado a um fluorocromo específico-ID

Paineis – Morfologia?

1- Preparo da

amostra em

bancada -

Paineis

2- Passagem

da amostra

no citômetro

3- Análise dos

gráficos

FLUXO

FUNDAMENTOS

ANALISA PARTÍCULAS em SUSPENSÃO.

PARTÍCULAS + AcMo LIGADO ao FLUOROCROMO.

ALINHAMENTO das CÉLULAS umas ATRÁS das OUTRAS em

uma CORRENTE FLUÍDICA.

PASSAGEM por uma FONTE LUMINOSA - LASER.

GERAÇÃO de DISPERSÃO de LUZ ao ENCONTRAR a CÉLULA.

EMISSÃO de NOVAS CORES PRODUZIDAS pelos DIFERENTES

FLUOROCROMOS, LIGADOS aos AcMo ESPECÍFICOS.

DETECÇÃO dos SINAIS LUMINOSOS.

TRANSFORMAÇÃO em IMPULSOS ELETRÔNICOS.

AMPLIFICAÇÃO dos SINAIS ELETRÔNICOS.

CONVERSÃO DESTES em SINAIS DIGITAIS.

ANÁLISE em PROGRAMA de COMPUTADOR.

É PRECISO SABER

*Parâmetros de dispersão de luz

FSC tamanho celular - viabilidade e conteúdo de DNA

SSC composição interna - grânulos, organelas e núcleo

*Parâmetros de fluorescência

# FL1 FITC = Fluoresceína

# FL2 PE = Ficoeritrina

# FL3 PECy5=Cianina, PerCP=Peridinina, ECD

# FL4 APC = Alocianina

Dispersão de Luz

Laser

Sensor FSC

Sensor SSC 900

5º

Fluorescência

Dispersão de Fluorescência

Dispersão de Luz +

Fluorescência

Laser

.FSC

. Detectores de Fluorescência

(PMT1, PMT2, etc.)

. SSC

INTERIOR DE UM CITÔMETRO DE

04 CORES

C

É

L

U

L

A

S

P

A

S

S

A

N

D

O

1- Preparo da

amostra em

bancada -

Paineis

2- Passagem

da amostra

no citômetro

3- Análise

dos gráficos-

Programas

de Análise

FLUXO

Tipos de diagramas

1 parâmetro

Histograma

2 parâmetros

Dot Plot

CÉLULAS CD34+

CD45 EM MO NORMAL

Eosinophils

Monocytic

cells

Mature

Lymphocytes

CD34+ B-cell

precursors

HPC

NRBC

A

UNGATED BM EVENTS

Basophils

pDC

CD34- B-cell precursors

CD45-PerCP

SSC

Orfao,A. 2009

CD45 EM MO NORMAL

EVOLUÇÃO

CITÔMETROS

FACSCaliburFC-500

FACSCanto II

CITÔMETROS

FACS-ARIA EPICS-ALTRA

NOVOS LASER/FLUOROCROMOS

1-Laser azul 488nm: FITC – 519nm, Alexa Fluor 488-519nm, PE- 578nm, PE-Texas Red- 615nm, PE-Cy5-667nm, PerCP- 678nm, PerCP-Cy5.5- 695nm, PE-Cy7-785nm.

2- Laser vermelho 640nm: APC- 660nm, Alexa Fluor647- 668nm, Alexa Fluor 700- 719nm, APC-Cy7- 785nm, APC-H7- 785nm.

3- Laser violeta 405nm: Horizon V450- 448nm, PacificBlue- 452nm, Am Cyan- 491nm, Horizon V500- 500nm.

4- Laser verde 532/561nm: PE- 578nm, PE-Texas Red-615nm, PE-Cy5- 667nm, PE-Cy7- 785nm.

O que mais podemos analisar

por Citometria de Fluxo?

Metabolismo

ReceptoresDNA Citocinas

Enzimas

Antígenos celulares

Tamanho

Complexidade

FUTURO

FUTURO

?

TUDO É POSSÍVEL

HOSPITAL DE CLÍNICAS - UFPRHOSPITAL DE CLÍNICAS DA UFPR

EQUIPE DE IMUNOFENOTIPAGEM

Ana Paula de AzambujaEdna MartinsEliana L LimaElisa NovelloJuli PimentelMaria Tadeu L RochaMiriam P Beltrame Noeli T Silva

OBRIGADA

1968- Wolfgang Gohde-Citometria de fluxo baseada em fluorescência-IMPULSZYTOPHOTOMETRIE-Un de Munster+Partec

1971-Cytofluorograph-Ortho diagnostics

1973-PAS 8000-Partec

1974-FACS-BD

1975-ICP22-Partec

1977-78-EPICS- Coulter

CITÔMETROS

Dispersão de Luz

Laser

SSC

FSC

LINFÓCITOS T MADUROS

CD4

CD8

CD2

CD7

CITÔMETROS

Partec

CyAn

Tamanho - FSC X

Complexidade - SSC

FSC X SSC

PLAQUETAS GIGANTES

PLAQUETAS DIÂMETROAUMENTADO

PLAQUETAS NORMAIS

FSC X SSC FSC X SSC

Gráfico de

Fluorescência

R2

O que é necessário para a

imunofenotipagem celular?

Citômetro de fluxo: compensação, calibração e

controles negativos

Anticorpos monoclonais

Fluorocromos

Paineis

Programas de Análise

CITÔMETROS

HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE

FLUXO NO BRASIL

Curitiba-antes de 1985-Ac trazidos da Itália pelo Dr.Eurípedes permitiam fazer diagnóstico de leucemias com E-roseta, Zimosan e a citotoxicidade.

Em 1985 Dr. Raul Ribeiro trouxe dos EUA Ac e a reação em placa , que colocada em lâminas eram lidas em microscópio de imunofluorescência.

FMUSP-1993-Beatriz Beutler

Em 1993-citometria de fluxo – 1997 – FACSVantage

EPM- 1987-imunofenotipagem por imunofluorescência

1989- APPAP-imunocitoquímica

1997-Citômetro FACSCalibur

Maria do Socorro Pombo de Oliveira-INCA, Valéria Buccheri-Fundação maria Cecília Vidigal, Neusa Melo -USP=Dr. Catovski

Lab Fleury-Dra.Maria Hsu – 1994=1ª reunião de Citometria de Fluxo, HAEinstein-Dra. Nydia Bacal