GENOMA E NUTRIÇÃO

CLAUDIA MARIA MEIRELLES MARCHINI

Genoma

• É a informação genética

pertencente a uma célula ou

um organismo

• Genoma humano apresenta

aproximadamente

25 mil genes

Projeto Genoma humano

• Mapeamento do genoma humano

• Identificação dos nucleotídeos

• Aproximadamente 1,5% do genoma codificam proteínas

• Seqüências genoma que não codificam proteínas consistem

RNA, seqüências regulatórias, íntrons e “junk” DNA

Ômicas: novas ciências* Genoma

* Transcriptoma

* Proteoma

* Metaboloma

* Nutrogenoma

* Lipidoma

Outras Ômicas…

Interação Nutriente – Gene• Objetivo: estabelecer dietas personalizadas com base no

genótipo para promover a saúde diminuindo os riscos de

doenças crônicas (cardiovasculares, diabetes, câncer...)

• É fundamental a aplicação na área da nutrição das

ferramentas da genômica funcional para a análise do

transcritoma, do proteoma e do metaboloma.

• Aplicabilidades: cultura de células, modelos

experimentais em animais, estudos pré-clínicos e clínicos

Ciências Nutricionais• Galactosemia é um defeito genético na enzima GALT, levando a um

acúmulo de galactose no sangue

• Fenilcetonúria é um defeito genético na enzima fenilalanina-

hidrolase, levando a um acúmulo de fenilalanina

• Deficiências de vitaminas como a B12, ácido fólico, B6, C, E, ferro

ou zinco causam dano no DNA quebrando a dupla-fita

• A deficiência de nutrientes pode explicar porque ¼ da população

dos Estados Unidos que não consome as 5 porções diárias

recomemdadas de vegetais e frutas tem um risco 2 X maior de

desenvolverem câncer

Nutrigenômica

“Caracteriza uma nova visão do estudo de alimentos e da pesquisa

nutricional na qual a avançada tecnologia funcional genômica é

usada, ao lado de técnicas nutricionais e bioquímicas, para

determinarem os mecanismos pelos quais os alimentos e seus

componentes individuais modulam processos que ocorrem nos

tecidos do corpo humano”.

Instituto de Pesquisa de Alimentos, 2001

Abordagem molecular: Estudo entre as interações dos nutrientes com os genes e o efeito na saúde do indivíduo

Nutrientes atuam em transdução de sinal

Chá verde

Polifenol

11-epigallocatechin-3-gallate (EGCG)

Inibe NF-kappaB fator de transcrição

Porque individuais respondem de forma

diferenciada a uma dieta especifica?

Variabilidade genética!

Antes

* Durante as cercas de 1016 mitoses possíveis durante uma vida

humana, em cada LOCUS podem ocorrer 108 a 1010 mutações

Mutações

Antes Depois

Luzultra-violeta

Mutações* Alteração permanente e transmissível na seqüência de nucleotídeos

em um gene que pode causar a alteração ou a perda da função normal.

| | | | | | | | |A T C G T A C G G

T A G C A T G C C

T A G C C T G C C

T A G C A T G C CA T C G T A C G G

A T C G G A C G GT A G C C T G C C

A T C G T A C G G

U A G C C U G C CU A G C A U G C CTranscrição

Replicação

RNA:

A T C G T A C G G

Proteína:

Tipos de Mutação

Sem Sentido

TAC CAC GTG ATA

AUG GUG CAC UAU

MET VAL HIS TYR

TAC CCC GTG ATT

AUG GGG CAC UAA

MET GLY HIS STOP

... !

Tipos de Mutação

Sentido Trocado

TAC CAC GTG CAC

AUG GUG CAC GUG

MET VAL HIS LEU

TAC CCC GTG CAC

AUG GGG CAC GUG

MET GLY HIS LEU

A estrutura da proteína permite que sua função seja executada. Alteração em sua estrutura afetará sua especificidade ou atividade.

Radiação Ionizante

* Formação de dímeros de Pirimidina

* Interrupção da replicação

* Seqüências truncadas

Modificações das Bases Nitrogenadas

Mutagênicos Químicos

* Alguns mutagênicos químicos modificam a estrutura molecular das bases.

* No caso dos agentes alquilantes, são adicionados grupos etil ou grupos metil

Mutagênicos Químicos

Ferguson & Philpott. The annual Review of Nutrition, 28:12.1-12.17, 2008.

Structures of dietary mutagens

Aflatoxina B1

* Produzida pelo fungo Aspergillus flavus

Aflatoxina B1

* Populações expostas a esta molécula tem alto índice de hepatocarcinoma

* 50% dos casos de hepatocarcinoma apresentam mutação no gene p53

GC TA

Transversão

Polimorfismo

Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

* Variação em uma seqüência de DNA em um único nucleotídeo

* Deve ocorrer em ao menos 1% da população

Como são detectadas as diferenças entre os indivíduos?

• O brócolis possui algum efeito na expressão genética na dieta?

• Experimento por um mês utilizando a Dieta A (enriquecida por Brócolis) e Dieta B (ausência de Brócolis outras hortaliças semelhantes)

• Sujeitos: gêmeos idênticos saudáveis

Microarranjo

• DNA microarray, DNA chip, genome chip,

expression chip e gene array

• São vendidos comercialmente por empresas

de biotecnologia

Aproximadamente 10.000 pontos/cm2

DNA Microarray

Cada ponto representa um gene distinto

Extração RNA

• O RNA é separado com auxílio de uma centrífuga , a

velocidade alta separa os componentes da solução

dependendo do tamanho ou densidade

RNA

Proteína, DNA e outros componentes

RNA total

•RNA mensageiro

•RNA transportador

•RNA ribossômico

Isolamento do mRNA

• Colunas contendo pequenas esferas recobertas por

poli-T que se ligam somente com mRNA que

possuem cauda poli-A

Pequenas esferasconstituem a coluna

Aumento de uma esfera

Retenção do mRNA na coluna

• As fitas de mRNA

ficaram retidas nas

esferas poli-T por meio

das caudas poli-A

Recuperação do mRNA

• Como liberar o mRNA das esferas?

– O pareamento de bases entre moléculas de DNA

é comprometido por concentrações de sais e pH

Produção de uma cópia de cDNA fluorescente

• Montagem de uma fita complementar de

DNA oposta a molécula de mRNA

Solução Fluoresncente verde

Solução fluorescentevermelha

Dieta BDieta A

Conteúdo da solução fluorescente

• Primers Poli-T: unem-se as

cadeias poli-A dos mRNA

• Transcriptase reversa: uma

enzima que sintetiza a fita de

cDNA

• Nucleotídeos fluorescentes:

serão incorporados na nova

molécula de cDNA

Aplicação do cDNAs marcados com fluorescência

• Transcriptase reversa produz cDNA fluorescente e

moléculas de mRNA foram degradadas com RNAses

cDNAs vermelhoshibridaram comeste ponto

cDNAs verdeshibridaram comeste ponto

cDNAs que não hibridaram

cDNAs vermelhose verdes hibridaram Com este ponto

Leitura da placa de microarray

• O scanner lê um fluoróforo

por vez;

• O programa faz uma

sobreposição das imagens;

• O importante são os pontos

verdes e vermelhos isolados

Exemplo de aplicação do microarray

• Uma linhagem celular de carcinoma de cólon

foi tratada com sulforafona

• Composto bioativo de brócolis

Resultado:

• Indução da expressão do 106 genes

• Inibição da expressão de 63 genes

– Atividade anticarcinogênica

Limitações• Necessidade de quantidades significativas de tecido para o

isolamento de mRNA.

• Necessidade de repetições para obter valor significativo

• Alto custo da técnica

• O tratamento com nutrientes específicos promovem,

geralmente, pequenas alterações na expressão gênica,

dificultando a análise dos resultados

• Baixa reprodutibilidade utilizando-se plataformas de

diferentes fabricantes

Doença inflamatória intestinal (IBD)

• Inflamação crônica do trato gastrointestinal

– Colite ulcerativa (UC)

– Doença de Crohn (CD)

• Sintomas: diarréia, cólica abdominal, febre e sangramento

• Tratamento: remédios que controlam os sintomas, mas não

curam a doença; dieta controlada

Doença inflamatória intestinal (IBD)

Genes envolvidos no estabelecimento da IBD

• Reconhecimento de bactérias

• Na modulação da resposta inflamatória

• No transporte de moléculas na mucosa

intestinal

Proteína NOD2

Proteção contra bactérias invasivas

I) Genes envolvidos no reconhecimento de bactérias

Afetam Resposta Imune

Autoimunidade

II) Genes envolvidos na modulação da resposta imunológica

Transdução de Sinal Intracelular

III) Genes envolvidos no transporte de moléculas na mucosa intestinal

Dieta na doença inflamatória intestinal

• A IBD pode ser controlada com uma dieta elemental, que

parece modular a ação de citocinas e mudar a microbiota do

intestino

• Desafios: não existe um grupo de alimentos que seja

benéficos ou causem danos a todos os pacientes. A dieta de

eliminação é usada para se verificar as necessidades

individuais

Perspectivas IBD

• Omega-3 pode reduzir os sintomas da inflamação; Chá verde pode regular a expressão de proteínas transportadoras

• Porém o gene de interesse deve estar funcionando normalmente no paciente

• A identificação dos genes levam ao desenvolvimento da doença e assim permitir uma abordagem mais específica

• Dietas específicas poderiam aliviar os sintomas e curar até 90% dos pacientes

Concluindo

• Nutrientes alteram processos moleculares, expressão

genética e metabolismo

• Variações genéticas individuais podem influenciar como os

nutrientes são assimilados

• Ferramentas moleculares estão sendo empregadas para

examinar a resposta individual aos nutrientes

• A nutrigenômica irá desenvolver dietas personalizadas para

prevenir o surgimento de doenças e manter a saúde humana

OBRIGADA PELA ATENÇÃOcmmarchini@gmail.com