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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE ENGENHARIA FLORESTAL

Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais e Ambientais

CULTIVO In Vitro DE Cochlospermum regium (Schrank)

Pilger

NATÁLIA HELENA GAVILAN

CUIABÁ-MT 2016

NATÁLIA HELENA GAVILAN

CULTIVO In Vitro DE Cochlospermum regium (Schrank)

Pilger

Orientador: Prof. Dr. Gilvano Ebling Brondani Co-Orientador: Dr. Leandro Silva de Oliveira

Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia Florestal da Universidade Federal de Mato Grosso, como parte das exigências do Curso de Pós- Graduação em Ciências Florestais e Ambientais, para obtenção do título de Mestre em Ciências Florestais e Ambientais.

CUIABÁ-MT 2016

iii

Dedico esse trabalho: Aos meus pais, Vera e Ulderico

Aos meus irmãos, Arthur e João Pedro

iv

AGRADECIMENTOS

À minha família, que pacientemente soube lidar com a minha

fase mestrado, pelo amor, carinho, compreensão, incentivo e todo apoio

que me deram para que chegasse até aqui.

À Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), pela

oportunidade de poder complementar minha formação.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Gilvano Ebling Brondani, pela

paciência, pela orientação, compreensão, críticas, conselhos e amizade.

Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Leandro Silva de Oliveira, por

todo o conhecimento partilhado, orientação, ajuda na coleta de campo,

ajuda nas longas horas iniciais de laboratório, pela amizade, críticas,

conselhos e sugestões.

Aos colegas de curso e laboratório, Alex e Fernanda, sozinhos

jamais teríamos feito metade do que conseguimos. Fer, obrigada pela

amizade/irmandade, por me surpreender mostrando ser uma pessoa

maravilhosa, por todas as brigas que compramos juntas, enfim, todo

apoio. Alex, obrigada por quebrar o galho quando não poderia ir ao

laboratório e você estava sempre disposto a ajudar.

Aos meus amigos Cinthia, Thadeu, Marina, Rafaela, Maria

Clara, Benito, Samy e Yarim pela paciência, compreensão e amizade, não

deve ter sido fácil me ouvir falar sobre esses anos de mestrado e eu não

teria conseguido passar por eles sem vocês.

À Dra. Erika Mendes Graner pelo auxílio na análise histológica

das minhas lâminas.

Aos componentes da banca examinadora, por aceitarem fazer

parte desse trabalho, suas contribuições, sugestões, críticas e

conhecimento.

Ao ICMBio pela autorização de coleta de material botânico na

Unidade de Conservação Parque Nacional da Chapada dos Guimarães –

Chapada dos Guimarães, MT.

v

É necessário abrir os olhos e perceber que as coisas boas estão dentro

de nós, onde os sentimentos não precisam de motivos, nem os desejos

de razão. O importante é aproveitar o momento e aprender sua duração,

pois a vida está nos olhos de quem sabe ver.

Gabriel Garcia Marques

vi

SUMÁRIO

RESUMO ......................................................................................... i

ABSTRACT ...................................................................................... i

1 INTRODUÇÃO .............................................................................1

1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................2

1.1.1 A ESPÉCIE Cochlospermum regium ......................................2

1.1.1.1 Caracterização botânica e habitat .......................................2

1.1.1.2 Etnobotânica e etnofarmacologia ........................................4

1.1.1.3 Propriedades fitoquímicas e biológicas ................................7

1.1.1.4 Características agronômicas ...............................................8

1.2 MICROPROPAGAÇÃO .............................................................9

1.2.1 Princípios gerais da micropropagação ....................................9

1.2.2 Esterilização química do meio de cultura ..............................11

1.2.3 Fitorreguladores ...................................................................12

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................14

2 ESTERILIZAÇÃO QUÍMICA DO MEIO DE CULTURA PARA A

MULTIPLICAÇÃO in vitro DE Cochlospermum regium ............................23

2.1 INTRODUÇÃO ........................................................................24

2.2 OBJETIVOS ............................................................................26

2.2.1 Objetivo geral .......................................................................26

2.2.2 Objetivos específicos ............................................................26

2.3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................26

2.3.1 Caracterização geral ............................................................26

2.3.1.1 Fonte dos explantes ..........................................................27

2.3.1.2 Tratamentos e delineamento experimental ........................28

2.3.1.2.1 Multiplicação in vitro .......................................................28

2.3.1.3 Preparo do meio de cultura e condições de crescimento ...29

2.3.3 Análise estatística dos dados ...............................................30

2.4 RESULTADOS ........................................................................30

2.5 DISCUSSÃO ...........................................................................38

2.6 CONCLUSÕES .......................................................................41


vii

3 CALOGÊNESE E ORGANOGÊNESE INDIRETA DE

Cochlospermum regium ...........................................................................45

3.1 INTRODUÇÃO ........................................................................46

3.2 OBJETIVOS ............................................................................47

3.2.1 Objetivo geral .......................................................................47

3.2.2 Objetivos específicos ............................................................47

3.3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................48

3.3.1 Caracterização geral ............................................................48

3.3.1.1 Fonte dos explantes ..........................................................48

3.3.1.2 Tratamentos e delineamento experimental ........................49

3.3.1.2.1 Calogênese ....................................................................49

3.3.1.2.2 Regeneração in vitro ......................................................49

3.3.1.3 Preparo do meio de cultura e condições de crescimento ...50

3.3.3 Análise estatística ................................................................51

3.4 RESULTADOS ........................................................................51

3.4.1 Calogênese ..........................................................................51

3.4.2 Regeneração in vitro ............................................................55

3.5 DISCUSSÃO ...........................................................................58

3.6 CONCLUSÕES .......................................................................60


viii

RESUMO

GAVILAN, Natália Helena. Cultivo in vitro de Cochlospermum regium (Schrank) Pilger. 2015. Dissertação (Mestrado em Ciências Florestais e Ambientais) - Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá-MT. Orientador: Prof. Dr. Gilvano Ebling Brondani. Coorientador: Prof. Dr. Leandro Silva de Oliveira.

Cochlospermum regium é uma espécie nativa do Cerrado que apresenta importância econômica devido ao seu potencial medicinal. A destruição do bioma e o uso desordenado de suas raízes pela população local visando a elaboração de fitoterápicos têm agravado ainda mais o risco de extinção. Contudo, estudos sobre a micropropagação da espécie ainda são escassos, principalmente ao considerar o desenvolvimento de protocolos que busquem definir as melhores condições para o cultivo in vitro, como é o caso da esterilização química do meio de cultura e da organogênese indireta. O presente estudo teve como objetivos: (i) elaborar um protocolo de multiplicação de gemas axilares de Cochlospermum regium por meio da esterilização química do meio de cultura, sendo o experimento conduzido em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial (4x5), com parcelas subdivididas no tempo, onde foram utilizados quatro preparos do meio de cultura (M1 – meio de cultura autoclavado, M2 – 0,001%, M3 – 0,003% e M4 – 0,005% de cloro ativo adicionado ao meio de cultura) e cinco subcultivos; e (ii) desenvolver um protocolo de organogênese indireta visando à calogênese e a regeneração de brotos adventícios, onde os tratamentos propostos baseram-se na combinação do tipo de explante (cotilédone, hipocótilo e raiz) e o tipo de fitorregulador (2,4-D, TDZ e ANA), sendo os experimentos conduzidos em delineamento inteiramente casualizado no esquema fatorial (3x3). Para o protocolo de multiplicação de gemas axilares em relação a esterilização química do meio de cultura, observou-se que o preparo convencional (meio de cultura autoclavado) apresentou os melhores resultados em relação ao preparo do meio de cultura suplementado com o cloro ativo. No entanto, foi possível recomendar o uso de até 0,005% de cloro ativo para a esterilização química do meio de cultura (sem a necessidade de autoclavagem), apresentando controle satisfatório de agentes contaminantes (como fungos e bactérias), além de apresentar a maior proliferação de brotos. Para a organogênese indireta verificou-se que o TDZ (thidiazuron) foi o fitorregulador que favoreceu a calogênese, independentemente do explante utilizado, enquanto que associado ao explante do tipo hipocótilo, resultaram nas melhores respostas quanto a regeneração de brotos adventícios. Palavras-chave: algodãozinho-do-cerrado; esterilização química; calogênese; organogênese indireta.

ix

ABSTRACT

GAVILAN, Natália Helena. Cultivation in vitro of Cochlospermum regium (Schrank) Pilger. 2015. Dissertation (Master in Forestry and Environmental Sciences) - Federal University of Mato Grosso, Cuiabá-MT. Advisor: Prof. Dr. Gilvano Ebling Brondani. Supervisor: Prof. Dr. Leandro Silva de Oliveira.

Cochlospermum regium is a native species to the Cerrado that has economic importance because of its medicinal potential. The destruction of the biome and the unrestricted use of C. regium roots by local human populations, which are aimed at producing phytotherapics, has aggravated its risk to extinction. However, studies concerning the micropropagation of the species are still scarce, especially when considering the development of protocols that seek to define the best conditions for their in vitro culture, such as the chemical sterilization of the culture medium and indirect organogenesis. This study aimed at: (i) Developing a protocol for multiplication of axillary buds of Cochlospermum regium through chemical sterilization of the culture medium, being the experiment conducted in a completely randomized design with factorial arrangement (4x5) with plots split through time. In this experiment, we used four preparations of the culture medium (M1 – autoclaved, M2 – 0.001%, M3 – 0.003%and M4 – 0.005% of active chlorine added to the culture medium) and five subcultures;(ii) Developing an indirect organogenesis protocol aimed at callus formation and regeneration of shoots, where the treatments were the combination of the type of explant (cotyledon, hypocotyl and root) and the type of plant growth regulator (2,4-D, TDZ and NAA). The experiments were conducted in a completely randomized design in factorial scheme (3x3). As regards the multiplication protocol of axillary buds concerning the chemical sterilization of the culture medium, the conventional preparation of the culture medium (autoclaved) showed the best results in comparison to the culture medium supplemented with active chlorine. However, it was possible to recommend the use of 0.005% of active chlorine for the chemical sterilization of the culture medium (without autoclaving), showing satisfactory control of contaminants (such as bacteria and fungi)/It also exhibited the best shoot proliferation results. As what concerns indirect organogenesis, we found that TDZ (thidiazuron) was the growth regulator that most favored callus induction regardless of the explant used. Mean while, when associated with the hypocotyl explant type, it resulted in the best responses and the regeneration of adventitious shoots. Keywords: algodãozinho-do-cerrado; chemical sterilization; in vitro callus induction; indirect organogenesis.

1

1 INTRODUÇÃO

O Cochlospermum regium (Schrank) Pilger é uma espécie

muito utilizada por possuir propriedades medicinais. Populações

tradicionais do Cerrado fazem uso desse extrato, o que vem prejudicando

a regeneração natural da espécie. No entanto, essa não é a única

maneira de devastação dessa espécie, que sofre também, com o

desmatamento do Cerrado para a ocupação humana e atividades

agrícolas. O uso desordenado de suas raízes para a produção de extratos

fitoterápicos vem causando erosão genética da espécie, tendo em vista

que a parte utilizada são as raízes e precisam ser coletadas por completo,

causando a morte da planta.

Diversos estudos farmacológicos comprovaram a eficiência do

extrato fitoterápico de suas raízes, e buscam o isolamento dos princípios

ativos por possuírem atividades antimicrobianas, os quais podem ser

utilizados na geração de fármacos, já que diversos fitoterápicos, de outras

espécies possuem autorização da ANVISA para comercialização.

Uma alternativa para evitar a extinção da espécie e também

para fornecer material para a farmacologia, têm sido o cultivo de tecidos

por meio da micropropagação, que consiste na propagação assexuada in

vitro em condições controladas, sendo uma ferramenta essencial, em

vista da espécie apresentar sementes com dormência tegumentar, o que

dificulta a sua germinação.

A micropropagação permite a produção em larga escala de

mudas, sendo muito utilizada na clonagem de espécies florestais de valor

comercial, o que não impede que seja utilizada como ferramenta para a

conservação de espécies nativas. No entanto, poucos são os estudos que

abordem essa técnica para a propagação de espécies nativas, do

Cerrado.

Ao considerar o Cochlospermum regium, caracterizada por ser

uma espécie medicinal intensamente utilizada pela população que habita

o Cerrado, vê-se a necessidade de multiplicá-la através da propagação in

vitro visando o abastecimento de mudas para o mercado e para fins

2

conservacionistas, tais como a criação de banco de germoplasma, além

de ser uma técnica alternativa à propagação via seminal.

Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo a

elaboração de protocolos de multiplicação in vitro de gemas axilares de

Cochlospermum regium.

1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1.1 A ESPÉCIE Cochlospermum regium

1.1.1.1 Caracterização botânica e habitat

Segundo o Missouri Botanical Garden (2014), a espécie

Cochlospermum regium apresenta a seguinte classificação taxonômica:

Reino: Plantae

Filo: Magnoliophyta Cronquist, Takht. & W. Zimm. Ex Reveal

Classe: Magnoliopsida Brongn.

Subclasse: Magnoliidae Novák ex Takht.

Super Ordem: Rosanae Takht.

Ordem: Malvales Juss.

Família: Bixaceae Kunth

Gênero: Cochlospermum Kunth

Espécie: Cochlospermum regium (Schrank) Pilger

A espécie é conhecida popularmente por diversos nomes, tais

como: algodãozinho-do-campo, algodão-cravo, algodão do mato, algodão

bravo, algodãozinho-do-cerrado (CAMILLO et al., 2009; INÁCIO et al.,

2011; PIO CORREA, 1975; SIQUEIRA, 1988). O C. regium é um arbusto

de ocorrência natural e frequente nas áreas de cerrado, pantanal e

caatinga (CAMILLO, 2008; CAMILLO et al., 2009; MENDONÇA et al.,

1998; SILVA, 1998).

Essa espécie é encontrada em áreas antropizadas, como em

bordas de matas e margens de estradas e ferrovias, sendo considerada

uma espécie pioneira, por ocorrer tanto em áreas abertas quanto em

3

perturbadas (COELHO et al., 2008; INÁCIO, 2010; POPPENDIECK,

1981).

O C. regium é um arbusto de aproximadamente dois metros de

altura, com raízes lenhosas, resistentes e bastante profundas, caule

ferrugíneo, nodoso e de ramos variando de coloração castanho-

avermelhada a acinzentada (RITTO e KATO, 1998; CAMILO, 2008;

KIRIZAWA, 1981; MENDONÇA et al., 1998; DURIGAN et al., 2004)

(Figura 1A).

As folhas são de coloração verde-escuras, alternas,

palmatífidas, com margem foliar variando de crenada a serrilhada, com

consistência coriácea e superfície pubescente, sendo longo-pecioladas,

com três a cinco lobos profundos e agudos (KIRIZAWA, 1981; CAMILLO,

2008; ANTUNES, 2009) (Figura 1B).

Suas flores são ígneo-fulvas ou amarelas, pentâmeras, em

formato de concha medindo de 6 a 8 cm de diâmetro, dispostas em

panículas terminais na extremidade de brotos grossos e totalmente

despidos de folhas, contendo de 5 a 10 flores (CAMILLO, 2008;

NORONHA e GOTTSBERGER, 1980; KIRIZAWA, 1981) (Figura 1C).

Os frutos formam uma cápsula deiscente ovóide, com cerca de

6 cm de comprimento. Sua coloração inicialmente é verde-escura,

tornando-se acastanhada quando se abre para liberar as sementes,

sendo essas reniformes e envoltas em filamentos compridos e lanosos

que se assemelham ao algodão comercial (ANTUNES, 2009; FERRI,

1969; MENDONÇA et al., 1998; PIO CORREA, 1984) (Figuras 1D e 1E).

O sistema radicular é bastante desenvolvido, com raízes

tuberosas devido a abundância de tecido parenquimático de reserva, o

qual é permeado pelo tecido vascular e pode atingir mais de 3 metros de

comprimento por 20 cm de diâmetro (KIRIZAWA, 1981) (Figura 1F).

A frutificação, germinação, desenvolvimento dos sistemas

aéreo e subterrâneo ocorrem nas épocas chuvosas, enquanto os botões

florais, frequentemente, ocorrem entre os meses de maio a julho, podendo

ocorrer também em períodos diferentes (ANTUNES, 2009; KIRIZAWA,

1981).

4

Uma característica única do C. regium, dentre as espécies do

gênero, refere-se a sua plasticidade em relação à floração. Suas flores

aparecem no topo da parte aérea anual do vegetal, que geralmente está

desfolhada na época. Quando o ramo do ano é destruído, pelos

incêndios, por exemplo, que são bastante frequentes no Cerrado, as

flores nascem ao nível do solo a partir do xilopódio, de onde também são

emitidos os ramos. Esta característica colabora para que a espécie se

adapte as intempéries da natureza e as ações antrópicas (INÁCIO, 2010;

POPPENDIECK, 1981).

FIGURA 1 – DETALHE DAS ESTRUTURAS DE UMA PLANTA DE Cochlospermum regium. (A) ARBUSTO; (B) FOLHA; (C) FLOR; (D) FRUTO VERDE; (E) FRUTOS MADUROS e (D) SISTEMA RADICULAR. FOTO: NATÁLIA HELENA GAVILAN (2014).

1.1.1.2 Etnobotânica e etnofarmacologia

O Cochlospermum regium é intensamente utilizado na

medicina popular e suas raízes são comercializadas em todo o bioma do

Cerrado (INÁCIO et al., 2011). De acordo com Nunes et al. (2003), a

espécie está classificada entre as 10 mais solicitadas e ou indicadas por

raizeiros em levantamentos realizados em 1992 e 2002.

Suas raízes são utilizadas na forma de fatias, cavacos ou pó,

para a preparação de chás, infusões e garrafadas (CASTRO et al., 2004).

5

O extrato de suas raízes é utilizado para diversos fins, tais como:

tratamento de infecções intestinais, gastrite, úlceras, artrite reumatóide,

leucorréia e afecções da pele depurativa do sangue (BATISTA et al.,

2014; CAMILLO et al., 2009; CASTRO et al., 2004; GUARIM NETO,

1987). No entanto, a maior indicação está relacionada à infecções do

ovário e do sistema reprodutor feminino (TRESVENZOL et al., 2006;

SOUZA e FELFILI, 2006).

Estudos revelaram diversas atividades farmacológicas, tais

como: efeitos anti-inflamatórios (PIO CORREA, 1975), efeitos analgésicos

e antidematogênicos (SIQUEIRA et al., 1991) e efeito antibacteriano para

Staphylococcus aureus e Escherichia coli (PIO CORREA, 1975;

SIQUEIRA et al., 1991; OLIVEIRA et al., 1996; CASTRO et al., 2004).

Siqueira (1988) adverte, entretanto, que a infusão da raiz é

empregada como um perigoso “purgativo”, devendo-se tomar o cuidado

de evitar doses excessivas no uso desta planta. Além disso, Cunha-Laura

et al. (2005) recomendaram cautela na utilização do extrato das raízes

durante a gestação, pois estudos realizados em laboratórios

demonstraram efeitos consideráveis de toxicidade neste período.

Na Tabela 1 estão relacionados os principais usos do C. regium

de acordo com levantamentos em diversas regiões brasileiras.

6

TABELA 1 – PRINCIPAIS USOS DE Cochlospermum regium.

Estado Órgão Uso Indicação Referência

TO

- - Dores de cabeça Rodrigues e Carlini (2005)

MT Raiz Chá, garrafada Inflamação em geral, problema de próstata e pneumonia.

Moreira e Guarim-Neto (2009)

GO Xilopódio Chá, garrafada ou pó Infecções ginecológicas, gastrite e úlcera gástrica Tresvenzol et al. (2006)

GO - - Infecção gástrica Carvalho (2004)

MS Raiz - Colesterol, feridas internas e externas, laxante, depurativo do sangue, inflamações da pele, útero, ovário e próstata

Nunes et al. (2003)

MT Casca Chá Depurativo do sangue Guarim-Neto (2006)

GO - - Inflamações uterinas, vias urinárias, diarréia Souza e Felfili (2006)

MT Rizófaro Decocto, chá Infecções, inflamações, corrimentos, depurativo Souza e Felfili (2006)

MT Folha Chá Cálculo renal, úlcera Sangalli et al. (2002)

MT Raiz Chá, banho Inflamação de mulher, inflamação do útero Loureiro (1999)

MT Raiz - Gonorréia, inflamação do útero e ovário, leucorréia, afecções não específicas do trato urinário

De La Cruz (1997)

MT Raiz Chá, garrafada com vinho

Dor de bexiga e urina, depurativo do sangue, anti-acne

Somavilla (1998)

GO Casca, raiz Decocto Afecções urogenitais, purgativo Vila-Verde et al. (2003)

ADAPTADO DE INÁCIO (2010) E SÓLON (2009).

7

1.1.1.3 Propriedades fitoquímicas e biológicas

A busca pela caracterização fitoquímica de Cochlospermum

regium é intensa e foram identificados diversos compostos. Flavanóides

(dihidro-kaempferol-3-O-glicose e kempferol) foram isolados em extratos

dos rizomas da espécie com acetato de etila (SIQUEIRA et al., 1994;

LIMA et al., 1995). Ritto (1996) relatou que as raízes de C. regium contêm

compostos triterpenóides, flavanóides, saponinas, taninos e compostos

fenólicos, posteriormente isolados e identificados os componentes 1-

hidroxi, tetradecanona-3, naningenina e aromadendrina. Amostras

químicas comprovaram a presença de taninos, derivados fenólicos,

mucilagem e óleos essenciais (HONDA et al., 1997; LIMA et al., 1996).

Em investigação fitoquímica no extrato hidroalcoólico das

raízes de C. regium, foram detectados cinco derivados fenólicos e dois

triacilbenzenos, conhecidos como Cochlosperminas A e B. O padrão

quimiotaxonômico pode ser caracterizado pela presença de flavonóides

triaclbenzenos e derivados de ácido gálico, fornecendo apoio para

justificar o uso popular desta espécie no tratamento de infecções

(SÓLON, 2009; SÓLON et al., 2012).

A presença do flavanóide Kaempferol (F-52) nas raízes de C.

regium foram confirmadas através de análises fitoquímicas e

farmacológicas e que apresenta propriedades analgésicas,

antidermatogênicas, anti-bacterianas, antioxidantes, mutagênicas e

citotóxicas (CAMILLO et al., 2009).

Existem estudos que buscam verificar a eficácia dos compostos

fitoquímicos de C. regium, tal como o relato de que o flavonóide 3-0-

glicosildihidrocanferol, isolado a partir de extrato de raízes, apresenta

efeito antinociceptivo, além de atividade anti-bacteriana do óleo essencial

(CASTRO, 2000; BRUM et al., 1997). Além disso, também foi detectada a

atividade citotóxica do extrato de C. regium em células CHO-K1 não

tumorigênicas, por inibição da proliferação celular e a indução da

apoptose (CESCHINI e CAMPOS, 2006), considerando que não houve

efeito antimutagênico quando avaliado no osso da medula de ratos

(ANDRADE et al., 2008).

8

Em vista dessas observações, estudos químicos,

farmacológicos e toxicológicos justificam, parcialmente, a eficácia do

extrato fitoterápico de C. regium (SÓLON et al., 2009), destacando

potencialidade para o aplicações comerciais.

1.1.1.4 Características agronômicas

O Cerrado, apesar de ocupar uma área de aproximadamente 2

milhões de km2 e conter uma elevada biodiversidade, têm sido pouco

valorizado em termos de conservação (MENDONÇA et al., 1998; BRASIL,

1999; FELFILI et al., 2002). A abertura de extensas áreas para pastagens,

lavouras, principalmente de soja, contribuiu para uma redução drástica

das áreas de cerrado (FELFILI et al., 2002), além de ocasionar a extinção

de espécies nativas com potencial biológico e econômico, ainda a serem

estudados, como é o caso do C. regium.

C. regium é considerada uma planta forrageira, ornamental e

medicinal, com resistência às queimadas e ao pastejo. Mesmo

sobrevivendo em condições áridas, está sendo considerada em perigo de

extinção, enquadrando-se na lista de espécies medicinais ameaçadas,

divulgada pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos

Naturais Renováveis (IBAMA) (POTT e POTT, 1994; SOUZA e LORENZI,

2008; IBAMA, 2015).

Sementes dessa espécie apresentam característica ortodoxa,

por tolerarem dessecação a -20ºC, e são consideradas dormentes devido

à presença do tegumento duro que impede a permeabilidade da água

(KIRIZAWA, 1981; CAMILLO, 2008).

A dormência de sementes têm fundamental importância para a

perpetuação e o estabelecimento de muitas espécies vegetais nos mais

variados ambientes, mas pode trazer desvantagens, principalmente ao

considerar a produção de mudas (ZAIDAN e BARBEDO, 2004).

Entretanto, esta dormência, pode ser superada com tratamentos

laboratoriais de escarificação mecânica (lixamento), química (ácidos) e

térmica (água quente), que promovem o rompimento do tegumento das

sementes, possibilitando à penetração de água e oxigênio, com

9

consequente reativação dos processos metabólicos que favorecem a

germinação (BORGES e RENNA, 1993).

O interesse medicinal associado ao perigo da extinção de C.

regium estimulou estudos agronômicos que objetivam, basicamente,

determinar métodos efetivos para superar a dormência da semente e

potencializar o processo de germinação possibilitando estabelecer

técnicas de cultivo e manejo para assegurar a sobrevivência e

disponibilidade deste material genético (SALES, 2001; MOLINARI et al.,

1996; NOGUEIRA e KUNIYOSHI, 1998; MELLO et al., 1998;

ALBUQUERQUE et al., 2002).

Dessa forma, a técnica de micropropagação pode ser utilizada

como ferramenta para a propagação de espécies que apresentam

dificuldade de germinação, como ocorre com o C. regium. Além disso,

essa técnica também poderá ser utilizada para a cultura de órgãos da

espécie visando à extração de compostos medicinais em escala

comercial.

1.2 MICROPROPAGAÇÃO

1.2.1 Princípios gerais da micropropagação

A micropropagação ou propagação in vitro proporciona a

clonagem de muitas espécies, permitindo a formação de indivíduos

geneticamente idênticos a partir de células, órgãos ou pequenos

fragmentos de uma planta matriz, os quais são mantidos em culturas

assépticas para regenerar novas plantas (INÁCIO, 2010; HARTMANN et

al., 2011). Os meios nutritivos fornecem substâncias essenciais para o

crescimento dos tecidos e também participam do controle do padrão de

desenvolvimento in vitro (CALDAS et al., 1998).

A micropropagação têm sido utilizada para a formação de

bancos de germoplasma, produção de plantas livres de doenças,

multiplicação rápida de plantas em períodos de tempo e espaço físico

reduzidos e rejuvenescimento de mudas de clones selecionados

10

(HARTMANN et al., 2011; GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998;

COMÉRIO et al., 1996).

Alguns procedimentos básicos iniciais devem ser seguidos a

fim de utilizar a técnica de micropropagação, dentre estes incluem-se a

seleção da planta-matriz, no qual deve ser considerada a sanidade e o

estádio fisiológico dos tecidos, o tipo de explante utilizado para iniciar o

cultivo in vitro, que podem ser folhas, cotilédones, talos, segmentos

nodais, ápices caulinares e radículas, dentre outros (ALBUQUERQUE et

al., 2000; SETHER et al., 2001; TEIXEIRA, 2005; CARVALHO et al.,

2006; INÁCIO, 2010).

O nível de diferenciação do tecido e a fase de desenvolvimento

em que se encontra devem ser levados em consideração para garantir o

potencial morfogênico e a estabilidade genética (SERRANO GARCÍA e

PIÑOL SERRA, 1991). Em programas de estabelecimento de bancos de

germoplasma ou de melhoramento genético, a juvenilidade do material

vegetal pode ser a chave do sucesso (BREESE, 1989; HIGASHI et al.,

2000; BACCARIN, 2012).

Grattapaglia e Machado (1998) estabeleceram que a

micropropagação pode ser dividida nas seguintes fases:

Fase 0: Refere-se ao condicionamento das plantas matrizes,

relacionando aspectos ligados a condição fisiológica, ao ambiente onde

ela se encontra e condições de sanidade. De maneira geral, as matrizes

vigorosas, sadias, isentas de qualquer tipo de estresse e em pleno

crescimento são aquelas que fornecem os melhores explantes, sendo a

nutrição das plantas matrizes um fator chave para o sucesso do

estabelecimento das culturas in vitro.

Fase I: Está ligada ao estabelecimento in vitro dos explantes,

onde neste estádio é visada a obtenção de explantes no tubo de ensaio

totalmente livre de contaminação, condição imprescindível ao

estabelecimento do mesmo, visto que o desenvolvimento de

microorganismos no meio de cultura pode resultar na morte do explante.

Nessa fase, todas as operações devem ser realizadas em condições

assépticas e em câmaras de fluxo laminar.

11

Fase II: É considerada a fase de multiplicação rápida dos

explantes obtidos sem contaminação na fase anterior (Fase I). Nessa

fase, objetiva-se a produção do maior número possível de gemas, no

menor espaço de tempo e com a máxima uniformidade.

Fase III: Refere-se ao alongamento das brotações obtidas por

multiplicação, caracterizando-se por ser uma fase necessária para a

maioria das culturas, visando condicioná-las para o enraizamento. Isto é

importante, pois a multiplicação dos explantes induz a formação de muitas

brotações pequenas, sendo necessário fornecer condições para a

indução de brotações mais alongadas, a fim de facilitar o manejo in vitro.

Fase IV: É a última etapa e está relacionada à indução do

enraizamento das brotações. Quando o enraizamento não ocorrer nas

condições de multiplicação in vitro, os explantes são acondicionados em

meio de cultura apropriado ao enraizamento, contendo maior relação

auxina/citocinina. No enraizamento ex vitro, os explantes induzidos in vitro

são enraizados em substrato sob condições de elevada umidade relativa

do ar (casa de vegetação ou outra estrutura adequada), para que os

mesmos formem as raízes e regenerem uma planta completa.

Para que o processo seja executado adequadamente, algumas

condições de incubação devem ser padronizadas, tais como a

manutenção da temperatura entre 20ºC e 27ºC e fotoperíodo entre 12h e

16h (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998).

1.2.2 Esterilização química do meio de cultura

Apesar das várias vantagens da micropropagação, alguns

problemas persistem e não satisfazem os interesses comerciais,

especialmente os altos custos de implementação e manutenção técnica

(BRONDANI et al., 2013).

Neste contexto, um dos principais problemas é o alto gasto de

energia e o tempo necessário para a preparação de material durante a

fase de autoclavagem do meio de cultura, a qual poderia ser substituída

pela adição de substâncias químicas ao meio de cultura que possa

erradicar os agentes patogênicos. Esse procedimento é conhecido como

12

esterilização química do meio de cultura (MACEK et al., 1995; BRONDANI

et al., 2013).

Uma das substâncias mais promissoras para esse

procedimento refere-se ao hipoclorito de sódio (NaClO), que é

normalmente utilizado para assepsia dos tecidos vegetais (ALCÂNTARA

et al., 2011; BORGES et al., 2012; BRONDANI et al., 2011; MALYSZ et

al., 2011; NIEDZ e BAUSHER, 2002; TEIXEIRA et al., 2006). Para atuar

como uma alternativa viável ao tratamento em autoclave ou a utilização

de produtos químicos mais prejudiciais, o NaClO deve ser eficaz em

pequenas concentrações, eliminando ou pelo menos reduzindo a

atividade de microorganismos, além de proporcionar condições ideais

para o crescimento e desenvolvimento dos tecidos vegetais (BRONDANI

et al., 2013).

1.2.3 Fitorreguladores

Os reguladores de crescimento ou fitorreguladores são

substâncias sintéticas que produzem efeitos semelhantes aos produzidos

pelos fitohormônios. Essas substâncias podem ser adicionadas ao meio

de cultura para auxiliar o crescimento e também o direcionamento da

resposta do desenvolvimento dos propágulos (CARVALHO et al., 2006;

HARTMANN et al., 2011).

A adição de fitorreguladores em meios nutritivos têm o objetivo

principal de suprir possíveis deficiências de teores endógenos de

fitohormônios nos explantes que se encontram isolados das regiões

produtoras na planta matriz. Simultaneamente, a adição de

fitorreguladores estimula respostas morfogênicas, tais como o

alongamento celular, a multiplicação de gemas e o enraizamento

(GRATAPAGLIA e MACHADO, 1998).

A escolha do fitorregulador a ser utilizado na cultura in vitro

dependerá do tipo de estímulo a ser induzido; de seu nível endógeno no

explante no momento da excisão; da capacidade do tecido sintetizar o

fitohormônio durante o período da cultura e da possível interação com os

fitohormônios e fitorreguladores meio (SANTOS, 2003).

13

Quanto aos reguladores de crescimento, das várias classes

conhecidas, as auxinas e citocininas são, sem dúvida, as mais

importantes na regulação do crescimento e da morfogênese na cultura de

tecidos (ALVES, 2001).

As auxinas estão envolvidas na divisão e alongamento celular

e na síntese de parede celular (ALVES, 2001). A principal auxina natural é

o AIA (ácido indol-3-acético), o qual não tem sido muito utilizado em

cultura de tecidos devido à sua instabilidade (BONGA e VON ADERKAS,

1992). No entanto, as auxinas sintéticas mais comumente utilizadas são o

2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), AIB (ácido indol-3-butírico) e ANA

(ácido α-naftalenoacético) (CARVALHO, 1999; GEORGE, 1993).

Uma das principais funções da citocinina na cultura de tecidos

refere-se a indução de gemas adventícias, bem como a proliferação de

gemas axilares através da supressão da dominância apical (HARTMANN

et al., 2011). Também é requerida para a formação de calos e outros

processos envolvendo a divisão celular (ALVES, 2001). As citocininas

comumente aplicadas são o BAP (6-benzilaminopurina), cinetina, TDZ

(thidiazuron), 2-iP (2-isopenteniladenina) e zeatina, sendo as duas últimas

citocininas de ocorrência natural (CARVALHO, 1999; BONGA e VON

ADERKAS, 1992).

O modo de interação entre as auxinas e citocininas é

frequentemente dependente da espécie, da planta e do tipo de tecido

utilizado na cultura (COENEN e LOMAZ, 1997; PIERIK, 1997). A ausência

na resposta a um regulador de crescimento é um problema maior quando

explantes de plantas adultas são utilizados, em comparação com material

juvenil (BONGA e VON ADERKAS, 1992).

A propagação por meio de cultura de tecidos pode ser feita por

via direta ou indireta. Nesta última via, há formação de calos com retorno

ao nível meristemático das células diferenciadas e, em seguida, a

transformação em novos brotos e plantas, sendo então considerada uma

forma potencial de propagação em massa (LANDA et al., 2000). Dessa

forma, o balanço hormonal entre auxinas e citocininas é um aspecto

essencial para a cultura de calos, com destaque para o 2,4-D e, mais

recentemente, TDZ (NOGUEIRA et al., 2007; AKRAM; AFTAB, 2008).

14

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23

2 ESTERILIZAÇÃO QUÍMICA DO MEIO DE CULTURA PARA A MULTIPLICAÇÃO in vitro DE Cochlospermum regium

Resumo – O objetivo deste estudo foi elaborar um protocolo de multiplicação de gemas axilares de Cochlospermum regium por meio da esterilização química do meio de cultura. Os tratamentos propostos foram baseados na comparação do preparo convencional (M1 – meio de cultura autoclavado) com a esterilização sem autoclavagem pela utilização de diferentes concentrações de cloro ativo no meio de cultura (esterilização química) (M2 – 0,001%, M3 – 0,003% e M4 – 0,005% de cloro ativo). O meio de cultura utilizado foi o MS suplementado com 1 mg.L-1 de BAP e 0,5 mg.L-1 de ANA. Como explantes foram utilizadas gemas apicais provenientes de plantas germinadas in vitro. O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial (4x5), com parcelas subdivididas no tempo, onde foram utilizados quatro preparos do meio de cultura e cinco subcultivos. As variáveis correspondentes à porcentagem de contaminação fúngica, bacteriana, indução de calo, número de brotos, oxidação, pigmentação e sobrevivência, foram mensuradas e submetidas à ANOVA, sendo em seguida analisadas pelo teste de comparação de médias de Duncan e/ou análise de regressão polinomial, logística e/ou exponencial. De modo geral, o preparo convencional do meio de cultura não foi significativamente mais responsivo para a multiplicação in vitro que o preparo com a suplementação de cloro ativo, chegando a 55,0% de indução de brotações, com média de 3,1 brotos por explante. O uso de 0,005% de cloro ativo para a esterilização química do meio de cultura controlou satisfatoriamente os agentes contaminantes (bactérias e fungos) e foi aquele que induziu a maior proliferação de brotos (65,0% com média de 2,7 brotos por explante). Palavras-chave: algodãozinho-do-cerrado; agente esterilizante; cloro ativo; micropropagação.

2 CHEMICAL STERILIZATION OF CULTURE MEDIUM FOR IN VITRO MULTIPLICATION OF Cochlospermum regium Abstract – The objective of this study was to develop a multiplication protocol axillary buds of Cochlospermum regium affix through the chemical sterilization of the culture medium, where the proposed treatment was the comparison of conventional tillage (M1 - means of autoclaved culture), with sterilization without autoclaving using different concentrations of active chlorine in the culture medium (chemical sterilization) (M2 - 0.001%, M3 - M4 and 0.003% - 0.005% of active chlorine added to culture medium). The culture medium used was MS supplemented with 30 g.L-1 sucrose, 1 mg.L-1 BAP 0.5 mg.L-1 NAA, and 6 g.L-1 agar. As apical buds explants from in vitro germinated plants were used. The experiment was conducted in a completely randomized design in a factorial arrangement (4x5) with split plot, where they were used four preparations of the culture medium and five subcultures. The variables percentage of fungal

24

contamination, bacterial, callus induction, shoot number, oxidation, pigmentation and survivors were subjected to ANOVA, the comparison analysis means Duncan (p <0.05) and polynomial regression analysis, logistic and exponential. Generally the conventional preparation of the culture medium was not significantly more responsive to in vitro multiplication that the preparation with active chlorine supplementation, reaching 55.0% of shoot induction, with an average of 3.1 buds per explant while the use of 0.005% of active chlorine for the chemical sterilization of the culture medium satisfactorily controlled contaminants (fungi and bacteria) and have been the one that induced the greatest shoot proliferation (65.0% with a mean of 2.7 shoots per explant).

Keywors: algodãozinho-do-cerrado; sterilizing agents; active chlorine; micropropagation.

2.1 INTRODUÇÃO

Os componentes da biodiversidade podem fornecer ampla

gama de produtos de importância econômica, onde destacam-se os

fitoterápicos e os fitofármacos. Essas substâncias são originadas dos

recursos genéticos vegetais, mais especificamente de plantas medicinais,

cuja demanda por essas espécies têm crescido consideravelmente nos

últimos anos (GUERRA e NODARI, 2007; NEPOMUCENO et al., 2014).

Dentre as espécies, encontra-se o Cochlospermum regium

(Schrank) Pilg., Bixaceae, que é considerada uma planta medicinal nativa

do bioma Cerrado (INÁCIO et al., 2014). Estudos químicos,

farmacognósticos e toxicológicos sugerem a eficácia e a segurança dos

extratos fitoterápicos de C. regium (SÓLON et al., 2009). Além disso, há

comprovação da atividade analgésica e antiedematogênica (CASTRO et

al., 2004) e de atividade antibacteriana em Staphylococcus aureus e

Escherichia coli (OLIVEIRA et al., 1994). A produção de fitoterápicos

industrializados a partir de C. regium é inviável até o momento, pois a

espécie é coletada de forma extrativista e não há estudos agronômicos

suficientes que viabilizem o seu cultivo em larga escala (INÁCIO et al.,

2010). Dessa forma, a cultura de tecidos, por meio da técnica de

micropropagação, torna-se uma alternativa para a propagação da

espécie.

25

O aumento do número de plantas produzidas in vitro deve-se

às diversas vantagens que a micropropagação oferece, incluindo a

possibilidade de multiplicação em larga escala e em curto espaço de

tempo; utilização de espaço reduzido para a obtenção de grande

quantidade de plantas, mudas livres de doenças e pragas, reduzida

dependência das condições ambientais externas, elevada precisão no

estabelecimento de cronogramas de produção e comercialização, elevada

qualidade do produto no que diz respeito à homogeneidade e vigor das

plantas, dentre outras (RIBEIRO et al., 2011).

Apesar de várias vantagens da micropropagação, alguns

problemas persistem e não satisfazem os interesses comerciais,

especialmente aqueles associados aos elevados custos de

implementação e manutenção da técnica, elevado consumo de energia

elétrica e o tempo necessário para a preparação de material durante a

fase de autoclavagem do meio de cultura (BRONDANI et al., 2013;

MACEK et al., 1995).

A autoclavagem é o método mais comumente utilizado para a

esterilização de vidrarias, meios de cultura e materiais cirúrgicos que são

utilizados em laboratório, sendo uma operação dispendiosa. A

possibilidade de substituição desse método de esterilização por outro de

menor custo seria altamente desejável (RIBEIRO et al., 2011).

Considerando esses aspectos e, para atuar como uma

alternativa viável para a assepsia, o uso de NaClO por meio da

esterilização química do meio de cultura pode ser eficaz em pequenas

concentrações, pois pode eliminar (ou pelo menos reduzir) a atividade

microorganismos. Contudo, é necessário estabelecer as condições ideais

para que não ocorram danos ao crescimento e desenvolvimento dos

tecidos vegetais em meio de cultura (BRONDANI et al., 2013).

O uso de NaClO para a esterilização do meio de cultura foi

comprovado para o cultivo in vitro de diversas espécies, tais como em

Ananas comosus (TEIXEIRA et al., 2006), Musa spp. (MATSUMOTO et

al., 2007), Eucalyptus pellita (TEIXEIRA et al., 2008), Pfaffia glomerata

(RIBEIRO et al., 2009), Sequoia sempervirens (RIBEIRO et al., 2011),

Saccharum spp. (COSTA-PINHO, 2012), Chrysantemum (DEEIN et al.,

26

2013), Eucalyptus benthamii (BRONDANI et al., 2013) e Hyptis

leucochepala e Hyptis platanifolia (NEPOMUCENO et al., 2014).

2.2 OBJETIVOS

2.2.1 Objetivo geral

Elaborar um protocolo de multiplicação in vitro de gemas

apicais de Cochlospermum regium por meio da esterilização química do

meio de cultura.

2.2.2 Objetivos específicos

Comparar a eficiência da esterilização química do meio de cultura

com o preparo convencional (autoclavagem);

Determinar a melhor concentração de cloro ativo para a

esterilização química do meio de cultura sem ocasionar a

mortalidade do explante;

Determinar a multiplicação de gemas axilares em relação a

esterilização química do meio de cultura.

2.3 MATERIAL E MÉTODOS

2.3.1 CARACTERIZAÇÃO GERAL

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura

de Tecidos Vegetais, pertencente à Faculdade de Engenharia Florestal da

Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Cuiabá – MT.

27

2.3.1.1 Fonte dos explantes

Como explantes foram utilizados ápices caulinares (Figura 1A e

1B) coletados de plantas germinadas in vitro, as quais foram obtidas a

partir de sementes. As sementes de Cochlospermum regium utilizadas

para a realização do experimento foram coletadas de frutos maduros

durante os meses de Setembro e Outubro de 2014 em área do Cerrado, a

qual foi localizada no Parque Nacional da Chapada dos Guimarães,

Rodovia MT – 251, no município de Chapada dos Guimarães (autorização

nº 46295 do ICMBio – Instituto Chico Mendes de Conservação da

Biodiversidade).

FIGURA 1 – DETALHE DA GERMINAÇÃO in vitro E SECCIONAMENTO DA PLÂNTULA DE Cochlospermum regium. (A) PLÂNTULA GERMINADA in vitro. (B) ÁPICE CAULINAR UTILIZADO COMO EXPLANTE (SETA). BARRA: 1 cm. FOTO: NATÁLIA HELENA GAVILAN (2014).

28

2.3.1.2 Tratamentos e delineamento experimental

2.3.1.2.1 Multiplicação in vitro

Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio (2×10 cm)

contendo 5 mL do meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962),

suplementado com 0,05 mg.L-1 de ANA (ácido α-naftalenoacético) e 1

mg.L-1 de BAP (bezilaminopurina), onde foram avaliados quatro preparos

de meio de cultura (Tabela 1). A esterilização química foi realizada com o

uso de NaClO (2,0-2,5% de cloro ativo) conforme a concentração de Cl

em cada tratamento avaliado. O primeiro subcultivo ocorreu aos 21 dias, e

os demais a cada 28 dias, totalizando 4 subcultivos (91 dias).

TABELA 1 - RELAÇÃO DOS MÉTODOS DE PREPARO DO MEIO DE CULTURA E CONCENTRAÇÕES DE CLORO ATIVO (NaClO) PARA A ESTERILIZAÇÃO QUÍMICA DURANTE O ESTABELECIMENTO IN VITRO DE EXPLANTES DE Cochlospermum regium.

Tratamento Método de preparo

M1 Meio de cultura tradicional - autoclavado M2 0,001% de Cl ativo - sem autoclavagem M3 0,003% de Cl ativo - sem autoclavagem M4 0,005% de Cl ativo - sem autoclavagem

O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente

casualizado em esquema fatorial (4x5), com parcelas subdivididas no

tempo, onde foram utilizados quatro preparos do meio de cultura e cinco

subcultivos. Para tanto, foram utilizadas 4 repetições compostas por 5

unidades experimentais para cada repetição. Cada unidade experimental

foi composta por um tubo de ensaio (2×10 cm), contendo 5 mL do meio

de cultura e um explante.

As caracterizações do crescimento e desenvolvimento dos

tecidos foram realizadas a cada subcultivo, onde foram avaliados a

porcentagem de contaminação fúngica e bacteriana, a indução de calo, o

número de brotos, a oxidação, e a sobrevivência.

29

2.3.1.3 Preparo do meio de cultura e condições de crescimento

O meio de cultura foi preparado com água destilada,

adicionando-se 6 g.L-1 de ágar e 30 g.L-1 de sacarose. O valor do pH foi

ajustado para 5,8 com HCl (0,1M) e/ou NaOH (0,1M), previamente a

adição do ágar ao meio de cultura, e então procedeu-se a autoclavagem a

temperatura de 121°C (≈ 1 kgf.cm-2) durante 20 minutos, conforme o

tratamento (somente no meio M1 – Tabela 1). O procedimento de

manipulação dos explantes foi executado em câmara de fluxo laminar em

condições assépticas. Os explantes foram cultivados em sala de

crescimento com temperatura controlada a 25°C (± 2°C), fotoperíodo de

16 horas e luminosidade de 32 μmol m-2 s-1.

2.3.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA

Amostras dos tecidos calogênicos e da região da gema axilar foram

fixados em solução de formaldeído e glutaraldeído (KARNOVSKY, 1965)

modificado (glutaraldeído 1%; paraformaldeído 4% em tampão fostato de

sódio - NaH2PO4.H2O à 0,1 M; pH 7,2) e submetidas a seis séries de

vácuo (-600 mmHg) por 30 minutos cada. As amostras foram

armazenadas durante 40 dias a 4°C, e posteriormente foram desidratadas

por meio de série alcoólica-etílica em concentrações crescentes (10, 20,

30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100%, v/v), permanecendo em cada solução

por 15 minutos. Em seguida as amostras foram imersas em meio de

infiltração (Historesina, Leica) durante 24 horas e após, foram alocadas na

porção inferior do recipiente de moldura. As amostras foram emblocadas

em Historesina (hidroxietil metacrilato, Leica) com endurecedor conforme

recomendação do fabricante, onde permaneceram durante 34 dias à

temperatura de 24°C. Os blocos foram seccionados longitudinalmente ou

transversalmente à 5 μm de espessura com o uso de micrótomo rotativo

automático Microm HM 355S (Thermo Scientific). Os cortes obtidos foram

corados com azul de toluidina (0,05%, v/v) em tampão fostato de sódio e

ácido cítrico (SAKAI, 1973) durante 15 minutos e montados em lâminas

histológicas com resina sintética (Entellan). As lâminas histológicas foram

30

analisadas e fotomicrografadas em microscópio de luz (Opton) sendo as

imagens capturadas em escala micrométrica.

2.3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS

O conjunto de dados foi submetido ao teste de Shapiro-Wilk

(p<0,05) afim de verificar a normalidade. Para verificar a homogeneidade

de variância foi utilizado o teste de Hartley (p<0,05) e, para transformar os

dados, foi utilizado o teste de Box-Cox. Após, os dados foram submetidos

à análise de variância (ANOVA, p<0,05 e p<0,01). Por fim, os dados

foram submetidos a análise de comparação de médias de Duncan

(p<0,05) ou análise de regressão polinomial, logística e exponencial,

selecionando o melhor modelo ajustado. Os programas SOC (EMBRAPA,

1990) e R (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2012) foram utilizados para

a análise estatística dos dados. As análises histológicas foram

caracterizadas por análise descritiva.

2.4 RESULTADOS

De acordo com a análise de variância houve efeito significativo

para todas as variáveis avaliadas, tanto para os subcultivos quanto para o

preparo do meio de cultura. No entanto, não houve interação entre os

tratamentos (Tabela 2).

31

TABELA 2 - RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA A CONTAMINAÇÃO FÚNGICA (FUN), CONTAMINAÇÃO BACTERIANA (BAC), CALOGÊNESE (CAL), BROTAÇÕES (BRO), OXIDAÇÃO (OXI), SOBREVIVÊNCIA DO EXPLANTE (SOB) E NÚMERO DE BROTOS (NBRO) PARA EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AOS TRATAMENTOS AVALIADOS AO LONGO DE 91 DIAS DE CULTIVO in vitro.

Quadrados médios

Causas da variação

GL FUN(1) (%)

BAC(1) (%)

CAL(2) (%)

BRO(1) (%)

OXI(1) (%)

SOB(1) (%)

NBRO(1)

(explante-1)

SUB 4 0,202* 0,026* 2,150* 0,382* 0,353* 0,264* 4,022* Resíduo – SUB 15 0,042* 0,004ns 0,154* 0,015ns 0,050ns 0,023ns 0,012ns Parcela 19 - - - - - - - PMC 3 0,067* 0,031* 0,340* 0,119* 0,100* 0,088* 0,060* SUB×PMC 12 0,007

ns 0,003

ns 0,031

ns 0,007

ns 0,009

ns 0,011

ns 0,018

ns

Resíduo 365 0,012 0,007 0,038 0,018 0,017 0,012 0,014 Subparcela 399 - - - - - - - Média Real - 22,0 9,5 55,2 40,0 38,0 78,0 2,0 CVexp(%) - 15,9 11,9 19,8 20,7 19,7 20,8 29,8

ns Valor não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.

* Valor significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro, pelo teste F.

(1) e

(2)

Dados transformados por 1/[exp(n+0,5)]0,5

e (n+0,5)0,5

, respectivamente, onde n = dado amostrado. GL = graus de liberdade, CVexp. = coeficiente de variação experimental, SUB = subcultivo, PMC = preparo do meio de cultura.

32

Na Figura 2, pode-se observar o comportamento de cada

variável ao longo de 91 dias de condução do experimento. As variáveis

correspondentes a porcentagem de contaminação bacteriana (Figura 2A)

e fúngica (Figura 2B) apresentam comportamento semelhante, onde os

valores médios aumentaram entre o 2º (49 dias) e o 3º (70 dias)

subcultivos. A estabilização ocorreu em torno dos 50 dias de cultivo,

permanecendo assim, até o término do experimento (aos 91 dias). A

diferença entre a ocorrência de contaminação bacteriana e fúngica foi

correspondente a incidência, onde a bacteriana foi próxima a 20%,

enquanto que a fúngica foi de 40%.

Para a indução de calos (Figura 2C) os valores máximos

estimados foram de 58%, aos 42 dias. Aos 91 dias de cultivo, o valor real

de produção de calo foi de, aproximadamente, 60%, tendo o pico de

produção ocorrido entre o 2º e o 3º subcultivo, chegando a 80% de

indução de calos.

Quanto a indução de brotação (Figura 2D), o valor máximo

estimado correspondeu aos 61 e 28 dias, correspondendo a 57% de

brotações emitidas. Aos 91 dias de experimento, a produção de brotos

por explante chegou próxima a 50%.

A oxidação apresentou valor máximo estimado em 54% de

ocorrência aos 59 dias, enquanto que a pigmentação apresentou 54% aos

58 dias. Os valores reais para tal variável ao fim do experimento, ou seja,

aos 91 dias, aproximaram-se a 40% de ocorrência (Figuras 2E).

Todas as variáveis avaliadas apresentaram comportamento

semelhante, com redução dos valores de produção aos 91 dias de

experimento, o que se explica pelo fato de que a sobrevivência dos

explantes (Figura 2F) também diminuiu ao longo do tempo, reduzindo

para aproximadamente 60% de sobrevivência de explantes ao fim do

experimento.

33

FIGURA 2 – VALORES MÉDIOS EM PORCENTAGEM DAS CARACTERÍSTICAS AVALIADAS EM EXPLANTES DE Cochlospermum regium, AO LONGO DE 91 DIAS DE CULTIVO in vitro. (A) PORCENTAGEM DE CONTAMINAÇÃO BACTERIANA; (B) CONTAMINAÇÃO FÚNGICA; (C) INDUÇÃO DE CALOS; (D) INDUÇÃO DE BROTOS; (E) OXIDAÇÃO E (F) SOBREVIVÊNCIA.

O preparo do meio de cultura por meio da autoclavagem (M1)

foi significativamente o mais eficaz para o controle da contaminação

bacteriana. A contaminação bacteriana aos 91 dias foi de apenas 5% de

ocorrência, enquanto o meio de cultura M3, mostrou-se o menos eficaz

para o controle da contaminação bacteriana, apresentando 25% aos 91

dias (Tabela 3).

34

TABELA 3 – PORCENTAGEM ACUMULADA DE CONTAMINAÇÃO BACTERIANA EM EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO PREPARO DO MEIO DE CULTURA PARA CADA SUBCULTIVO.

Meio de

cultura

Subcultivos (dias)

0 28 49 70 91

M1 0,0±0,0 a 5,0±5,0 a 5,0±5,0 b 5,0±5,0 b 5,0±5,0 b M2 0,0±0,0 a 5,0±5,0 a 5,0±5,0 b 10,0±6,8 ab 10,0±6,8 ab

M3 0,0±0,0 a 10,0±6,8 a 25,0±9,9 a 25,0±9,9 a 25,0±9,9 a M4 0,0±0,0 a 10,0±6,8 a 15,0±8,1 ab 15,0±8,1 ab 15,0±8,1 ab

Nas colunas, médias seguidas por letras iguais não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão. M1 = meio de cultura autoclavado, M2 = meio de cultura suplementado com 0,001% Cl, M3 = meio de cultura suplementado com 0,003% Cl e M4 = meio de cultura suplementado com 0,005% de Cl.

Para a contaminação fúngica, não houve diferença significativa

entre os tratamentos adotados, no entanto, o preparo M2, foi o que

apresentou menor ocorrência da contaminação aos 91 dias de cultivo

(Tabela 4).

TABELA 4 – PORCENTAGEM ACUMULADA DE CONTAMINAÇÃO

FÚNGICA EM EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO PREPARO DO MEIO DE CULTURA PARA CADA SUBCULTIVO.

Meio de

cultura

Subcultivos (dias)

0 28 49 70 91

M1 0,0±0,0 a 15,0±8,1 a 45,0±11,4 a 45,0±11,4 a 45,0±11,4 a M2 0,0±0,0 a 5,0±5,0 a 10,0±6,8 b 20,0±9,1 b 25,0±9,9 a M3 0,0±0,0 a 15,0±8,1 a 35,0±10,9 a 45,0±11,4 a 45,0±11,4 a M4 0,0±0,0 a 0,0±0,0 a 25,0±9,9 ab 30,0±10,5 ab 35,0±10,9 a

Nas colunas, médias seguidas por letras iguais não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão. M1 = meio de cultura

autoclavado, M2 = meio de cultura suplementado com 0,001% Cl, M3 = meio de cultura suplementado com 0,003% Cl e M4 = meio de cultura suplementado com 0,005% de Cl.

Em vista desses resultados, pode-se presumir que para a

esterilização do meio de cultura, o preparo convencional (autoclavado) foi

a melhor opção para o controle de bactérias e, o M2 para a fúngica.

Contudo, deve-se ressaltar que a ocorrência aos 91 dias representa a

contaminação acumulada ao longo do tempo.

Para a indução de calos, pode-se observar que o M2

sobressaiu aos demais tratamentos avaliados durante todo o experimento,

onde aos 91 dias apresentou uma taxa de 85% de indução de calo e o M1

apresentou 55%. Os preparos M1 e M3 foram os que responderam

35

significativamente melhor aos tratamentos avaliados, apresentando as

menores taxas de incidência de calos aos 91 dias de cultivo, sendo de

55% e 50%, respectivamente (Tabela 5).

TABELA 5 - PORCENTAGEM DE INDUÇÃO DE CALOS EM EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO PREPARO DO MEIO DE CULTURA PARA CADA SUBCULTIVO.

Meio de

cultura

Subcultivos (dias)

0 28 49 70 91

M1 0,0±0,0 a 85,0±8,1 a 55,0±11,4 b 55,0±11,4 b 55,0±11,4 b M2 0,0±0,0 a 90,0±6,8 a 85,0±8,1 a 85,0±8,1 a 85,0±8,1 a M3 0,0±0,0 a 65,0±10,9 a 50,0±11,4 b 50,0±11,4 b 50,0±11,4 b M4 0,0±0,0 a 85,0±8,1 a 70,0±10,5 ab 70,0±10,5 ab 70,0±10,5 ab

Nas colunas, médias seguidas por letras iguais não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão M1 = meio de cultura


Quando avaliada a indução de brotos, não houve diferença

significativa entre os tratamentos, aos 91 dias, mesmo que o M4 tenha

apresentado o maior valor para a indução de brotações, aos 28 dias,

obtendo uma média de 75% de brotações (Tabela 6). Tanto a redução

quanto o aumento da emissão de brotações ao longo dos subcultivos

pode ser explicada pela ocorrência de mortalidade de explantes ou por

contaminação (fúngica e/ou bacteriana), onde o material fora descartado.

TABELA 6 - PORCENTAGEM DE INDUÇÃO DE BROTOS EM EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO PREPARO DO MEIO DE CULTURA PARA CADA SUBCULTIVO.

Meio de

cultura

Subcultivos (dias)

0 28 49 70 91

M1 0,0±0,0 a 60,0±11,2 ab 50,0±11,4 a 55,0±11,4 a 55,0±11,4 a M2 0,0±0,0 a 40,0±11,2 b 35,0±10,9 a 35,0±10,9 a 35,0±10,9 a M3 0,0±0,0 a 45,0±11,4 b 40,0±11,2 a 40,0±11,2 a 40,0±11,2 a M4 0,0±0,0 a 75,0±9,9 a 65,0±10,9 a 65,0±10,9 a 65,0±10,9 a


Em relação ao número de brotos por explante, os tratamentos

M1 e M3, apresentaram os maiores valores médios em relação aos

36

demais tratamentos, resultando em média de 3,18 e 3,11 brotos por

explante, respectivamente, aos 91 dias de cultivo, correspondendo aos

melhores tratamentos em todo o período de experimento (Tabela 7).

TABELA 7 – NÚMERO DE BROTOS EMITIDOS EM EXPLANTES Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO PREPARO DO MEIO DE CULTURA PARA CADA SUBCULTIVO.

Meio de cultura

Subcultivos (dias) 0 28 49 70 91

M1 0,0±0,0 a 3,9±0,6 a 3,8±0,4 a 3,0±0,6 a 3,1±0,6 a M2 0,0±0,0 a 2,3±0,4 b 2,0±0,2 c 2,2±0,3 b 2,3±0,3 b M3 0,0±0,0 a 2,8±0,4 b 3,5±0,5 a 3,1±0,7 a 3,1±0,7 a M4 0,0±0,0 a 2,6±0,5 b 2,8±0,5 b 2,7±0,3 ab 2,7±0,3 ab



A oxidação foi evidente em todos os tratamentos, no entanto

quando o meio de cultura utilizado foi o M1 (isento de cloro ativo), a

ocorrência de oxidação foi menor. Esse efeito pode ser justificado pelo

fato do NaClO propiciar a oxidação dos explantes (Tabela 8).

TABELA 8 - PORCENTAGEM DE OXIDAÇÃO DE EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO PREPARO DO MEIO DE CULTURA PARA CADA SUBCULTIVO.

Meio de

cultura

Subcultivos (dias)

0 28 49 70 91

M1 0,0±0,0 a 45,0±11,4 a 25,0±9,9 b 25,0±9,9 b 25,0±9,9 b M2 0,0±0,0 a 60,0±11,2 a 60,0±11,2 a 60,0±11,2 a 60,0±11,2 a M3 0,0±0,0 a 65,0±10,9 a 50,0±11,4 ab 50,0±11,4 ab 50,0±11,4 ab M4 0,0±0,0 a 50,0±11,4 a 45,0±11,4 ab 45,0±11,4 ab 45,0±11,4 ab



Quanto à sobrevivência (Tabela 9), aos 91 dias, o tratamento

M2 foi o que apresentou melhores respostas, resultando em 75% de

sobrevivência de explantes. O M3 apresentou o pior desempenho, com

apenas 45% dos explantes vivos ao fim do experimento. Esse

comportamento foi observado também ao longo do tempo de cultivo.

37

TABELA 9 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA EM EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO PREPARO DO MEIO DE CULTURA PARA CADA SUBCULTIVO.

Meio de

cultura

Subcultivos (dias)

0 28 49 70 91

M1 100,0±0,0 a 100,0±0,0 a 55,0±11,4 c 55,0±11,4 bc 55,0±11,4 ab M2 100,0±0,0 a 100,0±0,0 a 85,0±8,1 a 80,0±9,1 a 75,0±9,9 a M3 100,0±0,0 a 85,0±8,1 a 60,0±11,2 bc 45,0±11,4 c 45,0±11,4 b M4 100,0±0,0 a 100,0±0,0 a 80,0±9,1 ab 75,0±9,9 ab 65,0±10,9 ab


Na Figura 3A-D pode-se observar o desenvolvimento de um

explante submetido à multiplicação in vitro com o uso da esterilização

química (M2), no decorrer do tempo. Pode-se observar a formação de

calo na base do explante, vindo este a oxidar com a passagem dos

subcultivos. Observa-se também a presença de pontos de pigmentação

avermelhada na borda das folhas.

FIGURA 3 – DESENVOLVIMENTO in vitro DE EXPLANTES DE

Cochlospermum regium AO LONGO DO TEMPO. (A) 28 DIAS DE CULTIVO; (B) 49 DIAS DE CULTIVO; (C) 70 DIAS DE CULTIVO; (D) 91 DIAS DE CULTIVO. FOTO: NATÁLIA HELENA GAVILAN (2015).

Na análise histológica foram observadas áreas meristemáticas

nos calos formados (Figura 4A), consistindo de células pequenas e

isodiamétricas. Nas figuras 4B e 4C, observou-se a presença de centros

meristemáticos unipolarizados em fase de diferenciação. Na figura 4D, foi

possível visualizar a presença de células pró-embrionárias. Como

verificado, a presença de calos foi evidente durante toda a fase de

multiplicação in vitro.

38

FIGURA 4 – CORTES HISTOLÓGICOS DE EXPLANTES DE Cochlospermum regium CULTIVADOS in vitro ONDE AS SETAS INDICAM: (A) ZONAS MERISTEMÁTICAS (BARRA: 100 µm); (B) E (C) DETALHE DE CENTROS MERISTEMÁTICOS EM FASE DE DIFERENCIAÇÃO (BARRA: 100 µm); (D) SETA EVIDENCIANDO CÉLULA PRÓ-EMBRIONÁRIA (BARRA: 50 µm).

2.5 DISCUSSÃO

O uso de cloro ativo para a esterilização química do meio de

cultura visando a propagação in vitro de plantas já foi comprovado para

diversas espécies (TEIXEIRA et al., 2008; RIBEIRO et al., 2011;

BRONDANI et al., 2013; NEPOMUCENO et al., 2014). Estes estudos

corroboram com os resultados obtidos neste trabalho ao considerar o uso

do cloro ativo para a esterilização química do meio de cultura durante o

cultivo in vitro de C. regium. Em termos gerais, mesmo que o meio de

cultura autoclavado tenha proporcionado o maior controle das

contaminações (bacteriana e/ou fúngica), foi possível comprovar o efeito

positivo da suplementação de cloro ativo ao meio de cultura (sem

necessitar de autoclavagem).

39

Os meios de cultura M2 (0,001% de cloro ativo), M3 (0,003%

de cloro ativo) e M4 (0,005% de cloro ativo) controlaram satisfatoriamente

as manifestações fúngicas e bacterianas durante os 91 dias de subcultivo.

Além disso, constatou-se reduzido efeito prejudicial quanto a multiplicação

de gemas dos explantes, sendo possível verificar emissão de brotações

saudáveis e vigorosas.

Os resultados encontrados neste estudo, quanto à incidência

de brotos diferem dos encontrados por Brondani et al. (2013) para E.

benthamii, onde concentrações iguais ou superiores a 0,005% de cloro

ativo induziu menores valores de viabilidade de brotos, indicando efeito

tóxico.

A concentração de 0,005% de cloro ativo foi a que apresentou

maior taxa de emissão de brotos para C. regium, corroborando os

resultados de Teixeira et al. (2008) para E. pellita, onde concentrações de

até 0,009% de cloro ativo, mostram-se satisfatórias para o cultivo in vitro,

mesmo que ocorrendo uma pequena redução do número de brotos em

comparação ao preparo convencional autoclavado.

Ao utilizar citocininas como fitorreguladores no processo de

multiplicação de gemas in vitro, espera-se que haja um aumento do

número de brotação (INÁCIO, 2010). Contudo, no presente experimento

com C. regium foi possível verificar que houve proliferação da calogênese

com a suplementação de BAP ao meio de cultura. Esse efeito também foi

constatado por Inácio (2010) e pode estar associado às concentrações

endógenas de fitohormônios, pois foram utilizados explantes provenientes

de plântulas germinadas in vitro, as quais apresentam elevada

juvenilidade.

Quanto a oxidação dos explantes, os resultados diferem dos

encontrados por Brondani et al. (2013), que observaram a oxidação

apenas em concentrações iguais ou superiores à 0,005% de cloro ativo

ao trabalhar com Eucalyptus benthamii, enquanto que para C. regium a

oxidação foi detectada em todos os tratamentos. Tal fato pode ser

justificado pela exsudação de substâncias endógenas pelos explantes de

C. regium após a excisão, fato esse que foi observado a cada subcultivo,

principalmente quando era necessário realizar algum corte no explante.

40

No entanto, não existem estudos que identifiquem a natureza das

substâncias exsudadas dos explantes de C. regium após a excisão. Uma

alternativa para redução da oxidação seria evitar cortes desnecessários

nos explantes, além da redução do tempo de subcultivos, que segundo

Jones e Saxena (2013) pode contribuir para a redução da oxidação.

Como evidenciado por Inácio et al. (2011), a multiplicação in

vitro de C. regium é possível de ser conduzida, o que também foi

confirmado no presente estudo. Além disso, mesmo com o uso de cloro

ativo para a esterilização química do meio de cultura, houve multiplicação

dos brotos, chegando a apresentar 65% de explantes combrotações

quando utilizado 0,005% de cloro ativo no meio de cultura.

Quanto ao tempo de cultivo in vitro, os resultados indicam que

a máxima produção de brotos ocorre aos 60 dias de cultivo, corroborando

as observações de Inácio et al. (2011). Dessa forma, o presente estudo

também permitiu verificar que o C. regium é uma espécie que necessita

de vários subcultivos in vitro para que apresente resposta morfogênica em

relação a multiplicação de brotos.

A análise histológica dos tecidos permitiu verificar intensa

atividade meristemática e células potencialmente embrionárias, com

divisões assimétricas, semelhante ao encontrado em estruturas pró-

embrionárias. A presença de zonas meristemáticas pressupõe a formação

de gemas adventícias, e a presença de células com características pró-

embrionárias mostra a possibilidade da ocorrência de embriogênese

somática, a qual têm origem a partir de células somáticas, sem a

ocorrência de fusão de gametas (CARNEIRO et al., 2014), sendo uma

excelente alternativa para a propagação assexuada.

Tendo em vista os resultados do presente estudo, pôde-se

verificar que a suplementação de cloro ativo ao meio de cultura até a

concentração de 0,005% foi viável para a multiplicação de brotos in vitro

de C. regium, ao comparar com o tradicional método de preparo do meio

de cultura (com autoclavagem).

Levando-se em conta o potencial da esterilização química do

meio de cultura para a multiplicação de brotos in vitro, também verificou-

se controle adequado da contaminação fúngica e bacteriana, resposta

41

positiva à calogênese, indução de brotos, e até 75% de sobrevivência de

explantes. Além disso, pela análise histológica, foi possível verificar a

presença de células potencialmente embrionárias, independente do

tratamento testado.

Dessa forma, a possibilidade da esterilização química do meio

de cultura com cloro ativo foi viável para o cultivo in vitro de C. regium,

tornando-se uma alternativa em relação ao preparo do meio de cultura

autoclavado. A esterilização química do meio de cultura é um processo a

ser considerado em sistemas de produção de plantas in vitro,

principalmente no que diz respeito à redução de custos.

2.6 CONCLUSÕES

A suplementação de cloro ativo ao meio de cultura apresentou

resultados satisfatórios para a multiplicação in vitro de C. regium, com

respostas similares ao preparo convencional (meio de cultura

autoclavado).

A concentração de até 0,005% de cloro ativo suplementado ao

meio de cultura foi adequada para a multiplicação in vitro de gemas

adventícias em C. regium, considerando 91 dias de cultivo.

A multiplicação de gemas adventícias foi verificada em todos os

tratamentos, apresentando o maior valor (65%) quando se aplicou 0,005%

de cloro ativo ao meio de cultura.

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45

3 ORGANOGÊNESE INDIRETA EM Cochlospermum regium

Resumo – O objetivo deste trabalho foi elaborar um protocolo de organogênese indireta em Cochlospermum regium por meio da indução à calogênese e regeneração de brotos. Os tratamentos propostos basearam-se nas combinações do tipo de explante (cotilédone, hipocótilo e raiz) e do tipo de fitorregulador (2,4-D, TDZ e ANA). O meio de cultura utilizado foi o MS. Os explantes foram coletados de plântulas germinadas in vitro. Para a indução da calogênese, o meio de cultura foi suplementado com 1 mg.L-1 de cada fitorregulador testado. Passados 49 dias de exposição aos fitorreguladores, os explantes foram transferidos para meio de cultura de regeneração, o qual conteve a suplementação de 1 mg.L-1 de BAP e 0,05 mg.L-1 de ANA. O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial (3x3). Para a calogênese foram avaliadas a porcentagem de indução de calos, a oxidação e a sobrevivência dos explantes. Para a regeneração foram avaliadas a porcentagem de brotos, oxidação e sobrevivência. Os dados foram submetidos à ANOVA e posteriormente à análise de comparação de médias de Duncan (p<0,05). Todos os tratamentos avaliados induziram à formação de calos e, ao final de 91 dias de experimento, verificou-se que o TDZ foi o único fitorregulador responsivo à regeneração de brotos, resultando em 5,3% de proliferação de brotos. Palavras-chave: Regeneração, regulador de crescimento, tipo de explante. 3 INDIRECT ORGANOGENESIS IN Cochlospermum regium Abstract – The objective was to prepare an indirect organogenesis protocol C. regium order to callus formation and regeneration of shoots. Proposed treatments were the combination of the type of explants (cotyledon, hypocotyl and root) and type of plant growth regulator (2,4-D and NAA TDZ). The culture medium used was MS supplemented with 30 g.L-1 sucrose and 6 g.L-1 agar. The explants were collected from seedlings germinated in vitro. For callus induction was used 1 mg.L-1 of each tested plant growth regulator. After 49 days of exposure to growth regulators, the explants were transferred to regeneration medium culture, which contained the 1 mg.L-1 BAP and 0.05 mg.L-1 NAA. The experiment was conducted in a completely randomized design in factorial scheme (3x3) for callus formation were evaluated percentage of callus induction, oxidation, pigmentation and survival and, for regeneration percentage shoots, oxidation and survival. Data were subjected to ANOVA and then to the comparison analysis means Duncan (p <0.05). After 49 days of experiment evaluated the callus formation, where all the treatments induced the formation of callus and at the end of 91 days of the experiment, it was found that the growth regulator TDZ was the only responsive to the regeneration of shoots with 5.3% proliferation. Keywords: Regeneration, growth regulators, type of explant.

46

3.1 INTRODUÇÃO

O Cerrado é o segundo maior bioma brasileiro, ocupando 21%

do território nacional (BORLAUG, 2002; KLINK e MACHADO, 2005). É

apontado ainda como a formação savânica de maior diversidade vegetal

do mundo (MENDONÇA et al., 1998). Em contraste a toda esta riqueza, a

vegetação vem sendo devastada demasiadamente, e por esse motivo,

está inclusa entre as vegetações de maior risco de desaparecimento no

país (KAPLAN et al., 1994).

A intensa exploração das áreas do Cerrado têm contribuído

para que muitas espécies nativas sejam classificadas em risco de

extinção. Além disso, ocorre a coleta indiscriminada, a qual é realizada

corriqueiramente por mateiros, raizeiros, comunidades locais e por

aqueles que revendem matéria-prima aos laboratórios, sem que haja

compromisso em repor à natureza o que dela é retirada (SANGALLI,

2000).

Dentre as espécies endêmicas e em risco de extinção do bioma

Cerrado pode-se citar o Cochlospermum regium, que é um arbusto de

ocorrência frequente nas áreas da região centro-oeste do país (CAMILLO

et al., 2009; ROSSI et al., 2013). O C. regium apresenta indicações

medicinais populares, onde o rizóforo é usado em chás ou para combater

infecções e inflamações (ROSSI et al., 2013). No entanto, a importância

dessa espécie não está restrita apenas à medicina popular, pois também

houve a comprovação do efeito analgésico e antiedematogênico

(CASTRO et al., 2004) e de atividade antibacteriana em Staphylococcus

aureus e Escherichia coli (OLIVEIRA et al., 1994).

Outro fator que agrava a extinção de muitas espécies

medicinais do cerrado é a baixa germinação, devido às sementes

apresentarem dormência (ROSSI, et al., 2013), como é o caso do C.

regium, onde as sementes apresentam dormência tegumentar, ou seja, o

tegumento duro impede a permeabilidade à água (KIRIZAWA, 1981;

CAMILLO et al., 2009; INÁCIO et al., 2010).

As técnicas de cultura de tecidos de plantas, em alguns casos,

podem representar a única estratégia para conservar espécies fora do seu

47

habitat, como no caso de plantas com sementes recalcitrantes e de difícil

propagação por métodos convencionais (ROCA et al., 1991; FERREIRA

et al., 1998).

Todavia, diversos fatores influenciam as diferentes etapas da

micropropagação e os materiais genéticos apresentam especificidades

quanto ao cultivo in vitro (BORGES et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2011),

exigindo a adequação de metodologias para os materiais genéticos

estudados de forma a realizar o cultivo in vitro com sucesso (OLIVEIRA,

2014).

A organogênese in vitro envolve uma variedade de sequências

complexas de desenvolvimento, resultantes da manipulação experimental

de partes de uma planta até culminar na formação de primórdios de

órgãos ou plantas inteiras (HICKS, 1980). A organogênese indireta é

caracterizada quando a regeneração ocorre a partir de calos isolados do

explante inicial (STIRMART, 1986) onde qualquer tecido vegetal pode ser

utilizado como explante (MORAIS et al., 2012). Entretanto, procura-se

utilizar explantes que contenham maior proporção de tecido meristemático

ou que apresentem maior capacidade de expressar a totipotência celular

(GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998), além de avaliar o melhor tipo de

fitorregulador para controlar os padrões morfogênicos (GEORGE, 1993).

3.2 OBJETIVOS

3.2.1 Objetivo geral

Elaborar um protocolo organogênese indireta para

Cochlospermum regium.

3.2.2 Objetivos específicos

Determinar o melhor fitorregulador e explante para induzir à

calogênese;

Determinar o melhor fitorregulador e explante para induzir à

regeneração in vitro de brotos.

48

3.3 MATERIAL E MÉTODOS

3.3.1 CARACTERIZAÇÃO GERAL

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura

de Tecidos Vegetais, pertencente à Faculdade de Engenharia Florestal da

Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Cuiabá – MT.

3.3.1.1 Fonte dos explantes

Como explantes foram utilizados tecidos vegetais (Figura 1A e

1B) coletados de plantas germinadas in vitro, as quais foram obtidas a

partir de sementes. As sementes de Cochlospermum regium utilizadas

para a realização do experimento foram coletadas de frutos maduros

durante os meses de Setembro e Outubro de 2014 em área do Cerrado, a

qual foi localizada no Parque Nacional da Chapada dos Guimarães,

Rodovia MT – 251, no município de Chapada dos Guimarães (autorização

nº 46295 do ICMBio – Instituto Chico Mendes de Conservação da

Biodiversidade).

FIGURA 1 – DETALHE DA GERMINAÇÃO in vitro E SECCIONAMENTO DA PLÂNTULA DE Cochlospermum regium. (A) PLÂNTULA GERMINADA in vitro. (B) TECIDOS VEGETAIS (COTILÉDONE, HIPOCÓTILO E RADÍCULA) UTILIZADOS COMO EXPLANTES (SETA). BARRA: 1 cm. FOTO: NATÁLIA HELENA GAVILAN (2014).

49

3.3.1.2 Tratamentos e delineamento experimental

3.3.1.2.1 Calogênese

Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio (2×10 cm)

contendo 5 mL do meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962),

onde foram avaliados nove tratamentos por 49 dias, realizando apenas

um subcultivo aos 28 dias (Tabela 1).

TABELA 1 - RELAÇÃO DOS TRATAMENTOS E CONCENTRAÇÕES DE FITORREGULADORES E TIPO DO EXPLANTE PARA A ORGANOGÊNESE EM C. regium.

Tratamento Fitorregulador Tipo de Explante T1 2,4-D (1,0 mg.L-1) Cotilédone T2 2,4-D (1,0 mg.L-1) Hipocótilo T3 2,4-D (1,0 mg.L-1) Radícula T4 TDZ (1,0 mg.L-1) Cotilédone T5 TDZ (1,0 mg.L-1) Hipocótilo T6 TDZ (1,0 mg.L

-1) Radícula

T7 ANA (1,0 mg.L-1) Cotilédone T8 ANA (1,0 mg.L-1) Hipocótilo T9 ANA (1,0 mg.L-1) Radícula TDZ: thidiazuron; 2,4-D: ácido 2,4-diclorofenoxiacético; ANA: ácido α-naftalenoacético.

O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente

casualizado no esquema fatorial (3x3), onde foram avaliados três

fitorreguladores e três tipos de explantes (Tabela 1). As avaliações foram

realizadas ao fim de 49 dias de cultivo, onde foram avaliadas a

porcentagem de calogênese, a oxidação e a sobrevivência.

3.3.1.2.2 Regeneração in vitro

Os calos obtidos no experimento anterior foram utilizados como

fonte de explantes visando regenerar gemas e brotos. Os explantes foram

inoculados em tubos de ensaio (2×10 cm) contendo 5 mL do meio de

cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), o qual foi suplementado com

1 mg.L-1 de BAP (benzilaminopurina) para induzir gemas e/ou brotações.

50

O experimento foi conduzido até os 49 dias de cultivo, tendo havido um

subcultivo aos 28 dias.

O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente

casualizado no esquema fatorial (3x3), onde foram avaliados três

fitorreguladores e três tipos de explantes (Tabela 1). As avaliações foram

realizadas ao fim de 49 dias de cultivo, onde foram avaliadas a

porcentagem de brotos, a oxidação e a sobrevivência.

3.3.1.3 Preparo do meio de cultura e condições de crescimento

O meio de cultura foi preparado com água destilada,

adicionando-se 6 g.L-1 de ágar e 30 g.L-1 de sacarose. O valor do pH foi

ajustado para 5,8 com HCl (0,1M) e NaOH (0,1M) previamente a adição

do ágar ao meio de cultura, e então autoclavado a temperatura de 121°C

(≈ 1 kgf.cm-2) durante 20 minutos. O procedimento de manipulação dos

explantes foi executado em câmara de fluxo laminar. Os explantes foram

cultivados em sala de crescimento com temperatura controlada a 25°C (±

2°C), fotoperíodo de 16 horas e luminosidade de 32 μmol m-2 s-1.

3.3.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA

Amostras dos tecidos calogênicos foram fixados em solução de

formaldeído e glutaraldeído (KARNOVSKY, 1965) modificado

(glutaraldeído 1%; paraformaldeído 4% em tampão fostato de sódio -

NaH2PO4.H2O à 0,1 M; pH 7,2) e submetidas a seis séries de vácuo (-600

mmHg) por 30 minutos cada. As amostras foram armazenadas durante 40

dias a 4°C, e posteriormente foram desidratadas por meio de série

alcoólica-etílica em concentrações crescentes (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,

80, 90 e 100%, v/v), permanecendo em cada solução por 15 minutos. Em

seguida as amostras foram imersas em meio de infiltração (Historesina,

Leica) durante 24 horas e após, foram alocadas na porção inferior do

recipiente de moldura. As amostras foram emblocadas em Historesina

(hidroxietil metacrilato, Leica) com endurecedor conforme recomendação

do fabricante, onde permaneceram durante 34 dias à temperatura de

51

24°C. Os blocos foram seccionados longitudinalmente ou

transversalmente à 5 μm de espessura com o uso de micrótomo rotativo

automático Microm HM 355S (Thermo Scientific). Os cortes obtidos foram

corados com azul de toluidina (0,05%, v/v) em tampão fostato de sódio e

ácido cítrico (SAKAI, 1973) durante 15 minutos e montados em lâminas

histológicas com resina sintética (Entellan). As lâminas histológicas foram

analisadas e fotomicrografadas em microscópio de luz (Opton) sendo as

imagens capturadas em escala micrométrica.

3.3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

O conjunto de dados foi submetido ao teste de Shapiro-Wilk

(p<0,05) afim de verificar a normalidade. Para verificar a homogeneidade

de variância foi utilizado o teste de Hartley (p<0,05) e, para transformar os

dados, foi utilizado o teste de Box-Cox. Após, os dados foram submetidos

à análise de variância (ANOVA, p<0,05 e p<0,01). Por fim, os dados

foram submetidos a análise de comparação de médias de Duncan

(p<0,05). Os programas SOC (EMBRAPA, 1990) e R (R DEVELOPMENT

CORE TEAM, 2012) foram utilizados para a análise estatística dos dados.

As análises histológicas foram caracterizadas por análise descritiva.

3.4 RESULTADOS

3.4.1 CALOGÊNESE

De acordo com a análise de variância, houve efeito significativo

do fitorregulador e tipo de explante para indução de calo e sobrevivência

de explantes. Foi constatada interação entre os tratamentos apenas

quando a variável avaliada foi a indução de calo. Para a oxidação, o tipo

de explante não foi significativo, porém ocorreu interação entre os

tratamentos.

52

TABELA 2 - RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA A CALOGÊNESE (CAL), OXIDAÇÃO (OXI) E SOBREVIVÊNCIA (SOB) DO EXPLANTE DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AOS TRATAMENTOS AVALIADOS EM 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.


GL

Quadrados Médios

CAL (1) (%)

OXI(1) (%)

SOB(1) (%)

FR 2 0,097* 0,238* 0,375* TE 2 0,652* 0,026ns 0,109*

FR×TE 4 0,099* 0,062* 0,021ns

Resíduo 416 0,013 0,008 0,016 Total 424 - - - Média - 74,3 87,5 77,4

CVexp(%) - 21,2 18,1 23,1 ns

Valor não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. * Valor significativo

ao nível de 5% de probabilidade de erro, pelo teste F. (1)


onde n = dado amostrado. GL = graus de liberdade, CVexp. = coeficiente de variação

experimental, FR = regulador de crescimento, TE = tipo de explante.

Quando a variável analisada foi a indução de calos (CAL),

pode-se observar que o explante proveniente do hipocótilo apresentou

maior predisposição ao calejamento, independentemente do fitorregulador

utilizado (Tabela 3). De maneira geral, todos os tratamentos induziram à

calogênese, sendo que a combinação entre os fitorreguladores 2,4-D

(92,0%) e TDZ (91,6%) com o explante de origem do hipocótilo,

apresentaram as maiores médias (Tabela 3).

TABELA 3 - PORCENTAGEM DE INDUÇÃO DE CALOS EM Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO FITORREGULADOR E TIPO DE EXPLANTE EM 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.

Tipo de Explante

Fitorregulador

2,4-D TDZ ANA

Cotilédone 83,6±5,3 Aa 78,7±6,0 Bb 89,1±4,6 Aa Hipocótilo 92,0±3,8 Aa 91,6±4,0 Aa 85,4±5,1 Aab

Radícula 31,2±6,7 Bb 38,2±7,1 Bc 78,5±6,4 Ab Nas colunas, médias seguidas por mesma letra minúscula e, nas linhas, médias seguidas por mesma letra maiúscula não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05).

Dados apresentados como: média ± erro padrão.

Explantes de origem cotiledonar foram os que, em geral,

apresentaram a menor porcentagem de oxidação (Tabela 4). A aplicação

de TDZ e ANA ao meio de cultura resultou em aumento da porcentagem

53

de oxidação dos tecidos, independente do tipo de explante avaliado.

Dessa forma, a combinação recomendável para reduzir a oxidação dos

tecidos de C. regium é a aplicação de 2,4-D como fitorregulador e

hipocótilo como explante (Tabela 4).

TABELA 4 - PORCENTAGEM DE OXIDAÇÃO EM EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO FITORREGULADOR EM 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.

Tipo de Explante

Fitorregulador

2,4-D TDZ ANA

Cotilédone 77,5±6,0 Ba 97,8±2,1 Aa 78,2±6,1 Bb

Hipocótilo 58,0±7,0 Bb 100,0±0,0 Aa 100,0±0,0 Aa

Radícula 83,3±5,4 Aa 95,7±2,9 Aa 100,0±0,0 Aa Nas colunas, médias seguidas por mesma letra minúscula e, nas linhas, médias seguidas por mesma letra maiúscula não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão.

Para os tratamentos com fitorregulador, os explantes que foram

cultivados em meio de cultura suplementado com ANA, apresentaram a

menor taxa de sobrevivência em relação aos que foram cultivados com

2,4-D e TDZ (Tabela 5).

TABELA 5 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA DE EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO TIPO DE FITORREGULADOR EM 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.

Fitorregulador Médias

2,4-D 82,9±3,1 a TDZ 86,6±2,8 a ANA 61,7±8,7 b

Médias seguidas por mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão.

Quanto ao tipo de explante, pode-se observar que o cotilédone

apresentou melhor resposta para a porcentagem de sobrevivência

(90,1%), o qual não diferiu significativamente do hipocótilo (75,3%). O

explante menos viável para a porcentagem de sobrevivência foi

proveniente do sistema radicular (66,4%) (Tabela 6).

54

TABELA 6 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA DE EXPLANTES DE Cochlospermum regium QUANTO AO TIPO EXPLANTE EM 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.

Tipo de Explante Médias

Cotilédone 90,1±7,8 a Hipocótilo 75,3±3,5 ab

Radícula 66,4±4,0 b Médias seguidas por mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão.

Na Figura 2, pode-se observar a formação calogênica em duas

épocas diferentes. A Figura 2A refere-se ao calejamento ocorrido aos 28

dias de cultivo, e a Figura 2B, ao final do experimento, com 49 dias de

cultivo, e sem a formação de brotos. Os calos obtidos ao longo do

experimento apresentaram textura macia e do tipo friável.

FIGURA 2 – CALOGÊNESE in vitro DE Cochlospermum regium. (A) CALOS INDUZIDOS AOS 28 DIAS DE CULTIVO. (B) CALOS INDUZIDOS AOS 49 DIAS DE CULTIVO. BARRA: 1 cm. FOTO: NATÁLIA HELENA GAVILAN (2014).

A análise histológica dos tecidos calogênicos evidenciou a

presença de células meristemáticas potencialmente embrionárias (Figura

3A), além da ocorrência de embriogênese somática, sendo possível

visualizar a estrutura do pró-embrião (Figura 3B), além de embriões

somáticos (Figura 3C) quando utilizado o fitorregulador TDZ com o

explante hipocótilo.

55

FIGURA 3 – CORTES HISTOLÓGICOS EM CALOS DE Cochlospermum regium CULTIVADOS in vitro AOS 49 DIAS. (A) SETAS INDICAM CÉLULAS MERISTEMÁTICAS; (B) SETA INDICANDO PRÓ-EMBRIÃO; (C) SETA INDICANDO PRESENÇA DE EMBRIÃO. BARRA: 50 µm.

3.4.2 REGENERAÇÃO in vitro

De acordo com a análise de variância, apenas as variáveis

correspondentes a porcentagem de oxidação e sobrevivência

apresentaram interação entre os tratamentos testados. Para a indução de

brotos, apenas o tratamento com fitorreguladores foi significativo (Tabela

7).

TABELA 7 – RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA A PORCENTAGEM DA INDUÇÃO DE BROTOS (BRO), OXIDAÇÃO (OXI) E SOBREVIVÊNCIA DE EXPLANTES (SOB) DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AOS TRATAMENTOS AVALIADOS EM 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.


GL

Quadrados Médios

BRO(1)

(%) OXI(1)

(%) SOB(1)

(%)

FR 2 0,011* 0,359* 0,407* TE 2 0,007ns 0,048ns 0,124*

FR×TE 4 0,006ns 0,398* 0,354* Resíduo 309 0,001 0,015 0,016

Total 317 - - - Média - 2,2 40,5 50,3

CVexp(%) - 5,6 19,0 20,3 ns

Valor não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. * Valor significativo

ao nível de 5% de probabilidade de erro, pelo teste F. (1)


onde n = dado amostrado. GL = graus de liberdade, CVexp. = coeficiente de variação experimental, FR = fitorregulador, TE = tipo de explante.

Apenas os calos originados pelo tratamento com TDZ emitiram

brotações, sendo essas observadas na maioria dos explantes do tipo

56

hipocótilo, o qual diferiu significativamente em relação aos demais

tratamentos avaliados (Tabela 8). Os calos originados pela aplicação de

2,4-D e ANA (embora tenham sido os que apresentaram a melhor indução

à calogênese) não emitiram brotos quando submetidos ao meio de cultura

para a regeneração (Tabela 8).

TABELA 8 – PORCENTAGEM DE BROTOS EMITIDOS EM EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO FITORREGULADOR AOS 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.

Fitorregulador Média

2,4-D 0,0±0,0 b TDZ 5,3±4,06 a ANA 0,0±0,0 b

Médias seguidas por mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão.

A porcentagem de oxidação dos tecidos foi observada em

todos os tratamentos, sendo a maior ocorrência no tratamento de

interação entre hipocótilo e TDZ. Embora os maiores índices de oxidação

terem sido verificados quando o fitorregulador utilizado foi o TDZ, não veio

a inviabilizar o experimento, uma vez que houve regeneração de brotos

apenas com o uso desse regulador de crescimento. Os reguladores de

crescimento 2,4-D e ANA, apresentaram menores taxas de oxidação em

comparação com TDZ (Tabela 9).

TABELA 9 – PORCENTAGEM DE OXIDAÇÃO EM EXPLANTES DE

Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO FITORREGULADOR AOS 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.

Tipo de Explante

Fitorregulador

2,4-D TDZ ANA

Cotilédone 48,9±7,3 Aa 15,0±5,7 Cb 36,6±8,9 Bb

Hipocótilo 0,0±0,0 Cb 77,7±6,2 Aa 37,5±10,0 Bb

Radícula 8,8±4,9 Bb 72,9±7,4 Aa 75,0±9,9 Aa Nas colunas, médias seguidas por mesma letra minúscula e, nas linhas, médias seguidas por mesma letra maiúscula não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05).

Dados apresentados como: média ± erro padrão.

Em relação à sobrevivência dos explantes, o fitorregulador que

apresentou o melhor desempenho foi o TDZ, principalmente quando o

explante utilizado foi o hipocótilo. Apenas para explantes de origem

cotiledonar, o regulador de crescimento 2,4-D foi superior quanto a

57

sobrevivência, apresentando a maior média em relação aos demais

tratamentos (Tabela 10).

TABELA 10 – PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA DE EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO FITORREGULADOR EM 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.

Tipo de Explante

Fitorregulador

2,4-D TDZ ANA

Cotilédone 74,4±6,4 Aa 52,5±7,9 Bb 46,6±9,2 Bb

Hipocótilo 0,0±0,0 Cb 77,7±6,2 Aa 37,5±10,0 Bb

Radícula 8,8±4,9 Bb 75,6±7,1 Aa 75,0±9,9 Aa Nas colunas, médias seguidas por mesma letra minúscula e, nas linhas, médias seguidas por mesma letra maiúscula não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão.

Na Figura 3 pode-se observar a regeneração de gemas e

iniciação dos brotos após a adição de BAP ao meio de cultura. É possível

observar também a oxidação na base do calo, o que não veio prejudicar a

emissão de brotos.

FIGURA 3 – DETALHES DA REGENERAÇÃO in vitro DE GEMAS E BROTOS DE Cochlospermum regium. (A) REGENERAÇÃO AOS 28 DIAS DE CULTIVO in vitro. (B) REGENERAÇÃO AO FINAL DO CULTIVO, AOS 49 DIAS (SETA). BARRA: 1 cm. FOTO: NATÁLIA HELENA GAVILAN (2015).

A presença de gemas adventícias foi evidenciada através da

análise histológica, vindo a confirmar a ação do TDZ para a regeneração

de brotos em calos cultivados in vitro de Cochlospermum regium (Figuras

4A e 4B). Essas gemas adventícias originadas dos tecidos do calo

58

indicam a formação de parte aérea, efeito importante para a obtenção de

plantas por meio de organogênese indireta.

FIGURA 4 – CORTES HISTOLÓGICOS DE CALOS de Cochlospermum regium REGENERADOS in vitro AOS 49 DIAS DE CULTIVOS. (A) E (B) DETALHES DA FORMAÇÃO DE GEMAS. BARRA: 50 µm.

3.5 DISCUSSÃO

O processo de organogênese indireta sob condições in vitro é

caracterizado como um evento complexo, com atuação de múltiplos

fatores externos e internos que envolvem a interação entre fonte de

explante, meio de cultura, fatores ambientais, além da ação de

reguladores de crescimento, e da habilidade do tecido em responder a

essas mudanças hormonais durante o período de cultivo (OLIVEIRA et al.,

2013; ALVES et al., 2004).

Inácio et al. (2011) ao avaliar o tipo de explante para a

organogênese de C. regium, observaram que tecidos do hipocótilo

apresentaram maior indução de calos. No entanto, a indução de

brotações foi menor, quando comparada com explantes cotiledonares, em

que a indução da calogênese foi elevada, assim como a indução de

brotações.

Resultados semelhantes também foram observados por

Oliveira (2014) ao estudar a organogênse indireta em E. cloeziana, onde

foi relatado que ambos os explantes (hipocótilo e cotilédone) foram

responsivos, no entanto, explantes cotiledonares apresentaram maior

59

potencial organogênico em comparação aos de origem do hipocótilo.

Esses resultados discordam dos encontrados no presente estudo com C.

regium, onde explantes de origem do hipocótilo foram mais responsivos, o

que pode ser explicado devido a elevada competência celular desse tipo

de tecido.

Dentre os reguladores de crescimento mais utilizados para a

indução de calo em tecidos vegetais destacam-se o thidiazuron (TDZ)

(LAMEIRA et al., 1997) e o 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético)

(NOGUEIRA et al., 2007). No entanto, neste trabalho, o regulador de

crescimento ANA (ácido naftaleno acético) foi o mais responsivo, assim

como observado em testes realizados em cupuaçu, onde a adição de

ANA ao meio de cultura aumentou a eficiência da indução de calos

(VELHO et al., 1988; FERREIRA et al., 2001; VENTURIANI e

VENTURIANI, 2004). O ANA e o 2,4-D apresentam ação de auxina e são

capazes de iniciar a divisão celular e controlar os processos de

crescimento e alongamento celular (NOGUEIRA et al., 2007), efeito esse

que pode favorecer a indução de massas calogênicas em determinadas

condições in vitro (GEORGE et al., 1993).

Quanto ao fato de explantes submetidos à calogênese com o

uso de TDZ terem sido os únicos responsivos à regeneração de brotos,

pode-se justificar devido ao efeito residual durante a fase de indução

(OLIVEIRA, 2014). Esse fitorregulador induz a formação de gemas

adventícias e embriões somáticos em maior frequência do que em

tratamentos a base de auxina-citocinina (RADICE, 2010; ASGHAR et al.,

2013).

A presença de células pró-embrionárias visualizadas na análise

histológica dos calos confirmou a eficiência do TDZ no favorecimento da

embriogênese. Enquanto que para a regeneração de brotos, a análise

evidenciou a indução de primórdios foliares, confirmando as observações

visuais (por meio da morfologia externa) e as comprovadas pela análise

estatística.

Em E. globulus a maior frequência de regeneração de brotos

foi verificada nos tratamentos que associaram BAP e TDZ (AZMI et al.,

1997), corroborando os resultados para C. regium.

60

Em virtude desses resultados, fica evidente a necessidade do

desenvolvimento de estudos em relação a rota organogênica para a

espécie C. regium, para que se possa estabelecer o balanço adequado de

auxina/citocinina para a regeneração de brotos in vitro.

Outro fator que deve ser estudado é o tempo de cultivo para a

indução de gemas e desenvolvimento das brotações. E espécie em si,

necessita de muito tempo de cultivo in vitro (inúmeros subcultivos) para

apresentar resposta organogênica a um determinado estímulo químico, o

que poderia vir a aumentar a proliferação de gemas e favorecer o

desenvolvimento de brotos.

Em termos gerais foi possível comprovar a viabilidade da

organogênese indireta em C. regium, contudo esse evento deve ser

aprimorado a para elaboração de protocolos futuros visando adequação

em sistemas de produção de mudas ou para a obtenção de determinados

tipos de órgãos.

3.6 CONCLUSÕES

Todos os fitorreguladores e explantes testados induziram à

calogênese, sendo a associação entre o 2,4-D e explante do tipo

hipocótilo foram os mais responsivos.

O TDZ quando associado à explantes de origem do hipocótilo

foi o único que resultou em regeneração de brotos.

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