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  • 7/23/2019 Clonagem Dna

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    Clonagem de DNA

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    1 - Formar DNA recombinante1 - Formar DNA recombinante

    bacterifagos

    bacterifago

    s

    bacterifago

    s

    bacterifago

    s

    bacterifago

    s

    Bactrias esto sobre constante ataque deBactrias esto sobre constante ataque debacterifagos (virus).bacterifagos (virus).

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    Para se protegerem muitas desenvolveram um sistema

    para destruir DNA estranho (por ex dosbacterifagos, impedindo assim o seu ataque).! So endonucleases--(enzimas de restrio, porque

    restringem a infeco por bacterifagos)! Corta qualquer DNA que entra na bactria

    PORQUE No destrudo o seu prprio DNA?

    Possuem um gene que impede as Enz Rest de atacar o prprio DNAcromossomal

    Enzimas de restrioEnzimas de restrio

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    2- Uso de plasmdeos (vectores de clonage

    3 - Transformao3 - Transformao

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    4 - Reconhecimento4 - Reconhecimentodos clones transformadodos clones transformado

    Transformao

    Preparao de clulas

    competentesE.Coli- clula

    hospedeiraTransformao qumica

    - CaCl2 e choque trmico

    Transformao

    Transformao elctrica

    - Choques elctricos

    cromossoma

    3. E.Coli sem plasmdio

    2. E.Coli+ plasmdio

    3

    2

    1

    1. E.Coli + DNA recombinante

    Lima, N.; Mota, M. 2003.Biotecnologia. Fundamentos e Aplicaes. Edies Tcnicas. pp. 130.

    Situaes que podem ocorrer:

    Adio de DNArecombinante

    construdo in vitro

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    Que estratgias utilizar para seleccionar asclulas com DNA recombinante?

    Resistncia a antibiticos

    - Ampicilina

    Actividade da !-Galactosidase(gene Lac Z)

    Marcas de seleco do vectorMarcas de seleco do vector

    AmpR

    Lac Z

    Insero de DNAestranho

    Origem dereplicao

    www.science.uwaterloo.ca/course-notes/biology

    Meio de cultura com ampicilina

    Transformao

    Como seleccionar

    as clulas comDNArecombinante?

    Clulas semplasmdiosClula com

    plasmdio

    Clula complasmdio

    Seleco das clulas complasmdios

    Resistncia ampicilina

    www.science.uwatterloo.ca/course-notes/biology

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    Gene Lac Zintacto

    Gene Lac Zdesintegrado

    !-Galactosidase

    X-GalPigmento azul

    !-Galactosidase

    Actividade daActividade da !!-Galactosidase-Galactosidase

    Meio de cultura comMeio de cultura comampicilinaampicilina

    X-GalX-Gal

    ++

    www.science.uwat terloo.ca/course-notes/biology

    Seleco dos clonesSeleco dos clones

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    Questes:

    Quantos fragmentos se obtm do DNA de um organismo?

    Quantos clones podero existir?

    Como procurar o Clone que nos interessa?

    E se houver pouco material?

    Como restringir a escolha?

    Pontos de Discusso

    Master plate

    Filter

    Solution

    containing

    probe

    Filter liftedand flipped over

    Radioactivesingle-stranded

    DNAProbeDNA

    Gene ofinterest

    Single-stranded

    DNA from cell

    Hybridization

    on filter

    Master plate

    Coloniescontaining

    gene of

    interest

    A special filter paper is

    pressed against themaster plate, transferring

    cells to the bottom side of

    the filter.

    The filter is laid

    under photographicfilm, allowing any

    radioactive areas to

    expose the film

    (autoradiography).

    After the developed

    film is flipped over,the reference marks

    on the film and master

    plate are aligned tolocate colonies

    carrying the gene of

    interest.

    The filter is treated to break

    open the cells and denaturetheir DNA; the resulting

    single-stranded DNA

    molecules are treated so that

    they stick to the filter.

    Hibridizao DNAComo encontrar a colnia com o gene

    de interesse?