Células madre adultas (mesenquimales y nucleadas ... · células madre embrionarias. Durante la...

DEDICATORIAIn Memoriam: Prof. SenénVilaró

RESUMEN

OBJETIVO: Valorar la efica-cia del implante de célulasmadre pluripotencialesadultas obtenidas a partir deaspirado medular (célulasnucleadas) y de tejido adi-poso (células mesenquima-les) en la rehabilitación fun-cional y estética del aparatoestomatognático de pacien-tes con insuficiencia óseamáxilo-mandibular.

DISEÑO: Ensayo clínicoaleatorio-controlado, en ungrupo constituido por 9pacientes con insuficienciaósea máxilo-mandibular.Los criterios de inclusión delos pacientes en este estu-dio, fueron adultos ambossexos tanto los de asigna-ción al grupo tratado concélulas obtenidas a partir de

aspirado medular como concélulas mesenquimales cul-tivadas a partir de lipoaspi-rados de tejido adiposo.

RESULTADOS: Los resulta-dos obtenidos evaluando elcrecimiento óseo han sidoaltamente satisfactorios en8/9 casos totales. Sólo 1caso de 9 se descartó porcontaminación. No se handistinguido diferencias des-tacables en la evolución delimplante celular en ambosgrupos objeto de estudio, yen todos los casos se consi-guió hueso cortical. Se haconseguido crecimiento dehueso vertical en los trata-mientos realizados concélulas progenitoras mesen-quimales, así como tambiénen los tratados con concen-trado de aspirado medular.

CONCLUSIONES: Elimplante de células madreadultas pluripotenciales esuna técnica que precisa deuna preparación meticulosa

y un control exhaustivo decada caso, pero que daresultados altamente positi-vos tanto si las célulasimplantadas son mesenqui-males como si se utilizaconcentrado medular, frentea las técnicas clásicas hastaahora utilizadas.

PALABRAS CLAVEOsteoinducción, osteogéni-co, células madre embriona-rias, células madre adultas,células mesenquimales, teji-do adiposo, médula ósea,células mononucleadas.

INTRODUCCIÓNEl problema que representala insuficiencia ósea maxilo-mandibular, que puedeimpedir o dificultar la reha-bilitación funcional y estéti-ca del aparato estomatogná-tico mediante implantes, esobjeto de estudio desdehace años. Las técnicas pararesolverlo han ido evolucio-nando e incorporando nue-vos elementos a lo largo del

tiempo. Actualmente, la téc-nica de elección es el trata-miento del defecto mediantela inserción de auto-injertoson-lay e in-lay, la cual escompleja y traumática y losresultados, como los de ladistracción ósea, dependenfundamentalmente de lahabilidad y preparación delcirujano. Sin embargo,muchos de los problemas deinsuficiencia ósea pueden,hoy día, resolverse con otrastécnicas más conservadoras.Los elementos de que se dis-pone podemos dividirlosbásicamente en 2 grupos.

El primer grupo de mate-riales, estaría formado porlas membranas que aíslan eldefecto y cuya función esimpedir el crecimiento delos tejidos blandos hacia suinterior, mientras que pre-servan o crean un espacioen donde pueda crecer elhueso. Sus componentespueden ser reabsorbibles ono reabsorbibles, rígidos ono, y todas ellas tienen ven-

Dr. Miguel Velilla LópezMÉDICO ESTOMATÓLOGO

SERVICIO DE ESTOMATOLOGÍA DE LA CLÍNICA HOSPITALARIA

ST. JOSEP DE VIC

Dr. Eduard Molina MascaróMÉDICO ESPECIALISTA EN CIRUGÍA MAXILO-FACIAL

CLÍNICA DEXEUS, BARCELONA

Dra. Adela Miralles MarínRESPONSABLE DEL BANCO DE TEJIDOS (BARCELONA) Dr. Juan García LópezDIRECTOR DEL CENTRO DE TEJIDOS Y TERAPIA CELULAR DEL

BANCO DE SANGRE Y TEJIDOS (BARCELONA)Dr. Manuel Reina del PozoPROF. TITULAR DEL DEP. DE BIOLOGÍA CELULAR DE LA

UNIVERSIDAD DE BARCELONA

Dra. Conxita de Castellarnau Castella INVESTIGADOR SENIOR, DEL DEP. DE BIOLOGÍA CELULAR DE LA

UNIVERSIDAD DE BARCELONA Y DE ADVANCELL

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76 GACETA DENTAL 173, septiembre 2006

Células madre adultas(mesenquimales y nucleadas).

Aplicación al campo de laregeneración ósea maxilar en

Implantología

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tajas e inconvenientes,debiéndose utilizar la másadecuada a cada caso con-creto. A una membranadeberíamos pedirle, ademásde que evite el crecimientode los tejidos blandos haciael defecto, que sea inmuno-lógicamente compatible,barata, fácil de utilizar, quepermita un cubrimientototal por la mucosa y encíaadherida y que no sea posi-ble su exposición. Existeuna membrana que reúnetodas estas condiciones, queno es otra que el propioperiostio.

El segundo grupo demateriales, estaría formadopor los posibles rellenos deldefecto como son las matri-ces biocompatibles, las cua-les imitan al hueso y tienenpropiedades osteoconducto-ras de la regeneración ósea,lo que facilitará el andamia-je para las células y portanto el crecimiento delhueso. Recordemos que laestructura ósea está consti-tuida por una fase mineralde fosfato cálcico llamadohidroxiapatita (HA), el colá-geno y otros componentes.Por este motivo, las cerámi-cas de fosfato cálcico simila-res al HA son en principio,una de las opciones usadasdesde hace muchos años enimplantes dentales, ortope-dia y cirugía maxilofacial.Se han utilizado todo tipode materiales (1), pero

actualmente la tendencia esutilizar principalmente elhueso bovino y otros mate-riales como el hueso decadáver, que al tener proteí-nas precursoras de hueso,podría inducir el crecimien-to de éste y presenta unabuena actividad osteocon-ductora e inductora del cre-cimiento óseo (2).

A este segundo grupopertenecería el materialosteogénico. Sólo el huesovivo lo es, y solamente elhueso del propio pacientenos da la seguridad inmu-nológica necesaria.

En la actualidad, al dis-cutible efecto morfogenéti-co del hueso de cadáver, sele ha unido la utilización deconcentrados de plaquetas(3), reservorio de factoresde crecimiento y que se hademostrado clínicamenteque aumentan el metabolis-mo óseo, estimulan la rege-neración periodontal, y ace-lera la cicatrización.

Estos factores de creci-miento plaquetarios no sonespecíficos del hueso, sinoque aceleran la formaciónde cualquier tipo de tejido,y su incorporación al arse-nal terapéutico de la regene-ración tisular guiada, hahecho a ésta más predeciblepero no totalmente y sólo sehan conseguido aumentosóseos horizontales. Se preci-saría un nuevo factor añadi-do al substrato, que diera la

seguridad de que será huesoy no otro tejido lo que cre-cerá en los defectos a tra-tar. Una posibilidad seríanlas células precursoras deltejido óseo, las cuales ya seincorporan al substrato pormedio del hueso molidodel propio paciente, perosu concentración estimadade 1/1.000.000 no nos ase-gura la predictibilidad deltratamiento.

Desde hace algunos añosse viene trabajando en laregeneración de tejidosmediante la implantación decélulas madre embrionarias.Durante la fase de mórulalas células embrionarias sontotipotenciales, esto es, cadauna de ellas puede diferen-ciarse en todas las célulasdel organismo y dar lugar aun ser completo. En el sép-timo día, en la fase de blas-tocito, se forma una cavidaden la masa celular que dalugar a dos partes, elembrioblasto del que sediferenciarán las tres hojasembrionarias y el trofoblas-to que dará lugar a la pla-centa. Estas células embrio-blásticas son denominadasmultipotenciales y van adiferenciarse en las distintaslíneas de células pluripoten-ciales, que se multiplicarána su vez en las estirpes celu-lares para las que están pre-determinadas y que daránlugar a los distintos órganosen el embrión.

En la fase multipotencial,es en la que las célulasembrionarias son obtenidaspara su utilización. Sinembargo la obtención eimplantación de las célulasmadreembrionarias presen-ta una serie de problemasmorales, éticos e inmunoló-gicos que dificultan suincorporación a la clínica.

Algunas células pluripo-tenciales permanecen en losdistintos sistemas del adultocon la función de regenera-ción específica de la líneacelular a que pertenecen.

Recientemente los traba-jos de Verfaille (4) y Prosper(5) han demostrado que esposible la obtención y laextensión de células madreadultas, mesenquimales demédula ósea, y más recien-temente Zuk PA y cols.,2001, las obtienen del tejidoadiposo (6). Parece ser queestas células adultas inserta-das en un medio favorable,son capaces de sufrir unproceso denominado detransdiferenciación, siendoentonces capaces de generarcélulas de tejidos de hojasembrionarias diferentes a suorigen, esto es, que vuelvena ser multipotenciales. Estascélulas madre adultas nopresentan ninguno de losproblemas tanto éticoscomo inmunológicos quehacían tan difícil la utiliza-ción de las embrionarias,por obtenerse del propio

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paciente. El doctor. delOlmo ha aplicado esta téc-nica a problemas clínicosconcretos con gran éxito elaño 2003 (7). Recientemen-te, Rei Ogawa y cols., 2006,(8) han revisado el tema dela potencial utilización delas células madre obtenidaspor técnicas de liposuccióndel tejido adiposo en laregeneración del tejido óseoy en su vascularización.Nuestro grupo ha descritola existencia en las célulasdel tejido adiposo de unapoblación de células proge-nitoras estromales muy pri-mitivas capaces de producirendoteliales y en conse-cuencia de participar en elproceso de vascularización(Martinez-Estrada O.y cols.,2005) (8). Además, las célu-las mesenquimales del teji-do adiposo se ha descritoque expresan marcadoresque indican su potencialcapacidad de diferenciarse acélulas del tejido óseo y quees importante que las célu-las vayan acompañadas deuna matriz que les sirva desoporte para su anclaje yproliferación (revisado en 9y 11).

En base a lo anterior, elobjetivo de este estudio hasido valorar la eficacia delimplante de células madrepluripotenciales obtenidas apartir de tejido adiposo(células mesenquimales) yde aspirado medular (célu-las nucleadas) en la rehabi-litación funcional y estéticadel aparato estomatognáticode pacientes con insuficien-cia ósea máxilo-mandibular.Estas células se han utiliza-do mezcladas con unamatriz ósea y plasma rico enplaquetas (PRP) para pro-porcionar soporte y factoresde crecimiento osteocon-ductivos.

METODOLOGÍAPACIENTES. En este estudio

se incluyeron un total de 9pacientes (6 varones y 3mujeres) de edades com-prendidas entre 45 y 65años. Los criterios de inclu-sión de los pacientes en esteestudio fueron la insuficien-cia maxilar en combinacióno no con la necesidad deelevación de senos para sutratamiento.

Los criterios de asigna-ción al grupo tratado concélulas nucleadas obtenidasa partir de aspirado medular(n = 7) o con células mesen-quimales (n = 3) obtenidasen cultivo de lipoaspiradosdel tejido adiposo, fueronúnicamente los expuestospara ambos grupos. La eva-luación clínica y radiológica(T.C. en todos los casos) fuerealizada en el periodo pre-y post-operatorio. La eva-luación clínica incluyó elseguimiento postoperatoriodurante 24-48 horas. Poste-riormente se realizó elseguimiento de formaambulatoria semanalmentedurante 8 semanas. La eva-luación por imágenes inclu-yó estudio radiológico altérmino de las 8 semanas yestudio citológico del tejidoóseo neoformado en loscasos que requirieron rein-tervención. Este estudio serealizó bajo la autorizaciónadministrativa de la Organi-zación Catalana de Tras-plantes (OCATT) y con elconsentimiento del ComitéÉtico del centro autorizadopor el propio OCATT parala obtención e implantaciónde células madre adultas(Clínica Hospitalaria St.Josep de Vic).

Técnica quirúrgica. Laobtención del aspiradomedular se realizó mediantepunción en cresta ilíaca,bajo sedación y anestesialocal; el lipoaspirado seobtuvo en las mismas con-diciones, de zona periumbi-lical mediante aspiración

manual con cánula huecaaplicando técnica húmeda.El abordaje quirúrgico parael implante de las célulasmadre pluripotenciales fueincisión crestal y descargasverticales en todos loscasos, excepto en uno en elque se expuso la mandíbulaen su totalidad para coloca-ción de prótesis (10). Comoera de esperar, cuando lascélulas adquieren aparienciafibroblastoide, en cultivoexpresan marcadores (CDs)específicos de mesenquima-les (CD90; CD44; CD105;etc.) y son negativas paraalgunos marcadores hema-topoyéticos que sí se expre-san al inicio.

La obtención de célulasprogenitoras mesenquima-les de tejido adiposo se rea-lizó mediante lavados y tra-tamiento enzimático dellipoaspirado y posteriorpuesta en cultivo de las mis-mas según técnica originaldescrita por Zuk PA y cols.2001 (6), y posteriormenteutilizada por nosotros(10). A estas células se lesha llamado PLA (processedlipoaspirate adipose cells),o también ADAS (adipose-derived adult stem cells)(8). Estas células multipo-tenciales pueden diferenciar-se in vitro hasta adipocitos,osteoblastos, condrocitos (6,8) y, recientemente, a célulasendoteliales (10). Una vezpuesto a punto el procesopor el grupo de investiga-ción Celltec UB de la Uni-versidad de Barcelona, estatécnica se transfirió al Cen-tro de Tejidos y TerapiaCelular del Banco de Sangrey Tejidos de Barcelona, parasu aplicación a terapiacelular. La caracterizaciónde las células obtenidas en3 pacientes se realizó, alfinal del cultivo y antes desu implantación, mediantecitometría de flujo y el usode alguno de los marcado-

res especificos antes men-cionados.

El aspirado medular de 7pacientes se procesó para elimplante mediante centrifu-gación a 3.500 rpm(1.506,50 g), durante 7minutos.

El Plasma Rico en Pla-quetas (PRP) se obtuvomediante la técnica habi-tual.

RESULTADOSLos casos clínicos globalesse presentan en la Tabla I amodo de resumen.

CASOS CLÍNICOS DE PACIEN-TES TRATADOS CON CÉLULAS

MESENQUIMALES DE TEJIDO

ADIPOSO

El volumen medio de tejidoadiposo obtenido en 3pacientes ha sido de 56,7 ±37,5 ml, a partir del cual alfinal del cultivo se hanobtenido 21,6 x 106 ± 6,2células para implante. Porcitometria de flujo seencontró que de estas célu-las un 94,6 ± 4,1 por cien-to han sido CD45-, un 92,4± 2,5 por ciento han sidoCD14-CD90+ y un 72,5 ±12,9 por ciento CD105 +CD166 + CD45-, lo cualnos estaría indicando suorigen mesenquimal y supotencial osteogénico.CASO I. Varón de 45 añosde edad que presenta grandefecto horizontal y verti-cal en zona vestibular ante-rior, que compromete gra-vemente la estética de larestauración (Figura 1).Bajo anestesia local y seda-ción, fue practicadamanualmente liposucciónperiumbilical (Figura 2)con técnica húmeda para laobtención del material adi-poso, que fue inmediata-mente trasladado al Bancode Tejidos para su procesa-do y puesta en cultivo(Figura 3). Siete días mástarde, bajo anestesia local

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se realizó la intervenciónpara la inserción de losimplantes y el relleno deldefecto mediante una mez-cla de hueso bovino, PRP ylas células mesenquimalesprocedentes del cultivo(Figura 4). Se interpusouna membrana de fibrinadel propio paciente, paraevitar la dispersión delrelleno, y mediante inci-sión del periostio se liberóel colgajo que fue suturadosin tensión. Parte de lascélulas se infiltraron en elárea de sutura para unamejor cicatrización. A las 8semanas el paciente con-servaba radiológicamenteel injerto en altura. El escá-ner demostró a los 90 díasque el crecimiento óseo sehabía producido tanto ensentido horizontal como enel vertical (Figura 5).

CASOS II Y III. Con lamisma técnica, se obtuvie-ron e implantaron célulasmesenquimales en otrosdos pacientes con atrofiamandibular severa, en unode los cuales se utilizó

como material de relleno yadhesivo para prótesis dementón y ángulo mandibu-lar, con resultados satisfac-torios (Figuras 6 y 7). Estepaciente, que había sidointervenido innumerablesocasiones, acumulaba fra-casos. Seis meses después

de la intervención elpaciente continúa asinto-mático.

En el tercer caso se per-dió el injerto a causa deuna infección (Tabla I).

La técnica descritademuestra que la inserciónde células madre adultas

(mesenquimales de tejidoadiposo autólogo) en maxi-lares induce el crecimientoóseo incluso vertical, ya queaunque en ninguno de loscasos pudo llevarse a cabo lacitología, la evolución clínicay radiológica fue suficiente-mente demostrativa.

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Figura 1

PACIENTES INSUFICIENCIA ELEVACIÓN PROCEDENCIA CULTIVO TIPO CELULAR CONTROL CONTROL RESULTADOS

MAXILAR DE SENOS CELULAR RADIOLÓGICO HISTOLÓGICO

1 Sí No Tejido adiposo Sí Mesenquimales T.C. No +

2 Sí No Tejido adiposo Sí Mesenquimales T.C. No +

3* Sí No Tejido adiposo Sí Mesenquimales No No ¿?

4 Sí Sí Médula ósea No Células nucleadas T.C. No +

de médula ósea

5 Sí Sí Médula ósea No Células nucleadas T.C. Sí +

de médula ósea

6 Sí Sí Médula ósea No Células nucleadas T.C. No +

de médula ósea

7 Sí No Médula ósea No Células nucleadas T.C. No +

de médula ósea

8 No Sí Médula ósea No Células nucleadas T.C. No +

de médula ósea

9 No Sí Médula ósea No Células nucleadas T.C. No +

de médula óseas

Tabla I. Principales características y resultados globales en los pacientes estudiados. (* el paciente 3 no se pudo considerar porquese infectó


CASOS CLÍNICOS DE PACIEN-TES TRATADOS CON CÉLULAS

NUCLEADAS DE MÉDULA

ÓSEA.CASO I. Paciente de 47años de edad, que presentainsuficiencia ósea muygrave en maxilar superiorque precisaría de injerto dehueso procedente de crestailíaca, con dudoso pronós-tico dado el escasísimomaterial ósea donde inser-tar el injerto (Figura 8).

Se obtiene el aspiradomedular mediante punciónde hueso ilíaco (Figura 9).

Se prepara una cavidadmediante una membranasemirrígida, que se rellenacon una mezcla de huesobovino, que nos dará volu-men, PRP que aportará fac-tores de crecimiento,homogenizará la mezcla y

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Figura 2a, b, c y d

Figura 3. Proceso de obtención de mesenquimales: a) centrifugado, b) cultivo, c) mesenquimales, d) transporte al centro hospitalario



la hará fácil de manipular y el centí-metro cúbico superior del precipita-do celular, obtenido mediante el cen-trifugado de 30 ml. de la muestra delaspirado medular, donde en razón desu densidad, se encontrarán las célu-las mononucleadas (Figuras 10 y 11).Tenemos pues el material de rellenoque buscábamos desde el principio:andamiaje biológico, impulso de cre-cimiento y células nucleadas comoprecursores potenciales del creci-

miento óseo. Estas células no hansido aún caracterizadas, pero cabesuponer que en esta fracción pue-den existir células precursoras. Conesta idea las hemos obtenido eimplantado en el mismo acto qui-rúrgico, y al ser del propio paciente,no existen problemas ni éticos niinmunológicos. Además, con estatécnica no hemos abierto un segun-do campo quirúrgico que siempreresulta traumático para el paciente y

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Figura 4a, b y c


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Figura 5a, b y c

Figura 6a y b


es comprometido para elprofesional. En este caso elT.C. demostró a los 3meses un crecimiento óseoextraordinario (figura 12).Los implantes fueron inser-tados y cargados sin pro-blema.

CASO II. Mujer de 50 añosque presenta una reabsor-ción extrema en maxilarsuperior (figura 13). Se pro-puso injerto de cresta ilíaca

que fue rechazado por lapaciente. Con la misma téc-nica que en el caso anteriorse procedió a la regenera-ción ósea, en esta ocasiónsin la ayuda de la membra-na que hubiera impedido lasutura sin tensión. A lostres meses, el T.C. demos-tró un crecimiento óseosumamente satisfactorio(Figura 14). En este caso lahistología dio el resultadode hueso medular. Los

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Figura 7a, b, c y d

Figura 8a y b

Figura 9


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implantes fueron colocados ycargados sin incidencia.

Finalmente comparamoseste caso con otro distintotratado con injerto de cres-ta ilíaca (Figura 15).

El resto de casos fuerontratados y resueltos conidéntica técnica (Tabla I).

DISCUSIÓNLa técnica es novedosa, yaque no hemos encontradoen la literatura revisada nin-gún caso de aplicación decélulas madre adultas en laregeneración ósea maxilaren relación con la Implanto-logía, por lo que natural-mente la experiencia clíni-ca es escasa, pero ante los

resultados obtenidos, sepodría expresar que unanueva y quizás prometedo-ra terapia celular en Medi-cina Regenerativa, podríaser la utilización de lascélulas madre mesenqui-males de origen adiposo(más abundantes que en lamédula ósea) del propiopaciente, multiplicarlas invitro utilizando su propiosuero como factor de creci-miento y posteriormentetransferirlas al paciente deforma adecuada para poderfacilitar su diferenciación.

Esta transferenciapodría hacerse con lascélulas solas o asociadas aalgún tipo de biomaterial

Figura 10a. Vertido en los tubos de centrifugado.10b. Obtención de la sangre para el P.R.P.10c. Material final de relleno

Figura 11a y 11b


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Figura 12a y b, antes del tratamiento

Figura 12c y d, después del tratamiento

Figura 13a, b y c


cerámico de los que ya seusan actualmente, pensandoque estos podría favorecerconjuntamente su anclaje yfavorecer su osteointegración.

De acuerdo con distintosautores (8, 9) y por resultadosexperimentales propios (10)creemos que esta podría sertécnica de elección para resol-ver los defectos óseos másimportantes y sobre todo elproceso de vascularización, elcual es muy necesario paraque haya formación de huesomedular.

Con esta intención a par-tir del tejido adiposo hemosobtenido un número muyelevado de células progeni-toras adultas, que expandi-das en cultivo presentan oexpresan marcadores reco-nocidos como específicospara células mesenquimalescon capacidad de diferen-ciación específica a célulasdel hueso. En los casos estu-diados y que se han podidoseguir, esta técnica ha sidoclínicamente muy efectiva.Sin embargo, en la práctica

diaria resulta, por ahora,legalmente inalcanzablepara el práctico general ybastante costosa.

Sin embargo, los resulta-dos también positivos obte-nidos en 7 casos utilizandolas células nucleadas de unconcentrado medular sinpurificar, nos estaría indi-cando otro camino por elque quizás de forma no tantraumática y en el mismoacto quirúrgico, se podríanresolver casi la totalidad delos casos de insuficiencia

ósea periimplantaria, con laaportación de las pocas célulasmadre hematopoyéticas pre-sentes en dichos concentradosde médula ósea medular. Nosencontramos, como sedemuestra radiológica, clínicae histológicamente (esto últi-mo en un caso), que las célu-las existentes son capaces detransdiferenciarse en célulasmadre precursoras de tejidoóseo. Si bien en estos casos seconsigue sólo hueso en formade bloque cortical, este essuficiente para llevar a cabo

Figura 14a, b, c y d

Figura 15a y b

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tratamientos implantológicos. No desesperamos, sin

embargo, de que aplicandoal aspirado medular técni-cas más refinadas de aisla-miento y extensión celularen el mismo acto quirúrgi-co, llegaremos a conseguirun número de células apor-

tado superior y el “efectorabo de lagartija” deseado,esto es, la restitución ínte-gra de cortical y medularque buscamos desde elprincipio.

CORRESPONDENCIADr. Miguel Velilla López

Tel. y fax: 93 883 37 24e-mail: [email protected]

AGRADECIMIENTOSDra. Esther BellafontDña. M.ª Jesús FélixDra. Carmen RosDra. M.ª José Giménez

Prof. Montserrat PonsàD. Miguel Velilla BellafontDr. Julián LópezDr. Albert VallésDr. Josep M.ª FerrerDr. Juan Ángel ClaveroDr. Luís Massuet Dr. Luciano RodríguezProf. Mariano Monzó.

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