Cobre, manganês e zinco afetam estado … INSTITUTO AGRONÔMICO CURSO DE PÓS -GRADUAÇÃO EM...

Campinas (SP) 2013

Cobre, manganês e zinco afetam estado nutricional, tolerância e

resistência de plantas com HLB?

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INSTITUTO AGRONÔMICO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL E

SUBTROPICAL

COBRE, MANGANÊS E ZINCO AFETAM O ESTADO NUTRICIONAL, TOLERÂNCIA E RESISTÊNCIA DE

PLANTAS COM HLB?

FAUSTO VEIGA DE ALVARENGA

Orientador: Dirceu de Mattos Jr. Co-orientador: Helvécio Della Colleta-Filho

Dissertação submetida como requisito para obtenção do grau de Mestre em Agricultura Tropical e Subtropical, Área de Concentração em Gestão de Recursos Agroambientais

Campinas, SP Abril 2013

Ficha elaborada pela bibliotecária do Núcleo de Informação e Documentação do Instituto Agronômico A473c Alvarenga, Fausto Veiga de Cobre, manganês e zinco afetam o estado nutricional, tolerância e resistência de plantas com HLB?./Fausto Veiga de Alvarenga. Campinas, 2013. 48 fls. Orientador: Dirceu de Mattos Jr. Co-orientador: Helvécio Della Colleta-Filho Dissertação (Mestrado) Agricultura Tropical e Subtropical – Instituto Agronômico

1. Citros 2. Doenças de plantas 3. HLB 4. Micronutrientes I. Mattos Jr, Dirceu de. II Colleta-Filho, Helvécio Della II. Título CDD. 631.4

iii

DEDICO

Aos meus pais, Eliana Dea e João (in memoriam),

minha irmã, Eliana,

e a todos que de alguma forma

me ajudaram a percorrer esse caminho.

iv

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus que de sua forma, possibilitou que essa jornada tivesse um bom final;

À Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES) pela concessão da

bolsa, item de grande importância para a conclusão deste trabalho;

A minha mãe, Eliana Dea Veiga de Alvarenga e ao meu pai, João Pereira de Alvarenga (in

memoriam) pelos exemplos de vida, retidão, amor e fé que permeiam o que me tornei;

A minha irmã, Eliana Veiga de Alvarenga, pela amizade e carinho desde sempre;

À Priscilla, pelo amor e paciência em todos os momentos durante esses anos tão especiais em

que estamos juntos;

Ao Dr. Dirceu de Mattos Jr., pela orientação em seu mais amplo significado e pela paciência,

amizade e confiança depositada nesses anos de trabalho;

Ao Dr. Helvécio Della Coletta-Filho, pela co-orientação e por compartilhar seus

conhecimentos e ideias;

Ao Fundo de defesa da citricultura (Fundecitrus) por acreditar nesse projeto e pelo apoio

disponibilizado;

Aos amigos do Laboratório de Fisiologia e nutrição do Centro APTA Citros “Sylvio

Moreira”, Franz, Guilherme, Geisa, Grazi, Danilo e Camila pelos cafés, risadas e muito

trabalho;

Aos amigos do IAC, Patrícia, Tadeu, Camila, Rimena e Vinícius por tornarem esses dois anos

mais agradáveis;

Aos amigos/irmãos/dinossauros Rafael, André e Danilo pela amizade e companheirismo

desde os tempos de faculdade;

Aos amigos José Maria, Lauriete e Pablo por réveillons, aniversários, bodas entre tantas

outras ocasiões sempre especiais e pela amizade sincera e acolhedora;

À “Família Bregão” e todos seus componentes, principalmente ao amigo Clério por ser

sempre um exemplo de caráter e luta;

Aos amigos do alojamento Tiago, Simone, Rosângela, Bárbara, Inaiara, Laís e Karine;

À Leidiane e Peterson pelo voto de confiança dado ao início desse desafio;

A toda equipe do IAC e do Centro APTA Citros “Sylvio Moreira”, pesquisadores,

funcionários, pós-graduandos e estagiários, que de alguma forma contribuíram para a

conclusão de mais essa etapa.

Muito obrigado!

http://www.capes.gov.br/�

v

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS ......................................................................................................... vi LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................... vii RESUMO ............................................................................................................................. ix ABSTRACT ......................................................................................................................... x 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 01 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 03 3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 10 3.1 Caracterização do substrato ............................................................................................ 11 3.2 Plantio das mudas ........................................................................................................... 12 3.3 Inoculação das plantas e acompanhamento dos sintomas .............................................. 14 3.4 Aplicação dos tratamentos ............................................................................................. 14 3.5 Determinação de massa de matéria seca de parte aérea e de raiz, área foliar, peso específico e análise de seiva .................................................................................................

15

3.6 Análise do extrato de seiva ............................................................................................ 16 3.7 Teor de clorofila ............................................................................................................. 17 3.8 Medida indireta de clorofila pelo uso do spad-502 ........................................................ 18 3.9 Determinação e quantificação de Las nas plantas .......................................................... 18 3.10 Delineamento experimental .......................................................................................... 19 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 20 4.1 Manifestação dos sintomas de HLB ............................................................................... 20 4.2 Produção de massa de matéria seca e área foliar ........................................................... 21 4.3 Análise química do teor total de nutrientes nas folhas ................................................... 26 4.4 Análise química do extrato de seiva e correlações com teores de nutrientes nas folhas 31 4.5 Teor de clorofila ............................................................................................................. 37 4.6 Quantificação de Las em função dos tratamentos .......................................................... 37 5 CONCLUSÕES.............................................................................................................. 39 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 40

vi

LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Distribuição dos tratamentos do experimento .............................................. 11

Tabela 2 - Características químicas do substrato antes do transplante das plantas ....... 12

Tabela 3 - Teor foliar de macronutrientes referentes às médias dos tratamentos nos

três períodos de análise ................................................................................ 28

Tabela 4 - Teor foliar de micronutrientes referentes às médias dos tratamentos nos três períodos de análise ................................................................................

29

Tabela 5 - Teores de macronutrientes presentes no extrato de seiva de ramos de último fluxo vegetativo referentes às médias dos tratamentos nos três períodos de análise .......................................................................................

33

Tabela 6 - Teores de micronutrientes presentes no extrato de seiva de ramos de último fluxo vegetativo referentes às médias dos tratamentos nos três períodos de análise .......................................................................................

35

Tabela 7 - Matriz de correlação de Pearson (r2) para teores de nutrientes solúveis determinados no extrato de seiva e totais na folha da laranjeira Pêra afetadas por HLB plantas e sadias. Médios de dados de análises químicas aos 180, 270 e 360 dias após inoculação (DAI) ...........................................

36

Tabela 8 - Resultados da análise clorofila total e leitura SPAD referentes às médias dos tratamentos .............................................................................................

37

Tabela 9 - Valores médios de Ct obtidos para as plantas submetidas aos tratamentos nutricionais ...................................................................................................

39

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Transplante das mudas e substituição do substrato ................................... 13

Figura 2 - Disposição geral do experimento na casa de vegetação ............................ 13

Figura 3 - Envelopamento da borbulha recém-enxertada (A) e cicatriz confirmando o sucesso da enxertia (B) ...........................................................................

14

Figura 4 - Separação física do extrato de seiva e éter no funil de separação 17

Figura 5 - Sintomas de amarelecimento e vein corking nas folhas de laranjeira Pêra infectada por HLB manifestados durante o período do experimento até 360 dias após inoculação (DAI): tratamento sem micronutrientes + (A), Cu + (B), Zn + (C), Mn + (D), CPLT + (E) e folha sadia (F) ...................

21

Figura 6 - Massa de matéria seca total de laranjeira Pêra nos três períodos de coleta (180, 270 e 360 DAI). Legenda: SM (sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio). Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05) ..............................................

22

Figura 7 - Massa de matéria seca de raízes de laranjeira pêra nos três períodos de coleta (180, 270 e 360 DAI). Legenda: SM (Sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio). Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05) ..............................................

23

Figura 8 - Massa de matéria seca de folhas de laranjeira Pêra nos três períodos de coleta (180, 270 e 360 DAI). Legenda: SM (sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio). Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05) ..............................................

24

Figura 9 - Área foliar específica estimada da laranjeira Pêra aos 360 DAI. Legenda: SM (sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio). Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05) ........................................................................................................

25

Figura 10 - Peso foliar específico estimado da laranjeira Pêra aos 360 DAI. Legenda: SM (sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio). Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05) ........................................................................................................

25

viii

Figura 11 - Sintomas visuais da deficiência de micronutrientes nas folhas de

laranjeira Pêra: Cu (A), Mn (B), Zn (C) .................................................... 30

ix

Cobre, manganês e zinco afetam o estado nutricional, tolerância e resitência de plantas com HLB?

RESUMO

A ocorrência do huanglongbing (HLB, ex-greening) nos citros tem provocado prejuízos ao

setor devido à sua severidade e à falta de um controle conhecido. A doença é causada por uma

bactéria restrita ao floema (‘Candidatus Liberibacter’ spp.) e leva à morte econômica da

planta. Aplicações de nutrientes via foliar e recentemente via solo, têm sido empregadas na

tentativa de amenizar os efeitos da doença na planta, uma vez que reduziriam direta ou

indiretamente a concentração do patógeno na planta. Neste contexto, o presente trabalho

estudou o crescimento de mudas da laranjeira Pêra sobre limão Cravo, infectadas com ‘Ca.

Liberibacter asiaticus’ (Las) ou mantidas sadias. As plantas foram supridas via foliar (Cu =

800 mg L-1, Mn = 500 mg L-1 e Zn = 750 mg L-1) e via substrato (Cu = 1150 mg L-1, Mn =

700 mg L-1 e Zn = 1000 mg L-1) com soluções contendo hidróxido de cobre, sulfato de

manganês e/ou sulfato de zinco. As aplicações ocorreram em intervalos de 30 dias em um

período de 12 meses e os efeitos dos tratamentos avaliados aos 180, 270 e 360 dias após a

inoculação (DAI) com Las. Foram avaliados o estado nutricional das plantas com base nos

teores de nutriente nas folhas e no extrato de seiva, além de produção de massa de matéria

seca de folhas, ramos e raízes, área foliar, peso específico foliar, clorofila total e da

concentração da bactéria nas folhas por PCR. Utilizou-se delineamento inteiramente

casualizado seguido da comparação de médias e de contrastes. As plantas doentes produziram

menor quantidade de massa de matéria seca total e de raízes em relação às sadias, o que não

ocorreu com a massa de matéria seca das folhas. Sintomas visuais pouco severos da doença

foram manifestados nas folhas apenas ao final do estudo, embora tenha sido detectado

aumento do peso específico das folhas das plantas doentes comparado àquelas sadias. Embora

as aplicações dos micronutrientes tenham afetado o estado nutricional das plantas, não

contribuíram para maior tolerância ou resistência dessas ao HLB, uma vez que o título da

bactéria aumentou nos três períodos analisados durante o experimento. Os tratamentos que

receberam cobre causaram prejuízos ao metabolismo do nitrogênio, visto que menores teores

do nutriente foram observados tanto nas folhas quanto no extrato de seiva das plantas doentes

ou sadias.

Palavras chave: ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’, ex-greening, huanglongbing, micronutrientes, PCR.

x

Copper, manganese and zinc affect the nutritional status, tolerance and resistance of hlb infected plants?

ABSTRACT

The occurrence of Huanglongbing (HLB, ex greening) in citrus has caused significant losses

to the sector because of the severity of the disease and the lack of control. The causal agent of

HLB is a bacterium restricted to the phloem (Candidatus Liberibacter spp.) that causes

economic death of the plant. Spray of nutrients to the leaves and more recently the application

to the soil, have been employed in an attempt to mitigate the effects of the disease on the

plant, since these strategies would reduce directly or indirectly the concentration of the

pathogen in infected plant. In this context, this study evaluated the growth of young sweet

orange trees infected with 'Candidatus Liberibacter asiaticus' (Las) by over-grafting and

healthy ones. Plants were supplied with foliar applications (Cu = 800 mg L-1, Mn = 500 mg L-1

and Zn = 750 mg L-1) and applications via substrate (Cu = 1150 mg L-1, Mn = 700 mg L-1 and

Zn = 1000 mg L-1) with solutions containing copper hydroxide, manganese sulphate and / or

zinc sulphate. The nutrient applications were at intervals of 30 days in a period of 12 months,

and the treatments effects were evaluated at 180, 270 and 360 days after inoculation (DAI)

with Las. The nutritional status of plants was evaluated based on the nutrient content of the

leaves and sap, also the production of dry matter of leaves, branches and roots, leaf area,

specific leaf weight, chlorophyll content and concentration of bacteria in the leaves by PCR.

We applied the analysis of variance pair-wised compared or within ortogonal contrasts.

Diseased plants produced lower amount of total dry mass and root compared to healthy ones,

which did not occur with the dry mass of leaves. Little severe visual symptoms of the disease

were only manifested in the leaves at the end of the study, although increased specific weight

of the leaves of diseased plants compared to those healthy were detected. Although the

applications of micronutrients have affected the nutritional status of plants, there is no

contribution to increased tolerance or resistance to HLB, since the concentration of the

bacteria increased in the three periods evaluated during the experiment. Treatments receiving

copper lead to losses on the nitrogen, whereas lower levels of the nutrient were observed both

in leaves and in the sap of healthy or diseased plants.

Key words: ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’, ex-greening, huanglongbing,

micronutrientes, PCR.

1

1 INTRODUÇÃO

A citricultura é uma das atividades agrícolas de importância econômica e social para o

Brasil (NEVES et al., 2010), mas para manutenção de sua atual posição na pauta econômica

do país, requer incrementos na eficiência da cadeia produtiva. Contudo, a ocorrência do

huanglongbing (HLB, ex-greening), doença recentemente constatada na citricultura brasileira,

tem causado sérios prejuízos ao setor devido à sua severidade e à dificuldade de controle nos

pomares (BOVÉ & AYRES, 2007; GOTTWALD et al., 2007; BASSANEZI et al., 2009).

Como provável consequência do curto período de co-evolução entre o hospedeiro e o agente

associado a esta doença não existem variedades de citros resistentes (HALBERTT &

MANJUNATH, 2004; GOTTWALD, 2010).

O agente causal do HLB é uma bactéria restrita ao floema (‘Candidatus Liberibacter’

spp.) que causa disfunção dos vasos pela deposição de caloses e produção de proteínas de

defesa das plantas que bloqueiam o tecido infectado, prejudicando o transporte de

carboidratos na planta, crescimento e funcionamento das raízes, levando à sua morte

econômica (BOVÉ, 2006; ACHOR et al., 2010; FAN et al., 2010). Destaca-se que o excesso

de amido acumulado nas folhas dos citros afetados pelo HLB causa a disfunção de

cloroplastos, perda de clorofila e amarelecimento do tecido vegetal (BONDADA &

SYVERTSEN, 2005; FOLIMONOVA & ACHOR, 2010), o que é associado ao

mosqueamento assimétrico e à deformação da lâmina foliar e queda prematura de folhas

característicos da doença, que se assemelha a sintomas de desordens nutricionais na planta (da

GRAÇA, 1991; BOVÉ, 2006).

No Estado de São Paulo duas espécies de Liberibacter estão associadas com o HLB,

Ca. L. asiaticus (Las) e Ca. L. americanus (Lam), sendo a primeira prevalente à segunda

(GOTTWALD, 2010). Ambas as espécies de Liberibacter são transmitidas pelo psilídeo-

asiático-dos-citros, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae) (YAMAMOTO et al.,

2006). A aquisição de Las pode ocorrer tanto por ninfas como por adultos de D. citri, e uma

vez infectado o psilídeo retém a bactéria por toda sua vida (XU et al., 1988; HUNG et al.,

2004). O diagnóstico/identificação precoce e a erradicação de plantas afetadas, bem como o

controle do inseto vetor têm-se apresentado como medidas mais eficientes para redução do

inóculo no pomar e manutenção da produção de frutos (BELASQUE Jr. et al., 2009).

2

Por outro lado, estratégias como a aplicação de nutrientes via foliar e via solo, como

forma de suprir a demanda da planta não atendida pelas raízes e o uso de outras substâncias,

denominadas eliciadores, que possam induzir a sinalização e a expressão da resistência

sistêmica adquirida (SAR, do inglês: Systemic Acquired Resistance) das plantas ao HLB, têm

sido empregados em pomares da Flórida (EUA) (MATTOS Jr. et al., 2010). Isso permitiria a

planta tolerar os efeitos da doença causados pela reduzida distribuição de carboidratos das

folhas para as raízes e consequentemente melhorar a absorção de água e nutrientes, o que

sustentaria a planta infectada por um período de tempo superior quando comparadas àquelas

não adequadamente manejadas, o que depende de fatores como tamanho e vigor da árvore.

Essas ações vêm de encontro à demanda do setor para manutenção da atividade citrícola, uma

vez que, embora se pleiteie a produção de plantas resistentes/tolerantes ao HLB obtidas por

transgenia, além de outros processos com base em ferramentas moleculares, a expectativa de

sucesso, bem como autorizações de uso e aceitação dos consumidores são esperadas apenas

em longo prazo.

Estudos da eficiência das aplicações foliares de nutrientes para aumentar o suprimento

e minimizar os prejuízos causados pelo HLB ao sistema radicular e, consequentemente, ao

transporte de água e nutrientes para a parte aérea das plantas foram propostos (AREVALO et

al., 2009; SPANN et al., 2010). Nesse caso, postulou-se que as plantas afetadas pelo HLB e

supridas com os nutrientes recuperam em parte a capacidade de crescimento vegetativo e

produção de frutos, o que talvez possa ser economicamente viável. Outra hipótese é que esses

nutrientes e outras substâncias como o ácido salicílico (SA, do inglês: Salicylic Acid),

carboidratos, ácidos graxos e proteínas poderiam induzir a produção de substâncias que

sinalizam as respostas de resistência da planta às doenças. Essas substâncias chamadas

eliciadores, atuam na indução da SAR e agem principalmente na redução da severidade dos

sintomas causados pelas doenças, como observado na indução da produção de fitoalexinas

pelo SA e na redução da severidade dos sintomas do cancro cítrico (Xanthomonas citri subsp.

citri) em folhas de citros (DARVILL & ALBERSHEIM, 1984; MATTOS Jr. et al., 2010).

Verifica-se ainda que os nutrientes minerais podem afetar direta ou indiretamente a sanidade

das plantas, cujas interações se dão pela alteração da suscetibilidade do tecido vegetal ao

ataque por insetos e à infecção por patógenos, ou pela alteração de características químicas do

sistema solo-planta que afetam a sobrevivência e a atividade desses indivíduos

(MARSCHNER, 1995; DIETRICH et al., 2004; DATNOFF et al., 2007; DORDAS, 2008).

No caso dos micronutrientes, respostas em várias culturas foram observadas e

relacionadas a processos fisiológicos e bioquímicos com consequente predisposição das

3

plantas ao ataque de patógenos quando deficientes, pelo estímulo da defesa natural do

hospedeiro ou pelo efeito direto sobre o patógeno (TIMMER & ZITKO, 1995; DORDAS,

2008). O suprimento crescente de zinco (Zn), manganês (Mn) ou cobre (Cu), por exemplo,

proporcionou menores populações de Xylella fastidiosa em plantas de videira quando

comparado àquelas crescidas em solução de Hoagland ou água (BRADY et al., 2010).

Entretanto, as informações disponíveis na literatura acerca do manejo nutricional em

pomares de citros ainda não possuem fundamento científico consolidado para seu emprego

como ferramenta que contribua para o controle do HLB. Assim, se justifica a necessidade de

novos conhecimentos sobre o tema, uma vez que a falta de informação pode induzir erros

estratégicos no manejo da doença em nossas condições, onde plantas infectadas, cujos

sintomas possam ser parcialmente suprimidos pelo fornecimento de nutrientes, poderiam atuar

como fontes de Ca. Liberibacter, contribuindo com a maior dispersão do patógeno pelo vetor.

Baseado nessa necessidade, o trabalho desenvolvido teve como objetivo a avaliação do

crescimento e da evolução do título da bactéria em plantas de citros em função do suprimento

de Cu, Mn e Zn e também o estabelecimento de correlações entre os teores de nutrientes nas

folhas e na seiva de plantas de citros e o aparecimento dos sintomas do HLB.

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O Brasil se destaca mundialmente como um dos maiores produtores de frutas cítricas e

o maior exportador de suco de laranja (FAO, 2012), tendo o Estado de São Paulo como o

principal produtor nacional com 80% do total interno e responsável por mais de 50% das

exportações mundiais de suco concentrado.

Como toda produção agrícola, a citricultura está sujeita à ocorrência de problemas

fitossanitários que determinam importantes perdas em toda a cadeia de seu agronegócio.

Somente nesta última década, quatro doenças foram responsáveis pela erradicação de cerca de

40 milhões de árvores do parque citrícola de São Paulo e do Triângulo Mineiro: a) o cancro

cítrico, doença introduzida no país em 1957, de grande relevância no Estado de São Paulo nos

anos de 1990, e que hoje mostra maior incidência nos pomares do Estado, b) a clorose

variegada dos citros (CVC), constatada em 1987, é uma doença bacteriana que afeta o xilema

e maior causadora de perdas na citricultura até os dias de hoje, c) a morte súbita dos citros

(MSC), relatada em 1999 e de causa ainda desconhecida, sendo de rápida expressão e de

grande importância nas regiões Norte e Nordeste do Estado de São Paulo, d) mais

4

recentemente, o HLB, doença que afeta o floema das plantas, responsável pela erradicação de

cerca de 22 milhões de árvores cítricas desde seu primeiro relato no Brasil em 2004

(FUNDECITRUS, 2013).

O HLB é causado por bactérias Gram negativas da classe das alpha proteobacterias

restritas ao floema e atualmente é a mais séria doença ligada à citricultura no mundo. Três

agentes etiológicos são associados ao HLB: 'Candidatus Liberibacter asiaticus' (Las) (Ásia,

América Central, Estados Unidos, Argentina e Brasil), 'Candidatus Liberibacter americanus

(Lam) (Brasil) e 'Candidatus Liberibacter africanus' (Laf) (África) (COLETTA-FILHO &

CARLOS, 2005; CARY et al., 2013). No Brasil a bactéria Las foi detectada pela primeira vez

no estado de São Paulo e dentre os dois agentes etiológicos da doença presentes no país, é

responsável pelos maiores danos aos pomares (TEIXEIRA et al., 2005; COLETTA-FILHO et

al., 2005; BOVÉ, 2006).

No ano de sua detecção no Brasil, foi estimado que 3,4% dos talhões no parque

citrícola do Estado de São Paulo estavam infectados com a doença. Em 2007, 2008 e 2009

quando outros levantamentos da sua ocorrência foram feitos, os dados mostraram aumento na

incidência de pomares infectados de 12,9%, 18,7% e 24,2% respectivamente (BELASQUE Jr.

et al., 2010). Já em 2012, o Fundo de Defesa da Citricultura (FUNDECITRUS) mostrou que a

doença atingia 6,9% das árvores do parque citrícola e que cerca de 64% dos talhões em

produção tinham ao menos uma árvore infectada.

Na Flórida (EUA), segundo maior produtor mundial de citros, a doença foi detectada

no ano de 2005 e, em 2008, todos os condados produtores já apresentavam árvores infectadas.

Estima-se que nos anos de 2010/2011, 43,3% das árvores de todo o Estado estavam com a

bactéria (TIMMER et al., 2011).

A bactéria é transmitida por duas espécies de insetos vetores (psilídeos): Diaphorina

citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae), responsável pela disseminação da doença na Ásia e

nas Américas (Lam e Las) e Trioza erytreae del Guercio (Hemiptera: Triozidae), vetor da

bactéria Laf no continente africano. O vetor pode transmitir a doença a partir do quarto e

quinto ínstares, e uma vez adquirida, os adultos formados a partir destas ninfas se mantém

infectivos por toda vida, já que a bactéria pode se multiplicar no vetor (XU et al., 1988).

A aquisição de Las por adultos pode superar 80% de eficiência (INOUE et al., 2009).

PELZ-STELINSKI et al. (2010) obtiveram eficiência ao redor de 40% e transmissão variando

de 3 a 7%, enquanto INOUE et al. (2009) não obtiveram sucesso na transmissão por adultos,

o que demonstra que apesar da razoável eficiência na aquisição da bactéria por insetos

adultos, a transmissão neste estádio de desenvolvimento é pouco eficiente. Um fator

5

importante para a aquisição é o tempo que o inseto permanece se alimentando na planta fonte

e, além deste, a fisiologia da planta e do inseto podem influenciar nesta eficiência, como

também a distribuição irregular da bactéria na planta (PELZ-STELINSKI et al., 2010).

Embora psilídeos virulíferos que tenham adquirido Las quando adultos não tenham eficiência

assegurada na transmissão, podem perpetuar a bactéria no ambiente uma vez que machos

infectados podem transmitir Las para a fêmea durante o acasalamento (MANN et al., 2011), e

a transmissão vertical da fêmea para a prole também foi comprovada (PELZ-STELINSKI et

al., 2010). Destaca-se que as ninfas de quarto e quinto ínstares adquirem e transmitem a

bactéria com maior eficiência que os insetos adultos (INOUE et al., 2009).

Os níveis populacionais do vetor estão relacionados à emissão de novos fluxos

vegetativos pelas plantas, uma vez que as fêmeas colocam ovos exclusivamente em tecidos

mais novos e as ninfas se desenvolvem neles até o estágio adulto (HALL et al., 2008).

A doença induz o aparecimento de sintomas de clorose nas folhas que podem se

assemelhar aqueles de algumas desordens nutricionais, como no caso de deficiência de Zn,

mas não apresentam o padrão simétrico na planta e a uniformidade de ocorrência nas árvores

de um pomar, como no caso dessas deficiências. Outros sintomas são mais característicos

como o mosqueado amarelo de padrão assimétrico nas folhas, queda excessiva de folhas e

frutos, estes deformados com columela assimétrica, de coloração desuniforme e com sementes

abortadas, além da redução da qualidade do suco (da GRAÇA, 1991; GOTTWALD et al.,

2007; BASSANEZI et al., 2009, 2011). Estes sintomas podem não se manifestar

simultaneamente e mesmo serem mascarados pela presença de outras doenças ou deficiências

nutricionais (BOVÉ, 2006). Diferentes variedades/espécies de citros apresentam sintomas

distintos, que também variam em condições de campo e de casa de vegetação, podendo ainda

ocorrer em pontos isolados na copa das árvores (FOLIMONOVA et al., 2009).

Alguns sintomas mais avançados estão relacionados ao acúmulo de amido nas folhas,

o que causa o rompimento das membranas dos tilacóides devido à compressão exercida nestas

estruturas. Este rompimento é responsável pelo aparecimento da clorose nas folhas (ACHOR

et al., 2010). Também é observado o menor tamanho do fluxo secundário de folhas, além de

nervuras encortiçadas.

Em nível celular, ocorre o colapso de grande parte dos elementos dos tubos crivados e

das células companheiras em plantas infectadas (FOLIMONOVA & ACHOR, 2010), e os

poros dos vasos do floema que não sofreram esses danos, permanecem obstruídos por calose e

p-proteína, compostos produzidos pela planta em resposta à infecção pela bactéria (KOH et

al., 2012). Essa barreira física promove diminuição e até mesmo a cessão do transporte de

6

fotoassimilados produzidos nas folhas para o resto da planta, o que prejudica diretamente no

crescimento de sistema radicular e resulta na redução da capacidade de absorção de nutrientes

pelas raízes, culminando com o menor aporte de nutrientes para a parte aérea da planta.

Até o presente momento não existem formas curativas de controle conhecidas e nem

mesmo variedades cítricas resistentes ao HLB (FOLIMONOVA et al., 2009)

Algumas características como a rápida evolução da doença entre as plantas e entre as

regiões de cultivo, o longo período de incubação, a presença de múltiplas infecções latentes, a

capacidade de transmissão do vetor em seus diferentes estágios de desenvolvimento e a

própria natureza da doença fazem com que a sua erradicação seja difícil e seu controle

represente um grande desafio à citricultura (GOTTWALD, 2010).

Prevenir a infecção das plantas é atualmente a principal forma de controle do HLB

(BELASQUE Jr. et al., 2009), e a maneira como isso é feito principalmente no Brasil, é

através de um programa de manejo baseado em três componentes principais: a) controle

químico intenso do vetor, b) produção e plantio de mudas sadias e c) inspeção e erradicação

de plantas doentes, estas duas últimas reguladas pela Instrução Normativa número 53 do

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento de 16 outubro de 2008 (MAPA, 2008),

que dita algumas ações a serem tomadas, como a eliminação de pomares com incidência

maior de 28% de plantas sintomáticas, e obriga a realização de ao menos quatro inspeções por

ano para a identificação e eliminação de plantas detectadas com HLB.

Somam-se ainda aos esforços de controle da doença, o desenvolvimento de variedades

que sejam resistentes à infecção – grande foco da pesquisa atualmente; e a tentativa de se

estabelecer um manejo nutricional eficiente. O enfoque desse manejo é principalmente a

manutenção das áreas com níveis de produção economicamente aceitáveis.

Mesmo sendo considerado como a alternativa mais eficiente para reduzir a velocidade

de disseminação da doença, o manejo tradicional baseado na inspeção, remoção de plantas

doentes, replantio com mudas sadias e controle intensivo do psilídeo, tem sido aos poucos

abandonado, principalmente por produtores na Flórida, e substituído por um manejo

nutricional diferenciado, que utiliza além dos nutrientes já conhecidos e recomendados para a

cultura dos citros, outras substâncias como o SA e o fosfito. Apesar da crescente adesão a esse

tipo de manejo diferenciado, os resultados de seu uso ainda são pouco conhecidos (SPANN et

al., 2011).

Em pomares da Flórida onde o manejo tradicional foi mantido, as taxas de infecção

ficaram abaixo de 2% ao ano, mas apesar desses dados, produtores têm se afastado desse tipo

de manejo devido ao tempo relativamente longo, entre dois e três anos, para se observar

7

algum controle da epidemia (IREY et al., 2011). A maioria dos produtores daquele Estado

tem adotado o manejo nutricional diferenciado, constituído por um programa de nutrição com

aplicações via foliar e via solo, manutenção do controle do inseto vetor para conter a infecção

vinda de pomares vizinhos e na maioria dos casos o não replantio, já que pela alta

porcentagem de infecção dos pomares, a introdução de plantas novas é economicamente

pouco viável, pois estas plantas sucumbem mais rápido à doença que as plantas mais velhas

(TIMMER et al., 2011). Tem-se nessa forma de manejo, segundo observações de campo feitas

na maioria das vezes pelos produtores, uma melhora no aspecto visual da planta, que retoma

em parte seu crescimento e assim, ocorre uma redução de alguns dos sintomas. Contudo, essa

melhora pode ser confundida com a diferente expressão da severidade da doença ao longo do

ano, uma vez que nos períodos de menor crescimento da planta a distribuição da bactéria pode

ser mais uniforme, e nessas condições, que correspondem às encontradas no segundo semestre

do ano no Estado de São Paulo, tanto os sintomas quanto as concentrações da bactéria nos

tecidos são acentuados.

O manejo nutricional, mesmo quando aliado a outras práticas culturais como irrigação,

pode manter a produtividade do pomar por certo período de tempo, o que depende da

variedade utilizada, da idade das plantas, da população de psilídeos, entre outros fatores. No

entanto, não existem evidências de que esse tipo de manejo possa se manter como meio

efetivo de manutenção da produção ou redução do progresso da doença na planta a longo

prazo (XIA et al., 2011).

Outro ponto que se destaca é que, nessas observações de melhoria as comparações das

produções mantidas pelo manejo nutricional diferenciado são feitas entre plantas doentes e

não entre plantas doentes e sadias. Quando comparadas às plantas sadias, tanto a produção por

planta quanto o tamanho dos frutos das plantas que recebem esse manejo são menores (IREY

et al., 2011). Ademais, além do custo elevado, pouco se conhece sobre as formulações dos

produtos destes pacotes nutricionais e as concentrações dos ingredientes ativos presentes.

Aos poucos se observa o incremento no uso dessas formulações por citricultores

brasileiros. Os riscos da aceitação deste tipo de produto são enormes, visto que a não

eliminação de plantas infectadas é a primeira etapa para a disseminação indiscriminada da

doença, como já ocorre na Flórida (ROKA et al., 2009; TIMMER et al., 2011)

O grande problema das formulações supracitadas se deve à escassez de informações

acerca dos estudos sobre estes produtos e seus componentes, e apesar da observação de

aparente melhora do desenvolvimento vegetativo das plantas tratadas, não se tem evidências

de efeitos positivos deste manejo sobre o controle da doença em campo (MATTOS Jr. et al.,

8

2010). São esses efeitos, diretos ou indiretos, os quais se buscam compreender,

principalmente no que se refere à interação entre nutrientes e o sistema planta-patógeno-vetor.

As aplicações foliares de nutrientes, principalmente micronutrientes, que vem sendo

feitas na Flórida, amenizam os sintomas de deficiência provocados pela doença, mas essas

aplicações não substituem o manejo tradicional, e servem apenas como um último recurso

para pomares com altos níveis de infecção (GILES, 2011). Destaca-se que o desbalanço

nutricional que ocorre nas árvores infectadas, comparado àquelas assintomáticas ou sadias, é

associado principalmente à redução da concentração de vários nutrientes minerais nas folhas

(MALAVOLTA et al., 2005; SPANN et al., 2008), em resposta ao somatório de prejuízos que

ocorrem. Por outro lado, os resultados do sequenciamento do genoma da bactéria (Las)

permitiram verificar genes associados a sistemas de absorção e sequestro de elementos

minerais como Zn e fósforo (P) nas células da planta (DUAN et al., 2009). Mais

recentemente, e embora não deva ser tratado como único evento que afetaria a recuperação

dos pomares afetados pelo HLB, ZHAO et al. (2013) demonstraram que as árvores doentes

sofrem de deficiência severa de P e que o suprimento do nutriente reduziu significativamente

sintomas do HLB e aumentou a produção de frutos em um pomar na Flórida no período de

três anos do estudo.

A infecção por patógenos pode afetar a absorção, assimilação, transporte e utilização

de nutrientes pela planta (MARSCHNER, 1995). Patógenos podem ainda imobilizar

nutrientes na rizosfera ou em tecidos infectados, ou interferir no transporte de nutrientes pela

planta pela obstrução e por danos causados ao sistema de vasos condutores (DORDAS, 2008;

SPANN & SCHUMANN, 2009), e mesmo causar deficiência ou toxicidade pela utilização

dos nutrientes (HUBER & GRAHAM, 1999).

No contexto geral das relações planta-patógeno, o efeito da recuperação do

crescimento vegetativo é uma das primeiras observações sobre os efeitos dos nutrientes

minerais na ocorrência das doenças. Assim, essa recuperação reduz a severidade de algumas

doenças em plantas deficientes quando nutridas adequadamente (DORDAS, 2008).

Apesar de há muito serem conhecidas as funções fisiológicas dos nutrientes nas

plantas, o correto manejo de sua aplicação para o controle de doenças ainda é pouco

compreendido, uma vez que a resposta da planta às doenças é única para cada complexo

planta-doença (DORDAS, 2008).

Uma das justificativas para o uso de nutrientes no controle de doenças seria a de que

alguns deles podem contribuir para o desenvolvimento da resistência adquirida (SAR) das

plantas à doença, funcionando como eliciadores (SPANN et al., 2010; GOTTWALD et al.,

9

2012), que são substâncias de ocorrência natural ou sintética que estimulam a resposta da

planta quando infectadas por patógenos. Essa resistência de acordo com MARSCHNER

(1995), apesar de controlada geneticamente pode ser afetada por fatores ambientais, como no

caso do fornecimento de nutrientes.

A redução da severidade das doenças atribuída aos nutrientes, principalmente aos

micronutrientes, pode ser tanto devido ao seu efeito tóxico direto sobre o patógeno quanto à

criação de condições que inibem seu crescimento, como seu envolvimento em processos

fisiológicos e bioquímicos na planta (DORDAS, 2008) e na regulação de genes de

patogenicidade e virulência (FONES & PRESTON, 2012).

O fato de micronutrientes metálicos se comportarem como toxinas quando presentes

em excesso permite, desta forma, que possam ser usados como agentes protetores e

antimicrobianos na agricultura. Produtos com estes efeitos e baseados em micronutrientes há

muito tempo são usados na agricultura para controlar doenças de plantas, a exemplo do Cu,

utilizado desde o século 19 como parte de um composto fungicida com efeito tóxico direto

sobre míldio (Plasmopara viticola) em videira (RUSSELL, 2005), e que ainda hoje é uma das

poucas opções conhecidas e liberadas para o controle de doenças bacterianas, como o cancro

cítrico (Xanthomonas citri subsp. citri). Ainda diretamente, micronutrientes fazem parte de

compostos estruturais da planta, como lignina, um composto de parede celular que funciona

como barreira física à penetração de patógenos e suas estruturas, e através do fortalecimento

de estruturas celulares, que impede que o conteúdo das células extravase e sirva de substrato

ao crescimento do patógeno (DORDAS, 2008).

De forma indireta, micronutrientes podem agir sobre os patógenos devido à sua

inclusão em metaloenzimas, como a superóxido dismutase (SOD). Durante a exposição a

estresses bióticos como a infecção da planta por patógenos, as plantas produzem altas

concentrações de espécies reativas de oxigênio (EROs) que podem atuar como agentes

antimicrobianos. Essa produção excessiva faz com que suas próprias defesas antioxidantes se

sobrecarreguem. Para evitar danos às próprias células, as plantas possuem enzimas

antioxidantes funcionais para retomar o controle dos níveis de EROs durante o estresse

(FONES & PRESTON, 2012). Dentre essas enzimas estão as metaloenzimas SOD, que

existem em três isoformas separadas por seus cofatores metálicos: ferro (Fe), Mn e Cu/Zn

(WU et al., 2011).

Além do Cu anteriormente citado, Zn e Mn também apresentam efeitos de controle de

doenças relatados na literatura. O Zn é o mais tóxico às bactérias e ao mesmo tempo tem

papel central em muitos processos metabólicos referentes à patogenicidade e virulência destes

10

patógenos, já que é necessário para a atividade de certas fitotoxinas bacterianas (DATNOFF

et al., 2007). Compostos de Zn tem efeitos de redução da concentração da bactéria

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria em pimenta (ADASKAVEG & HINE, 1985).

BRADY et al. (2010) mostraram o efeito de doses crescentes de Zn na redução dos níveis da

bactéria de xilema Xylella fastidiosa em videiras. Em Thlaspi caerulescens (Cruciferae)

infectada com a bactéria patogênica Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm), nas plantas

tratadas com concentrações progressivas de Zn, o crescimento da Psm e os sintomas na planta

foram significativamente reduzidos à medida que as concentrações de Zn aumentaram

(FONES et al., 2010).

O papel do Mn no controle de doenças se dá principalmente pela sua participação

direta no metabolismo de carboidratos não estruturais, nitrogênio e na formação de compostos

inibidores de crescimento do patógeno como fenóis e fitoalexinas, além de compostos

formadores de barreiras físicas como calose e lignina (DATNOFF et al., 2007). Respostas

tanto positivas quanto negativas foram relatadas para o uso de Mn no controle da bactéria

Xanthomonas oryzae pv. oryzae causadora da ferrugem bacteriana nas folhas do arroz

(PHILIP & DEVADATH, 1981, 1984). Já efeitos de redução em doenças que afetam o xilema

e causam murcha, como no caso da murcha de fusarium (Fusarium spp.), foram relatados em

diversas culturas tratadas com Mn (DATONOFF, 2007).

Um aspecto comum aos pacotes nutricionais usados na Flórida é que em sua

composição estão presentes micronutrientes, como o Cu, Mn e Zn. Esses micronutrientes já

são utilizados na citricultura brasileira junto às recomendações básicas de adubação para a

cultura (MATTOS Jr. et al., 2005), com o Cu principalmente aplicado de forma conjunta aos

inseticidas para aproveitamento da operação, e o Mn e o Zn em aplicações foliares.

O que se buscou entender é se existe correlação entre os teores de nutrientes nas folhas

e na seiva das plantas e a severidade da doença, bem como se o crescimento e a evolução do

título de Las na planta são afetados pelo suprimento nutricional diferenciado.

3 MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado em casa de vegetação no Centro de Citricultura Sylvio

Moreira (CCSM)/IAC/APTA localizado no município de Cordeirópolis, SP (22º28’55”S

47º27’24”O), com plantas jovens de citros, com sete tratamentos e quatro repetições. Os

11

tratamentos consistiram de plantas infectadas com ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ (Las) e

sadias, e do fornecimento de Cu, Mn e Zn via foliar e via substrato.

De acordo com os tratamentos (Tabela 1), as plantas receberam Cu, Mn e Zn (800 mg

L-1, 500 mg L-1, 750 mg L-1, respectivamente) via foliar, e via substrato (230 mg de Cu, 140

mg de Mn e 200 mg de Zn por planta) (Item 3.4).

Ao final do experimento cada planta recebeu via foliar o total de 41 mg de Cu, 27 mg

de Mn e 40 mg de Zn e via substrato 1,3 g de Cu, 0,9 g de Mn e 1,3 g de Zn. No decorrer do

primeiro, segundo e terceiro períodos de coleta, cada planta recebeu respectivamente 261, 470

e 610 mg de Cu; 160, 287 e 480 mg de Mn e 230, 410 e 650 mg de Zn.

Tabela 1 - Distribuição dos tratamentos do experimento.

Tratamento Micronutrientes Sanidade Nutrição Zn Mn Cu

Infectado (+)

0 SM - - - 1 Zn Zn - - 2 Mn - Mn - 3 Cu - - Cu 4 CPLT Zn Mn Cu

Sadio (-) 5 SM - - - 6 CPLT Zn Mn Cu

Legenda: SM (sem Cu, Zn e Mn), Zn (com aplicação de zinco), Mn (com aplicação de manganês), Cu (com aplicação de cobre), CPLT (com aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio).

3.1 Caracterização do substrato

Antes do transplante das mudas para seus recipientes definitivos - vasos plásticos com

capacidade para 12 L preenchidos casca de Pinus, foram determinadas as características

químicas do substrato (Tabela 2). A caracterização serviu principalmente para identificar os

teores dos micronutrientes Cu, Mn e Zn presentes no início do experimento, para que fosse

feita a adequação de adubações. A faixa ideal de pH em substratos de base orgânica para a

maioria das culturas varia entre 5,5 e 6,2 (KÄMPF, 2000; BAILEY et al., 2004) e os valores

de carbono orgânico (C-orgânico) devem ficar acima de 25% do volume do substrato

(SCHMITZ et al., 2002). Apesar da diferença entre a faixa considerada ideal e o valor de pH

12

(Tabela 2), este não foi corrigido, já que o fornecimento de NH4NO3 desde o período de

manutenção das mudas, pode ter promovido a acidificação do meio (BOLAN et al., 1991).

Tabela 2 - Características químicas do substrato antes do transplante das plantas.

pH

Umidade

C-orgânico

Relação C/N

%

g kg-1

6,6

49,1

346,1

65,3 N P K Ca Mg S B Cu Mn Zn Fe --------------------- g kg-1 -------------------- ----------- mg kg-1 ---------- g kg-1

5,3 9,7 4,4 7,0 5,4 0,8 49,9 7,2 90,0 21,2 3,3

3.2 Plantio das mudas

O transplante das 140 mudas do tipo haste única de laranjeira Pêra [Citrus sinensis

(L.) Osbeck] sobre porta-enxerto limoeiro Cravo [Citrus limonia (L.) Osbeck] com 12 meses

de idade para seus recipientes definitivos foi feito no início do mês de dezembro de 2011.

Antes de serem transplantadas, as mudas tiveram os primeiros 5,0 cm da porção

inferior das raízes cortados para estimular a produção de novas raízes (Figura 1) e em seguida

foram colocadas rapidamente em uma solução de 0,6 g L-1 de Cu(OH)2 para diminuir a

possibilidade de contaminação por fungos de raízes. Em sequência foram dispostas em casa

de vegetação onde o experimento foi conduzido (Figura 2).

13

Figura 1 - Transplante das mudas e substituição do substrato.

Figura 2 - Disposição geral do experimento na casa de vegetação.

Adubações de manutenção com macronutrientes foram feitas até o início dos

tratamentos definidos para o experimento, entre os meses de novembro de 2011 e março de

2012, com a aplicação de 500 mL de solução por planta, totalizando 10 aplicações por

período. A composição das soluções nutritivas utilizadas foi: 0,5 g L-1 de nitrato de cálcio

[Ca(NO3)2], 0,6 g L-1 de nitrato de magnésio [Mg(NO3)2] e 0,1 g L-1 de fosfato monopotássico

(KH2PO4).

14

3.3 Inoculação das plantas e acompanhamento dos sintomas

Vinte dias após o transplante as mudas foram separadas em dois lotes, dos quais um

foi inoculado com ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ (Las) por meio da enxertia de dois

“borbulhões” (gemas laterais com mais tecido lenhoso e aproximadamente 4 cm de

comprimento), em lados opostos da haste (Figura 3). O inóculo foi proveniente de plantas

fonte da bactéria com sintomas típicos da doença, mantidas em casa de vegetação no CCSM.

O mesmo procedimento de enxertia foi realizado para o segundo lote, mas neste caso as

plantas foram enxertadas com segmentos de plantas microenxertadas e sadias para HLB e

outros patógenos. As plantas do primeiro lote foram identificadas como “infectadas” e as do

segundo lote como “sadias”.

O sucesso da infecção nas plantas foi confirmado através da técnica de PCR (do

inglês: Polymerase Chain Reaction), cujo procedimento é descrito no item 3.9. A ocorrência

de sintomas foliares foi acompanhada em intervalos de 30 dias.

Figura 3 - Envelopamento da borbulha recém-enxertada (A) e cicatriz confirmando o sucesso

da enxertia (B).

3.4 Aplicação dos tratamentos

Os tratamentos iniciaram quando as folhas do segundo fluxo vegetativo se

encontravam maduras e totalmente expandidas, o que ocorreu cerca de 90 dias após a

inoculação (DAI) das plantas. As plantas dos dois lotes (infectadas e sadias) foram

15

discriminadas e divididas da seguinte forma: no lote de plantas infectadas, as 20 plantas do

tratamento 0 (TR0 SM+), não receberam os micronutrientes Cu, Mn e Zn; no tratamento TR1

(Zn+) 20 plantas receberam sulfato de zinco (ZnSO4.H2O) via foliar (750 mg L-1 de Zn) e via

substrato (200 mg de Zn por planta); TR2 (Mn+) 20 plantas receberam sulfato de manganês

(MnSO4.H2O) via foliar (500 mg L-1 de Mn) e via substrato (140 mg de Mn por planta); TR3

(Cu+) 20 plantas receberam hidróxido de cobre (Kocide® WDG BIOACTIVE, Du Pont) via

foliar (800 mg L-1 de Cu) e via substrato (230 mg de Cu por planta); TR4 (CPLT+) 20 plantas

receberam uma solução contendo as 3 fontes nas mesmas concentrações descritas para os

tratamentos individuais. No lote de plantas “sadias”, no tratamento TR5 (SM-) 20 plantas não

receberam doses de Cu, Mn e Zn e no TR6 (CPLT-) 20 plantas receberam uma solução

contendo os três nutrientes nas mesmas concentrações das aplicações feitas no lote de plantas

“infectadas”, via foliar e via substrato. Os tratamentos foram aplicados em intervalos de 30

dias.

A partir do início dos tratamentos, as plantas passaram a receber também soluções de

macro e micronutrientes (exceto Zn, Mn e Cu) em intervalos mensais nas seguintes fontes e

doses: 1,5 g de nitrato de amônio (NH4NO3) por planta, 2,7 g de nitrato de cálcio [Ca(NO3)2]

por planta, 3,8 g de nitrato de magnésio [Mg(NO3)2] por planta, 4,0 g de fosfato

monopotássico (KH2PO4) por planta. A aplicação das diferentes fontes de nitrogênio citadas

foi alternada e as fontes utilizadas foram fertilizantes comerciais de alta pureza. As plantas

também receberam semanalmente 200 mL de uma solução contento 33,3 mg L-1 de sulfato de

magnésio (MgSO4), 0,3 mg L-1 de ácido bórico (H3BO3) e 0,13 mg L-1 de molibdato de sódio

(Na2MoO4).

3.5 Determinação de massa de matéria seca de parte aérea e de raiz, área foliar, peso

específico e análise química foliar

As plantas foram coletadas de forma destrutiva aos 90, 180 e 270 dias após o início

dos tratamentos (DAT), o que correspondeu a 180, 270 e 360 dias após a inoculação (DAI), e

divididas em folhas, ramos e sistema radicular. Três plantas de cada tratamento foram

amostradas para análises em cada período de tempo.

Cada uma das partes divididas foi seca em estufa de circulação forçada de ar a 65 ºC,

até que a massa se estabilizasse para a quantificação da massa de matéria seca. A área foliar

de 30 folhas foi medida aos 360 DAI em Integrador de Área mod. 3100 (Li-Cor. Biosciensis,

16

Lincoln, Nebraska EUA). De posse dos dados de massa de matéria seca e da área foliar, foi

estimado o peso específico de folhas (g m-2).

Para a quantificação dos teores de nutrientes nas folhas, nos três períodos de coleta, a

3ª, 4ª, 5ª e 6ª folhas foram amostradas a partir da ponta do ramo.

Procedeu-se com a lavagem das folhas em água destilada e separação do material em

sacos de papel identificados com os tratamentos e colocados para secar conforme

procedimento descrito anteriormente. Em seguida o material foi pesado, moído e colocado em

frascos fechados e protegidos do tempo até o envio ao laboratório.

Os teores de nutrientes minerais do material proveniente das folhas jovens foram

avaliados conforme descrito por BATAGLIA et al. (1983). Os resultados obtidos nos três

períodos de avaliação foram agrupados para estimativa de uma média geral que foi submetida

à análise estatística.

3.6 Análise do extrato de seiva

Para a extração da solução extraída dos ramos provenientes da última brotação, aqui

chamada de “extrato de seiva”, foi utilizado o método de extração por éter com uma etapa de

congelamento da amostra. O extrato de seiva foi analisado seguindo método descrito por

CADAHÍA & LUCENA (2005) e adaptada por SOUZA et al. (2012).

Depois de retirados das plantas no período da manhã e com as folhas destacadas, os

ramos do último fluxo de brotação foram limpos com gaze umedecida com água destilada,

cortados em pedaços de cerca de 2,0 cm e colocados em potes de plástico com tampa, para

então se seguir com a adição do éter ao pote até que os ramos estivessem totalmente cobertos.

Feito isso as amostras foram acondicionadas em congelador à temperatura de 15 ºC.

Aos 15 dias após o acondicionamento, procedeu-se com a extração do extrato de seiva.

Os ramos com o éter foram colocados em um funil plástico sobre um funil de separação, que

fez a separação física do éter e do extrato de seiva (Figura 4).

A determinação dos nutrientes presentes no extrato de seiva (P, Ca, Mg, S, B, Cu, Fe,

Mn e Zn) foi feita em espectrômetro de plasma de argônio, com o extrato de seiva diluído 10

vezes em água deionizada (9:1). O nitrogênio total foi obtido pelo método de Kjeldahl e as

formas NH4+ e NO3

- foram determinadas por destilação a vapor conforme CANTARELLA &

TRIVELIN (2001).

17

Figura 4 - Separação física do extrato de seiva e éter no funil de separação.

3.7 Teor de Clorofila

Aos 180, 270 e 360 DAI, antes das amostragens destrutivas das plantas testadas, a 3ª e

a 4ª folhas a partir da ponta do ramo de cada uma das três plantas foram selecionadas por

tratamento e coletadas para determinação do teor de clorofila.

Estas folhas foram então colocadas em isopor com gelo e levadas ao laboratório para

análise de clorofila de acordo com o método destrutivo utilizado por BARNES et al. (1992).

Acrescentou-se a 50 mg de material fresco retirados das folhas coletadas e colocados em um

tubo de vidro, 7,0 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Em seguida esses tubos foram colocados

em banho-maria a 65 ºC até que ocorresse a despigmentação total do tecido vegetal. O extrato

resultante desse processo foi então lido em espectrofotômetro Femto mod. 600 plus (Femto

Ind. Com. Instrumentos, São Paulo, Brasil) nos comprimentos de onda de 648 nm e 665 nm.

Para a determinação dos teores de clorofila a (Ca), clorofila b (Cb) e clorofila total

(Ctotal), foram utilizadas as equações 1, 2 e 3, e os resultados foram expressos em mg de

clorofila por massa de matéria fresca de folha.

Ca = (14,85*A665) – (5,14*A648) Equação 1

Cb = (25,48*A665) – (7,36*A648) Equação 2

Ctotal = (7,49*A665) – (20,34*A648) Equação 3

18

3.8 Medida indireta de clorofila pelo uso do SPAD-502

Diferente dos métodos tradicionais de medição dos teores de clorofila que são

destrutivos e demorados, a medida indireta de clorofila pelo aparelho portátil SPAD-502

(Konica Minolta Holding Inc., Tokyo, Japão) é feita de forma rápida e não destrutiva. O

aparelho é utilizado para a obtenção de valores indiretos de clorofila através da medição da

intensidade da coloração verde nas folhas (quantidade de luz absorvida pela clorofila)

obtendo-se valores indiretos de clorofila.

As medições foram feitas nas mesmas folhas utilizadas para as medições de clorofila

pelo método destrutivo (item 3.7), com as folhas ainda nas plantas, e os resultados

comparados com os obtidos pela análise do teor de clorofila e o teor de nitrogênio da análise

química foliar

3.9 Determinação e quantificação de Las nas plantas

A confirmação da infecção das plantas por Las foi realizada por PCR convencional em

amostras de folhas coletadas aos 60 DAI, período no qual a enxertia apresentava 100% de

pegamento. Foram coletadas duas folhas por planta, mantendo os pecíolos. O limbo foliar foi

retirado em laboratório, sendo o pecíolo e parte da nervura central fatiados e submetidos à

extração de DNA.

Para a extração de DNA, 600 mg de massa fresca foram acondicionados em dois

eppendorfs de 2,0 mL contendo duas esferas de aço de 5 mm. Estes tecidos foram macerados

por meio de agitação dos tubos no sistema Tissuelyzer (Quiagen) a 30 Hz por 2 min. O DNA

total foi extraído de acordo com o método CTAB de MURRAY & THOMPSON (1980), e

eluído em 100 µL de solução tampão (0,1 vol de Tris-EDTA, 20 µg µL-1 de RNA). A

concentração do DNA obtido foi verificada por meio de espectrofotômetro na razão OD

260/280 através do sistema Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington – NC, EUA). Todo

DNA foi padronizado para a concentração de cerca de 100 ng µL-1. A PCR foi conduzida

utilizando os primers A2/J5 descritos por HACQUELLET et al. (1999), e os resultados

revelados em gel de agarose.

As quantificações do título (concentração) da bactéria nas plantas foram realizadas

junto aos três períodos de avaliação (180, 270 e 360 DAI), antes das amostragens destrutivas.

Para tal, foi utilizada a PCR quantitativa em tempo real (qPCR) baseada no sistema TaqMan

com uma forma indireta de medida da concentração de Las. A coleta das folhas, bem como o

19

procedimento de preparo do DNA destas em laboratório foram os mesmos assumidos para as

análises de PCR convencional, descritas anteriormente.

O sistema TaqMan da qPCR baseia-se na clivagem de uma sonda hibridizada ao DNA

alvo da bactéria durante a fase de extensão do PCR. Essa sonda é marcada com dois corantes,

um que emite fluorescência (reporter) e outro que capta (quencher) a fluorescência (energia)

liberada. Quando ocorre o anelamento dos primers/sondas ao DNA alvo (Las) e extensão do

mesmo acontece a clivagem da sonda pela enzima polimerase e a liberação da energia

armazenada. É essa energia que é captada por uma câmera CCD (do inglês: charge coupled

device) no aparelho que a quantifica (COLETTA-FILHO et al., 2010).

As reações foram corridas no sistema ABI 7500 fast usando o default do aparelho para

as condições de ciclagem, num total de 40 ciclos. Todas as reações foram conduziadas num

volume de 13,5 µL contendo 6,75 µL do tampão master mix Maxima Probe/Rox (Fermentas),

0,8 µmol L-1 de cada um dos primers, 0,2 µmol L-1 da probe (IDT Integrated DNA

technology) e 300 ng do DNA total. As sequências dos primers e probe foram baseadas no

gene “fator de elongação Ts” de Las (HONG et al., 2010) gerando um amplicon de 170 pares

de base (pb). Todas as reações utilizaram primers de controle interno (18S rRNA ou genes

GAPDH) para a quantidade normalizada do total de DNA e para verificar inibidores

enzimáticos da reação PCR. Os resultados obtidos foram expressos em número de ciclos da

PCR onde a emissão do reporter atinge um valor acima do qual as amostras são consideradas

positivas (threshold). Partiu-se do pressuposto de que somente valores de Ct<36 foram Las

positivos, sendo que o valor de Ct é inversamente proporcional à concentração de Las na

amostra.

3.10 Delineamento experimental

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado (DIC) seguido

de teste de comparação de médias pelo teste de Duncan (5%) e contrastes ortogonais.

Correlações entre médias dos teores dos nutrientes nas folhas e no extrato de seiva foram

analisadas através da matriz de correlação de Pearson.

Os dados coletados foram analisados no módulo GLM do SAS (Statistical Analysis

System).

20

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Manifestação dos sintomas de HLB

As plantas infectadas que receberam os diferentes tratamentos nutricionais e o

tratamento controle não apresentaram diferenças visuais para os sintomas de encortiçamento

das nervuras (vein corking) e nervuras amareladas (yellow veins) (Figura 5) que apareceram

no decorrer do experimento e, até o último período de coleta aos 360 DAI, sintomas mais

severos como mosqueado amarelo assimétrico não haviam sido manifestados.

O intervalo de tempo entre a infecção e o aparecimento dos sintomas pode variar de 6

a 12 meses ou mais (BOVÉ, 2006). Esse período de incubação varia em função de vários

fatores, como o ambiente, a idade e a espécie da planta, a concentração da bactéria no

momento da transmissão e mesmo a espécie ‘Candidatus Liberibacter’ infectante

(BELASQUE Jr. et al., 2009), o que explicaria a diferença ocorrida no presente experimento e

outros reportados na literatura (BOVÉ, 2006; SPANN & SCHUMANN, 2009; COLETTA-

FILHO et al., 2010; FOLIMONOVA & ACHOR, 2010).

Em condições de campo, esse período de incubação pode também se estender além de

dois anos, conforme reportado por JOHNSON et al. (2012) para plantas que receberam o

programa de manejo nutricional diferenciado e aquelas que receberam o tratamento

nutricional padrão, cuja manifestação e severidade dos sintomas visuais entre as plantas não

foram marcantes. Destaca-se que em nível celular não existem evidências de que o tratamento

nutricional diferenciado reduza o bloqueio das células dos tubos crivados, responsável pela

manifestação dos sintomas da parte aérea.

21

Figura 5 – Sintomas de amarelecimento e vein corking nas folhas de laranjeira Pêra infectada

por HLB manifestados durante o período do experimento até 360 dias após inoculação (DAI):

tratamento sem micronutrientes + (A), Cu + (B), Zn + (C), Mn + (D), CPLT + (E) e folha

sadia (F).

4.2 Produção de massa de matéria seca e área foliar

Tanto aos 180 DAI quanto no final do experimento aos 360 DAI, as plantas nos

tratamentos sadios TR5: SM- e TR6: CPLT- apresentaram maiores produções de massa de

matéria seca total [parte aérea (folhas+ramos) + raiz] (~161 e 299 g planta-1 respectivamente)

22

(Figura 6), resultado esse obtido em boa parte devido ao maior volume de sistema radicular

comparado aos tratamentos infectados (Figura 7).

No segundo período de avaliação (180 DAI) os valores entre os tratamentos sadios e

infectados não apresentaram diferença (Figura 6). Isso pode ser atribuído principalmente à

coleta das amostras nesse período, que ocorreu no mês de outubro, que sucede os meses de

menores temperaturas para a região em que o experimento foi conduzido. Sabe-se que para os

citros, durante os meses de menor temperatura e/ou déficit hídrico, as plantas apresentam o

chamado repouso vegetativo, estágio fenológico no qual ocorre redução e até mesmo cessão

no crescimento da planta (SENTELHAS, 2005).

Figura 6 – Massa de matéria seca total de laranjeira Pêra nos três períodos de coleta (180, 270 e 360

DAI). Legenda: SM (sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu

(aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio). Médias

seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05).

A massa de matéria seca das raízes foi menor pra as plantas infectadas por Las tanto

aos 180 DAI (33-69 g planta-1) quanto aos 360 DAI (52-91 g planta-1) comparadas àquelas

sadias nos mesmos períodos (180 DAI: 64-94 g planta-1 e 360 DAI: 107-144 g planta-1)

(Figura 7). Aos 270 DAI essas diferenças entre plantas sadias (42-90 g planta-1) e infectadas

(60-83 g planta-1) foram menos evidenciadas (Figura 7). Pesquisas recentes demonstram que a

bc bcc

ab bca a

a a a a aa

a

b b bb

ba a

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

350,0

SM+ Zn+ Mn+ Cu+ CPLT+ SM- CPLT-

Mas

sa d

e m

atér

ia se

ca to

tal

(g p

lant

a-1)

180 DAI 270 DAI 360 DAI

23

bactéria é frequentemente detectada nos tecidos das raízes anteriormente às folhas, além de

ser mais uniformemente distribuída no sistema radicular (JOHNSON et al., 2012). Essa

presença inicial da bactéria no sistema radicular é responsável pelo rápido declínio no

crescimento e na densidade das raízes das plantas doentes (GRAHAM, 2012), e

consequentemente, pela maior suscetibilidade apresentada por essas plantas no campo aos

estresses como frio e déficit hídrico. Plantas HLB positivas assintomáticas e sintomáticas

apresentam redução do crescimento do sistema radicular em condições de campo de 30% e

37% respectivamente, quando comparadas a plantas HLB negativas (GRAHAM et al., 2013).

Essa redução em plantas de três e quatro anos no campo foi também observada nas condições

do experimento aqui discutido, cujos valores médios da massa de matéria seca do sistema

radicular das plantas HLB positivo foram em média 45% menores quando comparados aos

tratamentos sadios, o que corrobora a ideia de que quando a planta manifesta os sintomas

típicos da doença na parte aérea, já se somam prejuízos ao sistema radicular. Esse dano ao

sistema radicular observado em plantas jovens pode explicar o insucesso do replantio em

pomares de citros com altos índices de infecção por Las (IREY, 2011; STANSLY &

KOSTYK, 2013).

Figura 7 - Massa de matéria seca de raízes de laranjeira pêra nos três períodos de coleta (180, 270 e

360 DAI). Legenda: SM (Sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês),

Cu (aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio). Médias

seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05).

bc bcc

b bc

a aaabc

bc bc c

ab abbc bc b

bcc

aa

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0


Mas

sa d

e m

atér

ia se

ca d

e ra

iz(g

pla

nta-1

)

180 DAI 270 DAI 360 DAI

24

Por outro lado, o crescimento das plantas de laranjeira Pêra avaliado entre os 180-360

DAI demonstrou que no período inicial do estudo, as plantas sadias mantinham maior massa

de matéria seca total acumulada nas folhas (~34 g planta-1) comparado aos tratamentos

infectados por HLB (~27 g planta-1) (Figura 8). Ao longo do tempo, essa diferença diminuiu e

se observou que a maior massa de matéria seca das folhas ocorreu nos tratamentos infectados

que receberam ou não as aplicações de Cu, Mn e Zn (82-102 g planta-1; TR0: SM+ e TR4:

CPLT+) (Figura 8). Apesar da área foliar específica de folha não ter diferido entre os

tratamentos nutricionais nem entre os tratamentos de sanidade (3x10-3 m2 folha-1) (Figura 9),

o peso específico de folha foi maior no tratamento TR4: CPLT+ (122 g m2) e no grupo

intermediário de plantas representado pelos TR0-3 (87-105 g m2) quando comparado aos dois

tratamentos sadios (TR5 e TR6: 83 g m2 e 81 g m2) (Figura 10). O maior peso seco por

unidade de área encontrado em folhas está ligado ao acúmulo de amido (CAO & TIBBITTS,

1997) e, em plantas infectadas por Las esse acúmulo se dá em resposta à doença

(GONZALES et al., 2012). A quantidade de amido em folhas de plantas infectadas quando

comparadas àquelas de plantas sadias chega a ser 20 vezes maior e pode representar até 50% a

mais na massa de matéria seca da folha dessas plantas (ETXEBERRIA et al., 2009; SPANN

& SCHUMANN, 2009).

Figura 8 - Massa de matéria seca de folhas de laranjeira Pêra nos três períodos de coleta (180, 270 e 360 DAI). Legenda: SM (sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio). Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05).

bcab

cab

bcab a

abb

aba a a

ab

ab

b bb

a

bb

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0


Mas

sa d

e m

atér

ia se

ca d

e fo

lhas

(g

pla

nta-1

)

180 DAI 270 DAI 360 DAI

25

Figura 9 – Área foliar específica estimada da laranjeira Pêra aos 360 DAI. Legenda: SM (sem

micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre),

CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio). Médias seguidas pela mesma

letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05).

Figura 10 – Peso foliar específico estimado da laranjeira Pêra aos 360 DAI. Legenda: SM (sem

micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre),

CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio). Médias seguidas pela mesma

letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05).

aa a a a a a

05

10152025303540


Áre

a fo

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a(c

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0

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120

140


Peso

folia

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fico

(g m

-2)

26

4.3 Análise química do teor total de nutrientes nas folhas

Os teores foliares de N, Mg e S diferiram entre os tratamentos infectados por HLB (+)

e sadio (-), conforme contrastes C1, C2, C4 e C5 (Tabela 3). Assim, as plantas sadias

apresentaram N>30 mg kg-1 e aquelas infectadas N<28 mg kg-1. De forma similar, as sadias

apresentaram Mg>2,2 mg kg-1 e S>2,7 mg kg-1. Destaca-se que aquelas infectadas e que

receberam a aplicação de Zn, o teor de Mg foliar (=2,4 mg kg-1) não diferiu dos tratamentos

sadios.

Essas desordens nutricionais são decorrentes de prejuízos que a doença causa ao

transporte de fotoassimilados na planta afetada pelo HLB e consequentemente de elementos

minerais das raízes para as folhas, e embora os sintomas da doença apresentem alguma

característica em comum com certas deficiências minerais como o aparecimento de clorose no

limbo foliar (Zn e Mn), que fundamentam pesquisas sobre o tratamento nutricional

diferenciado dos pomares com HLB (SPANN & SCHUMANN, 2009), verificou-se que o

suprimento dos micronutrientes não permitiu que as plantas infectadas apresentassem estado

nutricional equivalente àquelas sadias.

No caso dos tratamentos que supriram as plantas com Zn e Mn (TR1: Zn+ e TR2:

Mn+), é possível que o aumento das concentrações celulares desses micronutrientes tenha

favorecido a atividade de enzimas do sistema antioxidativo (ex: SOD) e consequentemente

reduzido danos aos cloroplastos, o que estaria associado aos maiores teores de Mg na planta.

O Mg é um elemento estrutural da molécula da clorofila, cuja localização ocorre

principalmente nos cloroplastos (MARSCHNER, 1995). Também esse elemento mineral atua

sobre a inativação de espécies reativas de oxigênio (O2- e H2O2) nos cloroplastos (CAKMAK

& MARSCHNER, 1992) e pelo carregamento e exportação de sacarose das folhas para o

floema (CAKMAK & KIRKBY, 2008), o que poderia favorecer a manutenção e/ou

crescimento das plantas afetadas pelo HLB. Nota-se, contudo, que esse efeito não afetou

positivamente as plantas do presente experimento (Item 4.2).

É possível que decorrido o período de 360 DAI das plantas com Las, as folhas das

plantas infectadas tenham apresentado acúmulo significativo de amido (ETXEBERRIA et al.,

2009), o que pode levar a variações na massa das folhas suficiente para interferir na

interpretação dos teores foliares de nutrientes expressos com base em massa (SPANN &

SCHUMANN, 2009). Com base nessa fundamentação, variações nos resultados das análises

de folhas para Zn e S, para amostras de plantas sadias, assintomáticas e sintomáticas para

HLB coletadas em diferentes pomares de citros na Flórida (EUA), não diferiram quando os

27

resultados de concentrações foram expressos com base na área foliar (g cm-2) (SPANN &

SCHUMANN, 2009).

Para Ca, K e P, não se verificaram diferenças entre os contrastes estudados, cujos

teores médios foram 16,7 mg kg-1, 31,5 mg kg-1 e 1,5 mg kg-1 respectivamente. Ao contrário,

dados moleculares, fisiológicos e de campo publicados recentemente por ZHAO et al. (2013)

suportariam que a deficiência de P nas plantas de citros é ligada a sintomatologia da doença

HLB. Contudo, os referidos autores não caracterizaram ao certo a idade fisiológica e a

severidade do sintoma da doença nas folhas amostradas nos diferentes estudos de laboratório

e nos trabalhos de campo que justificassem a conclusão do estudo. Também, discute-se no

trabalho que o suprimento de P na forma de fosfito (P-PO3-), embora pudesse alterar o teor

total de P na folha, não deveria corrigir sintomas severos da deficiência do elemento, uma vez

que o PO3- aplicado às folhas não é oxidado à PO4

- e desta forma não atende a demanda do

nutriente pela planta (ZAMBROSI et al., 2011).

É importante destacar que os teores dos macronutrientes nas folhas das plantas sadias

são comparáveis àqueles observados em mudas de viveiro (BATAGLIA et al., 2008;

MATTOS Jr. et al., 2010), cujos teores de N são maiores que 30 mg kg-1, P = 2,0 mg kg-1, K

de 25 a 30 mg kg-1, Ca = 20 mg kg-1, Mg de 2,0 a 3,0 mg kg-1 e S = 3,0 mg kg-1, o que

demonstra que o manejo de nutrientes estabelecido no presente estudo foi adequado para o

crescimento das plantas.

28

Tabela 3 - Teor foliar de macronutrientes referentes às médias dos tratamentos nos três

períodos de análise.

Tratamento N Ca Mg K P S ------------------------------------ g kg-1 -------------------------------------

0 SM+ 28ab 19a 1,9bc 33a 1,5a 2,1b 1 Zn+ 28ab 16ab 2,4a 31a 1,5a 2,3b 2 Mn+ 27ab 16ab 2,1abc 32a 1,4a 2,3b 3 Cu+ 26b 16ab 1,9bc 30a 1,5a 2,3b

4 CPLT+ 26b 14b 1,8c 29a 1,5a 2,2b 5 SM- 30a 19a 2,4a 33a 1,6a 2,7ab 6 CPLT- 30a 17ab 2,2ab 33a 1,6a 3,1a Contrastes ortogonais

C1 5 6 vs 0 1 2 3 4 ** ns ** ns ns ** C2 5 6 vs 0 4 ** ns ** ns ns ** C3 4 vs 1 2 3 ns ns ** ns ns ns C4 6 vs 4 ** ns ** ns ns ns C5 0 vs 4 ns ns ns ns ns ns Legenda: SM (Sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio); ns, *, **, não significativo e significativo aos níveis de 5% e 1% respectivamente; médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05).

Os teores de micronutrientes nas folhas da laranjeira Pêra diferiram em resposta aos

tratamentos aplicados, contudo quando se comparou as plantas infectadas e sadias, pela

análise de contrastes ortogonais, não se verificou resposta significativa, o que demonstra que

os padrões nutricionais das plantas foram similares dentro de cada condição estudada (Tabela

4). Os teores foliares para plantas nos tratamentos que não receberam aplicações com

micronutrientes foram: Cu < 1,0 mg kg-1, Mn = 20 mg kg-1 e Zn = 9,0 mg kg-1. Os teores de

Fe e B não variaram, tendo sido em média 90 mg kg-1 e 43 mg kg-1, respectivamente. Apesar

dos teores de Fe serem similares aqueles encontrados por PUSTIKA et al. (2008) em plantas

de Siem mandarin (Citrus reticulata Blanco) com cinco anos de idade onde o fornecimento

foliar desse nutriente causou redução da severidade dos sintomas nas plantas, esses teores não

foram suficientes para reduzir da severidade dos sintomas do HLB nas plantas estudadas no

presente trabalho.

Destaca-se que para o TR3: Cu+ o teor de Cu nas plantas foi cerca de duas vezes

maior (~20 mg kg-1) que no TR4: CPLT + (~11 mg kg-1), embora as quantidades do nutriente

supridas para as plantas nesses dois tratamentos tenham sido as mesmas (Tabela 4). A maior

29

atividade de um íon na solução do substrato (ex: Mn e Zn) pode diminuir a atividade do outro

(ex: Cu) e consequentemente causar diminuição da absorção pela planta deste último.

Também é possível ocorrer competição entre esses micronutrientes metálicos pelos sítios de

absorção na membrana celular (BRAR & SEKHON, 1976; BRAR & SEKHON, 1978,

KUMAR et al., 2009). Esses dois processos explicariam a diferença observada.

Teores foliares de Cu como os encontrados no TR3: Cu+ (Tabela 4) e nas raízes de 50

mg kg-1 prejudicaram o crescimento de mudas de citros em estudo de manejo de N e Cu para

a produção em viveiro (MATTOS Jr. et al., 2010). Esse prejuízo provocado pela toxicidade de

Cu causa inibição do crescimento das plantas e afeta processos celulares como o metabolismo

do N, dada a redução do N total da planta associado à redução dos teores de NO3- e

aminoácidos livres nas raízes e folhas (a assimilação de nitrato requer a redutase-NO3-, cuja

atividade é muito baixa em resposta à exposição ao Cu), e cujos eventos afetam

negativamente a fotossíntese e respiração (pela inibição da atividade de grande número de

enzimas e prejuízos à manutenção da integridade de membranas) (FERNANDES &

HENRIQUES, 1991; LLORENS et al., 2000; YRUELA, 2005; XIONG et al., 2006).

Tabela 4 – Teor foliar de micronutrientes referentes às médias dos tratamentos nos três

períodos de análise.

Tratamento Mn Zn Cu Fe B --------------------------------- mg kg-1 ---------------------------------

0 SM+ 19b 10b 1,6c 117a 50a 1 Zn+ 18b 29a 0,9c 91a 43ab 2 Mn+ 57a 9b 0,4c 81a 46a 3 Cu+ 20b 9b 20a 98a 45ab 4 CPLT+ 48a 31a 10b 81a 40ab 5 SM- 22b 10b 0,8c 37a 41ab 6 CPLT- 50a 33a 10b 100a 39b Contrastes ortogonais

C1 5 6 vs 0 1 2 3 4 ns ** ns ns ns C2 5 6 vs 0 4 ns ns ns ns ns C3 4 vs 1 2 3 ** ** ns ns ns C4 6 vs 4 ns ns ns ns ns C5 0 vs 4 ns ns ** ns ns Legenda: SM (Sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio); ns, *, **, não signficativo e significativo aos níveis de 5% e 1% respectivamente; médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05).

30

Os teores de micronutrientes nos tratamentos que receberam as aplicações com estes

foram mais baixos que aqueles reportados como padrões nutricionais adequados para mudas

de citros em viveiros comerciais prontas e antes da poda final de formação (BATAGLIA et

al., 2008). Deve-se ressaltar que nesses cultivos comerciais, o manejo nutricional antes da

finalização da muda é bastante intensivo, o que determina alta reserva dos micronutrientes no

substrato, e que a formação da muda com haste única também favorece a concentração de

nutrientes na biomassa da planta. A importância dessa reserva no substrato para a muda é

mostrada também por HIPPLER (2012), onde o aumento das doses de Zn e Mn no meio de

crescimento para as raízes (máximo 5,0 g planta-1 e 3,5 g planta-1, respectivamente), fez com

que houvesse incremento na massa de matéria seca da planta e dos teores desses nutrientes

nas folhas.

As plantas dos tratamentos nos quais os micronutrientes Cu, Mn e Zn não foram

supridos (TR0: SM+ e TR5: SM-) apresentaram no decorrer do experimento os sintomas

visuais característicos da deficiência destes micronutrientes (Figura 11).

Figura 11 - Sintomas visuais da deficiência de micronutrientes nas folhas de laranjeira Pêra: Cu (A),

Mn (B), Zn (C).

31

No caso do Cu essa deficiência se manifestou na forma de bolsas de goma nas axilas

das folhas e nos ramos novos e que, quando rompidas, mostravam extravasamento de seiva. Já

os sintomas de deficiência de Mn foram caracterizados por folhas jovens de maior tamanho

muitas vezes, com clorose internerval com aspecto de reticulado grosso, enquanto a

deficiência Zn se apresentou na forma de folhas jovens deformadas com limbo foliar estreito,

lanceolado e de tamanho reduzido, que mostraram clorose internerval e contrastaram com

nervuras central e laterais verde-escuras, além da ocorrência de ramos com internódios curtos,

dando à planta aspecto enfezado (MATTOS Jr. et al., 2005).

4.4 Análise química do extrato de seiva e correlações com teores de nutrientes nas folhas

Os teores de N total (Nt) determinados para plantas infectadas por HLB (+) e sadias (-)

diferiram significativamente, sendo cerca de 30% inferiores para aquelas primeiras (Tabela 5).

Essa diferença foi superior àquela observada para os teores de N total na folha (Tabela 3; Item

4.3). Embora as folhas das plantas não mostrassem cloroses típicas da doença foi possível

verificar os prejuízos causados pela doença à absorção e transporte de N no tecido vegetal,

como verificado na análise do extrato de seiva (Tabela 5).

O método avaliado de análise do extrato de seiva (CADAHÍA & LUCENA, 2005,

adaptada por SOUZA, 2012) não define claramente qual fração dos elementos solúveis é

extraída dos ramos coletados. Presume-se que seja uma composição da seiva do floema,

xilema e do vacúolo das células de outros tecidos, uma vez que durante o congelamento

prolongado das amostras com o éter ocorre desintegração da organização desses

compartimentos na planta. O N inorgânico (NH4+ + NO3

-) representou cerca de 20% do N

total determinado no extrato de seiva, cuja fração foi maior que aquela determinada em

extratos de seiva de xilema em laranjeiras adultas no campo (MORENO & GARCIA-

MATINEZ, 1983). Essa diferença pode ser explicada pelo fato de que na casa de vegetação,

os ciclos de adubação foram frequentes e a localização do fertilizante foi concentrada próxima

às raízes no substrato dos vasos.

Embora os citros apresentem alta atividade da redutase do nitrato (BAR-AKIVA &

SAGIV, 1967), a concentração de NO3- (140 a 220 mg L-1) no extrato de seiva determinado

no presente estudo foi maior que aquela de NH4+ (50 a 70 mg L-1) (Tabela 5), corroborando

dados obtidos em plantas adultas em sistema de produção sob fertirrigação (SOUZA et al.,

2012). Isso sugere que nas condições do presente estudo, os prejuízos causados pelo HLB

possivelmente foram associados mais à absorção do nutriente que aos vários processos do

32

metabolismo de assimilação desse nutriente na planta. Essa hipótese é suportada com a

observação de que os teores de NO3- nesses extratos de seiva foram maiores nos tratamentos

que não incluíram Cu (NO3- = 200 mg L-1) e menores com o suprimento desse metal (NO3

- =

140 mg L-1), independentemente da sanidade da planta (Tabela 5). Os teores de Cu no extrato

de seiva são comparados aqueles observados por SOUZA et al. (2012) em laranjeiras adultas

no campo. Apesar das quantidades aplicadas de Cu não terem sido excessivas, é possível

afirmar pelo teor encontrado no extrato de seiva dos tratamentos que receberam o nutriente

(Tabela 6), que para plantas jovens como do presente estudo, concentrações de Cu>1,0 mg L-1

são prejudiciais à planta.

As concentrações de Mg nos extratos de seiva diferiram entre os tratamentos sadios

(~354 mg L-1) e os tratamentos infectados (~270 mg L-1) (Contrastes C1 e C2; Tabela 5) o que

pode ser associado ao prejuízo aos tubos crivados e pela deposição de calose e p-proteínas nos

poros destes tubos em plantas HLB positivo, o que impede o fluxo normal de fotoassimilados

e de solutos como o Mg (FOLIMONOVA & ACHOR, 2010; KOH et al., 2012).

De forma similar à discussão do parágrafo anterior, os teores de S diferiram nos

extratos de seiva em relação aos tratamentos estudados (Tabela 5) e de forma correspondente

àqueles observados para os teores totais de S nas folhas (Tabela 3; Item 4.3). Assumindo que

essa relação é verdadeira, a assertiva de SPANN & SCHUMANN (2009) de que o cálculo das

concentrações foliares dos nutrientes nas plantas com base na área foliar seria mais adequada

para corrigir discrepâncias causadas pelo acúmulo de amido nas folhas das plantas afetadas

pelo HLB pode não ser aplicável em todas as condições de estudos (Item 4.2). Contudo, é

ainda necessário considerar nessa discussão que o S inorgânico (S-SO4-), assim como o N

inorgânico, representa apenas uma pequena fração do nutriente total na planta

(MARSCHNER, 1995). Nesse contexto, destaca-se ainda que exista uma relação direta entre

os teores de N e S nas plantas, devido à ocorrência desses nutrientes em aminoácidos e

proteínas, assim, variações no suprimento de N afetariam a demanda e consequente absorção

de S pelas plantas (HANEKLAUS et al., 2006), o que explicaria os dados obtidos no presente

estudo. Nota-se que o teor de S no extrato de seiva para o TR6: CPLT- (~160 mg L-1) é

comparado àquele observado para os tratamentos mais produtivos no estudo de fertirrigação

de citros desenvolvido por SOUZA et al. (2012). Outras diferenças demonstradas pela análise

de contrastes ortogonais demonstraram que nos tratamentos com a aplicação de Mn e Zn, os

teores de S foram maiores naqueles que não receberam esses micronutrientes (TR0, 1, 2 e 5)

ou apenas receberam Cu (TR3) (Tabela 5), o que seria explicado pela aplicação das fontes de

sulfato fertilizante.

33

Os teores de Ca, K e P nos extratos de seiva não diferiram em resposta aos tratamentos

estudados (Tabela 5). Algumas observações que se aplicam aos valores relativos encontrados,

as quais referem ao fato da concentração de K (~3000 mg L-1) ser bastante superior aos outros

nutrientes (<600 mg L-1), o que é justificado pelo fato deste nutriente não apresentar papel

estrutural no metabolismo e estar mais relacionado à função de ativação de enzimas e

equilíbrio eletrônico nas plantas, aparecendo, então como um elemento livre nos vários

compartimentos celulares (MARSCHNER, 1995). Outra observação, que os dados não

suportam as conclusões do estudo de ZHAO et al. (2013) que a deficiência de P está ligada

aos sintomas do HLB na planta. Notas-se que no presente estudo, embora as plantas

mostrassem alto nível de infecção por Las (Item 4.6), não se verificou sintomas visuais

severos da manifestação da doença nas plantas infectadas (Item 4.1). Acrescenta-se ainda à

discussão, que o P é altamente remobilizado na planta e redistribuído para diferentes partes

quando esta é deficiente em P (ZAMBROSI et al., 2011). Assim, se a deficiência de P fosse

claramente associada aos sintomas do HLB, variações entre os teores no extrato de seiva no

presente estudo deveriam ser díspares já na condição em que os sintomas de senescência

folhas das plantas afetadas pela doença ainda não eram severos.

Tabela 5 - Teores de macronutrientes presentes no extrato de seiva de ramos de último fluxo

vegetativo referentes às médias dos tratamentos nos três períodos de análise.

Tratamento Nt NH4+ NO3

- Ca Mg K P S ----------------------------------------- mg.L-1 ----------------------------------------

0 SM+ 1400ab 70a 204abc 452a 224b 2768abc 354ab 71de 1 Zn+ 1100ab 72a 214ab 423a 234b 2561bc 321b 87cde 2 Mn+ 1700a 60a 223a 568a 285ab 3151a 423a 99bcd 3 Cu+ 700b 58a 141c 452a 288ab 2416c 353ab 57e 4 CPLT+ 1100ab 55a 140c 620a 327ab 2826abc 411a 132ab 5 SM- 1700a 60a 204abc 613a 380a 2873ab 371ab 117bc 6 CPLT- 1800a 53a 148bc 589a 328ab 2898ab 366ab 162a Contrastes ortogonais

C1 5 6 vs 0 1 2 3 4 * ns ns ns * ns ns ** C2 5 6 vs 0 4 ns ns ns ns ** ns ns ** C3 4 vs 1 2 3 ns ns ns ns ns ns ns ** C4 6 vs 4 * ns ns ns ns * ns ** C5 0 vs 4 ns ns * ns ns ns ns ns Legenda: SM (Sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio); ns, *, **, não signficativo e significativo aos níveis de 5% e 1% respectivamente; médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05).

34

No que diz respeito aos micronutrientes (Cu, Mn e Zn), a análise do extrato de seiva se

mostrou sensível aos tratamentos nutricionais aplicados (Tabela 6). Destaca-se que os

coeficientes de correlação para teores totais nas folhas e nos extratos de seiva foram r2 (Zn) =

0,99 (Prob. r <0,0001), r2 (Mn) = 0,96 (Prob. r = 0,0008) e r2 (Cu) = 0,73 (Prob. r = 0,073)

(Tabela 7).

As concentrações nos extratos de seiva não diferiram entre os tratamentos infectados

por HLB (+) e aqueles sadios (-) para plantas que receberam ou não as aplicações via foliar e

via substrato, conforme contrastes C1, C2, C4 e C5 (Tabela 6). O suprimento de Zn, Mn e Cu

causou aumento nas concentrações determinadas no extrato de seiva até de sete vezes (Zn = 7

mg L-1, Mn = 3 mg L-1 e Cu = 2 mg L-1) comparadas quando não houve a aplicação dos

nutrientes (Zn = 1,5 mg L-1, Mn = 0,4 mg L-1 e Cu = 0,4 mg L-1). Ainda, essas concentrações

dos tratamentos com Zn, Mn e Cu, como Fe e B, com exceção deste último (cuja

concentração foi dez vezes menor; B ~0,5 mg L-1), são da mesma ordem de magnitude dos

dados reportados no estudo de campo apresentados por SOUZA et al. (2012).

Voltando aos resultados da análise de correlação, os dados obtidos suportam a

discussão sobre os prejuízos do efeito do Cu na planta sobre o metabolismo de N (Tabela 7),

visto que os coeficientes para teores nos extrato de seiva para Cu e NH4+ (r2 = -0,76) e NO3

-

(r2 = -0,93) foram significativos (Prob. r <0,05). Da mesma forma, observou-se correlação

entre o teor total de Cu na folha e a concentração de NO3- no extrato de seiva (r2 = -0,91;

Prob. r < 0,01).

35

Tabela 6 - Teores de micronutrientes presentes no extrato de seiva de ramos de último fluxo

vegetativo referentes às médias dos tratamentos nos três períodos de análise.

Tratamento Mn Zn Cu Fe B -------------------------------- mg L-1 ------------------------------

0 SM+ 0,7b 1,8b 0,8c 0,7abc 0,7abc 1 Zn+ 0,3b 7,2a 0,1d 0,8ab 0,8ab 2 Mn+ 2,9a 1,5b 0,1d 0,5c 0,5c 3 Cu+ 0,2b 1,3b 1,6b 0,4c 0,4c 4 CPLT+ 2,9a 6,7a 2,7a 0,5bc 0,5bc 5 SM- 0,6b 1,5b 0,5cd 0,8ab 0,8ab 6 CPLT- 3,7a 6,9a 2,7a 0,5abc 0,5abc Contrastes ortogonais

C1 5 6 vs 0 1 2 3 4 ** ** ns ns ns C2 5 6 vs 0 4 ns ** ns ns ns C3 4 vs 1 2 3 ** ns * ns ns C4 6 vs 4 ns ns ns ns ns C5 0 vs 4 ** ** ** ns * Legenda: SM (Sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio); ns, *, **, não signficativo e significativo aos níveis de 5% e 1% respectivamente; médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05).

36

Tabela 7 - Matriz de correlação de Pearson (r2) para teores de nutrientes solúveis determinados no extrato de seiva e totais na folha da laranjeira Pêra afetadas por HLB plantas e sadias. Médios de dados de análises químicas aos 180, 270 e 360 dias após inoculação (DAI). Ntseiva NH4

+seiva NO3

-seiva P seiva Cu seiva Mn seiva Zn seiva Nfolha Pfolha Cufolha Mnfolha Znfolha

Ntseiva 1,00 Prob. <r - NH4

+seiva -0,19 1,00

Prob. <r 0,6833 - NO3

-seiva 0,40 0,72 1,00

Prob. <r 0,3751 0,0678 - Pseiva 0,35 -0,59 -0,08 1,00

Prob. <r 0,4479 0,1663 0,8678 - Cuseiva -0,12 -0,76 -0,93 0,20 1,00

Prob. <r 0,7962 0,0493 0,0023 0,6602 - Mnseiva 0,53 -0,69 -0,30 0,68 0,55 1,00

Prob. <r 0,2245 0,0894 0,5062 0,0897 0,1976 - Znseiva -0,04 -0,11 -0,32 -0,18 0,47 0,41 1,00

Prob. <r 0,9361 0,8219 0,4881 0,7015 0,2920 0,3674 - Nfolha 0,73 <0,01 0,27 -0,31 -0,13 0,05 0,07 1,00

Prob. <r 0,0615 0,9949 0,5539 0,5001 0,7833 0,9149 0,8876 - Pfolha 0,26 -0,29 -0,35 -0,39 0,40 -0,03 0,25 0,72 1,00

Prob. <r 0,5698 0,5319 0,4447 0,3864 0,3722 0,9409 0,5814 0,0658 - Cufolha -0,60 -0,58 -0,91 -0,03 0,71 0,06 0,07 -0,41 0,14 1,00

Prob. <r 0,1527 0,1698 0,0045 0,9476 0,073 0,8913 0,8873 0,3566 0,7665 - Mnfolha 0,47 -0,66 -0,19 0,82 0,39 0,96 0,24 -0,10 -0,26 0,03 1,00

Prob. <r 0,2818 0,1054 0,6801 0,0235 0,3865 0,0008 0,6033 0,8353 0,5780 0,9478 - Znfolha -0,01 -0,24 -0,43 -0,12 0,58 0,48 0,99 0,09 0,32 0,16 0,30 1,00

Prob. <r 0,9907 0,6095 0,3401 0,7925 0,1707 0,2748 <0,0001 0,8500 0,4771 0,7392 0,5108 -

36

37

4.5 Teor de clorofila

Os tratamentos nutricionais não tiveram resposta no teor de clorofila total e nas

determinações indiretas de clorofila pelas leituras SPAD (Tabela 8). Até o terceiro período de

análise (360 DAI), as plantas ainda não apresentavam sintomas foliares de mosqueado

amarelo, atribuídos principalmente ao rompimento da membrana dos tilacóides (componentes

dos cloroplastos) pela pressão do acúmulo de amido nas folhas causado pela doença (ACHOR

et al., 2010). Esse rompimento afeta diretamente a fotossíntese e os teores de clorofila da

folha, já que os tilacóides são componentes dos cloroplastos e possuem incorporados em sua

membrana proteínas e pigmentos que participam da fotossíntese (TAIZ & ZEIGER, 2004).

Tabela 8 - Resultados da análise clorofila total e leitura SPAD referentes às médias dos

tratamentos.

Tratamento Clorofila Total SPAD mg g-1 massa fresca

0 SM + 2,4a 63,0a 1 Zn + 2,4a 64,9a 2 Mn + 2,0a 64,5a 3 Cu + 2,3a 65,7a 4 CPLT + 2,2a 64,8a 5 SM - 2,5a 66,9a 6 CPLT - 2,5a 65,8a Contrastes ortogonais

C1 5 6 vs 0 1 2 3 4 ns ns C2 5 6 vs 0 4 ns ns C3 4 vs 1 2 3 ns ns C4 6 vs 4 ns ns C5 0 vs 4 ns ns Legenda: SM (Sem micronutrientes), Zn (aplicação de zinco), Mn (aplicação de manganês), Cu (aplicação de cobre), CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), - (sadio); ns, não signficativo; médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05).

4.6 Quantificação de Las em função dos tratamentos

Nos três períodos de avaliação do experimento não houve efeito dos tratamentos

nutricionais na população de Las nas plantas quando comparados ao tratamento controle (TR0

38

SM+) (Tabela 9). As variações iniciais (180 DAI) nos resultados das análises de Ct foram

provavelmente consequência de uma infecção mais tardia da bactéria nas plantas analisadas

ou mesmo devido à distribuição desuniforme da bactéria na planta e a baixa densidade

populacional no tecido analisado (TATINENI et al., 2008). Diferenças na transmissão de

Liberibacter por borbulhas são observadas ao longo do tempo, e algumas plantas são

precocemente diagnosticadas positivas enquanto outras demandam maior tempo para a

infecção. Isso é bem exemplificado na análise subsequente (270 DAI) quando as plantas

analisadas apresentaram concentrações de Las muito próximas. Embora o tratamento que

recebeu as aplicações de Zn (TR1) tenha hospedado um menor título de Las (Ct =28,2), este

não foi estatisticamente diferente dos demais. GOTTWALD et al. (2012), em experimento

com tratamentos nutricionais a base de fosfito de K, onde variou os componentes aplicados

junto a esse, como ácido salicílico, macronutrientes (N, P, K e Mg) e micronutrientes (Zn,

Mn, Cu e Mo) juntos ou isolados e de diferentes fontes, além de produtos comerciais, também

não observaram efeito dos tratamentos nutricionais no título da bactéria quando comparados

ao tratamento controle (somente N, P e K), e ainda detectou um aumento da incidência do

HLB no decorrer do tempo nas árvores de pomares nos quais o tratamento nutricional foi

adotado.

Em linha com essas observações, JOHNSON et al. (2012) também mostrara, que a

população de Las em plantas que receberam o manejo nutricional foram similares à de plantas

que receberam a nutrição tradicional. Ainda nesse contexto, STANSLY et al. (2013)

avaliaram um pomar durante quatro anos, no qual a partir do quarto ano, foi observada um

contribuição significativa na produção das plantas onde se usou o tratamento nutricional

(baseado no programa foliar que vem sendo usado mais comumente pelos produtores na

Flórida) em conjunto com o controle intensivo do vetor, embora a incidência de HLB tenha

saltado de 30% no primeiro ano para 95% no terceiro.

Apesar de ter ocorrido certa variação entre o primeiro e o segundo período de coleta

(180 e 270 DAI), no terceiro período os valores de Ct se mostraram em média próximos a

22,0. Valores de Ct que se aproximam desta ordem são frequentemente encontrados em folhas

diagnosticadas com HLB na Flórida (EUA), sendo o intervalo de 18,0 < Ct < 30,0 o mais

comum para mais de 90% das amostras analisadas (LI et al., 2005; McCOLLUM et al., 2013).

39

Tabela 9 - Valores médios de Ct obtidos para as plantas submetidas aos tratamentos

nutricionais.

Tratamento Valores de Ct 180 DAI 270 DAI 360 DAI

0 SM+ 23 -- 25 1 Zn+ 26 28 23

2 Mn+ 24 20 22 3 Cu+ 26 20 21

4 CPLT+ 23 20 20 Legenda: 0 SM+ (sem micronutrientes), 1 Zn (aplicação de zinco), 2 Mn (aplicação de manganês), 3 Cu (aplicação de cobre), 4 CPLT (aplicação de Zn, Mn e Cu), + (infectado com Las), -- (dado não coletado); médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem significativamente entre si (Duncan = 0,05).

5 CONCLUSÕES

As aplicações de Cu, Mn e Zn via foliar e via substrato alteraram o estado nutricional

das plantas, avaliado pela análise química de folhas e pelo extrato de seiva, contudo não

causaram redução no título da bactéria nas plantas infectadas por Las. Assim, concluiu-se que:

os tratamentos diferenciais com Cu, Mn e Zn não contribuíram para o aumento do

vigor ou da resistência das plantas à doença;

plantas doentes, comparadas àquelas sadias, produziram menor quantidade de massa

de matéria seca de raiz, o que refletiu em menor massa de matéria seca total mesmo com o

maior peso específico de folhas associado ao HLB;

o suprimento de Cu causou prejuízos ao metabolismo da planta evidenciado pelos

menores teores de Nt, NH4+ e NO3

- nos extratos de seiva para ambas as condições de sanidade

das plantas.

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6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACHOR, D.S.; ETXEBERRIA, E.; WANG, N.; FOLIMONOVA, S.Y.; CHUNG, K.R.; ALBRIGO, L.G. Sequence of anatomical symptom observations in citrus affected with huanglongbing disease. Plant Pathology Journal, v. 9, p. 56-64, 2010. ADASKAVEG, J.E.; HINE, R.B. Copper tolerance and zinc sensitivity of Mexican strains of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, causal agent of bacterial spot of pepper. Plant Disease, v. 69, p. 993-996, 1985. AREVALO, H.A.; STANSLY, P.A.; ROUSE, R.E. Preliminary effects of insecticidal control of asian citrus psyllid and combinations of nutrients and systemic acquired resistance elicitors on incidence of greening disease in citrus resistant. Pest Management Newsletter, v. 18, p. 14-17, 2009. BAILEY, D.A.; NELSON, P.V.; FONTENO, W.C. S. Substrates pH and water quality. North Carolina Sate University, 2000. Disponível em: <http://www.ces.ncsu.edu/depts/hort/floriculture/plugs/ph.pdf>. Acesso em 12 de janeiro 2013. BAR-AKIVA, A.; SAGIV. Nitrate reductase in the citrus plants: properties, assay conditions and distributions within the plant. Physiologia Plantarum, v. 20, p. 500-506, 1967. BARNES, J.D.; BALAGUER, L.; MANRIQUE, E.; ELVIRA, S.; DAVISON, A.W. A reappraisal of the use of DMSO for the extraction and determination of chlorophylls a and b in lichens and higher plants. Environmental and Experimental Botany, v. 32, p. 85-100, 1992. BASSANEZI, R.B., MONTESINO, L.H., STUCHI, E.S. Effects of huanglongbing on fruit quality of sweet orange cultivars in Brazil. European Journal of Plant Pathology, v. 125, p. 565-572, 2009. BASSANEZI, R.B.; YAMAMOTO, P.T.; MONTESINO, L.H.; GOTTWALD, T.R.; AMORIM, L.; BERGAMIN FILHO, A. Regional HLB management on the effectiveness of local strategies of inoculum reduction and vector control. In: 2nd INTERNATIONAL RESEARCH CONFERENCE ON HUANGLONGBING, 1. 2011. Orlando. Anais eletrônicos... Disponível em: <http://www.plantmanagementnetwork.org/proceedings/irchlb/2011/>. p. 176, 2011. Acesso em: 15 jan. 2013. BATAGLIA, O.C.; FURLANI, A.M.C.; TEIXEIRA, J.P.F.; FURLANI, P.R.; GALLO, J.R. Métodos de análise química de plantas. Campinas: IAC, 1983. 48p. BATAGLIA, O.C.; FURLANI, P.R.; FERRAREZI, R.S.; MEDINA, C.L. Padrão nutricional de mudas de citros. Araraquara: Vivecitrus/Conplant, 2008. 40 p. BELASQUE Jr., J.; BERGAMIN FILHO, A.; BASSANEZI, R.B.; BARBOSA, J.C.; GIMENES-FERNANDES, G.; YAMAMOTO, P.T.; LOPES, S.A.; MACHADO, M.A.;

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