UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA

MICROBIOLOGIA DO LEITE E DERIVADOS – TAL 414

COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES

Professor: Antônio Fernandes de Carvalho

Alunos: Daniel de Oliveira - 70371

Gabriela Moreira Sales - 74293

Viçosa – Minas Gerais

2013

1. Introdução

O leite é definido como o produto oriundo da ordenha completa e

ininterrupta, em condições de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e

descansadas (BRASIL, 2002). Do ponto de vista nutricional, o leite é

considerado um dos alimentos mais completos, por apresentar em sua

composição alto teor de proteínas, vitaminas, sais minerais, além de ser

importante fonte de cálcio, sendo amplamente comercializado e consumido

pela população, e recomendado especialmente para crianças e idosos.

Devido a sua composição, constitui um excelente meio de cultura para

multiplicação de microrganismos (FRANCO; LANGRAF, 1996), podendo ter

importante participação na veiculação das DTA (Doenças Transmitidas por

Alimentos), quando consumido sem tratamento térmico adequado (BOOR,

1997). Diversos microrganismos patogênicos podem ser veiculados pelo leite,

destacando-se Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp., Listeria

monocytogenes, Campylobacter spp., Salmonella spp., Staphylococcus aureus

e Escherichia coli (RIEDEL, 1992; ROBINSON, 1990). Além dos patogênicos,

os microrganismos deteriorantes presentes no leite podem causar alterações

químicas, tais como a degradação de gorduras, de proteínas e de carboidratos,

tornando-o impróprio para o consumo e industrialização (COUSIN, 1982).

O controle microbiológico em amostras de leite é realizado,

principalmente, através da pesquisa de microrganismos indicadores que,

quando presentes, podem fornecer informações sobre as condições sanitárias

da produção, do processamento, ou armazenamento, assim como a possível

presença de patógenos e estimativa da vida de prateleira do produto.

Os principais grupos de microrganismos indicadores de qualidade do

leite são os aeróbios mesófilos (AM) e os coliformes (FRANCO; LANGRAF,

1996).

O grupo dos coliformes é composto por bactérias dos gêneros

Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella e pertencem à família das

Enterobacteriaceae. São bastonetes curtos, gram-negativos, aeróbios ou

anaeróbios facultativos, não esporulados, que apresentam como característica

marcante a capacidade de fermentar a lactose com produção de ácido e gás

quando incubados entre 32 e 35 ºC em 48 horas. Esses micro-organismos têm

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como habitat o trato intestinal do homem e de outros animais de sangue

quente. A Federação Internacional de Laticínios (FIL, 1998) define as bactérias

do grupo coliforme como formadoras de colônias vermelho escuras, com

aproximadamente 0,5 mm de diâmetro, se incubadas em ágar VRBL (violet red

bile lactose) a 30ºC.

Dentre o grupo dos coliformes (totais), há um subgrupo denominado

coliformes termotolerantes que é restrito aos membros capazes de fermentar a

lactose em 24 horas a 44,5 + 0,2 ºC com produção de ácido e gás. Este

subgrupo apresenta a particularidade de estar frequentemente associado a

contaminação recente de origem fecal. As bactérias pertencentes à esse grupo

podem multiplicar-se rapidamente em leite, especialmente acima de 20 ºC,

degradando proteínas e lactose. Consequentemente observa-se formação de

gás (CO2 e H2) que alteram o sabor e odor do leite e diminuem sua estabilidade

térmica. Na indústria de laticínios esses micro-organismos estão associados a

um defeito relativamente comum no processamento de queijos que é

conhecido como “estufamento precoce”. Nesse caso, se a contaminação do

leite no tanque de fabricação de queijos estiver entre 25 e 50 coliformes por

mL, com apenas 24 horas esse número pode chegar a 5 x 105 UFC/g de queijo.

Dessa forma já é possível observar a formação de sabores estranhos devidos à

produção de compostos como ácido fórmico e acético assim como a formação

de pequenas “olhaduras” ou orifícios distribuídos pelo interior do queijo.

Quando a contaminação por coliformes atinge cerca de 106 UFC/g de queijo,

seu volume é visivelmente aumentado e o estufamento torna-se evidente.

Em função de ser impraticável, sob o ponto de vista tecnológico,

pesquisar rotineiramente todos os patógenos que podem estar associados aos

alimentos ou à água, utiliza-se a pesquisa de um grupo de micro-organismos

que normalmente estão associados à contaminação por dejetos humanos. Os

indicadores com maior aceitação científica são representados pelo grupo dos

coliformes. Como as bactérias pertencentes à esse grupo são sensíveis ao

tratamento térmico da pasteurização, sua presença nos alimentos ou água

tratada indica falhas durante as etapas de processamento.

Para evitar sua presença na indústria de laticínios é importante que

sejam tomadas algumas medidas. Dentre elas convém citar a pasteurização

eficiente do leite, respeitando-se o binômio tempo/temperatura escolhido;

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adoção de procedimentos de higiene e sanitização bem elaborados e

controlados; o controle e orientação permanente quanto à higiene pessoal dos

funcionários; a eliminação da presença de leite ou creme cru dentro das

indústrias; a checagem periódica das placas do pasteurizador para avaliar a

presença de microfuros.

Existem dois métodos de análise para a enumeração de coliformes. A

contagem em placas utilizando ágar VRBL e a técnica do NMP (Número Mais

Provável). A FIL recomenda o método em placa quando é esperada uma alta

contagem de coliformes (> 100 UFC/g ou 10 UFC/ mL de produto).

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2. Método

2.1 NÚMERO MAIS PROVÁVEL

2.2.1 Objetivos

Estabelecer procedimento para a determinação do Número Mais

Provável de coliformes e termotolerantes em alimentos.

2.2.2 Materiais

Meio de cultura e reagentes: Caldo lauril sulfato de sódio (LST) concentração

simples, caldo lauril sulfato de sódio concentração dupla, caldo verde brilhante

bile 2 % lactose, caldo EC, solução salina peptonada 0,1 %.

Utensílios e equipamentos: bico de Bunsen, pipetas, tubos de vidro, tubos de

Durhan, banho-maria com movimentação de água.

3. Principais aplicações

Aplica-se a todos os produtos lácteos, devendo ser utilizada quando o

limite máximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL.

4. Procedimento

4.1. Metodologia segundo BRASIL, 2003

Pesagem e preparo da amostra

Foi analisada uma amostra de Leite Pasteurizado Integral Vitaminado Tipo B,

Lote 01, embalado dia 16/02/2013, Laticínios Funarbe. Foi transferido 1 mL da

amostra para o tubo contendo solução salina peptonada 0,1 % de forma a obter

a diluição 10-1.

Prova presuntiva

Diretamente da amostra (100),foram inoculados volumes de 1 mL em uma série

de 3 tubos contendo caldo verde brilhante em concentração simples. A partir da

diluição 10-1, foram efetuadas as demais diluições desejadas em solução salina

peptonada 0,1 %. A seguir, inoculados volumes de 1mL da diluição 10 -1 na

segunda série de 3 tubos contendo caldo verde brilhante em concentração

simples. Foram inoculados 1 mL da diluição 10-2 na terceira série de 3 tubos.

Incubados os tubos a 44,5 + 1 ºC por 48 horas.

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5. Resultados

Leitura: a suspeita de coliformes totais é indicada pela formação de gás

nos tubos de Durhan (mínimo 1/10 do volume total) ou efervescência quando

agitado levemente.

Tabela de determinação do Número Mais Provável (NMP) por 100 mL da

amostra nos limites de confiança de 95 %, quando são utilizados três tubos

para cada volume de 10, 1,0 e 0,1 mL.

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10 ml – Diluição 100 - 3 tubos positivos1,0 ml – Diluição 10-1 – 1 tubo positivo0,1 ml – Diluição 10 -2 – 0

Número mais provável/g ou ml: 4,3Intervalo de Confiança: 9 – 180

5. Conclusão

Os resultados mostram que há presença de coliformes termotolerantes, o que pode indicar má qualidade de higienização do leite e processo ineficiente de pasteurização, visto que coliformes não resistem ao mesmo.

Como a análise foi realizada com Leite Pasteurizado submetido a eficiente processo de pasteurização e boa qualidade de higiene, acreditamos ter havido contaminação durante a manipulação da amostra analisada, interferindo no resultado.

6. Referências

BRASIL, 2003. Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Secretaria

de Defesa Agropecuária. Instrução Normativa nº 62, de 26 de agosto de 2003.

Métodos Analíticos Oficiais Microbiológicos para Análises Microbiológicas para

Controle de Produtos de origem Animal e Água. DOU 18 de setembro de 2003.

BOOR, K. J. Pathogenic microorganisms of concern to the dairy industry. Dairy, Food and Environmental Sanitation, Ames, v.17, n.11, p.714-717, 1997.

COUSIN, M. A. Presence and activity psychotrophic microorganisms in milk and dairy products. Journal of Food Protection, Des Moines, v.45, p.172-207, 1982.

FRANCO, B. D. G. M.; LANGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, 1996.

International Dairy Federation. IDF/FIL. Norma 41:1966.

MARTH, E., STEELE, J. L. Applied Dairy Microbiology. 2 1d., 2001.

RIEDEL,G. Controle sanitário de alimentos. 2.ed. São Paulo: Atheneu, 1992.

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ROBINSON, R. Q. Dairy microbiology: the microbiology of milk. New York:

Elsevier Applied Science, 1990. v.1.

SILVA, N., JUNQUEIRA, V. C. A., SILVEIRA, N. F. A., TANIWAKI, M. H.,

SANTOS, R. F. S., GOMES, R. A. R. Manual de Métodos de Análise

Microbiológica de Alimentos. 3 ed., 2007.

WALSTRA, P., WOUTERS, J. T. M., GEURTS, T. J. Dairy Science and

Technology, 2 ed., 2006.

WEHR, H. M., FRANK, J. F. Standard Methods for the Examination of Dairy

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