Universidade Tecnológica Federal do Paraná Campus Campo Mourão

Disciplina de Microbiologia de Alimentos Profa. Leila Larisa M. Marques

Técnicas de coloração de Gram INTRODUÇÃO

A coloração é chamada de Gram devido ao Dr. Christian Gram, que descreveu pela primeira vez esse processo de coloração em 1884, ao fazer uma referência à composição da parede celular. As bactérias Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptidioglicano e de ácido teicóico; enquanto as Gram-negativas possuem uma fina camada de peptidioglicano sobre a qual se encontra uma camada de lipoproteínas, de fosfolipídeos, de proteínas e de lipopolissacarídios.

A coloração de Gram envolve a aplicação de quatro reagentes: cristal violeta (CV) e lugol (iodo metálico e iodeto de potássio) (I), que formam um complexo insolúvel (CV-I); álcool-acetona, que funciona como solvente de lipídios e desidratante de proteínas, e fucsina ou safranina.

O tratamento com álcool-acetona extrai os lipídios, resultando no aumento da permeabilidade da parede celular das bactérias Gram-negativas. Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado, e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias Gram-positivas, em virtude de sua composição, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool. Além disso, a permeabilidade é reduzida, e o complexo CV-I não pode ser extraído. Finalmente, utiliza-se fucsina ou safranina que funciona como corante básico de contraste (contracorante). O tratamento com fucsina ou safranina não altera a cor roxa das Gram-positivas, ao passo que as Gram-negativas, descoradas pelo álcool, tornam-se avermelhadas. MÉTODO - Fazer um esfregaço bem homogêneo, fixar pelo calor e esperar esfriar; - Cobrir com cristal violeta, e deixar agir por 1 minuto; - Lavar rapidamente com água; - Cobrir com solução de lugol durante 2 minutos; - Lavar em água corrente; - Lavar a lâmina com álcool-acetona até que não se desprenda mais corante da preparação (aproximadamente 15 segundos); - Lavar rapidamente a lâmina com água; - Corar com fucsina durante 30 segundos; - Lavar a lâmina com água e, em seguida, deixar secar ao ar ou entre papel de filtro; - Observar ao microscópio, focalizando com a objetiva de imersão (100x).