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UFTCAMPUS GURUPI

FUNDAMENTOS DE GENÉTICA VOLTADOS À BIOTECNOLOGIA

PROFESSOR RAIMUNDO WAGNER

ASSUNTO: SEQUENCIAMENTO DE DNA

ALUNA: MAUREN SILVEIRA

Fundamentos de genética Mauren Silveira UFT-Gurupi

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Sequenciamento de DNA

Uma forma de se saber qual é a sequencia de nucleotídeos é investigando a nova fita formada a partir da fita molde.

A enzima responsável pela formação da nova fita é a DNA polimerase. Entendendo como ela age, pode-se entender melhor a formação do DNA novo.

Em nucleotídeos normais há um grupo hidroxila na posição 3’ (OH).

A DNA polimerase reconhece esse (OH) e liga um outro nucleotídeo a essa posição pelo grupo 5’ fosfato.

A DNA polimerase usa como ponto de partida o grupo 3’ (OH), se ele não existir, a enzima não é capas de fazer a união desse nucleotídeo ao próximo, o que interrompe a replicação do DNA.

Acontece que existem nucleotídeos semelhantes aos normais, mas sem o grupo (OH). Eles são os TERMINADORES DE CADEIA. Eles indicam que um gene terminou e que não é preciso mais prosseguir com a replicação.

Cada nucleotídeo tem um peso diferente. Cada nucleotídeo tem um complemento seu devido às configurações químicas.

Como já se sabe como os terminadores de cadeia agem, como a enzima DNA polimerase age, pode-se fazer um teste “in vitro” para “ver” qual sequencia de DNA temos num gene.

Os terminadores de cadeias usados no seqüenciamento de DNA são os didesoxinucleotídeos. Assim como terminadores há os iniciadores.

Então, adiciona-se quatro cópias da fita de DNA a ser pesquisada separadamente em tubos com iniciadores e terminadores marcados com sondas radiotivas. São usados quatro terminadores: dA, dG, dC e dT. Um para cada nucleotídeo de DNA existente.

A enzima DNA polimerase vai iniciar a replicação para nova síntese de fitas de DNA, mas ela pode adicionar um didesoxinucleotídeo ao invés de um nucleotídeo normal. Assim, ela mesma pára a síntese do DNA, tendo como final neste pedaço de fita nova um dideoxinucleotídeo específico (ou A, ou T ou C ou G) marcado radioativamente. Como sabemos, no DNA, um nucleotídeo A liga-se a um T, um C liga-se a um G, um G liga-se a um C e um T liga-se a um A.

Quando a reação terminar haverá vários pedaços de fita marcados radioativamente. O conjunto desses pedaços representa o gene pesquisado.

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O conteúdo de cada tubo é desnaturado por aquecimento para eliminar a enzima e os “primers”. Cada tubo será analisado separadamente em gel de eletroforese.

Esse gel é feito em acrilamida no lugar de agarose. A diferença é que a acrilamida faz uma malha molecular que permite a separação mais definitiva das moléculas de DNA.

Essa eletroforese também é diferente na forma como é feita. Sendo em tubos verticais, a sequencia da nova fita é lida de baixo para cima.

Como cada nucleotídeo tem um peso diferente, ele migra no gel em posição diferente.

Dessa forma, através da leitura do gel que tem nucleotídeos marcados, pode-se prever o que está imediatamente antes deles, e quanto menor o fragmento, maior a definição da sequencia.

De acordo com as definições a seguir também será possível prever o seqüenciamento.

Em uma amostra normal de DNA espera-se encontrar: Quantidade de (T +C) é

sempre igual à de (A+G).

A quantidade de T é sempre igual à de A e C é sempre igual à de G, mas (A+T)

não precisa ser igual à de G+C).

Essa proporção varia em indivíduos de espécies diferentes, mas é a mesma em tecidos diferentes do mesmo organismo.

G-C tem 3 pontes de H e A-T tem 2 pontes de H. Portanto DNA com muito G-C é

mais estável que DNA com muito A-T.

Há um padrão na configuração do DNA:

Adenina e Guanina são moléculas maiores ligadas ao açúcar. Timina e Citosina

são moléculas menores ligadas ao açúcar.

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