Como escolher a coluna ideal para LCMS...Reduzindo o diâmetro da coluna para aumentar a...

Como escolher a colunaideal para LCMS

Celso Blatt, Ph.D.Agilent Technologies Brasil

COLACRO XIV - Florianopolis

Colunas para LCMS

Colunas ZORBAX RP-HPLC para a máximaestabilidade em faixas de pH específicas

StableBond, pH 1-61. Uses bulky silanes

2. Non-endcapped

Eclipse XDB, pH 3-81) eXtra Densely Bonded

dimethylalkylsilanes

2) proprietary double-endcapping

*

Si

O

NH O

Zorbax Rx-SIL Silica Support Surface

Bonus-RP, pH 3-81) polar alkyl phase

2) triple endcapped

3) uses bulky silanes

Extend-C18, pH 2-11.51) unique bidentate structure

2) double endcapped

Si

O

Si

O

C18C18

At low pH, silica breaks down by hydrolyzing the siloxane* bond. This

breakdown can be almost entirely eliminated by using bulky silanes, found in

StableBond columns (left).

At mid-range and high pH, breakdown occurs from silica dissolution, and is

minimized by using endcapping procedures such as those in Eclipse XDB, Bonus-

RP and Extend.

*

3

Diferentes seletividades com a ZORBAX RRHT C18

1 2

3

4

1 2

3

4

1 2,3 4

1 234

Eclipse Plus C18

Eclipse XDB C18

Extend C18

StableBond C18

Mobile phase: (69:31) ACN: water

Flow 1.5 mL/min.

Temp: 30 °C

Detector: Single Quad ESI positive

mode scan

Columns: 4.6 x 50 mm 1.8 um

Sample:

1. anandamide (AEA)

2. Palmitoylethanolamide (PEA)

3. 2-arachinoylglycerol (2-AG)

4. Oleoylethanolamide (OEA)

1 2 3 4 5

250000

500000

750000

1000000

1250000

MSD1 TIC, MS File (C:\CHEM32\1\DATA\120506\ETAMIDE000075.D) ES-API, Pos, Scan, Frag: 70, "scan"

1 2 3 4 5

250000

500000

750000

1000000

1250000

1 2 3 4 5

250000

500000

750000

1000000

1250000

min1 2 3 4 5

250000

500000

750000

1000000

1250000

1

2

3

4

Reduzindo o diâmetro da coluna para aumentar a sensibilidade

min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

200ng Bifenil

Coluna: Zorbax SB C18

0.3mm0.5mm1.0 mm4.6 mm

Efeito do tamanho da partícula

Curva de Van-Deemter para diferentes tamanho de partículas

16

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 2 4 6 8 10 12 14

ZORBAX Eclipse XDB-C18

4.6 x 50mm

85:15 ACN:Water

1.0µL Octanophenone

0.05 – 5.0 mL/min

20°C

5.0 µµµµm

3.5 µµµµm

1.8 µµµµm

HETP

[µ

m/

pla

te]

ue [mm/s]

Particle Hmin

5.0 µm 9.3 µm

3.5 µm 6.0 µm

1.8 µm 3.8 µm

H = A + B/u + Cu

Comprimento da coluna e tamanho de partícula na eficiência da coluna

Coluna

Comp.

(mm)

Coluna

Eficiência

N(5 µm)

Coluna

Eficiência

N(3.5 µm)

Coluna

Eficiência

N(1.8 µm)

150 12,500 21,000 35,000

100 8,500 14,000 23,250

75 6000 10,500 17,500

50 4,200 7,000 12,000

30 N.A. 4,200 6,500

15 N.A. 2,100 2,500

Eficiência(N)

Pressão

TempoAnálise

VolumePico

Tempo de

análise

-

-33%

-50%

-67%

-80%

-90%

Uso de Solvente

Aumento da Resolução

4.6 x 150, 1.8µm490 barN = 28669 R_S = 1.80 (+57%)S/N = 44

7 Impurezas

todas 7 separadas!

4.6 x 150, 3.5µm165 barN = 14862R_S = 1.37S/N = 50

7 Impurezas

6 nãoseparadas!

4.6 x 150, 5µm93 barN = 7259R_S = 1.15S/N = 42

4 Impurezas

2 nãoseparadas!

Colunas para LC/MS

Coluna Coluna I.D. Comp. colunaTamanhopartícula

Fluxo ideal

Nano 0.075, 0.10 mm 50, 150 mm 3.5 um100 – 600

nL/min

Capillary 0.3, 0.5 mm35, 150, 250

mm3.5, 5 um 1 – 10 uL/min

MicroBore 1.0 mm 30, 50, 150 mm 1.8, 3.5, 5um 30 – 60 ul/min

Narrow Bore 2.1 mm 15 – 250 mm 1.8, 3.5, 5 um0.1 – 0.3 mL/min

Solvent Saver 3.0 mm 50 – 250 mm 1.8, 3.5, 5um 0.3 – 1 mL/min

Analytical 4.6 mm 15 – 250 mm 1.8, 3.5, 5um 1 – 1.5 mL/min

Escolha colunas longas para ter a máxima resolução cromatográfica 2.1 x 150 mm Column

0 1 2 3 4 5

Bromazepam

m/z = 316

Oxazepam

m/z = 287

Lorazepam

m/z = 321

Diazepam

m/z = 285

Clobazamm/z = 301

Total Ion Chromatogram

4.58

4.07

3.26

3.01 4.07

2.26

Time (min)

Diazepam

3.01

2.26 3.28

4.07

4.57

160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

260

261 281

301

303

285

287

321

323

287

289

316 318

m/z

Bromazepam

Oxazepam

Lorazepam

Diazepam

ClobazamColumn: ZORBAX SB-CN

2.1 x 150 mm, 5 umMobile Phase: 60% water + 0.2% formic acid

40% ACNFlow Rate: 0.25 mL/minDetection: Electrospray Positive IonSample: Benzodiazepines

1. Bromazepam2. Oxazepam3. Lorazepam4. Diazepam5. Clobazam

Escolha colunas curtas para análises rápidas com identificação por MS 2.1 x 50 mm Column

m/z = 316

m/z = 287

m/z = 321

Diazepamm/z = 285

Clobazam

m/z = 301

2.19

1.94

1.63

1.47(1.94)

1.16

Time (min)

(Diazepam)

1.15 1.94

0 1 2 3 4 5

1.49

12,3

4,5

160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

260318

301

303

285

287

321

323

287

289

316 318

319

m/z

Diazepam

Clobazam

Total Ion Chromatogram

Bromazepam

Oxazepam

Lorazepam

Bromazepam

Oxazepam

Lorazepam

Single Ion Chromatograms

Column: ZORBAX SB-CN2.1 x 50 mm, 5 um

Mobile Phase: 60% water + 0.2% formic acid

40% ACNFlow Rate: 0.20 mL/minDetection: Electrospray Positive IonSample: Benzodiazepines

1. Bromazepam2. Oxazepam3. Lorazepam4. Diazepam5. Clobazam

Longitudinal diffusion

Partículas menores aumentam a eficiência da colunaP

late

Heig

ht

H

Linear Velocity u

Eddy Diffusion

Sum Curve: van-Deemter

Resistance to Mass Transfer

H = A + B/u + C u

Large Particle

Small

Particle

u opt

H min

Sub 2um Totally Porous Particle

Superficially Porous Particle

Melhor transferência de massaMelhor transferência de massa

SOLID CORE

Colunas Poroshell 120 para HPLC e UHPLC

• 80-90% efficiency of sub 2um

• At ~40-50% lower pressure

• 2X efficiency of 3.5um (totally porous)

• A 2.7um particle size

• A 2um frit to reduce clogging

• A 600 bar pressure limit

• The particle has a solid core (1.7um) and

porous outer layer with a 0.5um diffusion

path

Poroshell 120 columns have:

1.7um

0.5um

0.5um

14

Análise de 15 analgésicosMesmo método para ambas colunas

ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 3 x 100 mm, 1.8 µm

ZORBAX Poroshell 120 EC-C18, 3 x 100 mm, 2.7 µm

Ibuprofen:PW1/2=0.012S/N=353nc=54

Ibuprofen:PW1/2=0.012S/N=256nc=56

2 min

Poroshell 120 Comparada com Sub 2umDesempenho similar

min0 2 4 6 8 10

min0 2 4 6 8 10

RRHT Eclipse Plus C18

1.8 um

P = 510 Bar

Poroshell 120

EC-C18

2.7 um

P = 332 Bar

Columns: 4.6 x 100 mmA: Water 0.1% Formic Acid

B: Acetonitrile 0.1% formic Acid

Gradient 2 ml/min

Initial 8 % B

10 min 30% B

275 nm 2mm flow cell

Injection: 10 uL

Agilent 1200 SL

40 °C

1. Hydroquinone

2. Resorcinol

3. Catechol

4. 4-Nitrophenol

5. p-cresol

6. o-cresol

7. 2-Nitrophenol

8. 2,3 Dimethyl phenol

9. 2,5 Dimethyl phenol

10. 1-Naphthol

10

4 56 7

8

9

10

12

3

12

34 5

67

8

9

Tamanho de partícula constante, gradiente, mais resolução

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

50

100

150

200

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

50

100

150

200

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

50

100

150

200

RRHD SB-C18 2.1 x 50 mm, 1.8umPmax=366 barnc = 424

RRHD SB-C18 2.1 x 100 mm , 1.8umPmax=595 bar nc = 485

RRHD SB-C18 2.1 x 150 mm, 1.8umPmax=768 bar nc = 589

Rs: 2.40

Rs: 1.37

Rs: 0

Page 17

0 2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

50

100

150

200

250

VWD1 A, Wavelength=246 nm (D:\SAMPLE TEST\RRHT-1100\070809SBC180003.D)

1.4

74

3.3

23

5.0

64

5.6

51

6.1

14

6.9

64

8.3

37

9.6

90

10.

982

Coluna convencional - 4.6 x 150mm, 5µm, SB-C18

Flow Rate 1.0 ml/minInjection Volume 15uL

Temperature 30°CWavelength 246nmSample rate 2.5 Hz

Time (min) % Acetonitrile

0 50

10 90

13.5 90

13.6 50

15 50

Initial Pressure: 69 barFinal Pressure: 38 bar

Coluna mais curta, partícula menor e gradiente mais rápido1/3 Comprimento- 1/3 Gradiente

Coluna – 4.6 x 50mm, 1.8µm, SB-C18

min0 1 2 3 4 5 6

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

VWD1 A, Wavelength=246 nm (D:\SAMPLE TEST\RRHT-1100\HDS 2007-08-09 17-25-25\070809SBC180009.D)

1.1

76

2.0

04

2.2

54

2.4

64

2.8

11

3.3

57

3.8

71

4.3

43

Flow Rate 1.0 ml/min

Injection Volume 5uL

Temperature 30°CWavelength 246nm

Sample rate 13.74 Hz


0 50

3.33 90

4.5 90

4.53 50

5 50


Ancrease Column Flow-Reduce Gradient TimeDouble Flow (2mL/min) – ½ Gradient Time

RRHT 4.6 x 50mm, 1.8µm, SB-C18

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

VWD1 A, Wavelength=246 nm (D:\SAMPLE TEST\RRHT-1100\HDS 2007-08-10 08-22-16\070810SBC180004.D) 0

.58

7

1.0

20

1.1

46

1.2

60

1.4

37

1.7

15

1.9

70

2.2

01

Flow Rate 2.0 ml/min

Injection Volume 5uL

Temperature 30°CWavelength 246nm

Sample rate 13.74 Hz


0 50

1.67 90

2.25 90

2.27 50

3.34 50


Poroshell 120 150mm Columns – HPLC or UHPLC

2 mL/min

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

20

40

60

80

100

120

min0 5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

20

40

60

80

100

120

1 mL/minP = 285 bar

P = 538 bar

Conditions: Column: Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 150mm, 2.7um Mobile Phase: Solvent A: Water with 0.1% Formic Acid

Solvent B: Acetonitrile 1200 SL controlled temperature at 25 °C 2 ul flow cell

1. Hydroquinone2. Resourcinol3. Catechol4. Phenol5. 4-Nitrophenol6. p-cresol7. o-cresol8. 2-Nitrophenol9. 3,4 di methyl phenol10. 2,3 di methyl phenol11. 2,5 di methyl phenol12. 1-napthol

Gradient: 1mL/min

Time%B

6.0 5%

51 60%

Gradient: 2mL/min

Time%B

3.0 5%

25.5 60%

Comparison of 4.6 x 250 mm 5 um to Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um

min5 10 15 20 25 30

mAU

0

20

40

60

80

100

9.7

12

11

.11

6

11

.59

6

12

.67

4

15

.24

8

16

.15

11

6.4

35

20

.68

7

23

.07

6

29

.29

0

min5 10 15 20 25 30

mAU

0

50

100

150

200

250

1.7

19

2.1

89

2.3

11

2.6

06

3.8

67

4.4

37 4

.55

8

5.4

50

5.9

20

7.0

37

325 bar

110 bar

Sulfadiazine,Sulfathiazole SulfapyridineSulfamerazine,Sulfamethazine, Sulfamethazole, Sulfamethoxypyridazine,SulfachloropyridazineSulfamethoxazole, Sulfadimethoxine

Time %B0 833 3334 33Column: Eclipse Plus C184.6 x 250mm, 5umFlow Rate: 1 mL/min

Mobile Phase:A: 0.1% formic acid in WaterB: 0.1% formic acid in ACN

Time %B0 812 3313.2 33Column: 4.6 x 100mmPoroshell 120 EC-C18, 2.7umFlow Rate: 1 mL/min

Expand High Speed Chromatograms for True Comparison to Slower Separation

min5 10 15 20 25 30

mAU

0

20

40

60

80

100

9.7

12

11

.11

6

11

.59

6

12

.67

4

15

.24

8

16

.15

11

6.4

35

20

.68

7

23

.07

6

29

.29

0

110 bar

5

mAU

0

50

100

150

200

250

1.7

19

2.1

89

2.3

11

2.6

06

3.8

67

4.4

37 4

.55

8

5.4

50

5.9

20

7.0

37

325 bar

min

Max Performance RRHD - UHPLC/TOF (1290/6230)Identify More Compounds in Very Short Run Time

1 .5

min

Time Composition

0.0 10% ACN

1.5 100% ACN

224 pesticides at 50 pg each217 ionized & detected in positive mode(97%, Find by Formula) 2.1 x 50 mm x 1.8 micron

Eclipse Plus C-18900 bar1.5 mL/min1290 Infinity

Colunas para diferentes modos de operação emLCMS

• SCAN – (SQ, QQQ, TRAP) – coluna muito eficiente

• SCAN – (TOF, QTOF) – picos extreitos

•SIM – (SQ, QQQ) – coluna eficiente

•MRM – (QQQ) – picos extreitos

Escolhendo a coluna e condições para LC/MS

Configuração da coluna

• Comprimento da coluna – resolução cromatográfica

• Tamanho de partícula da coluna – resolução cromatográfica

• Diâmetro interno da coluna – fluxo, quantidade de amostra

Escolha da fase móvel

• Melhora a ionização do soluto – baseado na técnica usada – ESI, APCI, APPI

• Melhora a sensibilidade

• Uso de aditivos voláteis

Fase ligada

• Escolha do pH da fase móvel para aumentar a vida útil e diminuir o sangramento

Tampões indicados para ESI

Positive ion detection of basic

analytes

Buffer choices (10 mM or less)

• Acetate pKa 4.8

• Propionic acidpKa 4.8

• Formate pKa 3.8

• TFA highly acidic

Typical analytes – amines, amides,

antibiotics

Negative ion detection of acidic analytes

Buffer choices (10 mM or less)

• Ammonia pKa 9.2

• Diethylamine pKa 10.5

• Triethylamine pKa 10.7

• Piperidine pKa 11.1

Typical analytes – acids, hydroxyls,

phosphates, sulfates

Mantenha 1 – 2 pH acima ou abaixo do pKa do analito.

Adaptando um método LC existente para um método LC/API-MS

Substituia os tampões não voláteis por tampões voláteis na concentração

de <10 mM para ESI ou <100 mM para APCI

• Substitua os fosfatos e boratos com acetato de amonia, formiato de

amonia ou TFA

• Se um tampão não volátil tiver que ser usado, escolha o tampão com

somente uma parte anionica ou cationica não volátil (ex. fosfato de

amônia e mantenha a concentração bem baixa) e mantenha o diâmetro

e o fluxo baixo (2.1 ou 1.0 mm id)

Mantenha o mesmo pH do método original incluindo os aditivos voláteis –

ácido fórmico, ácido acético, TFA e hidróxido de amônia

[email protected] fone 0800 7281405

Muito obrigado!

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