BIANCA BERGAMO DE ARAJO

Componentes da matriz extracelular e seus

reguladores no msculo liso brnquico na asma

Tese apresentada Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Doutor em Cincias

rea de Concentrao: Patologia Pulmonar

Orientadora: Profa. Dra. Thais Mauad

So Paulo 2008

Dedico este trabalho

Ao meu Deus, pela companhia e cuidado constantes,

Aos meus queridos pais, Noel e Maria Lcia, por toda dedicao e amor incondicionais,

Aos meus lindos irmos, Fbio e Mrcio, pela amizade e apoio,

Aos meus avs, exemplos de vida, por todo amor recebido,

Ao Wanderson, por tornar minha vida mais bela,

Aos meus familiares e amigos.

Minha gratido,

querida Profa. Dra. Thais Mauad, minha orientadora, por proporcionar-me mais

que conhecimento cientfico e acadmico nestes quatro anos de doutorado.

Obrigada por todo auxlio e incentivo para que eu pudesse vivenciar outra Cultura,

e para que este trabalho se tornasse realidade. Meu apreo e admirao pela sua

dedicao e genialidade.

Aos grandes colaboradores para realizao deste trabalho: Profa. Dra. Marisa

Dolhnikoff, Dr. Luiz Fernando Ferraz da Silva, Sandra Morais Fernezlian e

Higor Alexandre Gomes.

Aos ps-graduandos: Tatiana Lanas, Diogenes Seraphim Ferreira, Aleta

Senhorini, Mana Maria Barbosa Morales, Ruy de Camargo Pires Neto, Denise

Simo Carnieli, Raquel Annoni, Ana Laura Nicoletti Carvalho, George Castro

Figueira de Mello, pelo apoio mtuo.

Aos funcionrios dos Laboratrios de Histologia e de Imunohistoqumica do

Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de So

Paulo (FMUSP), pelo processamento das lminas.

Aos funcionrios do Museu e Sala de Imagem, da Sala dos Residentes, e s

secretrias do Departamento de Patologia da FMUSP, por todo o auxlio.

Aos funcionrios do Servio de Verificao de bito da Faculdade de Medicina da

Universidade de So Paulo pelo auxlio na coleta do material.

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES) pela

concesso da bolsa de estudo.

SUMRIO

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

SUMMARY

1. INTRODUO ........................................................................................ 1

1.1 Asma - Definio ............................................................................. 2

1.2 Asma - Epidemiologia...................................................................... 3

1.3 Patognese da asma....................................................................... 4

1.3.1 Inflamao.......................................................................... 4 1.3.2 Alteraes estruturais brnquicas na asma........................ 5

1.4 Matriz extracelular ........................................................................... 8

1.4.1 Reguladores da matriz extracelular (MEC)....................... 12 1.4.2 Inibidores teciduais de metaloproteinases........................ 13

1.5 O msculo liso brnquico (MLB) na asma..................................... 13

1.5.1 Hipertrofia......................................................................... 15 1.5.2 Hiperplasia ....................................................................... 16

1.6 Deposio de MEC na camada do MLB........................................ 17

1.7 Mecanismos de alteraes da MEC no MLB na asma .................. 19

2. OBJETIVOS .......................................................................................... 24

2.1 Gerais ............................................................................................ 25

2.2 Especficos .................................................................................... 25

3. MTODOS ............................................................................................ 26

3.1 Casustica...................................................................................... 27

3.1.1 Indivduos de So Paulo................................................... 27 3.1.2 Indivduos de Perth........................................................... 28

3.2 Mtodos......................................................................................... 31

3.2.1 Histoqumica..................................................................... 31 3.2.2 Imunohistoqumica ........................................................... 31 3.2.3 Morfometria ...................................................................... 33 3.2.4 Anlise Estatstica ............................................................ 35

4. RESULTADOS ...................................................................................... 36

4.1 Casustica...................................................................................... 37

4.2 Morfometria ................................................................................... 38

4.3 Anlise histoqumica...................................................................... 40

4.4 Anlise imunohistoqumica ............................................................ 42

4.5 Subgrupos analisados ................................................................... 46

4.5.1 Fumantes versus no fumantes ....................................... 46 4.5.2 Uso de corticosteride...................................................... 47

5. DISCUSSO ......................................................................................... 49

6. CONCLUSES ..................................................................................... 60

7. PERSPECTIVAS FUTURAS ................................................................. 62

8. ANEXOS................................................................................................ 64

9. REFERNCIAS ..................................................................................... 69

APNDICE................................................................................................... 85

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Anticorpos e procedimentos utilizados na anlise imunohistoqumica .......................................................................65

Tabela 2. Dados clnicos do grupo de Asma Fatal, Asma No Fatal e Controle........ ...............................................................................66

Tabela 3. rea fracionada dos componentes de matriz extracelular no msculo liso brnquico na Asma Fatal, Asma No Fatal e Controle........................................................................................67

Tabela 4. rea fracionada das metaloproteinases 1, 2, 9 e 12; e inibidores das metaloproteinases 1 e 2 no interior do msculo liso brnquico nos casos de Asma Fatal e Controle.. ....68

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representao macroscpica de pulmes (A) e via rea (B). .............................................................................................30

Figura 2. Representao da anlise morfomtrica realizada na camada do msculo liso brnquico............................................34

Figura 3. Representao histolgica de grande via area de indivduo do grupo Controle (A) e Asma Fatal (B)........ .. ..........38

Figura 4. rea fracionada de fibras elsticas no msculo liso brnquico em grandes e pequenas vias areas nos grupos Asma Fatal, Asma No Fatal e Controle....................................40

Figura 5. Fotomicrografias mostrando rea fracionada de fibras elsticas no msculo liso brnquico de indivduo do grupo Controle (A) e Asma Fatal (B)........ ...........................................41

Figura 6. Fotomicrografias mostrando rea fracionada de fibronectina no msculo liso brnquico de indivduo do grupo Controle (A) e Asma Fatal (B) ..................................................................43

Figura 7. rea fracionada de fibronectina no msculo liso brnquico em grandes e pequenas vias areas nos grupos Asma Fatal e Controle. ........................................................................43

Figura 8. Fotomicrografias mostrando expresso de metaloproteinase-9 e metaloptoteinase-12 no msculo liso brnquico, epitlio e lmina prpria de indivduo do grupo Controle (A) e Asma Fatal (B)....................................................44

Figura 9. Expresso de metaloproteinase-9 no msculo liso brnquico de grandes e pequenas vias areas nos grupos de Asma Fatal e Controle. .........................................................45

Figura 10. Expresso de metaloproteinase-12 no msculo liso brnquico de grandes e pequenas vias areas nos grupos de Asma Fatal e Controle. .........................................................45

Figura 11. Expresso de metaloproteinase-9 no msculo liso brnquico de grandes e pequenas vias areas no grupo de Asma Fatal.................................................................................47

Figura 12. rea fracionada de fibras elsticas no msculo liso brnquico de grandes e pequenas vias areas no grupo de Asma Fatal. .....48

RESUMO Arajo BB. Componentes da matriz extracelular e seus reguladores no msculo liso brnquico na asma [tese]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2008. 84p. A matriz extracelular e as clulas musculares lisas das vias areas esto intimamente interrelacionadas. Poucos estudos porm, avaliaram a composio dos diferentes componentes da matriz extracelular e seus reguladores na camada do msculo liso brnquico na asma. Utilizando um programa de anlise de imagens, a rea fracionada do colgeno total e das fibras elsticas foi quantificada no interior do msculo liso brnquico de 35 indivduos que faleceram devido a um ataque de asma (Asma Fatal), e comparada com 10 casos de indivduos com asma e que faleceram de outras causas (Asma No Fatal), e com 22 indivduos controles sem patologia pulmonar. Expresso dos colgenos I e III, fibronectina, versicam, metaloprotease (MMP)-1, 2, 9 e 12, e inibidores de metaloprotease 1 e 2 foram quantificados no interior do msculo liso brnquico de 22 casos de asma fatal e 10 controles. Nas grandes vias areas dos casos de asma fatal, a rea fracionada das fibras elsticas foi significativamente maior na camada do msculo liso brnquico quando comparada com os grupos de Asma No Fatal e Controle. Semelhantemente, fibronectina, MMP-9 e MMP-12 estavam aumentadas no msculo liso das grandes vias areas nos casos de asma fatal quando comparadas aos controles. Apenas aumento das fibras elsticas foi observado nas pequenas vias areas na Asma Fatal, e somente quando comparadas aos casos de Asma No Fatal. O conjunto dos resultados mostra que h uma composio alterada dos elementos da matriz extracelular e um ambiente de degradao protica no msculo liso brnquico de indivduos que morreram por asma, o qual pode acarretar importantes conseqncias nas funes sintticas e mecnicas do msculo liso das vias reas. Descritores: 1.Msculo liso 2.Matriz extracelular 3.Asma 4.Metaloproteases 5.Inibidores de proteases

SUMMARY

Arajo BB. Extracellular matrix components and regulators in the airway smooth muscle in asthma [thesis]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2008. 84p. There is an intimate relationship between the extracellular matrix (ECM) and smooth muscle cells within the airways. Few studies have comprehensively assessed the composition of different ECM components and its regulators within the airway smooth muscle (ASM) in asthma. With the aid of image analysis, the fractional area of total collagen and elastic fibres was quantified within the ASM of 35 subjects with Fatal Asthma (FA) and compared with 10 Nonfatal Asthma (NFA) patients and 22 nonasthmatic control cases. Expression of collagen I and III, fibronectin, versican, matrix metalloprotease (MMP)-1, 2, 9 and 12 and tissue inhibitor of metalloprotease-1 and 2 was quantified within the ASM in 22 FA and 10 control cases. In the large airways of FA cases, the fractional area of elastic fibres within the ASM was increased compared with NFA and controls. Similarly, fibronectin, MMP-9 and MMP-12 were increased within the ASM in large airways of FA cases compared with controls. Elastic fibres were increased in small airways in FA only in comparison with NFA cases. The results shower that, there is altered extracellular matrix composition and a degradative environment within the airway smooth muscle in fatal asthma patients, which may have important consequences for the mechanical and synthetic functions of airway smooth muscle. Descriptors: 1.Smooth muscle 2.Extracellular matrix 3.Asthma 4.Metalloproteases 5.Inhibitor of Protease

1. INTRODUO

Introduo

2

1.1 Asma - Definio

A asma uma doena inflamatria crnica caracterizada por

hiperresponsividade das vias areas e por limitao varivel ao fluxo areo,

reversvel espontaneamente ou com tratamento, manifestando-se

clinicamente por episdios recorrentes de sibilncia, dispnia, aperto no peito

e tosse, particularmente noite e pela manh ao despertar (GINA 2006).

A hiperresponsividade brnquica, uma das caractersticas dos

pacientes asmticos, o estreitamento excessivo da via area, que ocorre em

resposta ao desafio da via area a uma ampla variedade de agonistas

inflamatrios e irritantes no especfico, como frio, ar seco e gases oxidantes.

Apesar da hiperresponsividade brnquica ser o substrato de base do

estreitamento varivel das vias areas caracterstico da asma, o seu

mecanismo no est ainda bem estabelecido. No se sabe se, este fenmeno

causado por alteraes fundamentais do fentipo muscular ou se causado

por alteraes estruturais-mecnicas dos elementos no contrteis, ou ainda

por alteraes na relao entre a parede da via area e o parnquima

pulmonar adjacente (King et al., 1999; Brusasco et al., 1998). Embora os

mecanismos que envolvem esta hiperresponsividade permaneam obscuros,

acredita-se que o msculo liso brnquico (MLB) dos asmticos seja um dos

principais responsveis pelo fenmeno (An et al., 2007).

Introduo

3

1.2 Asma - Epidemiologia

Apesar de a asma ser uma doena cujos mecanismos patogenticos

e teraputicos so relativamente bem conhecidos, a mortalidade aumentou

de maneira estatisticamente significante na dcada de 80, em nvel mundial,

e o termo paradoxo da asma foi introduzido para descrever esta observao.

Mais recentemente, parece ter havido uma queda gradual na mortalidade da

asma em alguns pases onde as estatsticas de mortalidade so atualizadas

de maneira acurada. Esta tendncia tem sido observada particularmente em

pases que adotaram teraputicas modernas no tratamento de asma, entre

elas o uso de corticosteride inalatrio (Baluga et al., 2001; Sly, 2004; Neffen

et al., 2006).

No Brasil, estima-se que 11% da populao seja asmtica (Masoli et

al., 2004). A asma um grande problema de sade pblica brasileira.

Anualmente ocorrem cerca de 350.000 internaes por asma no Brasil,

constituindo-se na quarta causa de hospitalizao pelo Sistema nico de

Sade (2,3% do total) e sendo a terceira causa entre crianas e adultos

jovens (Ministrio da Sade, 2004). O estudo multicntrico ISAAC

(International Study for Asthma and Allergies in Childhood) realizado em 56

pases mostrou uma variabilidade de asma ativa de 1,6% a 36,8%, estando

o Brasil em 8 lugar, com uma prevalncia mdia de 20% (ERJ, 1998).

Estima-se que cerca de 2000 pessoas morram por ano no Brasil em

decorrncia da asma, sendo 200 delas na cidade de So Paulo (Mauad et

al., 2008).

Introduo

4

1.3 Patognese da asma

1.3.1 Inflamao

A inflamao brnquica constitui um dos mais importantes fatores

patognicos da asma. resultante de interaes complexas entre clulas

inflamatrias, mediadores e clulas estruturais das vias areas (Barnes et

al., 1997; Djukanovic et al., 1990). Est presente em pacientes com asma de

incio recente, em pacientes com formas leves da doena e mesmo entre os

assintomticos (Vignola et al., 1998a).

A resposta inflamatria tem caractersticas especiais que incluem

infiltrao eosinoflica, degranulao de mastcitos e ativao de clulas T

helper (auxiliadoras) 2 que produzem citocinas, como as interleucinas IL-4,

IL-5, IL-13, entre outras, responsveis pelo incio e manuteno do processo

inflamatrio (Bousquet et al., 1990). A presena de inflamao crnica

poderia agir, teoricamente, em cada um dos compartimentos da via area,

inclusive entre as clulas do msculo liso brnquico, com infiltrao de

mastcitos (Brightling et al., 2002), tendo como conseqncia as alteraes

de carter anatmico. sabido que a inflamao, que pode seguir um

quadro agudo ou apresentar-se de maneira crnica, promove dano tecidual

progressivo.

Introduo

5

1.3.2 Alteraes estruturais brnquicas na asma

Um aspecto importante da asma so as alteraes estruturais da

parede dos brnquios. Atravs de seus mediadores, as clulas inflamatrias

causam leses e alteraes na integridade epitelial, anormalidades no

controle neural autonmico e no tnus da via area, alteraes na

permeabilidade vascular, hipersecreo de muco, mudanas na funo

mucociliar e aumento da reatividade do msculo liso da via area (Holgate,

2000).

Acredita-se que as alteraes estruturais das vias areas, muitas delas

de carter definitivo, possam ser responsveis pela obstruo persistente das

vias areas e perda progressiva da funo pulmonar observadas nestes

pacientes (Mauad et al., 2007; Chiappara et al., 2001; Lange et al., 1998).

Tambm sugerido que as alteraes estruturais brnquicas estejam

associadas com a gravidade da doena (Chetta et al., 1997).

1.3.2.1 Remodelamento brnquico na asma

O termo Remodelamento Brnquico normalmente utilizado para

expressar modificaes estruturais que ocorrem nos pulmes,

especialmente em situaes patolgicas decorrentes do prprio processo

inflamatrio e da falta de reparo adequado injria crnica (Vignola et al.,

2003). Vrias alteraes estruturais so relatadas no remodelamento

brnquico. As principais alteraes estruturais das vias areas descritas na

asma, resumidamente, so:

Introduo

6

Epitlio de revestimento brnquico:

No indivduo fora da crise observa-se metaplasia de clulas

caliciformes, e em menor grau, metaplasia escamosa. Nos casos de asma

grave e fatal observa-se intensa descamao epitelial que concede ao

epitlio um aspecto frgil (Mauad e Dolhnikoff, 2008). O principal fator que

pode levar leso epitelial na asma a ao de produtos derivados da

degradao de eosinfilos, entre eles a MPB (protena bsica principal),

protena com ao citotxica epitelial (Rennard et al., 1995). Alm da funo

de barreira fisiolgica, o epitlio brnquico exerce um importante papel na

resposta inflamatria. A leso epitelial cria condies que facilita a ao de

linfcitos T helper 2, mantm o processo inflamatrio eosinoflico atravs de

citocinas como o fator estimulante de colnia de granulcitos e macrfagos

(GM-CSF) (GINA 2006).

Membrana basal epitelial:

Representa uma camada de matriz extracelular especializada,

composta por colgeno tipo IV, proteoglicanos e fibronectina, a qual exerce

significante influncia no crescimento celular, maturao, funo celular,

suporte mecnico e barreira qumica. Na asma, a verdadeira membrana

basal est ntegra. Contudo, existe uma caracterstica deposio de

colgeno I, colgeno III e fibronectina na regio abaixo da membrana basal

epitelial (lamina reticular) que tpico desta doena (Roche et al., 1989).

Introduo

7

Lmina prpria:

Esta camada da via area contm, basicamente, elementos da matriz

extracelular, vasos e clulas inflamatrias. Os processos inflamatrios a

deposio de matriz e a angiognese encontradas na asma podem causar

um espessamento desta camada, promovendo uma diminuio acentuada

da luz da via area (James et al., 1989).

Msculo liso brnquico:

Vrios estudos em asma fatal e no fatal mostraram que h hipertrofia

e hiperplasia da camada de msculo liso, sendo essa alterao um fator

chave na patognese da asma. Pacientes que morreram de um episdio

agudo de asma apresentam aumento na espessura da camada muscular

comparados com os que morreram de outras causas (Carroll et al., 1993).

Detalhes desses processos sero descritos adiante.

Glndulas submucosas:

Na asma observa-se hiperplasia e hipertrofia de glndulas

submucosas que contribuem para a excessiva produo de muco presente

na asma fatal. Tampes mucosos so caractersticos desta doena e

ocorrem em vias areas de todos os tamanhos (Benayoun et al., 2003).

Adventcia

A adventcia a camada mais externa da parede da via area e inclui

tecido conectivo fibroso, componente vascular e cartilagem, esta ltima

Introduo

8

presente apenas nas grandes vias areas. Espessamento da adventcia nas

pequenas vias areas de asmticos tem sido descrito (Bai et al., 2000,

Dolhnikoff et al., 2008 submetido). Alm de estreitar o lmen, o

espessamento desta camada pode aumentar a capacidade de contrao do

MLB pelo desacoplamento do msculo carga aplicada pelo recolhimento

elstico pulmonar.

Alm das alteraes estruturais citadas acima, os componentes da

matriz extracelular (MEC) dos pulmes (fibras elsticas e colgenas,

proteoglicanos e glicoprotena), as metaloproteinases (MMPs) e seus

reguladores teciduais (TIMPs) podem estar alterados na asma.

1.4 Matriz extracelular

A MEC tem um papel importante na manuteno da estrutura e

funo das vias areas. As protenas da MEC esto envolvidas na interao

clula-clula, clula substrato de adeso, recebendo e emitindo sinais

moleculares, controlando a arquitetura tissular, orquestrando a adeso, a

migrao, a proliferao e a diferenciao celular (Johnson et al., 2004;

Parameswaran et al., 2006). A composio da MEC envolve processos

dinmicos de produo e degradao de protenas da matriz. As fibras

colgenas e elsticas, os proteoglicanos e as glicoprotenas so as

principais protenas da matriz extracelular. Os principais fatores que

controlam esse processo so as metaloproteinases (MMPs), os inibidores de

Introduo

9

metaloproteinases (TIMPs) e os fatores de crescimento (James, 2005). Em

um processo inflamatrio como o que ocorre na asma este equilbrio

prejudicado, resultando em uma quantia anormal da matriz depositada como

tambm, uma composio alterada dos seus componentes.

Os principais componentes da MEC que participam do

remodelamento brnquico na asma so:

Fibras Elsticas: Tm como principal componente a elastina que

uma glicoprotena estrutural. Diferentes propores de elastina e

microfibrilas promovem caractersticas funcionais variveis, adaptveis s

necessidades locais dos tecidos (Kielty et al., 2002). O desenvolvimento da

elastognese se d atravs de trs estgios graduais e sucessivos: fibras

oxitalnicas (formadas exclusivamente por microfibrilas e sem elastina),

elaunnicas (formadas por grande quantidade de microfibrilas e pouca

elastina) e fibras elsticas maduras (formadas por grande quantidade de

elastina e poucas microfibrilas). Assim, a propriedade da fibra relatada pela

sua grande quantidade de elastina, sendo que as fibras oxitalnicas e

elaunnicas, sem ou com pouca elastina, dariam resistncia tenso

mecnica, o que representa ser um elemento capaz de sustentar as

variaes de distenso a que se submetem, garantindo assim sua

integridade. J as fibras elsticas maduras, as quais possuem grande

quantidade de elastina, representariam o elemento responsvel pela

distensibilidade reversvel do tecido conectivo, sendo capaz de aumentar at

uma vez e meia o seu comprimento e retornarem ao seu comprimento inicial,

Introduo

10

regulando a patncia das vias areas e o recolhimento elstico pulmonar

(Paniagua et al., 1983). So sintetizadas por fibroblastos, MLB, condrcitos e

hidrolisadas facilmente por elastases.

Fibras colgenas: O colgeno uma glicoprotena estrutural, com

peso molecular de 290 quilodalton, composto pelos aminocidos glicina

(33,5%), prolina (12%) e hidroxiprolina (10%) formando trs cadeias

polipeptdicas enroladas entre si configurando uma estrutura de tripla hlice.

formado por fibrilas e microfibrilas que originam as fibras com dimetros

variados e presentes sob a forma de uma rede delicadamente tranada ou

de feixes espessos (Gelse et al., 2003). No pulmo j foram identificados

mais de 20 tipos diferentes de colgenos (Suki et al., 2005). Entre os vrios

tipos de colgenos, os tipos I e III so os mais abundantes e com

distribuio difusa no tecido pulmonar. O colgeno tipo I produzido pelos

fibroblastos, conferindo um grau de polimerizao mxima e conferindo

maior capacidade de resistir s tenses. O colgeno tipo III produzido

pelas clulas do msculo liso e clulas reticulares, conferindo ao msculo

liso, o tecido hematopoitico e nervos as suas propriedades, devida a mdia

polimerizao das suas finas fibrilas (Junqueira e Carneiro, 2000).

Proteoglicanos: Os proteoglicanos (PGs) representam uma famlia

de macromolculas composta por uma protena central e cadeias laterais de

polissacardeos sulfatados, glicosaminoglicanos (GAGs), covalentemente

ligadas (Iozzo, 1985). A protena, sintetizada no retculo endoplasmtico

Introduo

11

rugoso, tem a funo principal de interagir especificamente com outras

macromolculas alvo, repercutindo na distribuio dos PGs nos tecidos

(Pogny et al., 1994; Sini et al., 1997). As cadeias GAGs so ionicamente

carregadas e funcionam fisicamente como criadoras de compartimentos

preenchidos por gua, mantendo a matriz hidratada (Hardingham, 1992;

Yanagishita, 1993). Vrios PGs como biglicano, decorina, lumicam,

heparina, versicam, entre outros, foram identificados na MEC, na superfcie

ou entre as clulas. Participam da organizao de fibras colgenas (Wiberg

et al., 2002), do equilbrio hdrico tecidual, auxiliam a migrao (Saika et al.,

2000) e influenciam a permeabilidade vascular (Iozzo, 1985). Versicam um

grande proteoglicano chondroitin sulfato isolado a partir de culturas de

fibroblastos humanos com uma protena central rica em resduos de cido

glutmico, serina e treonina. Sua estrutura complexa com vrios domnios de

ligao confere a este PG participao em vrias funes como estimular a

proliferao e diferenciao celular, e inibir a formao de tecido

cartilaginoso (Zhang et al., 1998; de Kluijver et al., 2005).

Glicoprotenas: A principal alterao de glicoprotenas descrita na

asma a deposio subepitelial de fibronectina, tenascina e laminina (Vignola

et al., 2003). Dentre os componentes da matriz extracelular, a fibronectina, um

dmero de 450 quilodalton, caracterizada por ser uma protena com a funo

de adeso entre as clulas, em outras molculas de fibronectina e em

estruturas fibrosas da matriz, serve de ponte de unio entre as clulas no

epiteliais, promove a migrao celular e a quimiotaxia, regulando a

Introduo

12

proliferao e diferenciao celular (Hocking, 2002). Fibronectina esta

altamente expressa em tecidos lesados, com importante implicao no reparo

tecidual (Limper e Roman, 1992), sendo que nveis aumentados de

fibronectina no lavado broncoalveolar de pacientes asmticos, correlaciona-se

com a imunorreatividade de macrfagos alveolares.(Vignola et al., 1996).

1.4.1 Reguladores da matriz extracelular

Metaloproteinases: De acordo com sua estrutura e substrato

especfico ao qual se liga, membros da famlia das metaloproteinases so

classificados em subgrupos de colagenases, estromelisinas, matrilisinas,

metaloproteinases tipo-membrana, gelatinases e outras MMPs. Constituem

uma famlia de proteinases que contm um on zinco no seu stio cataltico.

Apresentam ampla gama de funes fisiolgicas e patolgicas, incluindo o

desenvolvimento embrionrio, reparos teciduais, ovulao, funes

macrofgicas e neutroflicas, desenvolvimento de cncer, remodelao ssea

entre outros (Yoon et al., 2003). Clulas mesenquimais, epiteliais, macrfagos

e neutrfilos so capazes de sintetizar as MMPs. Vrias MMPs tm sido

implicadas no processo de remodelamento brnquico na asma,

principalmente as MMP-2 e MMP-9, da famlia das gelatinases, capazes de

degradar elastina, fibronectina, colgenos I, II, III e IV, ser pr-MMP-9 e 13. A

MMP-1, da famlia das colagenases intersticiais, a qual degrada colgeno I, II,

III, VII, VIII e X, e gelatina, pr-MMP-9 e moduladora do Fator de

Crescimento Insulnico (GFI). J a MMP-12, uma metaloelastase capaz de

Introduo

13

degradar elastina e influenciar no recrutamento de clulas inflamatrias

(Gueders et al., 2006).

1.4.2 Inibidores teciduais de metaloproteinases

A inibio das formas ativas das MMPs pode dar-se pela ao de

seus inibidores teciduais (TIMPs). So quatro os TIMPs descritos (1, 2, 3, 4).

Com exceo do TIMP-3, so secretados sob forma solvel. Todos so

capazes de efetuar fortes ligaes com membros da famlia das MMPs, com

conseqente formao de complexos inibitrios. So importantes no

estabelecimento de balano entre sntese e degradao da MEC induzidas

pelas MMPs (Yoon et al., 2003). Estudo ps leso do tecido muscular

esqueltico mostra que a TIMP-1 ativada numa fase mais precoce (6

horas), enquanto que a TIMP-2 apresenta-se ativada aps 2 dias. As TIMPs

1 e 2 possivelmente tm papis diferentes de acordo com o tempo do dano

tissular e de reparo (Koskinen et al., 2001).

1.5 O msculo liso brnquico na asma

Evidncias sugerem que a clula muscular lisa o componente mais

importante envolvido na patognese da asma, pois alm de modular o tnus

broncomotor, participa na funo imunomoduladora da orquestrao e

perpetuao da inflamao das vias areas (An et al., 2007; Chung et al.,

Introduo

14

2000). Alm da capacidade proliferativa e contrtil, o msculo liso brnquico

tambm uma importante fonte de citocinas pr-inflamatrias, quimiocinas e

fatores de crescimento, e componentes da matriz extracelular (Panettieri,

2003; Howarth et al., 2004). Estudos patolgicos de quase um sculo atrs

demonstram que o MLB de pacientes asmticos est aumentado (Huber e

Koessler, 1922), desde ento, esta observao vem sendo repetidamente

confirmada por Kuwano et al., 1993; James et al., 1989; Heard e Hossain,

1973; Carroll et al., 1993; Takizawa e Thurlbeck, 1971; Ebina et al., 1990;

Sobonya, 1984; Bai et al., 2000; Saetta et al., 1991; Thomson et al., 1993;

Woodruff et al., 2004, e os dados destes estudos mostram que a quantia do

MLB, comparado com casos controles, est aumentado de 50 a 400% do

MLB nos casos de asma fatal e de 25 a 200% nos casos de asma no fatal,

dependendo do tamanho da via area examinada, e h correlao com a

hiperreatividade e aumento da resistncia das vias areas. Avanos tm

sido feitos para identificar os processos mitognicos e as vias que modulam

o crescimento do MLB (Noveral et al., 1994).

O paradigma a respeito do aumento da quantia do MLB na asma

que a inflamao crnica secreta mediadores que resulta em proliferao do

MLB (Ma et al., 1998; Panettieri, 1998). Alguns fatores de crescimento esto

aumentados no lavado broncoalveolar (LBA) das vias areas de asmticos

como, por exemplo: Fator de Crescimento Epidermal (EGF), Fator de

Crescimento Insulnico (GFI), entre outros, que podem alterar a

contratilidade e a homeostase do clcio e induzir hipertrofia e hiperplasia do

MLB, podendo ento as clulas musculares lisas responderem a substncias

Introduo

15

que elas prprias secretam (sinalizao autcrina) (Laazar et al., 2000). De

et al. (1993) demonstraram que a ao da IL-1 atua como um fator

mitognico para o msculo liso devido a secreo autcrina de Fator de

Crescimento Derivado das Plaquetas (PDGF).

Ebina et al. (1990, 1993) compararam grandes e pequenas vias

areas de 16 casos de asma fatal com indivduos no asmticos. Eles

observaram duas categorias de pacientes baseados na distribuio do MLB,

o tipo I com aumento do nmero de clulas do MLB (hiperplasia) somente na

via area central, e o tipo II com aumento do tamanho do msculo liso

(hipertrofia) nas vias areas centrais e perifricas. Este aumento da massa

do MLB pode ser devido a um aumento na proliferao, sobrevivncia ou

recrutamento de clulas progenitoras de MLB.

1.5.1 Hipertrofia

O aumento do tamanho das clulas do msculo liso brnquico

contribui para o espessamento da mucosa brnquica, o qual pode resultar

de numerosos fatores estimulantes, incluindo cargas aumentadas

(decorrentes do prprio espessamento da parede brnquica e de repetidos

episdios de broncoespasmo) (Vignola et al., 1998a). A hipertrofia tem sido

reportada em grandes e pequenas vias areas em casos de asma fatal

(Ebina et al., 1993), mas no nas grandes vias areas em casos moderados-

graves de asma (Woodruff et al., 2004). Benayoun et al. (2003) reportaram

um aumento de aproximadamente 1,5 vezes no dimetro de clulas de

Introduo

16

msculo liso de grandes vias areas de pacientes com asma intermitente e

moderada, e 3 vezes nos indivduos com asma grave em relao a

pacientes controles.

1.5.2 Hiperplasia

In vitro o MLB de asmticos apresenta uma taxa de proliferao maior

(Johnson et al., 2001), que em parte pode ser devido uma acelerada atividade

metablica (Trian et al., 2007) ou conseqncia a uma MEC de composio e

quantidade alteradas (Johnson et al., 2004). A inflamao na asma tambm

est associada com a produo de numerosos fatores mitognicos para o

MLB (Panettieri, 1998). Um estudo experimental de Bai et al. (1995)

demonstrou um aumento da sntese de DNA no msculo liso das vias areas

de porquinhos-da-ndia sensibilizados com ovoalbumina, aps provocao

duas vezes por semana, por seis meses, quando comparado com animais-

controles submetidos provocao com soluo salina. Os sinais que

estimulam a proliferao do MLB podem ser divididos em dois grupos

baseados nos receptores de superfcie que eles interagem (Hirst et al., 2000).

Fatores de crescimento de polipetdeos, como o Fator de Crescimento de

Fibroblasto (FGF) interagem com os receptores de superfcie especficos com

atividade intrnseca da protena tirosina-quinase. Outros estimulantes

mitognicos como a histamina e a trombina interagem com protenas G.

Ambas as vias ativam a quinase reguladora extracelular (ERK) e a

fosforilao da protena do retinoblastoma, aumentando a produo da ciclina

Introduo

17

e a degradao do inibidor p27 KIP 1. Estes eventos resultam na fase S do

ciclo da clula (sntese de DNA) e progride com a diviso celular. Heard e

Hossain (1973) descreveram que o nmero de ncleos de micitos por

volume de MLB estava aumentado nas grandes vias areas de 5 casos de

asma fatal, comparados com indivduos no asmticos.

1.6 Deposio de MEC na camada do MLB

Outro componente que poderia contribuir para o espessamento da

camada muscular na asma seria um aumento da deposio da MEC na

camada muscular lisa das vias areas.

As clulas do MLB so capazes de secretar uma grande variedade de

protenas da matriz, incluindo fibronectina, fibras colgenas, fibras elsticas,

hialorunan, laminina e versicam.

Na asma, deposio anormal de protenas da MEC tem sido descrita

nas camadas da submucosa e adventcia de grandes e pequenas vias

areas (Mauad et al., 1999; Mauad et al., 2004; Chakir et al., 2003; De

Medeiros et al., 2005), incluindo anormalidades nos colgenos, laminina,

tenascina e fibronectina (Laitinen et al., 1997; Wilson e Li, 1997). Mauad et

al. (1999) observaram um aumento das fibras elsticas na submucosa de

vias areas centrais de indivduos que morreram por asma e um menor

contedo de fibras elsticas quando se considera apenas a regio

subepitelial dessas vias areas em comparao aos controles. A perda de

Introduo

18

acoplamento das fibras elsticas na membrana basal poderia resultar em

uma diminuio da forca elstica da via area, facilitando o mecanismo de

broncoconstrio.

Na asma grave e fatal, os proteoglicanos versicam, biglicam e

lumicam esto aumentados na lmina prpria e ao redor do MLB (De

Medeiros et al., 2005; Pini et al., 2007; de Kluijver et al., 2005). Roberts

(1995) encontrou deposio dos proteoglicanos versicam e cido hialurnico

entre as fibras do MLB e na submucosa de vias areas de asmticos,

sugerindo que a presena aumentada destas substncias poderia contribuir

para as alteraes mecnicas observadas em uma via area espessa. Par

et al. (1997) notaram que, se a deposio de colgeno ocorrer na matriz

subepitelial a contrao do msculo liso pode ser dificultada, devido a

resistncia compresso e tenso, entretanto, se a deposio dessas

protenas estiverem entre as clulas do msculo liso brnquico, podem

promover um enrijecimento e estreitamento das paredes das vias areas. No

entanto, McParland et al. (2003) relatam que a deposio de matriz

extracelular na camada do MLB pode aumentar a carga e dificultar a

contrao desta musculatura, prevenindo o estreitamento excessivo das vias

areas. Estudos in vitro demonstram que a digesto da MEC com

colagenase promove um aumento da gerao de fora e encurtamento do

msculo liso nas vias areas de humanos (Bramley et al., 1995), consistente

tambm com os achados de Niimi et al. (2003), que sugerem que fibrose na

parede da via area protege contra reatividades excessivas.

Introduo

19

Hirst et al. (2000) observaram que a resposta proliferativa das clulas

do msculo liso era maior quando acrescentava determinados componentes

da MEC, como fibronectina e colgeno I, sendo que, culturas de MLB podem

variar seus fentipos em relao as condies de cultura (Ma et al., 1998).

De acordo com Johnson et al. (2000), clulas de MLB de indivduos normais

expostas em soro de indivduos com asma, produziram nveis aumentados

de protenas da MEC. E ainda, peptdeos de elastina degradada cultivadas

com clulas musculares lisas de artrias coronrias de porcos estimularam a

mitose de clulas musculares lisas (Mochizuki et al., 2002). Slats et al.

(2008), descreveram uma correlao entre a hiperresponsividade brnquica

e elastina na parede brnquica de indivduos asmticos. As clulas de MLB

podem desenvolver um fentipo secretrio, proliferativo e um aumento das

protenas contrteis, resultando em um estado hipercontrtil celular de

acordo com a composio da MEC que as circunda (Panettieri, 1998).

1.7 Mecanismos de alteraes da MEC no MLB na asma

Entre as protenas que parecem ter importante papel no

remodelamento brnquico encontram-se as metaloproteinases. As MMPs

so reconhecidas como coadjuvantes importantes em processos patolgicos

pulmonares, tm a capacidade de clivar protenas estruturais como as fibras

colgenas e elsticas.

Introduo

20

Na presena de inflamao crnica, macrfagos e neutrfilos so

capazes de sintetizar metaloproteinases. Alm disso, as prprias clulas

mesenquimais so capazes de produzir MMPs em condies associadas ao

remodelamento tissular (Emonard et al., 1989). Vrias so as MMPs que tm

sido implicadas no processo de remodelamento brnquico na asma. Xie et

al. (2005) observaram in vitro que clulas do MLB expressavam MMP-12 ao

serem induzidas com IL-1, sendo que, a expresso dessa metaloproteinase

pode ativar outras MMPs, clivar protenas da MEC, promover migrao de

clulas inflamatrias e induzir uma atividade elastoltica aumentada

agravando doenas respiratrias como a asma. Poucos trabalhos

avaliaram o papel da MMP-1 na asma. Rajah et al. (1999) mostraram

expresso aumentada de MMP-1 em MLB de asmticos e sugeriram que

MMP-1 poderia induzir a hiperplasia de MLB, alm de clivar os

colgenos tipo I e III, os mais importantes colgenos fibrilares da MEC

pulmonar. Elshaw et al. (2004) tambm demonstraram que o MLB expressa

constitutivamente MMP-2, capaz de degradar colgeno tipo IV, um dos

maiores componentes da camada subepitelial da membrana basal. J, a

MMP-3, capaz de degradar uma ampla gama de protenas incluindo

colgenos tipos IV e V, fibronectina, elastina e proteoglicanos (Whitelock et

al., 1996). Kelly e Jarjour (2003) encontraram aumento da expresso de

MMP-9 no lavado broncoalveolar e no escarro durante exacerbao

asmtica, voltando a nveis normais aps estabilizao da crise. Porm,

Vignola et al. (1998b) encontraram nveis aumentados de MMP-9 em escarro

de pacientes com asma estvel. A imunorreatividade subepitelial de MMP-9

Introduo

21

tem sido associada com a gravidade da asma (Wenzel et al., 2003), sendo a

MMP-9 considerada a metaloproteinase predominante nas vias areas de

indivduos asmticos.

Alm das MMPs, os inibidores teciduais de metaloproteinases

tambm contribuem para o reparo tecidual e remodelamento brnquico

encontrado na parede brnquica de asmticos. O equilbrio entre as MMPs e

seus inibidores controla a deposio dos componentes da MEC nos tecidos.

A expresso de TIMP-1 tambm foi encontrada em LBA durante

exacerbaes de pacientes com asma (Kelly e Jarjour et al., 2003).

Ao longo dos anos, o grupo do Departamento de Patologia Pulmonar

da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo, vem

organizando um banco de tecidos de pulmes de indivduos que morreram

por asma e que foram submetidos a autpsia no Servio de Verificao de

bitos da Capital. Estes pacientes tm em comum apresentarem asma

grave pobremente controlada, baixo uso de corticosterides inalados,

ausncia de acompanhamento mdico regular, baixo ndice scio econmico

e educacional (Mauad et al., 2008).

Desde ento, vrios trabalhos j foram publicados utilizando-se deste

material e vrios outros esto em andamento. A pesquisa realizada nesse

material tem a vantagem de nos proporcionar o acesso a diferentes regies

do tecido pulmonar e de vias areas de vrios calibres, permitindo tambm

a anlise das diferentes camadas da parede brnquica.

Nos ltimos anos, temos desenvolvido colaboraes com outros grupos

de pesquisadores que trabalham com o tecido de pacientes que faleceram

Introduo

22

de asma. Entre eles, temos colaborado com o Professor Alan James e seu

grupo, de Perth, Austrlia. Esta colaborao nos permitiu acesso ao tecido

de um grupo de pacientes que apresentavam asma (em geral leve) e que

morreram de outras causas que no asma. Este grupo de estudo

importante de ser acrescentado ao nosso, pois pode fornecer informaes

importantes sobre as especificidades de nossos achados em relao asma

ou a sua gravidade.

No entanto, a pesquisa com este material apresenta algumas

limitaes importantes, como a ausncia de dados relativos funo

pulmonar ou dados confiveis em relao terapia medicamentosa. A

ausncia destes dados no nos permite avanar nos mecanismos

relacionados relao estrutura-funo neste material.

O material de autpsia portanto, til para a caracterizao da matriz

extracelular nos diversos compartimentos pulmonares em pacientes com

asma.

At o momento do desenho deste estudo, havia poucos estudos em in

vivo onde a composio dos diferentes componentes da MEC e seus

reguladores no interior do msculo liso de grandes e pequenas vias areas

era descrita de maneira abrangente (Pini et al., 2007). Acreditamos haver

importantes razes para entender melhor este assunto. Primeiro, alteraes

da composio da MEC no MLB podem afetar suas propriedades contrteis.

Segundo, descrever a expresso das MMPs e TIMPs no MLB pode

aumentar o conhecimento do envolvimento do MLB no remodelamento na

Introduo

23

asma. Terceiro, uma composio alterada da MEC pode influenciar o

fentipo das clulas do MLB (Johnson et al., 2000).

Assim, o presente estudo tem como objetivo caracterizar os principais

componentes da MEC e seus reguladores em vias areas grandes e

pequenas de indivduos que faleceram devido a um ataque de asma (asma

fatal), comparar com indivduos com asma e que faleceram de outras

causas, e indivduos sem patologia pulmonar.

2. OBJETIVOS

Objetivos

25

2.1 Gerais

Caracterizar as alteraes dos componentes da matriz extracelular e

seus reguladores na camada muscular lisa das vias areas de indivduos

com asma.

2.2 Especficos

2.1.2 Determinar a frao de rea de colgeno total e fibras elsticas no

msculo liso de vias areas grandes e pequenas de indivduos falecidos por

asma, comparando com indivduos asmticos falecidos por causas no

pulmonares e com indivduos falecidos por causas no pulmonares, no

asmticos e sem doena pulmonar autpsia.

2.2.2. Quantificar a frao de rea dos colgenos I e III, versicam,

fibronectina, a expresso das metalopreinases 1, 2, 9 e 12, e dos inibidores

das metaloproteinases 1 e 2 no msculo liso de vias areas grandes e

pequenas de indivduos falecidos por asma e comparar com indivduos

falecidos por causas no pulmonares, no asmticos e sem doena

pulmonar autpsia.

3. MTODOS

Mtodos

27

O protocolo deste estudo retrospectivo teve a aprovao do Comit

de tica para a Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de So

Paulo (CAPPesq-FMUSP) e pelo Sir Charles Gairdner Hospital Ethics

Committee (Nedlands, Australia).

Parte da populao do presente estudo foi descrita previamente

(Mauad et al., 1999; Mauad et al., 2004; De Medeiros et al., 2005; De

Magalhes et al., 2005; Carroll et al., 1993; Carroll et al., 1996) em outros

estudos do Grupo de Patologia Pulmonar da Faculdade de Medicina da

Universidade de So Paulo e pelo Department of Pulmonary Physiology, Sir

Charles Gairdner Hospital, Nedlands, Western Australia.

3.1 Casustica

3.1.1 Indivduos de So Paulo

3.1.1.1 Grupo Asma Fatal

Tecido pulmonar foi obtido de indivduos autopsiados no Servio de

Verificao de bitos da Capital (SVOC) do Departamento de Patologia da

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo entre os anos de

1996 e 2003.

Mtodos

28

Indivduos que morreram por uma crise aguda de asma. Todos

apresentaram histria pregressa de asma documentada por um questionrio

aplicado por uma assistente social aos familiares dos indivduos. Foram

coletadas informaes relativas histria clnica, acompanhamento mdico,

tratamentos anteriores, incio da doena, hospitalizaes prvias

relacionadas asma, tabagismo, durao da crise final assim como o nvel

socioeconmico. Dentre os achados macroscpicos, todos os indivduos que

morreram por asma mostraram hipersecreo e hiperinsulflao pulmonar.

(FIGURA 1A e 1B). Microscopicamente, as espcimes pulmonares

apresentavam descamao epitelial, espessamento da membrana basal,

hiperplasia de glndulas submucosas, hipertrofia de msculo liso e

inflamao da mucosa com ou sem eosinfilos.

3.1.1.2 Grupo Controle

Os indivduos controles foram considerados aqueles que morreram

por causas no pulmonares, sem histria de asma, no fumantes e que

apresentavam pulmes macroscopicamente e microscopicamente sem

alteraes.

3.1.2 Indivduos de Perth

Tecido pulmonar foi obtido de indivduos autopsiados no Coroner's

Court of Western Australia.

Mtodos

29

3.1.2.1 Grupo Asma Fatal

Pulmo foi obtido de indivduos que morreram por mal asmtico, com

histria de asma confirmada por familiares e mdicos. Os casos de asma

fatal no ocorreram em ambiente hospitalar e ventilao mecnica no foi

utilizada. Os indivduos apresentavam histrias de internaes hospitalares

pregressas decorrentes de problemas relacionados asma, perodos de

ausncias na escola ou trabalho devido asma e uso freqente de

corticosteride oral.

3.1.2.2 Grupo Asma No Fatal

Consistiu de indivduos que morreram por causas no pulmonares e

sem trauma torcico. Atravs de questionrios aplicados aos familiares,

mdicos ou anlise de pronturios hospitalares, histria pregressa de asma

foi bem definida. Os sintomas decorrentes da asma eram considerados

leves, com menos ocorrncias de internaes hospitalares devido asma

quando comparado ao grupo de Asma Fatal.

3.1.2.3 Grupo Controle

Os indivduos que apresentavam pulmes macroscopicamente e

microscopicamente normais e que morreram por causas no pulmonares

foram includos no grupo controle.

Mtodos

30

Os critrios de excluso para todos os grupos basearam-se na

presena de infeces, neoplasias ou inflamao.

Figura 1. Achados macroscpicos caractersticos de indivduo que foi a bito por asma ( esquerda). Destaca-se a distenso do pulmo pela hiperinsuflao (A) e a ocluso das vias areas por tampes mucosos espessos e aderentes (B). O pulmo direita em (A) de um tabagista que morreu por causa no pulmonar (comparar o tamanho).

A

B

Mtodos

31

3.2 Mtodos

3.2.1 Histoqumica

Fragmentos de tecido foram coletados das reas centrais e perifricas

dos pulmes, fixados em formaldedo a 10% e emblocados em parafina.

Cortes de 5 m de espessura foram submetidos a colorao Hematoxilina

Eosina (HE) para avaliao inicial.

Para identificao das fibras elsticas, a tcnica de Resorcina

Fuchsina de Weigert oxidada foi utilizada e previamente descrita em Mauad

et al., 1999. Para a anlise do colgeno total nas vias areas, a colorao de

Picrossrius foi utlizada (Dolhnikoff et al., 1999).

3.2.2 Imunohistoqumica

Os anticorpos especficos contra os colgenos I e III, fibronectina,

versicam, metaloproteinases 1, 2, 9 e 12 e inibidores das metaloproteinases

1 e 2 utilizados no estudo esto apresentados no Anexo A, Tabela 1

(anticorpo, pr-tratamento, clone, titulao e fabricante). Resumidamente, as

lminas previamente preparadas com silane (Sigma Chemical, Saint Louis,

Missouri, USA) contendo os cortes histolgicos dos pulmes foram

desparafinadas, hidratadas e submetidas a uma soluo de H2O2 a 3% por

40 minutos com o objetivo inibir a atividade endgena da peroxidase. Em

seguida, foi realizada a incubao por 24 horas com o anticorpo primrio e

Mtodos

32

posteriormente utilizado um complexo de estreptoavidina-biotina (LSAB,

DAKO, Glostrup, Denmark) como anticorpo secundrio.

Os cortes foram ento corados com o cromgeno diaminobenzidina

(DAB) (Sigma Chemical, Saint Louis, Missouri, EUA) e contra-corados com

Hematoxilina de Meyer. Para o processamento dos controles negativos, foi

omitida a utilizao do anticorpo primrio, substitudo por PBS (soluo

tampo fosfato).

Essas reaes foram realizadas no Laboratrio de Imunohistoqumica

do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade

de So Paulo, sendo apenas o colgeno I realizado no Division of

Biomedical Research,TNO Prevention and Health, Leiden University Medical

Center (LUMC), The Netherlands.

Para a otimizao da imunorreatividade do material a ser analisado,

as reaes de cada anticorpo foram realizadas em uma mesma bateria.

Aps realizao desse processo padronizado, foi observado que a

intensidade da colorao da reao variava significativamente entre os

casos de Perth e os casos de So Paulo, apresentando um padro fraco de

colorao nos casos de Perth, provavelmente pelo fato desses casos terem

sido submetidos a longos perodos de imerso no formol. Devido a esse fato,

a anlise imunohistoqumica foi realizada apenas nos casos de asma fatal e

controles coletados em So Paulo.

Mtodos

33

3.2.3 Morfometria

As imagens foram analisadas a partir de um programa de computador

Image-Pro Plus 4.1 para Windows (Media Cybernetics Silver Spring,

MD, USA) em um computador pessoal acoplado a uma cmera de vdeo que

captura imagens de um microscpio ptico Leica DMR (Leica Microsystems

Wetzlar GmbH, Germany). Em cada caso foram analisadas 2 vias areas

grandes e 3 vias areas pequenas cortadas transversalmente, classificadas

de acordo com o permetro da membrana basal epitelial (Pmb), sendo

considerada via area grande (Pmb > 6 mm), e via area pequena (Pmb 6

mm) (Saetta et al., 1998).

As reas do msculo liso foram medidas em toda a circunferncia das

vias areas num aumento de 400X e sempre que o campo apresentasse a

camada muscular claramente definida.

A positividade de cada reao foi determinada utilizando uma

ferramenta do analisador de imagem denominada color cube. Esta

ferramenta realiza medidas atravs de diferenas de cor da amostra,

calculando um parmetro baseado em uma tonalidade de cor definida pelo

usurio. Para cada reao um padro de cor foi previamente estabelecido. O

programa permite a seleo de uma regio onde a medida deve ser

realizada, denominada rea de interesse. Assim, a rea de interesse, no

caso a camada muscular lisa, foi manualmente determinada em cada campo

(Figura 2).

Mtodos

34

Figura 2. Representao da anlise morfomtrica realizada na camada do msculo liso brnquico. Aps delimitao manual da rea de interesse (linha verde) num aumento de 400x, a marcao da rea positiva previamente estabelecida para uma determinada protena (fibras elsticas na figura), quantificada pelo programa de anlise de imagem (rea vermelha). Os resultados foram expressos em porcentagem. Colorao por Resorcina Fuchsina de Weigert oxidada. Ep = camada epitelial; lp = lmina prpria; mlb = msculo liso brnquico. Barra de escala = 20m.

mlb

Mtodos

35

3.2.4 Anlise Estatstica

Dados demogrficos foram apresentados como mediana e interquartis

e os dados numricos como mdia DP.

A rea fracionada de cada reao especfica foi corrigida pela rea do

msculo liso brnquico (m2/m2) e expressa em porcentagem.

Foi realizada transformao logartmica dos dados antes das anlises.

Para comparar a rea fracionada de cada protena, para os dados

paramtricos, foi realizado ANOVA ou Teste T, e para dados no

paramtricos, o teste de Mann-Whitney ou Kruskal Wallis. Ps-teste de

Bonferroni foi utilizado para discriminar diferena entre os grupos Asma

Fatal, No Fatal e Controle.

A rea fracionada de cada reao foi comparada entre as vias areas

grandes e pequenas utilizando teste T pareado ou Wilcoxon. As correlaes

foram realizadas utilizando o teste de Spearman.

Valores de p menor que 0,05 foram considerados significantes, em

todos os testes aplicados neste estudo.

O programa estatstico utilizado para a anlise dos dados foi o

programa de computador Statistical Package for the Social Sciences

(SPSS) 13.0 (Chicago, Illinois).

4. RESULTADOS

Resultados

37

4.1 Casustica

As caractersticas clnicas dos indivduos so apresentadas no Anexo B,

Tabela 2.

Foram estudados os pulmes de 35 indivduos vtimas de asma,

sendo 15 homens com a mediana da idade 38 (26 50) anos, sendo 25

fumantes ou ex-fumantes.

Todos os indivduos asmticos apresentaram diagnstico macro e

microscpicos compatveis com asma fatal, e suas mortes foram

atestadas pelo patologista como mal asmtico. Em geral, as

caractersticas clnicas deste grupo sugerem asma grave, com admisses

hospitalares freqentes, uso de corticosteride oral, ou prejuzo de suas

atividades dirias devido asma.

Dos 10 indivduos do grupo de Asma No Fatal, cinco eram homens e

apresentaram idade mediana de 24 (17 34) anos, sendo cinco fumantes ou

ex-fumantes. Em geral, o grupo de Asma No Fatal apresentou poucos

sintomas relacionados a asma, com uso ocasional de -agonistas, baixas

doses de corticosterides inalados e sem histrias prvias de

hospitalizaes devido a asma, sugerindo classificao clnica de asma leve.

Resultados

38

Os 22 indivduos controles apresentaram pulmes normais aos

exames, sendo 11 homens com mediana da idade de 43 (26 - 58) anos e

todos no fumantes.

4.2 Morfometria

A Figura 3 ilustra na colorao de Hematoxilina e Eosina (H&E) as

alteraes morfolgicas mais proeminentes presentes nas grandes vias

areas de indivduos asmticos quando comparado as vias areas de

indivduos sem patologia pulmonar. Nota-se na asma fatal, a espessa

camada de msculo liso, infiltrado inflamatrio, hiperplasia das glndulas

submucosas e rolha de muco no lmen quando comparado ao controle.

Figura 3. Grande via area de um indivduo do grupo Controle (A) e Asma Fatal (B). Dentre as principais alteraes histolgicas observadas na via area (B), destaca-se a exuberante camada muscular (mlb). H tambm aumento do nmero de glndulas submucosas (gsm) e muco no lmen da via area (m). Ep = camada epitelial; lp = lmina prpria, c = cartilagem. H&E. Barra de escala = 200m.

mlb

mlb

gsm

gsm

Resultados

39

No total, foram analisadas 458 grandes e 651 pequenas vias areas

no grupo Asma Fatal, 40 grandes e 60 pequenas vias areas no grupo de

Asma No Fatal (somente anlise histoqumica) e 199 grandes e 375

pequenas vias areas no grupo Controle.

A rea de msculo liso brnquico por campo nas grandes vias areas

foi 15,4 3,76 x 104 m2 na Asma Fatal, 12,2 4,16 x 104 m2 na Asma No

Fatal e 9,1 3,66 x 104 m2 no Controle (p < 0,001 para Asma Fatal versus

Controle; p = 0,085 para Asma Fatal versus Asma No Fatal; p = 0,16 para

Asma No Fatal versus Controle). A rea de msculo liso brnquico por

campo nas pequenas vias areas foi 5,4 3,56 x 104 m2 na Asma Fatal,

2,5 1,96 x 104 m2 na Asma No Fatal e 2,9 2,16 104 m2 no Controle (p

= 0,03 para Asma Fatal versus Controle; p = 0,02 para Asma Fatal versus

Asma No Fatal; p = 0,99 para Asma No Fatal versus Controle).

Nas vias areas grandes, a mdia do permetro da membrana

basal (Pmb) foi 10,6 3,4 mm no grupo Asma Fatal, 12,6 3,1 mm no

grupo Asma No Fatal e 10,3 3,8 mm no grupo Controle (p = 0,23).

Nas pequenas vias areas, o Pmb foi 2,7 1,0 mm no grupo de Asma

Fatal, 2,6 0,9 mm no grupo de Asma No Fatal e 2,4 0,5 mm no grupo

Controle (p = 0,58).

Resultados

40

4.3 Anlise histoqumica

Encontramos um aumento significativo na rea fracionada das fibras

elsticas na camada do msculo liso nas grandes vias areas de Asma Fatal

quando comparado ao grupo Asma No Fatal (p = 0,002) e grupo Controle (p =

0,007). No houve diferena significativa entres os grupos Asma No Fatal e

Controle. Em relao as pequenas vias areas, observamos um aumento

significativo da rea fracionada das fibras elsticas no grupo Asma Fatal

quando comparado com o grupo Asma No Fatal (p = 0,019), mas no quando

comparado com o grupo Controle. No houve diferena na rea fracionada das

fibras elsticas na camada do msculo liso das pequenas vias areas quando

comparado aos grupos Asma No Fatal e Controle (Figura 4).

Figura 4. rea fracionada de fibras elsticas no msculo liso brnquico em grandes e pequenas vias areas nos grupos Asma Fatal, Asma No Fatal e Controle. Dados apresentados em mdia DP.

Resultados

41

A comparao do contedo de fibras elsticas do msculo liso

brnquico, entre as grandes e pequenas vias areas, no mostrou diferena

significativa para os grupos Asma Fatal e Asma No Fatal. No grupo Controle,

as fibras elsticas nas pequenas vias areas foram significativamente maior

que nas grandes vias areas (p = 0,035).

Figura 5 (A e B) mostra exemplos de fotomicrografias representativas de

vias areas grandes de casos controles e asma fatal corados para fibras

elsticas.

Figura 5. Fotomicrografias mostrando rea fracionada de fibras elsticas no msculo liso brnquico (mlb) de indivduo Controle (A) e asmtico (B). Corados por Resorcina Fuchsina de Weigert oxidada. Ep = camada epitelial e lp = lmina prpria. Barra de escala = 50m.

Para a porcentagem da rea fracionada do colgeno total, na camada

do msculo liso brnquico analisado nas grandes e pequenas vias areas,

no houve diferena significativa entre os grupos, assim como, no houve

diferena significativa quando comparado as grandes e pequenas vias

areas entre os grupos. Os dados esto sumarizados no Anexo C, Tabela 3.

mlb mlb

Resultados

42

4.4 Imunohistoqumica

Dentre os componentes da matriz extracelular, no encontramos

diferena significativa na camada do msculo liso brnquico de grandes e

pequenas vias areas entre os grupos para: versicam, colgeno I ou

colgeno III.

Para ambos os grupos, asmticos e controles, a rea fracionada

de versicam, colgeno I e colgeno III apresentou aumento significativo

nas pequenas vias areas quando comparado as grandes vias areas

(Asma Fatal, p = 0,005, p = 0,001 e p = 0,001, respectivamente; Controle, p

= 0,033, p = 0,018 e p = 0,011, respectivamente; Anexo C,Tabela 3).

A fibronectina apresentou uma porcentagem de rea fracionada no

msculo liso brnquico significativamente maior nas grandes vias areas de

asmticos quando comparada ao grupo Controle (p = 0,04: Anexo C, Tabela

3, e Figuras 6 e 7). A expresso de fibronectina apresentou correlao

positiva com a idade (r = 0,48; p = 0,03) nas grandes vias areas dos

asmticos.

Resultados

43

Figura 6. Fotomicrografias mostrando rea fracionada de fibronectina no msculo liso brnquico (mlb) de indivduo controle (A) e asmtico (B). Corados por imunohistoqumica anti-fibronectina. Ep = camada epitelial, lp = lmina prpria. Barra de escala: 50m.

Figura 7. rea fracionada de fibronectina no msculo liso brnquico (MLB) em grandes e pequenas vias areas nos grupos Asma Fatal e Controle. Dados apresentados em mdia DP.

mlb mlb

Resultados

44

Dentre as metaloproteinases estudadas, encontramos um aumento

significativo da metaloproteinase-9 (Figura 8 e 9) e metaloproteinase-12

(Figura 8 e 10) no msculo liso das grandes vias areas de asmticos,

mas no nas pequenas vias areas, quando comparado aos controles.

Os indivduos controles apresentaram uma maior rea fracionada de MMP-9

no msculo liso das pequenas vias areas quando comparada as grandes

vias areas (p = 0,043), e os asmticos apresentaram maior rea fracionada

de MMP-12 nas grandes vias areas quando comparadas as pequenas vias

areas (p = 0,001).

Figura 8. Fotomicrografias mostrando expresso de metaloproteinase-9 e metaloptoteinase-12 no msculo liso brnquico (mlb), camada epitelial (ep) e lmina prpria (lp) de indivduo controle (A) e asmtico (B). Corados por imunohistoqumica anti-MMP-9 e anti-MMP-12. Barra de escala = 50m.

mlb

mlb

mlb

mlb

Resultados

45

Figura 9. Expresso de metaloproteinase (MMP)-9 no msculo liso brnquico (MLB) de grandes e pequenas vias areas nos grupos de Asma Fatal e Controle. Resultados expressos em %. Box-plots representam mediana e interquartis.

Figura 10. Expresso de metaloproteinase (MMP)-12 no msculo liso brnquico (MLB) de grandes e pequenas vias areas nos grupos de Asma Fatal e Controle. Resultados expressos em %.

Resultados

46

As expresses de MMP-9 (r = 0,51; p = 0,01) e MMP-12 (r = 0,52; p =

0,02) se correlacionaram positivamente com a idade de incio da durao da

asma. A metaloelastase MMP-12, apresentou correlao positiva com as

fibras elsticas mo msculo liso das grandes vias areas dos asmticos (r =

0,71; p = 0,003).

No foi encontrada diferena significativa entre os grupos para as

MMP-1, MMP-2, TIMP-1 ou TIMP-2. Os controles apresentaram maior rea

fracionada de TIMP-2 no msculo liso das pequenas vias reas quando

comparado as grandes vias areas (p = 0,025), sendo os resultados

demonstrados resumidamente no Anexo D, Tabela 4.

4.5 Subgrupos analisados

4.5.1 Fumantes versus no fumantes

No grupo de indivduos asmticos de So Paulo, onze eram fumantes

ou ex-fumantes, sendo que os fumantes apresentaram uma maior rea

fracionada de MMP-9 nas grandes e pequenas vias areas que os

asmticos no fumantes (vias areas grandes 8,6 10,6 versus 2,8 4,4 %,

p = 0,001; pequenas vias areas e 6,5 6,0 versus 1,2 1,0 %, p = 0,024),

como mostra a Figura 11.

Resultados

47

p = 0,024p = 0,001

Figura 11. Expresso de metaloproteinase (MMP)-9 no msculo liso brnquico (MLB) de grandes e pequenas vias areas no grupo de Asma Fatal. Resultados expressos em %.

No houve diferena significativa nas fraes de fibras elsticas e

colgenas entre fumantes e no fumantes nos casos de Asma No Fatal.

4.5.2 Uso de corticosteride

Os indivduos do grupo de Asma Fatal que receberam tratamento

regular com corticosterides (n = 13) apresentaram menor rea fracionada

de fibras elsticas nas grandes e pequenas vias areas quando comparados

queles que no receberam nenhum corticosteride (vias areas grandes

8,8 13,7 versus 28,8 9,5%, p = 0,003; vias areas pequenas 10,0 12,8

versus 20,4 9,5%, p = 0,01), como mostra a Figura 12.

Resultados

48

Figura 12. rea fracionada de fibras elsticas no msculo liso brnquico (MLB) de grandes e pequenas vias areas no grupo de Asma Fatal. Resultados expressos em %.

5. DISCUSSO

Discusso

50

No presente estudo analisamos o contedo dos diferentes

componentes da matriz extracelular, metaloproteinases e seus inibidores

teciduais na camada do msculo liso de vias areas grandes e pequenas de

indivduos com asma e comparamos com controles. At o momento, este o

primeiro estudo em tecido humano in vivo que descreve de maneira bastante

abrangente a composio dos diferentes componentes da MEC e seus

reguladores no interior do msculo liso de grandes e pequenas vias areas

em pacientes com asma fatal e asma no fatal.

Ns encontramos nos casos de asma fatal: uma rea aumentada de

msculo liso com aumento de fibras elsticas, fibronectina e

metaloproteinases (MMP-9 e MMP-12) nas grandes vias areas; e uma rea

aumentada de msculo liso com aumento somente de fibras elsticas nas

pequenas vias areas em relao aos controles e aos indivduos asmticos

que faleceram de outras causas.

O aumento significativo das fibras elsticas no MLB das grandes vias

areas nos casos de Asma Fatal foi observado quando comparado aos

grupos Asma No Fatal e Controle, e nas vias areas pequenas quando

comparado ao grupo Asma No Fatal.

As fibras elsticas um componente integral da matriz extracelular

das vias areas e do parnquima pulmonar, as quais tm a funo de

regular a patncia das vias areas e o recolhimento elstico pulmonar. As

Discusso

51

fibras elsticas so abundantes entre as clulas do MLB e, embora seu

papel fisiolgico no esteja totalmente esclarecido, so provavelmente

importantes nas alteraes do calibre e comprimento das vias areas

durante a tosse, respiraes normais e profundas, contribuindo para o

comportamento de histerese das vias areas e parnquima pulmonar, se

opondo a broncoconstrio durante a inspirao (Moreno et al., 1993; Noble

et al., 2005).

Estudos prvios do nosso grupo demonstraram uma diminuio de

fibras elsticas na regio subepitelial de vias areas centrais asmticas

quando comparado aos controles, e uma diminuio das fibras elsticas na

adventcia das pequenas vias areas e nos septos alveolares

peribronquiolares, local de ancoramento do parnquima pulmonar (Mauad et

al., 1999; Mauad et al., 2004). Estes achados contrastam com os nossos

atuais, onde observamos um aumento de fibras elsticas na camada

muscular de vias areas de indivduos falecidos por asma. Essa variao da

frao de fibras elsticas poderia ser explicada devido ao de proteases e

elastases liberadas por clulas inflamatrias, que exuberante na camada

interna (lmina prpria) e adventcia na asma (De Magalhes et al., 2005), e

pela potencial funo secretora do msculo liso de promover formao de

elastina. Sabe-se que o msculo liso brnquico no apresenta somente um

papel broncoconstritor, mas tem importante papel imunomodulador. Graas

a chamada plasticidade fenotpica, as clulas da musculatura lisa brnquica

podem secretar elementos da matriz extracelular, alm de fatores de

crescimento. A secreo destes elementos influenciada pelo ambiente

Discusso

52

inflamatrio prprio da asma, mas tambm a modula. Assim, clulas

musculares lisas de asmticos secretam determinados elementos da matriz

extracelular em maior quantidade que clulas musculares lisas obtidas de

pacientes no asmticos (Chan et al., 2006).

A contrao do msculo pode ser influenciada pelo tecido conectivo

externo a camada do MLB e dentro da prpria camada. Enquanto o tecido

conectivo externo ao msculo pode atuar como um componente paralelo

elstico, limitando a broncoconstrio, o aumento das fibras elsticas entre

os feixes de MLB pode representar uma maior carga contrtil as clulas, ou

mesmo dificultar a transmisso de foras, representando um possvel efeito

protetor contra a broncoconstrio excessiva. Pode-se hipotetizar ainda,

que alteraes quantitativas nas fibras elsticas reflitam uma

desorganizao estrutural e funcional. Sabemos que o reparo das fibras

elsticas um processo bastante difcil em adultos, pois requer a formao

ordenada de microfibrilas e elastina (Shifren e Mecham, 2006). Dessa

maneira, o prprio relaxamento muscular ps-contrtil pode estar danificado

na asma fatal por alterao quantitativa e possivelmente qualitativa das

fibras elsticas intermusculares.

O fato do aumento de fibras elsticas ocorrer apenas no grupo de

pacientes que foram bito por asma mostra que estes pacientes so

aqueles realmente mais suscetveis a desenvolverem alteraes estruturais

da parede da via area, e que alteraes estruturais, de alguma maneira,

podem contribuir para a gravidade da doena ou para ataques mais graves.

Discusso

53

Nossos resultados apontam para um aumento de fibras elsticas

dentro da camada muscular das vias areas de asmticos que foram a bito

por asma fatal, mas no em asmticos que foram a bito por outras causas

ou em pacientes sem doenas pulmonares. Uma possvel explicao para

este achado, que no interior da camada muscular predominem

mecanismos proteolticos e que um turnover exagerado de fibras elsticas

esteja ocorrendo, ou ainda que o aumento das fibras elsticas reflita o plo

secretrio que as clulas musculares lisas podem assumir, resultando numa

maior proporo de fibras elsticas nos casos mais graves da doena.

Encontramos tambm um aumento de fibras elsticas na camada de

msculo liso de vias areas grandes e pequenas em pacientes que faziam

uso regular de corticosterides em relao aos que no faziam, sugerindo

que o tratamento antiinflamatrio pode alterar o contedo de fibras elsticas

na camada muscular lisa. So escassos os dados referentes ao uso de

terapias para asma sobre a composio da MEC. Na doena estvel, o uso

de corticosteride inalado por 6 semanas no alterou a composio de

colgeno III (Bergeron et al., 2005), j um estudo com desafios alrgicos,

demonstra que a composio de MEC aumentou em respostas aos alrgicos

e, apesar de diminuir as clulas inflamatrias, aumentou o contedo de

biglicano na mucosa brnquica de asmticos quando comparado a

indivduos controles (De Kluijver et al., 2005). Portanto, tratamento com

corticosteride pode paradoxalmente aumentar certas protenas da MEC.

No se conhece porm, o efeito funcional destes achados.

Discusso

54

No tecido de adultos, o reparo funcional das fibras elsticas

prejudicado, pois demanda uma reexpresso coordenada da incorporao

de molculas de elastina nas fibras elsticas (Shifren e Mecham, 2006).

Sendo possvel especular que, embora haja um aumento de fibras elsticas

no MLB de asmticos, essas fibras elsticas apresentam uma estrutura

anormal, com prejuzos na sua funcionalidade. Este fato pode contribuir para

mecanismos alterados de contrao e relaxamento do MLB na asma.

Os proteoglicanos (PGs) integram uma famlia de protenas,

possuindo importantes funes biolgicas (Iozzo, 1985). Uma dessas

protenas, o versicam, capaz de regular o contedo hdrico e a resilincia

dos tecidos (De Kluijver et al., 2005). Estudos prvios tm demonstrado um

aumento do versicam na camada interna de grandes e pequenas vias

areas em casos de asma, porm diferenas no foram detectadas na

camada de MLB (De Medeiros et al., 2005; Pini et al., 2007; De Kluijver et

al., 2005). Pini et al. (2007) recentemente comparou a rea de versicam no

MLB num pequeno grupo de pacientes com asma moderada e grave, e

comparou com indivduos controles, e tambm no encontrou diferenas

significativas entre os grupos. O aumento do versicam observado na camada

interna de vias areas pode estar relacionado ao acmulo de edema

encontrado nessa regio. Esses achados indicam que as alteraes da MEC

podem variar entre diferentes compartimentos das vias areas (Brightling et

al., 2002). Entender a relao entre as estruturas das vias areas e funo

na asma, depender do estudo da composio e propriedades mecnicas

dos componentes alterados em cada compartimento da via area e no

Discusso

55

parnquima circundante. Seria extremamente interessante conectar os

nossos achados com os dados de funo pulmonar dos pacientes deste

estudo, mas infelizmente esses dados de funo pulmonar no esto

disponveis na grande maioria dos casos. Estudos correlacionando a

estrutura das vias areas e a funo pulmonar na asma certamente sero

necessrios para aumentar a compreenso dos nossos resultados.

A fibronectina uma protena de matriz tambm expressa no MLB, e

apresenta um contedo aumentado na parede da via area na asma

(Roche et al., 1989). Embora nosso estudo seja o primeiro a demonstrar

que a fibronectina est aumentada nas grandes vias areas de indivduos

com asma, existem muitas evidncias in vitro que a fibronectina influencia

bastante as funes biolgicas do MLB na asma. A fibronectina apresenta

efeitos biolgicos na proliferao do MLB (Hirst et al., 2000), migrao

(Parameswaran et al., 2004), e sobrevivncia da clula (Freyer et al.,

2001). O aumento do contedo de fibronectina no MLB nas grandes vias

areas de asmticos por ns descritos pode ento, estar contribuindo

criticamente para a possvel hiperplasia do MLB observada na asma. Chan

et al. (2006) demonstraram que, in vitro , clulas do msculo liso brnquico

de asmticos secretam mais fibronectina, e que esta secreo pode

contribuir autocrinamente para elevar os nveis de eotaxina dependente de

IL-13.

Por outro lado, o aumento observado de fibronectina associado ao

aumento de fibras elsticas no msculo liso de grandes vias areas de

asmticos pode levar a um aumento da resistncia do tecido deformao,

Discusso

56

representando um efeito protetor, promovendo uma maior pr-carga

contrao do MLB, opondo-se ao seu encurtamento e conseqentemente o

estreitamento da via area.

A composio da MEC pode estar tambm influenciando na contrao

do msculo liso brnquico (Zhang e Gunst, 2008). Os colgenos tipos I e III so

os mais abundantes colgenos fibrilares no tecido muscular, enquanto que o

colgeno IV o maior componente da membrana basal (Kovanen, 2002).

Estudos in vitro tm demonstrado que o MLB de asmticos secreta maior

quantidade de colgeno (Johnson et al., 2004). In vivo, alguns estudos

detectaram aumento de colgeno na submucosa bronquial de asmticos

(Roche et al., 1989; Wilson e Li, 1995; Benayoun et al., 2003) , enquanto que

resultados conflitantes so encontrados na literatura (Chu et al., 1998).

Bergeron et al. (2005) analisaram bipsias endobrnquicas e transbrnquicas

de pacientes com asma leve e moderada, no observando diferena entre as

vias areas grandes e pequenas ao analisar o contedo de colgeno III na

submucosa. Nossos resultados esto de acordo com Chu et al. (1998),

mostrando que no h diferena significativa do contedo dos colgenos

analisados no MLB de asmticos em comparao com o MLB de indivduos

controles, utilizando colorao de Sirius Red e imunohistoqumica para a

marcao de colgenos. O aumento de colgeno fibrilar na camada do MLB

poderia diminuir a resposta broncodilatadora a estmulos mecnicos e

farmacolgicos, ou mesmo, contribuir para a obstruo irreversvel das vias

areas. Por outro lado, uma fibrose na regio da mucosa poderia agir limitando

a fora de transferncia entre as clulas do msculo liso brnquico e desse

Discusso

57

modo diminuindo a broncoconstrio (Okazawa et al., 1995), hiptese esta no

sustentada pelos nossos dados.

Diferentes expresses de metaloproteinases tm sido associadas

patognese da asma. Alm de degradarem os componentes da MEC e

serem responsveis em grande parte pelo turnover dos elementos da MEC

(Atkinson e Senior, 2003), as MMPs esto envolvidas no trfego das clulas

inflamatrias, nos processo de defesa e reparo tissular (Greenlee et al.,

2007). Observamos no presente estudo aumento da expresso de MMP-9 e

MMP-12, mas no de MMP-1e MMP-2, ou TIMP-1 e TIMP-2 nos feixes de

MLB nos casos de asma fatal. Esses dados favorecem um ambiente

proteoltico na camada de MLB, especialmente envolvendo MMPs com

atividade elastoltica, com possveis ciclos repetidos de degradao da

matriz seguidos de reparo inadequado. Interessante ressaltar que, o

aumento da expresso de MMP-9 e MMP-12 no MLB sugerem um processo

dinmico que pode ser amenizado com terapia.

bem conhecida a super expresso de MMP-9 na asma,

particularmente em pacientes com asma grave (Wenzel et al., 2003), e

durante exacerbaes (Oshita et al., 2003). Clulas inflamatrias e clulas

estruturais pulmonares, incluindo clulas da musculatura lisa brnquica

podem expressar MMP-9. interessante observar que no presente estudo a

MMP-9 apresentou-se aumentada no MLB de fumantes quando comparada

a indivduos no fumantes. Assim como a MMP-9, a MMP-12 tem ao de

elastase, e tambm capaz de clivar colgeno tipo IV, fibronectina, laminina

e gelatina (Xie et al., 2005). O presente estudo encontrou aumento da

Discusso

58

expresso de MMP-12 no MLB de indivduos asmticos, e uma correlao

positiva desta protease com as fibras elsticas, consistente com a idia de

que um turnover dinmico de fibras elsticas ocorra na asma. No foram

observadas diferenas na expresso dos inibidores de metaloproteinases

teciduais na MLB, refletindo uma perda do equilbrio entre MMPs e TIMPs,

com aumento da atividade das MMPs.

O presente estudo tem importantes limitaes:

1) Dados clnicos e funcionais limitados dos indivduos asmticos, que

no nos permitem traar correlaes fidedignas entre os nossos achados;

2) Os indivduos controles apresentam histologia pulmonar normal,

porm no eram desprovidos de outras doenas; no sabemos o quanto as

doenas de base podem ter influenciado nosso resultado. No entanto, por

termos selecionados pulmes com estrutura de vias areas normais, essa

influncia de outras patologias pode ser minimizada.

3) No foi possvel realizar as coloraes de imunohistoqumica nos

casos de Asma No Fatal de Perth. Os casos de nossa colaborao

australiana exibiam padres de colorao bastante distintos dos nossos,

possivelmente pelo maior tempo de fixao dos casos em formol. Sabe-se

que a fixao em formol por tempo prolongado acarreta a perda de eptopos

necessrios para o sucesso da reao imunohistoqumica. Portanto,

optamos por no comparar os nossos achados imunohistoqumicos com o

de Perth, a interpretao dos resultados seria bastante difcil e

possivelmente no correta. No entanto, descrevemos o contedo do

colgeno total e das fibras elsticas, as duas principais protenas da MEC

pulmonar, nos casos de Asma Fatal, Asma No Fatal e Controle. Estas

Discusso

59

protenas provavelmente tm importante papel na mecnica da musculatura

lisa brnquica. Alm disso, os nossos dados histoqumicos do contedo do

colgeno total realizados nos trs grupos foram confirmados pela

imunohistoqumica nos casos de So Paulo.

Encontramos correlaes estatisticamente significativas entre algumas

protenas e idade e incio de asma, embora a relevncia clnica destes

achados seja obscura, Bai et al. (2000) tambm demonstram uma relao

entre idade e frao de rea de componentes da MEC no MLB na asma.

Os dados atuais baseiam-se em estudos histoqumicos e

imunohistoqumicos. Sendo que poderia ser til a confirmao de nossos

achados utilizando estudos de RNA. Infelizmente, tentativas de extrair RNA

do msculo liso brnquico dissecado de material de autopsia no foi bem

sucedido, devido extensa degradao de RNA post-mortem.

Apesar da proporo de MEC no MLB das vias areas pequenas ser

maior em geral, nossos resultados apontaram para maiores alteraes nos

asmticos nas grandes vias areas. Recentemente, dois estudos (Brown et

al., 2006 e Permutt, 2007) enfatizaram o envolvimento estrutural das grandes

vias areas como principais determinantes da hiperresponsividade na asma.

possvel que, alteraes dos componentes da MEC no MLB das grandes

vias areas contribuam de maneira mais significativa nas alteraes

intrnsecas na asma que as pequenas vias areas.

6. CONCLUSES

Concluses

61

Os dados do presente estudo in vivo confirmam que componentes da

matriz extracelular (fibras elsticas e fibronectina) e seus reguladores

(metaloproteinases 9 e 12) esto alterados no msculo liso brnquico na

asma, podendo acarretar importantes conseqncias funcionais para o

msculo liso brnquico e excessivo estreitamento das vias areas na asma.

7. PERSPECTIVAS FUTURAS

Perspectivas futuras

63

As alteraes da MEC associadas inflamao crnica das vias

areas na asma devem ser consideradas em conjunto, refletindo o processo

dinmico e de interao entre os diversos componentes envolvidos. Avanos

nos estudos por imagens no-invasivas, como tomografia computadorizada

de alta resoluo e tcnicas de imagens invasivas como, microscopia

fluorescente confocal in vivo (Thiberville et al., 2007), assim como

ultrassonografia endobrnquica (Coxson et al., 2008), podero fornecer

informaes detalhadas da geometria das vias areas. O advento da

termoplastia brnquica uma das novas oportunidades teraputicas como

uma ferramenta para modificar o remodelamento brnquico (Cox et al.,

2007) em pacientes com asma grave, porm mais estudos so necessrios

para compreender os seus benefcios a longo prazo. Mais estudos buscando

um melhor entendimento sobre as relao estruturafuno dos

componentes da matriz extracelular em indivduos sem patologias

pulmonares e asmticos so necessrios para podermos compreender se as

alteraes do remodelamento so prejudiciais ou protetoras na asma.

8. ANEXOS

Anexos

65

Tabela 1. Anticorpos e procedimentos utilizados na anlise imunohistoqumica

Abreviaes: MMP = metaloproteinases; TIMP = inibidor das metaloproteinases de tecido.

Anticorpo Pr-tratamento Espcies Diluio Clone Origem

Colgeno I Citrato/pepsina Cabra 1:2000 Policlonal US Biological-Swampscott, MA, USA

Colgeno III Tripsina Camundongo 1:2500 III-53 Oncogene & Calbiochem, Darmstadt, Germany

Fibronectina Tripsina Coelho 1:4000 Policlonal Dako, Glostrup, Denmark

Versicam Sem digesto Camundongo 1:2000 2-b-1 Seikagaku Co., Tokyo, Japan

MMP-1 Citrato Camundongo 1:1500 41-1E5 Oncogene & Calbiochem, Darmstadt, Germany

MMP-2 Citrato Camundongo 1:3000 A-Gel VC2 Labvision, Fremont, CA,

USA

MMP-9 Citrato Camundongo 1:40 626-644 Oncogene & Calbiochem, Darmstadt, Germany

MMP-12 Citrato Camundongo 1:10 4D2 R&D System, Minneapolis, USA

TIMP-1 Sem digesto Camundongo 1:25 2A5 Labvision, Fremont, CA, USA

TIMP-2 Tripsina Camundongo 1:100 3A4 Labvision, Fremont, CA, USA

Anexos

66

Tabela 2. Dados clnicos do grupo de Asma Fatal, Asma No Fatal e Controle

Definio das abreviaes: ECO = envenenamento por monxido de carbono; DCV = doenas cardiovasculares; DH = doenas hepticas; EX = ex-fumante; F = feminino; HGI = hemorragia gastroin