Construção de mutantes em RNases em...

Universidade de Lisboa

Faculdade de Ciências

Departamento de Biologia Vegetal

Construção de mutantes em RNases em Enterococcus

Tiago Maria de Carvalho da Costa Amado

Mestrado em Biologia Molecular e Genética

2008

Universidade de Lisboa

Faculdade de Ciências

Departamento de Biologia Vegetal


Tiago Maria de Carvalho da Costa Amado

Mestrado em Biologia Molecular e Genética

Dissertação orientada por:

Dr. Paulo Emanuel Marujo (IBET/ITQB)

Prof. Mário Almeida Santos (FCUL)

2008

i

Agradecimentos

Gostaria de agradecer em primeiro lugar à Doutora Fátima, por me ter recebido

prontamente, ter dado a oportunidade de realizar este trabalho no seu laboratório e me ter

orientado ao longo deste ano, apesar de o seu nome não constar na primeira página; ao

Doutor Paulo por ter aceitado ser meu orientador externo e ter sempre "a porta aberta" para

as minhas questões e a ambos um sincero obrigado por tudo o que me ensinaram. Aos

meus colegas de laboratórios, à Neuza e Teresa por alegrarem os dias, à Tânia, Martas,

Renata, Daniela e Frederic pelos concelhos, favores e ajudas e a todos em geral pela vossa

simpatia e por me terem mostrado os "cantos à casa".

Agradeço ao Prof. Doutor Mário Santos por ter sido o meu orientador interno e ter feito a

revisão da minha tese.

Agradeço também ao ITBQ e IBET por me terem proporcionado as condições de trabalho.

Por último gostaria de agradecer aos meus amigos, porque sim, e às pessoas para mim

mais importantes e que enchem a minha vida de cor: os meus pais Ana e Zé, a minha irmã

Marta e a minha mais-que-tudo Rita. Um obrigado sentido e carinhoso para vocês.

ii

Sumário

A expressão génica pode ser regulada a diferentes níveis. Nos últimos anos têm surgido

imensos exemplos de regulação pós-transcricional quer a nível do processamento, quer da

degradação (estabilidade) do RNA, a qual permite uma adaptação rápida a alterações no

meio extracelular.

No processo de invasão do hospedeiro, as bactérias patogénicas atravessam uma série de

condições físico-químicas muito distintas a que têm de fazer frente e se adaptar. Neste

contexto, na adaptação a condições de stress, estão envolvidos diversos mecanismos de

regulação pós-transcricional. No entanto, em enterococos, bactérias Gram-positivas

presentes em diversos ambientes e que tem emergido nos últimos anos como causadores

de infecções nosocomiais graves, não foi ainda estudada a função deste tipo de regulação

em geral e qual a sua relação com a patogenicidade. Assim, este trabalho teve como

objectivos a construção de mutantes em ribonucleases, enzimas cruciais na regulação

pós-transcricional, nomeadamente, em duas exoribonucleases, PNPase e RNase R, e em

duas endoribonucleases, RNase III e RNase J1.

O trabalho efectuado, devido à diversidade das dificuldades encontradas com cada um dos

mutantes, abrangeu uma grande gama de técnicas de biologia molecular e de genética, quer

em Escherichia coli, quer em Enterococcus faecalis.

Assim, o 'mutante' da RNase III encontra-se na última etapa do protocolo, enquanto os

'mutantes' das outras RNases se encontram na fase de confirmação das construções a

utilizar para integração em enterococos (PNPase e RNase R) ou ainda na primeira

clonagem (RNase J1). Os resultados obtidos até este momento, parecem indicar que a

RNase III é essencial em enterococos, tal como acontece em Bacillus subtilis; no entanto,

estudos adicionais serão necessários para confirmação deste resultado.

Palavras-chave: Enterococcus, ribonucleases, mutantes, OE-PCR

iii

Abstract

Gene expression can be regulated at different levels. In the past few years several examples

of post-transcriptional regulation have arise regarding the processing and degradation

(stability) of RNA molecules, which allows a rapid adaptation to changing environments.

When invading the host, pathogenic bacteria have to go through several and very distinct

extracellular conditions to which they have to adapt in order to survive. In this adaptation to

foreign stress causing factors are involved various mechanisms of post-transcriptional

regulation. However in enterococci, Gram-positive cocci present in a large variety of habitats

and that have become one of the leading cause of nosocomial infections, the function of this

kind of regulation and its relation with pathogenicity has not been studied. Thus the goal of

this work was the creation of bacteria mutants on ribonucleases namely on the

exoribonucleases PNPase and RNase R genes and on the endoribonucleases RNase III and

RNase J1. These RNases are enzymes of vital importance on the post-transcriptional

regulation processes.

Due to the diverse difficulties encountered during this work, it came to involve a great variety

of molecular and genetic techniques in both Escherichia coli and Enterococcus faecalis.

At the moment the RNase III 'mutant' is at the final stage of the protocol while the other

RNases 'mutants' are still at the construction confirmation stage before transforming

enterococci (PNPase and RNase R) or still at the first cloning step (RNase J1). The results

obtain so far seem to point RNase III as essencial, similarly to what is described in

Bacillus subtilis. Nevertheless further studies will be necessary to prove this hypothesis.

Keywords: Enterococcus, ribonucleases, mutants, OE-PCR

iv

Lista de abreviaturas

Amp - Amp

B. subtilis -

icilina

DNA - 'deoxyribonucleic acid'

Bacillus subtilis

dNTPs - 'deoxyribonucleotide triphosphate'

dsRNA - 'double-stranded ribonucleic acid'

E. - Enterococcus

E. coli - Escherichia

Ery -

coli

Eri

FCUL - Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa

tromicina

IBET - Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica

ITQB - Instituto de Tecnologia Química e Biológica

kb - kilo pares de base

LA - Luria-Bertani agar

LB - Luria-Bertani broth

M - marcador de massa molecular

MCS - 'multiple cloning site'

MIC - 'minimum inhibitory concentration'

mRNA - 'messenger ribonucleic acid'

ncRNA - 'non-coding ribonucleic acid'

nt - nucleótidos

OE-PCR - 'overlap extension by polymerase chain reaction'

ORF - 'open reading frame'

pb - pares de base

PCR - 'polymerase chain reaction'

pGh 9 - pGh

PNPase - 'polynucleotide phosphoryl

ost 9

ase

pSK+ - pBluescript

'

RNA - 'ribonucleic acid'

SK+

RNase - ribonucle

rRNA - 'ribosomal ribonucleic acid'

ase

S. - Staphylococcus

Ta - Temperatura de 'annealing'

tRNA - 'transfer ribonucleic acid'

V583 - Enterococcus faecalis

V583 ∆ABC - Enterococcus faecalis

V583

V583 ∆ABC

v

Índice Geral

1. Introdução 1

2. Contextualização e Objectivos 6

3. Materiais 7

4. Metodologia e Discussão 9

5. Perspectivas futuras 24

6. Bibliografia 25

7. Anexos 29

vi

Índice de figuras Figura 1 | Ribonucleases identificadas em B. subtilis e E. coli. 4

Figura 2 | Representação esquemática do protocolo para a 11 obtenção de mutantes em Enterococcus faecalis utilizando o pGhost 9.

Figura 3 | Conceito de 'Overlap Entension by Polymerase 12 Chain Reaction' (OE-PCR).

Figura 4 |. Quantificação dos fragmentos resultantes dos 15 PCRs I e II em gel de agarose.

Figura 5 | Obtenção dos fragmentos híbridos. 15

Figura 6 | Combinações das hibridações no passo de 'Overlap Entension'. 16

Figura 7 | PCR I+II com baixo rendimento. 17

Figura 8 | PCR I+II com o rendimento melhorado. 17

Figura 9 | Obtenção do fragmento híbrido correspondente à RNase III. 18

Figura 10 | Variabilidade nos tamanhos dos fragmentos da 18 PNPase e RNase R clonados em pSK+.

Figura 11 | Digestão dupla do pSAVE 6. 20

Figura 12 | Obtenção de transformantes de E. coli com o pSAVE 8. 20

Figura 13 | Obtenção de transformantes de E. faecalis com o pSAVE 8. 20

Figura 14 | Representação esquemática dos acontecimentos 22 de integração e excisão.

Figura 15 | Obtenção de um só tipo de integração do 23 pSAVE 8 no cromossoma de E. faecalis.

Figura 16 | Clones em que ocorreu excisão. 23

Figura Suplementar 1 | Marcadores de massa molecular. 32

vii

Índice de tabelas

Tabela Suplementar 1 | Estirpes e plasmídios utilizados neste trabalho. 29

Tabela Suplementar 2 | 'Primers' utilizados neste trabalho. 30

Tabela Suplementar 3 | Dimensões dos fragmentos esperadas ao longo 31 do protocolo.


1

1. Introdução

O termo francês “entérocoque” foi utilizado pela primeira vez numa publicação científica em

1899 por Thiercelin para descrever uma nova bactéria Gram-positiva de origem intestinal

capaz de formar pares e pequenas cadeias (1). Em 1906, Andrewes e Horna introduziram

este microorganismo no género Streptococcus com o nome de Streptococcus faecalis (2).

Um segundo microorganismo de origem fecal com características semelhantes a S. faecalis

foi isolado e denominado S. faecium por Orla-Jensen no ano de 1919 (3). Em 1933,

Lancefield cria um sistema de classificação serológica de Streptococcus com base na

composição dos antigénios bacterianos, onde os enterococos são inseridos no grupo D.

Posteriormente Sherman, em 1937, salienta o facto do termo enterococos ser utilizado com

diferentes significados, desde qualquer estreptococos de origem fecal até organismos

idênticos a S. faecalis (4). Cria então um novo sistema para a classificação dos

estreptococos que os divide em quatro grupos: piogénicos, lácticos, 'viridans' (ou orais) e

enterococos. Em 1970 Kalina propõe que os enterococos deveriam ser transferidos para um

novo género: Enterococcus (5). No entanto, isso só vem a acontecer em 1984 após um

estudo realizado por Schleifer e Kilpper-Balz em que a hibridação de DNA-DNA e DNA-

rRNA confirmam uma maior distância dos enterococos em relação aos estreptococos,

fixando assim a sua localização taxonómica em: Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales;

Enterococcaceae; Enterococcus (6). Nessa altura apenas faziam parte do novo género

E. faecalis e E. faecium mas desde então o número de espécies pertencendo ao género tem

vindo a aumentar. Actualmente pertencem ao género Enterococcus quarenta espécies

(taxonomicamente validadas) sendo E. faecalis a espécie tipo

(http://www.dsmz.de/microorganisms/bacterial_nomenclature_info.php?genus=Enterococcus

&show_all_details=1 acedido a 07/09/2008).

Os enterococos caracterizam-se por serem: bactérias Gram-positivas em forma de cocos,

podendo aparecer individualmente, aos pares ou sob a forma de pequenas cadeias, não

formarem esporos e terem um conteúdo baixo em G+C no genoma (entre os 37 e 45 mol%).

Metabolicamente são: anaeróbios facultativos, catalase e oxidase negativos, realizam

fermentação ácido láctica, possuem resistência intrínseca a vários antibióticos

(e.g. β-lactâmicos, cefaloesporinas, sulfonamidas) e são capazes de tolerar uma vasta gama

de condições de crescimento, nomeadamente a presença de 40% de sais biliares, 6,5% de

NaCl, pH entre 4,6 e 9,6 e temperaturas entre os 10 e os 45 ºC, sendo ainda capazes de

sobreviver a 60 ºC durante 30 minutos (7, 8). Estas bactérias são parte natural da microbiota

intestinal de humanos e animais mas são também frequentemente encontradas em plantas,


2

alimentos, solo e águas superficiais, provavelmente devido à contaminação fecal e à

tolerância intrínseca a condições ambientais adversas (9).

Este grupo de bactérias ácido lácticas é importante não só na microbiologia ambiental como

também na microbiologia clínica e alimentar. Os enterococos têm um papel benéfico

importante, considerado por muitos essencial, na produção de muitos queijos tradicionais,

inclusive queijos portugueses, o que se deve provavelmente à sua capacidade proteolítica,

lipolítica e de metabolizar o citrato (7). Estão igualmente envolvidos na fermentação de

vários outros produtos tradicionais, especialmente de origem mediterrânea, como salsichas

e azeitonas (10). Em alguns países estas bactérias são ainda utilizadas na constituição de

probióticos aplicados em produtos alimentares, como iogurtes e leites, e em produtos

farmacêuticos (10). A importância do uso de estirpes bacterianas como probióticos deve-se

às suas diversas acções benéficas, nomeadamente, a inibição de microrganismos

patogénicos, o reforço das barreiras mucosas, a estimulação do sistema imunitário e a

diminuição dos níveis de colesterol (8). Apesar destes seus papéis benéficos, os

enterococos estão também associados ao deterioramento de alimentos, em especial carnes,

e mais preocupantemente, a uma enorme variedade de infecções tanto em animais como no

ser humano (8). Estes patogénios oportunistas são capazes de provocar infecções ao nível

da corrente sanguínea, endocárdio, sistema urinário, sistema nervoso central, abdómen,

feridas e queimaduras, entre outros (11). O número de enterococos resistentes a

antibióticos, com particular destaque para a vancomicina, tem vindo a aumentar de uma

forma preocupante, o que se deve à eficiente capacidade dos enterococos para transferirem

e incorporarem material genético e também à incorrecta utilização dos antibióticos (12).

Existem várias características envolvidas na patogenicidade dos enterococos (7, 11):

− Síntese de citolisina (Cyl; proteína com actividade simultaneamente hemolítica e

bacteriocida);

− Síntese de substância de agregação (Agg; envolvida na conjugação bacteriana e

induzida por feromonas);

− Síntese de uma proteína de superfície extracelular (Esp; envolvida na adesão e

evasão à resposta imune do hospedeiro);

− Síntese de uma endoprotease (GelE; envolvida na degradação de várias proteínas

bioactivas);

− Síntese de outras enzimas hidrolíticas (e.g. hialuronidase e desoxirribonuclease);

− Formação de biofilmes;

− Presença de vários mecanismos de resistência a antibióticos, quer intrínseca

(e.g. β-lactâmicos, cefaloesporinas, sulfonamidas) quer adquirida (e.g. ampicilina,

vancomicina, eritromicina).


3

Estas características contribuíram para que, nos últimos anos, os enterococos se tornassem

numa das principais causas de infecção nosocomial em todo o mundo. Estas infecções são

provocadas em cerca de 80% dos casos pela espécie E. faecalis, sendo a maioria dos

restantes 20% causados pela espécie E. faecium (13).

Devido ao forte impacto dos enterococos na saúde humana, tem-se vindo a discutir com

alguma preocupação a segurança da utilização dos enterococos na fermentação e em

produtos probióticos (8). Determinar se há um risco geral ou se o risco se aplica apenas a

determinadas espécies ou estirpes e elaborar novas estratégias para combater as infecções

são alguns dos objectivos que se tem procurado alcançar. Os enterococos assumem assim

uma posição paradoxal pois são benéficos na fermentação de diversos alimentos e na

acção como probióticos, mas acarretam uma potencial patogenicidade (14).

Uma das primeiras estirpes de enterococos resistentes à vancomicina foi isolada em 1989

de uma amostra clínica e denominada E. faecalis V583 e conta com o seu cromossoma e

plasmídios sequenciados desde 2003 (15, 16). Esta estirpe tem sido alvo de vários estudos

e descobertas, nomeadamente a caracterização de uma ilha de patogenicidade (que contém

alguns dos factores de virulência acima mencionados), análise do transcriptoma e a

descrição de sistemas de dois componentes envolvidos em vários mecanismos celulares

(17-20). Foram identificados e estudados até à data dezoito sistemas de dois componentes

no genoma de Enterococcus faecalis, alguns dos quais representam potenciais alvos

terapêuticos (18, 21, 22). Entre estes encontram-se um sistema envolvido na resistência à

vancomicina (VanSB-VanRB) e um sistema envolvido na formação de biofilmes e produção

de factores de virulência (FsrC-FsrA) (23-25). Os sistemas de dois componentes são um

mecanismo muito utilizado pelos organismos procariotas como forma de responder a sinais

ou condições exteriores. Levam tipicamente à regulação da expressão génica, por exemplo,

de genes relacionados com o metabolismo ou a virulência. Apesar de nos últimos anos se

terem vindo a descobrir muitos genes envolvidos na virulência de enterococos, poucos

estudos foram ainda feitos para explicar a sua expressão diferencial e muito pouco se sabe

acerca dos mecanismos envolvidos na regulação da sua expressão (26-31).

A expressão de um gene até ao produto final, atravessa vários estádios, em que cada um

deles oferece uma oportunidade de regulação. Embora durante muito tempo se tenha

pensado que a iniciação da transcrição seria a etapa mais importante no controlo da

expressão génica, têm surgido nos últimos anos diversos exemplos importantes de

regulação ao nível pós-transcricional (32-34). São estes últimos, por vezes bastante

complexos, que comandam o destino e a funcionalidade de uma molécula de RNA através

do controlo da sua maturação, estrutura e degradação (estabilidade). Neste tipo de


4

regulação estão envolvidas diversas proteínas bem como outras moléculas de RNA

denominados RNAs reguladores ou não codificantes (ncRNAs). Entre as várias proteínas

envolvidas na regulação pós-transcricional estão as ribonucleases (RNases) e as

'chaperones' de RNA (e.g. Hfq e stpA).

As ribonucleases são enzimas capazes de processar e degradar moléculas de RNA, sendo

um dos principais e mais importantes intervenientes na regulação pós-transcricional. As

RNases exibem diferentes estruturas e modos de acção e podem ser agrupadas em duas

classes consoante o forma como clivam o RNA: Endoribonucleases e Exoribonucleases. As

primeiras clivam o RNA internamente (e.g. RNase III, RNase P, RNase J1) enquanto que as

segundas clivam o RNA a partir de uma das extremidades, nucleótido a nucleótido (e.g.

PNPase, RNase R, RNase J1) (35, 36). Em Escherichia coli e em Bacillus subtilis, bactérias

modelo nos estudos de degradação e processamento de RNA, estão identificadas vinte e

sete ribonucleases (36, 37) (Figura 1).

Figura 1 | Ribonucleases identificadas em Bacillus subtilis e em Escherichia coli. Algumas das

exoribonucleases (em cima) e endoribonucleases (em baixo) são partilhadas por B. subtilis e E. coli

(centro), enquanto as restantes foram apenas identificadas numa das espécies (esquerda ou direita

respectivamente). A vermelho estão representadas as ribonucleases essenciais.


5

O papel fundamental das RNases para o correcto funcionamento da célula advém do facto

de, para além de todo o RNA ter de ser, mais tarde ou mais cedo, degradado a nucleótidos

para permitir a reciclagem dos mesmos, estas proteínas actuarem ao nível dos vários tipos

de RNA: tRNA, rRNA, mRNAs e ncRNAs.

Assim as RNases acabam por estar directa ou indirectamente envolvidas em todos os

processos de que estes RNAs fazem parte, nomeadamente na formação das subunidades

ribossomais (rRNA), na tradução (tRNA e mRNAs) e nos variados processos a que estão

associados os ncRNAs (38-42). A identificação de novas moléculas pertencentes a este

último grupo, ncRNAs, e a determinação das estruturas dos RNAs, tem sido feita a um ritmo

alucinante nos últimos anos. Embora a função de muitos destes ncRNAs seja ainda

desconhecida, alguns deles comportam-se como reguladores chave em respostas

adaptativas face a condições e sinais do meio exterior, como é o caso do stress imposto por

iões, produção de luminiscência, resistência a antibióticos e controlo da virulência (25, 43,

44). Como exemplos de RNAs reguladores envolvidos no controlo da virulência bacteriana

encontram-se o RNAIII em Staphylococcus aureus, o RsmB' em Erwinia carotovora e o

RNAα em Vibrio anguillarum, entre muitos outros (32, 43). Assim, tendo em conta o referido

anteriormente é natural que as ribonucleases estejam também envolvidas no controlo da

virulência. Na realidade têm sido publicados diversos artigos que relatam o envolvimento

das RNases na virulência bacteriana. São exemplos disso a RNase R, necessária para a

expressão da virulência em Shigella flexneri, Escherichia coli e Aeromonas hydrophila; a

PNPase, que regula a virulência e persistência de Salmonella enterica e a RNAse III

envolvida na regulação da virulência em Staphylococcus aureus (45-49).

Um profundo conhecimento dos mecanismos e do modo como controlam a expressão de

factores de virulência poderá abrir novas perspectivas na quimioterapia antibacteriana.


6

2. Contextualização e objectivos

O laboratório onde este trabalho foi realizado, dedica-se ao estudo dos mecanismos de

resposta a diferentes stresses (biocidas, iões metálicos e antibióticos), da resistência a

antibióticos em enterococos e, de uma forma mais global, ao estudo da virulência e

patogenicidade destas bactérias (50-54).

Dado não existir, até à data, nenhum estudo sobre a regulação pós-transcricional, bem

como a função das RNases na virulência de enterococos, decidiu-se levar a cabo a

construção de mutantes em ribonucleases. Estes mutantes constituirão ferramentas

essenciais para estudar os efeitos dessas enzimas ao nível do metabolismo global da célula

e, em particular, de factores de virulência específicos, da patogenicidade e da capacidade

de resistência a antibióticos (11, 32, 55). Neste contexto, o objectivo deste trabalho foi a

construção de mutantes em RNases, bem como a familiarização com técnicas de biologia

molecular e de genética associadas à construção de mutantes em Enterococcus faecalis.

Para este trabalho foram escolhidas quatro RNases: PNPase, RNase R, RNase III e RNase

J1.


7

3. Materiais

Estirpes e plasmídios

- As estirpes bacterianas e os plasmídios utilizados neste trabalho

estão listados na Tabela 1.

Conservação de estirpes

- E. coli (-80 ºC): 1 ml de cultura bacteriana + 0,2 ml de glicerol

80%. E. faecalis (-20 ºC): 0,8 ml de cultura bacteriana + 0,2 ml de glicerol 80%. E. faecalis

(-80 ºC): 0,5 ml de cultura bacteriana + 0,5 ml de glicerol 40%.

Condições de crescimento

- Para o crescimento de E. coli foram utilizados os meios

Luria-Bertani broth (LB) e Luria-Bertani agar (LA) suplementados, quando apropriado, com

antibiótico: [ampicilina] = 100 µg/ml; [eritromicina] = 150 µg/ml. Em alguns casos, em que

estava presente o gene repórter lacZ, o meio foi também suplementado com X-GAL (80

µg/ml) e IPTG (0,5 mM), adquiridos à Apollo Scientific e à Promega, respectivamente.

Células de E. faecalis foram crescidas em M17 (56) suplementado com glucose (0,5%) e,

quando apropriado, com antibiótico: [eritromicina] = 30 µg/ml. A incubação das bactérias foi

feita a 27, 37 ou 42 ºC consoante as características das estirpes e o protocolo.

Enzimas, reagentes e materiais de biologia molecular

- As enzimas de restrição (PstI, SalI,

SmaI, SacI) e a 'T4 DNA ligase' utilizadas foram adquiridas à New England Biolabs, sendo

as restrições e ligações feitas de acordo com as instruções do fabricante. Para as reacções

de PCR a partir de colónias foi utilizada a MasterMix adquirida à 5Prime (62,5 U/ml 'Taq

DNA Polymerase'; 125 mM KCl, ®-CA360 0,5%; 500 µM de cada dNTP; 75 mM Tris-HCl pH

8,3; 3,75 mM Mg(OAc)2 ; 0,25% Igepal e estabilizadores). Para as restantes reacções de

PCR foi utilizada a 'VentR DNA polymerase' e respectivo tampão, adquiridos à New England

Biolabs, e os dNTPs (dATP, dTTP, dCTP e dGTP) adquiridos individualmente à Promega.

Todos os 'primers' utilizados (Tabela Suplementar 2) foram desenhados neste estudo tendo

por base o genoma de Enterococcus faecalis V583 publicado (GenBank, número de acesso

AE016830) e as sequências dos vectores utilizados: pBluescript SK+ (Stratagene) e

pGhost 9 (UBLO, Jouy-en-Jousas). Os 'primers' foram encomendados à MWG. A água

utilizada foi sempre ultra-pura. As reacções de PCR foram realizadas no aparelho 'T3000

Thermocycler' da Biometra. Os serviços de sequenciação foram realizados pela BaseClear.

O software utilizado para a análise das sequências foi o Vector NTI da Invitrogen. Os

marcadores de massa molecular utilizados na migração do DNA em géis de agarose foram

o 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) e o GeneRule Express (Fermentas) (Figura

Suplementar 1).


8

Extracção e purificação de DNA

- A extracção de DNA plasmídico, a purificação de produtos

de PCR e de digestões e a extracção e purificação de DNA a partir de géis de agarose foi

efectuada recorrendo a 'kits' da Qiagen e da Macherey-Nigel e de acordo com as instruções

do fabricante.

Células electrocompetentes e electroporação

- A preparação de células electrocompetentes

de E. coli e de E. faecalis foi feita segundo os protocolos de Dower et al. (1988) e de

Dunny et al. (1991), respectivamente. A electroporação, quer de E. coli quer de E. faecalis,

foi realizada no 'Gene Pulser Xcell' da Bio-Rad seguindo as instruções do fabricante e

utilizando o programa pré-definido 'Bacterial; 2. E. coli; Exponential decay; 25 µF; 200 ohm;

2,5 kV; 0,2 cm cuvette; 20-40 µl cell vol'.


9

4. Metodologia e Discussão

A estirpe em que se pretendeu criar mutações foi a E. faecalis V583 ∆ABC. ∆ABC significa

que esta estirpe não possui os três plasmídios que são característicos da estirpe V583

original (pTEF1, pTEF2, pTEF3), isolada em 1989 de uma amostra clínica e descrita como

um dos primeiros isolados de enterococos resistentes à vancomicina (15).

A estirpe V583 ∆ABC é sensível à eritromicina, uma vez que os genes responsáveis pela

resistência à eritromicina em V583 se localizam no plasmídio pTEF1. Esta característica é

importante na medida em que a marca de selecção do vector utilizado, o pGhost 9, na

transformação desta estirpe é o gene ermC que confere resistência à eritromicina.

A escolha desta estirpe deveu-se ao facto de ser a única pertencente ao género com o

genoma totalmente sequenciado na altura do início do trabalho, o que permitiu, através da

comparação com o genoma de B. subtilis, identificar os genes de ribonucleases presentes

no seu genoma (16). Foram escolhidos três genes para se criarem mutantes de delecção: o

gene pnpA (EF3064), o gene vacB (EF2617) e o gene rnc (EF3097), que codificam para a

PNPase, RNase R e RNase III, respectivamente. Foi também escolhido o gene da RNase J1

(EF2924) mas para se inserir um codão de terminação prematuro através de uma mutação

pontual. Escolheram-se estas RNases por abrangerem mecanismos de degradação

distintos.

A PNPase, 'polynucleotide phosphorylase', é uma exoribonuclease que remove os

nucleótidos de uma molécula de RNA de um modo processivo e no sentido 3' → 5'. A

reacção é fosforolítica e dependente de fosfato, uma vez que para haver a quebra de uma

ligação fosfodiester e se libertar um nucleótido 5' - difosfato é necessário a presença de uma

molécula de fosfato inorgânico (Pi). A PNPase é uma 'cold shock protein' sendo portanto

importante para a célula fazer face a temperaturas baixas. A inactivação do seu gene

provoca um fenótipo sensível a baixas temperaturas, nomeadamente com paragem do

crescimento por volta dos 16 ºC, aumento do tempo de meia-vida (ou semi-vida) do mRNA

total, aumento da susceptibilidade à tetraciclina e algumas alterações da morfologia celular

(57-59). Em B. subtilis, a PNPase é tida como uma das principais ribonucleases 3' → 5'

envolvidas na degradação do RNA, embora a RNase R também tenha um papel muito

importante, especialmente no que diz respeito à degradação de RNAs com estruturas

secundárias mais estáveis, como as presentes nos tRNAs e rRNAs, as quais a PNPase tem

dificuldades em ultrapassar. A RNAse R é, à semelhança da PNPase, uma exoribonuclease

3' → 5' e uma 'cold shock protein'. A degradação do RNA é hidrolítica, feita de um modo

processivo e cujo produto final são pequenos oligonucleótidos (58, 60).


10

Estas duas ribonucleases foram seleccionadas devido ao importante papel que assumem na

degradação e maturação de RNA em B. subtilis (organismo modelo no estudo de

degradação de RNA em bactérias Gram-positivas) e por, como já referido na introdução,

ambas já terem sido implicadas na regulação da virulência bacteriana (45-48).

A RNAse III é uma endoribonuclease que reconhece e cliva RNA em cadeia dupla (dsRNA)

de uma forma hidrolítica. A família das RNases III é composta por três classes. A RNAse III

bacteriana é a mais estudada e melhor caracterizada até à data e pertence à classe 1 (61).

Foi escolhida devido ao facto de ter sido descrita como essencial em B. subtilis e de,

juntamente com o RNAIII, regular a virulência em Staphylococcus aureus, cujo sistema de

virulência, agr, apresenta grande semelhança com o sistema fsr em Enterococcus faecalis

(49, 62, 63).

A RNase J1 foi seleccionada por ser uma RNase sem paralelo pois é simultaneamente uma

endoribonuclease e uma exoribonuclease. Foi descoberta em B. subtilis onde está envolvida

na maturação do rRNA; juntamente com a RNase J2 tem um impacto profundo na

expressão génica e apresenta-se como essencial para a viabilidade celular. Proteínas

ortólogas têm sido identificadas em diversos grupos procariotas (e.g. cianobactérias,

alfa-proteobactérias e alguns grupos de arqueobactérias). A sua actividade endonucleolítica

é comparada à da RNase E de E. coli e a sua actividade exonucleolítica de 5' → 3', única,

pois até à data pensava-se que as bactérias apenas eram capazes de degradar

exonucleoliticamente RNAs no sentido 3' → 5', faz com que a degradação de moléculas de

RNA possa acontecer a partir de ambas as extremidades, quer 5' quer 3', à semelhança do

que acontece nos eucariotas (36, 64-69).

A Figura 2 representa esquematicamente o protocolo seguido para a obtenção dos

mutantes.


11

Figura 2 | Representação esquemática do protocolo para a obtenção de mutantes em

Enterococcus faecalis utilizando o pGhost 9. Adaptado de Heckman e Pease (2007).

PCR

Sequenciação

E. faecalis

E. coli

E. faecalis com pGhost 9 : fragmento mutado

integrado no genoma (integrantes)

Passagens sucessivas em meio

sem antibiótico

E. faecalis com

gene selvagem

E. faecalis com gene mutado

Identificação colónias

sensíveis ao antibiótico

pGh 9

pGh 9

pSK+

E. coli

*

* E. faecalis com pGhost 9 : fragmento mutado

livre no citoplasma (transformantes)

'Choque térmico'

27 ºC 2h

42 ºC 2h


12

O primeiro passo é a construção de um fragmento de DNA recombinante composto pela

junção das duas zonas adjacentes ao gene de interesse. O objectivo final é a substituição

da zona homóloga no cromossoma, contendo o gene selvagem, pela construção por nós

criada, onde parte do gene não se encontra presente, obtendo-se assim um mutante de

delecção. Para a construção deste fragmento recorreu-se à técnica de 'overlap extension by

polymerase chain reaction' (OE-PCR). Esta técnica inovadora foi descrita pela primeira vez

por Horton e colaboradores em 1989 e veio revolucionar a engenharia genética, dado que

permite a fusão de duas ou mais moléculas de DNA numa só de um modo preciso,

independente da sua sequência nucleotídica e sem o uso de enzimas de restrição ou de

ligação (70-73). O fundamento da fusão de duas moléculas de DNA numa só ('splicing')

utilizando o OE-PCR está esquematizado na Figura 3.

Figura 3 | Conceito de 'Overlap Entension by Polymerase Chain Reaction' (OE-PCR). Os 'primers' a e

c são complementares à cadeia 3' → 5' e os 'primers' b e d são complementares à cadeia 5' → 3'. Os

'primers' a e d são denomidados de 'externos'. Os 'primers' b e c são complementares e

denominados de 'internos'. A vermelho está representada a porção de DNA que se pretende eliminar.


13

Os dois fragmentos a serem unidos são produzidos separadamente numa reacção de PCR

(PCR I e PCR II). São utilizados 'primers' internos complementares, c e d, de modo a que os

fragmentos produzidos contenham nas extremidades sequências complementares.

Seguidamente os produtos destes dois PCRs são misturados e utilizados num novo PCR

(PCR I+II). No passo de 'annealing', as cadeias com a sequência complementar na sua

extremidade 3' podem emparelhar e servir de 'primer' uma à outra, permitindo a extensão

das cadeias levada a cabo pela DNA polimerase (Figura 3). A este passo dá-se o nome de

'overlap extension'. A molécula de DNA produzida desta forma pode ser seguidamente

amplificada do modo exponencial característico do PCR, através dos 'primers' externos a e

d. Estes 'primers' podem conter locais de restrição de modo a permitir a clonagem do

fragmento obtido. Assim, o produto final deste PCR será uma molécula de DNA em que as

duas sequências originais estão agora concatenadas.

No caso esquematizado na Figura 3, o OE-PCR é utilizado para fundir as duas regiões

adjacentes, assinaladas a verde e a azul, a uma região de interesse, assinalada a vermelho,

de modo a se obter um fragmento idêntico ao inicial mas sem a região de interesse. Foi com

este intuito, o de criar uma delecção sítio-específica, que esta técnica foi utilizada,

nomeadamente para a eliminação quase na totalidade da sequência do gene alvo (excepto

para o caso da RNAse J onde se recorreu à criação de uma mutação pontual).

No entanto esta técnica, mantendo sempre o mesmo fundamento, permite a obtenção de

diferentes construções no que diz respeito à zona da fusão. Nesta região de justaposição

das duas moléculas é possível realizar vários tipos de mutações sítio-específicas: inserções,

substituições ou delecções de um ou vários nucleótidos. Esta técnica pode ser ainda

utilizada para a remoção de intrões e para a criação de genes híbridos que vão permitir a

criação de proteínas de fusão de interesse, por exemplo na área da imunologia e da biologia

molecular e celular (70-72, 74, 75). É na escolha da sequência dos 'primers' internos (b e c)

que se define qual das possibilidades referidas nos parágrafos anteriores é aplicada.

É importante que estes PCRs sejam realizados utilizando uma DNA polimerase de alta

fidelidade, i.e. com baixa taxa de erro, de modo a minimizar-se a probabilidade de

introdução de mutações não pretendidas. A DNA polimerase utilizada deverá também ter a

característica de não adicionar adeninas no final da polimerização (3'), de modo a que no

passo de 'overlap extension' no PCR I+II não haja a introdução destas adeninas na

sequência do fragmento final.

Neste trabalho recorreu-se à técnica de OE-PCR para se proceder à eliminação quase

completa dos genes da PNPase (pnpA), RNase R (vacB) e RNase III (rnc) e à inserção de

um codão de terminação prematuro no gene da RNase J1 (EF2924). Ao escolher a região a


14

eliminar, definida pela sequência dos 'primers' internos b e c, teve-se em conta a presença

de outras ORFs e tentou-se ao máximo que as alterações introduzidas não interferissem

com a sua expressão. No caso do gene pnpA a delecção feita deixou presentes os tripletos

codificantes para os últimos 21 aminoácidos da extremidade carboxilo da proteína devido ao

facto de na cadeia complementar e ainda dentro da zona codificante para a PNPase, existir

um codão de terminação correspondente a uma outra ORF (EF3063). Na delecção do gene

vacB mantiveram-se os nucleótidos correspondentes aos 27 aminoácidos da extremidade

carboxilo, devido à sobreposição do seu codão de terminação com a sequência promotora

da ORF EF2616, e aos 13 aminoácidos da extremidade amina, devido à sobreposição

parcial do codão de iniciação com o codão de terminação da ORF EF2618. No que diz

respeito ao gene rnc, e à semelhança do gene vacB, foram mantidos os nucleótidos

equivalentes aos 16 aminoácidos da extremidade carboxilo devido a uma sobreposição do

codão de terminação com a sequência promotora da ORF EF3096. No gene da RNase J1

foi introduzido um codão de terminação prematuro deixando os tripletos codificantes para os

primeiros 57 aminoácidos devido à sobreposição com a região 3' da ORF EF2923.

Na escolha da posição dos 'primers' externos a e d teve-se em consideração a sua

sequência e, principalmente, a distância ao 'primer' interno correspondente, b e d,

respectivamente. Esta distância deve ser aproximadamente 1000 pares de base de modo a

permitir a recombinação com a sequência homóloga do cromossoma (Figura 2). A estes

'primers' foi adicionado um local de restrição compatível com ambos os vectores utilizados.

Na Tabela Suplementar 3 estão representados os tamanhos esperados dos fragmentos de

DNA nas várias etapas do protocolo. Para facilitar a referência foi atribuída uma letra a cada

RNase: A para a PNPase, B para a RNase R, C para a RNase III e D para a RNase J1.

Nos primeiros PCRs, PCR I e PCR II (Figura 3), não foram encontradas dificuldades em

obter os fragmentos pretendidos. O DNA molde para cada um destes PCRs foi um

fragmento amplificado por PCR a partir do DNA genómico de E. faecalis V583 ∆ABC e

utilizando os 'primers' externos (a e d) respectivos a cada RNase (Tabela Suplementar 3). As

moléculas obtidas nestes PCRs serviram de DNA molde para o PCR seguinte, o PCR I+II.

No entanto aquando da realização deste último PCR, não se verificou a amplificação de

nenhum fragmento com o tamanho esperado. Na tentativa de resolver o problema fizeram-

se variar algumas das condições que normalmente estão associadas à optimização da

reacção de PCR:, nomeadamente a quantidade inicial de DNA molde, a temperatura de

'annealing' (Ta), o tempo das várias etapas da reacção: desnaturação, emparelhamento e

extensão, o número de ciclos e a quantidade de DNA polimerase. Esta estratégia revelou-se

infrutífera quaisquer que fossem as alterações feitas. A segunda abordagem ao problema


15

consistiu em seguir rigorosamente um protocolo da revista Nature Protocols intitulado: 'Gene

splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension' (75). A quantificação do DNA

para o cumprimento deste protocolo foi feita através de leituras no espectrofotómetro e em

gel de agarose, utilizando o marcador quantitativo GeneRuler Express (Figura 4 e Figura

Suplementar 1). Apesar de muito bem estruturado e parecer bastante promissor, este

protocolo não conduziu à formação do fragmento híbrido desejado. Numa nova tentativa

propôs-se a realização do PCR I+II em duas etapas distintas. A primeira com o objectivo de

promover o passo de 'overlap extension', i.e. a formação do fragmento híbrido, através de

alguns ciclos de PCR na ausência dos 'primers' exteriores. Na segunda etapa os 'primers'

seriam adicionados com o objectivo de levar à amplificação exponencial da molécula híbrida

formada anteriormente. Este ensaio, à semelhança dos anteriores, não teve os resultados

pretendidos. Como tal, e dado a obtenção destes fragmentos híbridos de DNA ser

absolutamente fundamental para a construção dos mutantes, tentou-se novamente uma

estratégia diferente. Esta consistiu na utilização do método descrito por Warrens et al. em

1997, o que finalmente permitiu a formação da molécula híbrida pretendida (Figura 5) (74).

Figura 4 | Quantificação dos fragmentos

resultantes dos PCRs I e II em gel de agarose

recorrendo ao marcador quantitativo (MQ)

GeneRuler Express. A seta indica a banda de

1 kb dos marcadores de massa molecular.

Figura 5 | Obtenção dos fragmentos híbridos.

Fragmentos após purificação por kit: PNPase /

RNase III / RNase R / RNase R / Marcador

(M). A seta indica a banda de 2 kb do

marcador de massa molecular.

Como ilustrado na figura Figura 6, na fase de 'annealing' do PCR I+II são possíveis quatro

combinações distintas. Apenas uma delas, (3), pode servir de molde à DNA polimerase de

modo a que se gere o fragmento híbrido completo, e esta combinação é uma das duas

menos favorecidas, (3) e (4). Como forma de favorecer esta combinação (3), em relação às

A C B B M A1 A2 B1 B2 C1 C2 M MQ


16

outras três, (1),(2),(4), as cadeias nela envolvidas foram produzidas em maior quantidade

que as suas complementares nos PCRs I e II. Para tal foi introduzido mais um PCR no

protocolo que tem a particularidade de ser assimétrico, isto é, um dos 'primers' está presente

numa maior concentração do que o outro, consequentemente originando um produto em

que uma das cadeias existe em maior quantidade do que a outra.

Figura 6 | Combinações das hibridações no passo de 'Overlap Entension'. Apenas uma das quatro

combinações (3) permite obter o fragmento híbrido de interesse, sendo esta combinação uma das

duas menos favorecidas - necessidade de utilização de PCR assimétrico. Adaptado de Warrens et al.

(1997).

Assim, foram feitos PCRs I e II assimétricos tendo como DNA molde o resultado dos PCRs I

e II não assimétricos, e onde os 'primers' a e d estavam 20x mais concentrados que os b e c

respectivamente. Os produtos de amplificação destes PCRs assimétricos vão servir de DNA

molde para o PCR I+II. Como se observa na Figura 7, a reacção tem um baixo rendimento e

a presença de outras bandas para além da com o tamanho pretendido implica a purificação

por gel de agarose do fragmento de interesse. Procurou-se amplificar com os 'primers' a e d

o resultado deste PCR mas sempre sem sucesso. A maneira encontrada para aumentar a

quantidade de fragmento e poupar tempo foi a de fazer os PCR assimétricos I e II

directamente a partir dos fragmentos iniciais ou do DNA genómico, reduzir a diferença da

quantidade dos 'primers' de 20x para 8x e aumentar o número de ciclos. O resultado destas

alterações pode ser visto na Figura 8. Assim deixa de haver a necessidade de fazer os

PCRs I e II não assimétricos e a obtenção de maiores quantidades de DNA facilita os

passos subsequentes de restrição e ligação para clonagem.


17

Aparentemente a maior ou menor dificuldade associada à obtenção destas moléculas

híbridas parece depender não só do tamanho dos fragmentos e do desenho dos 'primers'

mas também da natureza das próprias moléculas. Nos casos em que existe maior

dificuldade na obtenção do fragmento híbrido, como neste trabalho, este método revelou ter

uma grande eficácia e robustez.

Figura 7 | PCR I+II com baixo rendimento. A

seta indica a banda de 2 kb do marcador de

massa molecular.

Figura 8 | PCR I+II com o rendimento

melhorado. A seta indica a banda de 2 kb do


Uma vez obtido e purificado o fragmento, este foi digerido com as respectivas enzimas de

restrição, clonado no vector pBluescript SK+ (pSK+) e inserido em E. coli JM101TR por

electroporação (Tabela Suplementar 1). Foi escolhido este vector porque possui o gene lacZ,

o que possibilita a indicação branco/azul (distinção das moléculas recombinantes das não

recombinantes, respectivamente) e por ser um vector com elevado número de cópias, o que

permite obter grandes quantidades de inserto necessárias para a posterior sequenciação.

As colónias resultantes da transformação que apresentavam cor branca foram repicadas

para novo meio de cultura sólido e, a partir destas, foram efectuados PCRs de colónia com

os 'primers' #92 e #93 (Tabela Suplementar 2), desenhados de modo a amplificar a região do

multiple cloning site (MCS) do vector pSK+. Todos os plasmídios com fragmentos com

tamanho próximo do esperado foram sequenciados de modo a verificar se a sequência do

inserto é a desejada. Os 'primers' para a sequenciação foram desenhados de modo que

houvessem sempre zonas de sobreposição entre as várias sequenciações parciais. Para

A M C A A M A


18

garantir que a sequência obtida era a correcta e estava isenta de mutações, ambas as

cadeias de DNA foram sequenciadas.

Esta etapa não apresentou qualquer dificuldade para o fragmento da RNAse III, pois à

primeira tentativa foi possível obter clones com o fragmento do tamanho esperado e que a

sequenciação viria a demonstrar ser o correcto e não ter nenhuma mutação adicional

(Figura 9).

Figura 9 | Obtenção do fragmento híbrido correspondente à RNase III. A seta indica a banda de 2 kb

do marcador de massa molecular.

No entanto, para os restantes fragmentos, da PNPase, RNase R e RNase J1, a situação foi

substancialmente diferente. Para além do facto de a coloração branca das colónias não ser

uma indicação muito fidedigna de que existiria de facto um fragmento inserido no vector a

interromper o gene da β-galactosidase, foi obtida uma elevada e inesperada variabilidade no

que diz respeito à dimensão dos fragmentos inseridos no vector (Figura 10). Não se

conseguiu determinar a causa desta diversidade de massas moleculares.

Figura 10 | Variabilidade nos tamanhos dos fragmentos da PNPase e RNase R clonados em pSK+.

M C C


19

Devido ao facto de a indicação branco/azul, principal vantagem pela qual se optou pela

utilização do pSK+, não se ter mostrado tão útil quanto esperado e ter obrigado à realização

de dezenas de reacções de PCR de colónia, propõe-se a obliteração desta etapa do

protocolo, procedendo-se à clonagem directamente no vector pGhost 9. Assim, a procura

pelos transformantes será feita da mesma forma, recorrendo ao PCR de colónia, e deixa de

ser necessário remover o fragmento de interesse do pSK+ para o transferir para o pGhost 9.

O problema do pGhost 9 não ser um plasmídio com múltiplas cópias é facilmente

contornado através da extracção do plasmídio a partir de volumes superiores de cultura e

utilizando kits comerciais próprios para estes casos. Como já foi referido, os fragmentos da

RNase III que foram sequenciados não apresentavam qualquer erro, ao contrário dos muitos

fragmentos das restantes RNAses que apresentavam sequências muito diferentes das

pretendidas e cuja origem não se conseguiu determinar. Foram necessárias numerosas

tentativas de transformação para se conseguirem obter os fragmentos correctos

correspondentes à PNPase e à RNase R clonados em pSK+. Ainda não foi possível clonar o

fragmento da RNase J1, possivelmente devido às suas elevadas dimensões, muito

superiores às dos outros fragmentos. Para solucionar este problema vão ser desenhados

novos 'primers' de modo a reduzir as dimensões do fragmento.

Uma vez tendo o fragmento sem erros no pSK+, procedeu-se à restrição com as mesmas

enzimas utilizadas anteriormente (Tabela Suplementar 3 e Figura 11) e clonou-se o fragmento

em pGhost 9. O vector foi depois introduzido em E. coli VE 14188 por electroporação

(Tabela Suplementar 1). É neste passo que se encontram os fragmentos correspondentes à

PNPase e à RNase R. A estirpe de E. coli transformada com o pGhost 9 tem de codificar no

seu genoma a proteína RepA selvagem (genótipo repA+), proteína responsável pela

replicação do plasmídio, de modo a permitir a replicação do pGhost 9 a 37 ºC, temperatura

óptima de crescimento de E. coli. Este plasmídio é capaz de se replicar a 27 ºC mas é

incapaz de o fazer a 37 ou 42 ºC. Esta incapacidade de replicação a estas temperaturas

mais altas (37 e 42 ºC) deve-se ao facto de a proteína RepA codificada pelo plasmídio

pGhost 9 ser termosensível, não se encontrando funcional a tais temperaturas.

A transformação de E. coli com o pGhost 9 contendo o fragmento de interesse permite obter

esta construção em quantidade suficiente para permitir a transformação de E. faecalis

V583 ∆ABC por electroporação (para a qual é necessária maior quantidade de plasmídio do

que relativamente à transformação de E. coli). Os transformantes foram verificados através

de PCR de colónia com os 'primers' #112 e #113 (Tabela Suplementar 2) desenhados de

modo a amplificar a região do 'multiple cloning site' (MCS) do vector pGhost 9 (Figura 12).


20

Figura 11| Digestão dupla do pSAVE 6. A seta

indica a banda de 2 kb do marcador de massa

molecular.

Figura 12 | Obtenção de transformantes de

E. coli com o pSAVE 8. A banda inferior é

resultado de uma amplificação inespecífica

com o cromossoma da estirpe VE 14188. A

seta indica a banda de 2 kb do marcador de

massa molecular.

O plasmídio pGhost 9 com o fragmento de interesse clonado foi extraído de E. coli e inserido

em E. faecalis. A identificação de transformantes foi efectuada da mesma forma do que para

E. coli, realizando PCRs de colónia com os 'primers' #112 e #113 (Tabela Suplementar 2 e

Figura 13).

Figura 13| Obtenção de transformantes de E. faecalis com o pSAVE 8. A seta indica a banda de 2 kb

do marcador de massa molecular.


21

Uma vez em E. faecalis o objectivo é a integração do plasmídio no genoma através de

recombinação homóloga entre o fragmento de interesse presente no plasmídio e uma das

duas regiões de homologia presentes no cromossoma. Para seleccionar os clones onde a

integração ocorreu as bactérias foram incubadas durante 2 horas a 27 ºC sem antibiótico

(pGhost 9 é capaz de replicar) e posteriormente 2 horas a 42 ºC (pGhost 9 é incapaz de

replicar). Após esta variação de temperatura, a cultura foi plaqueada em meio com

antibiótico e incubada a 42 ºC. Deste modo as bactérias que conseguirem resistir ao

antibiótico fazem-no porque integraram o plasmídio no seu genoma, dado este não ser

capaz de se replicar a 42 ºC. Os integrantes foram confirmados através de um PCR de

colónia com os 'primers' #70 e #112 (Tabela Suplementar 2). No caso do mutante da RNase

III (o único a chegar até este ponto do protocolo) só foi obtido um tipo de integração, a do

tipo I relativamente à Figura 14 (Figura 15).

Depois de o fragmento, juntamente com o vector, estar integrado no cromossoma de

E. faecalis V583 ∆ABC, procurou-se promover a excisão, por recombinação homóloga, da

sequência do vector em conjunto com a sequência a eliminar ladeada pelas duas regiões de

homologia de modo a que fique no cromossoma o fragmento com o gene mutado em

substituição do gene selvagem. Para tal realizaram-se várias passagens crescendo os

enterococos a 27 ºC sem antibiótico. No final plaquearam-se as bactérias em meio com e

sem antibiótico e incubaram-se a 42 ºC. Comparando a mesma diluição, o número de

colónias na placa sem antibiótico deveria ser consideravelmente superior ao número de

colónias na placa com antibiótico. A existência de um razoável número de colónias sensíveis

ao antibiótico constitui um bom indicador da ocorrência da excisão do pGhost 9 (o qual

confere resistência à eritromicina) do cromossoma e posterior perda do pGhost 9, devido à

sua incapacidade de replicação a 42 ºC. Infelizmente o verificado para o caso da RNase III,

nos ensaios repetidos várias vezes e para diferentes integrantes, foi um número muito

semelhante o que indica uma fraca probabilidade de encontrar o mutante de delecção. Para

se identificar um clone onde tenha ocorrido excisão, as colónias das placas sem antibiótico

foram repicadas simultaneamente para placas com e sem antibiótico, utilizando uma grelha

para identificação. Aqueles que cresceram no meio sem antibiótico e não no meio com

antibiótico foram repicados novamente para placas com e sem antibiótico e foi realizado um

PCR de colónia com dois dos 'primers' utilizados na sequenciação, no caso da RNase III,

#94 e #95, respectivamente (Tabela Suplementar 2 e Figura 14). Após várias tentativas e

dezenas de colónias testadas ainda não foi possível encontrar um clone com o gene

mutado, somente clones em que a excisão deixou no cromossoma o gene selvagem (Figura

16). A eficácia desta etapa do protocolo pode variar bastante e por vezes ser muito baixa

mas, dado o número de tentativas, somos levados a considerar a


22

hipótese de que talvez, à semelhança do que acontece em B. subtilis, o gene da RNase III

seja essencial em E. faecalis, não sendo possível obter mutantes de delecção para este

gene.

Figura 14 | Representação esquemática dos acontecimentos de integração e excisão que podem ocorrer durante o protocolo.

Integração

I

#112

pGh 9 #70 #70

I II

pGh 9

Excisão

#97

#94

IV Gene Mutado

#112

pGh 9 #70 #70

II

#97

#94

III Gene Selvagem


23

Figura 15 | Obtenção de um só tipo de

integração do pSAVE 8 no cromossoma de

E. faecalis. A seta indica a banda de 2 kb do


Figura 16 | Clones em que ocorreu excisão.

Na pista 2 e 3 estão clones nos quais ocorreu

a excisão e onde o gene selvagem ficou no

cromossoma, na pista 4 está o V583 ∆ABC, na

pista 5 está o controlo sem colónia e nas

pistas 1 e 6 está o marcador. A seta indica a

banda de 2 kb do marcador de massa

molecular.

Apesar deste processo de construção de mutantes envolver várias etapas (um primeiro

'crossing-over' para integração do plasmídio, seguido de um segundo para excisão do

mesmo de forma a substituir o gene selvagem pelo mutante) (Figura 14), esta abordagem foi

seleccionada uma vez que é do nosso interesse obter um mutante exclusivamente neste

gene deixando o restante genoma inalterado. Por esta razão não se optou por exemplo pela

disrupção do gene por inserção de uma cassete de resistência a antibiótico.

1 2 3 4 5 6


24

5. Perspectivas futuras

Estabelecer se o gene rnc, que codifica para a RNase III, é essencial em

Enterococcus faecalis V583 ∆ABC, à semelhança do que acontece em Bacillus subtilis. Para

isso ir-se-á clonar o gene rnc selvagem num plasmídio com um promotor indutível, com

replicação não sensível à temperatura, com origem de replicação em E. faecalis e E. coli e

com uma marca de selecção apropriada. Este plasmídio será depois introduzido numa das

estirpes de Enterococcus que já possuem o pGhost 9 com o fragmento mutado integrado no

genoma (integrantes) e os transformantes serão submetidos às etapas finais do protocolo de

elaboração dos mutantes, nomeadamente as passagens a 27 ºC sem a presença de

eritromicina, de modo a promover a excisão do cromossoma do pGhost 9 juntamente com a

forma selvagem do gene rnc. Naquelas bactérias em que a excisão pretendida se verificar, e

se o gene for essencial, só sobreviverão os clones que possuam o plasmídio não

termosensível com o gene rnc selvagem a ser expresso sob a acção do promotor indutível.

Posteriormente, estudos poderão ser feitos para observar as consequências da variação na

expressão deste gene.

Após a obtenção dos mutantes na PNPase, na RNase R e na RNase J1 pretende-se

estudar o efeito destas mutações em vários processos, embora no caso da última exista

também a possibilidade de ser essencial dado que, à semelhança da RNase III, é essencial

em B. subtilis. Serão estudadas as alterações ao nível do crescimento celular, realizando

curvas de crescimento à temperatura óptima e a baixas temperaturas (uma vez que a

PNPase e a RNase R são 'cold shock proteins'); ao nível da resistência a vários antibióticos,

determinando as concentrações mínimas inibitórias (MIC) e ao nível da morfologia celular,

por observação ao microscópio. Em paralelo estes mutantes serão utilizados para a análise

do processamento e estabilidade das moléculas RNA em geral, e dos transcritos do operão

fsr em particular (sistema em estudo no laboratório). Pretende-se estudar também o

comportamento dos mutantes no que diz respeito à produção de factores de virulência

(e.g. teste da gelatinase) e à sua patogenecidade recorrendo a organismos modelos,

nomeadamente Galleria mellonella, macrófagos e Drosophila melanogaster.

Por último, será também interessante, recorrendo ao protocolo aqui apresentado, efectuar

os mesmos mutantes na estirpe E. faecalis V583 selvagem (que possui os três plasmídios:

pTEF1, pTEF2, pTEF3) ou noutras que se revelem de especial interesse.

Assim, com o trabalho desenvolvido nesta tese, pretendeu-se melhorar os protocolos para a

obtenção de mutantes em Enterococcus faecalis e abrir caminho para uma nova área,

criando ferramentas que irão permitir estudos futuros sobre as complexas relações entre

RNAses, RNAs e virulência em enterococos.


25

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29

7. Anexos Tabela Suplementar 1| Estirpes e plasmídios utilizados neste trabalho.

Estirpe ou plasmídio Características relevantes Fonte

JM 101 TR E. coli repA-, Amps

IBPC, Paris

VE 14188 E. coli GM1674 repA+, Amps, Erys

UBLO, Jouy-en-Jousas

V583 ∆ABC E. faecalis V583 curado dos seus plasmídios, repA-, Erys

LME, Caen

pBluescript SK+ Vector de clonagem, indicação LacZ, Ampr, Ori1

Stratagene

pGhost 9

Vector de clonagem, replicação termosensível, Eryr, Ori1, Ori2

UBLO, Jouy-en-Jousas

pSAVE 6 pBluescript SK+ : rnc mutado

este estudo

pSAVE 11 pBluescript SK+ : pnpA mutado

este estudo

pSAVE 13 pBluescript SK+ : vanB mutado

este estudo

pSAVE 8 pGhost9 : rnc mutado

este estudo

Ori1 representa origem de replicação em E. coli e Ori2 representa origem de replicação em E. faecalis

Amp : ampicilina

Ery : eritromicina

s : sensível

r : resistente


30

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CC

AGG

22

Tabela Suplementar 2 | 'Primers' utilizados neste estudo. O símbolo # representa o número de

identificação do 'primer' de modo a simplificar a sua referência e tornar a sua identificação mais

imediata. A dimensão dos 'primers' é dada em nucleótidos (nt).


31

Tabela Suplementar 3 | Dimensões dos fragmentos esperadas ao longo do protocolo. O símbolo #

representa o número de identificação do 'primer'.

Prim

ers

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Posi

ção

nº

(#)

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A II

1117

6447

2036

4770

1861

3713

3538


32

Figura Suplementar 1 | Marcadores de massa molecular.

(A) - 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen)

(B) - GeneRuler Express (Fermentas)

(A) (B)

Construção de mutantes em RNases em...

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