Controle da Expressão Gênica em Eucariotos

Aula de Bioquímica II

Tema:

Controle da Expressão Gênica

Prof. Dr. Júlio César BorgesDepto. de Química e Física Molecular – DQFM

Instituto de Química de São Carlos – IQSC

Universidade de São Paulo – USP

E-mail: [email protected]


Todas as células de um contêm as mesmas informações depositadas no genoma

O Gene é expresso quando ele é transcrito em mRNA �� Principal ponto de controle

Circuitos regulatórios guiam o desenvolvimento de eucariotos multicelulares e envolvem diversos tipos de mecanismos regulatórios

A expressão de uma proteína pode ser:

Constitutiva: Constantemente expressa

Induzida: Expressa quando necessária


Processos que afetam a concentração do produto gênico: pontos potenciais de controle

Gene: É um segmento de DNA que leva à produção de um transcrito de RNA e inclui regiões que

antecedem e que seguem a região transcrita, bem como sequências que não são traduzidas (íntrons)

que se intercalam aos segmentos codificadores individuais (éxons), que são traduzidos.

�� Inclui elementos reguladores, o promotor e oterminador da transcrição

� A iniciação da transcrição (1) é o principal mecanismo, pelo menos o mais bem documentado �� regulação sincronizada

�� O processamento pós-transcricional (2) e a estabilidade do mRNA (3) são muito importantes, principalmente em eucariotos


Esquema geral simplificado do promotor de genes de eucariotos

Existem elementos regulatórios a milhares de bases a upstream do promotor

Em procariotos

A identidade da sequência consenso do

promotor dita a “força” da transcrição pela

frequência do recrutamento da RNApol

�� Existe modulação adicional por proteínas

Região promotora do gene da PEP-carboxiquinase

�� Alta complexidade da regulação deste gene.

�� Ajuste fino proporcional a importância do processo


As informações para o controle da expressão gênica estão no DNA

Regulação negativa

Dependente de Repressores

- Inibem a expressão gênica por bloquear o acesso da RNApol ao

promotor

- Dependem da presença do Efetor (sinal molecular)

Tipo característico em procariotos

Elementos operador próximos ao promotor



Regulação positiva

Dependente de Ativadores

� Induz a expressão Gênica

- Dependem da presença do Efetor (sinal molecular)

Tipo característico em eucariotos

A Expressão Gênica é regulada por proteínas

�� Proteínas específicas reconhecem sequências específicas de DNA

� Possuem domínios de interação com DNA e de interação com outras proteínas

- Normalmente dímeros �� reconhecer sequências palindrômicas �� simétricas

� o papel dos Sulcos maior (mais específico) e menor (menos específico) no DNA

Alta especificidadeKA das proteínas regulatórias pelas

sequências-alvo é 4-6 ordens de grandeza maior do que para outras sequências

- Sequências específicas de DNA �� superfície específica para formação de ligações de H

Domínios de Ligação ao DNA

-Formam estruturas autônomas separadas do restante da proteína

- Estruturas capazes de interagir estreita e

especificamente com o DNA-alvo

- Relativamente pequenos (60-90 resíduos)

- projetam-se na superfície das proteínas

- Conectadas ao restante da proteína por

regiões flexíveis

�� O Domínio Hélice-volta-hélice está presente

em muitas proteínas ligadores de DNA

- Apresentam-se como “dímeros” de forma a

reconhecer a sequência palindrômica no DNA

- Forma um eixo de simetria com DNA

�� Reconhecimento por uma fita beta

Hélice-alça-hélice

Homeodomínios

Zinc Fingers

Leu

Resíduos básicosInteração com o Pi

Zíper de Leucina

Domínios de Ligação ao DNA

Organização dimérica (exceto o zinc finger)

Controle da expressão em Procariotos

Procariotos produzem proteínas relacionadas a processos interdependentes de forma

agrupada

- Mecanismo geral simples para coordenar a regulação de genes inter-relacionados

� Sistema óperon: unidade básica de transcrição

- Operador �� sequência de DNA próximo ao promotor

� mRNA policistrônico:

� 1 promotor �� 1 mRNA �� várias proteínas traduzidas

- Cada sequência codificadora tem seu próprio motivo Shine-Dalguarno

- Existem exemplos deste sistema em eucariotos �� exceção

Controle da expressão em Procariotos

Procariotos induzem a expressão de enzimas conforme a disponibilidade de fonte de

energia

β-galactosidade é uma importante ferramenta biotecnológica �� atua sobre galactosídios alternativos

Controle da expressão em procariotos

A indução da expressão da β-galactosidase �� induz a expressão de 2 outras enzimas

- Galactosídeo permease: transporte de lactose pela membrana

- Tiogalactosídeo transacetilase: desintoxicação de outras moléculas transportadas pela

permease

�� Indução conjunta de enzimas para adaptação a um novo ambiente:

�� Mecanismo comum de indução.

�� Modelo do óperon: Explica a regulação paralela de diferentes proteínas

-Formado por:

- um gene regulador: codifica uma proteína repressora

- uma sequência operadora: alvo da proteína repressora

- genes estruturais: produtos da expressão do óperon

P: sequência promotor

lacI: gene proteína repressora

O: operadores: sítio de ligação da proteína repressora

lacZ: gene da β-galactosidade

lacY: gene da permease

lacA: gene da tio-transacetilase

lacZ, lacY e lacA formam um mRNA policistrônico ou

poligênico

operon Lac

Conjunto de genes envolvidos na regulação e expressão das proteínas envolvidas no

metabolismo de Lactose.

Estrutura tetramérica

Cada monômero possui um domínio hélice-volta-hélice que reconhece a sequência operadora

- Ocasiona a formação do loop de DNA

Proteína repressora Lac

� Permanece fortemente ligado à sequência operadora na ausência de Lactose

- KA 1x106 vezes maior pela sequência operadora do que por outra sequência

� Impede a transcrição por impedir que a RNApol desenrole o DNA localmente

Proteína repressora Lac

� O ligante da Proteína repressora Lac é um produto secundário da β-galactosidase

� 1,6-alolactose: INDUTOR

- A lactose não interage com a Proteína repressora Lac

Indutores

α-D-galactopiranosil-(1��4)-D-glicopiranose

α-D-galactopiranosil-(1��6)-D-glicopiranose

Óperon Lac

1) Na ausência de Lactose, não existe 1,6-alolactose e portanto a Proteína repressora Lac

permanece ligada à sequência operadora impedindo a transcrição do DNA

2) Na presença de Lactose, parte desta é convertida a 1,6-alolactose que se liga à Proteína

Repressora Lac e reduz a afinidade desta pela sequência operadora. Com a saída da

Proteína repressora Lac da sequência operadora os genes estruturais podem ser transcritos

na forma de um mRNA policistrônico ou poligênico

�� Mesmo na ausência de lactose, existe transcrição basal dos genes estruturais

lacImRNA

Repressor lacI ligado ao operador bloqueia a

transcrição dos genes lacZ, lacY e lacA

lacImRNA

lac mRNA (policistrônico)

β-galactosidase

Permease

Transacetilase

[Glicose] alta �� [AMPc] baixa e lactose ausente

Controle da Expressão Gênica em procariotosComutação de reguladores

Ativação da expressão gênica por AMPcAMPc (coativador) �� indução conjunta de enzimas catabólicas

CRP liga-se ao operador do operon Lac a -51 do Promotor

e “recruta” a RNApol� Atuam em vários óperons

AMPc liga-se à cAMPreceptor Protein – CRP

[Glicose] baixa �� [AMPc] alto e lactose ausente

[Glicose] alta �� [AMPc] baixo e lactose presente

�� Ativação fraca

[Glicose] baixa �� [AMPc] alto e lactose presente

�� Ativação forte

Efeito coordenado entre repressor/ativador

�� Regulons: rede de óperons com reguladores

comuns

Controle da Expressão Gênica em procariotos

Em procariotos, muitos óperons funcionam de forma análoga ao óperon Lac

Ex: óperon Pur

Controla o metabolismo de Purinas

A proteína Repressor Pur liga-se à sequência operadora na presença de um ligante:

�� co-repressor

O genoma de E. coli contêm mais de 20

sequências operadora para a proteína

repressora Pur

Regulon

�� Permite a regulação paralela de todos

os passos metabólicos da síntese de

purinas

Controle da Expressão Gênica em procariotosA estratégia dos atenuadores

- Comum nos óperons para síntese aminoácidos

O óperon trp controla a síntese de Triptofano

Altos níveis de Trp reprime o óperon- Ligação do Trp a proteína repressora induz

ligação ao operador

Atenuação do óperon trp- Ocorre na síntese do mRNA

- Formação de grampos de mRNA auto complementares

Se a [Trp] ↑ síntese rápido do peptídeo líder�� Formação alça 3-4 �� fim da transcrição

Se a [Trp] ↓ síntese lenta do peptídeo líder�� Formação alça 2-3 �� transcrição continua

Controle da Expressão Gênica em procariotosOutros mecanismos, inclui-se a autoindução em biofilmes: quorum sensing

Feedback de tradução de óperons de proteínas ribossomais

- Visa regular a concentração das proteínas ribossomais e rRNA

�� A proteína ribossomal inibe a tradução de seu próprio mRNA� A medida que o respectivo rRNA é sintetizado, a proteína ribossomal dissocia-se de seu

mRNA e liga ao rRNA- Maior afinidade pelo rRNA

Controle da traduçãoResposta estringente

- Depende da disponibilidade de aminoácidos

- Ausência de aminoácidos- Recrutamento do fator estringente

- Síntese de ppGpp- Inibição da RNApol

Controle da Expressão Gênica em procariotosPapel de pequenos RNAs �� sRNA

Alguns mRNAs bacterianos são regulados por sRNA em cis ou em trans

trans: outro sRNAregula a tradução de

um dado mRNAFunção dependente da proteína Hfq �� facilita

formação de duplex RNA-RNA

cis: parte do próprio mRNA regula a própria

tradução- Riboswitches: Aptâmeros

naturais de RNA dependentes de ligantes- Ligantes identificados:

TPP, cobalamina, FMN, Lys, Gly, purinas e adoMet (S-

adenosilmetionina).

Indução

RepressãoMecanismo de splicing em eucariotos

Controle da Expressão Gênica em procariotosControle por recombinação

Recombinação regula a expressão de diferentes proteínas do flagelo (FljB e FliC) a cada 1000 gerações

Mecanismo de escape do sistema imune

�� Sistema óperon- Recombinase Hin inverte posição do promotor (e gene para a hin) para a FljB

- Sem expressão da proteína repressora FljA �� expressão da FliC

Controle da Expressão Gênica em Eucariotos

� O tamanho do genoma

� Diversidade Celular

- Impõem mais complexidade para atingir especificidade.

�� Transcrição e tradução NÃO são processos acoplados.

� Os genes de uma mesma via não estão organizados em óperons.

- Existem somente algumas exceções

�� Transcrição basal não observada �� transcrição está inativa para a maioria dos genes

- Regulação positiva �� requer Ativadores sempre

- Regulação negativa �� necessitaria de grande número de repressores presentes na célula

em quantidade �� há poucos exemplos em eucariotos

Papeis dos ativadores ou fatores de transcrição

1) Montagem do complexo de transcrição basal com os TFII

2) Outras proteínas regulatórias específicas se unem a este complexo basal

- Ligam-se à sequências “Enhancer” - Potenciadores

� São proteínas modulares e multiméricas

– Domínio de Ligação ao DNA e Domínio Ativador

Remodelamento da Cromatina

O DNA de eucariotos se apresenta ligado à proteínas formando os Nucleossomos

- As regiões do DNA que estão sendo transcritas estão menos compactadas

- Heterocromatina �� fortemente condensada: não disponível para transcrição

- Eucromatina �� Parcialmente disponível para a transcrição

�� A regulação negativa em eucariotos seria redundante com os nucleossomos


A acetilação das histonas contribuem para a ativação da transcrição

- Histonas acetilases (HAT) acetilam a Lys da cauda N-Terminal das Histonas

1) Reduz a afinidade da Histona pelo DNA �� afrouxa o nucleossoma

2) Recrutamento de outros componentes da maquinaria de transcrição

3) Iniciação da remodelagem da cromatina

Reversão executada por

Histonas desacetilases

�� repressão da transcrição por compactação da

cromatina

�� Regiões do DNA que estão mais ou menos compactadas são

tecidos específicas

�� Existem proteínas remodeladoras do DNA tecido específicas

que regulam os conjuntos de genes que deverão ser

transcritos e os que devem ser “silenciados”.

�� O DNA é metilado por Metilases específicas no C5 da C

- 70% das 5’-CG-3’ estão metiladas

- A metila projeta-se para o sulco maior bloqueando interações

- As 5’-CG-3’ próximas ao 5’ dos genes ativos são

hipometiladas


Em levedura, os genes necessários para o metabolismo de galactose são ativados pela

proteína GAL4.

- Reconhece a sequência: 5’-CGG(N)11CCG-3’ �� 4.000 pontos no DNA de levedura

- Somente 10 deles são identificados pela GAL4 �� 99,75% estão bloqueados



Envolve interação, direta ou indireta, de ativadores/repressores e a RNApol em eucariotos

� Requerimento de:- elementos potenciadores (enhancers) a longa

distância do promotor

- Regulador de arquitetura para dobrar o DNA (alças ou looping)

- Coativador aumenta a taxa de recrutamento/ativação da RNApol

�� Repressor pode atuar bloqueando a ação do coativador

�� Controle combinatório- Depende do subconjunto de proteínas produzidas

naquele tipo celular- Heteroligômeros e heterocomplexos


Controle combinatório

�� Dependendo do conjunto de proteínas �� diferentes efeitos

�� Número reduzido de proteínas reguladoras �� maior especificidade� reconhecem sequências assimétricas

� Ex: 2 famílias de reguladores com 3 membros cadaFormam Homodímeros e heterodímeros �� 36 possíveis combinações

Acentuadores ou potenciadores

- sequências específicas “acima” do promotor que funcionam como pontos de ligação

específicos para proteínas ativadoras ou repressoras.

- Podem estar a milhares de pares de base à 5’ do promotor

- Dependem da presença das proteínas ligadoras específicas

- Podem ajudar a expor o DNA para RNApol II

- Podem ajudar a montagem do complexo basal de

transcrição

Acentuador da creatina quinase regulando a expressão

da β-galactosidade

Regulação gênica em eucariotos

Requer ação combinada de diversos agentes

�� UAS: upstream activator sequences: Sequências ativadoras a montante

Pode ser a jusante também

�� Reguladores da arquitetura: proteínas HMG

�� Remodelamento da cromatina

�� Coativadores: Ativadores ou repressores �� interação com o Mediador

�� Fatores basais de transcrição

Regulação gênica positiva em eucariotos

Coreografia da ativação da transcrição

Eventos em cascata �� variável para diferentes genes

�� Processo dependente de moléculas efetoras e reversível

~ 50 membros no genoma humano

Atuam como dímeros �� reconhecem elementos simétricos

Agonistas

Antagonistas

Expressão gênica regulada por hormônios

Receptores Nucleares

Os receptores para hormônios estereoidais atuam induzindo a transcrição

- Proteínas modulares �� domínio de ligação ao DNA e domínio de ligação ao hormônio

Ex: Estrogênio e testosterona


Receptores Nucleares

Os Receptores de hormônios nucleares regulam a transcrição por recrutar Co-ativatores ou

mediadores para o complexo de transcrição


�� Ação hormônios esteroides, tireoidianos e retinoide

- Livre transito pela membrana plasmática

�� Presença de sequências HRE: elementos de resposta hormonal específicos

Regulação por repressão da Tradução

Transcrição e tradução são processos desacoplados �� edição do mRNA e transporte para o citoplasma

Envolve o armazenamento de mRNAs inativos no citoplasma

1) Fatores de iniciação da tradução são sujeitos a fosforilação �� inibe

2) Proteínas repressoras ligam-se à região 3’ não traduzida (3’UTR - untranslated region)

- Bloqueia a iniciação da tradução

3) Sítio de ação da regulação gênica regulada por RNA

Silenciamento gênico

O papel do microRNA – miRNA �� 60% dos genes humanos

Produção transitória �� chamados como pequenos RNAs temporais (stRNA)

Eucariotos superiores (nematódeos, mosca, plantas e mamíferos)

Fazem parte de noncoding RNA (ncRNA) �� incluem snRNA, tRNA, rRNA, snoRNA

- Mamíferos codificam mais ncRNA do que mRNA

- O miRNA interage com o mRNA na 3’UTR ��degradação ou inibição da tradução

- Controla o desenvolvimento do organismo

- Controle de infecções virais em plantas

� Possuem ~70 nt auto-complementares �� duplex RNA-RNA �� grampos

� Clivagem pela endonuclease DICER ou DROSHA

� Interação do fragmento com o mRNA alvo em duplex RNA-RNA �� inibição da tradução ou

degradação

- Base da técnica de RNA de interferência (siRNA)

- Aplicação no controle de infecções virais

Controle da Expressão Gênica em Eucariotos

Documents

Transcript of Controle da Expressão Gênica em Eucariotos