Controlo da Qualidade doS VinhoS - Repositório …...Ao Diogo, companheiro do quarto ao lado e...

Controlo da qualidade dos vinhos – Deteção de Sambucus nigra L. em vinhos do Douro e do Porto por HPLC

Maria Inês Almeida Oliveira Lopes

Mestrado em Tecnologia e Ciência Alimentar Departamento de Química e Bioquímica; Faculdade de Ciências, Universidade do Porto 2018

Orientador (Faculdade) Nuno Filipe da Cruz Baptista Mateus, Professor Associado, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

Coorientador (Empresa) Ana Isabel Braz de Oliveira, Química, Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, I.P.

Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri,

Porto, ______/______/_________

Aos meus pais, à minha irmã: a minha inspiração.

Agradecimentos

Antes de mais, quero agradecer à minha mãe, ao meu pai e à minha irmã. Os principais

impulsionadores deste trabalho, as pessoas que sempre me apoiam qualquer que seja

a minha decisão, pelo amor, compreensão e exemplo.

Ao meu orientador, Professor Doutor Nuno Mateus, por toda a disponibilidade, ajuda e

todos os conhecimentos transmitidos ao longo destes meses.

Ao Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, I. P., em especial ao Engenheiro Bento

Amaral, à Engenheira Natália Ribeiro e ao Engenheiro Tomás Simões, pela

oportunidade única de desenvolver o meu projeto no vosso laboratório, não podia estar

mais feliz.

À dra Ana Oliveira, pela competência, carinho, pelas críticas e conselhos e, sobretudo,

pela paciência que teve comigo e por me ter recebido tão bem no setor da cromatografia

líquida.

Ao Nuno Oliveira e Paulo Pereira por todos os conhecimentos transmitidos e

disponibilidade em me ajudar sempre que me sentia perdida e, no geral, a todos os

colegas do IVDP, I.P. que me fizeram sentir sempre “em casa”. Em especial, ao João,

colega e amigo estagiário, pela companhia em todas as horas de almoço (e em todas

as outras pausas).

Aos meus avós e restante família, pela preocupação e apoio e por me terem tornado

mais forte.

Ao Diogo, companheiro do quarto ao lado e amigo de todas as horas.

Aos restantes amigos, em especial à Mini, à Cláudia e à Rita, pelo encorajamento nos

momentos mais difíceis e pela bonita amizade.

Por último, mas não menos importante, ao meu Boss, fiel amigo de quatro patas pelo

mimo nos momentos de menos ânimo.

A todos que, de uma forma ou outra, contribuíram para o sucesso deste trabalho, o meu

sincero bem-haja.

Resumo

Este projeto de dissertação resulta da possibilidade de realização de um estágio

curricular em contexto empresarial no laboratório do Instituto dos Vinhos do Douro e

Porto, I.P. (IVDP, I.P.), um instituto público integrado na administração indireta do

Estado que tem como missão promover o controlo da qualidade e quantidade dos vinhos

do Douro e do Porto, regulamentando o processo produtivo, bem como a proteção e

defesa das denominações de origem Douro e Porto e indicação geográfica Duriense.

O laboratório do IVDP, I.P. segue métodos acreditados e encontra-se dividido em cinco

setores: cromatografia líquida, físico-química, análise mineral, cromatografia gasosa e

microbiologia.

O trabalho desenvolvido durante o estágio, teve como objetivo principal demonstrar que

é possível, através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), detetar

a adição de baga de sabugueiro (Sambucus nigra L.) a vinhos do Douro tintos e rosados

e a vinhos do Porto tintos e rosé. Assim, de um total de 622 amostras analisadas, foi

possível detetar antocianinas típicas de baga de sabugueiro em 22 (resultado positivo).

De maneira a utilizar os recursos disponíveis no setor da cromatografia líquida, o

aparelho utilizado no presente trabalho, consiste num sistema de cromatografia de ultra

eficiência (UHPLC), recentemente instalado neste setor, composto por módulos e

acoplado a um detetor DAD e uma bomba quaternária, no qual foi desenvolvido um

método de HPLC de fase reversa otimizado às condições desejadas.

Futuramente, será vantajoso tanto para o IVDP, I.P. como para os produtores, utilizar

um método típico de UHPLC dando proveito ao aparelho disponível no laboratório do

IVDP, I.P., uma vez que, consegue analisar com maior resolução, a mesma quantidade

de amostras em metade do tempo quando comparado com um método de HPLC.

Palavras-chave: vinho do Porto, vinho do Douro, HPLC, compostos fenólicos,

antocianinas, uva, baga de sabugueiro

Abstract

This project results from the possibility of making an internship in business context at the

Institute of Wines of Douro and Porto (IVDP, I.P.), which is a public institute, integrated

in the state’s indirect administration and has a mission to promote the control of the

quality and quantity of the wines of Porto, regulating the productive process, as well as

the protection and defense of the designations of origin Douro and Porto and the

geographical indication of Douro.

The laboratory of IVDP, I.P. follows accredited methods and is divided into five sectors:

liquid chromatography, physicochemical, mineral analysis, gas chromatography and

microbiology.

The work developed during the internship, had as main objective to demonstrate that is

possible, through the technique of high performance liquid chromatography (HPLC), to

detect the addition of elderberry (Sambucus nigra L.) to red and pink Douro wines and

to red and rosé Porto wines. So, of a total of 622 injected samples, it was possible to

detect in 21, typical anthocyanins of elderberry (positive result).

In order to use the available resources in liquid chromatography sector, the present work

consists of an ultra-high performance liquid chromatography system (UHPLC), recently

installed in this sector, composed of modules and coupled to a DAD detector and a

quaternary pump, in which an optimized reversed phase HPLC method was developed

at the desired conditions.

In the future, it will be useful for both, IVDP, I.P. and producers, to use a typical UHPLC

method, taking advantage of the apparatus available in the IVDP, I.P laboratory, since it

can analyze the same amount of samples in half the time when compared to a typical

HPLC method.

Keywords: Port wine, Douro wine, HPLC, phenolic compounds, anthocyanins, grape,

elderberry.

Índice

Agradecimentos ............................................................................................................ 3

Resumo ........................................................................................................................ 4

Abstract ........................................................................................................................ 6

Índice ............................................................................................................................ 8

Lista de Tabelas ......................................................................................................... 12

Lista de figuras ........................................................................................................... 15

Lista de abreviaturas................................................................................................... 19

Glossário .................................................................................................................... 22

Capítulo I – Introdução ................................................................................................ 28

O setor do vinho do Douro e Porto .......................................................................... 28

Região Demarcada do Douro .................................................................................. 32

Vinificação dos vinhos do Porto .............................................................................. 34

Vinificação dos vinhos do Douro ............................................................................. 43

Função do IVDP, I.P. ............................................................................................... 45

Serviço de Prova Acreditado do IVDP, I.P. .............................................................. 47

Laboratório Acreditado do IVDP, I.P. ....................................................................... 47

Setor da Cromatografia Líquida............................................................................... 48

Introdução à técnica de HPLC ................................................................................. 49

Fase estacionária ................................................................................................ 50

Fase móvel .......................................................................................................... 52

Mecanismos da HPLC ......................................................................................... 53

Equipamentos para HPLC ................................................................................... 54

Parâmetros cromatográficos ................................................................................ 58

Transferência de um método de HPLC para UHPLC e suas vantagens em relação à

HPLC ...................................................................................................................... 61

Validação de Métodos Analíticos por HPLC ............................................................ 63

Compostos fenólicos no vinho ................................................................................. 65

Antocianinas............................................................................................................ 68

Adição de Sambucus nigra L. ao vinho ................................................................... 72

Objetivos ..................................................................................................................... 75

Capítulo II - Procedimento experimental ..................................................................... 77

Reagentes e materiais: ........................................................................................... 77

Equipamento e método de análise .......................................................................... 78

Coluna analítica ................................................................................................... 79

Condições cromatográficas ................................................................................. 79

Preparação das soluções e das amostras ............................................................... 81

Solução de baga de sabugueiro fornecida pela FCUP ......................................... 81

Amostra de vinho do Porto dopada com solução de baga de sabugueiro ............ 81

Solução HCl/H2O/Metanol .................................................................................... 81

Soluções padrão de calibração e de verificação .................................................. 81

Preparação e determinação das amostras........................................................... 84

Capítulo III - Resultados e Discussão ......................................................................... 86

Parte I – Critérios de validação de um método de deteção de antocianinas em vinhos

tintos e rosados (Douro e Porto) .............................................................................. 86

Seletividade/Especificidade ..................................................................................... 86

Linearidade – Reta de calibração ............................................................................ 86

Cálculo dos limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ) .................................. 90

Gama de Trabalho .................................................................................................. 95

Precisão .................................................................................................................. 96

Repetibilidade ......................................................................................................... 96

Precisão Intermédia .............................................................................................. 100

Reprodutibilidade .................................................................................................. 112

Exatidão – Recuperações ..................................................................................... 113

Parte II – Estudo da estabilidade das antocianinas típicas de vinho tinto e de

Sambucus nigra L.; comparação entre a composição antociânica de diferentes estilos

de vinhos e identificação de antocianinas típicas de Sambucus nigra L. em vinhos do

Douro (tintos e rosados) e em vinhos do Porto (tintos e rosés) ............................. 117

Estudo da estabilidade antociânica das antocianinas típicas de vinho tinto e das

antocianinas típicas de baga de sabugueiro .......................................................... 117

Comparação da concentração antociânica entre vinhos do Douro tintos e rosados e

vinhos do Porto tintos e rosés ............................................................................... 128

Deteção de antocianinas de baga de sabugueiro em vinhos ................................. 134

Conclusões e providências futuras ........................................................................... 138

Bibliografia ................................................................................................................ 139

Anexos - Parte I ....................................................................................................... 146

Anexos - Parte II ...................................................................................................... 150

Lista de Tabelas

Tabela 1 – Divisão e descrição dos vários estilos de vinho do Porto. ......................... 38

Tabela 2 – Detetores utilizados em HPLC. ................................................................. 55

Tabela 3 – Algumas caraterísticas típicas de um detetor DAD. .................................. 56

Tabela 4 – Diferentes tipos de colunas de HPLC e respetivas caraterísticas. ............ 58

Tabela 5 – Estimativa da composição fenólica bruta de vinhos de mesa típicos da

espécie de uvas Vitis vinifera, em mg/L. ..................................................................... 67

Tabela 6 – Teor em antocianinas de alguns alimentos com relevância na uva tinta e na

baga de sabugueiro. ................................................................................................... 72

Tabela 7 – Preparação da solução-mãe de calibração e respetiva concentração final em

Mv-3-gl, em mg/L e preparação dos padrões de calibração e respetivas concentrações

finais da Mv-3-gl, em mg/L. ......................................................................................... 82

Tabela 8 – Preparação dos padrões de verificação e respetivas concentrações finais da

Mv-3-gl, em mg/L. ....................................................................................................... 83

Tabela 9 - Valores, em g/L, da concentração conhecida da Mv-3-gl das quatro soluções

padrão utilizadas para a calibração do método e respetivas áreas, em mg/L, bem como

outros fórmula posteriormente necessárias para o cálculo dos limites de deteção (LD) e

de quantificação (LQ). ................................................................................................. 88

Tabela 10 – Valores calculados para as média das concentrações conhecidas dos

padrões de calibração (𝒙) e dos valores obtidos pelo presente método (𝒚), para o

coeficiente de correlação (r), para o teste estatístico “t de Student” (t), o declive (b), a

ordenada na origem (a), os devios associados ao declive (Sb) e à ordenada na origem

(Sa) e por último, para os limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ) bem como

outros parâmetros necessários para cálculos intermédios destes limites. ................... 93

Tabela 11 – Representação dos valores máximos e mínimos das médias das

concentrações (mg/L) e dos coeficientes de variação (%) para cada antocianina

identificada em 6 vinhos (4 vinhos tintos do Porto, 1 dos quais foi adicionada baga de

sabugueiro, e 2 vinhos tintos do Douro), para um número de injeções para cada amostra

igual a 10 (n=10). ........................................................................................................ 97

Tabela 12 – Representação dos valores da concentração da Mv-3-gl, em mg/L, presente

no padrão 1 de verificação (P1V) em ensaios feitos ao longo do tempo bem como

cálculos da média, em mg/L, dos ensaios efetuados ao longo do tempo, do desvio

padrão (s), número total de ensaios efetuados (n), do coeficiente de correlação (r) e

correspondente coeficiente de variância, em percentagem (%CV). .......................... 101

Tabela 13 – Representação dos valores da concentração da Mv-3-gl, em mg/L, presente

no padrão 3 de verificação (P3V) em ensaios feitos ao longo do tempo bem como

cálculos da média, em mg/L, dos ensaios efetuados ao longo do tempo, do desvio

padrão (s), número total de ensaios efetuados (n), do coeficiente de correlação (r) e

correspondente coeficiente de variância, em percentagem (%CV). .......................... 103

Tabela 14 - Valores da concentração, em mg/L, de diferentes antocianinas encontradas

na amostra de vinho do Porto envelhecido e dopado com solução baga de sabugueiro,

usada como controlo. ................................................................................................ 105

Tabela 15 - Valores, em percentagem em função da Mv-3-gl, de nove antocianinas

presentes em dois ensaios BIPEA, entre os dois laboratórios que participaram nestes

ensaios. .................................................................................................................... 113

Tabela 16 - Estudo da recuperação de 4 amostras de vinho de diferentes estilos (vinho

do Porto tinto, vinho do Porto rosé, vinho do Douro tinto e vinho do Douro rosado) com

4 injeções de cada uma delas efetuadas ao longo do tempo e respetiva concentração

inicial de Mv-3-gl, em cada amostra e mg/L, concentração adicionada (em mg/L) e

concentração final de Mv-3-gl, em mg/L, %R, Rmédio e amplitude. ......................... 115

Tabela 17 – Concentração antociânica, em mg/L, de vários ensaios feitos ao longo do

tempo, de uma amostra de vinho do Porto (amostra 1) na qual foram detetadas

antocianinas típicas de baga de sabugueiro além das antocianinas típicas de vinho tinto.

................................................................................................................................. 118



antocianinas típicas de baga de sabugueiro além das antocianinas típicas de vinho tinto.

................................................................................................................................. 121



antocianinas típicas de baga de sabugueiro além das antocianinas típicas de baga de

sabugueiro ................................................................................................................ 124

Tabela 20 – Representação das concentrações máximas e mínimas, em mg/L, de cada

antocianina detetada num total de 286 amostras de vinho tinto do Douro analisadas.

................................................................................................................................. 129

Tabela 21 - Representação das concentrações máximas e mínimas, em mg/L, de cada

antocianina detetada num total de 19 amostras de vinho rosado do Douro analisadas.

................................................................................................................................. 130


antocianina detetada num total de 114 amostras de vinho tinto do Porto analisadas.

................................................................................................................................. 131


antocianina detetada num total de 13 amostras de vinho do Porto rosé analisadas. 132

Lista de figuras

Fig. 1 - Marco de pedra com a designação "Feitoria" situado na entrada principal do

IVDP, I.P., delegação do Porto ................................................................................... 29

Fig. 2 - Mapa da RDD dividida nas três sub-regiões ................................................... 32

Fig. 3 - Esquema resumido da vinificação completa dos vários estilos de vinhos do Porto

................................................................................................................................... 35

Fig. 4 - Representação de algumas das cores que se podem encontram nos vários

estilos de vinho do Porto existentes. ........................................................................... 37

Fig. 5 - Esquema-resumo da vinificação em vinhos tintos do Douro. .......................... 44

Fig. 6 - Esquema-resumo de uma vinificação típica de vinhos brancos do Douro (Filipe

et al., 1990). ................................................................................................................ 45

Fig. 7 - Selos de garantia emitidos pelo IVDP, I.P.. .................................................... 47

Fig. 8 – Sinal detetado num detetor de HPLC em função do tempo, designado de

cromatograma. ............................................................................................................ 50

Fig. 9 – Coluna de HPLC mostrando o fluxo da fase móvel ........................................ 51

Fig. 10 – Estrutura da sílica e grupos presentes. ........................................................ 52

Fig. 11 – Diagrama de um sistema de HPLC. ............................................................. 54

Fig. 12 - Esquema da composição de um detetor DAD .............................................. 56

Fig. 13 - Representação da estrutura básica dos flavonoides (à esquerda) bem como da

estrutura básica de algumas das classes a eles pertencentes (à direita) .................... 66

Fig. 14 – Estruturas das antocianinas presentes em Vitis vinifera (na forma do catião

flavílio). ....................................................................................................................... 69

Fig. 15 – Cromatogramas registados a 520 nm correspondentes a (a) uma amostra de

vinho de 4 meses, (b) uma amostra de vinho de 8 meses, (c) uma amostra de vinho de

13 meses, (d) uma amostra de vinho de 16 meses e (e) uma amostra de vinho de 23

meses. ........................................................................................................................ 70

Fig. 16 - Arbusto, flores e bagos, típicos de Sambucus nigra L (FCiências, (2018)). .. 73

Fig. 17 - Cromatogramas de HPLC - 520 nm. (1) cy-3-samb-5-gl, (2) df-3-gl, (3) cy-2-gl,

(4) pt-3-gl, (5) pn-3-gl, (6) mv-3-gl, (*) cy-3-gl + cy-3-samb (Bridle & García-Viguera,

1996) .......................................................................................................................... 74

Fig. 18 - (A) Sistema de UHPL da "Agilent Technologies, 1290 Infinity II", em módulos

((a)– reservatórios dos eluentes; (b) - bomba; (c) -“autosampler”; (d) – coluna com forno;

(e) – detetor DAD); (B) Aspeto do software “Open Lab CDS Chemstation Edition

C.01.07” acoplado ao sistema de UHPLC representado em (A). ................................ 79

Fig. 19 - Balões volumétricos de 10mL com as respetivas soluções padrão de

calibração. .................................................................................................................. 82

Fig. 20 - Curva de calibração obtida para a Mv-3-gl, com base em quatro pontos, com

representação da respetiva equação algébrica, coeficiente de determinação (R2) e

desvio-padrão da reta (Sy/x) ........................................................................................ 89

Fig. 21 – Gráfico de dispersão com linhas retas, representativo do comportamento da

concentração, em mg/L, das várias antocianinas identificadas num vinho do Porto

(amostra 1) no qual foram identificadas antocianinas típicas de baga de sabugueiro,

além das antocianinas típicas de vinho tinto, ao longo de três meses e respetiva legenda

representada no lado direito do gráfico ..................................................................... 120

Fig. 22 – Gráfico de barras representativo da concentração, em mg/L, do total de

antocianinas identificadas na amostra 1 de vinho do Porto exceto a Vitisin A (barra

laranja) e representação em separado da Vitisin A (barra cinzenta) no primeiro e último

mês de injeção desta amostra. A escala de concentrações, em mg/L, do lado esquerdo

do gráfico é relativa ao total de antocianinas (exceto Vitisin A) enquanto que a escala de

concentrações, em mg/L, do lado direito do gráfico é relativa à Vitisin A. ................. 120




além das antocianinas típicas de vinho tinto, ao longo de três meses e respetiva legenda

representada no lado direito do gráfico. .................................................................... 123

Fig. 24 – Gráfico de barras representativo da concentração, em mg/L, do total de









além das antocianinas típicas de vinho tinto, ao longo de um mês e respetiva legenda

representada no lado direito do gráfico. .................................................................... 126

Fig. 26 - Gráfico de barras representativo da concentração, em mg/L, do total de






Fig. 27 - Mudanças na intensidade da cor dos vinhos durante o seu envelhecimento, em

função da concentração em antocianinas e em compostos fenólicos totais .............. 134

Fig. 28 – Cromatograma de HPLC, representativo das 14 amostras de vinho do Porto

tinto nas quais foram detetadas, além das antocianinas típicas de uva identificadas pelo

método SAMB4, antocianinas típicas de Sambucus nigra, estando as restantes

amostras das 14 totais, no Anexo 12. ....................................................................... 135

Fig. 29 – Cromatograma de HPLC, representativo da amostra de vinho do Porto rosé,

na qual foram detetadas, além das antocianinas típicas de uva identificadas pelo método

SAMB4, antocianinas típicas de Sambucus nigra L. ................................................. 135

Fig. 30 – Cromatograma de HPLC, representativo das 7 amostras de vinhos tintos do

Douro, nas quais foram detetadas, além das antocianinas típicas de uva identificadas

pelo método SAMB4, antocianinas típicas de Sambucus nigra L., estando as restantes

amostras das 7 totais, no Anexo 13. ......................................................................... 135

Fig. 31 – Cromatograma de HPLC, correspondente à amostra de vinho do Porto

envelhecido dopado com solução de baga de sabugueiro. ....................................... 136

Lista de abreviaturas

Cy-3-samb – Cianidina-3-sambubiósido;

Cy-3-gl – Cianidina-3-glucósido;

Cy-3,5-sambgl – Cianidina-3-sambubiósido-5-glucósido;

CIRDD – Comissão Interprofissional da Região Demarcada do Douro;

Conc. – Concentração;

DAD – Detector Diodo Array (Detetor com Arranjo de Fotodiodos);

Df-3-gl – Delfinidina-3-glucósido;

Df-3-acgl – Delfinidina-3-acetil-glucósido;

DOC – Denominação de Origem Controlada;

FCUP – Faculdade de Ciências da Universidade do Porto;

HMF – Hidroximetilfurfural;

HPLC – High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência);

IVP – Instituto do Vinho do Porto;

IVDP, I.P. – Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, IP;

IG – Indicação Geográfica;

IPAC – Instituto Português de Acreditação;

ISO/IEC – International Organization of Standardization/International Electrotechnical

Commission;

LAB – laboratório;

LBV – Late Bottled Vintage;

MIV – método de validação interno;

Min – minuto(s);

Mv-3-gluc – Malvidina-3-glucósido;

Mv-3-acgl – Malvidina-3-acetil-glucósido;

Mv-6-cougl – Malvidina-3-(6-coumaroil)-glucósido.

NP – Norma Portuguesa;

OTA – Ocratoxina A;

P1C – Padrão 1 de calibração;





P1V – Padrão 1 de verificação;

P3V – Padrão 3 de verificação;

Pt-3-gl – Petunidina-3-glucósido;

Pn-3-gl – Peonidina-3-glucósido;

Pt-3-acgl – Petunidina-3-acetil-glucósido;

Pn-3-acgl – Peonidina-3-acetil-glucósido;

Pt-6-cougl – Petunidina-3-(6-coumaroil)-glucósido;

Pn-6-cougl – Peonidina-3-(6-coumaroil)-glucósido;

RDD – Região Demarcada do Douro;

TR – tempo de retenção;

UNESCO – United Nation Educational, Scientific and Cultural Organization

(Organização das Nações Unidas para a Educação, Ciência e Cultura);

UHPLC – Ultra Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Ultra

Eficiência);

UV-Vis. – Ultravioleta-Visível.

Glossário1

Acidez – característica essencial dos vinhos, contribui decisivamente para o seu sabor,

frescura e capacidade de conservação;

Ácido acético – principal ácido do vinagre encontrando-se em quantidades fracas nos

vinhos normais;

Ácido cítrico – ácido constitutivo dos vinhos que proporciona acidez fresca, por vezes

pode ser atacado pelas bactérias da fermentação malolática;

Ácido lático – resulta da decomposição do ácido málico, forma-se durante as

fermentações alcoólica e malolática, dá suavidade ao vinho;

Ácido málico – está presente em muitas frutas como a maça, dá frescura ao vinho,

provém da uva e diminui durante a maturação em garrafa ou quando se realiza a

fermentação malolática;

Ácidos sórbico, benzóico e salicílico – aditivos muito utilizados nas indústrias

alimentar e de bebidas para neutralizar leveduras e bolores, são produtos antisséticos.

O ácido sórbico pode utilizar-se no tratamento de vinhos como adjuvantes do dióxido de

enxofre (SO2);

Ácido tartárico – ácido orgânico que existe na uva e consequentemente no vinho,

principal ácido do vinho;

Açúcares – compostos essenciais do sumo de uva;

Adstringência – sensação de origem química que provoca uma contração das papilas,

corta a salivação e produz uma sensação áspera na língua e no paladar;

1 Glossário elaborado com base em: International Organisation of Vine and Wine (OIV), (1963). Lexique De La Vigne Et

Du Vin Bourdeux e Glossário Sogrape (2017), https://www.sograpevinhos.com/glossario.

Aguardente/Aguardente de produtos vínicos – produto da destilação de vinhos,

borras de vinho, bagaços ou de outra origem como é o caso do medronho. No vinho do

Porto apenas se usa a aguardente vitícola na sua elaboração;

Dióxido de enxofre (SO2) – substância desinfetante que se emprega para garantir o

controlo e a limpeza na elaboração de vinhos, acrescenta-se em doses pequenas e não

deve detetar-se num vinho bem elaborado, tem propriedades clarificantes, antioxidantes

e antisséticas, o seu uso está estritamente regulamentado;

Bactérias – microrganismos que estão presentes na fermentação malolática (bactérias

láticas), algumas podem causar doenças ao vinho ou acetificação originado pela

bactéria acética;

Beneficiação (ou aguardentação) – adição de aguardente ao mosto em fermentação;

Caraterísticas mesológicas – condições do meio ambiente;

Casta – variedade de uva, um dos elementos determinantes na caracterização de um

vinho e na sua tipicidade, a mesma casta em solos e climas diferentes origina vinhos

diferentes embora algumas componentes aromáticas da casta se mantenham;

Cepa – tronco da videira de onde brotam os sarmentos (galhos), as folhas e os frutos;

Cuba – depósito onde se desenvolve a fermentação dos mostos ou o armazenamento

de vinhos feitos, de preferência devem ser em aço inoxidável, mas também existem em

cimento revestido;

Densidade – relação entre a massa de um certo volume de uma substância a 15 ou 20

°C, e a massa do mesmo volume de água a 4 °C;

Desengace – operação que consiste em separar os bagos do engaço para evitar que o

vinho fique com taninos em demasia;

Engaço – parte verde e lenhosa do cacho que serve de suporte aos bagos da uva,

quando está muito presente nos vinhos dá-lhes aromas e sabores herbáceos;

Esgotamento – recolha do líquido obtido imediatamente antes de uma prensagem;

Fermentação – passos catabólicos de organismos anaeróbios produzindo gás

carbónico e outros detritos carbonados, sobretudo o etanol (álcool etílico) na

fermentação alcoólica;

Fermentação alcoólica – transformação do açúcar das uvas em álcool por ação das

leveduras;

Fermentação malolática – transformação do ácido málico em ácido lático, por ação

das bactérias láticas, pode ocorrer durante a fermentação alcoólica ou posteriormente,

caso não se controle a sua ocorrência pode dar-se após o engarrafamento originando a

formação de gás e tornando o vinho desagradável;

Hidroximetilfurfural – produto cristalino com um odor agradável, produzido durante a

separação de monossacarídeos. Uma das substâncias mais características do

envelhecimento oxidativo em vinhos fortificados (bom marcador de idade);

Lagar – recipiente em granito (ou inox) onde as uvas são pisadas a pé (ou através de

pisa mecânica) e onde decorre a fermentação do mosto, tem dimensões variáveis;

Leveduras – fungos unicelulares que se encontram nas películas das uvas e que

desencadeiam a fermentação alcoólica, por insuficiência podem ser inoculadas no

mosto para permitir a fermentação;

Maceração – termo que designa o contacto entre o mosto e as partes sólidas durante

a fermentação que pode ser mais ou menos prolongada, com o objetivo de extrair delas

as suas propriedades. Ao contrário da fermentação alcoólica, que beneficia de uma

baixa temperatura (28 °C) da cuba, esta pode realizar-se a 30 °C, para obter maior

dissolução dos polissacarídeos;

Maturação – fase fisiológica do ciclo da vinha, que começa no verão com o “pintor”

(mudança de cor das uvas) e acaba com a vindima;

Mosto – sumo da uva que não sofreu fermentação;

Organolético/a – apreciação sensorial de um vinho – cor, aroma e sabor, o mesmo

termo é usado para outros produtos alimentares (ex. azeite);

Oxidação – transformação de um vinho pelo contacto com o oxigénio o que se traduz

por uma modificação da sua cor, conferindo-lhe aromas característicos;

Películas – cobertura exterior do bago de uva, contêm elementos importantes como a

matéria corante (antocianinas), os taninos e componentes aromáticos;

Pipa, casco – recipiente de madeira de capacidade variável, tendo a forma de dois

troncos de cone unidos pelas suas bases e que serve para a fermentação e transporte

dos vinhos;

Terroir – termo francês que traduz a influência de inúmeros fatores na qualidade das

uvas de uma determinada vinha;

Tonel – recipiente grande de carvalho ou de castanho com uma capacidade de 600 ou

900 L, para o armazenamento dos vinhos e, por vezes, da sua fermentação;

Trasfega – operação que consiste em mudar o vinho de uma vasilha para outra com o

fim de separar do seu depósito (borras) ou de o arejar;

Vitis vinífera – nome genérico da vide europeia (independentemente da casta);

Vinho lotado – vinho obtido pela mistura de dois ou mais vinhos.

FCUP Controlo da qualidade dos vinhos

Deteção de Sambucus nigra L. em vinhos do Douro e do Porto por HPLC | 27

Capítulo I - Introdução



Capítulo I – Introdução

O Estágio em contexto empresarial que deu origem à presente dissertação para

obtenção do grau de Mestre, foi realizado no setor da cromatografia líquida do

laboratório do Instituto dos Vinhos do douro e Porto, I.P. A presente dissertação está

dividida em seis partes: Índices e Glossário, Introdução, Procedimento Experimental,

Resultados e Discussão, Anexos e Bibliografia, cada um subdividido em categorias que

a seguir se apresentam.

O setor do vinho do Douro e Porto

A história do vinhedo do Alto Douro é bastante antiga pelo que não faltam descobertas

arqueológicas e referências documentais a testemunhar a persistência cultural do

empenho vitivinícola de outras eras (Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2018)).

Só em meados do século XVII, é que a região do Douro se tornou fonte do hoje

conhecido como, vinho do Porto. Naquela época, o vinho do Porto não era o vinho

fortificado que conhecemos, era maioritariamente seco, embora uma pequena

quantidade de aguardente de produtos vínicos fosse adicionada antes do transporte

para garantir as boas condições do vinho até ao consumidor (Fonseca Porto (2018)).

A primeira vez que aparece a designação “vinho do Porto” é em 1675, a propósito de

um vinho exportado para a Holanda, que muito provavelmente se referia aos vinhos

saídos da barra do Porto e não unicamente oriundos do Douro. A discussão sobre o

vinho que melhor caraterizaria o tipo “Porto” prolongou-se até dentro do século XIX

havendo os defensores da tradição, que preferiam vinhos secos com “pouca ou

nenhuma aguardente” enquanto os opositores defendiam os vinhos doces. No entanto,

a criação do vinho do Porto como é hoje conhecido, foi-se reformulando ao longo do

tempo havendo uma influência inglesa que acabou por determinar o estilo do vinho

como doce, retinto e encorpado (Martins, 2011).

No último terço do século XVII, flamengos e ingleses aumentam a procura dos vinhos

ibéricos em detrimento dos vinhos franceses. A Inglaterra importa crescentes

quantidades de vinho do Porto e em 1703, Portugal e o Reino Unido assinam o “Tratado

de Methuen”, também conhecido por “Tratado de Panos e Vinhos” segundo o qual os

vinhos portugueses passavam a pagar apenas 2/3 dos direitos que eram cobrados aos



vinhos franceses e, em contrapartida, Portugal dava preferência aos têxteis ingleses.

Com este tratado e a elevada admiração destes vinhos pelos ingleses, houve uma

produção intensiva na região, na tentativa de dar resposta à elevada procura, o que não

impediu a existência de alguns casos de falsificação de vinhos (Instituto dos Vinhos do

Douro e Porto, (2018); Martins, 2011; Douro Family Estates, (2018)).

Já na década de 1750, surgem novas complicações, resultantes de uma queda

acentuada na procura e um excesso de produção no Douro. Em 1756, o Marquês de

Pombal aplica medidas que visam regular a produção de forma a diminuir os excessos

através do controlo estatal sobre o comércio do vinho do Porto, bem como sobre a

produção de aguardente usada na fortificação. Neste contexto surge a Comissão Geral

da Agricultura dos Vinhos do Alto Douro, que assegura a qualidade do produto evitando

adulterações, como a adição de sumo de baga de sabugueiro, equilibra a produção e

comércio, e estabiliza os preços. Procede-se também à primeira “demarcação das

serras” pois sem uma demarcação da região era impossível assegurar que as uvas

provinham de boas zonas do Douro (Fonseca Porto (2018); Taylor’s, (2018); Martins,

2011).

O Alto Douro Vinhateiro foi a primeira região vitícola regulamentada do mundo tendo

sido demarcada por marcos de pedra com a designação de “Feitoria”, como o exemplo

da figura 1, que se referia ao vinho de melhor qualidade, único que podia exportar-se

para Inglaterra, vulgarmente conhecido por vinho fino (Instituto dos Vinhos do Douro e

Porto, (2018)).

Fig. 1 - Marco de pedra com a designação "Feitoria" situado na entrada principal do IVDP, I.P., delegação do Porto (IVDP, I.P. (2018))



Em 1844, é criado um mapa da região demarcada. Vinhas fora daquela região foram

destruídas pelas autoridades (Robinson, 1994).

Depois das destruições provocadas nos anos cinquenta pelo aparecimento de doenças

da videira, muitos vinhedos foram reduzidos a “mortórios2”. Aos poucos, o vinhedo do

Douro foi-se reorganizando e estendendo ao Douro superior. Todavia, no final dos anos

80 surge um novo desafio para a indústria vinhateira, a crise comercial. Tal feito leva,

por sua vez, a uma intensificação de fraudes, manifestadas em imitações do vinho do

Porto (Filipe et al., 1990; Guichard et al., 2003).

Em 1907, assina-se um decreto que vem regulamentar a produção, venda, exportação

e fiscalização do vinho do Porto numa tentativa de retrocesso à política pombalina de

defesa da marca. Demarca-se novamente a região produtora incluindo agora o Douro

Superior e reserva-se a denominação de “vinho do Porto” para vinhos generosos da

região do Douro, com teor alcoólico mínimo igual a 16,5% vol. Esta proteção e

fiscalização da marca ficam a cargo da Comissão de Viticultura da Região do Douro

(CVRD). Devido à pressão exercida pelos viticultores do Sul, o decreto regulamentador

do comércio das aguardentes proibia a destilação dos vinhos durienses, obrigando o

Douro a receber de outras regiões vitícolas a aguardente para beneficiação dos seus

vinhos. Este facto, tal como o alargamento excessivo da área de demarcação, gera

alguma polémica levando a uma nova demarcação, por freguesias. Esta redemarcação

reduz a área produtora de vinho do Porto, praticamente ao espaço da atual demarcação.

Como resultado desta política, as exportações aumentam a um ritmo avassalador,

atingindo mais de cem mil pipas (Guichard et al., 2003).

Em 1926, o novo regime militar vem introduzir mudanças significativas no setor vinícola,

impondo alterações na organização do comércio de vinho do Porto e da lavoura

duriense e reforçando o intervencionismo estatal. Nesse sentido, surge o Entreposto em

Vila Nova de Gaia, como extensão da região demarcada. Todos os que se dedicassem

ao negócio do vinho do Porto seriam, daqui em diante, obrigados a armazenar os vinhos

em Gaia, acabando com as exportações diretas, a partir da região demarcada.

2 Vinhas destruídas pelas doenças.



Em 1932, dá-se a formação da Casa do Douro que se tornou, mais tarde, um

instrumento institucional controlado pelo governo, visando disciplinar e submeter os

interesses dominantes da lavoura duriense (Guichard et al., 2003).

Um ano mais tarde, são instituídos o Grémio dos Exportadores do Vinho do Porto

(associação com funções de zelar pela disciplina do comércio), e o Instituto do Vinho do

Porto (IVP), representante do Estado, que tem como funções o estudo e promoções da

qualidade, emissão dos certificados de origem, a fiscalização e promoção do produto.

Assim, as atividades da Casa do Douro e do Grémio dos Exportadores, passam a ser

coordenadas pelo IVP. Posteriormente, aparece a Câmara de Provadores oficiais,

integrada no IVP, sendo que o controlo da qualidade do vinho do Porto destinado a

exportação, passa a ser feito pela prova oficial, tornada obrigatória, simultaneamente às

análises laboratoriais (Filipe et al., 1990).

Após 1974, a organização corporativa é extinta, mantendo-se a Casa do Douro e o IVP

com as suas funções de defesa da qualidade da marca. O Grémio dos Exportadores do

Vinho do Porto passa a designar-se Associação das Empresas de Vinho do Porto

(Guichard et al., 2003).

Em 1986, funda-se a Associação de Produtores Engarrafadores de Vinho do Porto com

vista à exportação direta, a partir da região do Douro. Mais tarde, a Região Demarcada

do Douro (RDD) passa a estar dotada de um organismo interprofissional – a Comissão

Interprofissional da Região Demarcada do Douro (CIRDD), com sede na Régua,

integrando tanto representantes da lavoura como do comércio, tendo como objetivo o

controlo da produção e comercialização dos vinhos da região com direito a

Denominação de Origem Controlada (DOC) sendo que todas as alterações introduzidas,

respeitam as particularidades históricas, sociais e culturais da região. Duas secções

especializadas formam agora o Conselho Geral da CIRDD que determina as regras

aplicáveis a cada uma das denominações: uma relativa à denominação de origem

“Porto” e outra aos restantes vinhos de qualidade da região (Guichard et al., 2003).

O modelo anterior sofre alterações, quando em 2003 se dá a alteração da CIRDD por

um Conselho Interprofissional integrado no, agora designado, Instituto dos Vinhos do

Douro e Porto, I.P. (IVDP, I.P.) (Guichard et al., 2003).



Região Demarcada do Douro

Após a sua demarcação oficial, a RDD ocupa desde 1921 uma área de cerca de 250.000

ha, e está situada a nordeste de Portugal, na bacia hidrográfica do Douro limitada a

oeste, pelas serras do Marão e Montemuro, que fornecem as caraterísticas mesológicas

e climáticas particulares, e por Barca d’Alva a este, na fronteira com Espanha. Já a norte

e sul é mais difícil definir limites sendo estes variados, no entanto, pode dizer-se que a

altitude funciona como limite. Deste modo, não se pode produzir, vinho do Porto ou do

Douro a partir de, 400 e 700 metros, respetivamente. Do ponto de vista geológico, é o

xisto que domina a região sendo uma rocha de superfície que apresenta boas condições

para o cultivo da vinha (boa permeabilidade à água, permite boa penetração das raízes

e contraria a erosão). (Robinson, 1994; Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2017);

Martins, 2011).

A RDD é dividida em três sub-regiões oficialmente reconhecidas e naturalmente

distintas (figura 2), não só por fatores climáticos, mas também socioeconómicos.

Fig. 2 - Mapa da RDD dividida nas três sub-regiões (Vinhos em Segredo, (2018))

O Baixo Corgo é a mais a oeste das três e cobre a região a jusante do rio Corgo que flui

para o Douro logo acima da cidade da Régua. Das três, esta é a zona mais húmida e

com maior concentração de vinha, originando vinhos mais ligeiros e menos estruturados

adequados para a produção de vinhos do Porto estilos Tawny e Ruby “standard”. É

também uma zona propícia à produção de vinhos DOC Douro (Robinson, 1994; Martins,

2011).



A segunda região é designada por Cima Corgo, situa-se acima do rio Corgo, centrada

na cidade de Pinhão e é o coração da RDD. Aqui a precipitação é significativamente

mais baixa e as temperaturas de verão um pouco mais elevadas. É do Cimo Corgo que

saem a maior parte dos grandes vinhos do Porto, como Tawnys de alta qualidade, Late

Bottled Vintage (LBV) e Vintage. Segundo o autor (Martins, 2011) o segredo para a

qualidade, reside num vasto conjunto de fatores, podendo destacar-se a junção entre

um solo bem xistoso e um clima mais agreste. A produtividade por cepa é menor e a

qualidade é visivelmente superior (Robinson, 1994; Martins, 2011).

Por fim, das três regiões, a que se situa mais a leste, é o Douro Superior. Esta é a sub-

região pioneira e a de maior área. Embora faça parte da RDD há muito, é remota e

pouco povoada. É também a zona mais árida da região, com temperaturas médias de,

pelo menos, mais 3ºC que na Régua, mas consegue produzir vinhos de excelente

qualidade. Graças às potencialidades que esta sub-região tem demonstrado e à relativa

facilidade de mecanização, observa-se um elevado incremento de novas plantações,

geralmente bem dimensionadas, reduzindo os custos de produção e proporcionando

produtos vínicos de elevada qualidade (Robinson, 1994; Martins, 2011; Filipe et al.,

1990).

É ainda de destacar que, sendo a RDD, a mais antiga região vitícola regulamentada e

demarcada do mundo, realça-se a relação íntima que se criou entre a atividade humana

e a natureza permitindo criar um ecossistema de valor único que foi inscrita na Lista do

Património Mundial da UNESCO (United Nations Educational, Scientific and Cultural

Organization) em 2001. (Comissão Nacional da UNESCO, 2017)



Vinificação dos vinhos do Porto

A enologia começa na vinha, local onde todas as decisões base são tomadas, desde a

data exata da vindima, no momento ótimo de maturação de cada vinha, até ao

comportamento de cada casta e sua combinação correta na vinificação (Guichard et al.,

2003).

Inicialmente, a vinificação consistia na transformação das uvas pelo método tradicional,

com regras simples e empíricas, mas muito eficazes para produzir nos lagares os

melhores vinhos do Porto e do Douro. Com o desenvolvimento da ciência e

aparecimento da figura do enólogo, surgem alterações na tradição. O enólogo procede

a um estudo dos resultados das amostras de bagos recolhidos, semana a semana até

à vindima. Contudo, o lagar continua a ser uma referência para qualquer enólogo

(Guichard et al., 2003; Filipe et al., 1990).

Na figura 3, apresenta-se um esquema-resumo da vinificação típica em vinhos do Porto.



Fig. 3 - Esquema resumido da vinificação completa dos vários estilos de vinhos do Porto (Filipe et al., 1990),( Clube dos Vinhos Portugueses, (2018))

Tradicionalmente os vinhos do Porto e vinhos tintos da região do Douro são vinificados

em lagares feitos de granito - material que favorece condições para a realização da pisa

das uvas e da fermentação. Após se colocarem as uvas nos lagares, aplica-se o dióxido

UvasEsmagamento

Desengace

Fermentação

Maceração

Envasilhamento (encuba)

Trasfega Lotação

Prensagem Aguardente

77%

Vinho do Porto

Envelhecimento

Designação

Geral

Tipo de vinho do

Porto

Envelhecimento

em garrafa

Engarrafamento



de enxofre necessário para impedir o desenvolvimento das bactérias láticas e acéticas

que provocam alteração. Depois, trabalhadores contratados pisam as uvas esmagando-

as, enquanto o mosto se mistura com as películas, obtendo a melhor extração possível

e sem qualquer esmagamento mecânico. Hoje em dia, o desengace e esmagamento

são geralmente feitos por um só equipamento (esmagador-desengaçador) além da pisa

humana, estando a maioria das etapas de vinificação, inteiramente mecanizadas.

Sempre que necessário, sujeitam-se as uvas esmagadas à correção da sua acidez com

aplicação de ácido tartárico. Assim que as uvas estiverem espremidas, o volume do

mosto com suspensões de películas, engaços e outros sólidos aumenta e começa a

aquecer, uma vez que a levedura entra em contacto com o açúcar natural do sumo de

uva. Dá-se início à fermentação obtendo-se como principal produto o álcool etílico. A

fermentação surge da degradação dos açúcares pelas leveduras. Os compostos

fenólicos e restantes constituintes das películas, são mais solúveis em meio alcoólico e

temperaturas mais elevadas, o que facilita nesta fase a extração. No método clássico

de vinificação utilizam-se cubas de fermentação em inox com controlo de temperatura

(Douro Family Estates, (2017); Martins, 2011; Filipe et al., 1990; Caderno de

Especificações: DO “Porto”, (2018))

Durante todo o trabalho no lagar, é indispensável fazer algumas análises ao mosto para

o controlo da temperatura de fermentação e da densidade para se saber qual o

momento exato da adição da aguardente de produtos vínicos (Martins, 2011).

A última fase deste processo de vinificação, é designado por “encuba” e consiste na

separação do líquido das massas. É após esta separação que se procede à adição da

aguardente de produtos vínicos ou beneficiação. Suspende-se a fermentação e,

portanto, as leveduras deixam de conseguir reagir para transformar o açúcar em álcool.

Como resultado obtém-se um vinho naturalmente doce. Caso se queira obter um vinho

do Porto seco, deve deixar-se que a fermentação se prolongue durante mais tempo e

só depois adicionar a aguardente de produtos vínicos. Após a adição da aguardente, o

vinho é lotado para se homogeneizar, deixando-se estagiar até à Primavera seguinte.

Em janeiro, todos os vinhos jovens são provados, classificados e distribuídos para as

diferentes categorias de vinhos do Porto (Filipe et al., 1990; Martins, 2011; Guichard et

al., 2003).

Não é obrigatório por lei que a aguardente seja nacional, sendo que cada produtor pode

escolher a sua origem geográfica desde que o IVDP, I.P. aprove previamente. Em



particular, no caso do vinho do Porto e moscatel do Douro, Portugal e Espanha são,

atualmente, os maiores fornecedores de aguardentes (Martins, 2011).

A vinificação tradicional ainda existe no Douro, no entanto, há muito menos lagares em

funcionamento, essencialmente porque requerem uma quantidade de mão-de-obra que

atualmente se torna difícil de encontrar. Assim, é comum as casas reservarem os

lagares para as melhores uvas, que possivelmente poderão originar um vinho estilo

Vintage. As restantes uvas, são vinificadas em cubas de inox que é muito mais higiénico

e permite diminuir os ataques de bactérias (Martins, 2011)

Existem dois grandes estilos de vinhos do Porto fortificados que se caraterizam pelo seu

envelhecimento: envelhecidos em madeira (wood matured) ou amadurecidos em

garrafa (bottle matured). Os primeiros são envelhecidos em barris e estão prontos a ser

consumidos após filtração e engarrafamento. Os vinhos do Porto feitos para estagiar

em garrafa, são envelhecidos por um curto período de tempo antes de serem

engarrafados podendo levar até 20 ou 30 anos até que estejam prontos a ser

consumidos.

A cor dos diferentes tipos de vinho do Porto tinto pode variar entre o retinto e o alourado-

claro, podendo existir todas as tonalidades intermédias. Quanto aos vinhos do Porto

brancos, apresentam grande diversidade de cores desde branco pálido, branca palha a

branco dourado; quando são envelhecidos em casco durante muitos anos, adquirem um

tom alourado-claro, por oxidação natural, idêntico ao dos vinhos tintos muito velhos.

Mais recentemente foi introduzido um novo estilo, o Rosé, que se pode considerar um

vinho sem envelhecimento (Robinson, 1994; Instituto dos Vinhos do Douro e Porto,

(2017); IPort Wine, (2018)).

Fig. 4 - Representação de algumas das cores que se podem encontram nos vários estilos de vinho do Porto existentes (A vida secreta dos vinhos, (2018)).



Na tabela 1, segue uma descrição mais pormenorizada dos diferentes estilos de vinho

do Porto.

Tabela 1 – Divisão e descrição dos vários estilos de vinho do Porto (Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2018).

Estilos de vinho

do Porto

Descrição Subcategorias Descrição

Ruby

É dos estilos de vinho

do Porto mais simples

e menos dispendioso.

Como o nome indica, a

sua cor é semelhante

a um ruby. “Vinhos em

que se procura manter

a evolução da sua cor

tinta, mais ou menos

intensa, e o aroma

frutado.” Além do

estilo Ruby simples,

pode dividir-se em

mais 3 subcategorias.

Reserva

Fazem parte

desta categoria

vinhos que

geralmente

resultam da

seleção dos

melhores vinhos

de cada ano,

que se

combinam para

criar um vinho

jovem, frutado

de tons

vermelho rubi

escuro. São

vinhos ricos e

encorpados.

LBV (Late Bottled

Vintage)

Vinhos de

qualidade de um

único ano com

um estágio de 4

a 6 anos antes

do

engarrafamento,

a maioria estão



prontos a

consumir após a

sua compra.

Apresentam

uma cor

vermelha rubi

intensa e são

bastante

encorpados e

ricos de sabor.

Vintage

Este estilo, é

considerada a

preciosidade

dos vinhos do

Porto e é o único

que envelhece

bem em garrafa.

São os mais

dispendiosos e

de uma só

colheita de um

único ano.

Feitos a partir

das melhores

uvas

selecionada da

região do Cima

Corgo e

engarrafados

dois ou três

anos após

vindima

evoluindo



gradualmente

entre 10 a 50

anos em

garrafa. Nos

primeiros 5 anos

de

envelhecimento,

os Vintage

mantêm a cor

rubi intensa e

aromas a frutos

vermelhos e

chocolate negro,

após 10 anos,

desenvolvem

uma tonalidade

vermelho

granada e

sabores a frutos

maduros. Existe

ainda uma

categoria

especial

denominada

“Porto Single

Quinta Vintage”

que, além de

serem e um só

ano, são

também de uma

só quinta.

Tawny Vinho de cor alourada

obtido por lotação de

Reserva Envelhecidos

em madeira e de



grau de maturação

variável com várias

trasfegas.

Envelhecimento em

madeira (cascos ou

tonéis) durante muito

mais tempo que um

Ruby. A sua cor

demonstra evolução e

os aromas têm um

toque a frutos secos e

madeira. Provêm de

lotes de vários anos à

exceção dos Colheita

que são idênticos aos

Tawny com Indicação

de Idade (mesmo

tempo de

envelhecimento)

Divide-se também em

três subcategorias.

cor âmbar

médio.

Apresentam

uma

combinação de

sabores a frutos

jovens e

amadurecidos.

Com Indicação

de Idade

Vinhos de lotes

de vários anos

cuja idade

média é a

indicada no

rótulo (10 anos,

20 anos, 30

anos, 40 anos),

ricos e

complexos.

Permanecem

por vários anos

em cascos até

começarem a

assumir uma cor

alourada e um

caráter suave à

medida que os

compostos

fenólicos se vão

polimerizando.

Colheita Resultam de

uma só colheita

em ano



específico e são

envelhecido em

cascos de

madeira por um

período mínimo

de 7 anos até

serem

engarrafados e

apresentam um

amplitude de

cores do tinto

alourado ao

alourado.

Branco

Feitos a partir de

castas brancas.

Apresentam diferentes

estilos, relacionados a

períodos de maior ou

menor

envelhecimento e,

consequentemente,

diferentes níveis de

doçura distintos. São

jovens e frutados e

apresentam teor

alcoólico mínimo de

16,5%. Atualmente

também já existem

vinhos do Porto

brancos com 10, 20,

30 anos tal como os

- -



Tawny com Indicação

de Idade.

Rosé

Vinhos rosados

obtidos por

maceração pouco

intensa de castas

tintas. Não se

promove a oxidação

durante o seu

armazenamento e

devem consumir-se

novos. Têm tons de

frutos vermelhos.

- -

Ao nível da doçura, o vinho do Porto pode classificar-se em muito doce, doce, meio-

seco, seco ou extra-seco. A doçura constitui uma opção de fabrico, como consequência

da interrupção da fermentação (Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2018)).

Vinificação dos vinhos do Douro

Os vinhos do Douro são vinhos de fermentação alcoólica completa. Inicialmente eram

oriundos de sobras de uvas produzidas para a elaboração do vinho do Porto e só nos

anos cinquenta, alguns produtores iniciam o estudo da sua produção acreditando na

possibilidade de se poder produzir no Douro, vinhos brancos e tintos de alta qualidade

(Filipe et al., 1990).

Quanto à sua vinificação, a forma tradicional de vinificação é a que produz vinhos do

Douro com maior extração de cor (antocianinas) e adstringência (taninos) conferindo

aos vinhos, bom potencial de envelhecimento. Já o método moderno, produz vinhos

mais elegantes e onde os aromas são melhor preservados (Filipe et al., 1990; Instituto

dos Vinhos do Douro e Porto, (2018)).



Nas figuras 6 e 7 estão esquematizadas, as etapas das vinificações em tinto e em

branco, respetivamente, que devem ser levadas a cabo para os vinhos do Douro.

Fig. 5 - Esquema-resumo da vinificação em vinhos tintos do Douro (Filipe et al., 1990).

Na vinificação em tinto, após a receção da uva, é feito o desengace e esmagamento

através do esmagador-desengaçador que causa o rebentamento da película das uvas

para que o suma da uva (mosto) fique disponível para a fermentação.

O mosto é então colocado em cuba de fermentação. Depois do bago ter sido rebentado,

as massas (mistura de líquido e uvas rebentadas) ainda possuem algo mosto no interior

dos bagos. O mosto que se recolhe apenas do rebentamento das películas e cai

diretamente da prensa sem sofrer prensagem, ou seja, obtido por esgotamento, é

chamado mosto de gota e é encubado. O restante mosto é prensado e, posteriormente,

Uva Tinta

Vinificação

Esmagador-Desengaçador

Cuba de Fermentação

CubaPrensa



o vinho de prensa é adicionado ao vinho de gota em proporções variadas (Filipe et al.,

1990; Clube dos Vinhos Portugueses (2018)).

Fig. 6 - Esquema-resumo de uma vinificação típica de vinhos brancos do Douro (Filipe et al., 1990).

Nos vinhos brancos do Douro, que tanto podem provir de uva branca como de uva tinta,

a uva, após a sua chegada, é diretamente prensada (prensa direta). O mosto

proveniente da prensagem é clarificado (no caso de provir de uvas tintas tem de haver

clarificação muito intensa) por defecação a frio onde as partículas em suspensão, se

depositam no fundo da cuba e são eliminados por trasfega. De seguida, o mosto límpido,

é colocado em cuba ou casco para fermentar (a fermentação deve ser controlada de

maneira a não ultrapassar os 30 °C) (Filipe et al., 1990).

Função do IVDP, I.P.

O IVDP, I.P., é um instituto público, integrado na administração indireta do Estado,

dotado de autonomia administrativa e financeira e património próprio, sendo um instituto

público de natureza interprofissional. É um organismo central com jurisdição sobre todo

o território nacional com sede em Peso da Régua e delegação no Porto onde funciona

Uva Tinta/Uva Branca

Prensa Direta

Prensa

Cuba

Casco

Cuba



a Direção dos Serviços Técnicos e Certificação e se encontra instalado o laboratório de

análise (artigo nº 1 do Decreto-Lei n.º 97/2012, de 23 de abril; Instituto dos Vinhos do

Douro e Porto, (2018)).

Em termos formais, o IVDP, I.P. tem como funções o estabelecido no artigo nº 3 do Dec.

Lei nº 97/2012, de 23 de abril que diz que “o IVDP, I.P., tem por missão promover o

controlo da qualidade e quantidade dos vinhos do Douro e do Porto, regulamentando o

processo produtivo, bem como a proteção e defesa das denominações de origem

“Douro” e “Porto” e indicação geográfica Duriense.” Promove a imagem de prestígio

internacional para as denominações de origem Porto e Douro, e pretende aumentar a

perceção de valor pelos consumidores, baseada numa forte diferenciação dos produtos

no respeito dos conceitos de denominação de origem e seu terroir (Instituto dos Vinhos

do Douro e Porto, (2018)).

O IVDP, I.P. encontra-se acreditado desde dezembro de 2010 pelo Instituto Português

de Acreditação (IPAC), como organismo de certificação de produtos, pela norma NP EN

ISO/IEC 17065:2014. O Anexo Técnico do Certificado de Acreditação IPAC

N.º C0024 (Anexo 1) e a Lista de Certificações sob Acreditação Flexível (Anexo

2) discriminam o âmbito dessa acreditação. Esta acreditação veio associar-se às já

obtidas por este Instituto para o Laboratório em 1994-Lista de Ensaios Acreditados LAB

(Anexo 3) e para a Câmara de Provadores em 1999-Lista de Ensaios Acreditados CP

(Anexo 4), segundo a norma NP EN ISO/IEC17025: 2005-Requerimentos gerais de

competência para Laboratórios de Ensaio e Calibração (Instituto dos Vinhos do Douro

e Porto, (2018)).

https://www.ivdp.pt/pt/docs/acreditacoes/C0024A1(2016-06-09)_v1.pdf

https://www.ivdp.pt/pt/docs/acreditacoes/ListaCertifica%C3%A7%C3%B5esAcredita%C3%A7%C3%A3oFlex%C3%ADvel_Ed04_26_06_2017.pdf



Serviço de Prova Acreditado do IVDP, I.P.

A Câmara de Provadores do Instituto, cuja criação remonta à data de fundação do IVP

(1933), é um órgão dependente do Serviço de Prova, o qual reporta à Direção de

Serviços Técnicos e de Certificação. Compete-lhe pronunciar-se, do ponto de vista

organolético, sobre a qualidade dos Vinhos e Aguardentes que lhes são apresentados.

A sua avaliação pode ter diversas finalidades: atribuição da Denominação de Origem

Controlada do vinho do Porto e sua fiscalização e, ainda, a prestação de serviços aos

Operadores do sector (Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2018)).

As amostras são colocadas em prova segundo uma determinada ordem e todas as

amostras são analisadas segundo o Método de ensaio Interno do IVP, MIVP101 –

Classificação de características organoléticas em grupos ou classes e escalas nos

parâmetros: limpidez, cor, aroma, sabor, defeito e notação, e nos vinhos com indicação

de idade, além de todos estes parâmetros é também avaliada a idade (Instituto dos

Vinhos do Douro e Porto, (2018)).

Os vinhos comercializados com as DOC Douro e Porto, assim como os comercializados

com a IG Duriense, têm que exibir nas respetivas garrafas, os selos de garantia,

aprovados e emitidos pelo IVDP, I. P. Os selos de garantia são numerados

sequencialmente, para permitirem um adequado controlo de utilização (Instituto dos

Vinhos do Douro e Porto, (2018)).

Fig. 7 - Selos de garantia emitidos pelo IVDP, I.P. (Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2018); Clube dos Vinhos Portugueses, (2018)).

Laboratório Acreditado do IVDP, I.P.

O Laboratório do IVDP, I.P. é, pioneiro em Portugal na obtenção de um Certificado de

Qualificação (1994), nestes domínios, dentro do sector vitivinícola, designadamente dos



vinhos licorosos e aguardentes. Encontra-se disponível para a prestação de serviços

analíticos, não só ao sector do vinho do Porto como também ao sector vitivinícola

nacional em geral. As determinações que se executam, sobre vinhos e aguardentes

vínicas empregam os métodos oficiais de análise ou, na sua falta, métodos

reconhecidos internacionalmente. Dada a especificidade dos vinhos licorosos, diversos

métodos de análise foram adaptados e avaliados, constituindo métodos internos

(Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2018)).

Sendo o laboratório do IVDP, I.P., um laboratório acreditado, deve evidenciar

experiência prática na realização de ensaios/calibrações segundo os métodos para os

quais está acreditado, a fim de permitir avaliar e comprovar a competência e

familiarização com os mesmos. Para que o estado de acreditação seja mantido são

realizadas auditorias (Guia para aplicação da NP EN ISO/IEC17025 (2005)).

No Serviço de Laboratório fazem-se vários tipos de análises sendo cada um dos cinco

setores, operado por um corpo técnico convenientemente formado e especializado

(Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2018)).

Nestes laboratórios avalia-se o cumprimento dos rigorosos requisitos

qualitativos exigidos ao vinho do Douro e do Porto, dos quais se destacam os que se

prendem com a certificação dos DOC e a avaliação da segurança como produto

alimentar (Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2018)).

Setor da Cromatografia Líquida

As análises executadas neste laboratório são essencialmente baseadas em duas

técnicas: cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e eletroforese capilar. A HPLC

permite caraterizar os vinhos quanto aos açúcares redutores (glucose e frutose), glicerol

e hidroximetilfurfural (HMF) enquanto que a eletroforese capilar permite caraterizar

quanto a ácidos orgânicos (tartárico, málico, láctico, etc.). A nível de segurança

alimentar e garantia da qualidade é analisada a OTA, os conservantes e a sacarose.

Recentemente, o setor da cromatografia líquida foi equipado com um sistema de

cromatografia líquida de ultra eficiência (UHPLC), sendo este o aparelho destinado ao

meu projeto, apesar de não ter sido utilizado um método típico desta nova técnica, mas

sim um método de HPLC já existente (Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2018)).



Introdução à técnica de HPLC

Atualmente, a maioria das análises são realizadas com recurso a métodos instrumentais

uma vez que, ao contrário dos métodos clássicos, são bastante sensíveis, trabalham

com largos intervalos de concentração e são capazes de analisar vários analitos num

dado intervalo de tempo com um adequado tratamento de resultados. Técnicas como a

emissão e absorção espetrométrica a vários comprimentos de onda, eletroquímica,

espetrometria de massa, separações cromatográficas e eletroforéticas são exemplos de

métodos analíticos. Como o presente trabalho se baseia na técnica de HPLC, é sobre

ela que nos vamos debruçar (Miller & Miller, 2010).

A técnica de HPLC surge no final dos anos 60 e advém da evolução da cromatografia

líquida clássica. O HPLC é um dos muitos métodos cromatográficos de análise e

separação de misturas químicas sendo que apresenta inúmeras vantagens

comparativamente a outras técnicas:

é de aplicação praticamente universal;

apresenta uma notória precisão;

existe uma vasta gama de equipamentos, colunas e outros materiais necessários

que permitem o uso de HPLC para quase todas as aplicações;

a maioria dos laboratórios que funcionam com análises de misturas químicas

estão equipados de HPLC, como é caso, sendo muitas vezes a técnica de

eleição.

Quando a injeção é automática, o seu fundamento tem por base a disposição das

amostras num tabuleiro com vários poços (rack) para dar início à injeção automática

(autosampler) na coluna cromatográfica. O(s) solvente(s) é(são) continuamente

bombeado(s) através da coluna e os componentes da amostra que são eluídos,

abandonam continuamente a coluna para posterior deteção. O sinal resultante do

detetor é representado em função do tempo e é designado de cromatograma em que

os picos, representados na figura 8, correspondem a eluições dos componentes da

amostra (Lee, 2011).



Fig. 8 – Sinal detetado num detetor de HPLC em função do tempo, designado de cromatograma (Lee, 2011).

A separação depende do tipo de coluna e pode feita ser de duas maneiras distintas:

separação isocrática, quando a composição do solvente (um eluente ou mistura

de eluentes) permanece sempre a mesma ao longo da separação, ou seja, a

mesma concentração ao longo de toda a corrida sendo esta mais lenta. Separa

um número limitado de analitos e a largura dos picos resultantes, aumenta com

o tempo;

separação por gradiente, quando a composição da fase móvel varia durante a

análise e é composta por 2 a 4 eluentes. Quando são 2 eluentes, A e B, o A é o

mais fraco e o B o mais forte causando a eluição rápida do analito. Este tipo de

separação diminui os tempos de retenção, forma picos mais nítidos e separa

analitos mais complexos. Sendo a esta ultima a utilizada na realização do

presente trabalho (Snyder et al., 2010)

Um computador controla toda a operação durante as análises por HPLC sendo a única

intervenção manual, a colocação das amostras no tabuleiro. Além desta automatização

de todo o processo, a HPLC é caraterizada pelo uso de bombas de alta pressão para

uma separação mais rápida, colunas reutilizáveis e mais efetivas, maior separação e

melhor controlo do processo para se obter resultados precisos e reprodutíveis (Lee,

2011).

Fase estacionária

A coluna consiste num tubo cilíndrico tipicamente preenchido por pequenas partículas

esféricas (normalmente de 1,5 a 5 µm) como representado na figura 9. Estas partículas

que estão na base do enchimento da coluna cromatográfica, são na maioria, sílica

porosa com poros individuais de diâmetro específico. Estes enchimentos podem ser



unicamente sílica ou sílica de fase ligada (bonded phase) em que através de uma reação

química se promove a ligação de um grupo funcional (C18, C8, CN, etc.) aos grupos

hidroxilo livres da sílica. O interior de cada poro é coberto pela fase estacionária, sendo

a mais usual em HPLC, composta por grupos C18 ligados às partículas de sílica. Como

quase toda a superfície da partícula de sílica está contida nos poros, a maioria das

moléculas de amostra agregam dentro da partícula e não na sua superfície (Chust,

1990; Lee, 2011).

Fig. 9 – Coluna de HPLC mostrando o fluxo da fase móvel (Lee, 2011)

Há mais de 30 anos, a sílica tem sido o material preferido para preparação das fases

estacionárias, especialmente para a HPLC de Fase Reversa. A sílica apresenta-se em

unidades tetraédricas de dióxido de silício (SiO4) aleatórias, unidas por grupos siloxanos

e na superfície apresenta grupos silanois, como se mostra na figura 7. O destaque da

sílica como suporte cromatográfico em HPLC, deve-se às suas caraterísticas vantajosas

como ter boa resistência mecânica e estabilidade química térmica, área superficial

(indicativa da capacidade de adsorção do enchimento) e estrutura de poros controláveis

(totalmente porosa, superficialmente porosa, etc.) e presença de grupos silanois

suscetíveis a posteriores modificações na preparação de diferentes fases estacionárias,

consoante o tipo de separação cromatográfica pretendida (Tonhi et al., 2002;

Domingues Nazario & Lanças, 2013).

Fase móvel



Fig. 10 – Estrutura da sílica e grupos presentes (Carvalho, Lima, & Soares, 2014).

As características físicas das partículas são importantes, especialmente o seu tamanho,

uma vez que determina em grande parte, a eficiência da coluna. Partículas com

diâmetros à volta dos 5 µm, são geralmente preferidas para análises de rotina. As

partículas deste tamanho representam uma boa eficiência. No entanto, colunas com

diâmetro de partícula de 3 µm e menores, têm-se tornado usuais principalmente para

diminuir o tempo de corrida e aumentar a taxa de transferência da amostra. As colunas

com diâmetros de partícula pequenos, geram picos mais estreitos, minimizando o

alargamento do pico extra-coluna e podem utilizar-se com equipamentos que operam a

pressões mais elevadas.

Fase móvel

A fase móvel é composta de eluente(s) que rodeia(m) cada partícula de sílica à medida

que flui(em) através da coluna e, as moléculas de amostra podem entrar nos poros das

partículas por difusão. A amostra entra na coluna através da fase móvel, a alta pressão,

em etapas sucessivas e, eventualmente os componentes da amostra abandonam a

coluna em diferentes momentos, de modo a fornecer o cromatograma respetivo

(resposta ao longo do tempo) (Lee, 2011).

A HPLC utiliza uma fase móvel líquida para separar os componentes da amostra. Os

solventes usados em HPLC devem ser filtrados antes de se usarem para remover

partículas suspensas que poderiam bloquear o sistema e os gases dissolvidos também

devem ser removidos por desgaseificação com hélio ou azoto ou processamento num



banho de ultrassons. Os cromatógrafos mais recentes já possuem um desgaseificador

incluído. O solvente da fase móvel deve ainda possuir algumas caraterísticas

específicas. A principal característica é que a fase móvel dissolva a amostra sem

qualquer interação química entre ambas; deve também apresentar alto grau de pureza

ou ser de fácil purificação, para que se possam fazer análises de alta sensibilidade; deve

ser compatível com o detetor e, possuir polaridade adequada para permitir uma

separação conveniente dos componentes da amostra. Os solventes mais utilizados em

HPLC são: água, metanol e acetonitrilo (Eurachem, 2014; Kovac, 2006).

Mecanismos da HPLC

A migração diferencial das moléculas de amostra (que são eluídas à medida que

atravessam a coluna consoante a sua afinidade pela mesma), está na base da

separação cromatográfica que vai depender do tipo de coluna utilizada e, do tipo de

mecanismo cromatográfico. A mais comum, e a que é utilizada neste trabalho, é a

cromatografia de fase reversa, no entanto, existem sete mecanismos diferentes de

separação cromatográfica que podem ser utilizados em HPLC. Na cromatografia de fase

reversa (RPC), a coluna é apolar (ex. C18) e a fase móvel é uma mistura polar de água

e solvente orgânico (ex. acetonitrilo), é especialmente usada para amostras solúveis em

água; na cromatografia de fase normal (NPC), a coluna é polar (ex. sílica não ligada), e

a fase móvel é uma mistura de solventes orgânicos menos polares (ex. hexano com

diclorometano), é usada para amostras insolúveis em água e separação de isómeros;

na cromatografia de fase reversa não-aquosa (NARP) a coluna é apolar (ex. C18) e a

fase móvel é uma mistura de solventes orgânicos (ex. acetonitrilo com diclorometano),

é usada para amostras muito hidrofóbicas; na cromatografia de interação hidrofílica

(HILIC) a coluna é polar (ex. sílica ou amida ligada) e a fase móvel é uma mistura de

água com solvente orgânico (ex. acetonitrilo), é usada para amostras altamente polares

e por isso mal retidas em RPC; na cromatografia de troca iónica (IEC) a coluna contém

grupos carregados que podem ligar os iões da amostra de carga oposta e a fase móvel

é geralmente, uma solução aquosa com um tampão salino, é usada para separar

amostras ionizáveis como ácidos ou bases e especialmente para separar grandes

biomoléculas; na cromatografia de par iónico (IPC) são utilizadas as condições da RPC

exceto o facto de se adicionar um reagente de par iónico à fase móvel para interação

com iões da amostra de carga oposta, usada na separação de ácidos ou bases que são

fracamente retidos por RPC e finalmente, na cromatografia de exclusão molecular (SEC)



é usada uma coluna inerte e uma fase móvel aquosa ou orgânica, promove a separação

com base no peso molecular dos componentes da amostra e é usada maioritariamente

para grandes biomoléculas ou polímeros sintéticos (Lee, 2011).

Equipamentos para HPLC

Um sistema típico de HPLC está representado na figura 8.

Fig. 11 – Diagrama de um sistema de HPLC (Lee, 2011).

A fase móvel é extraída de um reservatório para uma bomba que controla a taxa de

fluxo e gera pressão suficiente para conduzir a fase móvel através da coluna. A fase

móvel passa através de um injetor (injeção manual) ou autosampler (injeção automática)

e leva a amostra até à coluna sem interromper o fluxo da bomba. A separação ocorre

na coluna que, normalmente está contida num forno e um detetor responde às

mudanças de concentração do analito durante a corrida. Um sistema de dados

monitoriza a passagem pelo detetor e fornece o processamento dos dados para a

elaboração do cromatograma. Um software controla as funções dos vários módulos,

integra os picos que vão constituir o cromatograma e fornece a área de cada um e a

área total de todos os picos (Lee, 2011).

O sistema de HPLC pode compreender um grupo de componentes individuais referido

como sistema em módulos, ou os componentes podem estar integrados num só como

num sistema integrado sendo o primeiro o mais usual (Lee, 2011).

reservatório

detetor sistema de dados

forno da coluna

coluna

“autosampler”

bomba



A maioria dos métodos analíticos depende da deteção UV-vis, pois estes detetores

apresentam o mais baixo custo, são praticamente insensíveis a pequenas variações de

fluxo e temperatura e totalmente compatíveis para gradientes de solventes. No entanto,

muitos outros detetores estão disponíveis para aplicações especializadas além dos UV-

Vis e estão esquematizados na tabela 2 (Chust, 1990).

Tabela 2 – Detetores utilizados em HPLC (Harris, 2005).

Detetor Limite de deteção

(ng)

de

Gradiente? Aplicação

Ultravioleta 0,1-1 Sim Seletivo

Índice de refração 100-1000 Não Universal

Espalhamento de luz 0,1-1 Sim Alta massa

molecular

Eletroquímico 0,01-1 Não Seletivo

Fluorescência 0,0001-0,01 Sim Seletivo

Espetrometria de massas 0,1-1 Sim Universal

Infravermelho com transformada de

Fourier 1000 Sim Seletivo

O mais usual dentro dos detetores de UV-Vis, e aquele que é utilizado neste

trabalho acoplado a um sistema de UHPLC, é o detetor de arranjo de fotodiodos (DAD)

esquematizado na figura 12. Algumas das suas caraterísticas estão representadas na

tabela 3. Um detetor DAD consiste numa série de detetores de fotodiodos posicionados

lado a lado num cristal de silício de modo a que cada comprimento de onda difratado



atinge um ponto deste arranjo e, consequentemente, um detetor. Permite que a

absorvância de uma amostra seja determinada em todos os comprimentos de onda em

simultâneo (Lee, 2011).

Fig. 12 - Esquema da composição de um detetor DAD (Espetrómetros e Espetrofotómetros, (2018))

Tabela 3 – Algumas caraterísticas típicas de um detetor DAD (HPLC Detectors, (2018)).

Um bom detetor de HPLC deve possuir algumas caraterísticas, tais como (Lee, 2011):

ter grande sensibilidade e resposta previsível;

responder a todos os solutos ou ter especificidade previsível;

não se afetar por mudanças de temperatura ou de fluxo;

responder independentemente da fase móvel;

não contribuir para a ampliação dos picos;

Detetor de arranjo de fotodiodos

Fonte de luz Lâmpada de deutério e de tungsténio

Linearidade >2 UA/h de limite superior

Intervalo de comprimento de onda 190-950 nm

Largura da fenda Programável: 1, 2, 4, 8, 16 nm

Largura do arranjo de fotodiodos < 1nm



ser seguro e de uso conveniente;

não ser destruidor do soluto;

promover informação quantitativa no pico detetado.

Quanto ao sistema de bombeamento da HPLC, o seu desenvolvimento tem sido o fator

mais importante para o próprio desenvolvimento da HPLC. A bomba tem de

proporcionar um fluxo adequado e constante através da coluna para que a análise seja

lenta e para não atrapalhar o sistema de deteção. Assim, os aspetos mais importantes

para o sistema de bombeamento são (Lee, 2011):

pressão máxima de operação na faixa dos 600 bars;

fluxo contínuo e sem pulsos;

intervalo de fluxos entre 0,01 e 10 ml/min para aplicações analíticas e até 100

ml/min para aplicações preparativas;

reprodutibilidade e constância de fluxo de 1%;

inércia química e solventes comuns;

pequeno volume de bombeamento nos sistemas com bomba de pistão, para uso

em eluição por gradiente e reciclagem.

Podem considerar-se essencialmente dois tipos de bombas, as mecânicas e as

pneumáticas sendo que dentro das mecânicas ainda existem as recíprocas (pistão ou

diafragma) e tipo seringa. A maioria das bombas possui uma válvula de purga que dirige

a saída da bomba para os desperdícios durante a passagem de eluente pela bomba, a

troca de eluentes e a remoção de bolhas (Lee, 2011).

No caso das colunas (o “coração” do sistema de HPLC), se estas são utilizadas com

amostras muito sujas, como é o caso do vinho, devem proteger-se com uma pré-coluna

(pequena coluna com o mesmo enchimento ou semelhante da camada porosa usada

na coluna, colocada entre o injetor e a coluna). A capacidade da coluna é determinada

pelo seu comprimento, diâmetro e partículas de enchimento. Quando se usam colunas

de maior comprimento, que efetuam análises mais rápido, devem ser de alta eficiência

(com um diâmetro de partícula pequeno, como referido anteriormente). Por outro lado,

a sua capacidade é muito limitada e consequentemente, a quantidade de amostra deve

ser pequena, o que exige um detetor muito sensível (Lee, 2011).



A influência da temperatura na separação cromatográfica sugere que, os melhores

cromatogramas são obtidos mantendo a temperatura da coluna sensivelmente

constante. Assim, a maioria dos instrumentos comerciais modernos, estão equipados

com fornos que controlam a temperatura da coluna desde a temperatura ambiente até

a 150ºC. Num sistema de HPLC, existe uma larga variedade de colunas, representadas

na tabela 4, dependendo da aplicação pretendida (Chust, 1990; Lee, 2011).

Tabela 4 – Diferentes tipos de colunas de HPLC e respetivas caraterísticas (Lee, 2011).

Parâmetros cromatográficos

Pratos teóricos

A eficiência do sistema de HPLC é expressa em termos da altura (H) dos pratos teóricos,

relacionada com o número de pratos teóricos existentes, N, que é definido como uma

zona fictícia onde a distribuição de um soluto atinge o equilíbrio. A eficiência é então

determinada pela Equação 1 e, expressa-se como o número de vezes que o soluto

atinge o equilíbrio (Lee, 2011).

𝑯 =𝑳

𝑵 Equação 1

H = altura equivalente de um prato teórico;

L = comprimento da coluna;

Tipo Diâmetro interno (mm) Comprimento (mm) Tamanho da partícula (µm)

Analítica 1-4,6 30-250 1,5-10

Cartucho 3-4,6 50-100 3-10

Micro-diâmetro 1, 2-1 50-250 2-8

Semi-preparativa 8-10 100-250 5-200

Preparativa 20-50 100-250 50-200



N = número de pratos teóricos.

Fator de retenção (k)

A interação de uma amostra com a fase estacionária na coluna, é referida como

retenção. Para qualquer sistema cromatográfico, o fator de retenção de um composto é

dado pela razão entre a fração de tempo em que o analito fica retido na fase estacionária

e a fração em que percorre a coluna na fase móvel, de acordo com a Equação 2 (Parris,

1984):

Equação 2

tR = tempo de retenção de um analito, que é o tempo decorrido desde a injeção até o

ponto máximo do pico;

tM = tempo de retenção de um analito não retido;

t'R = tempo de retenção ajustado.

Resolução

A resolução define-se como a capacidade de uma coluna cromatográfica para separar

dois compostos A e B (Lee, 2011):

Equação 3

Onde:

tRB e tRA = tempo de retenção dos dois picos adjacentes;

WB e WA = largura dos picos na base, em unidades de tempo.



Equação de van Deemter

É a equação que relaciona o alargamento dos sinais devido aos percursos múltiplos

seguidos pelas moléculas de analito, representado por A, com a difusão longitudinal ou

difusão de soluto na fase móvel (B) e a resistência à transferência de massa do analito

entre as duas fases (estacionária e móvel) representada por C, com a altura do prato

teórico (H) e, por isso, com a resolução dos picos cromatográficos. Sendo ux a

velocidade linear da fase móvel, em cm/min, temos (Lee, 2011; Nogueira et al., 2011):

Equação 4

A difusão turbilhonar (A) aplica-se apenas a colunas empacotadas com partículas e a

eficácia é inversamente proporcional ao tamanho das partículas (dp) (Lee, 2011):

λ = fator geométrico de empacotamento.

No caso da difusão longitudinal (B), toda a molécula dissolvida num fluido difunde-se

em todas as direções sendo que a difusão no sentido contrário ao do movimento da fase

móvel, tem mais. A difusão longitudinal é calculada pela Equação 6 (Lee, 2011):

Onde:

ϒ = fator de tortuosidade;

Dm = coeficiente de difusão (fase móvel).

Equação 5

Equação 6



Seletividade (α)

Razão entre os fatores de retenção de duas espécies, A e B, (KA e KB), que atravessam

uma coluna cromatográfica. Por convenção, coloca-se no numerador o coeficiente da

espécie mais fortemente retida. Para que haja possibilidade de separação de duas

espécies, A e B, α ≠ 1 (Lee, 2011).

Onde:

t’RB e t’RA = tempo de retenção ajustado da espécie B e A, respetivamente.

Assim, a Equação 8 representa a equação geral da cromatografia (Lee, 2011):

Transferência de um método de HPLC para UHPLC e

suas vantagens em relação à HPLC

O UHPLC surgiu a partir da introdução das partículas porosas de fase estacionária ≤ 2

µm, em consequência da procura de respostas mais rápidas e eficientes. Baseia-se nos

mesmo princípios do HPLC com os mesmos equipamentos que os sistemas de HPLC

mais recentes apresentando, no entanto, algumas diferenças que lhe conferem

vantagens em relação ao HPLC. Enquanto um sistema de cromatografia líquida

convencional trabalha com pressões entre os 350 a 400 bar, um sistema de UHPLC

pode alcançar pressões até 1350 bar; os volumes internos dos sistemas

Equação 7

Equação 8



cromatográficos são menores apresentando um sistema de dispersão3 menor o que

reduz o alargamento das bandas cromatográficas já que se utilizam colunas de menores

dimensões, com partículas sub-2 µm que aumentam a resolução e detetabilidade e

diminuem o tempo de análise e a quantidade de solvente, amostra e de fase estacionária

gastas; apresenta melhor tempo de resposta pontual e permite analisar mais amostras

por sistema (aumento da produtividade) em comparação com o HPLC. O UHPLC utiliza

também injetores de boa precisão funcionando na gama de volumes pequenos de

amostra injetada e os detetores utilizados têm de ser capazes de operar a altas taxas

de amostragem para garantir um número de pontos suficientes para a construção da

banda cromatográfica (Maldaner & Jardim, 2012) (LC/GS – Chromatography online,

(2018); Waters, (2018)).

A partir da introdução do primeiro equipamento de UHPLC desenvolvido pela Waters

Corporation em 2004, denominados de Acquity UPLC Systems, permitiu-se que a

técnica não fosse apenas utilizada no âmbito académico e que fosse testada por vários

analistas. Hoje em dia, tem vindo a tomar lugar em todas as áreas de aplicação da HPLC

pelas suas vantagens que, além da excelente relação custo-benefício, levam a menor

geração de resíduos minimizando o impacto ambiental e ocupacional e desta forma, à

Química Verde (Maldaner & Jardim, 2012; Nogueira et al., 2011).

A transferência de um método de coluna convencional desenvolvido, para um método

que usa partículas sub-2µm é possível, no entanto, deve ter-se em conta as distintas

necessidades analíticas uma vez que, as diferenças de desempenho podem resultar em

diferenças de resultados. Deste modo, há vários ajustes que podem ser requeridos,

nomeadamente no tamanho da coluna e tamanho das partículas e ainda na quantidade

de amostra bombeada. Assim, se apenas se reduz o tamanho da partícula mantendo-

se as dimensões da coluna, notam-se melhorias na eficiência, resolução e na

capacidade de sinais. Se forem ambos reduzidos, o tamanho da partícula e as

dimensões da coluna, então o tempo de análise também será menor. Em ambos os

casos, o fluxo, o perfil de gradiente e o volume de amostra injetado devem ser

3 O sistema de dispersão está relacionado com os volumes de fluido por onde passam as moléculas de analito desde o injetor e dos tubos de conexão até à célula do detetor, não fazendo parte deste sistema, os volumes antes do injetor nem após a célula do detetor. Todos os sistemas de UHPLC modernos são desenhados de maneira a terem baixos sistemas de dispersão reduzindo os volumes extra-coluna que causam alargamento dos picos (LC/GS – Chromatography online, (2018)).



devidamente ajustados. No caso de eluições por gradiente, deve ainda ter-se em

consideração o tempo de residência da fase móvel que leva a alterações nos tempos

de retenção pondo em causa a resolução, essencialmente das primeiras substâncias a

serem eluídas quando não existe compatibilidade desse tempo com o diâmetro da

coluna. Além do mais, a fase estacionária deve também ser semelhante à utilizada no

método já existente e a composição inicial e final do gradiente deve ser mantida

constante (Waters, (2018); Nogueira et al., 2011).

A capacidade de transferência de um método analítico já desenvolvido utilizando um

sistema de HPLC para um sistema de UHPLC, é um fator muito importante a considerar-

se e, para garantir que este gere informações compatíveis, confiáveis e rastreáveis,

deve ser sujeito a uma validação que envolve uma série de passos a seguir

discriminados (Maldaner & Jardim, 2012).

Validação de Métodos Analíticos por HPLC

É possível distinguir dois tipos de validação de métodos. Um chamado de validação

completa (full validation) que “envolve todas as caraterísticas de desempenho e um

estudo interlaboratorial que é utilizado para verificar como a metodologia se comporta

com uma determinada matriz em vários laboratórios, estabelecendo a reprodutibilidade

da metodologia e a incerteza expandida associada à metodologia como um todo”.

Apenas deste modo, a metodologia pode ser aceite como uma metodologia oficial para

determinada aplicação. E um segundo chamado de validação no laboratório (in house

validation), “consiste das etapas de validação dentro de um único laboratório, seja para

validar um método novo que tenha sido desenvolvido localmente ou para verificar que

um método adotado de outras fontes está bem aplicado” (Ribani et al., 2004).

É, portanto, necessário que os laboratórios demonstrem, através da validação, que os

métodos internos de ensaio que executam, conduzem a resultados credíveis e

adequados à qualidade pretendida, dispondo para tal, de meios e critérios objetivos.

Quando se pretende validar um método interno de ensaio ter-se-á de efetuar a sua

descrição e caraterização (Guia Relacre 13 Validação de Métodos Internos de Ensaio

em Análise Química (2013)).

Segundo a norma ISO/IEC 17025 – Requerimentos gerais de competência para

Laboratórios de Ensaio e Calibração, a validação de um método analítico consiste na



“comprovação, através de evidências objetivas, de que o método cumpriu os requisitos

para uma aplicação ou uso específico pretendido”. Assim, para um correto controlo dos

resultados, garantia da sua interpretação e confiabilidade dos mesmos, o método

analítico tem de ser sujeito a uma série de parâmetros de avaliação, que garantem a

sua validação (Guia para aplicação da NP EN ISO/IEC17025 (2005)).

Os parâmetros normalmente recomendados nos programas de validação de

metodologia analítica são: seletividade/especificidade que representa a capacidade do

procedimento analítico em quantificar o analito na presença de outros componentes que

possam existir na matriz da amostras nomeadamente impurezas; linearidade que

consiste na capacidade do método dar resultados que são diretamente proporcionais à

concentração do analito com um dado intervalo; limite de deteção (LD) definido como a

menor concentração de analito que se pode detetar mas não necessariamente

quantificar, ou seja, saber se o analito está ou não presente, corresponde ao início do

intervalo em que é possível diferenciar o sinal do branco do sinal da amostra com uma

dada confiança; limite de quantificação (LQ) corresponde à concentração mínima de um

analito numa amostra que se pode quantificar com precisão e exatidão aceitáveis; gama

de trabalho, definida como o intervalo entre a concentração superior e inferior de um

dado analito para o qual o método analítico apresenta níveis apropriados de exatidão,

precisão e linearidade; precisão que é o grau de concordância entre os resultados de

análises repetidas de uma mesma amostra homogénea e representa uma dispersão de

resultados entre análises independentes de um mesmo método e da mesma amostra,

amostras semelhantes ou padrões, sob condições definidas e é composta por 3

medidas: repetibilidade – concordância entre os resultados de várias medições

(usualmente 10 ou mais) de uma mesma amostra sob as mesmas condições e num

curto intervalo de tempo, precisão intermédia – dá uma estimativa da variação dos

resultados quando as análises são feitas no mesmo laboratório mas sob condições mais

variáveis que no caso da repetibilidade, no entanto, basta variar uma condição de

medição e reprodutibilidade - uso de procedimentos analíticos em diferentes

laboratórios, diferentes analistas e em diferentes dias, ou seja, exprime a precisão entre

vários laboratórios consoante estudos colaborativos aplicados para padronização de

metodologias e exatidão que corresponde ao nível de concordância entre os resultados

individuais obtidos por um dado ensaio e um valor de referência aceite como verdadeiro,

é sempre considerada dentro de certos limites e pode recorrer-se a vários processos

para a sua avaliação nomeadamente através de ensaios de recuperação e ensaios



interlaboratoriais que é o método utilizado neste trabalho (Mendes, 2007; Ribani et al.,

2004; Nogueira et al., 2011; Eurachem, 2014; Brito et al., 2003; Ich, 2005).

Compostos fenólicos no vinho

Os polifenóis ou compostos fenólicos fazem parte de um grupo de metabolitos

secundários das plantas tendo como principal função protegê-las contra microrganismos

patogénicos e servirem de filtro às radiações UV. Todos estes compostos, cuja estrutura

básica é um hidroxibenzeno (anel aromático com um ou mais grupo(s) hidroxilo

ligado(s)). Na dieta humana, encontram-se essencialmente em frutas, vegetais, vinhos,

chás e cacau (Diaconeasa et al., 2014; Veberic et al., 2009; Naczk & Shahidi, 2004;

Heim et al., 2002).

Estudos epidemiológicos sugerem que o consumo de alimentos e bebidas ricos em

polifenóis está associado à prevenção de doenças principalmente do foro

cardiovascular, AVC, incluindo ainda cancro, diabetes e aterosclerose, uma vez que são

capazes de eliminar radicais livres maus para a saúde graças à sua estrutura química,

ativar enzimas antioxidantes e inibir oxidases (Giovinazzo & Grieco, 2015; Heim et al.,

2002).

Existem dois grandes grupos distintos de compostos fenólicos nas uvas e no vinho: os

não-flavonoides e os fenóis flavonoides, sendo que o teor fenólico total do vinho é menor

do que o presente na fruta. O grupo dos flavonoides é o mais abundante na dieta

humana e a sua estrutura base consiste em dois anéis aromáticos (A e B) unidos por

um anel pirânico (C) (figura 13). Os flavonoides podem existir na sua forma livre ou

polimerizada com outros flavonoides, açúcares, não-flavonoides ou uma combinação

destes. Podem dividir-se em várias classes consoante o grau de oxidação do oxigénio

heterocíclico em: flavonas, flavonóis, isoflavonas, antocianinas, flavanóis,

proantocianidinas e flavanonas, alguns dos quais têm a sua estrutura representada na

figura 13 (Heim et al., 2002; Zoecklein et al., 1994).



Fig. 13 - Representação da estrutura básica dos flavonoides (à esquerda) bem como da estrutura básica de algumas das classes a eles pertencentes (à direita) (DBD Puc Rio, 2014; Silva, 2012).

As variações entre os diversos tipos de vinhos devem-se, em grande parte, à

composição e concentração polifenólica de cada um. Os compostos fenólicos têm

grande importância em enologia uma vez que estão relacionados com vários atributos

sensoriais do vinho como a cor (antocianinas), a adstringência (taninos) e amargor;

contribuem para o perfil olfativo; servem de reservatórios de oxigénio e atuam como

substrato para as reações de acastanhamento (Zoecklein et al., 1994).

Na tabela 5, apresenta-se uma estimativa da composição fenólica em vinhos de mesa

típicos de uvas da espécie Vitis vinífera.



Tabela 5 – Estimativa da composição fenólica bruta de vinhos de mesa típicos da espécie de uvas Vitis vinifera, em

mg/l (Zoecklein et al., 1994).

Classe fenólica

Vinho Branco Vinho Tinto

Jovem Envelhecido Jovem Envelhecido

Não-flavonoides, total 175 160-260 235 240-500

-cinamatos; 154 130 165 150

-derivados benzénicos de baixa

volatilidade; 10 15 50 60

-tirosol 19 10 15 15

-fenóis voláteis 1 5 5 15

-taninos hidrolisáveis, etc 0 0-100 0 0-260

Complexos macromoleculares - - - -

-proteína-tanino 10 5 5 10

Flavonóides, total 30 25 1060 705

-catequinas 25 15 200 150

Flavonóis 50 10

-antocianinas 0 0 200 20

-taninos solúveis 5 10 550 450



-outros flavonoids ? ? 60? 75?

Fenólicos Totais 215 190-290 1300 955-1215

Vários estudos têm demonstrado que os compostos fenólicos presentes no vinho

ocorrem principalmente da extração das uvas durante a vinificação e em menor

quantidade das cubas de madeira durante o envelhecimento ou até de fontes

microbianas. No que respeita à cor, são as antocianinas os compostos fenólicos

responsáveis, sobretudo nos vinhos tintos jovens (Stavridou et al., 2016).

Assim, pela observação da tabela 5 em relação às antocianinas, pode verificar-se que

não existem em vinho branco, como seria de esperar, e relativamente ao vinho tinto

existem em muito maior quantidade em vinho tinto jovem do que no envelhecido.

Antocianinas

Estruturalmente, as antocianinas são glucósidos de polihidroxi ou polimetoxi dos sais de

flavílio (2- fenil-benzopirilo). Estes compostos diferenciam-se pelo número de grupos

hidroxilo e o grau de metilação do anel lateral B, produzindo uma ampla gama de cores

do vermelho alaranjado ao violeta a pH muito ácido. A fração glicosídea da posição 3-O

do anel C pode também ser aciladas4 com ácido acético, ácido coumárico ou ácido

cafeico. Assim, as diferenças nos graus de hidroxilação e metilação dos anéis, tornaram

possível identificar cerca de 25 antocianinas distintas, no entanto, apenas 6 são

geralmente detetadas em uvas de Vitis vinífera, a cianidina (cy), peonidina (pn),

pelargonidina (pg), malvidina (mv), petunidina (pt) e delfinidina (df), representadas na

figura 14 e, estas não se encontram apenas nos seus monoglucósidos (3-glucósido)

mas também os seus derivados (3,5-diglucósido) acetil, p-coumarico e derivados de

cafeína. As suas quantidades relativas variam com a casta, mas a malvidina (na forma

4 A acilação descreve uma reação que introduz um grupo acila (R-CO-) num composto orgânico.



3-glucósido) é sempre maioritária e por isso, usada muitas vezes como antocianina de

referência (Mateus et al., 2004; Alcalde-Eon et al., 2006; Kong et al., 2003).

Fig. 14 – Estruturas das antocianinas presentes em Vitis vinifera (na forma do catião flavílio) (Alexandra, 2011).

As formas agliconas das antocianinas chamam-se antocianidinas (derivados

hidroxilados e metoxilados do catião flavílio), são instáveis em água e muito menos

solúveis que as antocianinas, por essa razão se julga que a glicolisação proporciona

estabilidade e solubilidade a estes pigmentos (Timberlake & Bridle, 1966; Curvelo-

Garcia, 1988).

A variação da composição e concentração das antocianinas na película das uvas tintas

e também na polpa das uvas de castas tintureiras, é influenciada por muitos fatores

vitivinícolas como o clima, influências sazonais, nutrição do solo, vinha, gerência de

água e processo de vinificação. Durante a maturação das uvas, o teor em antocianinas

aumenta progressivamente até atingir um valor máximo conhecido como maturação

fenólica. Nesta altura, há um equilíbrio entre cor e estrutura de taninos na pele e

grainhas indicando o período ótimo de vindima. Além de todos os fatores vitivinícolas,

as antocianinas são anfotéricas, ou seja, a sua cor é dependente do pH. Assim, de um

modo geral, em solução aquosa e a pH ácido predomina o catião flavílio de cor

vermelha. À medida que o pH aumenta ocorre hidratação do catião flavílio e, a pH>7

ocorre a desprotonação do catião flavílio e a formação de bases quinoidais de cor

violeta. (Henrique et al., 2013; Zoecklein et al., 1994; Castañeda-Ovando et al., 2009).

Nos vinhos, as antocianinas são extraídas para o mosto durante a vinificação

proporcionando a cor vermelha arroxeada caraterística dos vinhos tintos jovens. A cor

dos vinhos é uma das primeiras caraterísticas percebidas pelos consumidores pelo que



pode influenciar a sua aceitação e informar sobre a sua idade, condições de

armazenamento, etc. Assim sendo, a concentração de antocianinas nos vinhos tintos

jovens é entre 200 a 500 mg/L, decrescendo para 10 a 20 mg/l durante o envelhecimento

(Boido et al., 2006; Stavridou et al., 2016).

Durante o envelhecimento dos vinhos (essencialmente quando o vinho é armazenado

antes do seu envelhecimento em garrafa) ocorrem várias reações que levam a uma

diminuição dos níveis de antocianinas das uvas e mosto, à medida que reagem com

outros constituintes do vinho. Este processo, leva à formação de pigmentos mais

estáveis responsáveis pelas mudanças de cor bem como a perda de adstringência

observada durante o envelhecimento do vinho e a sua longevidade. A figura 15 mostra

como as antocianinas típicas de um vinho tinto, diminuem ao fim de 4, 8, 13, 16 e 23

meses, extraídas através de HPLC (De Villiers et al., 2004; Mateus & De Freitas, 2001).

Fig. 15 – Cromatogramas registados a 520 nm correspondentes a (a) uma amostra de vinho de 4 meses, (b) uma amostra de vinho de 8 meses, (c) uma amostra de vinho de 13 meses, (d) uma amostra de vinho de 16 meses e (e) uma amostra de vinho de 23 meses (Alcalde-Eon et al., 2006).

As antocianinas podem, portanto, estar envolvidas em diferentes tipos de reações.

Primeiramente, podem condensar com os flavanóis, diretamente ou por meio de

acetaldeído, causando mudanças no máximo de absorção visível das antocianinas. Os

novos pigmentos vão fornecer uma cor vermelho-azulado ao vinho. Outras reações que

(a) (b)

(c) (e) (d)



causam a transformação de antocianinas são aquelas que levam à formação de um

novo anel pirâmico na estrutura da antocianina pela adição de diferentes compostos,

também presentes no vinho, ao carbono da posição 4 e ao grupo hidroxilo da posição

5. Esta reação de ciclo-adição, que leva à formação de derivados pirúvicos como a vitisin

A, causa também uma mudança no máximo do espetro de absorção visível das

antocianinas causando uma mudança de cor do vinho para os tons alaranjados.

Algumas dessas piranoantocianinas formadas podem, por sua vez, reagir com outros

constituintes do vinho originando composto com um máximo de absorção no visível de

575 nm e, consequentemente, contribuir para a cor azulada que o vinho adquire. Estas

piranoantocianinas (derivados pirúvicos) encontram-se frequentemente em vinhos do

Porto envelhecidos, sobretudo do estilo Vintage exibindo uma cor azulada em solução

ácida (Alcalde-Eon et al., 2006; Mateus et al., 2004).

Atualmente, as antocianinas são o único grupo de compostos fenólicos presentes nas

uvas e vinhos que são analisados por injeção direta de amostras filtradas. Isto porque,

estes pigmentos absorvem a luz visível na faixa dos 510-535 nm enquanto os restantes

compostos fenólicos são incolores a estes comprimentos de onda. Por esta razão é

possível fazer análises de antocianinas do vinho através da técnica de HPLC (Revilla &

Ryan, 2000).

Os frutos de baga, incluindo o mirtilo, uva, amora, framboesa, o arando e a baga de

sabugueiro, são conhecidos pelo seu elevado teor antioxidante sendo uma rica fonte de

antioxidantes dietéticos. Esta atividade antioxidante, está associada ao número de

grupos hidroxilo da estrutura molecular dos seus compostos fenólicos, essencialmente

das antocianinas. O teor em antocianinas desses frutos de baga, bem como noutros

alimentos da dieta humana, está representado na tabela 6 (Diaconeasa et al., 2014;

Jakobek et al., 2007).



Tabela 6 – Teor em antocianinas, em mg/l, de alguns alimentos com relevância na uva tinta e na baga de sabugueiro

(Nave, 2014).

Adição de Sambucus nigra L. ao vinho

Entre os vários frutos e vegetais, a baga de sabugueiro (Sambucus nigra L.), é uma das

mais ricas em antocianinas (tabela 6) e, consequentemente, em capacidade

antioxidante. Em termos de peso, o teor em antocianinas de cada baga representa cerca

de 25-40% do seu peso total. Assim sendo, estas bagas podem ser utilizadas como uma

rica fonte de antocianinas dietéticas e outros compostos fenólicos acarretando vários

benefícios nutricionais essencialmente quando maduras. Schmitzer et al., confirmam

também o potencial antioxidante, anti-inflamatório e imunoestimulante da baga de

sabugueiro, acarretando portanto vários benefícios para a saúde humana (Veberic et

al., 2009; Seabra et al., 2010).

A baga de sabugueiro é uma espécie que cresce em locais expostos ao sol na Europa,

Ásia, Norte de África e nos EUA. Em Portugal, existe essencialmente no Vale do Varosa

(Lamego), Távora (Tabuaço) e no concelho de Tarouca. A figura 16 mostra o aspeto do

arbusto, flores e bago típicos da baga de sabugueiro (Veberic et al., 2009; Cerdeira,

2010).



Fig. 16 - Arbusto, flores e bagos, típicos de Sambucus nigra L (FCiências, (2018)).

Apesar do seu significativo potencial, a baga de sabugueiro não apresenta um alto valor

económico sendo tradicionalmente usada como alimento para animais e até como

fertilizante orgânico. No entanto, com o processamento adequado, pode transformar-se

facilmente num produto de alto valor, muito interessante para o uso em alimentos

aceites pelo consumidor, na cosmética e até na industria farmacêutica (Seabra et al.,

2010).

Extratos de baga de sabugueiro podem, portanto, ser utilizados para dar cor a alguns

alimentos e, fraudulentamente, a vinhos, especialmente vinhos do Porto tintos, pelo

elevado teor antociânico que possuem. Acredita-se que a adição de Sambucus nigra L.

ao vinho, acelere a fermentação e sirva também para produzir vinho tinto a partir de

castas brancas. Esta adição, de sumo de baga de sabugueiro ao vinho, é

completamente ilegal considerando-se então uma atividade fraudulenta. A técnica de

HPLC é particularmente sensível para detetar a adição de baga de sabugueiro ao vinho

uma vez que identifica e carateriza as antocianinas extra no vinho caraterísticas de baga

de sabugueiro (Bridle & García-Viguera, 1996).

As antocianinas típicas de Sambucus nigra L. são os glucósidos de cianidina,

essencialmente a cianidina-3-sambubiósido, cianidina-3-glucósido, cianidina-3-

sambubiósido-5-glucósido e cianidina-3,5-diglucósido sendo que a cianidina-3-

glucósido e a cianidina-3-sambubiósido representam 85% da quantidade total de

antocianidinas da baga de sabugueiro (Garofulić et al., 2012).



Assim, um vinho que tenha sido adulterado com baga, deverá apresentar no seu

cromatograma, o pico da cianidina-3-sambubiósido-5-glucósido5 que eluirá mais cedo

que os restantes e um pico bastante mais acentuado da cianidina-3-glucósido, uma vez

que, geralmente, o gradiente de HPLC não consegue separar esta antocianina típica do

vinho da cianidina-3-sambubiósido ou, quando se consegue, um pequeno pico depois

da delfinidina-3-glucósido, correspondente à cianidina-3-sambubiósido e,

imediatamente a seguir, um pico mais acentuado da cianidina-3-glucósido. A

combinação deste pico com, constituem um marcador de adulteração com baga de

sabugueiro. Na figura 17, apresenta-se um exemplo bem definido de um cromatograma

típico das antocianinas de vinho tinto (A), das antocianinas da baga de sabugueiro (B)

e das antocianinas de vinho com adição de baga (C) (Bridle & García-Viguera, 1996).

Fig. 17 - Cromatogramas de HPLC - 520 nm. (1) cy-3-samb-5-gl, (2) df-3-gl, (3) cy-2-gl, (4) pt-3-gl, (5) pn-3-gl, (6) mv-3-gl, (*) cy-3-gl + cy-3-samb (Bridle & García-Viguera, 1996)

5 Como no presente trabalho o interesse passa por apenas identificar se os vinhos contêm ou não as antocianinas típicas de baga de sabugueiro e não propriamente identificar cada uma delas, apenas foram identificados os picos correspondentes à cy-3-gl e cy-3-samb e não o correspondente à cy-3,5-sambgl.

vinho

vinho + baga de sabugueiro

baga de

sabugueiro11



Objetivos

Familiarização com todo o trabalho de laboratório que se desenvolve no

laboratório da Cromatografia Líquida do IVDP, I. P.;

Implementação de um método de análise por cromatografia líquida,

nomeadamente HPLC, para deteção de pigmentos de Sambucus nigra L. em

vinhos do Douro tintos e rosados e em vinhos do Porto tintos e rosé e análise,

em geral, das antocianinas do vinho;

Utilização do computador para análise de dados, controlo dos resultados e

atualização ou elaboração de documentos ou folhas de cálculo necessários ao

sector e, especificamente, ao método desenvolvido.



Capítulo II –

Procedimento

Experimental



Capítulo II - Procedimento experimental

Para este trabalho prático, o aparelho disponível e utilizado consiste, portanto, num

sistema de UHPLC baseado na técnica de HPLC de fase reversa e com separação por

gradiente. Não foi possível desenvolver um método típico de UHPLC pelo facto de a

coluna disponibilizada ser uma coluna de dimensões típicas de HPLC (já que não existia

coluna típica de UHPLC uma vez que são bastante mais caras e de menor tempo de

vida) que, no caso, acaba por ser vantajoso dado serem colunas mais resistentes a

matrizes como a de vinho tinto. No desenvolvimento de todo o trabalho foram utilizadas

as seguintes condições:

Reagentes e materiais:

Os reagentes utilizados:

Reagentes Pureza Marca

Oenin chloride (Mv-3-gl) - Extrasynthese

Solução de baga de sabugueiro - FCUP

Ácido fórmico (HCO2H) 98% Honeywell Fluka

Acetonitrilo (C2H3N) de HPLC ≥ 99,9% ChemLab

Água ultrapura tipo I - -

Ácido Clorídrico (HCl) ≥ 37% Sigma Aldrich

Metanol (CH3OH) de HPLC ≥ 98% ChemLab



Os materiais utilizados:

Filtros de nylon 0,45 µm de porosidade;

Frascos de vidro de 2 ml;

Seringa de plástico de 1 ml para retirar as amostras de vinho;

Frascos de vidro de 1000 ml para a preparação dos eluentes;

Provetas graduadas (de incerteza ± 0,1 ml) de diferentes capacidades para a

preparação dos eluentes e da solução de HCl/H2O/Metanol;

Balança analítica com resolução mínima de 0,0001 g;

Balões volumétricos de 10,00 ± 0,04 ml e de 100,0 ± 0,1 ml;

Micropipetas de 100 µl, 1000 µl, 5000 µl.

Equipamento e método de análise

O equipamento de UHPLC “UHPLC 1290-Agilent” utilizadp, consiste num cromatógrafo

“Agilent Technologies, 1290 Infinity II”, composto por módulos, como mostra a figura 13

(A), acoplado a um detetor DAD e uma bomba quaternária. Um software “Open Lab

CDS Chemstation Edition C.01.07” como o da figura 13 (B) controla todo o processo

efetua o processamento de dados para a construção dos cromatogramas, identificação

dos picos e respetivas áreas. Inicialmente foi criado um método num sistema “HPLC

1200-Agilent” que foi posteriormente transferido para “UHPLC 1290-Agilent” e otimizado

de acordo com os nossos objetivos. Após vários ensaios de otimização o método

utilizado, foi apelidado de “SAMB4.M” e foram inseridas as condições cromatográficas

abaixo detalhadas.



Fig. 18 - (A) Sistema de UHPL da "Agilent Technologies, 1290 Infinity II", em módulos ((a)– reservatórios dos eluentes; (b) - bomba; (c) -“autosampler”; (d) – coluna com forno; (e) – detetor DAD); (B) Aspeto do software “Open Lab CDS Chemstation Edition C.01.07” acoplado ao sistema de UHPLC representado em (A).

Coluna analítica

A coluna analítica utilizada é uma “Luna” C18 (2) de fase reversa da “Phenomenex”, de

dimensões 250x4,6 mm e cuja referência é “006-4252-EO”. A fase estacionária é

constituída por partículas de sílica de 5 µm diâmetro e poros de 100 Å.

Condições cromatográficas

Uma vez que o método analítico utilizado segue uma separação por gradiente, foram

necessários dois eluentes distintos, o eluente A constituído por 7,5% de ácido fórmico

em água ultrapura tipo I e o eluente B, constituído por 7,5% de ácido fórmico em

acetonitrilo. O perfil de gradiente em que se baseia o método é o seguinte: 0-1min com

97% de eluente A e 3% de eluente B; 1-12 min. com 85% de eluente A e 15% de eluente

B; 12-24 min. com 75% de eluente A e 25% de eluente B; 24-28 min. com 70% de

eluente A e 30% de eluente B; 28-32 min. com 70% de eluente A e 30% de eluente B;

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(A) (B

)



32-36 min. com 20% de eluente A e 80% de eluente B e 36-40 min. com 97% de eluente

A e 3% de eluente B sendo, portanto, o tempo de corrida igual a 40 minutos. Os últimos

dois passos do gradiente (dos 32 aos 36 min. e dos 36 aos 40 min.) servem,

respetivamente, para lavagem e estabilização entre análises. O volume de injeção é de

10 µL e o fluxo de 1 ml/min. A temperatura atingida pela coluna é de 25 °C e os picos

cromatográficos são detetados a 520 nm por um detetor DAD. Estas condições foram

baseadas em De Villiers et al.



Preparação das soluções e das amostras

Solução de baga de sabugueiro fornecida pela FCUP

Num eppendorf de 2 ml colocaram 20 mg de baga de sabugueiro em pó e diluíram com

2mL de H2O + HCl a 2%, obtendo-se uma concentração final de 10000 mg/l.

Homogeneizaram e reservaram.

Amostra de vinho do Porto dopada com solução de baga de

sabugueiro

Num frasco de vidro de capacidade de 2 ml foi adicionado 1 ml de um vinho do Porto

envelhecido e 10 µl de solução de baga de sabugueiro. Utilizou-se um vinho do Porto

de maior envelhecimento, uma vez que durante o envelhecimento as antocianinas

sofrem alterações transformando-se noutros composto e, portanto, vão desaparecendo

no vinho, o que torna mais fácil a identificação das antocianinas típicas de Sambucus

nigra L. após adição.

Solução HCl/H2O/Metanol

A solução utilizada para perfazer o volume das soluções padrão de calibração e de

verificação, foi preparada num balão volumétrico de 100 ml, no qual se adicionou 80 ml

de metanol com recurso a uma proveta de 100 ml e 1 ml de HCl com recurso a uma

micropipeta de 1000 µl, perfazendo-se o restante volume com H2O.

Soluções padrão de calibração e de verificação

Para a preparação de uma solução mãe (sol. mãe) de Mv-3-gl, pesou-se, numa balança

analítica, 0,0047 g (=4,7mg) do padrão de Mv-3-gl recebido, para um balão volumétrico

de 10,00 mal e perfez-se o volume com solução de HCl/H2O/Metanol.

Os padrões de calibração foram preparados em balões volumétricos de 10,00 ml (figura

19) por diluição da solução-mãe, utilizando novamente a solução de HCl/H2O/Metanol

para perfazer os volumes conforme apresentado na tabela 7 e utilizando micropipetas

de 100 µl, 1000 µl e 5000 µl.



Fig. 19 - Balões volumétricos de 10 ml com as respetivas soluções padrão de calibração.

Tabela 7 – Preparação da solução-mãe de calibração e respetiva concentração final em Mv-3-gl, em mg/l e preparação dos padrões de calibração e respetivas concentrações finais da Mv-3-gl, em mg/l.

Padrão Preparado

a partir de %Pureza

Massa

pesada

(mg)

Balão (ml) Pipeta (ml)

Concentração

(mg/l)

sol. mãe-

Mv-3- gl 100 4,7 10,00 - 470,00

P4C sol.mãe - - 10,00 2,00 94,00

P3C sol.mãe - - 10,00 1,00 47,00

P2C sol.mãe - - 10,00 0,200 9,40

P1C sol.mãe - - 10,00 0,100 4,70

Deve utilizar-se em todas as sequências analisadas, como forma de controlo da gama

de trabalho, um padrão de concentração igual ao limite de quantificação e o padrão mais

concentrado da reta de calibração, soluções de verificação.



Prepararam-se as soluções padrão de verificação (P1V e P3V) a partir da solução mãe

de calibração por não se dispor de outro reagente de Oenin chloride (Mv-3-gl). Uma vez

que estes padrões utilizados como soluções de verificação foram injetados diariamente

em todas as sequências injetadas, foi possível avaliar a sua estabilidade e precisão ao

longo do tempo.

Os restantes padrões de verificação representados na tabela 8 como o P1V’ e P4V’,

foram preparados a partir de uma solução mãe já existente no IVDP, I.P. preparada em

2016, para posteriormente serem utilizados nas Recuperações efetuadas.

Tabela 8 – Preparação dos padrões de verificação e respetivas concentrações finais da Mv-3-gl, em mg/l.

Padrão Preparado a partir de Balão (ml) Pipeta (ml) Conc. (mg/l)

P3V sol. mãe 10,00 1,00 53,00

P1V sol. mãe 10,00 0,10 5,30

P1V’ sol. mãe (2016) 5,00 0,050 5,80

P4V’ sol. mãe (2016) 2,50 0,500 116,00



Preparação e determinação das amostras

Para cada sequência de amostras a analisar, o procedimento efetuado foi o a seguir

descrito.

Para um vial com tampa, filtrou-se aproximadamente 1 ml de amostra através de uma

membrana de nylon de porosidade 0,45 µm. Se os teores da concentração de Mv-3-gl

na amostra forem superiores à concentração da solução de calibração de concentração

mais elevada (P4C), deve ser efetuada uma diluição adequada.

De seguida inseriram-se as amostras a analisar na lista da sequência, intercaladas com

os padrões de verificação e a amostra dopada com baga de sabugueiro. Dá-se início à

análise automatizada da sequência de amostras, injetando 10 µl de cada amostra.

Uma vez que existe um variado leque de antocianinas presentes nos vinhos tintos,

procedeu-se à seleção das que seriam as mais importantes para identificação pelo

presente método cromatográfico SAMB.4, com base em De Villiers et al., sendo elas:

Df-3-gl, Cy-3-samb, Cy-3-gl, Pt-3-gl, Pn-3-gl, Mv-3-gl, Df-3-acgl, Vitisin A, Pt-3-acgl, Pn-

3-acgl, Mv-3-acgl, Pt-6-cougl, Pn-6-cougl e Mv-6-cougl. A concentração das

antocianinas é determinada por interpolação gráfica da área do pico e com base na área

do pico correspondente à Mv-3-gl.

A interpretação de dados, foi feita com base na identificação dos picos correspondentes

a cada antocianina presente em cada vinho, e comparação qualitativa e quantitativa de

cromatogramas no que respeita às concentrações obtidas para cada pico.

A totalidade de amostras analisadas utilizando o presente método analítico foram 622 e

os valores correspondentes às concentrações antociânicas de cada uma das

antocianinas detetadas, estão representados no anexo 11.



Capítulo III – Resultados e

Discussão



Capítulo III - Resultados e Discussão

Parte I – Critérios de validação de um método de deteção

de antocianinas em vinhos tintos e rosados (Douro e

Porto)

Como referido anteriormente, a transferência de um método de HPLC já desenvolvido,

para um sistema de UHPLC é possível, desde que tal método seja validado. Uma vez

que apenas havia disponível o reagente Oenin chloride (Mv-3-gl) e, como esta

antocianina representa cerca de 80% do total de antocianinas do vinho, achou-se que

seria suficiente realizar uma validação do método analítico desenvolvido, e que a seguir

se apresenta, baseada apenas na Mv-3-gl (antocianina de referência).

Seletividade/Especificidade

Para se saber se o presente método é ou não seletivo, ou seja, se está a detetar

praticamente a totalidade das antocianinas típicas de vinho tinto e de baga de

sabugueiro, fizeram-se várias injeções a diferentes comprimentos de onda até se chegar

à conclusão que o mais adequado seria um comprimento de onda de 520 nm,

apresentando uma boa separação entre os picos cromatográficos e, portanto, uma boa

seletividade.

Linearidade – Reta de calibração

Para avaliar a linearidade do método analítico e determinar os limites de deteção e de

quantificação, é necessário efetuar-se uma calibração do método. Para a calibração,

tem-se uma série de amostras de concentração conhecida que neste caso são as

soluções padrão de calibração (P1C, P2C, P3C e P4C). Os resultados da análise destas

amostras servem para desenhar um gráfico de calibração que é, de seguida, utilizado

para determinar as concentrações de analito nas soluções padrão, por interpolação

(Miller & Miller, 2010).

A calibração realizada é feita em função da Mv-3-gl (antocianina disponível para a

validação).



Após preparação das soluções padrão de concentração conhecida, foram transferidas

para frascos de vidro de 2 ml devidamente identificados (P1C, P2C, P3C e P4C) com

ajuda de uma seringa de plástico de 1 ml e colocadas no cromatógrafo para se dar início

às respetivas injeções automatizadas.

Fizeram-se cinco injeções de cada uma das amostras e no final, calculou-se a média

das cinco injeções (média das áreas obtidas) para cada uma das soluções padrão

(coluna “Área” na tabela 9). Todos os restantes valores representados nas colunas da

tabela abaixo, vão ser necessários para o cálculo dos limites de deteção e de

quantificação.



Tabela 9 - Valores, em g/l, da concentração conhecida da Mv-3-gl das quatro soluções padrão utilizadas para a calibração do método e respetivas áreas, em mg/l, bem como outros fórmula posteriormente necessárias para o cálculo dos limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ).

Mv-3-gl (g/l) Área (mg/l) 𝒙𝒊 − �̅� (𝒙𝒊 − 𝒙)̅̅ ̅𝟐 𝒚𝒊 − �̅� (yi-y)̅2 (𝒙𝒊 − 𝒙) (𝒚𝒊 − �̅�) �̅� 𝑨𝑩𝑺(𝒚𝒊 − �̅�) [(𝒚𝒊 − 𝒚)̅̅ ̅]𝟐 𝒙𝒊𝟐

P1C 4,70 1,45 x 102 -69,325 4805,96 -2109,93 4451808,28 146270,96 139,3 5,70 32,53 22,09

P2C 9,40 2,69 x 102 -64,625 4176,39 -1985,60 3942607,96 128319,41 282,8 13,40 179,53 88,36

P3C 47,00 1,44 x 103 -27,025 730,35 -815,65 665279,26 22042,85 1430,2 9,09 82,67 2209

P4C 235,00 7,17 x 103 160,975 25912,95 4911,18 24119664,93 790576,81 7167,5 1,40 1,95 55225

Total 296,10 9019,90 0 35625,65 0 33179360,42 1087210,02 9019,90 29,59 296,67 57544.45



A curva de calibração obtida para os quatro padrões de calibração está representada

na figura 20, assumindo uma linha reta na forma algébrica 𝑦 = 𝑎 + 𝑏𝑥, onde o 𝑏 é o

declive e o 𝑎 a interceção com o eixo do 𝑦. O eixo vertical (𝑦) corresponde aos valores

das concentrações, em mg/l, de Mv-3-gl obtidas pelo método (representadas na coluna

“Área” da tabela 9 que equivale à média das cinco injeções de cada solução padrão) e

o eixo horizontal (𝑥) às concentrações conhecidas das soluções padrão de calibração.

Fig. 20 - Curva de calibração obtida para a Mv-3-gl, com base em quatro pontos, com representação da respetiva equação algébrica, coeficiente de determinação (R2) e desvio-padrão da reta (Sy/x)

A equação da reta de calibração obtida bem como o coeficiente de determinação (R2)

encontram-se também representados na figura 20. Pela observação da reta de

calibração, pode verificar-se que o composto analisado apresenta linearidade, isto é, o

método apresenta valores que são diretamente proporcionais à concentração do analito

e, uma vez que o critério mínimo aceitável para o valor de coeficiente de correlação (r)

estabelecido pelo Guia Relacre 2013 para métodos de quantificação é de 0,995, o

coeficiente de determinação (R2) é aceitável.

y = 30,52x - 4,09

R² = 1,00

Sy/x = 12,18

0,00E+00

1,00E+03

2,00E+03

3,00E+03

4,00E+03

5,00E+03

6,00E+03

7,00E+03

8,00E+03

0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00

Are

a

Mv-3-gl (g/l)

Calibração da Mv-3-gl de 15-02-2018



Cálculo dos limites de deteção (LD) e de

quantificação (LQ)

“Podem ser usados três métodos distintos para calcular os limites de deteção e de

quantificação: experimentalmente, a partir da razão sinal/ruído instrumental;

experimentalmente, a partir de uma série de ensaios com um branco representativo (ou

padrão de baixa concentração) e calculando a respetiva média e desvio-padrão ou

teoricamente, a partir da estatística de mínimos quadráticos da reta de calibração,

admitindo-se que o desvio-padrão da estimativa representa o desvio-padrão do branco”

(IPAC, 2010).

O presente relatório teve como referência o último método referido e seguiu as

determinações levadas a cabo pelo método de Miller & Miller. Para estas determinações,

Miller & Miller, baseiam-se não só no coeficiente de correlação (r) que garante a

linearidade da reta, como também em vários erros associados a todos os cálculos

necessários, por exemplo erros relativos ao declive e à interceção da linha de regressão

(Sb e Sa, respetivamente), e ainda num teste estatístico para verificar se o coeficiente

de correlação é significativo tendo em conta o número de pontos utilizados no cálculo

(teste t de Student em que o valor de t calculado é comparado com o valor de t tabelado).

Assim, todos estes parâmetros necessários para o cálculo final dos limites de deteção

(LD) e de quantificação (LQ), são a seguir representados.

Assim sendo, o coeficiente de correlação (r) é calculado pela seguinte fórmula:

r =∑ {(xi-x̅)(yi-y̅)}i

{[∑ (xi-x̅)2i ][∑ (xi-x̅)2

i ]}1/2 Equação 9

Onde (�̅�, �̅�) representam a média aritmética dos valores de 𝑥 e dos valores de 𝑦,

respetivamente.

O declive (b) e a ordenada na origem (a), são calculados segundo as equações 10 e 11:

𝒃 =∑ [(𝒙−�̅�)(𝒚−�̅�)]𝒊

∑ (𝒙−�̅�)𝟐𝒊

Equação 10



𝒂 = �̅� − 𝒃𝒙 Equação 11

Sendo o cálculo dos erros associados ao declive e à ordenada na origem dependentes

do desvio-padrão da reta de calibração (Sy/x), foi necessário fazer também o cálculo

deste parâmetro dado pela fórmula abaixo.

𝑺𝒚/𝒙 = {∑ 𝑨𝑩𝑺(𝒚𝒊−�̅�)𝟐

𝒊

𝒏−𝟐}

𝟏/𝟐

Equação 12

Sendo 𝐴𝐵𝑆 os valores absolutos, ou seja, os valores na curva de regressão que

correspondem aos valores individuais de 𝑥, que são calculados com facilidade com a

equação de regressão calculada e 𝑛 o número de padrões de calibração utilizado para

o cálculo.

Assim, o cálculo Sb e Sa, desvio padrão para o declive e para a ordenada na origem,

são feitos da seguinte forma:

𝑺𝒃 =𝑺𝒚/𝒙

{∑ (𝒙𝒊−�̅�)𝟐𝒊 }

𝟏/𝟐 Equação 13

𝑺𝒂 = 𝑺𝒚/𝒙 {∑ 𝒙𝒊

𝟐𝒊

𝒏 ∑ (𝒙𝒊−�̅�)𝟐𝒊

}𝟏/𝟐

Equação 14

Quanto ao teste t de Student para uma correlação significativa, isto é, Ho=0:

𝒕 =|𝒓|√𝒏−𝟐

√𝟏−𝒓𝟐 Equação 15

Existe ainda mais um parâmetro a ter em consideração uma vez que o cálculo do valor

de 𝑥 a partir de um dado 𝑦 segundo a equação da reta de calibração, como envolve o

uso do declive (b) e da ordenada na origem (a), fica também sujeito a erros. Além disso,

o sinal de HPLC obtido a partir de uma dada amostra está também sujeito a vários erros.



Portanto, o erro total associado ao cálculo de uma concentração é muito complexo e

usa-se para tal, uma fórmula próxima da seguinte:

𝑺𝒙𝟎=

𝒔𝒚/𝒙

𝒃√𝟏 +

𝟏

𝒏+

(𝒚𝟎−�̅�)𝟐

𝒃𝟐 ∑ (𝒙𝒊−�̅�)𝟐𝒊

Equação 16

Em que 𝑦0 é o valor experimental de 𝑦 a partir do qual se pode determinar o valor de

concentração de 𝑥0. Assim, 𝑆𝑥0 corresponde ao desvio-padrão de 𝑥0.

Posto isto, o cálculo dos limites de deteção e de quantificação, são efetuados segundo:

𝐿𝐷 =(𝑎+3𝑆𝑎)−𝑎

𝑏 e 𝐿𝑄 =

10𝑋

(𝑛−2) Equação 17

Onde (𝑛 − 2) são os graus de liberdade e 𝑛 o número de pontos de calibração.

Os valores calculados, correspondentes a todos os parâmetros referidos necessários

para se chegar ao cálculo final dos limites do presente método analítico, estão

representados na tabela 10, bem como os respetivos limites.



Tabela 10 – Valores calculados para as média das concentrações conhecidas dos padrões de calibração (�̅�) e dos

valores obtidos pelo presente método (�̅�), para o coeficiente de correlação (r), para o teste estatístico “t de Student” (t), o declive (b), a ordenada na origem (a), os devios associados ao declive (Sb) e à ordenada na origem (Sa) e por último, para os limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ) bem como outros parâmetros necessários para cálculos intermédios destes limites.

�̅� (mg/L) 74,03

�̅� (mg/L) 2254,98

r 1,00

t 579,23

b 30,52

a -4,09

(𝒚𝒊 − 𝒚)𝟐

𝒏 − 𝟐

148,34

Sy/x 12,18

Sb (mg/l) 0,06

Sa (mg/l) 7,74

a + 3Sa 19,13

LD (mg/l) 0,76

LQ (mg/l) 3,80



Assim, sendo o limite de deteção (LD) igual a 0,76 mg/l, significa que, para o presente

método, apenas é possível detetar um sinal cromatográfico cuja concentração em Mv-

3-gl, em mg/l, seja superior a 0,76, o que não quer dizer que esse sinal seja quantificável.

É por isso que se recorre ao limite de quantificação (LQ) que, representando o valor

mínimo que um dado método analítico consegue quantificar sob dadas condições,

significa que, neste caso, apenas é possível quantificar amostras cujo valor de

concentração em Mv-3-gl, em mg/l, seja superior a 3,80. Poderíamos ter preparado um

padrão de calibração com esta concentração para validar o LQ, mas optou-se por utilizar

o P1C (=4,70 mg/l) e validar o limite com este padrão. Assim, amostras cujo valor de

concentração em Mv-3-gl sejam inferiores a este valor, devem ser representadas como

“< P1C”.



Gama de Trabalho

A gama de trabalho definida para o presente método cromatográfico será estabelecida

entre o valor de concentração em Mv-3-gl do P1C, uma vez que este é usado como

limite de quantificação e o valor de concentração do padrão de calibração cuja

concentração é a mais elevada, ou seja, o P4C. Assim sendo, a gama de trabalhado

estabelecida para este método cromatográfico é [3,80; 235,0] em mg/l de Mv-3-gl.

Amostras que apresentem valores acima desta gama, terão de ser diluídas .



Para avaliação da qualidade dos resultados, procede-se à determinação dos

parâmetros de validação a seguir apresentados.

Precisão

A precisão pode ser avaliada de várias maneiras distintas, no entanto, a forma de

avaliação utilizada pelo presente método analítico, é feita através da estimativa do

coeficiente de variação (CV), em percentagem, utilizando a análise de variância

(ANOVA). A precisão, em validação de métodos analíticos, é considerada em três níveis

diferentes: repetibilidade, precisão intermédia e reprodutibilidade, (Ribani et al., 2004).

A avaliação dos referidos níveis para o presente método cromatográfico está a seguir

descrita.

Repetibilidade

Analisaram-se 6 vinhos distintos com 10 injeções cada e sob as mesmas condições,

para estudos de repetibilidade do método analítico. Por uma questão de simplicidade,

na tabela 11 estão representados apenas os valores das concentrações máximas e

mínimas, em mg/l, para cada uma das antocianinas detetadas no total de injeções dos

6 vinhos analisados, bem como respetivos valores de CV, em percentagem, máximos e

mínimos também para o total de injeções dos 6 vinhos. A totalidade de valores de

concentrações antociânicas e respetivos CV obtidos nas 10 injeções de cada uma das

6 amostras estão representados nos anexos 5, 6, 7, 8, 9 e 10.



Tabela 11 – Representação dos valores máximos e mínimos das médias das concentrações (mg/l) e dos coeficientes de variação (%) para cada antocianina identificada em 6 vinhos (4 vinhos tintos do Porto, 1 dos quais foi adicionada baga de sabugueiro, e 2 vinhos tintos do Douro), para um número de injeções para cada amostra igual a 10 (n=10).

Df-3-gl Cy-3-samb Cy-3-gl Pt-3-gl6 Pn-3-gl

Conc. (mg/l) TR (min) Conc. (mg/l) TR (min) Conc. (mg/l) TR (min) Conc. (mg/l) TR (min) Conc. (mg/l) TR (min)

Média

Mín. 1,23 13,31 1,49 14,57 9,18 14,79 1,47 15,98 1,45 17,82

Máx. 7,68 13,50 6,60 14,81 32,64 14,93 12,13 16,22 14,05 18,06

CV%

Mín. 0,39 0,39 1,10 0,41 0,21 0,42 0,30 0,40 0,28 0,34

Máx. 3,04 0,71 2,13 0,65 0,22 0,63 1,51 0,76 3,50 0,74

Mv-3-gl Df-3-acgl Vitisin A Pt-3-acgl Pn-3-acgl

6 Numa das amostras de vinho tinto do Douro para a antocianina Pt-3-gl, apenas se contabilizou n=8 porque os resultados de duas injeções foram eliminados pelo teste dos aberrantes.



Conc.(mg/l) TR(min) Conc.(mg/l) TR(min) Conc.(mg/l) TR(min) Conc(mg/l) TR(min) Conc.(mg/l) TR(min)

Média

Mín. 7,35 18,70 1,48 19,98 1,16 20,70 1,27 22,55 1,58 25,40

Máx. 121,01 18,97 2,18 20,10 11,86 20,95 2,19 23,30 4,31 26,31

CV%

Mín. 0,24 0,36 1,21 0,33 0,92 0,32 1,37 0,33 1,75 0,28

Máx. 0,98 0,75 8,54 0,36 4,54 1,41 3,63 0,80 6,10 0,70

Mv-3-acgl Pt-6-cougl

Pn-6-cougl Mv-6-cougl

Conc.(mg/l) TR(min) Conc.(mg/l) TR(min) Conc.(mg/l) TR(min) Conc.(mg/l) TR(min)

Média

Mín. 2,82 26,15 1,05 28,45 1,28 30,29 2,38 30,67

Máx. 23,51 26,60 1,72 28,46 3,88 30,44 22,35 30,79



CV%

Mín. 0,44 0,26 0,94 0,22 0,50 0,17 0,34 0,16

Máx. 9,99 0,67 0,95 0,24 3,75 0,39 4,53 0,36



Pela análise da tabela 11, verificamos que os tempos de retenção (TR) estão sempre

muito próximos variando no máximo uma unidade, e da percentagem dos coeficientes

de variância, que apresentam sempre resultados muito bons e suficientemente baixos

(<10%), pode concluir-se que o método apresenta boa repetibilidade para a análise do

analito em questão.

Precisão Intermédia

Para avaliação da precisão intermédia, analisaram-se amostras preparadas sob as

mesmas condições, mas em dias diferentes. As amostras analisadas sob estas

condições foram os padrões de verificação 1 e 3 (PV1 e PV3) (tabelas 12 e 13) e a

amostra de vinho do Porto dopada com Sambucus nigra L. (tabela 14) uma vez que

estas 3 amostras foram analisadas em todas as sequências efetuadas servindo de

controlo. Em todas estas sequências, foram utilizados os mesmos vials, para cada uma

das três amostras, preparados inicialmente.

Tal como na repetibilidade, efetua-se o cálculo da média das concentrações

antociânicas das várias injeções e respetivos coeficientes de variância (CV).



Tabela 12 – Representação dos valores da concentração da Mv-3-gl, em mg/l, presente no padrão 1 de verificação (P1V) em ensaios feitos ao longo do tempo bem como cálculos da média, em mg/l, dos ensaios efetuados ao longo do tempo, do desvio padrão (s), número total de ensaios efetuados (n), do coeficiente de correlação (r) e correspondente coeficiente de variância, em percentagem (%CV).

Ensaio Data Mv-3-gl

(mg/l)

1 07-03-18 4,90

2 09-03-18 4,60

3 12-03-18 3,80

4 14-03-18 3,54

5 15-03-18 3,15

6 16-03-18 4,86

7 19-03-18 4,84

8 20-03-18 4,69

9 28-03-18 4,81

10 05-04-18 4,47

11 09-04-18 4,72

12 10-04-18 4,65



Média

(mg/l) 4,42

s 0,59

n 12

r 1,65

CV% 13,30



Tabela 13 – Representação dos valores da concentração da Mv-3-gl, em mg/l, presente no padrão 3 de verificação (P3V) em ensaios feitos ao longo do tempo bem como cálculos da média, em mg/l, dos ensaios efetuados ao longo do tempo, do desvio padrão (s), número total de ensaios efetuados (n), do coeficiente de correlação (r) e correspondente coeficiente de variância, em percentagem (%CV).

Ensaio Data

Mv-3-gl

(mg/l)

1 07-03-18 46,62

2 09-03-18 44,65

3 12-03-18 41,37

4 14-03-18 40,34

5 15-03-18 39,40

6 16-03-18 47,06

7 19-03-18 46,82

8 20-03-18 46,07

9 26-03-18 42,40

10 28-03-18 41,20

13 10-04-18 40,56

14 16-04-18 39,94



Através da análise dos coeficientes de variação dos padrões de verificação 1 e 3 da Mv-

3-gl, representados nas tabelas 12 e 13, respetivamente, é possível verificar durante

quanto tempo tais amostras poderão ser utilizadas nas sequências de injeção. Como

cada um dos padrões foi injetado durante sensivelmente um mês, em diferentes dias

pelo mesmo analista e sob as mesmas condições, e, como cada CV é aproximadamente

<10% (para o P1V=13,30% e para o P3V=6,93%), é possível utilizar os padrões de

verificação 1 e 3 como controlo nas várias sequências de amostras vínicas, durante um

mês, para validar a reta de calibração e, por conseguinte, os resultados de Mv-3-gl

obtidos.

Média

(mg/l)

43,04

s 2,98

n 12

r 8,35

CV% 6,93



Tabela 14 - Valores da concentração, em mg/l, de diferentes antocianinas encontradas na amostra de vinho do Porto envelhecido e dopado com solução baga de sabugueiro, usada como controlo.

Ensaio Data Df-3-gl (mg/l) Cy-3-samb (mg/l) Cy-3-gl (mg/l) Pt-3-gl (mg/l) Pn-3-gl (mg/l)

1 05-03-18 4,73 6,83 34,50 6,34 4,60

2 06-03-18 4,71 6,88 34,01 6,26 4,59

3 07-03-18 4,62 6,61 33,68 6,21 4,54

4 09-03-18 4,57 6,60 32,64 6,06 4,48

5 12-03-18 4,41 6,03 30,83 5,77 4,30

6 14-03-18 4,61 6,53 31,96 5,95 4,38

7 15-03-18 4,32 6,11 30,02 5,58 4,18

8 16-03-18 4,26 5,92 29,39 5,53 4,11



9 19-03-18 4,98 7,28 34,39 6,35 4,60

10 20-03-18 4,31 6,05 29,28 5,52 4,12

11 26-03-18 4,34 5,84 29,41 5,52 4,15

12 28-03-18 4,57 6,30 30,99 5,75 4,30

Média 4,54 6,41 31,76 5,90 4,36

s 0,22 0,45 2,04 0,33 0,20

n 12 12 12 12 12

r 0,60 1,25 5,71 0,93 0,55

CV% 4,75 6,97 6,43 5,64 4,47



Ensaio Data Mv-3-gl (mg/l) Df-3-acgl (mg/l) Vitisin A (mg/l) Pt-3-acgl (mg/l) Pn-3-acgl (mg/l)

1 05-03-18 45,93 0,00 1,29 1,27 2,17

2 06-03-18 45,44 0,00 1,28 1,18 2,04

3 07-03-18 44,88 0,00 1,29 - 2,08

4 09-03-18 43,68 0,00 1,31 1,27 2,03

5 12-03-18 41,91 0,00 1,27 1,26 1,82

6 14-03-18 42,82 0,00 1,34 1,27 1,84

7 15-03-18 40,41 0,00 1,31 1,24 1,75



8 16-03-18 39,97 0,00 1,43 1,24 1,72

9 19-03-18 44,69 0,00 1,51 1,35 2,01

10 20-03-18 40,15 0,00 1,26 1,26 1,76

11 26-03-18 40,41 0,00 1,36 1,24 1,74

12 28-03-18 41,51 0,00 1,44 11,00 1,79

Média 42,65 0,00 1,34 1,26 0,11

s 2,22 0,00 0,08 0,04 0,16

n 12 12 12 117 12

7 Para esta antocianina apenas se contabilizaram 11 ensaios (n=11) porque o ensaio nº3 foi eliminado pelo teste dos aberrantes.



r 6,21 0,00 0,22 0,11 0,44

CV% 5,20 - 5,95 3,21 8,37

Ensaio Data Mv-3-acgl (mg/l) Pt-6-cougl (mg/L)

Pn-6-cougl (mg/L) Mv-6-cougl (mg/L)

1 05-03-18 6,48 0,00 1,85 8,02

2 06-03-18 6,42 0,00 1,82 7,90

3 07-03-18 6,31 0,00 1,81 7,81

4 09-03-18 6,50 0,00 1,77 7,55

5 12-03-18 5,79 0,00 1,70 7,23



6 14-03-18 5,85 0,00 1,74 7,45

7 15-03-18 5,61 0,00 1,65 6,93

8 16-03-18 5,54 0,00 1,66 6,90

9 19-03-18 7,47 0,00 1,83 7,82

10 20-03-18 6,70 0,00 1,64 6,92

11 26-03-18 6,73 0,00 1,69 7,19

12 28-03-18 5,41 0,00 1,75 7,34

Média 6,23 0,00

1,74 7,42

s 0,61 0,00 0,08 0,40



n 12 12 12 12

r 1,70 0,00 0,21 1,13

CV% 9,76 0,00 4,31 5,44



Tal como no caso anterior, também os coeficientes de variância representados na tabela

14, são <10%. Neste caso, significa que esta amostra de vinho do Porto dopada com

solução de baga de sabugueiro, pode ser utilizada durante também aproximadamente

um mês (concentração das várias antocianinas representadas na tabela 14, estáveis

durante um mês), como controlo nas várias sequências de amostras a serem

analisadas. Desta vez o controlo será dos tempos de retenção das várias antocianinas

típicas de vinho tinto e de baga de sabugueiro identificadas através do presente método.

Usualmente esta amostra é colocada a meio de cada sequência.

Reprodutibilidade

O método pode considerar-se aceitável se apresentar níveis de variação dentro do

aceitável para cada nível de concentração.

Para avaliar a reprodutibilidade do método, participamos num ensaio interlaboratorial

pelo BIPEA (Bureau Interprofessionnel d’Études Analytiques) que consiste na

determinação, através do método cromatográfico de HPLC utilizado por cada laboratório

participante, da concentração, em percentagem em função da Mv-3-gl, de nove

antocianinas típicas de vinho tinto. A amostra BIPEA é de concentração antociânica

desconhecida para os vários laboratórios.

Neste ensaio, apenas houve a participação de um laboratório além do IVDP, I.P. pelo

que a análise de resultados (tabela 15) será feita por comparação entre ambos.



Tabela 15 - Valores, em percentagem em função da Mv-3-gl, de nove antocianinas presentes em dois ensaios BIPEA, entre os dois laboratórios que participaram nestes ensaios.

Pela observação da tabela 15, pode verificar-se que para as nove antocianinas

representadas, os valores, em percentagem, de ambos os laboratórios participantes são

muito idênticos e dentro dos parâmetros pretendidos dando uma indicação positiva

relativamente ao trabalho que foi desenvolvido devendo, no entanto, ser reforçado com

mais ensaios interlaboratoriais.

Exatidão – Recuperações

As recuperações relacionam-se com a exatidão uma vez que representam uma possível

forma de a avaliar num dado método analítico. Sendo a recuperação um

“enriquecimento” de uma amostra, isto é, a adição de soluções com diferentes

concentrações do analito, em que a solução de adição corresponde a um padrão de

concentração conhecida, seguida da determinação da concentração de analito da

solução final, construiu-se a tabela 16 na qual se encontram as concentrações de Mv-

3-gl, em mg/l, das soluções em questão e respetivo valor das recuperações, em

percentagem.

Participan

tes Amostra

%Df-

3-gl

%Cyn-

3-gl

%Pt-

3-gl

%Pn-

3-gl

%Mv-

3-gl

%Pn-3-

acgl

%Mv-3-

acgl

%Pn-6-

cougl

%Mv-6-

cougl

Lab IVDP,

I.P.

Ensaio

BIPEA 1

13 2 11 8 46 4 10 2 4

Lab

participan

te

12 2 10 8 50 3 10 1 4

Lab IVDP,

I.P.

Ensaio

BIPEA 2

10 1 9 6 47 2 14 0 3

Lab

participan

te

10 1 9 6 53 2 15 1 3



Foram efetuadas recuperações para 4 amostras de vinho (1 vinho tinto do Porto, 1 vinho

do Porto rosé, 1 vinho tinto do Douro e 1 vinho do Douro rosado), com quatro injeções

de cada, efetuadas em dias diferentes. Por fim, calculou-se a recuperação média das 4

injeções (Rmédio) para cada uma das amostras. Assim, a recuperação, é medida como a

resposta de uma amostra enriquecida expressa em percentagem de resposta de uma

amostra pura (padrão) e indica se o método fornece a quantidade de analito presente

na amostra na sua totalidade. O valor, em percentagem, recuperado pelo processo é

calculado pela seguinte fórmula (Ribani et al., 2004; Causon R, 1997):

𝑹% =|𝒗𝒂𝒍𝒐𝒓 𝒂𝒅𝒊𝒄𝒊𝒐𝒏𝒂𝒅𝒐−𝒗𝒂𝒍𝒐𝒓 𝒊𝒏𝒊𝒄𝒊𝒂𝒍|

𝒗𝒂𝒍𝒐𝒓 𝒇𝒊𝒏𝒂𝒍𝒙𝟏𝟎𝟎 Equação 18



Tabela 16 - Estudo da recuperação de 4 amostras de vinho de diferentes estilos (vinho do Porto tinto, vinho do Porto rosé, vinho do Douro tinto e vinho do Douro rosado) com 4 injeções de cada uma delas efetuadas ao longo do tempo e respetiva concentração inicial de Mv-3-gl, em cada amostra e mg/l, concentração adicionada (em mg/l) e concentração

final de Mv-3-gl, em mg/l, %R, Rmédio e amplitude.

Data

Amostra

Mv3Glu

inicial

(mg/l)

Adição

(mg/l)

Mv3Glu

final

(mg/l)

R%

Rmédio

Amplitude

28-03-18 Vinho do Porto

tinto

28,32 14,13 44,20 112,42

112,27 15,97


tinto

30,49 12,98 46,00 119,51


tinto

25,49 13,73 41,08 113,62


tinto

25,43 33,23 59,83 103,54


rosé

9,38 33,42 43,64 102,52

103,46 1,87


rosé

9,15 33,19 43,80 104,39


rosé

8,95 33,46 43,56 103,45


rosé

8,97 33,01 43,13 103,47

23-04-18 Vinho do

Douro tinto

36,25 33,22 73,58 112,38 110,98 4,19



24-04-18 Vinho do

Douro tinto

36,66 33,01 73,86 112,69

27-04-18 Vinho do

Douro tinto

36,42 33,17 73,03 110,37

02-05-18 Vinho do

Douro tinto

33,70 33,47 70,02 108,50

08-05-18 Vinho do

Douro rosado

27,14 45,67 75,66 106,26

106,77 1,35

09-05-18 Vinho do

Douro rosado

26,43 45,66 75,57 107,61

14-05-18 Vinho do

Douro rosado

26,33 46,31 75,78 106,78

15-05-18 Vinho do

Douro rosado

26,03 46,72 75,74 106,41

Uma vez que a recuperação percentual desejada é de 100%, o que significa que o

método está a quantificar na totalidade o analito de interesse na amostra injetada, pode

afirmar-se que, no geral, o nosso método apresenta boa exatidão pois todos os valores

de Rmédio, são apenas ligeiramente acima de 100, sendo o valor mais elevado igual a

112,27 % com uma amplitude entre as 4 injeções de 15,97 valores, que é um valor

aceitável.



Parte II – Estudo da estabilidade das antocianinas

típicas de vinho tinto e de Sambucus nigra L.;

comparação entre a composição antociânica de

diferentes estilos de vinhos e identificação de

antocianinas típicas de Sambucus nigra L. em vinhos

do Douro (tintos e rosados) e em vinhos do Porto

(tintos e rosés)

Estudo da estabilidade antociânica das antocianinas

típicas de vinho tinto e das antocianinas típicas de

baga de sabugueiro

Para o estudo do comportamento antociânico das antocianinas típicas do vinho

derivadas da uva e das antocianinas típicas de baga de sabugueiro ao longo do tempo,

analisaram-se três amostras de vinho do Porto (amostra 1, amostra 2 e amostra 3) nas

quais foram detetadas antocianinas típicas de baga de sabugueiro. Estas foram

preparadas sempre pelo mesmo analista e sob as mesmas condições e injetadas ao

longo do tempo, as amostras 1 e 2 durante 3 meses e a amostra 3 durante um mês,

uma vez que tínhamos disponível menor quantidade desta última.

Adiante, apresenta-se o comportamento das antocianinas identificadas em formato de

tabelas e gráficos.



Tabela 17 – Concentração antociânica, em mg/l, de vários ensaios feitos ao longo do tempo, de uma amostra de vinho do Porto (amostra 1) na qual foram detetadas antocianinas típicas de baga de sabugueiro além das antocianinas típicas de vinho tinto.

Conc. Antociânica (mg/l)

Ensaio Data Df-3-gl Cy-3-samb

Cy-3-gl

Pt-3-gl Pn-3-gl Mv-3-gl Df-3-acgl

1 26-03-

18 8,36 9,75 2,36 13,36 15,27 130,78 1,95

2 08-05-

18 5,99 7,93 2,20 8,78 10,81 90,14 2,19

3 09-05-

18 6,21 7,78 2,10 8,49 11,26 92,39 2,56

4 15-05-

18 6,24 8,34 2,28 8,30 11,14 91,68 2,38

5 16-05-

18 4,82 6,25 1,97 6,88 8,57 72,00 1,92

6 17-05-

18 4,66 6,04 1,80 6,29 8,24 69,60 1,88

7 22-05-

18 4,16 5,52 1,73 5,54 7,39 62,37 1,85

8 06-06-

18 3,41 4,72 1,53 4,39 6,12 52,19 1,95

Vitisin

A Pt-3-acgl

Pn-3-acgl

Mv-3-acgl

Pt-6-cougl

Pn-6-cougl

Mv-6-cougl



1 26-03-

18 10,76 1,83 5,04 26,09 2,17 5,32 28,21

2 08-05-

18 16,15 2,05 3,38 17,60 4,41 3,02 16,17

3 09-05-

18 16,72 2,12 3,81 18,20 1,59 3,58 18,72

4 15-05-

18 17,89 2,22 3,63 18,23 1,68 3,50 18,39

5 16-05-

18 13,47 1,68 2,63 14,02 1,39 2,05 10,93

6 17-05-

18 14,16 1,65 2,54 13,44 1,22 1,93 10,29

7 22-05-

18 14,34 1,62 2,28 12,07 1,27 1,77 9,16

8 06-06-

18 14,08 1,42 1,91 10,17 1,13 1,42 7,24



Fig. 21 – Gráfico de dispersão com linhas retas, representativo do comportamento da concentração, em mg/l, das várias antocianinas identificadas num vinho do Porto (amostra 1) no qual foram identificadas antocianinas típicas de baga de sabugueiro, além das antocianinas típicas de vinho tinto, ao longo de três meses e respetiva legenda representada no lado direito do gráfico

Fig. 22 – Gráfico de barras representativo da concentração, em mg/l, do total de antocianinas identificadas na amostra 1 de vinho do Porto exceto a Vitisin A (barra bordô) e representação em separado da Vitisin A (barra cinzenta) no primeiro e último mês de injeção desta amostra. A escala de concentrações, em mg/l, do lado esquerdo do gráfico é relativa ao total de antocianinas (exceto Vitisin A) enquanto que a escala de concentrações, em mg/l, do lado direito do gráfico é relativa à Vitisin A.

0,00

10,00

20,00

30,00

26-Mar 5-Apr 15-Apr 25-Apr 5-May 15-May 25-May 4-Jun

Co

ncen

tração

(mg/L)

Data de injeção

Comportamento das diferentes antocianinas de um vinho do Porto (amostra 1), no qual se identificaram antocianinas típicas

baga de sabugueiro, ao longo de três meses

Df-3-gl

Cyn-3-sambCyn-3-glPt-3-gl

Pn-3-glDf-3-acglVitisinAPt-3-acglPn-3-acglMv-3-acglPt-6-couglPn-6-cougl

0

50

100

150

200

250

300

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

Co

nce

ntr

ação

(m

g/L)

Tempo (dias)

Co

nce

ntr

ação

(m

g/l)

Amostra 1

Vitisin A Total

26-03-2018 06-06-2018



Tabela 18 – Concentração antociânica, em mg/l, de vários ensaios feitos ao longo do tempo, de uma amostra de vinho

do Porto (amostra 2) na qual foram detetadas antocianinas típicas de baga de sabugueiro além das antocianinas típicas

de vinho tinto.



Cy-3-gl


1 26-03-

18 7,01 15,98 3,16 9,67 14,95 115,55 1,77

2 08-05-

18 5,38 13,36 3,06 7,73 10,97 82,70 1,91

3 09-05-

18 5,37 13,40 3,18 7,64 11,06 82,49 1,96

4 15-05-

18 5,11 13,16 3,07 6,96 10,69 79,15 2,08

5 16-05-

18 4,95 12,94 3,13 7,15 10,51 76,85 2,10

6 17-05-

18 4,81 12,75 3,09 6,86 10,30 75,02 2,00

7 22-05-

18 4,17 11,67 2,86 5,71 9,35 66,38 1,97

8 06-06-

18 3,54 10,64 2,54 5,49 8,40 59,35 2,10

Vitisin

A Pt-3-acgl

Pn-3-acgl

Mv-3-acgl

Pt-6-cougl

Pn-6-cougl

Mv-6-cougl



1 26-03-

18 9,02 1,63 3,81 22,36 1,64 3,85 20,20

2 08-05-

18 13,60 1,78 2,98 15,89 1,29 3,07 15,63

3 09-05-

18 13,11 1,83 2,99 15,79 1,28 3,03 15,39

4 15-05-

18 14,13 1,83 2,97 15,31 1,19 3,06 15,24

5 16-05-

18 14,53 1,78 2,85 14,81 1,15 2,95 14,48

6 17-05-

18 14,87 1,75 2,80 14,46 1,13 2,84 14,08

7 22-05-

18 14,40 1,74 2,58 12,85 1,04 2,61 12,60

8 06-06-

18 15,57 1,62 2,29 11,54 0,00 2,34 10,97



Fig. 23 – Gráfico de dispersão com linhas retas, representativo do comportamento da concentração, em mg/l, das várias antocianinas identificadas num vinho do Porto (amostra 2) no qual foram identificadas antocianinas típicas de baga de sabugueiro, além das antocianinas típicas de vinho tinto, ao longo de três meses e respetiva legenda representada no lado direito do gráfico.

Fig. 24 – Gráfico de barras representativo da concentração, em mg/l, do total de antocianinas identificadas na amostra 2 de vinho do Porto exceto a Vitisin A (barra bordô) e representação em separado da Vitisin A (barra cinzenta) no primeiro e último mês de injeção desta amostra. A escala de concentrações, em mg/l, do lado esquerdo do gráfico é relativa ao total de antocianinas (exceto Vitisin A) enquanto que a escala de concentrações, em mg/l, do lado direito do gráfico é relativa à Vitisin A.

0

50

100

150

200

250

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

Co

nce

ntr

ação

(m

g/L)

Tempo (dias)

Co

nce

ntr

ação

(m

g/l)

Amostra 2

Vitisin A Total

06-06-201826-03-2018

0,00

10,00

20,00

30,00

26-Mar 5-Apr 15-Apr 25-Apr 5-May 15-May 25-May 4-Jun

Co

ncen

tração

(mg/L)

Data de injeção


baga de sabugueiro, ao longo de três meses

Df-3-gl

Cyn-3-sambCyn-3-glPt-3-gl

Pn-3-gl

Df-3-acglVitisinAPt-3-acglPn-3-acglMv-3-acglPt-6-cougl



Tabela 19 – Concentração antociânica, em mg/l, de vários ensaios feitos ao longo do tempo, de uma amostra de vinho do Porto (amostra 3) na qual foram detetadas antocianinas típicas de baga de sabugueiro além das antocianinas típicas de baga de sabugueiro



Cy-3-gl


1 07-05-

18 23,41 19,15 8,16 26,75 18,79 153,58 4,68

2 08-05-

18 23,83 19,81 8,43 26,96 18,96 154,61 4,62

3 09-05-

18 23,72 19,77 8,45 26,48 18,76 154,74 4,08

4 15-05-

18 22,16 18,82 8,20 23,43 17,57 143,08 4,04

5 16-05-

18 22,38 18,85 8,11 22,97 17,79 144,01 4,13

6 17-05-

18 21,91 18,45 8,01 22,88 17,41 139,51 4,86

7 22-05-

18 19,95 17,13 7,34 21,28 15,63 127,75 3,90

8 06-06-

18 17,43 15,07 6,28 19,65 13.59 110,06 4,30

Vitisin

A Pt-3-acgl

Pn-3-acgl

Mv-3-acgl

Pt-6-cougl

Pn-6-cougl

Mv-6-cougl



1 07-05-

18 14,02 4,04 5,38 26,00 2,62 4,03 20,62

2 08-05-

18 14,12 4,18 5,38 26,02 2,47 3,83 19,91

3 09-05-

18 13,11 4,08 5,59 26,21 2,52 4,09 20,76

4 15-05-

18 16,29 4,01 4,94 24,26 2,30 3,58 18,25

5 16-05-

18 14,92 4,44 5,29 24,30 2,43 3,96 20,01

6 17-05-

18 15,13 5,03 4,99 23,62 2,34 3,66 18,49

7 22-05-

18 15,55 4,80 4,50 21,54 2,12 3,22 16,65

8 06-06-

18 17,05 4,23 3,98 18,76 1,65 3,11 14,79



Fig. 25 – Gráfico de dispersão com linhas retas, representativo do comportamento da concentração, em mg/l, das várias antocianinas identificadas num vinho do Porto (amostra 3) no qual foram identificadas antocianinas típicas de baga de sabugueiro, além das antocianinas típicas de vinho tinto, ao longo de um mês e respetiva legenda representada no lado direito do gráfico.

Fig. 26 - Gráfico de barras representativo da concentração, em mg/l, do total de antocianinas identificadas na amostra 3 de vinho do Porto exceto a Vitisin A (barra bordô) e representação em separado da Vitisin A (barra cinzenta) no primeiro e último mês de injeção desta amostra. A escala de concentrações, em mg/l, do lado esquerdo do gráfico é relativa ao total de antocianinas (exceto Vitisin A) enquanto que a escala de concentrações, em mg/l, do lado direito do gráfico é relativa à Vitisin A.

0

10

20

30

7-May 17-May 27-May 6-Jun

Co

ncen

tração

(mg/L)

Data de injeção


baga de sabugueiro, ao longo de um mês

Df-3-glCyn-3-sambCyn-3-glPt-3-gl

Pn-3-glDf-3-acglVitisinAPt-3-acglPn-3-acglMv-3-acglPt-6-couglPn-6-cougl

0

50

100

150

200

250

300

350

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Co

nce

ntr

ação

(m

g/L)

Tempo (dias)

Co

nce

ntr

ação

(m

g/l)

Amostra 3 (1438)

Vitisin A Total

07-05-2018 06-06-2018



As tabelas 17, 18 e 19, bem como os gráficos respetivos, figuras 21 e 22, 23 e 24, 25 e

26, pertencem a amostras de vinhos do Porto do mesmo ano de colheita, nas quais

foram detetadas antocianinas de baga de sabugueiro e, por observação rápida, verifica-

se que as conclusões relativas à estabilidade da concentração antociânica de todas as

antocianinas identificadas nestas três amostras (amostra 1, 2 e 3), são idênticas.

Assim sendo, através de uma observação detalhada das tabelas 17, 18 e 19, verifica-

se que, no geral, as antocianinas típicas de baga de sabugueiro (Cy-3-samb e Cy-3-gl)

mantêm uma concentração sensivelmente mais estável, variando apenas em algumas

unidades durante três meses de injeção, do que as antocianinas presentes no vinho

derivadas da uva, essencialmente a Mv-3-gl cuja concentração varia em dezenas de

unidades durante três meses.

Quanto à observação dos gráficos das figuras 21, 23 e 25 pode concluir-se que a

totalidade das antocianinas, tanto as que provêm da uva como as que provêm da baga

de sabugueiro, têm tendência a diminuir a sua concentração presente no vinho ao longo

do tempo enquanto que a Vitisin A, um derivado pirúvico, tende a aumentar a sua

concentração presente no vinho ao longo do tempo, correspondendo à única linha de

tendência que aumenta nestes gráficos.

Os gráficos das figuras 22, 24 e 26, correspondem a uma representação quantitativa do

total de antocianinas, apresentadas pelas barras a cinzento, presentes nas amostras 1,

2 e 3, respetivamente, e ainda da Vitisin A, que se encontra representada

separadamente pelas barras a bordô. Estes gráficos demonstram igualmente que, à

medida que a concentração total de antocianinas no vinho aumenta, a concentração da

Vitisin A diminui ao longo do tempo. Assim, na amostra 1, o total de antocianinas passa

de 261,26 mg/l para 111,67 mg/l enquanto que a concentração de Vitisin A passa de

10,76 mg/l a 14,09 mg/l; na amostra 2, o total de antocianinas passa de 230,61 mg/l

para 136,40 mg/l antocianinas passa de 331,23 mg/l para 249,96 mg/l enquanto que a

concentração de Vitisin A passa de 14,02 mg/l a 17,05 mg/l. Correspondendo, portanto,

os gráficos das figuras 20, 22 e 24, a uma representação qualitativa enquanto que os

gráficos das figuras 21, 23 e 25 correspondem a uma representação mais quantitativa.

Isto vai de encontro com o esperado e referido anteriormente uma vez que, a Vitisin A

é um derivado pirúvico proveniente da Mv-3-gl. Tal como a Vitisin A, existem outros

derivados pirúvicos que se formam durante reações de polimerização das antocianinas



com outros compostos presentes no vinho (nomeadamente o ácido pirúvico derivado da

fermentação malolática) durante o seu envelhecimento, e resultam nestes pigmentos

mais estáveis presentes essencialmente nos vinhos mais fortificados. Assim sendo é

natural que, durante o envelhecimento dos vinhos estes derivados pirúvicos, como é o

caso da Vitisin A, aumentem a sua concentração enquanto a totalidade das antocianinas

(tanto do vinho como típicas de baga de sabugueiro) diminuem, visto que estas vão

também sofrer transformações originando outros compostos.

Comparação da concentração antociânica entre

vinhos do Douro tintos e rosados e vinhos do Porto

tintos e rosés

De um total de 622 injeções de amostras feitas utilizando o presente método

cromatográfico (SAMB.4), incluindo padrões de verificação e a amostra de vinho do

Porto dopada com solução de baga de sabugueiro utilizada como controlo, fez-se uma

divisão de acordo com os vários tipos de vinhos analisados. Deste modo, dividiram-se

as amostras vínicas analisadas em: vinhos tintos do Douro, vinhos rosados do Douro,

vinhos tintos do Porto e vinhos do Porto rosé e, por uma questão de simplicidade,

organizaram-se os valores dos diferentes tipos de vinhos através de tabelas onde se

representaram a concentração mínima e máxima, em mg/l, do total de injeções para

cada tipo de vinho, para posteriores comparações antociânicas.

Os resultados correspondentes à totalidade das injeções efetuadas, encontram-se em

anexo.



Tabela 20 – Representação das concentrações máximas e mínimas, em mg/l, de cada antocianina detetada num total de 286 amostras de vinho tinto do Douro analisadas.

Estilo de vinho

Vinho do Douro – Tinto

Antocianinas Df-3-

gl Cy-3-samb

Cy-3-gl Pt-3-gl Pn-3-gl Mv-3-gl Df-3-acgl

Conc. mín. (mg/l)

1,03 1,04 0,50 1,27 1,05 5,28 1,00

Conc. máx. (mg/l)

19,97 7,28 13,31 92,13 20,91 160,51 10,54

Antocianinas Vitisin

A Pt-3-acgl Pn-3-acgl

Mv-3-acgl

Pt-6-cougl

Pn-6-cougl

Mv-6-cougl

Conc. mín. (mg/l)

1,11 1,01 1,01 1,22 0,50 1,00 1,01

Conc. máx. (mg/l)

19,10 4,66 6,71 42,32 2,59 4,81 21,94

Total amostras

286



Tabela 21 - Representação das concentrações máximas e mínimas, em mg/l, de cada antocianina detetada num total de 19 amostras de vinho rosado do Douro analisadas.

Estilo de vinho

Vinho do Douro – Rosado

Antocianinas Df-3-gl Cyb-3-samb

Cyn-3-gl Pt-3-gl Pn-3-

gl Mv-3-

gl Df-3-acgl

Conc. mín. (mg/l)

1,20 - - 1,09 1,12 6,15 1,04

Conc. máx. (mg/l)

7,58 - - 8,63 2,66 54,27 1,36

Antocianinas Vitisin A Pt-3-acgl Pn-3-acgl

Mv-3-acgl

Pt-6-cougl

Pn-6-cougl

Mv-6-cougl

Conc. mín. (mg/l)

- 1.21 1.40 1,15 - - 1,04

Conc. máx. (mg/L)

1,78 1.55 2.17 10,37 - - 3,96

Total amostras

19



Tabela 22 - Representação das concentrações máximas e mínimas, em mg/l, de cada antocianina detetada num total de 114 amostras de vinho tinto do Porto analisadas.

Estilo de vinho

Vinho do Porto – Tinto


Cyn-3-gl


Conc. mín. (mg/l)

1,05 1,04 1,06 1,00 1,00 5,32 1,01

Conc. máx. (mg/l)

31,64 19,98 8,45 31,85 62,47 174,64 7,29


A Pt-3-acgl

Pn-3-acgl

Mv-3-acgl

Pt-6-cougl

Pn-6-cougl

Mv-6-cougl

Conc. mín. (mg/l)

1,61 0,55 1,00 1,02 1,02 1,03 0,88

Conc. máx. (mg/l)

26,72 6,45 8,15 35,64 4,29 9,11 32.58

Total amostras

114



Tabela 23 - Representação das concentrações máximas e mínimas, em mg/l, de cada antocianina detetada num total de 13 amostras de vinho do Porto rosé analisadas.

Estilo de vinho

Vinho do Porto – Rosé


Cyn-3-gl


Conc. mín. (mg/l)

1,17 3,53 - 1,23 1,24 6,03 -

Conc. máx. (mg/l)

1,95 3,70 - 2,87 1,87 19,65 -


A Pt-3-acgl

Pn-3-acgl

Mv-3-acgl

Pt-6-cougl

Pn-6-cougl

Mv-6-cougl

Conc. mín. (mg/L)

1,01 - - 2,04 - - 2,38

Conc. máx. (mg/l)

1,18 - - 3,47 - - 2,78

Total amostras

13



Como é sabido, a cor é um dos principais atributos dos vinhos tintos sendo as

antocianinas provenientes das uvas e seus derivados formados durante o processo de

vinificação, os principais responsáveis pela intensidade da cor dos vinhos. Deste modo,

é de esperar que vinhos tintos possuam muito mais concentração antociânica do que

vinhos rosados cuja intensidade de cor é muito mais ténue. Assim, como se pode ver

pela comparação entre as tabelas 20 e 21, 22 e 23, as concentrações máximas de todas

as antocianinas identificadas nas amostras de vinho injetadas, são muito maiores em

vinhos tintos que em vinhos rosadas, tanto em vinhos do Douro como em vinhos do

Porto.

Já comparando os valores da tabela correspondente a vinhos tintos do Douro (tabela

20) com os valores da tabela correspondente a vinhos tintos do Porto (tabela 22),

principalmente as concentrações máximas, pode concluir-se que estas são mais

elevadas, em geral, nos vinhos tintos do Porto do que nos vinhos tintos do Douro

injetados. Enquanto que, no que diz respeito a vinhos rosados, os valores de

concentração da tabela 21 (vinhos rosados do Douro) são mais elevados que os que se

encontram na tabela 23 (vinhos do Porto estilo rosé). Isto deve-se praticamente na

integra, à data de colheita dos vinhos. Isto é, seria de esperar que ambas as conclusões,

tanto para vinhos tintos como rosados, fossem que os valores das concentrações dos

vinhos do Douro fossem mais elevados que os dos vinhos do Porto uma vez que, tal

como mostra a figura 27 e como já foi explicado anteriormente, apesar da concentração

em fenólicos totais aumentar, a concentração antociânica diminui durante o

envelhecimento dos vinhos já que estas dão lugar à formação de novos pigmentos.

Assim, quanto mais jovens os vinhos, maior o seu teor antociânico e, quanto mais antigo

o seu ano de colheita, menos antocianinas deverá conter. Como os vinhos do Proto,

devido à sua matriz caraterística, requerem um envelhecimento mais longo que a

generalidade dos vinhos do Douro, estes deverão, à partida, conter maior concentração

antociânica. No entanto, isto apenas se verifica nos vinhos rosados injetados e não nos

tintos porque, de facto, todos os vinhos do Porto do estilo rosé injetados, têm anos de

colheita muito mais antigos que os vinhos rosados do Douro, no entanto, a maioria dos

vinhos tintos do Douro injetados são de anos de colheita inferiores aos dos vinhos tintos

do Porto, daí as conclusões ditas anteriormente.



Fig. 27 - Mudanças na intensidade da cor dos vinhos durante o seu envelhecimento, em função da concentração em antocianinas e em compostos fenólicos totais (Zoecklein et al., 1994).

Deteção de antocianinas de baga de sabugueiro em

vinhos

A seguir, e como não existem diferenças muito significativas entre estes

cromatogramas, estão representados apenas alguns dos cromatogramas de amostras

de vinho do Douro e do Porto nas quais foram detetadas antocianinas típicas de baga

de sabugueiro, aparecendo os restantes cromatogramas em falta nos anexos 12 e 13.

Compostos fenólicos

Totais

Intensidade Antocianinas (g/l)

Dias



Fig. 28 – Cromatograma de HPLC, representativo das 14 amostras de vinho do Porto tinto nas quais foram detetadas, além das antocianinas típicas de uva identificadas pelo método SAMB4, antocianinas típicas de Sambucus nigra, estando as restantes amostras das 14 totais, no Anexo 12.

Fig. 29 – Cromatograma de HPLC, representativo da amostra de vinho do Porto rosé, na qual foram detetadas, além das antocianinas típicas de uva identificadas pelo método SAMB4, antocianinas típicas de Sambucus nigra L.

Fig. 30 – Cromatograma de HPLC, representativo das 7 amostras de vinhos tintos do Douro, nas quais foram detetadas, além das antocianinas típicas de uva identificadas pelo método SAMB4, antocianinas típicas de Sambucus nigra L., estando as restantes amostras das 7 totais, no Anexo 13.

2 5

0

1 2

3

45

6

78

9 10

11

12 13

14

1

2

3

45

6

811 14

1

3

4

6

7 8 9 10

11

12 13

14



Fig. 31 – Cromatograma de HPLC, correspondente à amostra de vinho do Porto envelhecido dopado com solução de baga de sabugueiro.

Por comparação dos cromatogramas representados nas figuras 28, 29 e 30 com o

cromatograma típico da amostra de vinho do Porto envelhecido dopado com solução de

baga de sabugueiro, representado na figura 31, bem como pela análise dos seus tempos

de retenção, é fácil de perceber que em todas estas amostras vínicas foram detetadas

antocianinas típicas de baga de sabugueiro.

Assim, como referido anteriormente, estes resultados são positivos se no seu

cromatograma aparecer um pequeno pico depois da df-3-gl, correspondente à cy-3-

samb e, imediatamente a seguir a este, um pico mais acentuado correspondente à cy-

3-gl, uma vez que através deste método é possível separar os dois picos

Legenda geral:

1 – Df-3-gl;

2 – Cy-3-samb;

3 – Cy-3-g;

4 – Pt-3-gl;

8 – Vitisin A;

9 – Pt-3-acgl;

10 – Pn-3-acgl;

11 – Mv-3-acgl;

1 2

3

4 5

6

7

8

9 10

11

12 13

14



correspondentes a estas duas últimas antocianinas. De facto, é possível identificar estes

picos nos cromatogramas das figuras 28, 29 e 30, no entanto, nestas figuras, assim

como na maioria dos cromatogramas dos anexos 12 e 13, a cy-3-gl apresenta-se

através de picos ainda mais pequenos que a cy-3-samb porque, como já foi dito, as

antocianinas típicas de baga de sabugueiro são, à partida, mais estáveis que as

antocianinas que advêm da uva e, devido à idade avançada destes vinhos, todas as

antocianinas começam a reagir com outros compostos presentes na sua matriz, daí os

picos cromatográficos serem mais pequenos para a cy-3-gl do que para a cy-3-samb,

uma vez que esta última sendo mais estável, apresenta maior durabilidade na matriz

dos vinhos.

Sendo este o principal objetivo do presente trabalho, a deteção de antocianinas típicas

de baga de sabugueiro em vinhos, pode dizer-se que, do total das 622 amostras vínicas

injetadas, 22 deram um resultado positivo para esta finalidade, sendo 14

correspondentes a amostras de vinho do Porto tinto, 1 amostra de vinho do Porto rosé

e 7 amostras de vinho tinto do Douro



Conclusões e providências futuras

Com o presente trabalho permitiu-se a implementação de um método que permite a

determinação das antocianinas típicas de baga de sabugueiro, caso tenham sido

adicionadas ao vinho, através da técnica de HPLC. Este método analítico veio reforçar

o papel do Instituto dos Vinhos do Douro e Porto na certificação e qualidade dos vinhos

permitindo incrementar à sua base de dados, novas caraterísticas antociânicas.

Para além dos benefícios internos ao IVDP, I.P., com a implementação deste método

os produtores vínicos ficam mais alerta acerca da questão do controlo de qualidade dos

seus vinhos e especificamente à adição fraudulenta de baga de sabugueiro que pode

causar sérios problemas relativos à economia dos vinhos portugueses essencialmente

de vinhos do Porto.

Por fim, e uma vez que se utilizou um sistema de UHPLC com um método caraterístico

de HPLC, será útil para o IVDP, I.P., apostar na criação de um método típico de UHPLC

no qual se usa uma coluna de menores dimensões e com partículas também de

menores dimensões tornando exequível obter, com melhor resolução, a mesma

quantidade de amostras, em metade do tempo em comparação com o método utilizado

no presente trabalho, típico de HPLC. Assim, será possível ao IVDP, I.P., não só analisar

uma maior quantidade de amostras de uma só vez, como também responder num menor

intervalo de tempo aos produtores.



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http://www.chromatographyonline.com/uhplc-part-i-perspectives-and-instrumental-features

http://www.chromatographyonline.com/uhplc-part-i-perspectives-and-instrumental-features



Anexos - Parte I

Anexo 1 – Anexo técnico correspondente ao certificado de acreditação IPAC, nº C0024 (Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2017)).



Anexo 2 – Lista de certificações sob acreditação flexível (Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2017)).



Anexo 3 – Lista de ensaios acreditados do serviço de laboratórios do IVDP, I.P. (Instituto dos Vinhos do

Douro e Porto, (2017)).



Anexo 4 – Lista de ensaios acreditados da câmara de provadores do IVDP, I.P. (Instituto dos Vinhos do Douro e Porto, (2017)).



Anexos - Parte II

Anexo 5 – Concentração (Conc.), em mg/l, e respetivo tempo de retenção (TR), em min., das antocianinas encontradas num amostra de vinho tinto do Douro usada para

avaliação da repetibilidade, o qual de injetou 10 vezes (n) e, representação das respetivas médias (Media), desvio-padrão (s), coeficiente de correlação (r) e coeficiente de variância (%CV).

07-03-18 Df-

3-gl

Cy-3-

samb

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3-gl

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n A

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Pt-6-

cougl

Pn-6-

cougl

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cougl

Con

c

TR Conc T

R

Con

c

T

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c

TR Con

c

TR Con

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TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc TR

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AL

5.33 13.

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0.00 0.

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18.

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AL

5.43 13.

34

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00

0.00 0.

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7.93 16.

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4.67 18.

03

95.8

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18.

93

1.49 20.

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98

- - 2.26 25.

67

23.57 26.

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AL

5.44 13.

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00

0.00 0.

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7.97 16.

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95.9

8

18.

95

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98

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35

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23.46 26.

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AL

5.43 13.

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0.00 0.

00

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s 0.03 0.0

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n 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

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Anexo 6 – Concentração (Conc.), em mg/l, e respetivo tempo de retenção (TR), em min., das antocianinas encontradas numa amostra de vinho tinto do Porto, usada para


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94 0.00

0.

00 8.69

20.

91 0.00

23.

26 1.55

26.

31 3.09

26.

61 0.00

0.

00 0.00

0.

00 0.00

0.

00

Media 1.23 13.

47 0.00

0.

00 0.00

0.

00 1.47

16.

16 0.00

0.

00 7.35

18.

90 0.00

0.

00 8.72

20.

90 0.00

23.

26 1.58

26.

31 3.07

26.

60 0.00

0.

00 0.00

0.

00 0.00

0.

00

s 0.01 0.0

8 0.00

0.

00 0.00

0.

00 0.02

0.0

8 0.00

0.

00 0.04

0.0

8 0.00

0.

00 0.08

0.0

8 0.00

0.0

8 0.10

0.0

8 0.05

0.0

9 0.00

0.

00 0.00

0.

00 0.00

0.

00

n 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

r 0.03 0.2

1 0.00

0.

00 0.00

0.

00 0.05

0.2

3 0.00

0.

00 0.10

0.2

4 0.00

0.

00 0.22

0.2

3 0.00

0.2

1 0.27

0.2

3 0.15

0.2

4 0.00

0.

00 0.00

0.

00 0.00

0.

00



CV% 0.85 0.5

7

0.00 0.

00 0.00 0.

00 1.12

0.5

0

0.00 0.

00 0.49

0.4

5

0.00 0.

00 0.92

0.3

9 0.00

0.3

3 6.10

0.3

1 1.76

0.3

2

0.00 0.

00 0.00 0.

00 0.00 0.

00



Anexo 7 – Concentração (Conc.), em mg/l, e respetivo tempo de retenção (TR), em min., das antocianinas encontradas na amostra de vinho tinto do Porto dopada com solução

de baga de sabugueiro, usada para avaliação da repetibilidade, o qual de injetou 10 vezes (n) e, representação das respetivas médias (Media), desvio-padrão (s), coeficiente de correlação (r) e coeficiente de variância (%CV).

Df-

3-gl

Cy-3-

samb

Cy-

3-gl

Pt-

3-gl

Pn-

3-gl

Mv-

3-gl

Df-3-

acgl

Vitisi

n A

Pt-3-

acgl

Pn-3-

acgl

Mv-3-

acgl

Pt-6-

cougl

Pn-6-

cougl

Mv-6-

cougl

Vinho do

Porto dopado 4.58

13.

24 6.59

14.

51

32.6

4

14.

88

6.0

6

15.

98 4.48

17.

88

43.8

1

18.

79 0.00

0.

00 1.28

20.

82 1.26

23.

21 2.04

25.

53 6.10

26.

29 0.00

0.

00 1.78

30.

38 7.60

30.

73

Vinho do

Porto dopado 4.55

13.

30 6.68

14.

56

32.6

4

14.

91

6.0

7

15.

96 4.48

17.

80

43.7

6

18.

69 0.00

0.

00 1.29

20.

69

23.

06 1.92

25.

40 6.10

26.

16 0.00

0.

00 1.78

30.

27 7.58

30.

61

Vinho do

Porto dopado 4.55

13.

15 6.71

14.

40

32.6

0

14.

75

6.0

3

15.

80 4.49

17.

61

43.7

2

18.

50 0.00

0.

00 1.30

20.

50 1.29

22.

93 2.05

25.

35 7.42

26.

14 0.00

0.

00 1.77

30.

36 7.53

30.

72

Vinho do

Porto dopado 4.54

13.

41 6.53

14.

68

32.7

3

15.

03

6.0

2

16.

08 4.46

17.

92

43.7

1

18.

80 0.00

0.

00 1.31

20.

80 1.25

23.

16 2.07

25.

48 6.10

26.

23 0.00

0.

00 1.78

30.

34 7.57

30.

69

Vinho do

Porto dopado 4.59

13.

36 6.57

14.

61

32.6

6

14.

96

6.0

9

15.

99 4.48

17.

81

43.6

7

18.

69 0.00

0.

00 1.30

20.

67 1.27

23.

01 2.03

25.

32 6.08

26.

08 0.00

0.

00 1.77

30.

23 7.55

30.

58

Vinho do

Porto dopado 4.57

13.

47 6.53

14.

72

32.7

1

15.

07

6.0

8

16.

12 4.47

17.

95

43.6

4

18.

83 0.00

0.

00 1.34

20.

83 1.26

23.

18 2.07

25.

50 6.09

26.

25 0.00

0.

00 1.78

30.

36 7.57

30.

70

Vinho do

Porto dopado 4.59

13.

27 6.72

14.

50

32.4

9

14.

85

6.0

3

15.

88 4.53

17.

68

43.7

5

18.

56 0.00

0.

00 1.29

20.

54 1.22

22.

92 2.03

25.

25 6.08

26.

01 0.00

0.

00 1.76

30.

19 7.52

30.

55



Vinho do

Porto dopado 4.55

13.

31 6.52

14.

59

32.6

9

14.

94

6.0

5

16.

00 4.47

17.

85

43.6

3

18.

74 0.00

0.

00 1.32

20.

75 1.35

23.

13 2.04

25.

51 7.40

26.

27 0.00

0.

00 1.77

30.

40 7.54

30.

75

Vinho do

Porto dopado 4.58

13.

28 6.59

14.

53

32.6

0

14.

89

6.1

1

15.

93 4.44

17.

75

43.4

2

18.

63 0.00

0.

00 1.43

20.

61 1.30

22.

97 1.94

25.

30 7.49

26.

04 0.00

0.

00 1.76

30.

20 7.53

30.

55

Vinho do

Porto dopado 4.58

13.

38 6.55

14.

65

32.6

2

15.

00

6.0

3

16.

05 4.46

17.

90

43.6

6

18.

78 0.00

0.

00 1.29

20.

75 1.23

23.

06 2.10

25.

33 6.13

26.

05 0.00

0.

00 1.76

30.

22 7.54

30.

56

Media 4.57 13.

31 6.60

14.

58

32.6

4

14.

93

6.0

6

15.

98 4.48

17.

82

43.6

8

18.

70 0.00

0.

00 1.31

20.

70 1.27

23.

06 2.03

25.

40 6.50

26.

15 0.00

0.

00 1.77

30.

29 7.55

30.

64

s 0.02 0.0

9 0.08

0.0

9 0.07

0.0

9

0.0

3

0.1

0 0.02

0.1

1 0.11

0.1

1 0.00

0.

00 0.04

0.1

2 0.04

0.1

1 0.06

0.1

0 0.65

0.1

0 0.00

0.

00 0.01

0.0

8 0.03

0.0

8

n 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

r 0.05 0.2

6 0.22

0.2

6 0.19

0.2

6

0.0

8

0.2

7 0.07

0.3

0 0.30

0.3

1 0.00

0.

00 0.12

0.3

2 0.11

0.3

0 0.16

0.2

8 1.82

0.2

9 0.00

0.

00 0.02

0.2

3 0.07

0.2

3

CV% 0.39 0.6

9 1.16

0.6

5 0.21

0.6

3

0.4

8

0.6

0 0.55

0.6

0 0.24

0.5

9 0.00

0.

00 3.28

0.5

6 3.05

0.4

6 2.81

0.4

0 9.99

0.3

9

0.00 0.

00 0.50

0.2

7 0.34

0.2

6



Anexo 8 – Concentração (Conc.), em mg/l, e respetivo tempo de retenção (TR), em min., das antocianinas encontradas na amostra de vinho tinto do Porto, usada para avaliação

da repetibilidade, o qual de injetou 10 vezes (n) e, representação das respetivas médias (Media), desvio-padrão (s), coeficiente de correlação (r) e coeficiente de variância (%CV).

Df-

3-gl

Cy-3-

samb

Cy-

3-gl

Pt-

3-gl

Pn-

3-gl

Mv-

3-gl

Df-3-

acgl

Vitis

in A

Pt-3-

acgl

Pn-3-

acgl

Mv-3-

acgl

Pt-6-

cougl

Pn-6-

cougl

Mv-6-

cougl

Con

c TR Conc TR

Con

c TR

Con

c TR

Con

c TR

Con

c TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc TR

2018-0933-P-CR

(Vintage 2016)

7.6

6

13.

55 1.46

14.

63 9.18

14.

84

12.

07

16.

26

14.0

7

18.

10

121.

21

18.

98 1.89

20.

14

11.1

8

21.

00 2.19

23.

36 4.28

25.

67 23.58

26.

41 1.71

28.

49 3.72

30.

46 21.11

30.

81

2018-0933-P-CR 7.8

1

13.

40 1.48

14.

48 9.15

14.

71

12.

18

16.

18

14.1

4

18.

05

121.

40

18.

96 2.44

20.

13

11.8

5

21.

01 2.16

23.

38 4.31

25.

71 23.60

26.

45 1.72

28.

54 3.98

30.

50 22.65

30.

85

2018-0933-P-CR 7.6

5

13.

59 1.49

14.

66 9.19

14.

88

12.

19

16.

29

14.0

9

18.

13

121.

23

19.

01 2.15

20.

17

11.8

5

21.

03 2.22

23.

39 4.30

25.

72 23.56

26.

45 1.75

28.

54 3.94

30.

50 22.58

30.

84

2018-0933-P-CR 7.6

6

13.

52 1.49

14.

60 9.18

14.

82

12.

13

16.

23

14.0

7

18.

06

121.

22

18.

95 2.10

20.

11

11.8

8

20.

97 2.19

23.

33 4.28

25.

65 23.52

26.

34 1.72

28.

47 3.89

30.

43 22.48

30.

78

2018-0933-P-CR 8.0

3

13.

52 1.48

14.

58 9.19

14.

79

12.

14

16.

19

14.0

3

18.

02

121.

09

18.

90 2.12

20.

06

11.8

3

20.

92 2.20

23.

27 4.27

25.

59 23.53

26.

32 1.74

28.

42 3.91

30.

39 22.47

30.

74

2018-0933-P-CR 7.6

8

13.

50 1.50

14.

56 9.14

14.

77

12.

15

16.

19

14.0

4

18.

03

121.

01

18.

91 1.96

20.

07

11.8

4

20.

94 2.19

23.

29 4.31

25.

62 23.52

26.

36 1.73

28.

46 3.90

30.

43 22.48

30.

78



2018-0933-P-CR 7.6

1

13.

63 1.51

14.

69 9.22

14.

90

12.

11

16.

31

14.0

4

18.

15

120.

96

19.

03 2.13

20.

18

11.9

4

21.

04 2.21

23.

38 4.30

25.

71 23.50

26.

44 1.72

28.

50 3.91

30.

43 22.51

30.

78

2018-0933-P-CR 7.6

5

13.

48 1.51

14.

56 9.19

14.

77

12.

09

16.

19

14.0

2

18.

04

121.

05

18.

92 2.43

20.

07

11.9

0

20.

93 2.13

23.

28 4.27

25.

61 23.50

26.

34 1.71

28.

43 3.86

30.

40 22.38

30.

75

2018-0933-P-CR 7.6

2

13.

45 1.48

14.

54 9.19

14.

76

12.

12

16.

18

14.0

3

18.

02

121.

00

18.

91 2.10

20.

06

11.8

7

20.

92 2.18

23.

26 4.27

25.

58 23.48

26.

31 1.74

28.

40 3.88

30.

37 22.43

30.

72

2018-0933-P-CR 7.6

3

13.

42 1.49

14.

50 9.16

14.

71

12.

12

16.

13

14.0

1

17.

96

120.

75

18.

85 2.37

20.

00

12.0

6

20.

86 2.18

23.

21 4.54

25.

54 23.45

26.

27 1.71

28.

38 3.87

30.

36 22.43

30.

71

2018-0933-P-CR 7.5

9

13.

46 1.52

14.

52 9.19

14.

74

12.

14

16.

14

14.0

1

17.

96

120.

63

18.

84 2.11

19.

99

12.0

3

20.

85 2.25

23.

20 4.27

25.

51 23.43

26.

25 1.69

28.

36 3.88

30.

35 22.38

30.

69

2018-0933-P-CR 7.6

0

13.

48 1.50

14.

54 9.16

14.

75

12.

09

16.

15

14.0

3

17.

97

120.

64

18.

85 2.42

20.

00

12.0

5

20.

86 2.18

23.

21 4.28

25.

54 23.43

26.

28 1.71

28.

38 3.86

30.

37 22.35

30.

72

Media 7.6

8

13.

50 1.49

14.

57 9.18

14.

79

12.

13

16.

20

14.0

5

18.

04

121.

01

18.

93 2.18

20.

08

11.8

6

20.

94 2.19

23.

30 4.31

25.

62 23.51

26.

35 1.72

28.

45 3.88

30.

42 22.35

30.

76

s 0.1

2

0.0

7 0.02

0.0

6 0.02

0.0

6

0.0

4

0.0

6 0.04

0.0

6 0.24

0.0

6 0.19

0.0

7 0.23

0.0

7 0.03

0.0

7 0.08

0.0

7 0.05

0.0

7 0.02

0.0

6 0.06

0.0

5 0.40

0.0

5

n 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12



r 0.3

5

0.1

9 0.05

0.1

8 0.06

0.1

7

0.1

0

0.1

6 0.11

0.1

7 0.68

0.1

8 0.52

0.1

8 0.64

0.1

9 0.08

0.2

0 0.21

0.2

0 0.15

0.2

0 0.05

0.1

7 0.17

0.1

4 1.12

0.1

4

CV% 1.6

1

0.5

0 1.10

0.4

4 0.22

0.4

2

0.3

0

0.3

5 0.28

0.3

4 0.20

0.3

4 8.54

0.3

3 1.93

0.3

2 1.37

0.3

0 1.75

0.2

8 0.23

0.2

7 0.95

0.2

2 1.57

0.1

7 1.79

0.1

6



Anexo 9 – Concentração (Conc.), em mg/l, e respetivo tempo de retenção (TR), em min., das antocianinas encontradas na amostra de vinho tinto do Porto, usada para avaliação

da repetibilidade, o qual de injetou 10 vezes (n) e, representação das respetivas médias (Media), desvio-padrão (s), coeficiente de correlação (r) e coeficiente de variância (%CV).

Df-

3-gl

Cy-3-

samb

Cy-

3-gl

Pt-

3-gl

Pn-

3-gl

Mv-

3-gl

Df-3-

acgl

Viti

sin

A

Pt-3-

acgl

Pn-3-

acgl

Mv-3-

acgl

Pt-6-

cougl

Pn-6-

cougl

Mv-6-

cougl

Con

c TR Conc TR

Con

c

T

R

Con

c TR

Con

c TR Conc TR Conc

T

R

Con

c TR Conc

T

R Conc

T

R Conc TR Conc

T

R Conc

T

R Conc TR

2018-

1159-P-R 1.93

13.

66 3.79

14.

97 0.00

0.

00 2.82

16.

40 1.47

18.

24

18.6

4

19.

15 0.00

0.

00 1.17

21.

20 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.90

26.

57 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.49

30.

88

2018-

1159-P-R 1.91

13.

47 3.53

14.

74 0.00

0.

00 2.83

16.

17 1.47

18.

02

18.5

5

18.

94 0.00

0.

00 1.16

21.

01 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.85

26.

46 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.49

30.

86

2018-

1159-P-R 1.89

13.

55 3.51

14.

82 0.00

0.

00 2.78

16.

25 1.45

18.

10

18.3

8

19.

01 0.00

0.

00 1.17

21.

05 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.83

26.

47 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.42

30.

87

2018-

1159-P-R 1.89

13.

54 3.72

14.

81 0.00

0.

00 2.79

16.

23 1.46

18.

08

18.3

4

18.

99 0.00

0.

00 1.16

21.

05 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.82

26.

48 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.44

30.

88

2018-

1159-P-R 1.89

13.

50 3.71

14.

76 0.00

0.

00 2.78

16.

17 1.48

18.

03

18.3

4

18.

94 0.00

0.

00 1.16

20.

99 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.80

26.

46 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.42

30.

87



2018-

1159-P-R 1.89

13.

49 3.71

14.

77 0.00

0.

00 2.78

16.

17 1.46

18.

02

18.3

1

18.

93 0.00

0.

00 1.14

20.

98 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.79

26.

46 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.42

30.

87

2018-

1159-P-R 1.88

13.

54 3.71

14.

81 0.00

0.

00 2.77

16.

22 1.47

18.

05

18.3

1

18.

95 0.00

0.

00 1.17

21.

00 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.79

26.

48 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.39

30.

90

2018-

1159-P-R 1.88

13.

52 3.69

14.

76 0.00

0.

00 2.77

16.

16 1.46

17.

97

18.2

4

18.

87 0.00

0.

00 1.14

20.

88 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.79

26.

29 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.37

30.

75

2018-

1159-P-R 2.07

13.

60 3.68

14.

85 0.00

0.

00 2.76

16.

24 1.40

18.

07

18.1

0

18.

97 0.00

0.

00 1.13

20.

02 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.87

26.

38 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.31

30.

76

2018-

1159-P-R 1.85

13.

54 3.69

14.

80 0.00

0.

00 2.74

16.

20 1.42

18.

03

18.1

3

18.

93 0.00

0.

00 1.16

20.

98 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.82

26.

40 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.29

30.

82

2018-

1159-P-R 1.87

13.

56 3.67

14.

82 0.00

0.

00 2.76

16.

22 1.43

18.

05

18.1

2

18.

95 0.00

0.

00 1.17

20.

99 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.80

26.

41 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.29

30.

85

2018-

1159-P-R 1.86

13.

61 3.69

14.

86 0.00

0.

00 2.75

16.

25 1.43

18.

07

18.0

7

18.

97 0.00

0.

00 1.17

21.

00 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.78

26.

43 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.28

30.

88

Media 1.90 13.

55 3.67

14.

81 0.00

0.

00 2.78

16.

22 1.45

18.

06

18.2

9

18.

97 0.00

0.

00 1.16

20.

93 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.82

26.

44 0.00

0.

00 0.00

0.

00 2.38

30.

85



s 0.06 0.0

5 0.08

0.0

6 0.00

0.

00 0.03

0.0

6 0.02

0.0

7 0.18

0.0

7 0.00

0.

00 0.01

0.2

9 0.00

0.

00 0.00

0.

00 0.04

0.0

7 0.00

0.

00 0.00

0.

00 0.08

0.0

5

n 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12

r 0.16 0.1

5 0.22

0.1

7 0.00

0.

00 0.07

0.1

8 0.07

0.1

8 0.50

0.1

9 0.00

0.

00 0.04

0.8

2 0.00

0.

00 0.00

0.

00 0.11

0.1

9 0.00

0.

00 0.00

0.

00 0.22

0.1

4

CV% 3.04 0.3

9 2.13

0.4

1 0.00

0.

00 0.93

0.4

0 1.70

0.3

7 0.98

0.3

6 0.00

0.

00 1.21

1.4

1 0.00

0.

00 0.00

0.

00 1.35

0.2

6 0.00

0.

00 0.00

0.

00 3.23

0.1

6



Anexo 10 – Concentração (Conc.), em mg/l, e respetivo tempo de retenção (TR), em min., das antocianinas encontradas na amostra de vinho tinto do Douro, usada para


Df-

3-gl

Cy-3-

samb

Cy-

3-gl

Pt-

3-gl

Pn-

3-gl

Mv-

3-gl

Df-3-

acgl

Vitisi

n A

Pt-3-

acgl

Pn-3-

acgl

Mv-3-

acgl

Pt-6-

cougl

Pn-6-

cougl

Mv-6-

cougl

Con

c TR Conc

T

R

Con

c

T

R

Con

c TR

Con

c TR

Con

c TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc TR Conc

T

R Conc TR Conc TR

2018-

1532-D-R 6.80

13.

40 0.00

0.

00 0.00

0.

00 9.13

16.

03 4.53

17.

83

65.7

9

18.

69 1.85

19.

85 2.39

20.

69 2.00

23.

02 2.47

25.

35 13.82

26.

09 0.00

0.

00 1.20

30.

22 6.41

30.

58

2018-

1532-D-R 6.89

13.

30 0.00

0.

00 0.00

0.

00 9.16

15.

95 4.55

17.

76

65.1

6

18.

63 1.84

19.

79 2.42

20.

64 2.07

22.

95 2.46

25.

28 13.78

26.

01 0.00

0.

00 1.24

30.

17 6.45

30.

53

2018-

1532-D-R 6.95

13.

35 0.00

0.

00 0.00

0.

00 9.42

15.

98 4.97

17.

78

65.3

4

18.

65 1.83

19.

81 2.46

20.

65 2.23

22.

98 2.39

25.

31 13.69

26.

04 0.00

0.

00 1.31

30.

18 7.05

30.

54

2018-

1532-D-R 6.88

13.

35 0.00

0.

00 0.00

0.

00 9.34

15.

98 4.97

17.

77

64.8

8

18.

65 1.86

19.

82 2.45

20.

66 2.30

23.

00 2.42

25.

32 16.07

26.

06 0.00

0.

00 1.29

30.

20 7.27

30.

55

2018-

1532-D-R 6.88

13.

42 0.00

0.

00 0.00

0.

00 9.29

16.

10 4.60

17.

96

64.7

1

18.

87 1.84

20.

08 2.44

20.

93 2.18

23.

32 2.41

25.

65 16.04

26.

38 0.00

0.

00 1.30

30.

44 7.34

30.

79

2018-

1532-D-R 6.87

13.

55 0.00

0.

00 0.00

0.

00 9.25

16.

22 4.89

18.

06

64.8

0

18.

94 1.83

20.

12 2.47

20.

95 2.19

23.

33 2.41

25.

68 15.98

26.

42 0.00

0.

00 1.30

30.

49 7.31

30.

84



2018-

1532-D-R 6.84

13.

64 0.00

0.

00 0.00

0.

00 9.04

16.

37 4.92

18.

16

64.6

2

19.

03 1.84

20.

16 2.43

20.

98 2.23

23.

27 2.38

25.

57 15.97

26.

29 0.00

0.

00 1.29

30.

35 7.27

30.

70

2018-

1532-D-R 6.87

13.

40 0.00

0.

00 0.00

0.

00 9.00

16.

18 4.78

18.

05

64.6

6

18.

99 1.78

20.

29 2.81

21.

21 2.22

23.

54 2.37

25.

80 15.93

26.

51 0.00

0.

00 1.28

30.

45 7.22

30.

79

2018-

1532-D-R 6.86

13.

42 0.00

0.

00 0.00

0.

00 9.23

16.

04 4.67

17.

82

64.4

8

18.

69 1.85

19.

83 2.44

20.

65 2.19

22.

94 2.36

25.

26 15.89

25.

99 0.00

0.

00 1.29

30.

20 7.26

30.

58

2018-

1532-D-R 6.81

13.

48 0.00

0.

00 0.00

0.

00 9.19

16.

12 4.88

17.

94

64.4

7

18.

82 1.82

19.

99 2.44

20.

82 2.13

23.

17 2.37

25.

50 15.90

26.

24 0.00

0.

00 1.29

30.

40 7.20

30.

69

2018-

1532-D-R 6.78

13.

48 0.00

0.

00 0.00

0.

00 8.95

16.

15 4.92

17.

97

64.3

9

18.

86 1.82

20.

03 2.39

20.

86 2.20

23.

21 2.35

25.

54 15.88

26.

28 0.00

0.

00 1.30

30.

38 7.23

30.

73

2018-

1532-D-R 6.81

13.

50 0.00

0.

00 0.00

0.

00 9.18

16.

17 4.93

18.

00

64.3

4

18.

89 1.85

20.

05 2.45

20.

89 2.15

23.

24 2.36

25.

57 15.83

26.

31 0.00

0.

00 1.30

30.

40 7.22

30.

76

Media 6.85 13.

44 0.00

0.

00 0.00

0.

00 9.18

16.

11 4.80

17.

92

64.8

0

18.

81 1.83

19.

98 2.47

20.

83 2.17

23.

16 2.40

25.

48 15.40

26.

22 0.00

0.

00 1.28

30.

32 7.10

30.

67

s 0.05 0.0

9 0.00

0.

00 0.00

0.

00 0.14

0.1

2 0.17

0.1

3 0.43

0.1

4 0.02

0.1

6 0.11

0.1

8 0.08

0.1

9 0.04

0.1

8 0.99

0.1

7 0.00

0.

00 0.03

0.1

2 0.32

0.1

1

n 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12



r 0.13 0.2

7 0.00

0.

00 0.00

0.

00 0.39

0.3

4 0.47

0.3

7 1.21

0.4

0 0.06

0.4

6 0.31

0.4

9 0.22

0.5

2 0.11

0.5

0 2.77

0.4

9 0.00

0.

00 0.09

0.3

4 0.90

0.3

1

CV% 0.69 0.7

1

0.00 0.

00 0.00 0.

00 1.51 0.7

6 3.50

0.7

4 0.67

0.7

5 1.21

0.8

2 4.54

0.8

5 3.63

0.8

0 1.57

0.7

0 6.43

0.6

7

0.00 0.

00 2.51 0.3

9 4.53

0.3

6



Anexo 11 – Concentração, em mg/l, de todas as antocianinas detetadas na totalidade de injeções feitas ao longo do método “SAMB4”.



1

2

34

1 2 3

4

1

2

3

4

1 23

4 5

6

7 8

9 10

11

12

14

13

5

6

78

9 10

11

12

14

13

5

6

7

8

9 10 11 14

12

5

6

7

8

9 10

11

12 13

14



1

2

34

1 2

34

1 2

34

1 2 3

4

2 3 4

5

6

8 10 11

12 14

5

6

7

8

9 10

11

12 13

14

5

6

7

8

9 10

11

12 13

14

5

6

7 8

9 10 11

12 13

14

5

6

7

8

11 14



Anexo 12 – Cromatogramas das restantes amostras de vinho tinto do Porto, nas quais foram detetadas


1 2 34 5

3

6

3

1

1 3

4

5

6

7

1 2 34 5

6

7

7

8

9 10 11

12

8 10 11 12

14 13

1 2 3

4 5

6

7

8

9 10

11

12 13

14

13

14

8

9 10 11

12 13 14



9 10 11

12 1314

5

6

7 8 9 10 11

12 13

14

1 24

35

6

7 8 9 10 11

12

14

13

1 32

45

6

7 8 9 10

11

12

14 13

1 2 3

4

1

3

4 5

6

7 8 9 10 11

12 1314

2

1

3

4 5

6

7 2



Anexo 13 - Cromatogramas das restantes amostras de vinho tinto do Douro, nas quais foram detetadas


Legenda geral:

1 – Df-3-gl;

2 – Cy-3-samb;

3 – Cy-3-g;

4 – Pt-3-gl;

8 – Vitisin A;

9 – Pt-3-acgl;

10 – Pn-3-acgl;

11 – Mv-3-acgl;

4

5

6

8 9 10 14

32

1 11

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