R-Biopharm AG

An der neuen Bergstraße 17

64297 Darmstadt, Germany

info@r-biopharm.de

www.r-biopharm.com

Controlo da Qualidade em

Vinhos

Alergéneos em Vinhos

CVRVV

Porto, 23/02/2011

A R-Biopharm

Empresa alemã produtora de testes de análise e diagnóstico

Presente em Portugal na área alimentar através da Ambifood

Sede em Darmstadt

Gama de produtos

– Constituintes

– Resíduos

– GMO

– BSE / Animal ID

– Microbiologia / Higiene

– Alergéneos

A Ambifood

Fundada em 2001

Áreas Alimentar, Ambiental, Industrial

Fornecedora de métodos de análise e diagnóstico

Equipamentos

Missão

– Contribuir para a competitividade do tecido empresarial nacional

ALERGENEOS

1. Introdução

“O que é alimento para alguns,

pode ser veneno para outros”

Titus Lucretius Carus

(99-55 B.C.) Poeta Romano e autor de

“De Rerum Natura” (On the Nature of the Universe)

Reacções Adversas aos Alimentos

Reacção Adversa Reacção Tóxica

Reacção Psicossomática Reacção Não-Tóxica

Imunológica

Alergia Alimentar

Não-Imunológica

Intolerancia Alimentar

IgE induced

not IgE induced

enzymopathy

not defined

pharmacological

Bruijnzeel-Koomen C. et al., Allergy 59: 623, 1995

Alergia Alimentar

alergeneos, presentes nos alimentos causam reacções

adversas no sistema imunitário das pessoas alérgicas

Quase todos os alergeneos são proteinas

As reacções alérgicas são causadas pela presença de

anticorpos IgE

Acredita-se que cerca de 25% das pessoas possam

apresentar uma reacção alérgica a algum alimento

Apenas 2-3% duma reacção alérgica real consegue ser

provada

Maiores alergéneos

Crianças Adultos

Leite 70%

Ovos 40%

Amendoim 5%

Trigo 4%

Amendoim 23%

Peixe, marisco 10%

Leite 7%

Ovo 4%

Source: Weißbuch „Allergien in Deutschland“

(Allergies in Germany)

>90% alergias causadas pelo ” Big 8”

Amendoim

Leite

Ovos

Peixe

Crustáceos

Nozes

Soja

Cereais

Portugal

Leite, Peixe, Ovos, Cereais

5 a 10% população

Source: Sociedade Portuguesa de Alergrologia e Imunologia Clinica

União Europeia

13/2000/EC : rotulagem alimentar

89/2003/EC : rotulagem dos alergeneos

2005/26/EC: alergeneos isentos de rotulagem

2007/68/EC: alteração da lista do 2005/26/EC

1266/2010: rotulagem de vinhos, Junho 2012

2. Legislação Rotulagem

Austrália

Food Standard 1.2.3.

SO2, Caseínas e sais K, Ovo, Leite e Frutos Secos

Canadá

Healt Canada a partir de 4/08/12

Cola de peixe, Ovo, Leite, Caseína

Australia

(The Code 2000)

Canada

(Health Canada 2008)

China

(Food & Environ-mental

Hygiene Dept. 2005)

EU

(EU directives 2000-2007)

Japan

(Ministry of Health 2001) **

South Africa

(Foodstuffs, Cosmetics &

Disinfectants Act 1972)

United States

(FALCPA 2004)

Gluten (Cereals) X X X X X X X

Crustacean X X X X X X

Molluscs X X

Egg X X X X X X X

Fish X X X X X X

Shellfish X

Peanut X X X X X X X

Soybean X X X X X X

Milk X X X X X X X

Tree nuts * X X X X X X

Sulfites X X X

Sesame X X X

Celery X

Mustard X X

Lupine X

Buckwheat X

* Almond, brazil nut, cashew, hazelnut, macadamia, queensland nut, pecan, pine nuts, pistachios, walnut

** Abalone, squid, salmon roe, shrimp/prawn, oranges, crab, kiwifruit, beef, tree nuts, salmon, mackerel, soybeans, chicken (poultry),

pork, mushrooms, peaches, yams, apples and gelatin

3. Testes de análise em Vinhos

Enzimáticos

– Sulfitos, Cobre, Ferro,Tartárico

– Açucares …. Álcoois … Ácidos

Contaminantes

– OTA

Alergéneos

– Ovo

– Leite

– Lisosima

– Gluten

– Histamina

Outros

– Brettanomyces

3. Testes de determinação de Alergéneos

PCR

ELISA

Lat. Flow Tests

quantitative, suited for automation

semiquantitative, qualitative

qualitative

ELISA RIDASCREEN® / RIDASCREEN®FAST

Dip Stick RIDA®QUICK / BIOAVID

PCR GEN-IAL / SureFood®

Enzimatico Boehringer/Roche ou Enzytec

FUNDAMENTOS do MÉTODO

Anticorpos

proteinas, que pertencem ao grupo das globulinas

(imunoglobulinas, Ig)

Existem em todos os animais

Presentes no sangue, outros fluidos (saliva, etc.) e em

muitos tecidos.

Altamente especificas na detecção de estruturas

definidas nos antigeneos com terminações Fab.

Quase todas as moléculas podem actuar como antigeneo

Há 2 tipo de anticorpos usados:

- monoclonal e policlonal.

Anticorpos

Como detectar as suas reacções?

Os anticorpos são muito pequenos para serem vistos

Nem as suas reacções com os antigeneos podem ser vistas

Desenvolveram-se métodos para visualizar a reacção

precipitação

Marcação radioactiva

Marcação fluorescente

Marcação por enzimas

Marcação por enzimas

Anticorpos podem acoplar-se a enzimas

(ex. Glucoseoxidase, Fosfatase Alcalina, Peroxidase, etc.)

estas enzimas podem catalizar a reacção originando um

produto colorido

método:

Imunohistologia

EIA – Ensaio Imuno Enzimático

EIA

EIA – ENSAIO IMUNO ENZIMÁTICO

Sistema onde a reacção anticorpo/antigeneo é

visualizada pela mudança de cor, promovida por uam

enzima acoplada ao anticorpo ou ao antigeneo.

a cor pode ser desenvolvida como uma cor soluvel

numa fase liquida (microplaca EIA) ou um precipitado

insoluvel numa superficie (fase solida EIA) ou num

tecido (imunohistoquimica)

A tecnologia EIA é usada para detecção/determinação

de antigeneos e anticorpos

A detecção pode ser: sandwich EIA ou

competitivo EIA

Sandwich

ELISA

Competitive

ELISA

Principio do método

Sandwich ELISA

Sandwich

ELISA

Sandwich ELISA

Sandwich ELISA Sandwich ELISA

Após a adição do padrão ou

da amostra ocorre a ligação

anticorpo-analito. Um

segundo anticorpo marcado,

especifico para a

determinação, é adicionado e

também se liga ao analito,

formando uma ligação tipo

“sandwich”. Depois adiciona-

se o substrato que reage com

a enzima originando uma

coloração, que é

directamente proporcional à

concentração do analito.

A gama RIDASCREEN® FAST

A1 mL vinho + 19 mL sol. extração quente

RIDASCREEN® FAST – procedimento (I)

1

2

3 Filtrar ou centrifugar

Mix vortex

Procedimento ELISA

Colocar os poços no suporte 1/amostra

RIDASCREEN® FAST – procedimento (II)

4

5 Adicionar 100 µL de cada padrão ou

amostra por poço

Procedimento ELISA

Lavar e bater vigorosamente

contra papel absorvente

RIDASCREEN® FAST Assays – procedimento (III)

Incubar10 min e limpar os

poços

Adiconar 250 µL sol lavagem

(3x)

6

7

8

Procedimento ELISA

Adicionar 100 µL conjugado

RIDASCREEN® FAST – procedimento (IV)

Diluir o conjugado

Incubar 10 min ambiente

9

10

11

Procedimento ELISA

Lavar (3 x),

Adicionar 100 µL substrato-/cromogéneo

RIDASCREEN® FAST – procedimento (V)

Incubar 10 min no escuro ambiente

Adicionar 100 µL stop solution

13

14

12

Procedimento ELISA

Medir a absorvância @ 450 nm.

Usar RIDASOFT Win para cálculo resultados

OD

RIDASCREEN® FAST – procedimento (VI)

15

Procedimento ELISA

RIDA WIN

Testes Kits

LOD (ppm)

LOQ (ppm)

Critérios OIV* (ppm)

LOD LOQ

RIDASCREEN® FAST

Casein

0,24 0,5 <0,5 ≥1

RIDASCREEN®FAST

Lysosime

0,02 0,05 <0,5 ≥1

RIDASCREEN® FAST

Ei/Egg Protein

0,27 0,5 <0,5 ≥1

RIDASCREEN® Gliadin –

AOAC OM

1,5 2,5 Outros: Recuperações 80 / 105%

Sem interferentes

*Resolução OIV/OENO 427/210

Aplicação RIDASCREEN® FAST Ei/Egg (I)

2 amostras vinho tinto (Pinot noir and St. Laurent) clarificadas com ovo em pó.

Medição do teor em ovo ao longo de diferentes etapas:

Am. J. Enol. Vitic. 62:3 (2011)

VALIDAÇÕES

Aplicação RIDASCREEN® FAST Ei/Egg (II)

Amostras de vinhos alemães e italianos recolhidos no mercado.

Uma amostra de vinho italiano continha a concentração de 1.7 mg/kg ovo.

N=10

Am. J. Enol. Vitic. 62:3 (2011)

Standard OD

(450 nm) Egg concn

(mg/L)

Calibrator 1 0.101 0.0

Calibrator 2 0.421 0.5

Calibrator 3 0.544 1.5

VALIDAÇÕES

Validação RIDASCREEN® FAST Ei/Egg

Differentes materiais (extrato clara de ovo, ovo em pó (NIST) clara ovo em pó adicionadas a

vinho tinto

Recuperações entre 76 – 110%

VALIDAÇÕES

Validação RIDASCREEN® FAST Casein

Diferentes materiais como leite em pó e UHT foram adicionados a vinho tinto.

Recuperações entre 78 – 117%

VALIDAÇÕES

Validação RIDASCREEN® FAST Casein

Caseina dissolvida em PBS-buffer contendo urea e adicionada a vinho tinto.

Recuperações entre 100 – 102%

A caseina adicionada diretamente ao vinho precipita, logo as recuperações serão mais

baixas.

VALIDAÇÕES

Validação RIDASCREEN® FAST Lysozym (I)

Adicionada a vinho branco e tinto lisozima liofilizada Sigma

(L6876).

Recuperações entre 100 – 120%

VALIDAÇÕES

Validação RIDASCREEN® FAST Lysozym (II)

Usadas duas preparações comerciais em vinho tinto e branco

1.) LALLZYME™ Lyso-easy (Lallemand)

• solução pronta a usar

• 22% solução, sem aditivos, estável @ TA / 6 meses

• especifica para gram-positivo (LAB)

• usada em várias etapas (no mosto para reduzir as LAB e no final da

fermentação alcoólica fermentação malolática).

2.) BactiCare (Erbslöh)

• produzida a partir da clara do ovo

Validação RIDASCREEN® FAST Lysozym (II)

Resultados:

Recuperações entre 83 – 119%

EIL FAPAS

EIL 2791, Jun/Jul 2011, Ovo em bolo

EIL FAPAS

EIL 2789, Abr 2011, Caseína em baby-food

EIL FAPAS

EIL 2799, Nov 2011, Glúten, Caseína e Ovo em bolo

Conclusão

Estamos convictos que os testes da gama RIDASCREEN® para a

determinação de

• caseina

• ovo

• lisosima

São métodos robustos e confiáveis para determinar concentrações

residuais de agentes de tratamento do vinho

Saúde! ... e obrigado pela vossa

atenção.