Extração do DNA da cebola (Alliun cepa)

OBJETIVOSConhecer os princípios básicos da extração do material genético da cebola, a partir dos tecidos do bulbo.

INTRODUÇÃOPara a análise do DNA de células eucarióticas, a primeira etapa importante é o seuisolamento. O procedimento a seguir é utilizado para extrair grandes quantidades de DNA a partir de cebola. Protocolos similares são usados nas extrações de DNA de outras fontes, como amostras de sangue, tecidos, etc.A extração de DNA de células eucariontes consta fundamentalmente de três etapas:

ruptura (física e química) das membranas celulares para liberação do material genético;

desmembramento dos cromossomos em seus componentes básicos: DNA e proteínas;

separação do DNA dos demais componentes celulares.

MATERIAIS Álcool isopropílico (Isopropanol) Cebola picada Solução de lise (quebra): 4 colheres de sopa de detergente incolor (SDS –

Dodecil Sulfato de Sódio), 1 colher de chá de cloreto de sódio, 75 mL de água. Papel de filtro Gelo 2 béqueres pequenos de plástico (50 mL) e 1 béquer de 500 ou 1000 mL Funil Tubos de ensaio Bastão de vidro ou de madeira (para maceração) Estilete ou faca de cozinha Banho-maria (50-60 ºC) Palitos de sorvete

PROCEDIMENTOS1. Pique a cebola em pedaços pequenos ou rale;2. Coloque no béquer pequeno de plástico (50 ml) 4 colheres de chá de pedaços

de cebola;3. Adicione 2 colheres de sopa de solução de lise;4. Macere intensamente com o auxílio do bastão de madeira;5. Complete com a solução de lise até 25 mL no béquer, misturando a solução;6. Coloque no banho-maria por 15 minutos;7. Em seguida, coloque o tubo no béquer com gelo e água, durante 5 minutos;8. Coe a solução, com o auxílio do funil e do papel de filtro; coloque o filtrado em

um tubo de ensaio (dica: suspenda o papel de filtro para facilitar o escoamento da solução);

9. Decorrido este tempo, adicione um volume igual de isopropanol (gelado) ao do tubo e misture vagarosamente (por inversão). O que ocorreu?

Questões

Qual a função do sal? O sal proporciona um ambiente favorável para o processo de extração pois contribui com íons positivos (NA+) que neutralizam a carga negativa do DNA

O que o liqüidificador faz? O liqüidificador ajuda a quebrar mecanicamente as membranas da célula

O que acontece quando se adiciona o detergente? As enzimas presentes no detergente desestruturam as moléculas de lipídios presentes nas membranas celulares

Qual o papel do álcool? O DNA é insolúvel em álcool e deste modo se separa da solução. O DNA tem também menor densidade que os outros constituintes celulares, por isso surge na superfície da solução

Por que você não pode ver a dupla hélice? A estrutura de dupla hélice só pode ser visualizada de modo indireto e através de aparelhos sofisticados. O que você está observando são milhares de fitas de DNA juntas