UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE

UNIDADE ACADÊMICA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

DAIANE BIFF

CORRELAÇÃO DOS MARCADORES INFLAMATÓRIOS DE FASE

AGUDA COM A ALTERAÇÃO COGNITIVA A LONGO PRAZO

CRICIÚMA, FEVEREIRO DE 2010

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DAIANE BIFF

CORRELAÇÃO DOS MARCADORES INFLAMATÓRIOS DE FASE

AGUDA COM A ALTERAÇÃO COGNITIVA A LONGO PRAZO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Felipe Dal Pizzol

CRICIÚMA, FEVEREIRO DE 2010.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por ter me dado forças para superar os desafios que encontrei e

chegar até aqui.

Agradeço aos meus pais pelo incentivo, carinho e por acreditar sempre que eu

conseguiria. Obrigada pelas noites sem dormir, pelos “extras” no orçamento, pela

força e reconhecimento.

Agradeço ao meu companheiro que esteve do meu lado, com apoio e força que

sempre precisei, nunca me deixando desamparada nos momentos mais difíceis.

Obrigada pela alegria, palavras de conforto e ânimo e, principalmente, por todo amor

dedicado.

Agradeço aos meus irmãos pelo incentivo e apoio de sempre, em quaisquer

situações.

Agradeço de coração ao meu orientador Professor Dr Felipe Dal Pizzol que me

ajudou muito com a bolsa de estudos da CAPES /PROCAD, sem ela eu não

conseguiria concluir o mestrado. Agradeço ainda pela amizade, pelos sustos e pelas

pesquisas que tanto me acrescentaram no âmbito pessoal e profissional.

Agradeço ao laboratório de Fisiopatologia, onde passei boa parte dos meus dias

estudando, trabalhando. Obrigada às pessoas que nele se encontram, pelos braços

sempre abertos a me receber com carinho.

Agradeço aos meus amigos e colegas de mestrado, pude conhecer pessoas que

mostraram o verdadeiro valor da palavra amizade.

Agradeço à minha amiga Giselli Scaini que sempre esteve do meu lado me ajudando

com os compromissos do mestrado e, principalmente foi meu ombro direito na fase

final desta dissertação.

Dedico esta dissertação aos meus pais e

meu noivo pela paciência e incentivo de

sempre. Sem o apoio deles eu não teria

conseguido.

RESUMO

A sepse é uma síndrome complexa caracterizada por um desequilíbrio entre a resposta pró-inflamatória e anti-inflamatória ao patógeno. Ela deve ser entendida como um processo, já que ela pode derivar de múltiplas causas e envolvem múltiplos processos. A ocorrência e a evolução da clínica estão diretamente ligadas à resposta imune. A inflamação é uma resposta tecidual à agressão a despeito da natureza do agente causador. Inicia de maneira localizada, desencadeada por uma série de processos inflamatórios considerados fisiológicos, ou seja, uma resposta tecidual protetora do organismo ao agente agressor. Nesta cascata, as moléculas desencadeantes estimulam a liberação de mediadores primários como o TNF-α (fator de necrose tumoral alfa) e interleucina-1 (IL-1). Nos doentes sépticos, encontram-se com frequência níveis elevados de mediadores pró-inflamatórios como o TNF-α e a IL-1, assim como níveis elevados de citocinas essencialmente anti-inflamatórias, como a Interleucina 10. Esses biomarcadores podem se tornar aliados como indicadores de processos biológicos normais, processo patogênico, ou resposta farmacológica a uma intervenção terapêutica. Além deles, os níveis de estresse oxidativo tem importantes mecanismos envolvidos na fisiopatologia da sepse. A geração maciça de espécies reativas de oxigênio (ROS) durante a sepse compromete funções como a sobrevivência da célula. Todos esses mecanismos estão envolvidos na fisiopatologia da encefalopatia séptica que parece ser multifatorial, como sugerido por alguns estudos. Estas pesquisas propõem que os organismos infectantes ou suas toxinas não são os responsáveis diretos pela encefalopatia, mas sim a inflamação sistêmica resultante da infecção. Vários estudos têm demonstrado que os sobreviventes de sepse apresentam comprometimento cognitivo a longo prazo, incluindo as alterações de memória, atenção, concentração e/ou perda da função cognitiva global. Desse modo, verificamos neste trabalho a correlação dos marcadores inflamatórios de fase aguda e de estresse oxidativo, como o TNF-α e a Interleucina 1 e 10 com os níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), respectivamente, com a memória a longo prazo. Nossos resultados comprovaram o dano cognitivo a longo prazo em ratos com indução de sepse. Também demonstraram que os níveis de TNF-α e TBARS elevaram-se consideravelmente nos ratos que tiveram a indução de sepse, quando comparados ao controle. Demonstraram dentro do grupo CLP, que os ratos que tiveram melhor desempenho no teste de esquiva inibitória tiveram alta concentração de TNF-α e TBARS logo nas 6 horas após a indução. Puderam mostrar que os ratos que tiveram maior inflamação e maior índice de estresse oxidativo obtiveram melhor desempenho de memória a longo prazo. Desse modo, pode-se entender que o estresse e a inflamação aumentada fisiologicamente na sepse significa um sinal de preparo do organismo para combater com mais eficiência o patógeno, levando a uma melhor adaptação celular.

Palavra Chave: sepse; biomarcadores; alteração cognitiva.

ABSTRACT

Sepsis is a complex syndrome characterized by an imbalance between pro-inflammatory and anti-inflammatory responses to the pathogen. It must be understood as a process, since it can derive from multiple causes and involve multiple processes. The clinical occurrence and evolution are directly linked to immune response. Inflammation is a tissue response to aggression, regardless of the nature of the causing agent. It starts in a localized way, triggered by a series of physiological inflammatory processes, i.e., an organism’s protective tissue response to the attacker agent. In this cascade, triggering molecules stimulate the release of primary mediators like TNF-α (tumor necrosis factor alpha) and interleukin-1 (IL-1). In septic patients, high levels of pro-inflammatory mediators such as TNF-α and IL-1 are often found, as well as high levels of essentially anti-inflammatory cytokines, such as interleukin 10. These biomarkers may be used as indicators of normal biological processes, pathogenic processes, or pharmacological response to therapeutic intervention. Besides them, the oxidative stress levels and its mechanisms are involved in the pathophysiology of sepsis. The massive reactive oxygen species’ (ROS) generation during sepsis undertakes functions such as cell survival. All these mechanisms are involved in the pathophysiology of septic encephalopathy, which seems to be multifactorial, as suggested by some studies. These researches propose that the infecting organisms or their toxins are not directly responsible for the encephalopathy, but the inflammation resulting from infection is linked to the disease. Several studies have shown that sepsis’ survivors have long-term cognitive impairment, including memory, attention, and concentration changes; and / or global cognitive function loss. Thus, this study found a correlation between acute phase inflammatory markers, such as TNF-α and Interleukin 1 and 10, and the oxidative stress with the levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS), respectively, with the long-term memory. Our results confirm the long-term cognitive impairment in rats with induced sepsis. They also showed that TNF-α and TBARS levels increased considerably in mice that had the induction of sepsis, when compared to control. In the CLP group, the results demonstrate that mice with a better performance in inhibitory avoidance test had higher concentrations of TNF-α and TBARS in the first 6 hours after induction. This study also shows that mice with greater inflammation and increased oxidative stress levels had a better performance of long-term memory. Therefore, it’s possible to understand that the oxidative stress and the physiologically increased inflammation in sepsis is due to the preparation of the body to effectively combat the pathogen, leading to better cellular adaptation.

Key words: sepsis; biomarkers; cognitive impairment.

LISTA DE ABREVIATURAS

BASES – Brazilian sepsis epidemiological study

BBB – Barreira hemato-encefálica

C5a – Fator do sistema complemento 5a

CAT – Catalase

DC – Células Dendríticas

EROs – Espécies Reativas de Oxigênio

LBP – Proteínas ligantes ao Lipopolissacarídeo

LPS – Lipopolissacarídeo

IL-1 – Interleucina 1

IL-2 – Interleucina 2

IL-4 – Interleucina 4

IL-6 – Interleucina 6

IL-8 – Interleucina 8

IL-10 – Interleucina 10

NFkB – do ingles nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (fator

nuclear kappa B)

NK – Natural Killer

PAF – Fator de ativação plaquetária

PCR – Proteína C Reativa

RLO – Radicais Livres derivados do Oxigênio

SIRS - Systemic Inflamatory Response Syndrome

SOD – Superóxido dismutase

SPSS – Statistical Package for the Social Sciences

TBARS – Espécies Reativas ao ácido Tiobarbitúrico

TLRs – Toll Like Receptors

TNF-α – Fator de Necrose tumoral

UTI – Unidade de terapia intensiva

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 09

1.1 Conceitos Fundamentais .................................................................................... 09

1.2 Fisiopatologia da Sepse ..................................................................................... 11

1.3 Biomarcadores Inflamatórios de Sepse .............................................................. 14

1.4 TNF-α ................................................................................................................. 15

1.5 Interleucina-1 ...................................................................................................... 17

1.6 Interleucina-10 .................................................................................................... 18

1.7 Sepse e Estresse Oxidativo ................................................................................ 20

1.8 Sepse e Sistema Nervoso Central ...................................................................... 21

1.9 Modelo animal de sepse ..................................................................................... 24

2 OBJETIVOS .......................................................................................................... 26

2.1 Objetivo Geral ..................................................................................................... 26

2.2 Objetivos Específicos ......................................................................................... 26

3 METODOLOGIA .................................................................................................... 27

3.1 Animais Experimentais ....................................................................................... 27

3.2. Modelo animal de CLP ...................................................................................... 27

3.3 Teste de Esquiva Inibitória ................................................................................. 29

3.4 Determinação de Citocina(IL-1 e IL-10) e TNF-α em líquor ................................ 31

3.5 Medida de substâncias reativas ao ácido tiobartúrico (TBARS) ......................... 31

3.6 Analise Estatística .............................................................................................. 31

4 RESULTADOS ...................................................................................................... 32

5 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 41

6 REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 48

9

1 INTRODUÇÃO

1.1 Conceitos Fundamentais

A sepse é uma doença caracterizada por infecção grave associada a reação

inflamatória sistêmica (Vandijck et al., 2006). É uma desregulação da expressão

gênica com acentuação da resposta sistêmica à agressão caracterizada por vários e

complexos mecanismos envolvendo mediadores inflamatórios, alterações nos

sistemas de coagulação, da anticoagulação e da fibrinólise. Esses mecanismos

levam à hipoperfusão tissular, à morte celular, à síndrome de múltipla disfunção

orgânica e morte do paciente (David & Neto, 2007). Além disso, a sepse é uma

síndrome complexa caracterizada por um desequilíbrio entre a resposta pró-

inflamatória e anti-inflamatória ao patógeno (Hotchkiss & Karl, 2003).

As complicações da sepse são as causas mais frequentes de morbidade e

mortalidade em unidades de terapia intensiva (UTI), contribuindo para 750.000

casos por ano nos Estados Unidos, com uma média de mortalidade de 29%, cerca

de 215.000 mortes (Sands et al., 1997). Apesar dos inúmeros estudos realizados, a

incidência da sepse está aumentando continuamente e esta tendência

epidemiológica reflete o envelhecimento da população e o aumento do número de

pacientes cronicamente doentes. Uma resistência crescente dos agentes infecciosos

que causam a sepse também possui um papel importante no processo (O’Brien,

2007).

Recentemente, vários estudos têm demonstrado que os sobreviventes de

sepse apresentam comprometimento cognitivo a longo prazo, incluindo as

alterações de memória, atenção, concentração e/ou perda da função cognitiva

10

global. No entanto, a patogênese e história natural da encefalopatia séptica e

disfunção cognitiva, ainda são pouco conhecidos e uma maior compreensão destes

processos é necessário para o desenvolvimento de intervenções eficazes de

preventivas e terapêuticas (Streck et al., 2008).

No Brasil, apesar de ainda não existirem estimativas precisas, a elevada

frequência de sepse pode ser observada em um estudo epidemiológico denominado

BASES (do inglês Brazilian Sepsis Epidemiological Study). Este estudo foi sendo

desenvolvido entre maio de 2001 e janeiro de 2002, trata-se de um estudo

prospectivo, de coorte que avaliou todos os pacientes internados em UTIs,

independente de sua patologia. As incidências de sepse grave e choque séptico nos

centros considerados foram de 27% e 23%, respectivamente, e a taxa de letalidade

global foi de 22% (Silva et al., 2004), sendo de 47% para sepse grave e de 52% para

choque séptico.

Com o intuito de aumentar a precisão e a rapidez do seu diagnóstico, em

1991 foi realizada a Conferência de Consenso de Sepse, a qual elaborou novas

definições e critérios diagnósticos sobre a sepse. A síndrome da resposta

inflamatória sistêmica (do inglês Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS)

foi definida como a resposta do organismo a um insulto variado (trauma, pancreatite,

infecção sistêmica), com a presença de pelo menos 2 dos critérios abaixo:

1. Febre, temperatura corporal maior que 38ºC ou hipotermia, temperatura

corporal menor que 36ºC;

2. Taquicardia – frequência cardíaca maior que 90 bpm;

3. Taquipnéia – frequência respiratória maior que20 rpm ou PaCO2 menor que

32 mmHg;

11

4. Leucocitose ou leucopenia – Leucócitos acima de 12.000 cels/mm3 ou <

4.000 cels/mm3, ou presença de mais de 10% de formas jovens (bastões) (Matos &

Victorino, 2007).

Estudos mais aprofundados estão identificando uma melhor relação entre os

mediadores da cascata imunológica com o mecanismo da fisiopatologia da sepse.

Como esta rede de mediadores ainda não está completamente esclarecida, buscar

formas de conhecer melhor a ação desses biomarcadores pode nos mostrar um

diagrama aproximado dos primeiros eventos bioquímicos que conduzem à sepse.

1.2 Fisiopatologia da Sepse

A sepse deve ser entendida como um processo, já que ela pode derivar de

múltiplas causas e encerrar em si mesmo múltiplas ações. Na sua abordagem mais

atual, a sepse compreende, no seu desenvolvimento, uma resposta inflamatória

aguda sistêmica a partir de um foco de infecção (David & Neto, 2007).

A inflamação é uma resposta tecidual à agressão a despeito da natureza do

agente agressor. Inicia de maneira localizada, desencadeada por uma série de

processos inflamatórios “considerados fisiológicos”, ou seja, uma resposta tecidual

protetora do organismo ao agente agressor. Dessa forma, acredita-se que o início e

a progressão da sepse se devem a uma “desregulação” da resposta normal, com

uma maciça e descontrolada ativação de células inflamatórias, resultando em uma

anarquia metabólica, na qual “o próprio organismo não consegue controlar o que ele

próprio criou” (Bone, 1991).

12

Um dos componentes principais que envolvem a fisiopatologia da sepse é a

exacerbada ativação da resposta imune inata. O papel central do sistema imune

inato durante a síndrome da resposta inflamatória sistêmica e a sepse é

documentado pelo aumento dos fatores pró-inflamatórios após a infecção (Wong et

al., 1996; Wong et al., 1997; Williams et al., 2000; Mastronardi et al., 2000;

Mastronardi et al., 2001; Mastronardi et al., 2005), com consequente aumento de

citocinas pró-inflamatórias tais como o IL-1 e o TNF-α para o sistema nervoso

central (Takala et al., 2002). Como a maioria dos estudos envolvendo sepse

focalizou órgãos periféricos como citados previamente, a participação do cérebro

durante este processo ainda não está muito clara.

A ocorrência e a evolução da clínica estão diretamente ligadas à resposta

imune. Logo, genes envolvidos na resposta imune inata, respondem a uma

sequência de eventos desencadeados pela infecção, como: os receptores Toll (do

inglês Toll-like Receptors, TLRs), que funcionam como um sistema de monitorização

da presença de moléculas associadas à patógenos; as proteínas ligantes ao

Lipopolissacarideo (LPS), como a LBP e CD-14; fatores de coagulação; citocinas pró

e antiinflamatórias e quimiocinas.

Um dos processos mais importantes da ativação das vias desencadeadas na

sepse, hoje conhecidos, é a ativação da resposta imune mediada por citocinas pró e

antiinflamatórias (IL-1, IL-10 e TNF-α) que regulam a intensidade e a duração da

resposta imune, exercendo vários efeitos sobre linfócitos e outras populações

celulares do sistema imune (David & Neto, 2007).

Nesta cascata, as moléculas desencadeantes estimulam a liberação de

mediadores primários como o TNF-α (fator de necrose tumoral), interleucina-1 (IL-1),

13

complemento 5a (C5a), que induzem a resposta imune celular e humoral com

ativação de mediadores secundários como citocinas, proteínas do sistema

complemento, prostanóides, fator ativador plaquetário (PAF), espécies reativas de

oxigênio (EROs), ativando também leucócitos, ou seja, os macrófagos e monócitos,

produzindo sequencialmente, TNF-α, IL-1, interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8),

estas citocinas agem em outras células ou elementos sanguíneos, através da

ligação a seus receptores de superfície, induzindo a produção e liberação de

mediadores. Após a liberação de TNF-α, IL-1 e PAF, o ácido araquidônico é

metabolizado, formando os leucotrienos, tromboxano A2 e prostaglandinas (Bozza et

al., 2005).

A IL-1 e IL-6 ativam as células T, que passam a produzir interferon γ,

interleucina-2 (IL-2) e interleucina-4 (IL-4), contribuindo assim para uma resposta

inflamatória tardia. Estes mediadores são os responsáveis pela reativação das

células fagocitárias e da cascata inflamatória resultando em um ciclo vicioso

inflamatório que induz a vasodilatação, o aumento da permeabilidade com

vazamento dos componentes do plasma e o extravasamento, e ativação de

leucócitos. Além disso, os mediadores ativam também o sistema de coagulação

levando a uma coagulação intravascular disseminada, sendo que a junção destes

efeitos provoca a hipoperfusão e a hipóxia tissular que levam ao choque e a

síndrome da disfunção de múltiplos órgãos (Bozza et al., 2005).

Estas citocinas agem em outras células ou elementos sanguíneos

(polimorfonucleares, células endoteliais, fibroblastos, plaquetas e nos próprios

monócitos) através da ligação a seus receptores de superfície, induzindo a produção

e liberação de mediadores, contribuindo para uma resposta inflamatória tardia

14

(Bone, 1991; Parrilo, 1993; European Society of Intensive Care Medicine, 1994; Thijs

et al., 1995).

A IL-1 e IL-6 ativam as células T a produzir interferon-γ, IL-2 e IL-4 (Moldawer,

1994; Lowry, 1993; Fong et al., 1990). Quase todos estes agentes agem diretamente

no endotélio vascular (Fong et al., 1990; Bone, 1991; Lowry, 1993).

Deve ser feita uma distinção entre os efeitos locais das citocinas (efeitos

parácrinos) e as consequências de seus altos níveis na circulação sistêmica (Fong

et al., 1990; Lowry, 1993). Os efeitos locais envolvem o recrutamento de células

fagocitárias, essencial para a eliminação dos microorganismos, enquanto que os

efeitos sistêmicos causam danos ao hospedeiro. Isto é particularmente verdadeiro

para o anti-TNF-α, que parece ser o mediador chave no choque séptico (Fong et al.,

1990; Bone, 1991; Lowry, 1993).

1.3 Biomarcadores inflamatórios da sepse

Um biomarcador é definido como “uma característica que é objetivamente

medida ou avaliada como um indicador de processo biológico normal, processo

patogênico, ou resposta farmacológica a uma intervenção terapêutica (Ventetuolo &

Levy, 2001). Atualmente a utilização dos biomarcadores inflamatórios vem

auxiliando no diagnóstico precoce da sepse.

Nos doentes sépticos, encontram-se com frequência níveis elevados de

mediadores pró-inflamatórios como o TNF-α e a IL-1, assim como níveis elevados

de citocinas essencialmente anti-inflamatórias, como a IL-6 e a IL-10 (Póvoa, 2000).

Idealmente, um biomarcador útil deve ser preciso e disponível, melhorar a avaliação

15

clínica e auxiliar na tomada de decisões para o cuidado do paciente (Ventetuolo &

Levy, 2001).

Grande parte da atenção tem sido desviada para o TNF-α. Porém, este

mediador inflamatório não é exclusivo da sepse, sendo encontrado em pacientes

com outras patologias. No entanto, parece ser o mediador que mais reflete à

resposta imune (Bone, 1991; Réa Neto, 1996).

Como parece não haver um mediador central que explique a origem da

sepse, podemos considerar que há uma interação específica entre dois ou mais

mediadores que desencadeiam o estímulo inicial. A complexidade desta cascata

torna difícil a elucidação exata de quais os efeitos que podem ser atribuídos a cada

mediador, pois muitos têm efeitos sinérgicos (Bone, 1991; Moldawer, 1994). Após a

ação do TNF-α inicia-se a elevação da Interleucina-1 (IL-1) e Interleucina-6 (IL-6).

Juntos, TNF, IL-1 e IL-6 induzem a liberação de proteínas de fase aguda,

particularmente a PCR (proteína C reativa), e a IL-6 também atua inibindo a

liberação de TNF-α e IL-1, num mecanismo de feedback negativo que impede,

juntamente com as interleucinas antiinflamatórias, a perpetuação da resposta imuno-

inflamatória (Girardini et al, 1993).

Há alguns anos vêm-se tentando utilizar as citocinas como marcadores

precoces de sepse. O TNF-α e IL-1, IL-10 estão sendo considerados candidatos

promissores num diagnóstico mais preciso e eficaz.

1.4 TNF-αααα

16

O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória que representa uma das mais

importantes linhas de defesa contra patógenos (especialmente intracelulares), pois

induz a formação de granulomas, além de exercer ações quimiotáticas sobre

neutrófilos (David & Neto, 2007).

O TNF-α é um quimiotático para monócitos e neutrófilos, induzindo a

fagocitose e a aderência dessas células ao endotélio, o que leva à geração de

radicais livres derivados do oxigênio (RLO). Na parede endotelial ele é responsável

por aumentar a permeabilidade vascular e a expressão de moléculas de adesão

(Kilpatrick & Harris, 1998). O TNF-α também estimulará a liberação de outras

interleucinas e citocinas quimiotáticas, que ampliarão a resposta inflamatória.

Algumas citocinas inflamatórias são mediadores liberados

predominantemente pelos monócitos e linfócitos (Salles et al., 1999). O

lipolossacarídeo (LPS) é um dos maiores indutores de produção de TNF-α, razão

pela qual tal citocina vem sendo constantemente discutida como um dos mais

importantes mediadores do choque séptico. Aparentemente essa resposta precoce

de instabilidade hemodinâmica é devida à excessiva e precoce liberação de TNF-α,

o qual é liberado minutos após a exposição ao antígeno, porém seus níveis séricos

podem tornar-se indetectáveis após 3 a 4 horas do início do processo infeccioso.

Além disso, o TNF-α também é responsável pela liberação de IL-10 (Bont et al.,

1994).

O TNF-α não é o único mediador que pode reproduzir os sintomas da sepse.

A administração de baixas doses de IL-1 ou PAF (Fator de Ativação Plaquetária)

também induzem a um estado de sepse (Bone, 1991).

17

Atuando sinergicamente, o TNF-α e IL-1 estimulam a liberação de IL6, a qual

se dá principalmente pelos macrófagos, fibroblastos e células endoteliais. Uma de

suas ações seria a indução da diferenciação dos linfócitos B em anticorpos

específicos, além de atuar de maneira semelhante ao TNF-α e IL-1, aumentando a

proliferação de timócitos (Reyes et al., 2003).

1.5 Interleucina-1

Originalmente descrito como a molécula endógena da febre, a interleucina (IL-

1_, um polipeptídeo não estrutural) é uma citocina pró-inflamatória, com a

capacidade de induzir a expressão de uma ampla gama de genes normalmente não

expresso. Por exemplo, a IL-1 aumenta a expressão de quase todas as outras

citocinas, como o TNF-α e a IL-6, além das quimiocinas e/ou as moléculas de

adesão. Além disso, IL-1 aumenta a expressão de diferentes proteases de tecido e

metaloproteases de matriz e inibe a síntese de proteoglicanos. Ao contrário do TNF-

α, a IL-1 é um estimulante da medula óssea que aumenta o número de células

progenitoras mielóide e promove a liberação de neutrófilos, resultando em neutrofilia

(Dinarello, 2005).

A participação da IL-1, na fisiopatologia da sepse foi bem demonstrada pela

observação de que um antagonista do receptor para essa citocina (IL-1ra) reduziu a

letalidade causada pela administração de endotoxina (Ohlsson et al., 1990) ou E.

Coli (Wakabayashi et al., 1991), em coelhos. Além disso, a IL-1, quando

administrada I.V. em humanos, mimetiza sintomas verificados em pacientes com

18

choque séptico, como a hipotensão, febre e outros. Também foi demonstrado que

camundongos deficientes na produção da enzima conversora da IL-1β (responsável

pela clivagem da pró-IL-1β em IL-1β madura) não produzem essa citocina após

estimulação com LPS e são resistentes ao choque séptico (Li et al., 1995). Nos

estudos de sepse, em humanos, o aumento dos níveis plasmáticos de TNF-α e IL-1β

foi correlacionado com o grau de severidade da doença, detectando-se níveis mais

elevados nos casos fatais (Gardlund et al., 1995). Cabe ressaltar que a IL-1β e o

TNF-α estimulam a liberação sistêmica de IL-6 e IL-8, amplificando, desse modo, a

resposta inflamatória (Dinarello, 1997).

1.6 Interleucina-10

A interleucina 10 (IL-10) é uma citocina antiinflamatória que inibe a síntese de

vários mediadores inflamatórios normalmente secretados por monócitos/macrófagos

ativados, como: IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α (Mocellin et al., 2001).

A principal função biológica da IL-10 parece ser exercida sobre as DCs

(células dendítricas) e macrófagos. Ela é um potente inibidor da apresentação de

antígenos, pois inibe o principal complexo de histo-compatibilidade, bem como a

regulação positiva de moléculas de co-estimulação CD80 e CD86. O outro efeito

significante da IL-10 é a inibição da produção de citocinas e mediadores pró-

inflamatórios, como os macrófagos e as células dendríticas. As principais citocinas

inflamatórias, IL-1, IL-6, IL-12 e fator de necrose tumoral (TNF), são reprimidas

drasticamente à exposição de IL-10. Ela pode ainda inibir a inflamação, aumentando

19

a liberação do antagonista do receptor de IL-1 de macrófagos (Akdis & Blaser,

2001).

É importante ressaltar também que nem todas as bioatividades da IL-10

resultam na supressão de respostas imunes. A IL-10 estimula a ativação de células

B e contribui para a mudança de classe de células B. Ela também pode coestimular

as células Natural killer (NK) e a produção de citocinas inflamatórias (Cai et al.,

1999). A IL-10 também pode funcionar como um fator de crescimento para estimular

a proliferação de determinados subgrupos de células T CD8 + (Groux et al., 1998;

Rowbottom et al., 1999; Santin et al., 2000). Essas atividades estimulantes de IL-10

parecem ser dose dependente, explicando o excesso de produção de citocinas

inflamatórias em humanos tratados com altas doses de IL-10 (Laux et al., 2000).

Estudos recentes demonstram que o aumento na apoptose de linfócitos T

contribui para indução da mortalidade na sepse. Além disso, estudos evidenciam

que a apoptose de linfócitos acontece, em parte, pela alta regulação da expressão

de Bcl-2 (B-cell lymphoma 2, família que genes regulam a permeabilidade da

membrana externa da mitocôndria) diminuindo a ativação da morte celular

programada (Tschoeke et al., 2008).

Como afirma um grupo Alemão Oberholzer (2001), a expressão tímica de IL-

10 humana por meio de terapia genética pode levar a uma alta regulação da

proteína anti-apoptótica Bcl-2 em alguns órgãos. Consequentemente, os animais

sépticos sem a expressão de IL-10 humana demonstraram diminuição significativa

da apoptose de linfócitos do timo, com melhoria do resultado (Tschoeke et al., 2008).

Foi mostrado previamente que a administração intratímicas de IL-10 com um

vetor adenoviral em camundongos “selvagem” melhora significativamente o

20

resultado de sepse. Assim, a expressão local de IL-10 no timo reduz a apoptose do

tecido local e ativação da caspase-3 e parece atenuar a resposta sistêmica de

citocinas pró-inflamatórias (Tschoeke et al., 2008).

1.7 Sepse e o extresse oxidativo

O estresse oxidativo é um dos vários e mais importantes mecanismos

envolvidos na fisiopatologia da sepse. A geração maciça de ROS durante a sepse

compromete as funções bem como a sobrevivência da célula, especificamente

agindo sobre a mitocôndria e alterando a fosforilação oxidativa por meio da inibição

dos complexos enzimáticos, gerando mais ROS e tendo como desfecho final a

diminuição da produção energética mitocondrial que por fim culmina com morte

celular (Clementi et al., 1998; Siami et al., 2008).

A resposta inflamatória determina a liberação de radicais livres de oxigênio,

os quais mantêm um ciclo vicioso de lesão-inflamação-ativação de fatores

nucleares. Nesse ponto, houveram muitos estudos a respeito do estresse oxidativo

na sepse. A sepse gera um estado de desequilíbrio entre a produção de oxidantes e

antioxidantes, gerando um excesso de radicais livres de oxigênio. Essas moléculas

têm a função de destruir o agente agressor, entretanto não são específicas e

acabam por determinar lesão também no hospedeiro (Macdonald & Webster 2003).

Basicamente o que se observa é um desequilíbrio entre a produção de ROS

(principalmente pelos complexos I e IV) e os agentes contra-reguladores

(antioxidantes fisiológicos), principalmente as enzimas catalase (CAT) e superóxido

dismutase (SOD) (Barichello et al., 2006), nas células de órgãos vitais (Crouser,

21

2004). Ritter et al. (2003) demonstraram que a atividade da CAT estava reduzida

durante a sepse, havendo mais acúmulo de ROS e por consequência maior dano. Já

foi demonstrado experimentalmente a existência de dano neuronal em algumas

regiões do cérebro de ratos causados por ROS, após indução de sepse por CLP.

Esses achados são de grande valor, pois ajudam a explicar a alteração da

consciência presente na encefalopatia séptica (Streck et al., 2008).

Estudos têm demonstrado que a disfunção orgânica está associada à hipóxia

citopática, mediada por radicais livres de oxigênio lesando a mitocôndria (Fink,

2002). Sabe-se que o dano orgânico secundário ao choque séptico está associado à

liberação de radicais livres de oxigênio. Mais ainda, o estado redox celular influencia

a ativação do fator nuclear κB (NFκB) que iniciará o processo imunoinflamatório

observado na sepse, com liberação de interleucinas e amplificação da resposta do

hospedeiro (Batra et al., 2000).

A resposta inflamatória gerada na sepse é mediada por fatores de transcrição

nuclear, destacando-se o NFκB. A ativação desse fator pode ocorrer via

reconhecimento de patógeno pelos receptores Toll-like na membrana celular ou por

alterações no estado redox celular. Tais flutuações no estado redox teriam a

capacidade de deflagrar uma resposta inflamatória no hospedeiro, via ativação de

fatores de transcrição nuclear. Nesse ponto, então, se tem uma situação na qual a

resposta determina liberação de radicais livres que continuará ativando fatores

nucleares e amplificará a resposta inflamatória (Vistos & Rocha Fuente, 2004).

1.8 Sepse e Sistema Nervoso Central

22

Vários estudos têm demonstrado que os sobreviventes da UTI apresentam

comprometimento de funções cognitivas em longo prazo, incluindo alterações de

memória, atenção, concentração e/ou perda da função cognitiva global (Angus et al.,

2001; Gordon et al., 2004; Granja et al., 2005). Estudos envolvendo modelos

animais de sepse em modelos murinos de ligação e perfuração cecal (CLP) são

clinicamente relevantes, uma vez que induzem uma sepse polimicrobiana que imita

a sepse humana (Ritter et al., 2004).

O termo dano cognitivo, tal como definido aqui se refere a anormalidades

clinicamente significativas em um ou mais funções do cérebro incluindo memória,

atenção, velocidade de processamento mental, função executiva, habilidades visuo-

espaciais e função intelectual. O prejuízo cognitivo pode ser leve, moderado ou

grave e pode limitar a capacidade do indivíduo de pensar, raciocinar e executar as

tarefas diárias (Streck et al., 2008).

Recíprocas interações entre o sistema imunológico e sistema nervoso central

(SNC) são considerados os principais componentes da resposta do hospedeiro em

estado de choque séptico. O cérebro é muitas vezes considerado um órgão

privilegiado, pois é anatomicamente isolado do sistema imunológico pela barreira

hemato-encefálica (BBB), carente de um sistema linfático e com baixa expressão de

antígenos do complexo histocompatibilidade em seu parênquima celular (Sharshar

et al., 2003).

O SNC controla uma grande variedade de funções fisiológicas que são

cruciais para manter a homeostase da resposta do hospedeiro em níveis

comportamentais, neuroendócrinos e níveis autonômicos. Alterações em qualquer

23

uma dessas funções adaptativas podem influenciar o curso de choque séptico.

(Sharshar et al., 2003).

Os efeitos biológicos causados pela liberação de citocinas se refletem no

SNC, como: febre, anorexia (Maier et al., 1998), e ativação do eixo hipotálamo-

pituitária-adrenal, tendo por resultado o aumento da produção dos corticóides

adrenais (Licínio & Wong, 1997). As interações recíprocas entre o sistema nervoso

central e o sistema imunológico são considerados como os componentes principais

da resposta inflamatória a sepse, o que acaba causando alterações nos sistemas

neuroendócrino, autonômico (Chrousos, 1995), comportamental (Gordon et al.,

2004) e distúrbios em quaisquer funções adaptáveis como as respostas

inflamatórias e hemodinâmicas no SNC (Saper & Breder, 1994; Sharshar et al.,

2003; Sharshar et al., 2004).

A fisiopatologia da encefalopatia séptica parece ser multifatorial, pois estudos

sugerem que os organismos infectantes ou as toxinas produzidas por eles não são

os responsáveis diretos pela encefalopatia, mas sim a inflamação sistêmica

resultante da infecção. A sequência de eventos que leva à inflamação sistêmica

inclui a ativação de leucócitos e liberação de mediadores inflamatórios. O cérebro

comporta-se de maneira diferente, pois a presença da barreira hemato-encefálica e

a diminuição da expressão de moléculas de adesão (VCAM-1 e ICAM-1) nesse

tecido impedem o acúmulo de leucócitos no mesmo. Apesar desse acúmulo não

ocorrer no cérebro, sabe-se que mediadores inflamatórios passam pela barreira

hemato-encefálica e provocam efeitos importantes nesse tecido. Estudos sugerem

que esses mediadores provocam alterações significativas nas células endoteliais

24

cerebrais, responsáveis pela integridade da barreira hemato-encefálica e pela

proteção e isolamento do cérebro (Papadopoulos et al., 2000).

Portanto, a inflamação sistêmica decorrente de um foco infeccioso ou outras

causas, parece ser a causa mais plausível da encefalopatia séptica (Deitch, 1998).

Endotoxinas ou outros produtos bacterianos ativam macrófagos e linfócitos, os quais

geram dano neuronal (Bardenheuer et al., 1999; Weigand et al., 1999; Bauer et al.,

2000). A ocorrência do dano oxidativo e produção aumentada de citocinas (IL-1; IL-

2; TNF-α) parecem ter sinaptotoxidade causando morte neuronal (Papadopoulos et

al., 2000).

Além disso, as células gliais, células com função de suporte e homeostase no

SNC e cuja ativação/desregulação pode levar à lesão e morte neuronal por diversos

mecanismos, parecem participar efetivamente do dano cerebral na sepse. Estudos

mostram que alterações nas funções dos astrócitos podem induzir morte neuronal

por diminuição da regulação de fluxo cerebral local, redução da atividade sináptica

causada por menor aporte de nutrientes aos neurônios e aumento da

permeabilidade da barreira hemato-encefálica (Papadopoulos et al., 2000).

1.9 Modelo animal de sepse

Realizar pesquisas experimentais de sepse em humanos são difíceis devido à

severidade da doença, a necessidade de intervenções terapêuticas imediatas e a

heterogeneidade dos pacientes. Devido a isso, modelos animais tornam-se opções

de estudos para explorar a patogênese e determinar dados pré-clínicos capazes de

propor intervenções terapêuticas corretas. Para estas propostas, deve-se utilizar um

25

modelo animal que reproduza as características da sepse: vasodilatação,

hipotensão, aumento do débito cardíaco, resposta ao tratamento e mortalidade

vistos em pacientes sépticos.

Alguns modelos animais de indução de sepse são muito utilizados, como a

sepse induzida pelo LPS ou por TNF-α que reproduz exemplo de sepse abdominal e

sepse cutânea. Desse modo, também os modelos que induzem peritonite são

bastante aceitos e utilizados.

Entretanto, o modelo mais aceito, conhecido hoje, e que parece reproduzir

mais adequadamente o quadro clínico de sepse, é o chamado CLP (cecal ligation

and perforation). O modelo de CLP tem contribuído para elucidar a patogênese e

determinar novas terapias em sepse (Ritter et al., 2004). Também tem sido

amplamente utilizados para explicar o comprometimento cognitivo dos sobreviventes

da sepse (Ritter et al., 2004). Este modelo refere-se a ligação do ceco logo abaixo

da válvula ileocecal (desta forma não obstruindo todo o trânsito intestinal) e

perfuração do ceco com agulha de tamanho padronizado e a liberação de conteúdo

fecal para a cavidade peritoneal, conforme classicamente descrito por Wichterman e

coleboradores em 1980.

Com isso, além de induzir a peritonite ocasiona uma isquemia mesentérica

simulando melhor as grandes síndromes clínicas de sepse abdominal.

Recentemente este modelo foi modificado para melhor simular as características

clínicas dos pacientes com sepse abdominal, incluindo desta maneira a

ressuscitação volêmica e o emprego de antibióticos de amplo espectro (Hollenberg

et al., 2001).

26

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar a correlação entre os marcadores inflamatórios de fase aguda e a

alteração cognitiva a longo prazo.

2.2 Objetivos Específicos

Avaliar os efeitos da sepse sobre os níveis de TNF-α, interleucinas 1 e 10 em

líquor na fase aguda da inflamação.

Correlacionar os resultados dos testes de memória à longo prazo com os

níveis de marcadores inflamatórios de fase aguda.

Avaliar os efeitos da sepse sobre os níveis de TBARS.

Correlacionar os resultados dos testes de memória à longo prazo com os

níveis de TBARS na fase aguda.

27

3 METODOLOGIA

Os experimentos foram feitos na Universidade do Extremo Sul Catarinense –

UNESC – nos laboratórios de Neurociências e de Fisiopatologia Experimental.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as

recomendações internacionais para o cuidado e o uso de animais de laboratório,

além das recomendações para o uso de animais da Sociedade Brasileira de

Neurociências e Comportamento (SBNeC).

3.1 Animais experimentais

Foram utilizados 80 ratos Wistar machos (60 dias) procedentes do Biotério da

UNESC. Os animais foram acondicionados em 5 animais por caixa, com ciclo claro -

escuro de 12 horas (07:00h às 19:00h) e comida e água ad libitum. O ambiente será

mantido a temperatura de 23 + 1º C. Todos os animais (ratos Wistar, adultos,

machos) randomizados participarão dos experimentos.

Os animais foram mortos por decapitação (guilhotina) e o descarte dos

mesmos será o acondicionamento em saco branco leitoso e, em seguida, serão

encaminhados para freezer (conservação) na universidade e após foram coletados e

transportados por empresa terceirizada.

3.2 Modelo Animal de CLP

28

Primeiramente os ratos foram divididos em dois grupos. O grupo Sham

(controle) e grupo Sepse. Todos os ratos foram anestesiados com Cetamina

(50mg/kg) injetados na parte intraperitoneal. Os animais foram submetidos a CLP

como previamente descritos (Fink & Heard, 1990) (figura 1). Primeiramente os ratos

foram submetidos a laparotomia abdominal (passo1). Os ratos tiveram o ceco

exposto (passo 2) e firmemente amarrados (não ocluindo totalmente a luz de

passagem da parede intestinal) com sutura de fio seda de 3.0mm, debaixo da

válvula de ileocecal (passo 3). O grupo sham terá o ceco apenas exposto e colocado

novamente dentro da cavidade peritoneal. O grupo sepse, antes de recolocado o

ceco de volta à cavidade peritoneal teve o ceco perfurado uma vez com uma agulha

de 14mm (passo 4). O ceco foi apertado suavemente para expulsar uma quantia

pequena de conteúdo fecal do local de perfuração e então devolvido na cavidade

peritoneal (passo 5), em seguida foi realizado o fechamento da incisão peritoneal

com fio de suturas de seda de 4.0.

Os animais foram hidratados com solução salina (50 mL/kg subcutâneo)

imediatamente e 12 h após realização de CLP (passo 6). Todos os animais foram

devolvidos às suas gaiolas com acesso livre para comida e água. O grupo sepse

recebereu a cada 6 horas durante 3 dias, antibioticoterapia com 30 mg/kg

ceftriaxone e 25 mg/kg clindamicina. O grupo sham recebereu solução salina

correspondente à quantidade de administração da antibioticoterapia.

29

Figura 1: Modelo animal de sepse.

3.3 Teste de esquiva inibitória

Este teste consegue avaliar a memória a longo prazo do animal. Ele foi

realizado 2 vezes, 30 dias após indução de sepse. Primeiramente como pré-teste e

24 horas após, realizado o teste.

O equipamento consiste em uma caixa de acrílico (50 x 25 x 25 cm) na qual o

piso é formado por barras paralelas de metal (1 mm de diâmetro). Os espaços entre

30

as barras medem 1 cm. Uma plataforma com 7 cm de largura e 2,5 cm de altura é

colocada junto à parede esquerda do aparelho (Quevedo et al., 1997; Roesler et al.,

2003; 2004).

Na sessão de treino os animais foram colocados sobre a plataforma e

determinou-se o tempo que o animal levava para descer com as quatro patas da

plataforma. Esse tempo é denominado latência. Imediatamente após descer da

plataforma (com as 4 patas), o animal recebeu um choque de 0,4 µA durante 2

segundos.

Na sessão de teste, o animal foi novamente colocado na plataforma e

determinou-se o tempo que o mesmo levava para descer da plataforma (latência),

porém não foi administrado choque. Sendo que após 180 segundos de latência os

ratos seriam retirados da caixa.

A latência é um parâmetro clássico de retenção de memória. Os intervalos

entre o treino e o teste foi de 24 horas para memória de longa duração (Izquierdo et

al., 1998; Quevedo et al., 1997; Roesler et al., 2003; 2004).

Figura 2: Plataforma teste de esquiva inibitória.

31

3.4 Determinação de citocinas (IL-1 e IL-10) e TNF-α no líquor

As concentrações de IL-1, IL-10 e TNF-α foram avaliadas 6 horas após a

indução da sepse. No tempo inicial (6 horas) o sangue foi coletado através de

punção da veia ocular. IL-1, IL-10 e TNF-α foram determinados pelo método imuno-

enzimático: Standard Sandwich Enzymelinked Immunosoberbent Assay (ELISA),

empregando kits comercias (R & D Systems, Minneapolis, MN).

3.5 Medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

Como indício de peroxidação lipídica e avaliação de dano oxidativo será

medida a concentração de TBARS tecidual durante uma reação ácida aquecida

como previamente descrito (Draper, 1990). Brevemente, as amostras obtidas (líquor)

serão misturadas com 1mL de ácido tricloroacético 10% e 1mL de ácido

tiobarbitúrico, fervidas por 15 minutos, e após a quantidade de TBARS será

determinada pela absorbância em 532 nm por espectrofotometria.

3.6 Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o programa SPSS (Statistical

Package for the Social Sciences) versão 17.0. Os dados serão expressos em forma

de média e desvio padrão e analisados pelo teste T Student com P<0,05

considerado estatisticamente significativo.

32

4 RESULTADOS

No presente estudo realizamos as dosagens de TNF-α, interleucinas 1 e 10 e

TBARS 6 horas após a realização de CLP como marcadores de inflamação e de

lipoperoxidação, relacionando tais concentrações com o cognição a longo prazo.

A avaliação de memória dos grupos, através do teste de esquiva inibitória,

comprova que há realmente déficit neurológico, como mostrado na figura 3. O grupo

Sham (controle) teve seu tempo de latência estatisticamente maior que os ratos

submetidos a CLP.

Figura 3: Tempo de latência do teste de esquiva inibitória em ratos submetidos ao modelo animal de sepse. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em segundos, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05. N= .

Foram avaliadas as concentrações de IL-1 e IL-10 em animais submetidos ao

modelo animal de sepse por CLP, as avaliações foram realizadas 6 horas após a

indução. Os animais do grupo CLP apresentaram um aumento significativo nos

33

níveis de IL-1 no líquor em comparação com o grupo sham (figuras 4 e 5,

respectivamente). Entretanto não foram encontradas diferenças significativas nos

níveis da IL-10 quando comparada ao grupo sham.

Figura 4: Concentração de IL-1 em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após). Com N=80. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM).

Figura 5: Concentração de IL-10 em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após). Com N = 80. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM).

34

Dentre o grupo CLP, selecionamos os 50% e 25% dos ratos que tiveram

melhor desempenho no teste de esquiva inibitória e correlacionamos com os níveis

de IL-1 e IL-10 (figuras 6, 7, 8 e 9, respectivamente). Não encontramos diferença

estatística nessas correlações.

Figura 6: Correlação dos níveis de IL-1 com o desempenho do teste de esquiva inibitória submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 50. Com N=. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas no grupo CLP).

35

Figura 7: Correlação dos níveis de IL-1 com o desempenho do teste de esquiva inibitória submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 75. Com N=. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas no grupo CLP).

Figura 8: Correlação dos níveis de IL-10 com o desempenho do teste de esquiva inibitória submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 50. Com N=. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas no grupo CLP).

36

Figura 9: Correlação dos níveis de IL-10 com o desempenho do teste de esquiva inibitória submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 75. Com N=. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas no grupo CLP).

Os níveis de TNF-α após em 6 horas da indução da sepse aumentaram

consideravelmente nos ratos submetidos a CLP quando comparados com o grupo

sham (figura 10).

37

Figura 10: Concentração de TNF-α em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após). Com N=80. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM).

Não encontramos correlação estatisticamente significativa ao compararmos

os níveis de TNF-α e TBARS com o desfecho dos animais submetidos a CLP

(figuras 11 e 12, respectivamente).

Figura 11: Correlação dos níveis de TNF-α em líquor 6 horas após indução modelo animal de sepse em ratos com o desfecho. * Com N=36. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL x10-3, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM).

38

Figura 12: Correlação dos níveis de TBARS em líquor 6 horas após indução modelo animal de sepse em ratos com o desfecho. * Com N=36. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL x10-3, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (em relação ao grupo SHAM)

Ao analisarmos os 50% dos ratos que tiveram melhor desempenho no teste

de esquiva inibitória e correlacionamos com os níveis de TNF-α coletados 6 horas

após indução de CLP, encontramos significativo aumento de TNF-α nos animais que

apresentaram melhor desempenho (figura 13).

39

Figura 13: Correlação dos níveis de TNF-α submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 50. * Com N=13. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em pg/mL x10-3, analisados pelo Teste T Studant considerado significante * p <0,05 (Apenas grupo CLP).

Verificou-se na figura 14 um aumento considerável nos níveis de TBARS nos

ratos submetidos ao modelo animal de sepse quando comparados ao grupo sham.

Figura 14: Lipoperoxidação em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após). Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em nmol de TBARS/mg de proteínas. * p < 0,05 (em relação ao grupo SHAM).

40

Observa-se que os níveis de TBARS dosados nos grupos com melhor e pior

desempenho no teste de esquiva inibitória estão aumentados nos ratos que

apresentaram um melhor desempenho quanto ao tempo de latência. Dentre os ratos

que apresentaram melhor desempenho do grupo sepse, selecionamos 25% dos

ratos que tiveram melhor desempenho, sendo que nestas avaliações observou-se

que os níveis de TBARS estão aumentados nos ratos que apresentaram um melhor

desempenho quanto ao tempo de latência (figura 15).

Figura 15: Lipoperoxidação em líquor de ratos submetidos ao modelo animal de sepse (6 horas após) Percentil 75. Os valores são apresentados em média ± DP e os resultados foram expressos em nmol de TBARS/mg de proteínas. * p < 0,05.

41

5 DISCUSSÃO

As incapacidades observadas neste estudo, como as alterações cognitivas,

são verificadas em sobreviventes de sepse, principalmente a incapacidade na

memória. Desta forma, o modelo de CLP pode ajudar a investigar os mecanismos

biológicos que estão associados com a incapacidade cognitiva, determinando

possíveis ações terapêuticas para esta situação. Estudos prévios em pacientes em

Unidade de Terapia Intensiva que apresentaram sepse constataram que estes

pacientes apresentam alguma incapacidade cognitiva na alta hospitalar (Hopkins et

al., 1999; Granja et. al, 2004). Apesar disso, os mecanismos envolvidos na

incapacidade cognitiva ainda não estão bem elucidados.

Nossos estudos demonstram que os animais sépticos submetidos ao teste de

esquiva inibitória apresentaram um tempo de latência menor quando comparados ao

controle. O teste de esquiva inibitória envolve vários estímulos, incluindo percepção

espacial e visual, sensibilidade a dor, acompanhados de um componente emocional

amplamente controlados por hormônios relacionados ao estresse (Gold, 1986).

Estes resultados indicam que o déficit de memória persiste após 30 dias da indução

de sepse. Essa persistência reforça a idéia que este modelo poderia ser uma

ferramenta importante no estudo das sequelas cognitivas em sobreviventes à sepse.

Barrichello e colaboradores (2006) demonstraram que 10 dias após a indução

de sepse por CLP, os ratos apresentaram diminuição da capacidade de memória

aversiva, mostrando que o grupo sepse necessita aproximadamente duas vezes

mais estímulos para alcançar o critério de aquisição de memória, quando comparado

com o grupo sham, comprovando, assim, a dificuldade na aprendizagem.

42

Semmler e colaboradores (2007) mostraram que ratos submetidos à sepse

pelo modelo LPS (injeções de lipopolissacarídeos) apresentaram após 3 meses,

alterações comportamentais, dano neuronal em sub-regiões hipocampais e redução

da inervação colinérgica em áreas corticais.

Em um modelo animal de sepse induzido por LPS, foram encontrados

mecanismos conhecidos de apoptose no hipocampo 24 horas após a indução,

sendo assim o mais severamente afetado de sepse (Semmler et al., 2005). As

incapacidades cognitivas parecem estar relacionadas diretamente aos processos

dependentes do hipocampo, danificando a memória (Squire e Zola-Morgan, 1991)

Similarmente, como indicou Semmler e colaboladores (2007) em estudo,

caracterizado por uma redução significativa na densidade dos neurônios na região

CA1/CA2 do hipocampo.

Como clinicamente quase nenhuma manifestação pode ser considerada

exclusiva da sepse, a utilização de outros marcadores inflamatórios torna-se

essencial. Muitas pesquisas sobre marcadores precoces de sepse vem acontecendo

há alguns anos e a utilização das interleucinas parece ser promissora.

Dentre os mediadores endógenos, liberados, primeiramente, pelas células

residentes e, posteriormente, pelas células recrutadas para o foco infeccioso, as

citocinas desempenham um papel primordial na resposta do hospedeiro. Citocinas

como a interleucina-1 (IL-1), o fator de necrose tumoral (TNF-α) e as demais

quimiocinas promovem o recrutamento de leucócitos para o sítio inflamatório, bem

como sua ativação com consequente aumento da atividade microbicida, sendo a

resposta local fundamental para o controle da infecção (Reyes et al., 2003).

43

A evolução de uma infecção localizada para um quadro sistêmico caracteriza-

se pela presença de citocinas pró-inflamatórias na circulação e ativação das células

circulantes, podendo, também, haver a presença de bactérias, endotoxinas ou

exotoxinas (Wei & Li & Li, 1995). Esse fato é responsável pela maioria das

alterações fisiopatológicas, observadas em um quadro clínico de sepse e em

modelos experimentais (Van Der Poll & Sauerwein, 1993).

Como demonstrado em nosso estudo, os níveis de TNF-α e IL-1 elevam-se

significativamente logo nas primeiras horas após a indução de sepse por CLP,

sugerindo que a resposta inflamatória ao agente infeccioso inicia-se imediatamente

após indução de sepse.

Esse aumento de dos níveis de TNF-α e IL-1 corroboram com achados de

outros autores (Girardin et al., 1993; Kilpatrick & Harris, 1998; Dollner et al., 2001;

Reyes et al., 2003).

Além desses dados, quando comparamos os níveis de TNF-α com o teste de

memória a longo prazo em ratos sobreviventes de sepse, podemos encontrar que

25% dos ratos que tiveram melhor desempenho, ou seja, maior tempo de latência,

tiveram seus níveis aumentados. Isto pode mostrar que os animais que tiveram

melhor desempenho a longo prazo, consequentemente, menos dano, foram aqueles

que tiveram maior inflamação inicial. Esta inflamação inicial (antes da sepse

realmente acontecer) funcionaria como uma organização antecipada do sistema

imunológico do organismo do animal. Assim, no momento da agressão pelo

patógeno, seu sistema imunológico estaria mais resistente ou mais preparado,

acarretando em uma defesa inicial importante na prevenção da lesão celular, o que

levaria a tornar-se um mecanismo de proteção celular.

44

Com aumento da inflamação logo no inicio da indução acontece então o

aumento da defesa imunológica de primeiro impacto do animal, ou seja, a

inflamação aumentada é importante apenas na fase inicial da sepse, pois na fase

tardia, o aumento significativo da inflamação acaba sendo outro problema no animal.

Diferentes mediadores da resposta inflamatória da sepse podem levar a

disfunção mitocondrial e esta, a liberação de espécies reativas de oxigênio. Foi

demonstrado que, o dano oxidativo avaliado pela técnica de TBARS ocorrem

precocemente no desenvolvimento do curso da sepse. Os níveis de TBARS foram

significativamente elevados no grupo CLP em relação ao grupo sham.

Em contraste, quando correlacionados apenas dentro do grupo CLP,

encontramos aumento dos níveis de TBARS nos animais que tiveram melhor

desempenho no teste de esquiva inibitória. Ou seja, os ratos sépticos que tiveram

maior tempo de latência no teste de memória a longo prazo, apresentaram maior

concentração de TBARS nas primeiras 6 horas após a indução de CLP.

Logo, o maior tempo de permanência dos ratos que tiveram indução de sepse

na plataforma relacionou-se ao acentuado nível do dano, o que pode levar a

explicação de que os ratos que apresentaram maior dano obtiveram maior

adaptação e melhor desempenho cognitivo.

Talvez esse mecanismo que envolva a proteção celular, não bem

compreendido ainda, seja o fator principal que leve esses ratos a terem um melhor

desempenho no teste de memória.

O que poderia explicar muitos desses acontecimentos seria a indução de

proteínas existentes no interior das células que são induzidas por tipos específicos

de estresse. Como por exemplo, as proteínas de choque térmico (HSP), também

45

chamadas de proteínas de estresse. Estas são induzidas por tipos específicos de

estresse como o calor. Um fato importante que explicaria o provável efeito de quanto

maior a inflamação no animal, melhor seu desempenho no teste de cognição é que

ao interagir com um intervalo de HSPs, a proteína é induzida a regular seu

funcionamento. Além disso, membros da família HSP tem sido reconhecidos por

terem efeitos citoprotetor (Weiss et al., 2002).

Dentro da família das HSP, existem algumas proteínas específicas que

desempenham um papel importante como citoprotetora, antiapoptótica, imunológica

e com efeitos de regulação, e é de longe a melhor estudada. O aumento da

expressão de HSP72 em modelos experimentais de acidente vascular cerebral,

sepse, síndrome do desconforto respiratório agudo, insuficiência renal e isquemia

miocárdica foi mostrado para reduzir lesões de órgãos e, em alguns casos, e

melhorar a sobrevida. O aparecimento do gene HSP está associado com melhores

resultados em ratos (Singleton & Wischmeyer, 2006).

Assim, aumento dos níveis de HSP pode indicar não só danos nos tecidos,

mas podem indicar também o sucesso de montagem de uma resposta ao estresse

que se correlaciona com proteção de tecido e melhor desfecho (Ganter et al., 2006).

As HSP foram mostradas para fornecer neuroproteção da isquemia cerebral

em animais com cultura celular em modelos de choque (Giffard & Yenari, 2004).

Também, trabalhos recentes tem demonstrado que elas também podem interferir

diretamente com a vias da morte celular, como apoptose e necrose e pode modular

a inflamação (Jaattela, 1999).

A morte celular programada ocorre por múltiplos caminhos (Leist & Jaattela,

2001). A apoptose ocorre principalmente por um da via intrínseca que responde ao

46

estresse e alterações intracelulares, esta se baseia sobre a liberação de moléculas

pró-apoptóticas mitocondriais, a abertura da permeabilidade mitocondrial dos poros

de transição, e ativação de caspases (Gogvadze & Orrenius, 2006).

O segundo bem descrito caminho é a via extrínseca, que é desencadeada

pela ativação de receptores de membrana plasmática que libera sinal através de

domínios de sua morte. Esta sinalização ativa a caspase-8 e pode prosseguir,

independentemente da via intrínseca, mas também pode levar a ativação da via

intrínsica (Kroemer & Martin, 2005).

Apesar de nossos estudos não terem sido correlacionados com os níveis

dessa proteína citoprotetora, ela pode ser a explicação de porque as altas

concentrações dos indicadores de inflamação e de dano oxidativo tiveram direta

relação com o melhor desempenho dos ratos no teste de esquiva inibitória. Talvez

em estudos futuros, seja necessário verificar a correlação desses níveis que se

apresentaram significantes com os níveis iniciais e tardios dessa proteína que

parece ser tão importante nesses animais.

Muitos estudos mostraram fenômenos neurobiológicos envolvidos no dano

cognitivo em sobreviventes da sepse, contudo falta um aprofundamento do

entendimento da fisiopatologia dessa doença e da relação dela com o déficit

cognitivo a curto e longo prazo.

Pode-se afirmar com clareza que os níveis inflamatórios e de danos

oxidativos iniciais nos ratos submetidos à sepse por CLP apresentam ótimos

resultados. Confirmando a teoria de que o organismo que mais concentradamente

responder (em fase inicial) ao agente agressor tem melhor adaptação e,

consequentemente, melhor resultado prognóstico.

47

Neste contexto, os resultados deste estudo sugerem uma incapacidade

cognitiva a longo prazo como alterações de memória. É difícil afirmar claramente

com os dados que encontramos o exato mecanismo que leva esse estresse celular a

relacionar-se com a melhoria da capacidade cognitiva dos animais submetidos a

CLP. Verificar a relação desses estudos com níveis de mediadores induzidos pelo

estresse poderia ser uma importante explicação de como exatamente os animais

conseguem apresentar melhor desempenho com maiores níveis de dano e de

inflamação.

48

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