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ESTUDO COMPARATIVO DAS CARACTERISTICAS MORFOLÓGICAS E FISIOlÓGICASDE DOIS ISOLAMENTOS DE COR YNESPORA CASSIICOLA

M.L.R. DUARTEt, S. ASAN02 & F.C. ALBUQUERQUE1

1Centro de Pesquisa Agropecuária do Trópico Úmido (CPATU)Caixa Postal 48, 66.000, Belém,PA; 2 Estação Experimental

do PLANALSUCAR, Castanhal, PA(Aceito para publicação em 19/10/82)

RESUMO

o fungo Corynespora cassiicola (Berk &Curt) Wei é de ocorrência freqüente em diferenteshospedeiros, entre os quais mamoeiro e cacaueiro. Estes isolamentos apresentam diferenças mar-cantes quanto ao crescimento vegetativo em meio de cultura batata-dextrose-ágar.

Diferenças morfológicas, fisiológicas e patogênicas foram detectadas através de vários en-saios em laboratório e casa-de-vegetação.

Foram observadas variações no comprimento, largura e número de septos dos conídios econidióforos, em ambos os isolamentos. O do mamoeiro apresentou sempre maiores dimensõesque o do cacaueiro. A velocidade de crescimento foi maior no do mamoeiro, pois 120 horas apósa inoculação do meio de cultura apresentou um crescimento radial médio de 48mm, enquantoque no do cacaueiro o crescimento radial médio alcançou 27mm, em igual período. Entre osmeios de cultura testados batata-dextrose-ágar em escuro contínuo favoreceu o crescimento ra-dial do isolamento do cacaueiro, enquanto que batata-dextrose-ágar + I% de extrato de levedura,em luz contínua, favoreceu a esporulação. O isolamento do mamoeiro apresentou maior cresci-mento radial quando cultivado em Czapek Dox e em regime contínuo de escuro.

Este isolamento esporulou bem em meio de Czapek Dox, tanto em luz como em escurocontínuos. Ambos os isolamentos mostraram diferenças na manifestação de sirItomas em dife-rentes hospedeiros.

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ABSTRACf

FITOPATOLOGIA BRASILEIRA

Comparative study of Phisiologic and morphologic characteristics of twoCorynespora cassiicola isolates

Corynespora cassiicola (Berk &Curt) Wei occur frequent1y in different hosts such as pa-paya and coco a plants. Conspicous differences in relation to vegetative growth in potato-dextro-se-agar culture medium were observed.

Morphologic, physiologic and pathogenic differences were detected through several assayscarried out in the laboratory and the greenhouse.

Variations in length, width and number of septa of conidia, and conidiophorus were obser-ved in both isolates. The growth rate was greater in papaya isolate than cocoa isolate. While incocoa isolate, the radial growth reached 27mm, in 120 hours after inoculation of culture media,papaya isolate attained 48mm of growth during the same period. Among the culture media tes-ted potato-dextrose-agar in continuous dark period, favored the radial growth of cocoa isola te ,while potato-dextrose-agar + 1% yeast extract in continuous light period favored the sporulati-on. The papaya isolate showed greater growth when cultived in Czapek Dox medium in contínu-ous dark period. This isolate produced greater spore number in Czapek Dox medium in dark aswell as continuous light period. Both isolates showed differences in symptons in different hosts.

INTRODUÇÃO

o fungo Corynespora cassiicola (Berk&Curt) Wei afeta vários hospedeiros, entre osquais caupi, mamoeiro, cacaueiro, seringuei-ra, juta, além de plantas nativas onde causamanchas foliares, em plantas adultas e emmudas mantidas em viveiro.

Em mamoeiro, o patógeno causa man-chas circulares com 0,3 a 0,5 mm de diâme-tro, com centro branco acinzentado e bordasde cor amarela tênue,distribuídas pelos lóbu-los foliares. Em mudas ainda em viveiro pro-voca manchas necróticas, queda das folhas elesões nas hastes. A doença em cacaueiro foidescrita recentemente por Duarte et al (1978)e caracteriza-se pela formação de manchas decor parda, irregulares, angulosas com centrode cor branca cinza e margem parda escuranítida, envolvidas por um halo amarelo tênue,tanto em mudas mantidas em viveiro comoem plantas adultas, em condições de campo.

Durante o exame de lesões formadas

nestes hospedeiros, sob a binocular, observou-se que as estruturas reprodutivas eram forma-das mais na face ventral das folhas de mamoei-ro e em ambas as faces, nas folhas de cacauei-ro. Além disso, quando cultivados em batata-dextrose-ágar, estes isolamentos apresenta-vam variações quanto à velocidade de cresci-mento e à coloração das colônias.

Visando a detectar diferenças morfoló-gicas e fisiológicas entre estes isolamentos e acapacidade de infectar diferentes hospedei-ros, foram conduzidos ensaios em condiçõesde laboratório e de ripado, nas dependênciasdo Centro de Pesquisa Agropecuária do Tró-pico Úmido (CPATU), em Belém, Pará.

No presente trabalho são apresentadose discutidos os resultados dos ensaios, cujosobjetivos foram selecionar meios de culturacapazes de favorecer o crescimento e esporu-lação em regimes contínuos de luz ou escuro,verificar diferenças quanto à velocidade decrescimento e à especificidade de hospedei-ros, através de inoculações cruzadas.

VaI. 8

MATERIAL E MÉTODOS

Obtiveram-se culturas puras do pató-geno, transferindo-se com escalpelo, esporosformados em lesões foliares em mamoeiro ecacaueiro para tubos de ensaio contendo BDA(batata 200 g, dextrose 20 g, ãgar 20 g).

- Influência do tempo de incubação no cres-cimento radial '

Discos de colônias, com 4 mm de diâ-metro, foram retirados da zona de crescimen-to ativo de colônias dos dois isolamentos,transferidos para placas de Petri contendo 20ml de BDA e submetidos a diferentes temposde incubação. Após a transferência dos discosdas colônias para o meio de cultura, as placasforam mantidas em um regime alternado de12 horas de luz e 12 horas de escuro. Foramfeitas mensurações do crescimento radial dosdois isolamentos, nos períodos de 24,48,72,96 e 120 horas, expressas em milímetros.

- Estudo comparativo das estruturas repro-dutivas

Foram obtidas culturas monospóricasdos dois isolamentos, Após o desenvolvimen-to das colônias, discos de 4 mm retirados dazona de crescimento ativo foram transferidospara placas de Petri contendo BDA, Quinzedias após, época em que as colônias cobriramtoda a superfície dos meios de cultura, usando-se a lente micrométrica, fizeram-se as mensu-rações das seguintes estruturas: comprimento,largura e número de septos dos conídios econidióforos, dimensões da escara dos espo-ros e da célula-pé dos conidióforos, Foramfeitas 800 mensurações para cada um dosisolamentos.

- Influência de diferentes meios de cultura edo regime de luz no crescimento e esporu-lação.

Após a distribuição dos diferentesmeios de cultura, estes foram inoculados comdiscos de 4 mm de diâmetro retirados de co-lônias com 10 dias de idade, desenvolvidas

Junha/1983 207

em BDA, Foram testados os meios de cultu-ra BDA Lev(batata 200g, dextrose 20 g, ágar20 g, extrato de levedura 1 g), Czapek Dox(NaN03 2g; KH2 P04 l g; Mg S04 ,7H200,5g; KCL 0,5g; Fe S04 . 7H2 °O,Olg; sucro-se 30 g; ágar 15 g), Folhas de cacau-ágar (de-cocção de 50 g de folhas de cacaueiro; ágar20g) e Folhas de mamão-ágar (de cocção de50g de folhas de mamoeiro; ágar 20g), Insta-laram-se dois experimentos. No primeiro, asplacas de Petri, inoculadas com os dois fun-gos, foram submetidas à luz contínua de duaslâmpadas fluorescentes tipo "Day Ligth", de40 watts e à distância de 40 em; no outro, asplacas de Petri foram envolvidas com papelalumínio tipo Rochedo. O delineamento ex-perimental usado foi inteiramente casualiza-do, com cinco tratamentos e seis repetições.Cada placa de Petri constituiu uma repetição,As mensurações do crescimento radial dascolônias dos isolamentos foram tomadasdez dias após. A produção de esporos tam-bém foi avaliada, fazendo-se uma suspensãode esporos de cada uma das repetições. Paraisso, adicionaram-se 3 ml de água destiladaestéril, na superfície de cada uma delas e,com um pincel pelo de marta nv 10, fez-se aretirada dos esporos, tendo-se o cuidado deeliminar o excesso de micélio. A fím de ma-tar os esporos, adicionou-se em seguida, emcada uma das suspensões de esporos, umagota de bicloreto de mercurio 1:1000. Acontagem do número de esporos nas suspen-sões foi feita com a câmara de Neubauer e,para efeito do cálculo da concentração,usou-se a fórmula proposta por Tuite (1969)para esporos grandes,

RESULTADOS

- Influência do tempo de incubação no cres-cimento radial

Na Figura 1, observa-se que o isola-mento do mamoeiro apresentou maior velo-

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cidade de crescimento que o do cacaueiro,nos diferentes períodos de incubação. Estavelocidade de crescimento ocorreu nas se-

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guintes taxas: 1:1,40;1:1,99;1:2,21;1:1,98e 1:1,81nos períodos de 24,48,72,96 e120horas, respectivamente.

60-r--------------------------------------------------~

,.-., 40ee'-'ta:a'"•..o•..~'I.l

.5o'"'I.l•..u

20

------- Mamão-----Cacau

O~--~----------~--------~--------~----------~----~24 48 72 96 120

Horas após inoculação do meioFig. 1. Crescimento radial (mm) de C. cassiicola isolado do mamoeiro e cacaueiro em diferentes períodos de

incubação.

- Estudo comparativo das estruturas repro-dutivas

Os dois isolamentos apresentaram va-riações quanto às dimensões dos conídios econidióforos, quando cultivados em meio de

cultura BDA (Tabela 1). O isolamento domamoeiro apresentou sempre dimensõesmaiores que o do cacaueiro, entretanto, deacordo com as dimensões propostas para aespécie (Wei, 1950)parecem pertencerem amesma espécie.

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Tabela 1 - Dimensões das estruturas de C. cassiicola isolado do mamoeiro e cacaueiro, obser-vadas quinze dias após o cultivo em meio de cultura batata dextrose-ágar.

ESTRUTURAS ac. cassiicu/acacaueiro

Conídio

comprimento- largura- n9 de septos- escara

Conidióforo

- comprimento- largura- n9 de septos- célula-pé

60J.1 a2J.1 a2J.1 a

2J.1 x4J.1 -

C. cassiicolamamoeiro

200J.112 J.114 J.1

6J.1

32J.1 a 180J.14 J.1 a 8 J.12J.1 a 9 J.12 J.1 a 4 J.1

200J.112 J.1llfJ.

60 J.1 x 20 J.1

a 192 J.1a 8J.1a 8 J.1

24J.1 x 8

~ Média de 200 mensurações,

- Influência de diferentes meios de cultura edo regime de luz no crescimento e esporula-ção

Entre os meios de cultura testados,Czapek Dox foi o que mais favoreceu a espo-rulação do isolamento do mamoeiro seguidoda BDA e BDA + 0,1 % de extrato de levedu-ra, em regime de escuro contínuo. Quantoao crescimento radial, Czapeck Dox foi ligei-ramente superior quando comparado aos de-mais. (Fig. 2). O isolamento do cacaueiroesporulou bem em BDA + 0,1 % de extratode levedura, seguido de Czapek Dox, quandoas culturas permaneceram em regime de luzcontínua. Em relação ao crescimento radialos meios de cultura que proporcionam me-lhores condições para o crescimento foramBDA, Czapek Dox e BDA + 0,1% de extratode levedura em regime de escuro contínuo.Estes meios de cultura foram ligeiramentesuperiores aos demais (Fig. 3)

O meio de cultura que menos favore-ceu a esporulação do isolamento do mamoei-ro foi a decocção de folhas de cacaueiro -ágar, tanto em luz como em escuro contí-nuos. Quanto ao crescimento radial, estemeio de cultura foi ligeiramente inferior aosdemais, em regime de escuro contínuo. Napresença de luz, sua capacidade de promoverum bom crescimento radial é comparável aosmeios de cultura BDA + 0,1 % de extrato delevedura e decocção de folhas de mamoeiro-ágar.

Em relação ao isolamento do cacauei-ro, o meio de cultura que menos favoreceua esporulação foi o BDA, na ausência de luz,embora o maior crescimento radial tenhasido observado nas colônias desenvolvidasneste meio de cultura (Fig. 3).

Os dados sobre a interação meios decultura e luminosidade revelaram que o isola-mento do mamoeiro esporulou bem, tanto

210

100-

FITOPATOLOGIA BRASILEIRA

Mamão-agar

Fig. 2. Crescimento radial (mm) e produção de esporos de C. cassiicola isolado do mamoeiroquando cultivado em diferentes meios de cultura, na presença e ausência de luz.

80-

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Czapek Dox BOA +Lev BOA Cacau-agar

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:.:.:-:.:.:.:.Czapek OOX BDA BOA +Lev Mamão-agar Cacau-agar

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em luz quanto em escuro contínuos, haven-do uma tendência para melhor esporulação ecrescimento radial em escuro contínuo. Oisolamento do cacaueiro cresceu melhorquando submetido ao regime de escuro con-tínuo embora a esporulação tenha sido favo-recida na presença de luz, a exceção do meiode cultura de cocção de folhas de mamoeiro-ãgar onde a ausência de luz induziu maior es-porulação (Fig. 3).

Observou-se que os isolamentos apre-sentaram diferenças quanto à necessidade deluz para crescerem o esporularem. O isola-mento do mamoeiro cresceu bem tanto emluz como em escuro contínuo, enquanto quea esporulação foi maior em escuro contí-nuo quando o patógeno foi cultivado nosmeios Czapek Dox, BDA e BDA + 0,1 % deextrato de levedura. Nos meios de culturadecocção de folhas de mamoeiro e de cacau-eíro-ãgar, a presença de luz induziu maioresporulação. O isolamento do cacaueiro cres-ceu melhor em escuro contínuo necessitan-do de luz contínua para produzir maiorquantidade de esporos.

- Avaliação da capacidade patogênica dosisolamentos através de inoculações cruzadas

Nas plantas de caupi, seringueira, ma-moeiro e cacaueiro inoculadas com os doisisolamentos de C. cassiicola, foram observa-das variações quanto aos sintomas.

Mudas de mamoeiro inoculadas com oisolamento do mamoeiro exibiram pontosdescoloridos nas folhas. Esta descoloraçãotornou-se mais acentuada seis dias após ainoculação, observando-se ainda queda defolhas. Quando as nervuras eram afetadas olóbulo foliar quebrava no ponto afetado.Oito dias após as áreas descoloridas torna-ram-se encharcadas, depois necróticas, próxi-mas da nervura. Foi notada abundante espo-rulação nas lesões formadas na face inferior

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das folhas. Nos pecíolos surgiram lesões ne-gras, alongadas, deprimidas. Nas plantas ino-culadas com o isolamento do cacaueiro sur-giram áreas de tecido descolorido, asseme-lhando-se à reação de hipersensibilidade.

Em caupi inoculado com o isolamentodo mamoeiro ocorreu amarelecimento e que-da de folhas, entretanto os sintomas de le-sões pardas, circulares e com anéis concêntri-cos provocadas pelo fungo neste hospedeironão foram observadas. O isolamento do ca-caueiro não provocou sintomas nas plantasde caupi.

Plantas de seringueira noculadas com oisolamento do mamoeiro apresentaram ini-cialmente pontuações cloróticas, mal forma-ção foliar, quando a penetração do fungoocorreu próximo às nervuras e lesões necrô-ticas. As plantas inoculadas com o isolamen-to do cacaueiro não manifestaram sintomas.

Mudas de cacaueiro inoculadas com oisolamento do mamoeiro não exibiram sin-tomas, entretanto naquelas inoculadas com oisolamento do cacaueiro surgiram lesões an-gulosas, necróticas, características da doençaneste hospedeiro.

DISCUSSÃO

O estudo das características morfoló-gicas e fisiológicas de Corynespora cassiicola(Berk. & Curt.) Wei isolado do mamoeiro ecacaueiro revelou diferenças quanto ao cres-cimento radial e produção de esporos emdiferentes meios de cultura e regimes contí-nuos de luz e escuro, assim como, em relaçãoà patogenicidade em mudas de mamoeirocultivar Solo, cacaueiro híbrido, caupi culti-var IPEAN V-69 e seringueira.

Os isolamentos apresentaram variaçõesnas dimensões de comprimento, largura enúmero de septos dos conídios e conidiófo-ros, entretanto estas variações estão dentro

212 FITOPATOLOGIA BRASILEIRA

Fig. 3. Crescimento radial (mm) e produção de esporos de C. cassiicola isolado do cacaueiroquando cultivado em diferentes meios de cultura, na ausência e presença de luz.

70-

50-

30-

10-

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~ 10-

BOA Czapek Dox Mamão

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~Luz

BOA +Lev Cacau

BOA +Lev Czapek Dox Mamão BOA Cacau

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das dimensões citadas para a espécie (Wei,1950).

Awoderu (1969) fazendo um estu-do comparativo entre três isolamentos dofungo sendo dois de seringueira de KualaLumpur e Sierra Leone e um de mamoeirode Sierra Leone também observou diferençasnas dimensões das estruturas reprodutivas.Entretanto estas diferenças não foram sufici-entes para que os isolamentos estudados fos-sem considerados espécies diferentes.

Os dados da literatura não se referemàs diferenças na velocidade de crescimento.No presente trabalho, quando se estudoueste parâmetro, observou-se que o isolamen-to do mamoeiro teve maior capacidade paradesenvolvimento em BDA do que o do ca-caueiro (Fig. 1).

A produção abundante de esporos nosmeios de cultura Czapek Dox eBDA+O, 1%de extrato de levedura observada no isola-mento do mamoeiro e cacaueiro, respectiva-mente, estão em concordância com os resul-tados obtidos por Awoderu (1969). EmBDA os dois isolamentos apresentaram umbom crescimento radial, entretanto, o núme-ro de esporos formados neste meio de cultu-ra foi inferior ao daqueles formados emCzapek Dox e BDA + 0,1 % de extrato delevedura. Estas diferenças não foram sufici-entes para que os isolamentos estudados fos-sem considerados espécies diferentes. Oaumento da produção de esporos verificadono isolamento do cacaueiro quando cultiva-do em BDA + 0,1 % de extrato de leveduraquando comparado com BDA sugere queeste isolamento necessita de um fator decrescimento para estimular a esporulação,provavelmente ácido nicotínico ou riboflavi-na presentes no extrato de levedura (Anô-nimo, 1976). Um baixo índice de esporula-ção do isolamento de C cassiicola da soja cul-tivada em BDA também foi observado por

Junhot1983 213

Almeida & Yamashita (1976). Estes au-tores verificaram que seu isolamento espo-rulou mais em escuro contínuo parecendoassemelhar-se ao isolamento de mamoeiro.

As condições de luz e escuro a queforam submetidos os dois isolamentos tive-ram influência no crescimento radial e espo-rulação. Enquanto o isolamento do mamoei-ro cresceu ligeiramente melhor em escurocontínuo e esporulou bem na mesma condi-ção de luminosidade, exceção feita aos meiosdecocção de folhas de mamoeiro e cacaueiro-ãgar, o do cacaueiro cresceu melhor quandoas colônias foram mantidas em escuro contí-nuo. Já a esporulação foi favorecida pela pre-sença de luz contínua.

Embora os isolamentos não tenhamapresentado diferenças quanto à morfologiao mesmo não ocorreu quando a capacidadepatogênica foi testada. Os testes de inocula-ção cruzada revelaram a existência de varia-ção entre os dois isolamentos quanto à capa-cidade de infectarem hospedeiros comuns. Oisolamento do mamoeiro incitou lesões emmamoeiro, caupi e seringueira, mas, não ~mcacaueiro, enquanto que o do cacaueiroquando inoculado em mamoeiro incitou le-sões brancas semelhantes àquelas verificadasquando ocorre reação de hipersensibilidade.Este isolamento induziu lesões característi-cas da doença no cacaueiro mas não infectoucaupi nem seringueira.

Olive et al (1945) fazendo um estu-do comparativo entre um isolamento docaupi e um da soja verificaram que apesardos isolamentos não mostrarem díferençasmarcantes nas estruturas reprodutivas, dife-renças na manifestação dos sintomas foramobservadas o que permitu aos autores identi-ficá-los como raça 1 (caupi) e raça 2 (soja).Spencer & Walters (1969) trabalhando com14 isolamentos diferentes de C cassiicolaobservaram diferenças morfológicas,

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culturais e patogênicas entre estes isolamen-tos. Os autores também confrrmaram a exis-tência de duas raças do patógeno.

Desde que o patógeno em mamoeiroé classificado como C cassiicola (Fros-sard, 1969, Bird et al. 1966) e que o iso-

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lamento do cacaueiro foi identificado peloDr. Ellis do Commonwealth Mycologica1 Ins-titute como C cassiicola (Duarte et al.1978), as diferenças na capacidade de ínfec-tar diferentes hospedeiros sugerem a existên-cia de duas raças do patógeno afetando omamoeiro e o cacaueiro no Estado do Pará.

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