cp123364 tese fermentação contra uso H2SO4

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Sinergismo entre sulfito, ácido lático, pH e etanol na fermentação alcoólica de Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26 CLAUDIA DORTA Tese apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, para obtenção do título de Doutorado em Ciências Biológicas (área de Microbiologia Aplicada) Rio Claro Estado de São Paulo 2006

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Sinergismo entre sulfito, cido ltico, pH e etanol na fermentao alcolica de Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26

CLAUDIA DORTA

Tese apresentada ao Instituto de Biocincias do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, para obteno do ttulo de Doutorado em Cincias Biolgicas (rea de Microbiologia Aplicada)

Rio Claro Estado de So Paulo 2006

Sinergismo entre sulfito, cido ltico, pH e etanol na fermentao alcolica de Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26

CLAUDIA DORTA

Orientador: Prof. Dr. Pedro de Oliva Neto

Tese apresentada ao Instituto de Biocincias do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, para obteno do ttulo de Doutorado em Cincias Biolgicas (rea de Microbiologia Aplicada)

Rio Claro Estado de So Paulo 2006

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DEDICO, minha famlia por todo apoio e carinho.

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AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Pedro de Oliva Neto pela orientao, dedicao e confiana.

Aos bilogos Mrio Soares de Abreu Neto e Nilson Nicolau Jnior, e aos alunos de Biotecnologia da Unesp de Assis Agnes Izumi Nagashima e Nelson Floresto Lizier pela cooperao, dedicao e amizade durante o desenvolvimento do trabalho.

CAPES pela bolsa oferecida durante parte da realizao deste trabalho.

Aos professores do curso de Ps-Graduao de Microbiologia Aplicada do Instituto de Biocincias da Unesp de Rio Claro que contriburam para a ampliao dos meus conhecimentos.

USINA NOVA AMRICA pela doao de materiais e aos seus funcionrios por suas colaboraes.

Ao Ms. Vitrio dos Santos Jnior e Profa. Dr. Wilma Aparecida Spinosa do CEPECI (FEMA), Assis/ SP, por fornecerem o CG para a anlise de etanol das amostras.

Ao Prof. Dr. Rogelio Brando da UFOP/ MG e sua orientada Michelle B. Moura por suas contribuies.

Aos meus companheiros de laboratrio de Bioqumica e Microbiologia da Unesp de Assis pela fora e amizade.

minha famlia por me apoiar nos momentos mais difceis durante o desenvolvimento deste trabalho.

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NDICE

Pginas 1. INTRODUO ................................................................................... 01 2. REVISO DA LITERATURA .............................................................04 2.1. Tecnologia da produo industrial de etanol carburante....................04 2.1.1. Processos fermentativos....................................................................04 05 2.1.2. Efeito do tratamento cido sulfrico................................................... 2.1.3. Contaminao no processo da fermentao alcolica......................07 2.2. Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae........................................... 9 0 0 2.2.1. Consumo do substrato......................................................................... 9 1 2.2.2. Trealose................................................................................................ 0 2.2.3. Efeito antagnico do cido ltico ......................................................10 12 2.2.4. Efeito txico do etanol ............................................................................ 13 2.2.5. Efeito inibitrio do sulfito ...................................................................... 15 2.2.6. pH e a atividade de H+-ATPase ............................................................. 3. OBJETIVO...............................................................................................17 3.1. Objetivo geral........................................................................................17 17 3.2. Objetivos especficos.............................................................................. 1 4. MATERIAL E MTODOS .................................................................... 9 1 4.1. Material ................................................................................................. 9 1 4.1.1. Microrganismos .................................................................................. 9 20 4.1.2. Meios de cultivo e fermentativo............................................................ 2 4.2. Condies de cultivo.............................................................................. 0 20 4.2.1. Multiplicao dos microrganismos ...................................................... 4.2.2. Processos fermentativos .....................................................................21 21 4.2.2.1. Verificao dos fatores sinrgicos de estresse ................................. 4.2.2.2. Efeito do tratamento cido associado a outros fatores de estresse fermentativos para a linhagem S. cerevisiae PE-2................................... 22 4.2.2.3. pH timo fermentativo em condies de fatores de estresse associados.................................................................................................. 23

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4.2.2.4. Efeito do tratamento cido e pH dos mostos durante a fermentao mista com S. cerevisiae PE-2 e L. fermentum CCT 1396. ... 24 2 4.3.Tcnicas Analticas .............................................................................. 5 2 4.3.1.Tcnicas analticas para a anlise microbiana .................................. 5 4.3.1.1. Determinao da biomassa seca .....................................................25 2 4.3.1.2. Viabilidade e brotamento das leveduras ......................................... 5 2 4.3.1.3. Contagem de leveduras e bactrias ................................................. 5 4.3.1.4 Contagem de clulas viveis de bactrias ..................................... 26 2 4.3.1.5. Produo de biomassa seca ............................................................. 6 4.3.1.6. Determinao da acidez total expressa em cido ltico............... 26 27 4.3.1.7. Quantificao e identificao dos cidos orgnicos ....................... 27 4.3.1.8. Clculo da atividade da Bomba de prtons ...................................... 2 4.3.1.9. Determinao da trealose ................................................................ 8 4.3.1.10. Determinao da protena residual ..............................................29 4.3.1.11. Determinao de Acares Redutores Residuais Totais

(ARRT)........................................................................................................ 29 4.3.1.12. Determinao da concentrao de etanol ....................................29 4.4. Clculos relacionados produo etanlica .......................................29 4.5. Forma de anlise dos resultados ..........................................................30 5. RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................31 31 5.1. Processos fermentativos com fatores sinrgicos de estresse ................. 5.1.1.Viabilidade e brotamento ....................................................................31 5.1.2. Produo de Biomassa .......................................................................36 5.1.3. Acidez total expressa em cido ltico e cidos orgnicos............................. 36 3 5.1.4. Atividade da Bomba de prton ........................................................... 9 5.1.5. Trealose ..............................................................................................41 5.1.6. Protena residual ................................................................................45 5.1.7. Determinao do acar redutor residual total (ARRT), rendimento e produtividade etanlica ...................................................... 47 5.2. Efeito do tratamento cido associado a outros fatores de estresse para a linhagem S. cerevisiae PE-2. .......................................................... 52

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5 5.2.1.Viabilidade e Brotamento .................................................................... 2 55 5.2.2. Produo de Biomassa ........................................................................ 5.2.3. Acidez total expressa em cido ltico.......................................................... 58 5 5.2.4. Atividade da bomba de prtons .......................................................... 9 5.2.5. Trealose ..............................................................................................61 5.2.6. Protena residual ...............................................................................64 5.2.7. Determinao do acar redutor residual total, rendimento e produtividade etanlicos............................................................................. 64 5.3. pH timo fermentativo sob condies de fatores de estresse associados ................................................................................................. 74 5.3.1. Viabilidade e Brotamento ..................................................................74 5.3.2. Produo de Biomassa .......................................................................74 78 5.3.3. Acidez total expressa em cido ltico....................................................... 78 5.3.4. Atividade da Bomba de prtons .......................................................... 80 5.3.5.Trealose ................................................................................................. 5.3.6.Protena residual .................................................................................80 5.3.7. Determinao do acar redutor residual total, rendimento e produtividade etanlica ............................................................................. 84 5.4. Efeito do tratamento cido e pH dos mostos durante a fermentao mista de S. cerevisiae PE-2 e L. fermentum CCT 1396 ...... 89 5.4.1. Viabilidade e Brotamento ..................................................................89 92 5.4.2. Produo de Biomassa e Relao Bactria/ Levedura ........................ 5.4.3. Acidez total expressa em cido ltico............................................... 95 97 5.4.4. Atividade da Bomba de prtons .......................................................... 1 5.4.5. Trealose ............................................................................................... 01 5.4.6. Protena residual ................................................................................102 5.4.7. Determinao do acar residual, rendimento e produtividade etanlica............................................................................... 105 111 6- CONCLUSES ........................................................................................ 1 7-RESUMO .................................................................................................. 13 1 8-ABSTRACT .............................................................................................. 15

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9-LITERATURA CITADA ........................................................................117

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1. INTRODUO

A indstria sucro-alcooleira no Brasil de grande importncia para a economia. O etanol, alm de suas propriedades antimicrobianas, utilizado como combustvel alternativo para automveis, sendo menos poluente que a gasolina e, alm disso, derivado de uma fonte de energia renovvel. Devido ao alto custo da gasolina gerado por conflitos e oscilaes econmicas mundiais, e por ser derivada de uma fonte de energia no renovvel (o petrleo), o etanol est ganhando abertura para se tornar uma importante matriz energtica mundial. A produo comercial de lcool no Brasil feita mediante do processo de batelada alimentada ou fermentao contnua. O etanol produzido aps a fermentao do acar de cana por Saccharomyces cerevisiae, na qual existe o reciclo de clulas que acaba intensificando o problema da contaminao bacteriana. Tal problema caracteriza-se pela floculao, diminuio do acar e lcool, alm do decrscimo do crescimento e da viabilidade da levedura como resultado dos componentes txicos liberados no meio pelos contaminantes. As bactrias lticas, principalmente as pertencentes ao gnero Lactobacillus, so comumente responsveis pela diminuio do rendimento alcolico nas usinas. Segundo MAIORELLA (1983), 40 g/L de cido ltico foi suficiente para o

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decrscimo de 80% na populao de Saccharomyces cerevisiae crescidas em meio sinttico. De acordo com CARTWRIGHT et al. (1989), o mecanismo em que os cidos presentes no meio fermentativo atuam dependem do valor do pH. Assim, em pH baixo os cidos orgnicos estaro predominantemente em sua forma no dissociada, permitindo com que estes entrem na membrana da levedura passivamente, j que esta impede a entrada passiva de ons. O tratamento da levedura com cido sulfrico feito nas usinas sucroalcooleiras aps o trmino de cada ciclo fermentativo para evitar o aumento de bactrias contaminantes e diminuir a floculao, entretanto, este procedimento pode interferir negativamente no metabolismo e fisiologia do fermento. Desde a ltima dcada do sculo XX as usinas de acar e lcool tm aumentado a dosagem de melao no mosto fermentativo em relao ao caldo de cana, acarretando maiores problemas para a produo etanlica, como a adio de sulfito no processo. Tal substncia utilizada na clarificao do acar e acumulada tornando-se excessiva no melao. A presena do referido reagente, em quantidades elevadas no melao-de-cana, tem sido descrita por pesquisadores como um outro fator de diminuio do rendimento alcolico, da viabilidade e do crescimento celular de leveduras. Entretanto, ALVES (1994) chegou a concluso que a presena de sulfito no meio fermentativo pode exercer um efeito benfico fermentao, quando age contra a proliferao de bactrias contaminantes. O etanol pode tornar-se txico para a clula de levedura, causando uma inibio do tipo no competitiva. (GHOOSE e TYAGI, 1979, LEO e van UDEN, 1982). Fatores como a temperatura e existncia dos subprodutos acetaldedo, cidos frmico, actico, ltico, octanico e decanico contribuem para a elevao do efeito txico pelo etanol. Tanto a concentrao de cido ltico, quanto a presena de sulfito durante o processo fermentativo, podem ter menor ou maior efeito txico, dependendo das condies em que estes se encontram, como o teor alcolico, pH e nvel de contaminao. Muito ainda tem que ser feito para a verificao dos efeitos sinrgicos de toxinas e outros fatores estressantes para as leveduras durante a produo etanlica, visando maior otimizao do processo. Este trabalho teve o propsito de verificar os efeitos sinrgicos ligados presena de cido ltico, sulfito, etanol e pH no

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metabolismo de Saccharomyces cerevisiae (linhagens Pedra-2 e M-26) durante o processo de produo etanlica, simulando em escala laboratorial, o sistema de batelada alimentada. Verificou-se tambm o efeito do tempo de tratamento cido no controle da contaminao por Lactobacillus fermentum CCT 1396 durante o processo fermentativo de Saccharomyces cerevisiae Pedra-2 (PE-2). Tal trabalho visou, dessa forma, buscar condies mais adequadas para aumento da eficincia e do rendimento alcolico aps a compreenso de vrios fatores que interferem no metabolismo das leveduras durante o processo fermentativo.

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2. REVISO DA LITERATURA

2.1. Tecnologia da produo industrial de etanol carburante

2.1.1.Processos fermentativos Os processos de fermentao etanlica mais utilizados no Brasil so o de batelada alimentada e o contnuo. O processo de batelada alimentada surgiu inicialmente na fabricao industrial de fermento para a panificao, no incio do sculo XIX (BROWN, 1990, apud ABUD, 1997). Segundo ALMEIDA (1940), em tal processo h a alimentao contnua do mosto na dorna de fermentao e ao seu trmino, o produto fermentado centrifugado e separado da levedura. A conduo pelo processo de batelada alimentada permite evitar o efeito inibitrio do acar, durante a fase inicial, resultando em maior concentrao de etanol num mesmo perodo de tempo quando comparada com a batelada convencional (no alimentada). Ainda, no referido processo, a alimentao pode ser realizada mediante adies intermitentes, velocidade constante e de forma exponencial. (WINKLER, 1991 e 1995). Segundo LALUCE et al. (1990), grande parte das usinas brasileiras trabalha com o processo de batelada alimentada com o reciclo do fermento, o qual tratado com cido sulfrico antes de retornar para as

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dornas fermentativas. O mosto , assim, adicionado lentamente durante 4h, sendo que aps 6-9h chega-se ao final do processo fermentativo. No processo contnuo, o meio nutriente mais o inculo so injetados de forma contnua em reatores, com a sada da mesma quantidade de meio fermentado. (WINKLER, 1995; ABUD, 1997). Tal processo pode ser mais vantajoso que o de batelada alimentada, pois inclui otimizao das condies de processo para uma maior produtividade, perodo longo de produtividade contnua, maior produtividade volumtrica, reduo dos custos laboratoriais uma vez alcanado o estado desejado e reduzido o tempo de limpeza e sanitizao das dornas. (CYSEWSKI e WILKIE, 1978). A maior desvantagem que as fermentaes contnuas so mais suscetveis contaminao bacteriana por longos prazos de exposio, alm de exigir um conhecimento apurado para otimizar as condies de processo para atingir o rendimento desejado - especialmente durante a adio de produtos qumicos, alteraes da taxa de fluxo e a mistura dos nutrientes, ou alteraes nos parmetros estimados (INGLEDEW, 2003 apud BAYROCK e INGLEDEW, 2005). importante o total conhecimento desses parmetros quando a planta do processo contnuo desenhada ou operada (BAYROCK E INGLEDEW, 2005).

2.1.2. Efeito do tratamento com cido sulfrico A lavagem do fermento com cido sulfrico, alm de contribuir para o controle dos contaminantes da fermentao alcolica, o principal mtodo de controle da floculao do fermento (OLIVA-NETO, 1995). O tratamento com cido sulfrico feito diminuindo o pH do fermento, diludo em gua, a uma faixa de 2,0 a 3,0. Ao fermento mantido na cuba so adicionados cido sulfrico e gua e mantido em constante agitao. O tempo de tratamento varivel (at 3 horas), quanto maior for este tempo menor a viabilidade celular. As clulas de levedura mais jovens e as mais velhas so menos resistentes ao tratamento. (BOVI e MARQUES, 1983). Segundo RODINE (1985), o uso excessivo do cido sulfrico para o controle do contaminante uma prtica danosa s clulas de levedura num processo de fermentao alcolica. O tratamento cido excessivo pode ter efeito abrasivo sobre a parede da levedura que essencial para sua viabilidade e produo de etanol, assim

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segundo PATERSON et al.(1988) a intensidade do tratamento deve variar de acordo com o ndice de contaminao do meio. GOMES (1988) no observou nenhuma ao drstica sobre a viabilidade celular em experimentos de laboratrio utilizando S. cerevisiae quando o leite da levedura foi tratado em trs nveis de pH (2,0; 2,5 e 3,0) ajustados com cido sulfrico, obtendo maiores rendimentos em relao aos controles. Foi observada a reduo de 44,3% da microbiota contaminante, em funo do vigor e tempo de tratamento.(GALLO e CANHOS, 1991). ALVES DA SILVA (1993) mostrou atravs de seus experimentos que o uso do cido sulfrico como agente de desinfeco do leite de leveduras constitui-se numa das prticas mais eficientes e econmicas para a fermentao alcolica. Entretanto, seu uso no deve ser indiscriminado, mas baseado num rigoroso acompanhamento dos parmetros fsico-qumicos e microbiolgicos do processo fermentativo. Embora muitos pesquisadores defendam o uso do cido sulfrico como descontaminante do processo de fermentao alcolica, para outros sua prtica no eficiente, elevando o custo com este reagente, alm do perigo do transporte, manipulao e danos ao meio ambiente quando o vinho delevurado (com o cido) despejado ao solo (OTENIO, 1998). Para NUNES et al. (1991), o uso do cido sulfrico inadequado, porque o tratamento cido no funciona como descontaminante e tambm no existe a necessidade do uso de qualquer bactericida, pois o nmero de bactrias no chega justific-lo. Estes pesquisadores defendem o ajuste dos processos de centrifugao, alimentao e nutrio, como a soluo para um bom processo fermentativo. A adio de cido sulfrico e de bactericidas seja qual for quantidade inadequada e inoportuna passando, ento, a ter a funo de destruidor de leveduras e enzimas. Esta adio causa muitas reaes qumicas resultando no desequilbrio do importante sistema de enzima-substrato no meio de fermentao. Ainda, o tratamento cido da levedura quando floculada induz a disperso do fermento e das bactrias, mas no sua total eliminao (GUERRA e ANGELIS, 1998). Apesar da eficcia do tratamento na desfloculao do fermento, esta no duradoura, sendo revertida em funo do pH quando o inculo tratado retornado dorna fermentativa (BOVI e

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MARQUES, 1983). Alm disso, a utilizao do pH baixo (2,0-2,5) pode afetar o metabolismo da levedura. (LUDWIG et al., 2001). OTNIO (1998) mostrou que o tratamento cido no foi eficiente para o aumento do teor alcolico da dorna, volume do fermento da dorna, acidez fixa, tempo de fermentao, viabilidade e brotamento da levedura na Usina de Bandeirantes/ PR.

2.1.3. Contaminao no processo da fermentao alcolica A decomposio da sacarose por microrganismos inicia-se quando a cana-de-acar est ainda no campo. Quanto mais rpido a cana for levada usina para ser convertida em sacarose ou lcool, mais eficiente ser o processo de obteno de tais produtos. Segundo OLIVA-NETO (1995), durante a passagem da cana at a etapa de fermentao alcolica nas dornas das destilarias, a microbiota contaminante passa por uma grande seleo em funo do pH, temperatura, condies atmosfricas e produtos inibidores (presentes no substrato) a que so submetidas. Assim, durante o processo fermentativo, a microflora restringe-se a poucos gneros, uma vez que o pH torna-se mais baixo e existe o aumento do teor alcolico, ficando difcil a adaptao para a maior parte dos microrganismos. Entretanto, o processo de batelada alimentada ou contnuo com o reciclo de clula, utilizado nas usinas sucro-alcooleiras, favorece a proliferao de alguns gneros contaminantes nas dornas fermentativas (OLIVA-NETO e YOKOYA, 1994). Pesquisadores constataram a presena de fermentaes paralelas fermentao alcolica em funo da presena de contaminantes. Esses agentes diminuem o rendimento etanlico devido produo de cidos como o actico, ltico e butrico e de gomas dextrana e levanas. (NEVES, 1938; ALMEIDA, 1940; OLIVANETO e YOKOYA, 1994 e 1997). WALKSMAN, segundo ALVES (1994), em 1945 concluiu que as relaes antagnicas entre as leveduras e as bactrias lticas so marcadas por um amplo nmero de substncias txicas, abrangendo desde compostos simples como cidos orgnicos, lcoois, at polipeptdeos, protenas e derivados do metabolismo secundrio. A literatura aponta como principais contaminantes do meio fermentativo bacilos Gram-positivos compostos pelos gneros Lactobacillus, Bacillus e

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Leuconostoc, sendo este ltimo menos comum devido a menor resistncia ao teor alcolico. (OLIVA-NETO, 1995; NOBRE, 2005). OLIVA-NETO (1990) isolou como principal contaminante da fermentao o gnero Lactobacillus a partir de amostras de "leite de levedura" em usinas do estado de So Paulo. A anlise taxonmica demonstrou que L. fermentum foi a bactria predominante (62%), seguida por L. murinus (9%), L. vaccinostercus (9%), L. plantarum (2%) e Leuconostoc sp (2%). Do total da referida microflora 64% resistiu a 10% (v:v) de etanol em cultivo isolado. Os Lactobacillus tem ampla distribuio, so espcies principalmente acidfilas e tolerantes ao etanol, vulgarmente denominadas de bactrias lticas, so sacarolticas (TILBURY, 1975; PRIEST, 1981; apud ALVES, 1994), sendo exigentes em termos nutricionais, principalmente quanto aos aminocidos (OLIVA-NETO e YOKOYA, 1997). Segundo HYNES et al. (1997), a contaminao por bactrias lticas o maior problema da fermentao industrial de lcool. O crescimento das referidas bactrias reduz o rendimento alcolico devido o consumo de glicose que seria destinada na sntese etanlica, alm da competio dos nutrientes do meio, e do efeito txico do cido ltico. (YOKOYA, 1991, HYNES et al. 1997). Alm disso, segundo LUDWIG et al. (2001), tais bactrias podem induzir a floculao do fermento causando o assentamento de clulas de leveduras no fundo das dornas e perda de clulas nas centrfugas contribuindo ainda mais para a diminuio do rendimento produtividade etanlica e viabilidade celular (ROSE, 1980; OLIVA-NETO e YOKOYA, 1994; LUDWIG et al., 2001). De acordo com SERRA et al. (1979), o rendimento fermentativo diminuiu 15% devido a bactrias contaminantes. Segundo ALTERTHUM et al. (1984), quando as bactrias durante a fermentao atingiram nveis de 108 a 109 cel/mL, a queda no rendimento fermentativo foi na faixa de 14 a 90% do terico. CRUZ et al. (1985) observaram diminuies de 10 a 40% no rendimento, quando a contaminao chegou de 107 a 108 cel/mL. OLIVA-NETO (1990) mostrou que ao final de 18 ciclos de uma fermentao mista com S. cerevisiae (fermento Fleishmann) e L. fermentum, o fermento ficou seriamente comprometido e as bactrias tiveram um grande crescimento. Existiu uma diminuio acentuada no rendimento etanlico, o qual chegou ao valor de at

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46,7% (comparado ao terico), e a sua produtividade teve uma diminuio de at 53,5% em relao mdia dos ciclos iniciais. Tal diminuio na atividade cataltica do fermento foi atribuda a acidez que atingiu nveis superiores a 6g/L, expressos em cido ltico. THOMAS et al. (2001) ao estudarem a influncia da contaminao por lactobacilos durante a fermentao etanlica por S. cerevisiae concluram que quando o nmero de clulas da levedura foi superior ou ao menos igual ao da bactria, o crescimento do contaminante foi inibido. Entretanto, o rendimento etanlico e a viabilidade da levedura diminuram em at 22% e 45%, respectivamente, quando o nmero de clulas de Lactobacillus fermentum ultrapassou o de S. cerevisiae.

2.2. Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae

2.2.1.Consumo do substrato A sacarose, principal substrato utilizado na produo etanlica no Brasil, hidrolisada primeiramente em glicose e frutose pela invertase periplasmtica (-D-fructofuranoside fructohydrolase, E.C.3.2.1.26) (ZECH e GRISH, 1995) produzida pela prpria levedura. Atravs do processo de difuso facilitada da membrana do microrganismo por permeases (CARTWRIGHT et al., 1989), tais acares fosforilados podem fazer parte da via Glicoltica. Segundo CHAPMAN e BARTLEY (1968), as enzimas respiratrias das leveduras so inibidas a partir de 2 g/L de glicose no meio, o que torna a fermentao a principal via de degradao do acar, mesmo em condies aerbias. Tal inibio denominada Efeito Crabtree (WEUSTHUIS et al., 1994). A fermentao etanlica com acares em concentraes excedentes a 27% (p:v) so lentas e poucos sacardeos so convertidos em acares (BAFRNCOV et al., 1999). Altas concentraes de acares no mosto fermentativo so responsveis pela parada ou diminuio da fermentao devido ao aumento da presso osmtica e da alta toxicidade do etanol para as clulas de leveduras (BISSON e BUTZKE, 2000; MALACRIN et al., 2005). Segundo OLIVA-NETO (1990), a conduo pelo processo

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de batelada alimentada permite evitar o efeito inibidor do acar na fase inicial da fermentao.

2.2.2. Trealose A trealose um dissacardeo constitudo por duas unidades de glicose com ligao no carbono anomrico, dessa maneira, no redutora. (LELOIR e CABIB, 1953, apud PANEK, 1991). Segundo a literatura, a trealose um carboidrato de reserva e de proteo das leveduras em situao de estresse como temperatura elevada, toxicidade do etanol, desidratao celular e aumento da presso osmtica; sendo esta acumulada em presena de oxignio, em baixas concentraes de acares, como quando h exausto da glicose no meio durante a fase de diauxia (PANEK, 1975a; CROWE et al., 1984; THEVELEIN, 1984; HOTTINGER et al.,1987; PANEK et al.1990; ALCARDE e BASSO, 1997). De acordo com MACKENZIE et al. (1988), a resistncia de leveduras presso osmtica foi acompanhada por acmulo de trealose. SHARMA (1997) mostrou que a exposio de Saccharomyces cerevisiae concentraes estressantes de NaCl estimulou o acmulo de trealose na levedura e aumentou sua resistncia ao etanol. Leveduras provenientes de trs destilarias de produo artesanal de cachaa revelaram capacidade de produzir invertase e acumular trealose na presena de glicose, alm disso, foi observada uma forte relao entre o acmulo de trealose intracelular e a viabilidade celular (PATARO, 2002). A anlise do teor da trealose produzida pela levedura mostra ser um eficiente parmetro para verificao do nvel de estresse em que esta submetida.

2.2.3. Efeito antagnico do cido ltico Segundo OLIVA-NETO (1995), a ao inibitria de cidos orgnicos sobre as leveduras depende da concentrao do cido e da levedura usada no processo fermentativo, do sinergismo com outros produtos e a presso osmtica do meio. Existe uma ampla classe de cidos que causa danos fermentao etanlica, como cido actico, propinico, butrico, isobutrico, valrico (SAMSOM, 1955), frmico, ltico (MAIORELLA et al., 1983), octanico e decanico (LAFON-

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LAFOURCADE et al., 1984; VIEGAS et al., 1989; VIEGAS e S-CORREIA,1997). Entretanto, o cido ltico destaca-se frente aos outros cidos durante a contaminao pelas bactrias lticas que so muito freqentes nos processos fermentativos industriais (OLIVA-NETO, 1990; HALM, 1993; HYNES et al., 1997; NOBRE, 2005). Segundo MAIORELLA et al. (1983), os cidos actico, frmico e ltico tm o efeito inibitrio por interferncia qumica das funes de manuteno das clulas. O cido ltico possui uma hidroxila extra, caracterizando-se assim, por uma menor solubilidade aos lipdeos em relao aos outros dois citados e sua propriedade inibitria ocorre em concentraes mais elevadas, na faixa de 10-40 g/L. DAESHEL et al. (1988), utilizando espcies de Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces rosei junto a Lactobacillus plantarum como contaminante, durante uma fermentao com suco de repolho, estabeleceram concentraes inibitrias de cido ltico para o crescimento celular a partir de 2g/L. OLIVA-NETO e YOKOYA (1994) constataram que aps o 15 ciclo de um processo fermentativo, a eficincia alcolica sofreu uma marcante inibio quando o cido ltico ultrapassou 6 g/L e o nmero de bactrias contaminantes tornou-se maior que 1,2 x 109/ mL. CASSIO et al. (1987) demonstraram o processo ativo simultneo do prton-lactato para o acmulo de lactato no interior da clula de S. cerevisiae, na proporo 1:1. Segundo os mesmos autores, a taxa de acmulo do referido nion no interior da clula depende da oscilao do pH fora e dentro da clula. Permeases tambm foram citadas como envolvidas no processo de transporte ativo do lactato. (CASSIO et al., 1987; NARENDRANATH et al., 2001). Contrariamente, a forma no dissociada do cido ltico atravessa a membrana plasmtica por difuso passiva. No interior da clula, a forma no dissociada do cido ltico se ioniza, pois o pH intracelular em torno de 6,0 a 7,0 e o pKa do cido ltico igual a 3,86 causando, assim, a acidificao do citosol. Com o acmulo de H+ intracelular, a H+-ATPase intensifica sua atividade para expulsar estes prtons (HOLYOAK et al., 1996). O aumento da atividade de H+-ATPase em funo da acidificao interna resultar em uma significante diminuio da energia necessria para o crescimento da levedura e outras funes metablicas essenciais (BRUL e COOTE, 1999) e com o tempo no ser possvel a manuteno do pH intracelular levando a diminuio do crescimento e finalmente a morte celular (HALM et al., 2004).

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De acordo com NGANG et al. (1989), a presso osmtica do meio e a quantidade do inculo exerceram influncia no grau de toxicidade do cido ltico, durante o cultivo em melao de beterraba para a produo de lcool. Nos testes que havia maior presso osmtica, 2,5 g/L foram suficientes para causar uma inibio na taxa especfica de produo de etanol. Entretanto, em mostos com baixa presso osmtica, com at 10 g/L de cido ltico, o aumentaram da taxa especfica de produo do lcool. O aumento do inculo de levedura amenizou o efeito txico do referido cido.

2.2.4. Efeito txico do etanol O etanol pode tornar-se txico para a clula de levedura. (GHOOSE e TYAGI, 1979; BEAVEN, 1982; LEO e van UDEN, 1982). A tolerncia a altas concentraes de etanol dependente da linhagem, sendo que para a maioria das linhagens tolerantes a concentrao mxima de etanol que permite o crescimento de 10% (p:v) e que proporciona a produo de etanol no mximo de 20% (p:v). (JONES et al., 1981). As enzimas hexoquinase e a lcool desidrogenase so mais sensveis a grandes concentraes de etanol (CASEY e INGLEDEW, 1976; SHARMA e TAURO, 1987). MILLAR et al. (1982) consideraram a invertase, frutose-1,6-bifosfato aldolase e piruvato descarboxilase as mais sensveis enzimas. Segundo ZECH e GRISCH (1995), a invertase de Saccharomyces cerevisiae sofre inativao de at 100% quando submetida a altas concentraes de lcool (acima de 8% v:v) e concentraes de NaCl ocorrida no meio industrial com o melao, sendo esta condio reversvel quando tais inibidores tm sua concentrao diminuda. O etanol no se concentra no interior da clula de Saccharomyces cerevisiae (GUIJARRO e LAGUNAS, 1984, apud CARTWRIGHT, 1989). Segundo a literatura, o lugar de ao do etanol na parte fosfolipdica das membranas, onde se liga no interior hidrofbico causando enrijecimento, e conseqentemente, acarretando distrbios dos sistemas de transportes (LOREIRO-DIAS e PEINADO, 1982; LEO e van UDEN, 1982; INGRAM, 1985). Alm disso, diminui a capacidade de seletividade da membrana plasmtica, permitindo a sada de constituintes celulares e a entrada passiva de prtons, reduzindo assim, o potencial de membrana e por fim interferindo em

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todos os sistemas que requeiram fora protomotiva. Tal descontrole celular acaba resultando em deficincias nutricionais, o que intensifica a inibio alcolica (CASEY et al., 1984; DOMBEK e INGRAM, 1986). O etanol inibiu de forma no competitiva o transporte de maltose e glicose atravs da membrana plasmtica (LEO e van UDEN, 1982; LOUREIRODIAS e PEINADO, 1982 ) de Saccharomyces cerevisiae. Oxignio molecular (ANDREASON e STIER, 1954, BUTTKE et al., 1980, BUTTKE e PYLE, 1982) e lipdeos tm sido acrescentados em processos fermentativos para a manuteno da atividade de altas taxas de rendimento alcolico, uma vez que a produo de cidos graxos insaturados fica comprometida em anaerobiose (THOMAS et al., 1978, BEAVAN et al., 1982, CASEY et al., 1984). Foi observada uma melhora do metabolismo da levedura durante a fermentao quando se adicionou colesterol de membranas de mamferos (CHIN et al., 1984).

2.2.5. Efeito inibitrio do sulfito Sulfito de sdio no processo industrial incorporado no melao-decana na faixa de 200 a 700 mg/L (OLIVA-NETO e YOKOYA, 2001), formando algumas vezes mostos com at 300 mg SO2/L, especialmente quando envolve a presena de caldo sulfitado da fbrica de acar. Segundo a literatura, o dixido de enxofre uma substncia muito reativa e sua ao inibitria est diretamente relacionada com o pH, j que caracterizase por duas constantes de dissociao. Entre os valores de pH mais baixos coexistem as formas bissulfito (HSO3-) e dixido de enxofre (SO2), com pK1 = 1,77, enquanto entre valores de pH 5,0 e 9,0, h uma composio mista de bissulfito e sulfito (SO3-2), sendo o pK2 = 6,9. Uma vez que o pH da fermentao cido, parte do sulfito encontra-se na forma mais txica (SO2) na ausncia de oxignio. O SO2 transportado para o interior da clula, entretanto, converte-se nas outras duas formas, devido o ambiente ser caracterizado pelo valor de pH prximo a 6. (CARR et al., 1976; ANACLETO e van UDEN; 1982, CARTWRIGHT et al. 1989). O bissulfito pode formar cidos hidroxisulfnicos pela reao com grupos carbonlicos de aldedos, cidos orgnicos e outros (HARADA et al., 1968, apud WARTH, 1985). Segundo CARR et al. (1976), compostos como acetaldedo-bissulfito

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so bactericidas. HARADA et al.(1968) observaram que o bissulfito ao reagir com o acetaldedo bloqueia a regenerao do NAD requerido pela gliclise em leveduras. Segundo ALVES (1994), BASSO (1991) constatou que na adio de 100 mgSO2/L na forma de NaHSO3, 40% de tal substncia reage com componentes do mosto e apenas 45% do acetaldedo terico pode ser detectado. Em tal experimento ocorreu uma diminuio da eficincia fermentativa e do crescimento celular. BRECHOT et al.(1969) verificaram a inibio de 30 a 40% na fermentao e de 40 a 80% na respirao por adio de sulfito no mosto. Maiores teores de metabissulfito, na produo de etanol combustvel a partir da beterraba, foram responsveis por diminuio na produtividade alcolica e queda na viabilidade celular. (GIBBONS e WESTBY, 1987). GUTIERREZ (1988), entretanto, verificou que na presena de 219 mg de SO2/L de meio de melao no alterou a produo de etanol a pH 4,0, havendo diminuio de lcoois superiores e elevao no teor de acetaldedo. ALVES (1994) chegou a concluso que a presena de sulfito no mosto fermentativo pode ser benfica se este atuar como bactericida, pois segundo tal autora a contaminao pelo microrganismo causa maiores danos ao rendimento alcolico. OLIVA-NETO e YOKOYA (2001) concluram que o CMI (Concentrao Mnima Inibitria) para o sulfito de sdio, em pH 4,5, foi na faixa de 10-40 g/mL para bactrias lticas, j para a levedura o CMI foi de 5000 g/mL, nas mesmas condies. Em pH 6,5 o valor do CMI para a levedura foi o mesmo, entretanto, para as bactrias lticas este ficou na faixa de 312-625 g/mL, mostrando ser mais eficiente para estas na faixa de pH 4,5. ANACLETO e van UDEN (1982) estudaram a cintica de morte celular em funo da elevao da concentrao do sulfito e da temperatura. Tais pesquisadores propuseram atravs de um modelo cintico da morte celular que existe dois stios na superfcie da membrana que esto envolvidos com o grau de toxicidade do sulfito. O primeiro SDD (provavelmente uma protena), teria alta afinidade pelo SO2, funcionando como um catalisador e diminuindo a energia de ativao para a termodesnaturao ou ativao da ATPase. O segundo stio de ligao seria o EM (certamente uma protena ou at outra regio da protena de SDD), que em presena do dixido de enxofre, aumentaria a entropia do processo, induzido pela ocupao do primeiro stio. A morte celular ocorre quando h a saturao dos dois stios.

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Os nveis de ribonucleosdeos fosfatos de leveduras sofrem um drstico decrscimo na presena de 2mM de SO2 a pH 3,6. A atividade de ATPase aumentada com 1mM de SO2. (MAIER et al., 1986). 2.2.6. pH e a atividade de H+-ATPase Um fator muito importante para a produo etanlica o potencial hidrogeninico do meio, tanto para o crescimento da levedura, taxa de fermentao e formao de produtos, quanto para o controle da contaminao bacteriana (ALVES, 1994). As bactrias so menos resistentes ao pH baixo e tem menor velocidade de crescimento que as leveduras em tal situao. Enquanto que para as bactrias lticas o pH ideal na faixa de 6,0, a levedura S. cerevisiae apresenta um bom rendimento na produo alcolica em pH acima de 3,8 (KANDLER e WEISS, 1986). Segundo SOUZA et al. (2001), a enzima H+-ATPase da membrana plasmtica de S. cerevisiae controla um importante processo fisiolgico. Atravs da Bomba de prtons, tal enzima regula o pH intracelular e promove a fora motora para a elevao de nutriente. Uma marcante caracterstica desta enzima o fato desta ser ativada em presena de glicose que causa a acidificao interna aumentando o nvel de sua atividade em clulas de leveduras (BECHER DOS PASSOS et al., 1992; SOUZA et al., 2001). A levedura para evitar que seu pHi se torne muito cido, libera H+ para o meio externo atravs da ativao de H+-ATPase, alm de absorver K+ e aminocidos bsicos, excretar cidos orgnicos e liberar gs carbnico. (CONWAY e BRADY, 1950; COOTE e KIRSOP, 1976). A H+-ATPase plasmtica sofre alteraes conformacionais em funo de H+ (BLANPAIN et al., 1992), assim em pH igual a 4,0 triplica sua atividade, dobrando a afinidade por ATP, sem porm, causar mudanas no pH timo (6,0) (ERASO e GANCEDO, 1987). Quando o pH diminui de 6 para 3, existe um aumento da sensibilidade da levedura ao etanol (GAO e FLET, 1988), dissipando a fora protomotiva da membrana. Quando a clula sofre um dano metablico a H+-ATPase presumivelmente a ajuda ativando a fora proto-motora atravs da membrana plasmtica com o gasto de ATP. A acidificao intracelular ocorre na presena de

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estressores que afetam a organizao da membrana plasmtica. (VIEGAS e SCORREIA, 1991; ALEXANDRE et al., 1996; CARMELO et al., 1997; VIEGAS et al., 1998; FERNANDES et al., 1998). Etanol (ROSA E S-CORREIA, 1991), cidos octanico, decanico (VIEGAS e S-CORREIA, 1997), succnico, actico (CARMELO et al., 1997), cinmico (CHAMBEL et al., 1999), pH cido (ERASO e GANCEDO, 1987), escassez de fonte de nitrognio (BENITO et al., 1992) e temperaturas supra-timas (VIEGAS et al., 1995) estimulam in vivo a atividade de H+-ATPase da levedura. Segundo alguns pesquisadores, a ativao desta enzima no pode ser atribuda sua sntese e sim a alteraes ps-traduo desta protena, uma vez que o nmero total de enzima diminui em condies de estresse e sua atividade aumenta. (VIEGAS et al., 1995; CARMELO et al., 1997). Esta ativao de ATPase pode ser causada, ao menos em parte, pela alterao na poro lipdica da membrana plasmtica que modifica a disposio de suas enzimas contribuindo para o maior contato com seu substrato (VIEGAS et al., 1995; CARMELO et al., 1997). CHANG e SLAMAN (1991) mostraram uma correlao entre a fosforililao da glicose e a ativao de H+- ATPase. Segundo estes autores, o mecanismo de ativao de H+-ATPase da levedura durante situaes de estresse ainda no est totalmente esclarecido.

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3. OBJETIVO

3.1. Objetivo Geral Avaliao do estado fisiolgico e metablico da levedura Saccharomyces cerevisiae durante diferentes condies de estresses sinrgicos que so comuns ao processo de fermentao industrial de lcool, atravs de diferentes parmetros analticos, buscando aprimoramento em tcnicas de controle do processo.

3.2. Objetivos especficos 1) Verificao dos efeitos sinrgicos de estresse do cido ltico, sulfito, teor alcolico e pH, durante o processo fermentativo das duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae - PE-2 e M-26. 2) Investigao dos efeitos sinrgicos de estresse causado pelo tratamento cido na presena de cido ltico, sulfito, etanol e pH, durante o processo fermentativo do microrganismo estudado.

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3) Identificao o pH timo para o metabolismo da levedura durante fermentaes com alto grau de estresse. 4) Verificao do efeito do pH do mosto junto ao tempo de tratamento cido no metabolismo de S. cerevisiae PE-2 e rendimento etanlico, durante o processo fermentativo com contaminao de L. fermentum CCT 1396.

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4. MATERIAL E MTODOS

4.1. Material

4.1.1. Microrganismos As fermentaes foram conduzidas com duas linhagens de Saccharomyces cerevisiae. A linhagem Pedra-2 (PE-2) fornecida pelo Departamento de Cincia e Tecnologia Agroindustrial da ESALQ- USP- Piracicaba/ SP. Esta linhagem foi isolada da Usina da Pedra, localizada no municpio de Serrana, Estado de So Paulo, e apresenta capacidade de permanncia no processo e resistncia aos estresses causados pelas condies existentes em unidades industriais de produo de etanol (CHERUBIN, 2003). A linhagem S. cerevisiae M-26, isolada por pesquisadores do Laboratrio de Bioqumica e Microbiologia da FCLA-UNESP- Assis/ SP da Usina Nova Amrica, Municpio de Tarum, Estado de So Paulo e usada em processos industriais alm de apresentar, in vitro, atividade bacteriosttica para o Lactobacillus fermentum, podendo esta estar atribuda maior produo (do que outras leveduras) de cidos orgnicos como o succnico e o tartrico (OLIVA-NETO et al., 2004). A linhagem Lactobacillus fermentum CCT 1396, isolada de uma destilaria de lcool com srios ndices de contaminao (OLIVA-NETO e YOKOYA,

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1994), foi utilizada como um contaminante padro durante a conduo de alguns processos fermentativos. Tais leveduras e bactria encontram-se armazenadas -75oC, respectivamente, em Ependorfes com meios YM (com 10% de glicerol - Labsynth) a pH 5,0 e MRS (MAN, RAGOSA e SHARP; com 10% de glicerol) em pH 6,0, no Laboratrio de Bioqumica e Microbiologia da FCLA.

4.1.2. Meios de cultivo e fermentativo _ Meio de cultivo para as leveduras: Meio Formulado: sacarose 2% (Difco P.A.), extrato de levedura 1% (Difco), sulfato de amnia 0.1% (Labsynth), Fosfato bipotssico3H2O 0.1140% (Labsynth), Sulfato de magnsio 7H2O 0.024% (Labsynth), Sulfato de mangans H2O 0.00104% (Labsynth), Sulfato de zinco 7 H2O 0.0028% (Labsynth) (pH 5.0). _ Meio de cultivo para as bactrias: MRS (pH 4,5 e pH 6,0). _ Meio fermentativo: mesma composio bsica do Meio Formulado, variando quanto concentrao de acar, cido ltico, sulfito e pH como descrito no prximo item 4.2.

4.2. Condies de cultivo

4.2.1. Multiplicao dos microrganismos A obteno do inculo para os processos fermentativos das linhagens Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26 foi feita de forma assptica atravs de seus sucessivos cultivos no Meio Formulado em tubos de cultura e posteriormente em Erlenmeyers temperatura de 30oC, sob agitao constante de 135 rpm (Agitador orbital com refrigerao -Tecnal) por 24 h. Aps atingirem a concentrao celular desejada no cultivo, as leveduras foram centrifugadas (centrfuga refrigerada - Fanen) durante 25 min 3500 x g. Assim como a produo do inculo das leveduras para o processo fermentativo, o de Lactobacillus fermentum CCT 1396 foi obtido atravs de seu cultivo sucessivo em meio estril em MRS, incubado a 30oC na estufa bacteriolgica (Tecnal). Aps 3 sucessivas inoculaes de 0,1 mL da bactria em tubos de cultura com 6mL de

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meio MRS (pH 6,0), a primeira com 72 h de crescimento e as demais com 48 h, a inoculao passou a ser feita em meio MRS com o valor de pH igual a 4,5. A bactria s pde ser centrifugada e utilizada no processo fermentativo quando houve maior adaptao desta com o meio cido.

4.2.2. Processos fermentativos

4.2.2.1. Verificao dos fatores sinrgicos de estresse Estas fermentaes permitiram avaliar os efeitos sinrgicos de diferentes fatores de estresse e identificaram qual deles foi o mais relevante. Para a conduo dos processos fermentativos foram pesadas 27 g de biomassa mida das leveduras (M-26 e PE-2) e cada uma destas suspensas em 75 mL de gua destilada em Erlenmeyers. Tais clulas foram alimentadas sob condies estressantes com mostos fermentativos semi-sintticos, os quais simularam o mosto com o melao. A TABELA 1 mostra como foram conduzidas as fermentaes com alto grau de estresse, que tiveram seus respectivos pHs ajustados com NaOH (5M) durante todo o processo. Para tanto, junto aos componentes e condies relacionados na TABELA 1 foram adicionados aos mostos: sacarose a 16,4 ou 20,6% (w/v) (ajustada para a converso etanlica a 7,5 ou 9,5%, respectivamente) como fonte de carboidrato, e os demais componentes do Meio Formulado (item 4.1.2.), fermentao representando "in vitro" uma

no sistema de batelada alimentada. As leveduras foram alimentadas

TABELA 1: Formulao do meio fermentativo com fatores de estresse: etanol, cido ltico, sulfito e pH a uma temperatura de 32oC.

______________________________________________________________________ sulfito (mg/L) cido ltico etanol pH toxicidade M (meio) (NaHSO3) (g/L) (% p:v) _______________________________________________________________________ 1 200 6,0 9,5 3,6 mxima 2 50 6,0 9,5 3,6 menos sulfito 3 200 2,0 9,5 3,6 menos c. lt. 4 200 6,0 7,5 3,6 menos etanol 5 200 6,0 9,5 4,5 pH normal 6* 0 0 7,5 4,5 _____

__________________________________________________________________ * M6 = controle

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com 15 mL de mosto nos tempos 0; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 e 9h de fermentao. O processo foi interrompido aps 12 h. As leveduras foram centrifugadas (centrfuga refrigerada Fanen) a 4000 x g por 30 min e as amostras do vinho delevurado foram congeladas para anlises posteriores. O mesmo procedimento de processo fermentativo foi repetido por mais 6 ciclos. Cada experimento das fermentaes em meios semi-sintticos foi conduzido em triplicata, junto ao controle onde no existiu condies estressantes. 4.2.2.2. Efeito do tratamento cido associado a outros fatores de estresse fermentativo para a linhagem S. cerevisiae PE-2. Apenas a linhagem PE-2 foi utilizada nesta segunda etapa do experimento por ser mais usada no processo industrial. Para tanto, foram pesadas 27 g de biomassa mida de levedura e esta suspensa em um volume de 75 mL com gua destilada. A alimentao desta foi feita sob condies estressantes com meios fermentativos semi-sintticos. A TABELA 2 mostra como foram conduzidas as

fermentaes, junto aos componentes e condies relacionados foram adicionados aos

TABELA 2: Mostos com alto grau de estresse utilizados na fermentao a 32oC de S. cerevisiae PE-2, a qual foi submetida ao tratamento cido por 45 min., pH 2,0.

____________________________________________________________________________ sulfito (mg/L) cido ltico etanol pH cido M (NaHSO3) (g/L) (% p:v) sulfrico (Meio) (g/75mL) ____________________________________________________________________________ 1 0 0 7,5 4,5 0,158 (controle) 2 200 6,0 9,5 3,6 0,110 3 390 6,0 9,5 4,5 0,170 4 200 6,0 9,5 4,5 0,167 ____________________________________________________________________________

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mostos: sacarose a 16,4 ou 20,6% (p:v) (ajustada para a converso etanlica a 7,5 e 9,5% p:v, respectivamente) como fonte de carboidrato, e os demais componentes do Meio Formulado, representando "in vitro" uma fermentao no sistema de batelada alimentada. A levedura foi alimentada da mesma forma descrita no item anterior. O processo foi cessado aps 12 h. A levedura foi centrifugada (centrfuga refrigerada Fanen) a 4000 x g por 30 min e as amostras obtidas de cada vinho delevurado congeladas para anlises posteriores. O mesmo procedimento do processo fermentativo descrito foi repetido por mais 6 ciclos. O tratamento cido foi feito a partir do 1o ciclo fermentativo, com cido sulfrico a 2N at a soluo de levedura atingir pH 2,0 durante 45 min, sob agitao de 70 rpm a 30 C em um agitador orbital refrigerado. Aps o tratamento cido, a correo de pH do fermento foi feita com a adio do mosto e de NaOH 2N at o pH desejado. Cada experimento das fermentaes em meios semi-sintticos foi conduzido em triplicata, junto ao controle onde as condies estressantes se restringiram apenas ao tratamento cido.

4.2.2.3. pH timo fermentativo em condies de fatores de estresse associados O processo de fermentao e obteno das amostras foi o mesmo utilizado nos itens 4.2.2.1. e 4.2.2.2. para a linhagem PE-2 com as devidas alteraes descritas na TABELA 3, havendo a correo peridica de pH do mosto fermentativo com NaOH 2N. Nestes experimentos no se fez o tratamento cido.

TABELA 3: Mostos com alto grau de estresse que foram utilizados na fermentao de S. cerevisiae PE-2, a 32 C para a verificao de pH timo.

______________________________________________________________________ sulfito (mg/L) cido ltico etanol pH Meio (NaHSO3) (g/L) (% p :v) ______________________________________________________________________ 1 0 0,0 7,5 4,5 (controle) 2 200 6,0 9,5 3,5 3 200 6,0 9,5 4,0 4 200 6,0 9,5 5,0 ___________________________________________________________________

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4.2.2.4. Efeito do tratamento cido e pH dos mostos durante a fermentao mista com S. cerevisiae PE-2 e L. fermentum CCT 1396 Foram pesados 27 g (~ 8 x 108 clulas/mL) de biomassa mida da levedura PE-2 mais 1g (~ 3 x 108 clulas/mL) de biomassa mida da bactria e estas suspensas em um volume de 75 mL com gua destilada. A alimentao da levedura mais a bactria foi feita com o Meio Formulado descrito no item 4.1.2., o qual reproduziu o mosto com o melao. Entretanto, a concentrao de sacarose inicial foi de 16,4% (p:v). A TABELA 4 mostra como foi conduzido o tratamento cido do

fermento. A alimentao foi feita com 30 mL de mosto nos tempos 0; 2; 4; 6 e 8 h de fermentao. O processo, aps sucessivas correes de pH do mosto com NaOH (2N), foi interrompido com 10 h de fermentao. A cultura mista foi centrifugada (centrfuga refrigerada Fanen) a 4000 x g por 30 min, tratada com cido sulfrico, o vinho delevurado congelado para anlises posteriores e o processo fermentativo foi repetido por mais 6 ciclos. O tratamento cido foi feito a partir do final do 2o ciclo fermentativo, com cido sulfrico 2N at a soluo de levedura atingir pH 2,5 durante 1 ou 2 h, sob agitao de 70 rpm, a 30 C, em um agitador orbital refrigerado.

TABELA 4: Tempo de tratamento cido* e o pH dos mostos durante os processos fermentativos de S. cerevisiae PE-2 e L. fermentum CCT 1396 a 32o C.

______________________________________________________________________ Tempo de pH do mosto Tratamento tratamento fermentativo cido da levedura (h) ______________________________________________________________________ 1 0 3,8 (controle) 2 2 4,8 3 1 4,8 4 2 3,8 5 1 3,8 ___________________________________________________________________* pH = 2,5. Foram usadas em mdia 1,5mg /mL de cido sulfrico durante o tratamento.

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Aps o tratamento cido, a correo do pH do fermento foi feita com a adio do mosto e de NaOH 2N at o pH desejado. Cada experimento das fermentaes em meios semi-sintticos foi conduzido em triplicata, junto ao controle que no foi submetido ao tratamento cido.

4.3.Tcnicas Analticas

4.3.1.Tcnicas analticas para a anlise microbiana

4.3.1.1. Determinao da biomassa seca Para o clculo da biomassa seca foram feitas suspenses de clulas puras das linhagens estudadas, lavadas em soluo EDTA (0,015M) e gua destilada e, ao final, centrifugadas. O material centrifugado foi depositado em placa de Petri (previamente pesada em balana analtica Tecnal, Mod. AG 200), sendo seco em estufa (Tecnal-Mod. TE 394/1) a 105C, at que atingisse um peso constante. (AOAC, 1975).

4.3.1.2. Viabilidade e brotamento das leveduras A porcentagem de brotamento e de clulas vivas (viabilidade) em relao ao total de clulas foi determinada atravs do microscpio ptico em cmara de Neubauer. Para tanto, as clulas de leveduras foram coradas com soluo eritrosina (diluio 5000 X), sendo tomado como parmetro, amostras do final de cada ciclo fermentativo. Os resultados foram dados em porcentagem de clulas vivas (clulas descoradas) e porcentagem de brotos vivos (descorados) em funo do nmero total de clulas contadas.

4.3.1.3. Contagem de leveduras e bactrias A contagem de clulas totais foi determinada atravs do microscpio ptico em cmara de Neubauer, sendo tomado como parmetro, amostras do final de cada ciclo fermentativo. A equao abaixo representa o clculo para obteno do nmero de clulas por mL:

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Nmero de clulas = Mdia de 5 x 25 x 104 x F,

onde F = fator de diluio.

4.3.1.4. Contagem de clulas viveis de bactrias O cultivo em placas para a contagem das Unidades Formadoras de Colnia (UFC/mL) da bactria foi realizado atravs da tcnica de semeadura em profundidade (SPECK, 1978), utilizando o meio MRS-gar com 10 ppm de actidiona para inibio do crescimento da levedura. Antes do plaqueamento, 1 mL de cada amostra coletada ao final do 3, 5 e 7 ciclos foi diludo de forma seriada decimal em tubos de cultura com 9,0 mL de gua peptonada (0,1%) esterilizada. As placas foram incubadas a 32 C por 48h para o crescimento e posterior contagem das colnias de bactrias. A UFC/ mL foi determinada multiplicando-se o total de colnias contadas pelo fator de diluio.

4.3.1.5. Produo de biomassa seca Ao final do 3o, 5o e 7o ciclos fermentativos foi feita a medida da massa mida da cultura mista estudada, e em seguida feita a converso para a biomassa seca.

4.3.1.6. Determinao da acidez total expressa em cido ltico A quantia de 5mL de uma amostra foi completada para 50 mL com gua destilada e, em seguida, titulada com hidrxido de sdio a 0,1 N at a mudana para a colorao rosa (pH 8,3) (mtodo AOAC 22038-22039, 1984). Para a padronizao de NaOH foi usado o biftalato de potssio (dessecado a 120o C/ 2 horas antes de usado). O clculo da acidez foi feito atravs da seguinte equao:

Acidez total = V NaOH 0,1N (mL) x 9,008 x fator de correo NaOH __________________________________________ ; volume da amostra (mL) sendo a Acidez total expressa em g de cido ltico/ L.

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4.3.1.7. Quantificao e identificao dos cidos orgnicos A quantificao e identificao dos cidos orgnicos presentes nas amostras coletadas dos processos fermentativos descritos no item 4.2.2.1 foram determinadas atravs da anlise por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE- SHIMADZU), sendo esta constituda por uma Bomba (LC-10AD), forno para a coluna (CTO-10AVP), de um detector UV (SPD-10A), uma coluna (SCR 101 H), uma pr-coluna (SCR-H) e o mdulo de comunicao CBM 101. Para a referida anlise, um sistema composto por cido perclrico (Merck) diludo a 10mM em gua ultrapurificada (pH = 2,0) foram usados como solvente e a velocidade de fluxo em 1,2 mL/min, com temperatura a 50oC, o comprimento de onda do detector a 210 nm com atenuao de 6x. O volume da injeo foi de 20 L e o tempo para cada anlise foi de 9 min. A padronizao externa foi feita atravs de uma curva padro com cidos: acontico, ctrico, tartrico, mlico, succnico, ltico e actico.

4.3.1.8. Clculo da atividade da Bomba de prtons Segundo SERRANO (1980), a atividade da Bomba de prtons est diretamente relacionada com a atividade de H+-ATPase na clula, desta maneira, neste trabalho foi usado somente o primeiro mtodo de anlise como uma forma de quantificao indireta da atividade da referida enzima. Para tanto, as clulas das leveduras Saccharomyces cerevisiae PE-2 e S. cerevisiae M-26 que foram submetidas a condies estressantes durante os processos fermentativos, tiveram sua atividade da Bomba de prtons quantificada atravs do mtodo utilizado por SERRANO (1980) adaptado por SOUZA et al. (2001) com algumas alteraes. Para tal procedimento, clulas de levedura aps a fermentao (3o, 5o e 7o ciclos) foram coletadas por centrifugao a 1000 g (centrfuga Fanen) por 10 minutos e lavadas 2 vezes em gua destilada. Foi pesada 0,4 g dessas clulas, coletando-as em 2 bqueres de 5 mL, contendo 4,5 mL de tampo Tris/ HCl/ KCl 100 mM pH 4,5. No primeiro bquer foi adicionado 0,5 mL de gua destilada e a suspenso de clulas foi homogeneizada, acompanhando a estabilizao do pH (pHmetro-Tec-2). Em seguida, foram adicionados 10 L de HCl (100 mM), acompanhando-se a variao do pH por 2 minutos e meio, cujos valores foram anotados de 30 em 30 segundos (controle). No outro bquer, aps

28

estabilizao do pH, foi adicionado 0,5 mL de glicose (1 M) acompanhando-se a variao do pH por 10 minutos. Ao final de cada experimento fez-se a massa seca. Para o clculo da extruso de prtons foram feitos 2 grficos (um com os dados obtidos das clulas que estavam no primeiro bquer e o outro com os dados das que estavam no segundo) para cada amostra, onde se calculou a variao de pH e do tempo atravs da seguinte frmula:

moles H+/ h/ g =

X 60 y cm / cm _____________________________________ x cm X massa seca em g

sendo; _ y cm = variao de pH dada em cm em funo da adio de glicose; _ cm = variao de pH em cm aps a adio de 1 Mol H + (controle); _ x cm = tempo referente variao do pH em cm convertido por escala em minuto; _ multiplicado por 60 para converso em hora; _ dividido pela massa seca para obter o resultado em g.

Como os experimentos fermentativos descritos no item 4.2.2.4. foram feitos atravs de cultura mista, primeiramente obteve-se o grfico de acidificao do meio atravs da adio de glicose para uma anlise prvia do comportamento da levedura e bactria em culturas puras frente atividade da Bomba de prtons.

4.3.1.9. Determinao da trealose A trealose endgena das leveduras foi quantificada atravs da reao com antrona (P.A. Merck) em meio com cido sulfrico (P.A. Merck ), aps a extrao seletiva com cido tricloroactico a 0oC, de acordo com o mtodo descrito por THEVELEIN (1984), sendo dosada em mg/ 100 mg de massa seca. O clculo da trealose foi feito na biomassa das leveduras estudadas antes da fermentao (Tempo 0) e aps o 7o ciclo fermentativo.

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4.3.1.10. Determinao da protena residual A quantificao protica foi feita atravs do mtodo adaptado de LOWRY (1951), onde 1 mL da amostra diluda foi incubado com 0,9 mL da soluo A por 10min a 50 C. Acrescentou-se 0,1 mL da soluo B mais 3 mL da soluo de Folin (diluio 1/15), a 50 C por mais 10 min. Para o branco foi utilizado 1 mL de gua destilada e feito o mesmo procedimento descrito acima. Foi feita uma curva padro com a casena (Merk) e assim obtida a equao da reta. Fez-se a leitura das amostras no espectrofotmetro (Amersham Pharmacia BIOTECH/ ABSE-75184) a 650 nm.

4.3.1.11. Determinao de Acares Redutores Residuais Totais (ARRT) Primeiramente foi feita a hidrlise cida da amostra (diluda 90X) misturando 1mL desta com 1mL de HCl a 2N, aquecendo-se durante 10 minutos a 100oC. Aps o resfriamento foi adicionado 1mL de NaOH a 2N para a neutralizao da soluo. Em seguida determinado o ARRT pelo mtodo de SOMOGYI e NELSON (1944). Simultaneamente, foi feita uma curva de calibrao para dosagens conhecidas de glicose (P.A. Labsynth). A leitura em espectrofotmetro foi feita a 535nm. Os resultados foram expressos em porcentagem.

4.3.1.12. Determinao da concentrao de etanol A concentrao do etanol foi calculada por meio de um cromatgrafo gasoso (Mod. CG 37- Instrumentos CG Ltda SP), equipado e uma coluna (PAD 2499 CG- empacotada) e a leitura feita atravs de um integrador (Mod.CG 200) do mesmo fabricante. A amostra foi submetida a uma diluio de forma que se apresentava no integrador na faixa de 1 a 2 g de etanol /L. As seguintes condies para a anlise foram fixadas: temperatura da coluna igual a 96o C , temperatura de vaporizao = 150o C, temperatura de ionizao de chama = 250o C, o fluxo dos gases nitrognio e hidrognio = 30 ml/min e o volume da injeo foi de 1 L. A curva de calibrao foi feita por padronizao externa com soluo de etanol 1,5 g/L.

4.4. Clculos relacionados produo etanlica O rendimento do etanol foi calculado atravs da seguinte frmula:

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R etanlico = (M12 - M0) x 100 ___________ M terica onde, M terica = 0,511 x S0

(%)

S0 = concentrao de ART no substrato inicial (g/L) M12 = massa de etanol produzida (g) ao final de 12 h de fermentao (ou de 10h para as fermentaes de cultura mista). M0 = massa de etanol inicial (g) (tempo 0). 0,511= coeficiente de transformao de ART em etanol.

O clculo de produtividade etanlica uma grandeza cintica que expressa a velocidade mdia de produo da referida substncia, sendo calculada da seguinte forma:

Pe = (M 12 - M0) ____________ (g/ L.h) t x V

onde,

M12 = massa de etanol produzida (g) ao final de 12 h de fermentao (ou de 10 h para as fermentaes de cultura mista). M0 = massa de etanol inicial (g) (tempo 0). t = tempo de fermentao (h) V= volume (L) Pe = produtividade do etanol expressa em g/ L.h

4.5. Forma de anlise dos resultados Os experimentos foram realizados em triplicata. Os dados amostrais do 3 ao 7 ciclo fermentativo foram submetidos anlise de varincia (ANOVA) e das mdias comparadas por testes de TUKEY e KRAMER atravs do programa GRAPHPAD INSTAT (Rutgers University). O Teste-t e Teste-F foram aplicados atravs do mesmo programa quando houve necessidade de comparar mdias entre dois grupos amostrais.

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5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1. Processos fermentativos com fatores sinrgicos de estresse Estes experimentos foram realizados atravs das amostras retiradas dos processos fermentativos mostrados na TABELA 1 (p. 21). Tais fermentaes foram feitas com as linhagens de levedura S. cerevisiae PE-2 e M-26.

5.1.1.Viabilidade e brotamento Aps submeter os dados anlise de Varincia, verificou-se que os diferentes tratamentos realizados durante a fermentao alcolica das linhagens de levedura Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26 foram significativos (ANOVA, p < 0,001) para a viabilidade celular e brotamento. A FIGURA 1 mostra que o pH e a concentrao de etanol foram os principais fatores de estresse para a viabilidade celular dos dois microrganismos estudados. O pH 4,5 (Meio 5 ou M5) repercutiu em um aumento significativo (TUKEY, p < 0,05) da viabilidade de Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26, respectivamente, de at 43,5% e 31,3% em relao aos meios em que se utilizou o pH 3,6 e alta concentrao de etanol (M1, M2 e M3). A FIGURA 2 mostra as clulas da linhagem PE-2 fotografadas em um microscpio tico (aumento 400X)

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80 70 Viabilidade celular (%) 60 50 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativos

FIGURA 1: Efeito de diferentes fatores de estresse associados na viabilidade celular das linhagens de levedura Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26 aps a fermentao etanlica a 32o C. Mdias obtidas do 3 ao 7 ciclo fermentativo.M1 = 200 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L , 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M2 = 50 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M3 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M4 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M5 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 4,5. M6 (controle) = 0 mg de NaHSO3/L, 0 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH4,5.

33

aps

sua

fermentao

no

M1

e

no

M5, respectivamente. As clulas

resultantes da fermentao do M5 mostram-se visivelmente mais regulares e maiores. A concentrao etanlica estimada 7,5% (p:v) utilizada no M4 refletiu em um aumento significativo da viabilidade de Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26 de at 38% e 29%, respectivamente, em relao ao M1, M2 e M3. No existiu diferena significativa (TUKEY, p > 0,05) entre M4 e M5 para as duas linhagens estudadas, ainda que tais meios mostrem atravs da FIGURA 1 uma viabilidade significativamente (TUKEY, p < 0,05) menor que o controle M6, indicando que todos os fatores de estresse estudados atuam de forma sinrgica sobre a viabilidade, entretanto, o pH baixo e a concentrao de etanol so fatores que se sobressaem. O pH muito baixo ocasiona perda de nutrientes como nitrognio e potssio, segundo GOMES (1988), alm de aumentar a sensibilidade ao etanol, aos cidos orgnicos e ao SO2 (CARTWRIGHT et al., 1989). A toxicidade do etanol em concentrao elevada (acima de 10% p:v), limita o seu rendimento durante a fermentao industrial (WALKER-CAPRIOLO et al., 1985). Os efeitos txicos do etanol so conhecidos, e envolvem modificao na composio da camada lipdica da membrana, na sntese de protenas de choque trmico, na modulao dos processos de troca inica, to bem quanto reduo de atividades metablicas como causa da inibio do transporte de glicose, diminuindo a viabilidade, formao do produto (ALEXANDRE et al., 2001, apud MARTINI et al., 2004) e causando o estresse hdrico (HALLSWORTH, 1998). O fator de maior impacto para a taxa de brotamento das duas linhagens estudadas foi o pH. A FIGURA 3 mostra que a utilizao do M5 resultou em um brotamento celular prximo ao do controle, e cerca de 80% significativamente (TUKEY, p < 0,05) maior que o meio fermentativo de maior estresse (M1). A taxa de brotamento importante para se avaliar a renovao celular, assim, quanto maior for este parmetro a clula mostrar, provavelmente, melhores condies metablicas. No existiram diferenas significativas entre as duas linhagens de leveduras testadas quanto viabilidade celular e o brotamento, embora a PE-2 tenha mostrado uma tendncia de maiores taxas. CHERUBIN (2003), ao estudar a fermentao das mesmas linhagens de leveduras, verificou, tambm, uma tendncia da PE-2 mostrar maior viabilidade do que a M-26.

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A)

B)

FIGURA 2: A) Clulas da linhagem S. cerevisiae PE-2 aps a fermentao em M1. B) clulas da linhagem PE-2 aps a fermentao em M5.

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20 18 Brotamento celular (% ) 16 14 12 10 8 6 4 2 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativosFIGURA 3: Efeito de diferentes fatores de estresse associados na taxa de brotamento Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26 aps das linhagens de levedura o aps a fermentao etanlica a 32 C. Mdias obtidas do 3 ao 7 ciclo fermentativo.M1 = 200 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L , 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M2 = 50 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M3 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M4 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M5 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 4,5. M6 (controle) = 0 mg de NaHSO3/L, 0 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH4,5.

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5.1.2. Produo de BiomassaA FIGURA 4 mostra que houve tendncia significativa (Anova, p = 0,0002) para o aumento de biomassa aps o processo fermentativo das duas leveduras estudadas em relao ao primeiro inculo. Tal resultado est de acordo com CHERUBIN (2003), que mostrou a mesma tendncia de crescimento para as linhagens PE-2 e M-26. No existiu diferena significativa (TUKEY, p >0,05) quanto produo de biomassa entre os dois microrganismos testados. O meio controle proporcionou um aumento da biomassa seca de 45% e 28%, respectivamente, para a linhagem M-26 e PE-2 em relao biomassa seca inicial (To).

5.1.3. Acidez total expressa em cido ltico e cidos orgnicosA TABELA 5 mostra que a maior produo de cidos orgnicos totais ocorreu no M2, no qual a linhagem S. cerevisiae PE-2 e M-26 superaram em cerca de 50% o meio controle, sendo esta diferena significativa (TUKEY, p < 0,05; Teste-t, p = 0,0009). Os mostos fermentados pela linhagem M-26 apresentaram em torno de 48% a mais (Test-t, p < 0,05) de cidos orgnicos totais quando comparados aos da outra levedura, exceto para o controle (M6). Este resultado est de acordo com CHERUBIN (2003), o qual mostrou que a linhagem M-26 obteve menores valores de pH no vinho delevurado que a linhagem PE-2, sugerindo que a primeira levedura produziu mais cidos orgnicos do que a segunda. Segundo OLIVA-NETO et al. (2004) o sobrenadante obtido aps o cultivo de M-26 apresentou um certo poder bacteriosttico sobre o Lactobacillus fermentum, o que poderia ser justificado por uma maior produo de cidos orgnicos como o cido succnico junto ao etanol (BASSO et al. 1997). Atravs da FIGURA 5 foi possvel verificar uma tendncia de maior produo de cido succnico pela linhagem M-26, embora no seja significativa (TUKEY, p > 0,05). Entretanto, tal FIGURA mostra no haver uma relao positiva significativa (TUKEY, p > 0,05) entre os diferentes meios e a produo de cido ltico pela bactria contaminante do processo fermentativo das duas linhagens de leveduras estudadas.

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12 10 8 6 4 2 0 To M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativosFIGURA 4: Efeito de diferentes fatores de estresse associados na formao de biomassa seca pelas linhagens de levedura Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26 aps a fermentao, a 32 C, etanlica. Mdias obtidas do 3 , 5 e 7 ciclos fermentativos.To = incio da fermentao. M1 = 200 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L , 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M2 = 50 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M3 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M4 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M5 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 4,5. M6 (controle) = 0 mg de NaHSO3/L, 0 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH4,5.

Biomassa seca (g)/ 225 mL

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TABELA 5. cidos orgnicos* produzidos durante a fermentao alcolica, a 32o C por S. cerevisiae M-26 e PE-2 em diferentes condies de estresses. _____________________________________________________________________________ cidos orgnicos (g/ L) M1 M2 M3 M4 M5 M6

_____________________________________________________________________________ M** SD*** M SD M SD M SD M SD M SD

_____________________________________________________________________________ Acontico M-26 0.81 0.19 1.00 0.20 0.80 0.29 0.73 0.20 1.50 0.70 1.30 0.08 PE-2 0.62 0.17 0.75 0.23 0.60 0.18 0.50 0.13 1.18 0.39 0.92 0.20 Ctrico M-26 0.19 0.02 PE-2 0.09 0.06

0.26 0.23 0.12 0.12

0.10 0.07

0.11 0.10

0.19 0.23 0.03 0.04

0.00 0.00 0.03 0.06

0.08 0.05 0.03 0.14

Tartrico M-26 0.67 0.05 0.72 0.12 0.42 0.50 PE-2 0.43 0.12 0.60 0.23 0.36 0.05 Mlico M-26 5.08 PE-2 3.70

0.42 0.05 0.39 0.07

0.44 0.05 0.32 0.15

0.31 0.03 0.15 0.03

0.57 1.00

4.90 0.42 4.25 1.26

3.00 2.63

0.42 0.60

0.34 0.13 3.07 0.98

5.14 0.68 3.85 0.91

2.42 0.25 2.21 0.39

Succnico M-26 3.89 0.25 4.20 0.85 PE-2 2.86 1.03 3.12 1.04 Ltico M-26 1.39 0.44 1.55 0.21 PE-2 1.10 0.43 1.27 0.39 Actico M-26 3.18 PE-2 2.13

3.87 0.54 2.84 0.92 1.02 0.85 0.36 0.31

4.38 0.33 3.04 1.03 1.62 0.29 1.11 0.19

4.30 0.28 3.17 1.00 1.21 1.50 0.07 0.25

4.20 0.43 3.06 1.00 1.00 0.07 1.11 0.12

0.91 0.83

3.18 0.53 2.39 0.90

2.83 1.78

0.47 0.43

2.40 0.29 1.58 0.37

1.90 0.29 1.14 0.58

1.36 0.17 0.74 0.18

cidos orgnicos totais M-26 14,80 2,57 15,80 0,25 12,10 1,00 13,30 0,44 14,65 1,37 10,60 1,0 PE-2 10,90 3,68 12,30 2,60 8,50 2,00 8,10 2,90 11,00 2,27 8,04 2,0 _____________________________________________________________________________*Quantificados por CLAE. **M= Mdias obtidas do 3, 5 e 7 ciclos fermentativos. ***SD= desvio padro.

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TABELA 6: Composio mdia de acidez total (expressa em cido ltico) e cido ltico total (quantificado por CLAE) aps a fermentao, a 32 C, de S. cerevisiae M-26 e PE-2._____________________________________________________________________________________ Meios S. cerevisiae M-26 S. cerevisiae PE-2 _______________________________ ___________________________________ Acidez total cido ltico total Acidez total cido ltico total (g cido ltico /L) (g/L) (g cido ltico /L) (g/L) (CLAE) (CLAE) ___________ ___________ _________ ____________ M* DP** M DP M DP M DP _____________________________________________________________________________________ M1 9,0 0,85 7,4 1,0 8,7 0,80 7,1 0,90 M2 9,0 0,70 7,5 0,2 8,4 0,90 7,3 0,75 M3 6,7 0,45 3,0 0,4 6,1 0,50 2,8 0,47 M4 8,2 0,70 7,6 0,3 7,7 0,43 7,1 0,74 M5 5,8 0,60 7,2 0,5 5,6 0,50 7,5 0,96 M6 4,2 0,80 1,0 0,1 3,9 1,00 1,1 0,12 *M= Mdias obtidas do 3, 5 e 7 ciclos fermentativos. **DP=desvio padro.

importante observar, atravs da TABELA 6, que o mtodo de quantificao do cido ltico por CLAE no sofreu influncia dos diferentes pHs dos meios, entretanto, o mesmo no ocorreu com o mtodo de acidez total (expressa em g de cido ltico/ L), no qual se usou a titulao com NaOH. Assim, enquanto o vinho delevurado do M1 (pH 3,6) fermentado pela linhagem M-26 mostrou em sua composio 7,4 g de cido ltico/ L e do M5 (pH 4,5) 7,2 g/ L aps a anlise em CLAE, o teste de acidez apresentou os valores de 9,0 g de cido ltico/ L para o M1 e 5,8 g/ L para o M5. Dessa forma, o mtodo de quantificao por acidez no foi confivel para comparar a produo de cido ltico em mostos com pHs diferentes.

5.1.4. Atividade da Bomba de prtonA ativao de H+-ATPase na membrana plasmtica ocorre quando clulas de levedura so expostas glicose (SERRANO,1983; SOUZA et al., 2001), etanol, acidificao intracelular, temperaturas supra-timas (abaixo de 40o C), presena de cidos orgnicos e pH baixo. (VIEGAS et al., 1998). Ou seja, fatores muitas vezes estressantes so responsveis pelo aumento da atividade da referida enzima, e

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Concentrao de cidos orgnicos (g/ L)

6 5 4 3 2 1 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativos

FIGURA 5: Efeito de diferentes fatores de estresse associados na produo de cido succnico e cido ltico durante o processo fermentativo a 32 C das linhagens S. cerevisie PE-2 e M-26. PE-2: cido succnico e cido ltico ; M-26: cido succnico e cido ltico. Mdias obtidas do 3, 5 e 7 ciclos fermentativos.M1 = 200 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L , 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M2 = 50 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M3 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M4 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M5 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 4,5. M6 (controle) = 0 mg de NaHSO3/L, 0 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH4,5.

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conseqentemente, da atividade da Bomba de prtons. Entretanto, segundo alguns pesquisadores, a levedura exposta a condies estressantes tem inicialmente uma reduo do nmero total da enzima H+-ATPase e posteriormente ocorre sua ativao que pode ser atribuda a alteraes ps-traduo desta protena e no a sua sntese. (VIEGAS et al., 1995; CARMELO et al., 1997). As FIGURAS 6 e 7 mostram que a variao das atividades da Bomba de prtons das leveduras est de acordo com as observaes feitas por VIEGAS et al. (1995) e CARMELO et al. (1997). Assim, tais FIGURAS mostram, de uma forma geral, uma reduo da atividade da Bomba de prtons que poderia ser atribuda diminuio no nmero de H+-ATPase de membrana em resposta ao estresse que as leveduras foram expostas aps o incio da fermentao. No 7o ciclo fermentativo existiu uma tendncia de aumento da atividade da Bomba de prtons para a maioria dos processos fermentativos testados, provavelmente, ocorrendo a ativao ps-traduo da enzima. Dessa forma, dentre todos os fatores sinrgicos de estresse testados, o pH mais elevado usado no meio fermentativo 5 (M5), manuteno do foi responsvel por uma maior

potencial de membrana da linhagem S. cerevisiae PE-2 (FIGURA

6), ou seja, este provavelmente proporcionou menor diminuio do nmero da enzima H+-ATPase na primeira resposta ao estresse. Entretanto, para a linhagem S. cerevisiae M-26, o fator de maior influncia para a manuteno do potencial de membrana foi o cido ltico a 2 g/L (M3), mostrando, provavelmente, que este cido a 6 g/L associado a maior produo de cidos orgnicos totais afetou mais a atividade de H+-ATPase de membrana do que na linhagem PE-2 (FIGURA 7).

5.1.5. TrealoseA FIGURA 8 mostra que os processos fermentativos testados estimularam a produo de trealose para as duas linhagens de levedura estudadas. O M4 e o controle, ambos com 16,4% de sacarose, foram responsveis por uma maior produo de trealose pelos dois microrganismos. Este resultado est de acordo com a literatura, a qual mostra que menores concentraes de acares so responsveis pelo maior acmulo de trealose (PANEK, 1975 a; LILLIE e PINGLE, 1980).

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Liberao de H ( moles de H / h/ g)

500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 To 5 Ciclo fermentativo 7

M1 M2 M3 M4 M5 M6 FIGURA 6: Efeito de diferentes fatores de estresse associados na atividade da Bomba de prtons, aps o processo fermentativo, a 32o C, por S. cerevisiae PE-2.To = incio da fermentao. M1 = 200 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L , 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M2 = 50 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M3 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M4 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M5 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 4,5. M6 (controle) = 0 mg de NaHSO3/L, 0 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH4,5.

+

+

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Liberao de H ( moles de H / h/ g)

500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 To 5 Ciclo fermentativo M1 M2 M3 M4 M5 M6 7

FIGURA 7: Efeito de diferentes fatores de estresse associados na atividade da Bomba de prtons, aps o processo fermentativo, a 32o C, por S. cerevisiae M-26.To = incio da fermentao. M1 = 200 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L , 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M2 = 50 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M3 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M4 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M5 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 4,5. M6 (controle) = 0 mg de NaHSO3/L, 0 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH4,5.

+

+

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12 de massa seca) Trealose (g. 100g-1

10 8 6 4 2 0 To M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativos

FIGURA 8: Efeito de diferentes fatores de estresse associados na formao de trealose atravs da fermentao, a 32oC, de S. cerevisiae PE-2 e M-26. o Mdias obtidas do 7 ciclo fermentativo.To = incio da fermentao. M1 = 200 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L , 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M2 = 50 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M3 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M4 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M5 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 4,5. M6 (controle) = 0 mg de NaHSO3/L, 0 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH4,5.

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A linhagem S. cerevisiae PE-2, mostrou ter uma maior capacidade de estoque de trealose que a linhagem M-26, indicando que tal manuteno pode estar relacionada com a viabilidade, j que a primeira levedura apresentou uma tendncia de obter o maior nmero de clulas viveis. Segundo pesquisadores, a trealose um carboidrato de reserva e de proteo das leveduras em situao de estresse como temperatura elevada, toxicidade do etanol, desidratao celular e aumento da presso osmtica (THEVELEIN, 1984; HOTTINGER et al.,1987; PANEK et al.1990;

ALCARDE e BASSO, 1997). Foi observada uma forte relao entre o acmulo de trealose intracelular e a viabilidade celular por PATARO (2002) e CHERUBIN (2003).

5.1.6. Protena residualAo submeter os valores de concentraes obtidos da protena residual no vinho delevurado ao teste Anova, verificou-se que os diferentes tratamentos tiveram uma certa influncia na obteno de tais resultados (FIGURA 9). A linhagem de levedura PE-2 apresentou aumento significativo (TUKEY, p < 0,05) de protena residual em cerca de 83% quando o meio controle (M6) foi substitudo por M1 e M2. A FIGURA 9 mostra que a menor concentrao de protena residual entre os meios estressantes foi resultante da fermentao no M5, sem diferena significativa quando comparada ao controle. Este resultado indica que dentre os fatores de estresse associados, o pH 4,5 proporcionou menor lise celular, maior integridade da membrana da linhagem PE-2 e ou maior consumo de protena no meio. Entretanto, para a linhagem M-26 os diferentes tratamentos no tiveram influncia significativa (TUKEY, p > 0,05) na quantidade de protena residual. Houve uma tendncia de maior concentrao de protena residual nos mostos da linhagem PE-2 em relao aos do M-26 aps as fermentaes (FIGURA 9). A concentrao de protena residual nos tratamentos M1 e M2 da linhagem PE-2 foi em mdia 80% significativamente maior que nos mesmos meios para a outra linhagem, o que pode ser desvantajoso, pois o excesso de aminocido residual no meio estimula a contaminao bacteriana. Um dos motivos para a existncia de menor concentrao de protena residual no vinho delevurado da linhagem M-26 talvez possa ser atribudo maior sntese de cido orgnico por tal levedura, pois segundo ALVES (1994), a sntese destes est, tambm, relacionada com o consumo de nitrognio.

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45 40 Protena residual (mg/ mL) 35 30 25 20 15 10 5 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativosFIGURA 9: Efeito de diferentes fatores de estresse associados protena residual no mosto fermentado, a 32 C, pelas linhagens e M-26. Mdias obtidas do 3 ao 7 ciclo fermentativo. na formao de S. cerevisiae PE-2

M1 = 200 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L , 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M2 = 50 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M3 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M4 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M5 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 4,5. M6 (controle) = 0 mg de NaHSO3/L, 0 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH4,5.

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5.1.7. Determinao do acar redutor residual total (ARRT), rendimento e produtividade etanlicaA FIGURA 10 mostra que existiu uma tendncia significativa (Anova,

p < 0,0001) de haver um maior consumo da sacarose no controle, M4 e M5 para as duaslinhagens estudadas, ainda que no ltimo meio tenha se acrescentado cerca de 4% (p:v) a mais do acar. Dentre os fatores de estresse associados, mais uma vez o pH se destacou, pois ao se utilizar o M5 (pH 4,5) houve um aumento significativo (TUKEY, p < 0,05; Test-t, p < 0,018) do consumo de acar em cerca de 160% e 84% em relao a utilizao do M1, respectivamente, para as linhagens PE-2 e M-26. No foi detectada diferena estatstica (TUKEY, p > 0,05) entre o consumo de acar pelos dois microrganismos, embora, tenha existido uma tendncia da linhagem M-26 ter

consumido mais acar principalmente nos M1 e M2, onde coincidiu com a menor liberao de protena. Dessa forma, verifica-se que parte da protena residual do vinho de PE-2, em tais meios, venha do fato desta no consumir todo o nitrognio acrescentado no meio devido ao balano de Carbono/ Nitrognio ocorrido em uma clula. Existiu uma tendncia da influncia dos diferentes tratamentos fermentativos no rendimento etanlico (Anova, p = 0,015), onde os fatores de estresse que mais se sobressaram foram o pH para a linhagem M-26; pH e sulfito para a linhagem PE-2, entretanto, essa diferena no foi confirmada quanto ao teste de TUKEY (p > 0,05). (FIGURA 11). importante observar que em uma fermentao com mais ciclos, ou at a industrial, provavelmente, tal diferena se tornaria relevante, associado ao fato de que o pH 4,5 foi responsvel por uma maior viabilidade, brotamento e menor ARRT para as duas linhagens estudadas. Houve tambm uma tendncia da linhagem M-26 produzir maiores rendimentos etanlicos do que a outra em cerca de 10%, sendo esta diferena no significativa (TUKEY, p > 0,05). A FIGURA 12 mostra uma tendncia significativa (Anova, p < 0,0001) do M5 ser responsvel pelos maiores valores de produtividade etanlica para os dois microrganismos estudados, alm da linhagem M-26 apresentar maiores valores que a PE-2 em cerca de 13%, embora, no significativa para o teste de TUKEY.

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3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativosFIGURA 10: Efeito de diferentes fatores de estresse associados no ARRT aps 12h de fermentao, a 32 C, de S. cerevisiae PE-2 e M-26. Mdias obtidas do 3 ao 7 ciclo fermentativo.M1 = 200 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L , 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M2 = 50 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M3 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M4 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M5 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 4,5. M6 (controle) = 0 mg de NaHSO3/L, 0 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH4,5.

ARRT % (p/v)

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Aps a anlise de todos os parmetros estressantes, o pH 3,6 foi o que mais interferiu no metabolismo das duas linhagens estudadas, entretanto, o pH 4,5 mostrou ser suficiente para minimizar os efeitos danosos de sulfito, etanol e cido ltico sobre a clula. Com pH nesta faixa a ao deletria de tais substncias foi minimizada, por se apresentarem em suas formas menos txicas. O metabissulfito de sdio em pH 4,5 est predominantemente na forma de bissulfito, no sendo a forma mais txica para a levedura quanto de SO2 (pK1 = 1,77) (CARTWRIGHT et al. 1989). Com o pKa = 3,86, o cido ltico em pH 4,5 est predominantemente em sua forma dissociada e no atravessa passivamente a membrana plasmtica (CASSIO

et

al.,

1987;

NARENDRANATH et al., 2001). Alm disso, o pH muito baixo exacerba o efeito danoso do etanol ao metabolismo da levedura (CARTWRIGHT et al. 1989).

50

90 85 Rendimento etanlico (% ) 80FIGURA 12: Efeito de diferentes estresses associados no rendimento etanS. cerevisiae PE-2 e M-26. As 75 lico obtido da fermentao de mdias foram obtidas das amostras do 3 ao 7 ciclo fermentativo.

70 65 60 55 50 45 40 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativos

FIGURA 11: Efeito de diferentes fatores de estresse associados no rendimento etanlico obtido da fermentao, a 32o C, de S. cerevisiae PE-2 e M-26. Mdias obtidas do 3 ao 7 ciclo fermentativo.M1 = 200 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L , 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M2 = 50 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M3 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M4 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M5 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 4,5. M6 (controle) = 0 mg de NaHSO3/L, 0 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH4,5.

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12 Produtividade etanlica (g/ L.h) 10 8 6 4 2 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativosFIGURA 12: Efeito de diferentes fatores de estresse associados na produtividade etanlica obtida da fermentao, a 32o C, de S. cerevisiae PE-2 e M-26. Mdias obtidas do 3 ao 7 ciclo fermentativo.M1 = 200 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L , 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M2 = 50 mg de NaHSO3/L, 6g de cido ltico/L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M3 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M4 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH 3,6. M5 = 200 mg de NaHSO3/L, 2 g de cido ltico /L, 9,5% (p:v) de etanol e pH 4,5. M6 (controle) = 0 mg de NaHSO3/L, 0 g de cido ltico /L, 7,5% (p:v) de etanol e pH4,5.

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5.2. Efeito do tratamento cido associado a outros fatores de estresse para a linhagem S. cerevisiae PE-2.Como DORTA et al. (2006) verificaram que o pH baixo (3,6) foi o fator de maior estresse para as leveduras dentre outros testados, a segunda etapa deste trabalho foi pesquisar o efeito do tratamento cido sobre o metabolismo da linhagem de levedura PE-2 em processos fermentativos tambm estressantes. Os dados analisados neste item foram obtidos das amostras retiradas dos processos fermentativos