Profa Dra Luciana Furlaneto Maia Texto Adaptado (Profa. Dra Cynthia Maria Kyaw – UNB)

CRESCIMENTO MICROBIANO

Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e não ao aumento das dimensões celulares (tamanho da célula).

Crescimento Populacional: é definido como o aumento do número, ou da massa microbiana. A taxa de crescimento é a variação no número ou massa por unidade de tempo. O tempo de geração é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique. O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos até dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de geração não corresponde a um parâmetro absoluto, uma vez que é dependente de fatores genéticos e nutricionais, indicando o estado fisiológico da cultura. O tempo de geração pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela fórmula abaixo: N=No.2

n, onde N= número final de células, No= número inicial de células, n= número de gerações.

n= log(N) - log(No)/0.301

g = t/n , onde g= tmpo de geração, t= tempo de crescimento e n= determinado acima.

Medidas do crescimento microbiano

O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes técnicas, tais como pelo acompanhamento da variação no número ou peso de células, por exemplo. Dentre as diferentes técnicas utilizadas, descreveremos alguns exemplos.

Contagem total de células: esta metodologia envolve a contagem direta das células em um microscópio, utilizando-se câmaras de contagem. A contagem direta é uma técnica rápida, mas tem como principais limitações a impossibilidade de distinção entre células vivas e mortas e contagens errôneas, devido às pequenas dimensões de algumas células, ou pela formação de agregados celulares.

Exemplo ilustrando o procedimento de contagem direta (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Em determinadas situações, por exemplo quando se requer apenas uma estimativa da quantidade de microrganismos, pode-se empregar a contagem proporcional, que corresponde a uma análise comparativa das culturas com suspensões padrão. Como exemplo de uma suspensão padrão podemos citar a escala de MacFarland, apresentando assim, graus de turvação distintos. Desta forma, comparando-se a turvação da cultura em estudo com os tubos de MacFarland, pode-se obter uma estimativa do número de células presentes na amostra.

Profa Dra Luciana Furlaneto Maia Texto Adaptado (Profa. Dra Cynthia Maria Kyaw – UNB)

Contagem de viáveis: Procedimento também conhecido como contagem em placa, que estima o número de células viáveis (isto é, capazes de se reproduzir) em uma amostra. Esta metodologia envolve a coleta de uma cultura microbiana em diferentes tempos de crescimento, as quais são então inoculadas em meio sólido. Após a incubação dos meios, geralmente por uma noite, o número de colônias é contado. Como uma colônia normalmente é originada a partir de um organismo, o total de colônias que se desenvolvem no meio corresponde ao número de células viáveis presentes na alíquota analisada. Esta técnica deve sempre realizada empregando-se várias diluções (100 a 104 células) das amostras. Esta metodologia é amplamente utilizada, exibindo elevada sensibilidade, detectando baixos números de células e permitindo também a contagem de diferentes tipos de microrganismos, pelo emprego de meios seletivos (meios que favorecem o crescimento de um determinado tipo ou grupo de organismo) e/ou seletivos e diferenciais (meios que além de favorecerem o desenvolvimento de um tipo ou grupo de organismo, também permite sua distinção, a partir de alguma característica fenotípica). Também podem ser usadas membranas filtrantes, onde os líquidos são filtrados e as membranas colocadas diretamente sobre os meios de cultura.

Técnica de contagem de viáveis (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Massa de células: pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou do peso úmido de uma cultura. Este tipo de procedimento é realizado quando não é necessário determinar o número preciso de microrganismos presentes. Peso seco: Muito utilizado na quantificação de fungos, onde o micélio é retirado da cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido à secagem. Realizam-se então sucessivas pesagens, até o momento onde não observa-se mais variações. Este procedimento pode também ser realizado centrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou então secando-o (100 - 150°C/16 horas) e depois pesando-o.

Profa Dra Luciana Furlaneto Maia Texto Adaptado (Profa. Dra Cynthia Maria Kyaw – UNB)

Turbidimetria: quantificação em espectrofotômetro ou colorímetro a 660 nm, uma vez que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos meios de cultura não interfere com os resultados. Nestes comprimentos, a absorção de luz por componentes celulares corados é desprezível mas, se necessário, outros comprimentos de onda podem ser usados. Tal metodologia requer a confecção de uma curva padrão. Embora a análise turbidimétrica seja menos sensível, é de rápida e fácil execução, não destruindo a amostra. Entretanto, não permite a determinação de células viáveis.

Análises químicas: A partir da quantificação de proteínas ou de nitrogênio, ou por meio da análise de diferentes atividades metabólicas.

Número Mais Provável (NMP): Amplamente utilizado em laboratórios de microbiologia de alimentos ou ambiental, na quantificação de microrganismos em água, leite e outros produtos. Esta metodologia é basicamente utilizada para a pesquisa de coliformes totais e coliformes fecais, que são microrganismos indicadores de poluição fecal, o que pode ter como consequência a presença de outros organismos, tais como protozoários e vírus. Esta técnica foi desenvolvida após análises estatísticas complexas.

CURVA DE CRESCIMENTO (CULTURA DESCONTÍNUA)

Quando uma cultura microbiana desenvolve-se em um sistema fechado, pode-se confeccionar uma curva de crescimento. Esta pode ser dividida em diferentes etapas: lag, log, estacionária e de declínio.

Curva de Crescimento Padrão, em um sistema fechado

Lag: período variável, onde ainda não há um aumento significativo da população. Nesta fase ocorre a síntese de várias enzimas e/ou outros constituintes celulares necessários à absorção dos nutrientes presentes no meio.

Log ou exponencial: nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. A taxa de crescimento

Profa Dra Luciana Furlaneto Maia Texto Adaptado (Profa. Dra Cynthia Maria Kyaw – UNB)

exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo em questão. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos.

Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento da população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem. Na fase estacionária que são sintetizados vários metabólitos secundários, que incluem antibióticos e algumas enzimas. Nesta etapa ocorre também a esporulação das bactérias.

Declínio: A maioria das células está em processo de morte, embora outras ainda estejam se dividindo.

Crescimento em culturas contínuas: técnica muito usada nos processos industriais de obtenção de produtos microbiológicos. Nestes casos, tem-se o interesse em manter as células em fase log ou estacionária. Utilizam-se fermentadores que permitem um crescimento em equilíbrio dinâminco.

CONDIÇÕES IDEAIS DE CRESCIMENTO

O crescimento dos microrganismos é grandemente afetado pelas condições físicas e químicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podem influir positivamente ou negativamente de acordo com o microrganismo em questão.

TEMPERATURA: Corresponde a um dos principais fatores ambientais que influenciam o desenvolvimento bacteriano. A medida que há um aumento da temperatura, as reações químicas e enzimáticas na célula tendem a tornar-se mais rápidas, acelerando a taxa de crescimento. Entretanto, em determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturação de proteínas e ácidos nucléicos, inviabilizando a sobrevivência celular.

Assim, todos os microrganismos apresentam uma faixa de temperatura onde desenvolvem-se plenamente. Nesta faixa de temperatura podemos determinar as temperaturas mínima, ótima e máxima para cada microrganismo. A temperatura máxima provavelmente reflete os processos de desnaturação mencionados acima.

Profa Dra Luciana Furlaneto Maia Texto Adaptado (Profa. Dra Cynthia Maria Kyaw – UNB)

Temperaturas cardeais dos microrganismos (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade de faixas de temperatura, onde para alguns o ótimo encontra-se entre 5 e 10°C, enquanto para outros é de 90 a 100°C. Assim, os microrganismos podem ser classificados em quatro grupos, de acordo com os ótimos de temperatura: PSICRÓFILOS (0 a 20°C, ótimo de ≈ 15°C), MESÓFILOS (12 a 45°C), TERMÓFILOS (42 a 68°C), e HIPERTERMÓFILOS (80 a 113°C).

Tipos de bactérias em relação à temperatura (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Há os microrganismos psicrotolerantes que são aqueles cujo ótimo encontra-se entre 20 e 40°C e que sobrevivem a 0°C. São um grupo amplo (bactérias, fungos, algas e protozoários) que podem contaminar alimentos e outros substratos refrigerados.

Profa Dra Luciana Furlaneto Maia Texto Adaptado (Profa. Dra Cynthia Maria Kyaw – UNB)

Mesófilos: crescem numa faixa de 20 a 40°C, com um ótimo em torno de 37°C, sendo os principais microrganismos encontrados em animais de sangue quente.

Termófilos e Hipertermófilos: São encontrados nos solos, silagem, fontes termais e no fundo oceânico.

TENSÃO DE HIDROGENIO - pH:

Os ambientes naturais tem uma faixa de pH de 5 a 9, o que comporta o crescimento de diferentes tipos de microrganismos. Os fungos tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (pH <5).

Distribuição de alguns microrgansmos, de acordo com o pH (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

TENSÃO DE O2: Extremamente importante no desenvolvimento, uma vez que os microrganismos comportam-se de forma bastante distinta, sendo classificados como AERÓBIOS, ANAERÓBIOS FACULTATIVOS, ANAERÓBIOS ESTRITO S, ANAERÓBIOS AEROTOLERANTES E MICROAERÓFILOS .

As condições de anaerobiose podem ser conseguidas pelo uso de agentes redutores nos meios de cultura, tais como o tioglicolato de sódio, que reage com o oxigênio, formando água; pela remoção mecânica do oxigênio, sendo substituído por nitrogênio e CO2; pelo uso de sistemas comerciais do tipo "GasPak", que gera hidrogênio e CO2 com um catalisador de paládio.

Profa Dra Luciana Furlaneto Maia Texto Adaptado (Profa. Dra Cynthia Maria Kyaw – UNB)

Classes de organismos, em relação à tensão de oxigênio (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

PRESSÃO OSMÓTICA

Classes de organismos, em relação à salinidade (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)